FACULTAD DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL

´´ MÉTODOS DE ESTERILIZACIÓN´´

CURSO: Microbiología Agroindustrial

PRACTICA : N° 01

DOCENTE : Ing. Nelson García Garay

ALUMNO : Isaac David Peña Pezo

CÓDIGO : 71891124

FECHA : 28/04/2015

MORALES – SAN MARTÍN

2015

TITULO: MÉTODOS DE ESTERILIZACIÓN

I. INTRODUCCION

UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN MARTIN

ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL

Los microorganismos pueden producir enfermedades cuando infectan personas, animales y plantas y cuya gravedad oscila entre una infección débil, intoxicación e incluso la muerte. Pueden contaminar los alimentos y producir cambios físicos y químicos en ellos, haciéndolos en algunos casos incomibles e incluso venenosos. Los microorganismos son responsables también de la alteración de muchos otros materiales, generando graves pérdidas económicas. Por ello es indispensable disponer de procedimientos para controlar la contaminación y el crecimiento microbiano.

Y uno de esos procesos que se puede aplicar es la esterilización, que es un proceso a través del que se logra la destrucción total de los microorganismos viables presentes en un determinado material. Este procedimiento es de gran utilidad dentro de varios campos, siendo una de estas el de microbiología agroindustrial, pues existen muchos procesos que requieren la utilización de materiales estériles. Entre éstos podemos destacar lo siguiente:

El acondicionamiento del material (pipetas, tubos,

- placas de Petri, pinzas, etc.) que va a ser utilizado en los laboratorios de microbiología.

- La preparación de medios de cultivo que serán empleados con diferentes propósitos (cultivo de microorganismos, control de ambiente, equipos o personal, análisis microbiológico de medicamentos, cosméticos, alimentos, etc.)

- La descontaminación de material utilizado.

Existen diversos métodos de esterilización. La selección del método a aplicar en cada caso está determinada por el tipo de producto a esterilizar.

II. OBJETIVOS

- Conocer el fundamento de los métodos de esterilización.- Conocer los equipos con que cuenta el laboratorio, y los que se utilizan para la

esterilización.- Conocer los materiales de vidrio, básicos para el uso en un laboratorio de

microbiología.- Aprender a preparar los materiales de vidrio y medios de cultivo para su

esterilización.

II. REVISIÓN DE LITERATURA

Los microorganismos pueden ser eliminados, inhibidos o muertos por agentes físicos, agentes químicos, o por procesos físicos y agentes quimioterapéticos. Se dispone de una gran variedad de técnicas y agentes que actúan de maneras diferentes y cada uno tiene su aplicación y límite de uso. Un agente físico es una

propiedad o condición que causa un cambio, por ejemplo la temperatura, la presión, radiación y los filtros. Un agente químico es una sustancia que causa una reacción específica y que se caracterizan por una estructura molecular típica, por ejemplo tenemos los compuestos fenólicos, los alcoholes, alógenos (cloro y yodo), aldehídos, oxido de etilo, fenoles.

Un proceso físico es un procedimiento que causa un cambio, por ejemplo la filtración la esterilización, incineración, higienización. Se utilizan varios términos específicos para escribir a estos agentes y procesos:

Esterilización: El proceso que destruye todas las formas de vida se llama esterilización. Un objeto estéril, en sentido microbiológico esta libre de microorganismos vivos. Un objeto o una sustancia están estéril o no está estéril; no puede estar nunca semiestéril o casi estéril.

Desinfectante: Un agente, usualmente un producto químico que mata las células vegetativas pero no necesariamente las formas esporuladas de los microorganismos productores de enfermedades, se denomina un desinfectante. El término se aplica comúnmente a sustancias usadas sobre objetos inanimados. La desinfección es el proceso mediante el cual se destruyen las células vegetativas pero no necesariamente las esporas de los agentes infecciosos.

Antiséptico: Una sustancia que se opone a la infección (sepsis) o previene crecimiento o acción de los microorganismos, bien sea destruyendo o bien inhibiendo su crecimiento o actividad, se denomina un antiséptico. El término está usualmente asociado a sustancias aplicadas al cuerpo.

Higienización: Un agente que reduce la población microbiana hasta niveles que se juzgan seguros para las exigencias de la salud pública se denomina un higienizante. Usualmente es un agente químico que mata el 99.9% de las bacterias en crecimiento. Los higienizantes suelen aplicarse a objetos inanimados y generalmente se emplean en el cuidado diario de equipos y utensilios en las plantas lecheras y de preparación de alimentos, así como para los vasos, platos y utensilios en los restaurantes. El proceso de desinfección producirá higienización. Sin embargo en el sentido estricto, higienización implica una condición sanitaria ó de limpieza cosa que la infección no implica necesariamente.

Germicida (microbicida): Un agente que mata las células vegetativas pero no necesariamente las formas esporuladas de los gérmenes se llaman germicida (microbicida). En la práctica, germicida es casi sinónimo de desinfectante. Pero un germicida se usa generalmente para toda clase de gérmenes microbios y para cualquier aplicación.

Bactericida: Un agente que mata las formas vegetativas de las bacterias. Del mismo modo, los términos fungicida, viricida y esporocida se refieren a agentes que matan a los hongos, virus y esporas respectivamente.

Bacteriostasis: Una condición en la que se previene (se inhibe) el crecimiento de las bacterias se denomina bacteriostasis (adjetivo: bacteriostático. Del mismo modo, fungistático describe la acción de un agente que detiene el crecimiento de

los hongos. Los agentes que tienen en común la capacidad de inhibir los crecimientos de los microorganismos se designan colectivamente, como agentes microbiostáticos.

Agente Antimicrobiano: El término de agente antimicrobiano se refiere a un agente que interfiere con el crecimiento y metabolismo de los microbios. En el uso común, el término denota inhibición de crecimiento y cuando se refiere a grupos específicos de organismos, suelen usarse con frecuencia los términos tales como antibacteriano o antifungico. Algunos agentes antimicrobianos se utilizan específicamente para el tratamiento de infecciones, estos se denominan agentes terapéuticos.

CONTROL DEL PROCESO DE ESTERILIZACIÓN

Todos los procesos de esterilización se deben controlar para poder asegurar que han sido efectivos. Para ello se pueden utilizar indicadores físicos, químicos y/o biológicos, los cuales deben ser colocados en cada carga de esterilización.

Indicadores físicos

Entre los principales indicadores físicos se encuentran los medidores de presión y los termómetros los cuales permiten constatar las condiciones físicas dentro de la cámara de esterilización. También existen los termógrafos los cuales, además de registrar la temperatura alcanzada en el proceso, permiten conocer durante cuánto tiempo ésta se mantuvo.

Indicadores químicos

La mayoría de estos indicadores son cintas adhesivas que se adhieren al material a esterilizar. Estas cintas están impregnadas con una sustancia química que cambia de color cuando el material ha sido sometido al proceso de esterilización. Este tipo de cintas no son completamente confiables debido a que muchas veces sólo indican que se llegó a la temperatura deseada, pero no indican por cuanto tiempo ésta se mantuvo. También existen cintas diseñadas de manera que el cambio de color es progresivo, estas cintas son un poco más seguras porque permiten estimar si el tiempo de esterilización fue el adecuado.

Indicadores biológicos

Son preparaciones de una población específica de esporas de microorganismos, las cuales son altamente resistentes a un proceso de esterilización en particular. Estos indicadores se deben colocar junto con la carga de esterilización, en el sitio que se considera que es más difícil que llegue el vapor y después del proceso, se deben incubar durante 24 horas en condiciones adecuadas. Si después de este periodo hay evidencia de crecimiento microbiano (por ejemplo cambio de color del medio de cultivo), el proceso de esterilización no fue satisfactorio. Cuando se utilizan indicadores biológicos se debe verificar:- Tipo de microorganismo- Tipo de proceso de esterilización- Número de lote- Fecha de expiración- Medio de cultivo utilizado

- Condiciones de incubación del indicador después de aplicado el proceso de esterilización

- Métodos de descontaminación para evitar la diseminación de esporas en el medio ambiente

Con este tipo de indicadores se controlan la esterilización por vapor a presión, por calor seco y la esterilización con óxido de etileno.

ALMACENAMIENTO DEL MATERIAL ESTÉRIL

Una vez que un material está estéril puede mantener esta condición si está protegido en la forma apropiada. Es decir, la duración de la esterilidad de un material no está relacionada directamente con el tiempo, sino con factores que comprometen su exposición al medio ambiente.

Los materiales estériles pierden su esterilidad:

- Cuando se produce cualquier ruptura, accidental o no, del material que lo recubre durante su transporte o almacenamiento.

- Al humedecerse el material de empaque.Es importante no manipular los materiales estériles con las manos húmedas, ni colocarlos sobre superficies mojadas.

Al almacenar los materiales estériles se deben tomar una serie de precauciones, tales como:

- Controlar el acceso a las áreas de almacenamiento de materiales estériles.- Mantener el área de almacenamiento limpia, libre de polvo, sucio e insectos.- Controlar la temperatura y la humedad de las áreas de almacenamiento.

La temperatura ideal debe estar por debajo del 26ºC y la humedad relativa entre 30 y 60%. Los periodos prolongados de almacenamiento en lugares tibios y húmedos, pueden producir condensación de humedad sobre el material de empaque.

- Utilizar, preferiblemente, estantes cerrados para colocar el material.- Dejar que los materiales que salen del horno o el autoclave alcancen la

temperatura ambiente antes de ser almacenados; de esta forma se evita la condensación dentro del empaque.

IV. CUESTIONARIO

1. Hacer un inventario de todos los equipos y materiales de vidrio con que cuenta el Laboratorio de Microbiología y Fermentación de la FIAI.

EQUIPO CANTIDAD

1. Autoclave2. Destilador de agua3. Ph-metro4. Balanza Analítica5. Incubadora6. Agitador 7. Refrigeradora8. Horno9. Baño María10. Cocinilla eléctrica11. Termómetro de max y min12. Microscopio13. Reloj horario14. Computadora 15. Impresora16. Estabilizador de Voltaje

01020102010201010202010301010101

EQUIPO CANTIDAD

1. Pipetas2. Pipetas Volumétricas3. Probeta 50 ml4. Probeta 500 ml5. Probeta 1000 ml6. Erlenmeyer de 1 litro7. Erlenmeyer de 500 ml8. Pipetas 10 ml9. Pipetas 5 ml10. Pipetas 1 ml11. Balón de destilación de 1000 ml12. Balón de destilación de 15000 ml13. Matraz 14. Agitador de Vidrio15. Portaobjetos16. Cubreobjetos17. Crisol18. Placa Petri chica19. Placa Petri grande20. Tubo de ensayo mediano 15x150

mm21. Tubo de ensayo mediano 25x150

mm22. tubo de ensayo grande

03020303030305040304030303030203020404

060606

2. Esquematizar los equipos y materiales que recién has conocido.

3. Nombrar los equipos de esterilización con que cuenta el laboratorio e indicar su funcionamiento y aplicación.

Nombre del equipo: Autoclave

Aplicación: El autoclave es un equipo utilizado para la esterilización por vapor de materiales estables al calor, mediante la desnaturalización irreversible de enzimas y proteínas estructurales de agentes biológicos.

Funcionamiento: Las autoclaves funcionan permitiendo la entrada o generación de vapor de agua pero restringiendo su salida, hasta obtener una presión interna de 103 kPa, lo cual provoca que el vapor alcance una temperatura de 121 grados centígrados. Un tiempo típico de esterilización a esta temperatura y presión es de 15- 20 minutos. Ciertos materiales no pueden ser esterilizados en autoclave, como el papel y muchos plásticos (a excepción del polipropileno). Este producto es de uso general en laboratorio y no es un producto sanitario por tanto no lleva marcado CE según la directiva 93/42/EEC ni le es de aplicación esta legislación.

Cuando el autoclave está destinado a la esterilización de productos sanitarios tiene unos requisitos especiales, esterilizador Especialmente para la destrucción de los microorganismos, sean cuales sean sus características, siendo lo mismo que sean patógenos o no, que estén sobre el material o dentro del mediante el calor seco. Se trabaja a una temperatura de 180° C por un tiempo de 2 horas con determinados materiales; ya sean de vidrio, madera o metal.

Nombre del Equipo: Horno Pasteur o Poupinel

Aplicación: El Horno Pasteur o Poupinel, que es una caja metálica con circulación de aire forzado, impulsado por un ventilador eléctrico y termorregulado por un termostato, su calefacción se consigue por medio de resistencias eléctricas. Se utiliza en materiales de vidrio como Placas Petri, tubos de ensayo, matraces, etc. También para porcelanas. El mecanismo de acción en la esterilización por calor seco o aire caliente es a través de una exageración de los procesos oxidativos, hay destrucción por oxidación de los microorgasnismos.

Funcionamiento: Se emplea a altas temperaturas (160-180º C) durante un tiempo prolongado (1.5 a 3 horas). Debido a su poca capacidad de penetración se usa para esterilizar vidrio y metales. Actúa principalmente desnaturalizando las proteínas y secundariamente oxidando los compuestos celulares.

4. Explicar la manera de esterilizar ambientes, superficies (piso, mesas de trabajo), del laboratorio de Microbiología y Fermentación.

La limpieza y la desinfección son procedimientos de gran importancia, ya que permiten controlar la presencia de microorganismos sobre las superficies. La desinfección es un proceso que implica la destrucción de microorganismos perjudiciales (formas vegetativas), a través del uso de sustancias químicas o agentes físicos aplicados sobre superficies inertes. La limpieza debe ser un paso previo a la desinfección ya que con este proceso, además de eliminar muchas sustancias que pueden servir como nutrientes para los microorganismos, se eliminan sustancias que pueden impedir que las soluciones desinfectantes actúen eficientemente.

LIMPIEZA DE CRISTALERÍA Y MATERIAL DE POLIETILENO PARA USO DE LABORATORIO

PROPÓSITO: Garantizar la calidad de los resultados de los análisis, utilizando material de laboratorio libre de impurezas y residuos químicos.

MATERIALES:

- Agua.- Detergentes.- Agua Destilada.

PROCEDIMIENTO:

- Descontaminar todo lo que contenga material bioinfeccioso antes de la limpieza.

- Iniciar la limpieza de cristalería inmediatamente después que se ha utilizado, para evitar la formación de costras y desprendimiento de éstas en el siguiente uso.

- Sumergir el material en recipientes que contengan agua con detergente durante 30 minutos.

- Enjuagar con suficiente agua para eliminar completamente el detergente.- Enjuagar con agua destilada. (Se considera que el material de vidrio está limpio

cuando mantiene una película continua de agua destilada en toda su superficie interna, es decir que se escurra de manera uniforme).

- Dejar escurrir o secar.- Almacenar en condiciones que impidan la contaminación con polvo u otras

sustancias ambientales.

FUENTES DE ERROR:

- No eliminar por completo el detergente.- No enjuagar con agua destilada.- No realizar el secado.- Lavar cristalería quebrada.- Falta de supervisión del proceso por parte del profesional.

LIMPIEZA DE LAS MESAS DE TRABAJO

PROPÓSITO: Disponer de una superficie de trabajo libre de riesgos biológicos y químicos a los que se expone el personal de laboratorio en el desempeño de sus labores.

MATERIALES:

- Dilución de Hipoclorito de Sodio al 0.5% (lejía 5% diluida 1:10).- Agua.- Papel toalla o paños de tela.

PROCEDIMIENTO:

- Limpiar la mesa antes y después de cada jornada de trabajo- Preparar la dilución de hipoclorito de sodio al 0.5% (lejía 5% diluida 1:10) .- Humedecer el papel toalla o paño de tela con la dilución de hipoclorito y frotar

toda la superficie de la mesa hasta que se observe completamente limpia.- Dejar secar.

FUENTE DE ERROR:

- No utilizar la dilución adecuada de hipoclorito de sodio.- Que la dilución de Hipoclorito de Sodio no sea preparada el mismo día que se

utiliza.- No realizar las dos limpiezas indicadas en la jornada de trabajo.

LIMPIEZA DE PISOS

PROPÓSITO: Eliminar la suciedad de los pisos, la cual es una fuente ideal en donde pueden crecer los microorganismos.

MATERIALES:

- Trapeadores.- Agua.- Detergente.- Desinfectante- Baldes, cubetas o piletas.

PROCEDIMIENTO:

Los pisos deben limpiarse por lo menos una vez al día.

- Iniciar la limpieza de las áreas de menor riesgo a las áreas de mayor riesgo.- Remover las partículas gruesas con un trapeador húmedo, para evitar la

formación de aerosoles y que las partículas suspendidas se depositen nuevamente en el piso o en las mesas. (por lo que no es recomendable barrer en seco).

- Finalizar pasando un segundo trapeador humedecido con una mezcla que contenga soluciones de un desinfectante y de un detergente, (la dilución de estos será de acuerdo a las áreas que tengan mayor probabilidad de contaminación con microorganismos)

- Para lavar el trapeador, utilizar el sistema mecánico de dos baldes, para enjuagar y exprimir o el sistema de golpe en pileta para este propósito.

- Dejar los trapeadores fuera de los baldes con agua.- Los trapeadores se emplearán sólo para el laboratorio.

FUENTES DE ERROR:

- Utilizar cera para los pisos, pues esto facilita la adherencia de contaminantes además vuelve el piso liso y puede causar accidentes.

- Exprimir los trapeadores con las manos.- Barrer con escoba.- Dejar trapeadores dentro de cubetas con agua durante toda la noche.

5. Que entiende por Bioseguridad, y cómo debe implementarse en el laboratorio.

Bioseguridad, debe entenderse como una norma de comportamiento encaminada a lograr actitudes y conductas que disminuyan el riesgo de los trabajadores de la salud en el medio laboral. La formación en bioseguridad es la clave en la eficacia de los programas de seguridad del laboratorio y ésta debe ser facilitada a todas las personas que están expuestas a estos riesgos.

La Bioseguridad pretende reducir a un nivel aceptable el riesgo inherente que conlleva la manipulación de material peligroso para ello es necesario contar con un “Manual de Procedimientos de Bioseguridad para los Laboratorios” que detalle los pasos para guardar la bioseguridad en el trabajo diario, describiendo como hacer los procedimientos de bioseguridad.

La Bioseguridad se puede implementar teniendo en cuenta las normas de bioseguridad en laboratorio, además de los equipos de protección personal.

NORMAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

- Entrar al laboratorio en forma ordenada, dejar las carteras, libros y otros objetos personales en el lugar que se les indique para tal fin.

- Llevar puesta la bata de laboratorio en todo momento. La misma debe permanecer completamente cerrada.

- Limpiar y desinfectar las superficies de trabajo, antes de comenzar y al finalizar la sesión práctica.

- Lavar las manos con agua y jabón antes de realizar las actividades programadas, antes de salir del laboratorio y siempre después de manejar materiales que se sabe o se sospecha que son contaminantes

- Trabajar cerca del mesón, adoptando una buena postura y estando físicamente cómodo.

- Llevar un calzado apropiado, preferiblemente cerrado y de suela antideslizante en las áreas de laboratorio.

- Evitar llevar en el laboratorio accesorio que podrían ser fuente de contaminación (por ejemplo joyas).

- Recoger el cabello largo.- Evitar desplazamientos innecesarios, movimientos bruscos. Hablar sólo lo

indispensable.- No comer, beber, fumar, almacenar comida, objetos personales o utensilios,

aplicarse cosméticos ni ponerse o quitarse lentes de contacto en ningún área del laboratorio.

- Conocer el manejo de todos los equipos y reactivos a emplear antes de iniciar las actividades indicadas en la práctica. Si usted tiene alguna duda, diríjase al profesor.

- Mantener el área de trabajo ordenada, libre de libros, cuadernos u objetos personales, exceptuando aquellos equipos y materiales necesarios para la realización del trabajo práctico

- Tener cuidado con el alcohol cuando manipule el mechero. Nunca debe dejar éste desatendido. Regresar los reactivos y equipos empleados (microscopio, mechero, etc.), limpios y de manera ordenada a su respectivo lugar una vez finalizada la actividad. Reporte cualquier daño de los mismos al profesor.

- Colocar los materiales de vidrio contaminados en los recipientes dispuestos para tal fin, por ejemplo: las pipetas en los pepiteros, tubos y placas de Petri en las ollas de desecho, etc.

- No usar ningún reactivo que no esté debidamente identificado, verificar las etiquetas de los mismos y estar seguro de cómo emplearlo.

- No devolver sustancias a sus envases originales.- Emplear la pro pipeta al medir líquidos. Está rigurosamente prohibido pipetear

con la boca. De igual manera las pipetas tendrán tapones de algodón para reducir la contaminación de estos dispositivos de pipeteo.

- Realizar solamente aquellas actividades indicadas por el profesor, no llevar a cabo experimentos no autorizados. Reportar inmediatamente cualquier accidente al profesor (derrame de material contaminado, heridas, quemaduras, etc.), ninguno puede ser catalogado como menor.

- Reducir al mínimo la formación de aerosoles durante la realización de cualquier trabajo práctico.

- Extremar las precauciones cuando se utilicen agujas y jeringas para evitar la inoculación accidental y la generación de aerosoles durante su manipulación y desecho.

- Emplear técnicas asépticas para el manejo de cultivos de microorganismos.

MEDIDAS EN CASO DE EMERGENCIA

(En caso de cualquier tipo de suceso dado por cualquier mal manejo, etc.), Reportar el incidente al profesor y buscar atención médica inmediatamente.

EQUIPOS PROTECCIÓN

Los equipos de protección individual que pueden ser necesarios, en algún momento, en un Laboratorio de Microbiología son: los protectores de los ojos y de la cara (gafas de seguridad, pantallas faciales), los protectores de las vías respiratorias (mascarillas, máscaras), los protectores de manos y brazos (guantes, manguitos), los protectores de la totalidad del cuerpo (batas), etc.

6. Según su opinión, a qué nivel (en %) de implementación está el laboratorio, cómo hay que complementarlo.

Se podría decir que el laboratorio está implementado aproximadamente a un porcentaje de 70%, porque faltan algunos equipos y materiales que no contamos, además de que solo esta implementada lo básico que usualmente se usa, aparte de que no cumplimos al 100% con algunas medidas de bioseguridad.

Estufa de incubación: Es una cámara de temperatura controlada para cultivo de microorganismos. Se utiliza para facilitar el desarrollo de los microorganismos a su temperatura óptima de crecimiento (generalmente 35-37º).

Centrífugas: Aparato que aplica sobre los tubos una fuerza centrífuga lo que permite la separación de los distintos componentes de la muestra mediante la precipitación en el fondo del tubo de las partículas en suspensión. Entre otros equipos, materiales, reactivos, medios de cultivo, etc., que si bien es cierto hay en el laboratorio pero no en el estado y la cantidad indicada.

Jarra de Anaerobiosis: Recipientes que se usan para conseguir una atmósfera libre de oxígeno para el cultivo de microorganismos anaerobios

V. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

http://www.ugr.es/~pomif/pom-bac/pb-ii/pb-ii-2-introduccion.htm http://prontus.uv.cl/pubacademica/pubprofesores/d/pubdinamarcaalejandro/

site/artic/20070416/asocfile/guias_laboratorio_1_y_2.pdf http://www.etpcba.com.ar/DocumentosDconsulta/ALIMENTOS-PROCESOS

%20Y%20QU%C3%8DMICA/Manual-de-Microbiolog%C3%ADa.pdf http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_farmacia/catedraMicro/10_M

%C3%A9todos_de_esterilizaci%C3%B3n.pdf

VI. ANEXOS