CENTRO UNIVERSITARIO DE INVESTIGACIONES BIOMEDICASDE LA UNIVERSIDAD DE COLIMA

POTENCIALES DE ACCIÓN Y ACOPLE EXCITACIÓN-CONTRACCIÓN EN FIBRA MUSCULAR ESQUELÉTICA DE

ANFIBIO.

TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO DE

MAESTRO EN CIENCIAS

EN LA ESPECIALIDAD DE

FISIOLOGÍA

PRESENTA

RAYMUNDO VELASCO RODRÍGUEZ

ASESOR DE TESIS: DR. ISMAEL D. URIBE ARRIAGA.

I N D I C E

1 INTRODUCCIdN 1

1.1 ACOPLE EXCITACIóN-CONTRACCIóN (antecedentes y justificación)

1.2 HIP&l’ESIS PROPUESTAS PARA EXPLICAR EL AECa) Transmisión químicab) Continuidad el&ricac) Movimiento de cargad) Liberación de calcio por calcioe) Regulación alosthica

1.3 PROPIEDADES FISIOLdGICAS Y CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICASDE LAS FIBRAS MUSCULARES ESQUELÉTICAS

a) Excitabilidadb) Inervaciónc) Estructura y ultraestructura

HIPÓTESIS DE TRABAJO

H METODOLOGíA2.1 DISECCIÓN Y MONTAJE2.1.1 Preparación de la cámara de registro experimental2.1.2 Traslado y montaje de la fibra única2.1.3 Montaje de la cámara experimental de registro

2.2 CARACTERÍSTICAS DE LA PREPARACIÓN

2.3 SOLUCIONES EXPERIMENTALES2.4 REGISTROS ELÉCTRICOS2.4.1 Conexiones eléctricas a la cámara experimental2.4.2 Conexiones de la cámara experimental a la fijación de corriente2.4.3 Adquisición y procesamiento de datos

2.5 ECUACIONES2.5.1 Relación corriente VS voltaje2.5.2 Periodos refractariosal autiisis matemático y justificación de las constantes a y bW análisis matemático del intervalo entre ambos pulsos (x) de

estimulación durante el desarrollo del periodo refractario2.5.3 Relación intensidad-duración (I-D)

al estudio analítico de la reobaseb) estudio analítico de la cronaxia

3

1010l ll l1 2

1 3

1 41 51 51 61 6

1 8182022

24262729

2.6 PROGRAMAS UTILIZADOS2.6.1 Programas usados para el análisis de los componkntes electrotónicos

30

obtenidos a partir de la relación estimulo VS respuesta 302.6.2 Programas usados para analizar el curso del periodo refractario 322.6.3 Programas usados para analizar el curso de la relación (I-D) 33

III RESULTADOSa) PRIMERA FASE EXPERIMENTAL

3.1 EFECTO DE LA LS SOBRE LAS PROPIEDADES ELECTROTÓNICASDE LA h4EMBRANA EN UNA h4ISh4A FIBRA MUSCULAR

3.1.1 Estudio de propiedades ekct.rotónicas3.1.2 Efecto de la LS sobre Emax3.1.3 Efecto de la LS sobre la conductancia de membrana (Gm)3.2 EFECTO DE LA LS SOBRE LOS POTENCIALES DE ACCIÓN EN

FIBRAS ESQUELÉTICAS ÚNICAS3.3 EFECTO DE LA LS SOBRE LA RELACIÓN INTENSIDAD-DURACION

EN FIBRA ESQUELÉTICA ÚNICA DE ANFIBIO3.4 EFECTO DE LA LS SOBRE LA REFIMCTARIEDAD EN FIBRA

ESQUELÉTICA ÚNICA DE ANFIBIO3.5 EFECTO DE LA LS SOBRE EL VOLTAJE Y LA CORRIENTE DE

MANTENIMIENTO EN UNA MISMA FIBRA h4USCULAR

b) SEGUNDA FASE EXPERIMENTAL3.6 EFECTO DE LA LS (456 pm) SOBRE LAS RESPUESTAS

ELECTROTÓNICAS DE LA MEMBRANA MUSCULARESQUELÉTICA EN DIFERENTES FIBRAS

3.6.1 Efecto del sobreestiramiento sobre las propiedades electrotónicasde la membrana muscular esquelética

3.6.2 Efecto de la LS sobre la conductancia de membrana en diferentes fibras3.7 EFECTO DE LA LS SOBRE LOS POTENCIALES DE ACCIÓN

EN DIFERENTES FIBRAS MUSCULARES3.8 EFECTO DE LA LS SOBRE LA RELACIÓN INTENSIDAD-DURACIÓN

EN DIFERENTES FIBRAS3.9 EFECTO DE LA LS SOBRE LA REFRACTARIEDAD EN

DIFERENTES FIBRAS3.10 EFECTO DE LA LS SOBRE EL VOLTAJE Y LA CORRIEWTE DE

MANTENIMIENTO EN DIFERENTES FIBRAS3. ll EFECTO DE LA LS SOBRE EL DIÁMETRO EN FIBRAS ESQUELÉTICAS

DE ANFIBIO

34

34353839

41

42

43

45

47

47

485 1

53

54

55

57

59

IV DISCUSIÓN 61

V CONCLUSIONES 64

VI BIBLIOGRAFÍA 65

1. INTRODUCCIÓN

La conversión de energía química en movimiento mecánico en el músculo, es un tema relevanteen el estudio de la fisiología muscular. El aporte energético del adenosin trifosfato (ATP), la interacción deproteínas contractiles en las sarcómeras y el papel central que juega el calcio (Ca++) proveniente delretículo sarcoplásmico (RS) en la mecánica muscular son fenómenos en continua investigación a nivelmundial; por otro lado, el estudio de la comunicación entre el Sistema Nervioso Central (SNC) y el músculose centra en la fisiología de la sinápsis neuro-muscular denominada “placa neuromuscular” de la cual, estaperfectamente establecido que la despolarización de la membrana presrnáptica por arribo de potenciales deacción (cuya naturaleza es de Na+ y K+) generados en los conos axónicos de las neuronas motoras induceun cambio en el potencial de dicha membrana, lo que a su vez, genera la entrada de iones Ca++ en lasterminales nerviosas desencadenando una cascada de eventos cuyo resultado final será el vaciamiento delneurotransmisor (acetilcolina) en el espacio sináptico; la unión de este neurotransmisor con su receptorespecifico situado en la membrana postsináptica provoca cambios locales en la conductancia de lamembrana (Gm) despolarizandola y generando (si se alcanza el umbral) potenciales de acción (PA) queviajan autorregenerandose sobre la superficie membrana1 de la fibra muscular y despolarizando también,radialmente , el sistema tubular transverso (túbulo T).

Actualmente se conoce muy bien que la despolarización del túbulo T a nivel de la triada (estructuramembranal constituida por el túbulo T y dos membranas cisternales situadas a ambos lados), comanda laapertura de canales de Ca++ de la cisterna terminal (CT) del retículo sarcoplásmico, incrementándose laconcentración libre de Ca++ en el mioplasma activando, de esta manera, la cascada de eventos para que sepresente la contracción en un proceso denominado acople excitación contracción (AEC).

Dentro del estudio de la tisiología muscular, la investigación sobre el AEC es quizás uno de loscampos más estudiados y ha generado gran cantidad de trabajos publicados sobre el tema. Para estudiar elAEC en nuestra situación experimental se hizo necesario inhibir la contracción, lo cual pudo lograrsemediante dos maniobras: a) utilizando altas concentraciones de amortiguadores de Ca++ en solucionesinternas que permitan amortiguar el Ca++ del mioplasma ( García J, Pizarro G, Ríos E, and Stefani E.,1991 ) y b) estirando la fibra muscular a longitudes de sarcómera (LS) mayores de 3.6 Pm ( Huxley andPeachey 196 1; y Csernoch L, Pizarro G, Uribe 1, Ríos E., 199 1).

Estirar la fibra muscular entre 3.6 y 4.0 um de LS inhibe la contracción , sin embargo laliberación de Ca++ desde el RS que se presenta es normal (Csernoch L, Pizarro G, Uribe 1, and Ríos 1991),y algunas respuestas eléctricas de la membrana talcs corno la generación y la velocidad de conducción depotenciales de acción, muestran cambios mínimos al estiramiento ( Martin A.R., 1954 ). Cuando las fibrasson estiradas a LS mayores de 4.0 um, probablemente debido a una alteración del ABC , tienen inhibida laliberación de Ca++ desde el RS, como lo demuestra los trabajos realizados en 1974 por Taylor S.R, RudelR, y Blinks J, quienes utilizando la aequorina,- que es una proteína bioluminosa sensible al Ca++ -,observaron que en fibras musculares inyectadas con esta proteína y estiradas a LS mayores a 4.0 umpresentaban flujos de liberación de Ca++ disminuidos cuando eran sometidas a diferentes patrones deestimulación, manifestándose tanto en la sacudida simple como en el tétanos. Por otro lado, Baylor S M, yOetliker en 1976, utilizando senales ópticas birrefringentes en fibra muscular esquelética, demostraron quees posible captar una disminución en la liberación de Ca++ desde el RS como una imagen refringentereducida a LS mayor de 4.0 km.

El AEC es un fenómeno fisiológico que ha sido estudiado desde hace varias décadas, sin embargo,aún se desconoce el mecanismo mediante el cual se establece la comunicación intima entre las membranasdel sistema tubular transverso y retículo sarcoplásmico de la fibra muscular esquelética. En 1973, Schneidery Chandler obtuvieron una corriente capacitiva no lineal (movimiento de carga) que se genera en fibrapolarizada ante pulsos despolarizantes, postulando que corresponde al registro electrofisiológico de unsensor de voltaje para el AEC; desde entonces, los trabajos de estos autores apoyan la hipótesis delmovimiento de carga para explicar el AEC. La presencia de sensores de voltaje para el AEC parece habersedemostrado a nivel de membrana tubular (Eduardo Ríos and Gonzalo Pizarro, 1988; y William S. Agnew.1988).

En 1991, Pizarro G, Fitts R, Uribe 1, y Ríos E reportaron que en ausencia de movimiento de carga nose presenta liberación de calcio.

También en 1991, Ríos E. y Uribe 1 (comentario personal), encuentran que al estirar la fibramuscular a LS mayores de 4.0 um, se inhibe la liberación de calcio desde el RS. En 1992, Uribe 1, CandiaR, y Hernández, encontraron que el movimiento de carga es inhibido cuando la fibra esquelética es estiradaa LS de 4.5 pm, sin embargo, reportaron la presencia de corriente de Ca++ de características normales bajoestas mismas condiciones experimentales.

En base a los antecedentes mencionados, creemos que la ausencia de liberación de Ca++ desde el RScuando las libras son estiradas a LS mayores de 4.0 um se debe, muy probablemente a una alteración anivel del AEC, cuyas causas pueden ser múltiples. La alteración en el AEC puede deberse a una lesión de lamembrana tubular, sin embargo continúan registrándose corrientes de Ca++ normales (véase mas arriba).Además, (comentario personal) Uribe 1 y Valdiosera R, muy recientemente han registrado mediantemediciones de impedancia, capacitancias del orden de 6-8 pF/cmL, lo cual nos habla de una integridad de lamembrana.

Por otro lado, desconocemos el estado electrofisiológico de la membrana a la LS de 4.5 um que, encaso de estar afectado, explicaría la alteración del AEC. Para descartar esta posibilidad, estudiamos elestado electrofisiológico de la membrana en fibras estiradas a LS de 4.56 um, aportando datos quecontribuyen a esclarecer el mecanismo del AEC.

Se utilizan libras esqueléticas de anfibio sometidas a diferentes longitudes de sarcómera (desde elreposo hasta 4.56 um) además, en base a nuestra situación experimental, se combina la acción deamortiguadores de Ca++ (EGTA) y el estiramiento de fibras aisladas como mecanismo para inhibir lacontracción. Se analiza el efecto que este cambio de LS ejerce sobre algunas propiedades eléctricas de lamembrana (PEM), tales como las respuestas lineales (RL) o electrotónicas. el potencial de acción (PA), larelación intensidad-duración (I-D) y la refractariedad de la fibra.

Demostrar la persistencia de las respuestas de membrana anteriormente citadas cuyas característicasdeben ser semejantes a las obtenidas en fibras no estiradas, constituye el objetivo principal de trabajo, quees demostrar la integridad de la membrana a LS mayores de 4.0 um.

Al demostrar la integridad electrotisiológica de la membrana a la LS anteriormente citada, se apoyanuestra hipótesis de trabajo: La supresión en la liberación de Ca++ desde el RS, es consecuencia de unaalteración primaria a nivel de la comunicación entre las entidades proteicas que participan en el AEC, y nopor lesión de la fibra muscular.

2

1.1. ACOPLE EXCITACIÓN-CONTRACCIÓN.

antecedentes y justificación

La comunicación entre las membranas del sistema tubular transverso y del retículosarcoplásmico se conoce como acople excitacióncontracción (ABC) y, muy probablemente,corresponde a un conjunto de eventos cuyo resultado final es la apertura de canales de liberación deCa++ localizados en la membrana reticular. Se desconocen los mecanismos íntimos de lacomunicación entre ambas membranas. Estudios recientes establecen que el AEC se lleva a caboentre dos entidades proteicas, una de ellas corresponde a un receptor a dihidropiridinas @HP) quese localiza en la membrana del túbulo T exactamente “enfrente” de la otra, que es el receptor arianodina localizada en la membrana de la cisterna terminal (YB. Ríos and G. Pizarro 1988; y WillianS. Agnew 1988). Al receptor a DHP se le ha adjudicado el papel de sensor de voltaje (E. Ríos y G.Brum, 1987), mientras que al receptor a rianodina se le adjudica un simple papel pasivo; esto es, ladespolarización de la membrana tubular es sensado por el receptor a DHP el cual comanda, dealguna manera, la apertura de los canales de liberación de Ca++ (receptor a rianodina) de la cisternaterminal.

Existen trabajos con miscroscopía electrónica que refieren sistemáticamente un espacio entre 10 y20 nm entre ambas membranas de la triada y por consiguiente entre las entidades proteicas que participanen el ABC.

Las hipótesis propuestas para explicar la “comunicación” entre ambas entidades proteicas a nivel dela triada son de cinco tipos :

1.2 HIPÓTESIS PROPUESTAS PARA EXPLICAR EL AEC:

a) Transmisión química.

Propuesta por Vergara y col. (198.5) esta hipótesis sugiere que la despolarización de la membranatubular “activa” una fosfolipasa (localizada en, o muy cerca de la membrana) degradando un fosfoglicerido(fosfatidil-inositol-trifosfato) en diacilglicerol e inositol-trifosfato (IP3); el primero permanece en lamembrana, y el grupo polar IP3 (anclado durante el reposo en la cara interna de la membrana tubular )cruza el espacio entre las membrana de la triada para unirse a receptores específicos activandoconsecuentemente, los canales de liberación de Ca++ de la cisterna terminal. Una vez terminada su función,es degradado por procesos enzimáticos y recuperado por la membrana tubular.

En apoyo a esta hipótesis, los autores (Vergara y col.) proporcionan evidencias experimentales dondese aprecia la inducción de liberación de Ca++ por efecto del IP3 (ver Vergara y col 1985). Sin embargo,existe duda del posible papel de este “transmisor”. Además de ello, la relación tan estrecha entre ambasentidades proteicas responsables del ABC, podría descartar una activación por transmisión química ( amenos que el transmisor forme parte del receptor a DHP). Es posible un efecto modulador del IP3 oactivación de canales de liberación sensibles que estuviesen “aportando” un componente en el transiente deCa++.

3

b) Continuidad eléctrica.

Formulada en detalle por Mathias y col. (1980) esta hipótesis, propone la existencia de unaconductancia que conecta eléctricamente la membrana tubular con la de la cisterna terminal; Planteado deesta manera, es fácil entender que una vez generado el potencial de acción a nivel de la placaneuromuscular y su viaje al interior de la fibra muscular a través del sistema tubular, la despolarización dela membrana tubular generaría una corriente hacia la cisterna terminal despolarizando consecuentementela membrana reticular a nivel de la triada. Esta despolarización genera corrientes de membrana del retículoque, en forma de potencial de acción reticular o simples cambios de potenciales locales explicaríafácilmente la liberación de Ca++ para la contracción (ver Mathias R.T., 1980).

Desgraciadamente la interrelación tan estrecha entre los receptores a DHP y rianodina (10 a 20 nm),indicaría que la hipotética continuidad eléctrica fuese a este nivel y, como se indicó, el receptor a rianodinacorresponde a los canales de liberación de Ca++, de tal forma que la comunicación eléctrica entre el exteriorde la fibra (espacio tubular) e interior de la cisterna terminal no puede ser entre ambas entidades proteicasresponsable del AEC; en otras palabras, no es posible pensar en un flujo de corriente del túbulo hacia lacisterna a través de la misma vía por donde sale el Ca++ proveniente del interior de la cisterna hacia elmioplasma. En cualquier caso, es claro que esta hipotesis no ha sido favorecida por hallazgosexperimentales, sino que por lo contrario, cada vez se acepta más la inexistencia de comunicación eléctricaentre ambas membranas.

Por otro lado, a nivel de la triada no se han observado otras moléculas de naturaleza proteica queindicasen una continuidad eléctrica, sin embargo su inexistencia aún no ha sido comprobada.

c) Movimiento de carga.

Propuesta originalmente por Schneider y Chandler (1973) es la hipótesis que más evidenciasespcrimentales ha acumulado desde su postulación. Propone la existencia de “sensores de voltaje” en lamembrana tubular que, como respuesta al cambio de potencial se “mueven” o modifican su estructura enel campo eléctrico de la membrana (lo cual genera corrientes capacitivas suceptibles de ser detectadas)activando mecánicamente los canales de liberación de Ca++ de la cisterna terminal; En otras palabras, elsensor mantiene cerrado (como si este fuese su compuerta) al canal de liberación de Ca++ en el reposo, ydurante la despolarización se desplaza “abriendo” los canales.

Schneider y Chandler muestran la existencia de corrientes capacitivas no lineales que se generan enfibra polarizada como respuesta a pulsos despolarizantes que parten de diferentes potenciales de membrana.La figura 1 refiere el experimento original publicado por estos autores que, utilizando la técnica de fijaciónde voltaje de tres micro electrodos, y sustituyendo el sodio externo con tetraetilamonio (TEA+), muestracomo a la respuesta que partió del potencial de reposo, se le restan las obtenidas, a valores más negativos,obteniéndose así los transientes capacitivos no lineales que son interpretados como movimiento de carga.

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mQm.25rrkr)8 - 6107mv. 251nW

LOO weg

Figura No.1 Movimiento de carga. En A se tiene representada la técnica de fijación de voltajede tres micro electrodos. En B se tienen dos pulsos (a y b) de la misma magnitud que parten dedistintos niveles de polarización con sus respectivas respuestas de membrana. En C se tiene la restaentre la obtenida a nivel de polarización normal (-79mV) menos la respuesta a niveles mayores. Lasolución externa contiene TEA+ isotónico ( en presencia de 10-6 g/ml de TTX) y sacarosa 350 mMpara inhibir la contracción (tomado de Schneider and Chandler, 1973).

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Independientemente de que los transientes capacitivos (Schneider y Chandler, 1973) interpretadoscomo movimiento de carga correspondan o no al “desplazamiento” de los sensores de voltaje dentro delcampo eléctrico de la membrana y sea cual fuere la manera en que comanda la apertura de los canales deliberación, existe una relación lineal entre la carga y la liberacibn de Ca++ del reticulo sarcoplásmico(Kovacs L., Ríos E., and Schneider M.F., 1979 ; véase también Ríos and Brum, 1987); indicando unainterrelación entre ambos eventos (movimiento de carga y liberación de Ca++).

d) Liberación de calcio inducida por calcio.

Probablemente, la primera interrelación de un fenómeno de liberación de Ca* por Ca++ fuepublicada en 1958 por Frank; posteriormente fue demostrado y ampliamente estudiado en fibra estriada porM. Endo (1985); Su papel preponderante en el AEC en fibra cardiaca, quedó plenamente establecido con lostrabajos de Fabiato y Fabiato (1975a). Desgraciadamente en músculo esquelético no parece ejercer un papelpreponderante en el AEC dado que la fibra continua contrayéndose aún en ausencia total de Ca++ externo(Gonzalez-Serratos H., Valle-Aguilera R, Lathrop D.A. and García M. del C., 1982);

En 1985, Endo publicó un trabajo donde relaciona la liberación de Ca++ del RS en función de laconcentración de Ca++, observando una clara inducción de la liberación de Ca++ desde el RS aconcentraciones externas de Ca++ de 104 a 10-5 M. ( Ver Endo M., 1985).

e) Regulación alostérica.

Enunciada recientemente por el Dr. E. Ríos y M. Karhanek en 1993. Esta hipótesis sugiere laexistencia de una regulación de tipo alostérica entre las 2 entidades proteicas que participan en el AEC(receptor a DHP y receptor a rianodina) del músculo esquelético. Esta interacción esta formuladacuantitativamente en el modelo alostérico de transición que se presenta en la hemoglobina ( Monod J.,Wyman J., and Changeux P., 1965) y análogo a un modelo propuesto por Marks y Jones (1992) para loscanales de Ca++ dependientes de voltaje. En este caso, la proteína alostérica es el canal liberador de Ca++del RS (receptor a rianodina) un hornotetrámero con dos estados posibles: abierto o cerrado. La cinética yequilibrio de esta transición es modulada por el sensor a voltaje (receptor a DHP).

Independientemente de que esta hipótesis resulte cierta, es motivo de discusión y resta mucho trabajopara que pueda ser aceptada como la hipótesis que explique el AEC.

1.3. PROPIEDADES FISIOLÓGICAS Y CARACTERÍSTICAS MORFOLdGICASDE LAS FIBRAS MUSCULARES ESQUELÉTICAS

La caracterización de estas estructuras se ha efectuado desde varios puntos de vista, entre los quedestacan: a) su excitabilidad, b) su inervación y c) su estructura y ultra estructura entre otras.

a) EXCITABILIDAD: Al estimular eléctricamente a las fibras musculares esqueléticas con pulsosunitarios, estas pueden responder con contracciones que exhiben diferentes cursos temporales o incluso noresponden. Las fibras musculares pueden responder con una sacudida rápida (fibras de sacudida rápida)cuyo curso temporal es muy breve, o una sacudida de curso temporal muy lento (fibras de sacudida lenta).Sin embargo, a diferencia de estos dos tipos de fibras musculares esqueléticas existe un tercer tipo que noresponde a la estimulación eléctrica pero responde cuando es colocada en soluciones despolarizantes (altopotasio) generando una contracción lenta que persiste mientras la fibra permanece inmersa en dichasolución. Este tipo de fibras son llamadas fibras musculares tónicas (Kuffter y Vaughan 1953; Hodgking yHorowickz 1960). De esta manera, las fibras musculares esqueléticas son clasificadas en 3 grupos: a) fibrasrápidas o de sacudida rápida, b) fibras lentas o de sacudida lenta y c) fibras musculares tónicas.

b) INERVACIÓN: La fibra muscular rápida en el anfibio se caracteriza por estar inervada por una placanerviosa terminal del tipo “Endbuschell”, la cual se extiende a lo largo de la fibra muscular cubriendo unárea relativamente grande de la misma (Hess 1960; Peachey y Huxley 1962); Los axones que inervan a

tales fibras son gruesos con velocidades de conducción de 8 a 40 m/seg, mientras que las fibras tónicas estáninervadas por axones más delgados cuyas velocidades de conducción varían entre 2 y 8 rnkeg (Kufller yVaughan 1953).

A su vez, en la fibra muscular estriada lenta, la inervación que se presenta es del tipo múltiple ymuestra varias terminaciones en placas distribuidas a lo largo de la fibra cuya forma recuerda a un racimode uvas. Es pertinente señalar que en el mamifero son escasos los músculos esqueléticos que poseen fibraslentas. Estas han sido descritas en el músculo tensor del tímpano y el estampedio del gato (Fernand y Hess1969) y en el musculo estriado del esófago del gato (Floyd 1973).

La caracterización precisa del tipo de fibra muscular se consiguió gracias a la aplicación de latécnica de la colinesterasa (Hess 1960; Peachey y Huxley 1962; Karnovsky 1964; Hess 1970); por otro lado,el patrón de inervación tanto de las fibras musculares estriadas rápidas como de las lentas del mamífero essimilar a las del anfibio aunque con algunas diferencias morfológicas.

c) ESTRUCTURA Y ULTRA ESTRUCTURA:

Las fibras rápidas en el anfibio se caracterizan por la organización de sus miofíbrillas que es del tipofibrilar, con un retículo sarcoplásmico bien desarrollado, que responden con un potencial de acción al serestimuladas, propiedades que permiten que su actividad mecánica sea fásica y que cuenten ademas con unmecanismo intracelular eficiente y rápido para la liberación y captura del Ca++ durante la misma;presentan triadas en la linea Z que es recta, y los pliegues postsinápticos del sarcolema están biendesarrollados.

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En el mamifero, las fibras rápidas presentan iguales características excepto que las triadas selocalizan en la unión de las bandas A-I. Por otra parte en la fibra muscular tónica, las miofibrillas presentanun arreglo estructural del tipo de campo (ver cuadro l), con escaso retículo sarcoplásmico , carecen depotencial de acción pero presentan potencial de unión, características importantes para que su actividadmecánica sea tónica, cuyo desarrollo depende en buena medida del Ca++ extracelular; ademas presentanausencia virtuaI de triadas; la linea Z es dentada o en zig-zag y los pliegues postsinápticos del sarcolemaestán poco desarrollados.

En el mamífero la fibra muscular tónica posee las mismas características que acaban de Malarespara las fibras musculares del anfibio (Hess y Pilar 1963; Ninomiya, Echeverría y Vazques-Nin 1981). Elcuadro No 1 resume las características anteriormente seííaladas.

Por otra parte un aspecto de singular importancia en la fisiología del musculo esquelético, consisteen el estudio de los mecanismos involucrados en la regulación nerviosa de la actividad en las fibrasmusculares esqueléticas. Se sabe, por ejemplo, que la influencia nerviosa es fundamental para elestablecimiento de sus propiedades fisiológicas.

Es importante destacar la importancia de esas propiedades para la adecuada comprension de lapatología del músculo esquelético. No puede dejar de mencionarse, por lo demás, que el estudio demiopatías ha ayudado a comprender los mecanismos fisiológicos normales, lo que subraya la importanciadel estudio del músculo esquelético enfermo o bien, de sus modelos con alguna disfunción producidamediante procedimientos experimentales.

CUADRO 1. Caracterfsticas de la Inervacibn, Estructura y Ultraestructura de las Fibras

ITusculares Estriadas Rápidas y Lentas en el Anfibio y en el Mamífero.-.

tipo de inervación organización de retículo triadas linea M linea i! Pliegues postsinápticos

fibras las fibras sarcoplá~ del sarcolema

lmico

( 1 ) Rápidas

(anfibio)

en placa f ib r i l a r bien desa- l í n e a 2 .presente, , . recta bien desarrollados(“Endbuschel”) (“fibrillen-

\rrollado

struktur”)

(1) lentas en racimo

(anfibio) de uvas

e n c a m p o

(“Felderstruktur”)

poco desa- virtual- ausente d e n t a d a poco desarrolladosrrollado mente au- 0 ausentes

sentes

(2) de sacudi- en placa f ibrilar bien desa- unión ban presente rectada (mamí- (“Fibrillen- rrollado dasA.

poco desarrollados

fero) struktur”)

(3) tónicas en racimo en canpo poco desa- virtual- presente dentada poco desarrolladas(mamífero) de uvas (“Felderstruktur”) rrollado mente ag

sentes

(1) Hess, A. (1970) Physiol. Rev., 50: 40532..

(2) Hess, A. & Pilar, G. (1963) J. Physiol., 169: 760-798.

(3) Ninomiya, Echeverría L Vázquez-Nin, (1961) Acta Anat., 111: 240-246

Tomado de músculo esqueléltico y cardiaco (bases fisiológicas). Sociedad mexicana deciencias fisiológicas. Cap. 5 : 195-235, 1987.

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HIPÓTESIS DE TRABAJO:

De lo anteriormente expuesto, es claro que aun se desconoce el mecanismo que desencadena elacople excitación-contracción (AEC) en fibra esquelética. La hipótesis que más evidencias experimentalesha aportado a su favor para explicar el AEC es el movimiento de carga intramembrana propuestooriginalmente por Schneider y Chandler en 1973; en apoyo a esta hipótesis existen trabajos muy solidos,ejemplo de ello son los realizados en 1979 por Kovacs, Ríos y Schneider quienes demostraron una relaciónlineal entre el movimiento de carga y la liberación de calcio desde el BS, también en 1991 Pizarro, Uribe,Ríos y Fitts reportaron que en ausecia de movimiento de carga no se presenta liberación de calcio del KS.

Tomando en cuenta los antecedentes previamente mencionados respecto al estudio del AEC, y enparticular el hecho de que en fibras esqueléticas estiradas a longitudes de sarcómera mayores a 4.0 prn nose presente liberación de calcio ni movimiento de carga, es factible pensar que tales eventos no se presentanporque probablemente las fibras se están lesionando cuando se estiran a LS entre 4.0 y 4.56 Pm, sinembargo, la existencia de corrientes de calcio de características normales en estas condiciones, sugiere queno están lesionadas, y la ausencia de registro de los eventos ya mencionados, sea por otras causas.

Basándonos en esto, nos pareció interesante conocer el estado electrofisiológico de estas fibras y enparticular el de las sobreestiradas a 4.5 Pm de LS, para lo cual, nos enfocamos a estudiar suscaracterísticas eléctricas como son: a) propiedades lineales, b) potenciales de acción, c) corrientes iónicasy d) movimiento de carga. Demostrar la persistencia de las respuestas de membrana anteriormente citadas,cuyas características deben ser semejantes a las obtenidas en fibras no estiradas, constituye el objetivoprincipal de nuestro trabajo, que es demostrar la integridad de la membrana a LS mayores a 4.0 Pm. Elpresente trabajo solamente reporta los resultados obtenidos respecto a las dos primeras característicasektricas de la membrana ya mencionadas.

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I I . M E T O D O L O G Í A

Para la realización de los experimentos se utilizaron ranas de la especie pipiens, las cuales fueronalimentadas con alimento infantil variado (Gerber), administrado a través de una sonda gástrica. Las ranasfueron mantenidas a temperatura de 24 +/- 2 “C dentro del laboratorio.

2.1 DISECCIÓN Y MONTAJE

Las ranas fueron sacrifícadas por decapitación destruyéndoseles posteriormente la médula espinalcon un estilete. Bajo microscopio de disección (Unitron ZSB) se lleva a cabo la obtención del musculosemitendinoso (ST) procediéndose a disecar ambos fascículos (ventral y dorsal), de los cuales solo el dorsales trasladado y fíjado con minucias a una caja de petri con resina transparente en el fondo (Sylgard).Durante el traslado y fijación, el músculo se mantiene inmerso en una solución de Ringer normal (versoluciones), en la cual se quita el exceso de tejido conectivo y se prepara al músculo para la obtención defibra única. Posteriormente la solución Ringer es sustituida por una solución isotónica de potasio (soluciónrelajante, ver soluciones) donde se lleva a cabo la obtención de la fibra , siendo trasladada posteriormente ala cámara de registro que ha sido previamente preparada con vaselina e inundada con solución interna (versoluciones). La cámara de registro esta hecha de lucita con una partición central de aproximadamente 230um, dividiéndola en tres compartimentos: a) uno central (compartimento A), en cuyo eje longitudinal sedeposita la fibra, y donde un segmento de aproximadamente 230 pm es sometido a fijación de corriente unavez que son colocados los dos sellos de vaselina; este compartimento central, que en su parte media divide alos laterales, se amplifica en sus extremos a manera de 2 cubetas por extremo (ver figura 2) para permitir lacolocación de los electrodos de registro que consisten en puentes de agar (agar/KCl 1 molar ) cuyaresistencia va de 1 a 3 KQ y b) dos compartimentos laterales (compartimentos B y C ) los cuales durante laprimera fase del experimento (obtención, traslado y montaje de la fibra) se encuentran inundados desolución interna, además, contienen los pedestales a los cuales se tijan los extremos de la fibra durante elestiramiento.

z CdMARA EXPERIMENTAL DE REGISTRO

Figura 2. El compartimento A separa en su parte central a los laterales (C y B) por un espacio deaproximadamente 230 prn que es la longitud de la fibra utilizada durante la fijación de corriente.Durante la obtención de respuestas membranales el compartimento central permanece inundado porsolución externa y los laterales con solución interna (ver soluciones).

1 0

2.1.1 Preparación de la cámara de registro experimental:

Antes de colocar la fibra en la cámara, esta es preparada siguiendo la siguiente secuencia:Q a) Se lubrica la superficie externa con una fina capa de vaselina al 100% para evitar que posibles

derrames de liquido establezcan una continuidad eléctrica entre la cámara de experimentación y lasuperficie metálica sobre la cual se deposita.

b) Se coloca una pared de vaselina al 100% (no mayor de 0.5 cm de altura) en los bordes de lasuperficie de la cámara y alrededor de los límites de los compartimentos laterales.

c) La cámara es inundada con solución interna en un primer tiempo.d) Encima de los bordes que limitan la partición central, se coloca una pequefia pared de vaselina al

75% tratando de respetar la distancia que existe entre ambos bordes que es de 230 micras y, con un disectorde cristal , se asegura el contacto de la vaselina a la superficie de lucita.

e) Se procede a colocar los pedestales en cada compartimento lateral, para lo cual, primero se aplicaen el fondo de cada compartimento una capa relativamente gruesa de vaselina fibrosa (hecha en ellaboratorio) sobre la cual se fijan los pedestales, a los que se les aplica en su superficie una capa de vaselinafibrosa que junto con unos pedazos de cinta diurex contribuirán a la fijación de la fibra durante suestiramiento.

De esta manera, la cámara de registro se encuentra preparada para recibir a la fibra muscular única

2.1.2 Traslado y montaje de la fibra muscular única

Una vez disecada la fibra muscular y bajo control microscópico, es transportada a la cámara deregistro utilizando para ello un pedazo de película, procurando que el volumen acarreado de soluciónrelajante sea mínimo, de tal manera que la contaminación de la solución interna que inunda a la cámaratambién sea mínima. Una vez depositada, utilizando finas pinzas de disección, la fibra es transportadahacia el compartimento central, donde es depositada sobre el eje longitudinal de la partición. Posteriormentese procede a la fijación de cada uno de los extremos de la fibra sobre la superficie de los pedestales quecontienen vaselina fibrosa. Una vez fijada la fibra, a nivel de ambos bordes de la particibn central, se aplicauna segunda pared de vaselina al 75% que cubre lo ancho de la fibra inmediatamente por encima de lavaselina que contacta con la lucita, realizando de esta manera la formación de los sellos. Se deja unsegmento de fibra muscular de aproximadamente 230 micras en el compartimento central entre ambossellos. Bajo estas condiciones, se realizan pequefios cortes de membrana en los extremos de la fibralocalizados en los compartimentos laterales, lo más cercano a los sellos de vaselina, de tal manera que laresistencia longitudinal interna del segmento de fibra en experimentación sea mínima. Así, se asegura lacomunicación de la solución interna que inunda a la camara con el medio intracelular. pja el nivel dela solución interna por succión, aislando eléctricamente a los distintos compartimentos gracias a lascaracterísticas dieléctricas de la vaselina y, dado que la solución que se tiene en el medio interno y elexterno es la misma, se espera obtener un potencial y una corriente de membrana de cero_/-f5osteriormentese montan los electrodos (ver figura 3) que consisten en puentes de agar cuya reststencia es deaproximadamente 1-3 m a los diferentes compartimentos y se traslada al sistema de registro; donde, encaso de que el potencia1 de membrana no sea cero (potencia1 D.C.), seajusta hasta alcanzar este valor en elregistro del potencial (compensación de D.C.).

l l

Una vez realizada la compensación se lleva a cabo, en un segundo tiempo, el cambio de la solucióninterna del compartimento central por Ringer normal permitiendo, de esta manera y a nivel del segmento defibra en experimentación, las diferencias de potencial (Em) existentes entre el medio interno y externo de lafibra. Con esto tenemos a nuestra fibra montada y lista para ser conectada eléctricamente al amplificador decontrol.

2.1.3 Montaje de la cámara experimental al sistema de registro.

El montaje de la cámara experimental al sistema general de registro consta de dos fases:1) en una primera fase, como se observa en la figura 3, la cámara experimental es depositada sobre otraplataforma de lucita y los diferentes compartimentos de la cámara (A, B y C) son comunicados a través depuentes de agar a 5 depósitos (cubetas) que posee, la plataforma. Cada una de estas cubetas esta llena deKCl 1M y posee en su interior un pelet de plata clorurada (Ag/AgCl2 ); Además, cada cubeta de laplataforma presenta una entrada (o salida) que le permite ser conectada al sistema general de fijación decorriente (ver fígura 3).

2) En una segunda fase, la cámara experimental es conectada al sistema general de registro (ver figura 4).

MONTAJE DE LA CdMARA EXPERIMENTALAL SISTEMA GENERAL DE REGiSTRO

Figura 3. Cámara experimental montada y conectada a los diferentes compartimentos, loscuales, a su vez son conectados al sistema de registro a travh de puentes de agar a los pelets deAglAgCI2 localizados dentro de las cubetas llenas de KCI lM, y de aquí, al dispositivo electrónicoutilizado para la obtención de las señales biológicas.

1 2

2.2 CARACTERíSTICAS DE LA PREPARACIÓN :

- a) La constante dieléctrica de la vaselina permite una resistencia a través de ella de más de 10megaohmios (Mn).

* b) La resistencia de los sellos que permiten un adecuado registro, no debe ser menor de 10 Mn.

c) La solución interna que penetra al interior de la fibra, permite una isopotencialidad entre elintehor y el exterior, impidiendo de esta manera el flujo de corriente a través de la membrana.

d) La longitud de la fíbra (230 um) colocada en el compartimento central y entre los dos sellos devaselina, permite un adecuado control de la corriente en toda el área correspondiente a este compartimento;contribuye a esto la cercanía, a los sellos, de las incisiones hechas a la fibra en los compartimentos laterales,lo cual se explica por una reducción de la resistencia longitudinal (del mioplasma) al paso de la corriente entanto menor distancia exista entre el sitio de inyección y la membrana sometida a experimentación.

4 e) La presencia de Ringer normal en el compartimento central permite, bajo control del voltaje, elregistro de corrientes iónicas y bajo control de corriente, el registro del voltaje.

f) Bajo control microscópico es factible determinar las dimensiones de la fibra, para lo cual,utilizando una regla de 100 um, se gradúa una cuadricula de diez divisiones utilizando un objetivo de 40x,proporcionando así una calibración de ll.4 um por división, de esta manera, contando el número dedivisiones existentes de borde a borde de la fibra muscular, es posible determinar el diámetro de la fibra; porotro lado, conociendo el número de sarcómeras observadas en una división, la longitud de sarcómera puedecalcularse por simple regla de tres.

13

2.3 SOLUCIONES EXPERIMENTALES:

La composición de la solución externa o Ringer normal utilizada para llevar a cabo la disección delmúsculo semitendinoso, así como el cambio de solución en el compartimento central, cuenta con lossiguientes compuestos:

NaCl : 122.0 mMKCl : 5.0 mMCaC12. 2.0 mh4K mops: 5.0 mM

La solución isotónica de potasio (solución relajante) utilizada durante la diseccibn y obtención de lafibra única, cuenta con los siguientes compuestos:

CH3S03K : 1350;”Na mops:K2 EGTA: 0.1 mM

La solución utilizada para inundar la cámara de registro en una primera fase y que establececontinuidad con el medio intracelular una vez hechas las incisiones en la fibra, consta de lo siguiente:

K2 EGTA : 82.0 mMNaCl : 5.0 mMK mops : 5.0 mMATVW9: 2.0 mi4

En todos los casos, el EGTA fue titulado con hidróxido de potasio (KOH) a pH 7.0, al cual seobtiene una equimolaridad y proporciona el compuesto utilizado en las soluciones madres, que es K2EGTA.

Por otro lado, el Mops fue titulado con KOH (K mops) o con NaOH (Na mops), según el caso, a pH7.1

La solución interna fue preparada y refrigerada sin agregársele el ATP(Mg), el cual se agregódurante la realización del experimento, preparando solamente 10 ml de solución interna-ATP por fibramontada.

Todas las soluciones presentan una osmolaridad calculada a partir de las relaciones estequiométricasde los compuestos, de 270 miliosmoles por litro:

14

2.4 REGISTROS ELÉCTRICOS:

2.4.1 Conexiones eléctricas de la cámara experimental:

En el presente proyecto experimental las fibras aisladas fueron sometidas a fijación de corriente conla técnica de dos sellos de vaselina desarrollada por Dodge y Frankenhauser (1958) y modificada porKovacs y Schneider (1978) para el registro de voltaje en fibras musculares esqueléticas de anfibio.

El sistema de fijación de corriente al cual es conectada la cámara experimental, se muestraesquemáticamente y de manera simplificada en la figura 4.

FIJAClóN DE CORRIENTE - VOLTAJE

iOOK

s

r v -

%I

‘\\\

if-n ‘I .IDA)

Figura 4. Cámara experimental conectada al circuito de fijación de corriente. En la partecentral se muestra a la fibra muscular depositada en la cámara experimental y extendiendose desdeun compartimento lateral a otro (II y C) atravesando la partición central del compartimento A que esdonde se encuentran el segmento (230 Pm) sometido a fijación de corriente. En el lado derecho de lafigura se ilustra el circuito electrónico responsable del registro del Em e Im; en la parte izquierda, semuestra el dispositivo utilizado en la fijación de corriente y estimulación de la fibra.

15

* 2.4.2 Descripción de las conexiones de la cámara experimental al sistema de fijación de corriente:

Como puede observarse en la figura No 4, la fibra muscular depositada en la cámara experimental seextiende desde un compartimento lateral al otro pasando por el central delimitado por los sellos de vaselina;las seííales registradas por el electrodo del compartimento lateral (B) junto con las registradas por elelectrodo del compartimento centra1 (A), ingresan a un amplificador operacional AD52 1 de alta impedanciade entrada (Amplificador No. 1) cuya pata positiva se conecta a una resistencia de retroalimentación de 10 KR. De esta manera, a la salida del amplificador se obtiene una señal amplifícada por 10, y el potencial demembrana (Em) es obtenido como la diferencia existente entre el exterior y el interior de la fibra. Otroamplificador AD521 (No. 2) es utilizado para amplificar la sefial .

La corriente de membrana (Im), es registrada por dos electrodos que registran Míales desde elcompartimento central (A) el cual es sometido a fijación de corriente; la setal de uno de los electrodos,ingresa a un amplificador operacional 356 de alta impedancia de entrada (Amplificador No.3) a través desu pata negativa, cuyo voltaje será el mismo (signo contrario) que a la salida del amplificador. Por otro lado,el otro electrodo se conecta a la resistencia de retroalimentación de 100 KR. De esta manera, la corriente demembrana es registrada por el amplificador No 4 como la caída de voltaje en la resistencia de 100 KR (elamplificador tiene diferentes ganancias que permite amplificar la seiíal).

A través del electrodo colocado en el compartimento lateral (C) de la cámara experimental, sonaplicados tanto el voltaje comando (Vcom) como el voltaje de mantenimiento (Vh), los cuales ingresan a unamplificador operacional 356 de alta impedancia de entrada (amplificador No 5) a través de su patanegativa, punto en el cual también se conecta una resistencia de retroalimentación de 10 K!X De estamanera, al pasar por esta resistencia la corriente inyectada, se obtiene un factor de 0.1 en la aplicación deVh y 0.021 en el de Vcom y, por lo tanto, por cada volt que se comanda, se aplica a la fibra a través delelectrodo de estimulación 100 mV de Vh y 21 mV de Vcom respectivamente, estando el sistema en fijaciónde corriente.

2.4.3 Adquisición y procesamiento de datos.

Una vez definidas las conexiones de la preparación experimental con el sistema de fijación decorriente, se procede a mencionar el equipo utilizado para la estimulación, la adquisición y el procesamientode datos el cual es representado como un diagrama de bloques (figura 5), constituido por los siguienteselementos:

a) La generación de los pulsos comandos para la estimulación de la preparación biológica se hizo através de un convertidor digital/analógico (DIA) ( Tecfen) de hasta 8 salidas incluido en una computadora(Jameco) 286 . Para manejarlo se utilizó un soflware (RC200a) con opción a 3 condiciones de trabajo(pasivo, activo y automático) y 12 posibles pulsos de diferentes condiciones (estados).

b) El pulso comando emitido por el convertidor D/A entra al sistema de fijación de voltaje y/ocorriente ya mencionado anteriormente en la figura No 4.

1 6

c) La respuesta de la fibra muscular que sale del sistema de fijación de corriente es amplificada: elEm por 10 y la Im por 50 en la mayoria de los experimentos realizados. Antes de ingresar al sistema decomputo, las Míales amplificadas provenientes de la fijación de corriente, son filtradas a través de un filtroButterworth pasa bajas utilizando un factor de filtración de 5 KHz tanto para el Em como la Im.

d) Posteriormente, ambas señales (Em e Im) ingresan a un circuito de amplificadores operacionales356 de 3 canales. Cada amplificador posee ganancias que van de X1 a X500. En nuestro caso, utilizamos elmínimo factor de amplificación (X1) para las dos seftales.

e) Una vez amplificadas la Males, entran de manera simultanea a un sistema de adquisición yvisualización: Los trazos de Em e Im junto con el pulso comando emitido por el convertidor D/A, sonvisualizados en un Osciloscopio (Tektronix) doble, cada uno de los cuales cuenta con dos canales conmemoria.

f) Además, dichos registros son adquiridos de manera simultanea por un convertidoranalógico/digital (A/D) (Tecfen) de hasta 16 entradas posibles, incluido dentro de una computadora(Jameco) 286. Este convertidor es manejado por un software (ISC-67) en el cual se manejó una velocidadmáxima de adquisición de 4 useg y un Buffer de 65 mseg de tamaiio.

g) El sistema de computo (Jameco) consta de un procesador 286, disco duro de 20 Mb y memoriaRam de 1Mb; Posee, además 1 unidad lectora de disco blando (A) de 5 1/4”. Los registros adquiridos sonvisualizados en un monitor de 14” CGA de color.

h) Todos los experimentos adquiridos fueron almacenados en discos blandos de alta densidad para suposterior análisis, utilizando para ello, programas disertados en el laboratorio escritos en lenguaje basic,tomando en consideración ciertas ecuaciones que describen el comportamiento de nuestros eventosbiológicos.

OBTENCIÓN Y PROCESAMIENTO DE DATOS

E

A B C D --c +RC‘wxll. cJ-L F’JDCEIoN

.FILTRO 4

D/A - CORRIENTEpsAsnJns-~~~

Fm3510 w

.

e A/D

3

ANAUYS .4

c

H

VIDEO -

1

DISCG e

I

G

COMPUTAD. 4

Figura 5. Diagrama de bloques. Obtención y procesamiento de datos

J

1 7

2.5 ECUACIONES:

2.5.1 RJZLACIbN CORRIENTE VS VOLTAJEDesglose matemzitico para el análisis de la relación corriente VS voltaje

Ajuste a una función exponencial:

Sabemos que Im = Ii f Ic donde Ii= E/R y Ic= Cm (dE/dT)

si Im es la corriente de membrana, Ii es la iónica , Ic es la corriente capacitiva , E es el voltaje, R esla resistencia y Cm es la capacitancia de la membrana, entonces tenemos que.. . .

Im = E/R + Cm (dE/dT)

Cm (dE/dT)= Im - E/R si Im=I y Cm=Ctenemos.....

IR -EC (&/dT)= ________-

R

RC (dE) = dT(IR-E)

CE dT___-__-- = -m-c ----_ - Ecuación equivalente a

I R - E R C una función de ler orden

. . . . Ahora, si hacemos un cambio de variable tenemos:

IR-E=A porloque -dE=dA=>dE=-dAy

sustituyendo estos nuevos valores en nuestra función de ler orden tenemos que....

dA dT---------= - - - - -

A C R

si integramos esta ecuación tenemos.. .

i,dNA = -1,CRldT

Si resolvemos esta integral, tenemos que....

In A - In Ao = -l/CR [T - To] donde To=O tenemos..

In A - In Ao = -T/CRSi sustituímos A donde A= IR-E y Eo=O tenemos.....

1 8

In (IR - E) - In (IR) = -T/CR y por lo tanto....

In (IR - E) = -T/CR + In (IR)

que es una ecuación que tiene semejanza a una ecuación y = mx + b y por consiguiente se puederealizar una regresión lineal donde..

Y = ln (IR-E)

m = l/CR

x=T

b = In (IR)

de esta manera, los parámetros ajustados son:

b Cyi + m Cxiyi -l/n(Cyi)2 donder = ----____--___--____-______________ n= No. de datos.

C@i2) - l/n (Cyi)2

n% - cx cym = _______________________________

n Xx2 - @x)2

cy cx2 - cxcxyb = ----_------_----_---------------

nCx2 - (Xx)2

ya una vez ajustados los valores constituyentes de la regresión lineal, se pueden expresar en suforma exponencial, obteniendo.. . . .

In (IR - E) = -T/CR + In (IR)

In (IR - E) - In (IR) = -T/CR

(IR - E)In --__---_- = -T/CR

IR

1 9

I R - E______m__ = Exp ( --l-/(--R )

I R

IR-E = IR [Exp (-T/CR)]

E = IR - IR [Exp (-TKR) ]

E = IR [ 1 - Exp(-T/CR) ] pero como CR escte. y equivaleal valor de zmtenemos que..

Em = Im Rm [l - Exp (-Thm) ] donde Tm = Cm Rm

. . . . . pero si el tiempo (T) tiende a infinito ( T ìco )

entonces Em tiende a ImRm (estado estable, ImRm = Emax ), por lo que.....

Em = Emax [ 1 - Exp (-Thm) ] . . . . Ecuación No. 1

donde Em representa el potencial de membrana obtenido a un tiempo determinado; Emax representa elpotencial de membrana alcanzado en el estado estable; T representa el tiempo y Tm es la constante detiempo de la función.

Esta función exponencial es utilizada en su expresión lineal, por el programa “poten” (verprogramas) para llevar a cabo el ajuste de los datos experimentales y realizar el ajuste del potencial demembrana a una función exponencial.

2.52 PERIODOS REFRACTARIOS

El curso del periodo refractario de una fibra muscular sigue un comportamiento exponencialcreciente, este comportamiento es semejante al que presenta la distribución de Boltzmann:

V = Vmax /[l + Exp(-V + v)/k ]

donde Vmax es el voltaje máximo alcanzado por el evento bioelécttico, ves el voltaje aI punto medio y k esuna medida de la pendiente de la curva. Sin embargo, el ajuste de nuestros resultados no es muy adecuadocon esta función, por lo cual, tomando en consideración el principio de la función utilizada para el ajustedel potencial de membrana (Em, ecuacion No.l), se implementó una función exponencial creciente yempirica (ecuación No 2) para el ajuste del periodo refractario, que es la siguiente:

20

Em = Emax [ l- Exp(-Thm)] Función No. 1 utilizada para el ajuste de Em.

Y = Ymax [l- Exp(-(x+a)/b)] . . . . . . . Ecuación No. 2

que es la función utilizada para el ajuste de datos experimentales obtenidos del periodo refractario;donde Y es la magnitud del segundo potencial de acción, Ymax representa la magnitud al pico delprimero, X representa el intervalo de tiempo entre ambos pulsos de estimulación , a y b son constantes.(b - a es la constante de tiempo de la función (Tm), -a es equivalente al periodo refractario absoluto (PRA).

linearizando la ecuación No. 2 tenemos:

Y = Ymax [l- Exp(-(x+a)/b)]

Ymax ll- Exp(-(x+a)/b)] = y

Ymax - Ymax Exp(-(x+a)/b) = Y

- Ymax Exp(-(x+a)h) = Y - Ymax

Y - Ymax- Exp(-(x+a)/b) = -v--m----

Ymax multiplicando por -1tenemos....

Ymax-YExp(-(x+a)/b) = -----_-

YIINX sacando logaritmostenemos.. . . .

- (x+a)/b) = In (Ymax-Y) -In (Ymax)

-X a--- - -..- = In (Ymax-Y) - In (Ymax)b b

-X aIn (Ymax- y) = ----- - --- + In (Ymax)

b b

1 aIn (Ymax-Y) = - --- x + [In (Ymax) - --- ]

b b

21

Esta ecuación representa la forma linearizada de la ecuacion No 2, ya que es una función del tipo Y =mx + b donde:

1m = ____-

b

b = [In (Ymax) - a- ]b

x = intervalo de tiempo entre ambos pulsos, y...

y = In (Ymax - Y) corresponde a la magnitud del 20 potencial de acción.

A). Análisis matemático y justificación de las constantes a y b introducidas en lafunción de ajuste del periodo refractario

¿Qué importancia tiene la introducción de las constantes a y b ?. Analizemos primero que representa laconstante a

,.... Partiendo de nuestra ecuación No 2 implementada para el ajuste de nustros datos tenemos.. . .

Y = Ymax [1-Exp(-(x+a)/b) ]

. . . . . . . Durante la duración del periodo refractario absoluto (PRA), la magnitud de la respuesta del 20potencial de acción es nula, esto quiere decir :

enPRA Y=O portanto

Ymax [ lExp(-(x+a)/b)] = 0

l-Exp(-(x+a)/b) = 0

I

-Exp(-(x+a)/b) = -1 multiplicando por -1

Exp(-(x+a)/b) = 1 sacando logaritmos

x+a-( -----------) = In 1 obteniendo el In 1

b

22

- x - a------__ = 0 multiplicando por - 1

b e intercambiandodenominadores tenemos.. .

x + a---_-_- = 0

b

1(x + a) = b(0)

x + a = 0

x = - a

Por lo tanto -a representa el tiempo en el cual no existe respuesta por parte del segundo potencial deacción, lo cual constituye la duración del periodo refractario absoluto, siempre y cuando Y = 0 .

2 3

B) Análisis matemático y justificación de la constante b

¿que sucedería en nuestra ecuación No.2 si b = x+a ?

Y = Ymax Il-Exp(-(x+a)/b)]

Y = Ymax [ 1-Exp(-(x+a)/x+a) ]

Y = Ymax [l- Exp(-l)]

Y = Ymax [l -l/Exp(l)]

Y = Ymax (l- U2.7182)

Y = Ymax (l- 0.3678)

Y = Ymax ( 0.632 ) , que en porcentaje = 63.2%

Por lo tanto, cuando b = x+a se alcanza el valor de la constante de tiempo (zm ) para la distribución en unafíbra muscular esquelética, tiempo que es equivalente al 63% del total de la recuperación.

C) Análisis matemático del intervalo entre ambos pulsos (x) de estimulación durante el desarrollo delperiodo refractario de la fibra muscular esquelética.

Pasemos ahora a analizar que pasaría si incrementamos o disminuímos el intervalo de estimulación00.

que datos nos aportaría nuestra función si x + 0

Y = Ymax [ l-Exp(-(x+a)/b) ]

Y = Ymax [l-Exp(-(a/h) ]

Y = Ymax [l- l/Exp(a/b)]

Y = Constante negativa

Podemos observar, que si x + 0, el valor final del periodo refractario sera negativo, 10 cual no es lológico observado durante el desarrollo de dicho parámetro. Sin embargo.. . . . . . . .

24

¿que pasaría si al intervalo de la duración de los estímulos (x) le atribuimos cada vez un valor mayortendiendo a infinito, esto es:

Cuando x +GO . . . . .

Y = Ymax [ 1-Exp-(x+a/b)]

Y = Ymax [1-Exp-(oo+a/b)]

Y = Ymax [ l-Exp(-oo)]

Y = Ymax [ l- l/Exp(oo )]

Y = Ymax ( l- lh )

Y=Ymax( 1-O)

Y = Ymax (1)

Y=Ymax

Esto quiere decir, que conforme se incremente el intervalo de tiempo entre ambos pulsos deestimulación (x), llegara el momento en que la intensidad del segundo pulso despolarizante que es igual adel primero tanto en tiempo como en intensidad, sea suficiente para que la amplitud de ambos potencialessea igual, lo que denota la recuperación total.

25

2.5.3 RELACIÓN INTENSIDAD VS DURACIÓN

La relación intensidad VS duración sigue un comportamiento exponencial decreciente, y puede serajustada por una función del siguiente tipo:

Y = Yo/[l - Exp(-kx )]

Sin embargo, fue necesario la introducción de otra constante (b) en la anterior ecuación para laobtención de un mejor ajuste de nuestros datos y disminución de la desviación estandar, obteniendo de estamanera la siguiente ecuación :

Y = Yo/[l - Exp(-kx + b)] . . . . . . . Ecuación No. 3

donde Y representa la intensidad umbral del estimulo en mV, x representa la duración del mismo en ms, Yorepresenta la reobase en mV cuando x tiende a infinito, b y k son constantes introducidas por la funciónexponencial

Si procedemos a linealizar la ecuación No 3 tenemos que . .

Y = Yo/[ 1 - Exp(-kx + b)]

Y [1 -Exp(-kx+b)] =Yo

y -mxp(-kx + b) =Y0

- YExp(-kx + b) =Y0-Y

Y - Y oExp (-kx + b) = ---e--m-m--

Y

Y - Y o-kx+b = ln ( - - - - - )

Y

Y - Y oln ( mm___ --- ) = - b + b

Y

Como puede observarse, esta última ecuación es del tipo Y = mx + b que es la expresionlinearizada de la función exponencial No 3. El programa REGREZID (ver programa) maneja esta expresiónlinearizada para proporcionarnos el ajuste de nuestros valores experimentales.

26

A) Estudio análitico de la reobase

La reobase se refiere a la magnitud mínima del estimulo con el cual se desencadena un potencial deacción, independientemente de su duración.

Analizando las variables de que depende la reobase, ique sucedería con la intensidad umbral delestimulo (Y) si la duración (x) de este se incrementara tendiendo a infinito ?.......

iY?six +oo

partiendo de nuestra ecuación No 2 tenemos que:

Y = Yo 11 - Exp (-k-x + b)]-1

Y=Yo[l -Exp(-km+b)]-1

Y = Yo [l- Exp(-c#

Y = Yo (l! 1-Exp-)

Yo Yoy = -------- + ----w---me ì

l- Exp -UJ l- l/Expoo

Yo Yoy = ------- + ---------

l- ll00 1-o

Y = Yo (reobase)

Por tanto y de acuerdo al resultado anterior:

siempre que X + m , Y 3 Yo

En otras palabras, si la duración del estimulo es suficientemente amplia, se alcanzará un valorconstante en la magnitud del estímulo, el cual corresponde al valor de la reobase.

27

Continuando con el análisis de la reobase en la relación intensidad VS duración, kque sucede con laintensidad umbral (Y) si la duración del tiempo (x) tiende a cero ? . . . . . .

¿Y? s i x+0

Partiendo de nuestra ecuación No 3 tenemos :

y = Yo [l- Exp (-kx + b)]-1

y = YO [l- Exp (40 + b)]-1

Y = Yo [l- Exp (0 + b)]-l

Y = Yo [l- Exp(b1

Yoy = -_--_____- pero como b es prácticamente

l- Exp(b) = cero entonces..

Yoy = _____-____

1 - Exp(0)

Yoy = __--------

l- 1

Yoy = mD-ww--m-m

0

Y = infinito ( al)

De acuerdo al resultado anterior tenemos que

Cuando x + 0, Y -s intinito

En otras palabras, si la duración del estímulo disminuye tendiendo a cero, la magnitud del mismodebe ser cada vez mayor (tendiendo a infinito) para generar un potencial de acción. Así, la intensidadumbral tendera a un valor infinito, volviéndose asintótico en la curva.

28

B). Estudio análitico de la cronaxia

La cronaxia es un valor característico de cada fibra muscular, y corresponde al tiempo necesariopara generar un potencial de acción cuando la intensidad del estimulo es el doble de la reobase.

La anterior definición surge de la siguiente pregunta:¿que sucede con la duración del estímulo (x), si en la intensidad del pulso (Y) doblamos el valor de la

reobase (2 Yo)?

ix ? siY=2Yo

Partiendo de nuestra ecuación de trabajo No 2 tenemos:

Y=Yo/[l-Exp(-kx+b)]

2Yo = Yo/ [ l- Exp(-kx + b)]

2 [l- Exp(-kx + b)] = YoNo

2 [l-Exp(-kx+b)] = 1

[ l- Exp(-kx + b)] = 1/2

- Exp(-kx + b) = ll2 - 1

- Exp(-kx + b) = -112 multip por -l.....

Exp(-kx + b) = ll2

-kx+b = ln(1/2)

-kx = In (1/2) - b multip por -l......

b - In (1/2) b - In (1/2)k = ------------ Y x =

X k

Tenemos que, en base a que k y b son constantes, el valor de x posterior al desglose matemático,resulta ser también una constante, cuyo valor es igual a la cronaxia de la fibra, es decir:

si Y = 2Yo entonces x = constante -> CRONAXIA

En base al estudio analítico hecho sobre la cronaxia y la reobase, dos parametros obtenidos de larelación intensidad VS duración, podemos entender el comportamiento que sigue la gráfica de dicharelación: es decir, por que ante intensidades de estimulo grandes se requiere poca duración de este paragenerar un potencial de acción y viceversa porque al incrementar la duración del estimulo se requiere deintensidades pequefias para generar dicho evento.

29

2.6 PROGRAMAS UTILIZADOS

Para el análisis de nuestros datos utilizamos programas diseííados en el propio laboratorio escritosen lenguaje basic.

Los eventos estudiados tales como : a) el curso temporal de las propiedades electrotónicas, b) Elpotencial de acción , c) la refractariedad de la fibra muscular esquelética y d) la relación intensidad-duración, siguen un comportamiento que se ajustan a ciertas funciones exponenciales ya expuestas; sinembargo, es necesario linearizar primero nuestra función exponencial a la forma Y = mx + b, para que losprogramas diseñados puedan ajustar los datos experimentales, y posteriormente correlacionarlos con elcurso de la función exponencial, valorando la fidelidad del ajuste tanto gráfica como matemáticamentegracias al coeficiente de regresión lineal (r) obtenido durante la linerización de nuestra función exponencial.

2.6.1 PROGRAMAS UTILIZADOS PARA EL ANÁLISIS DE LOS COMPONENTESELECTROTÓNICOS OBTENIDOS A PARTIR DE LA RELACIÓN ESTIMULO VS RESPUESTA.

Las respuestas subumbrales (electrotónicas) de la membrana fueron desencadenadas aplicando pulsosubumbrales de diferente magnitud, y con una duración de 10 ms para permitir al potencial demembrana alcanzar el estado estable (Emax). Se mantuvo un potencial de mantenimiento de 100 mv.Los estímulos fueron aplicados utilizando un convertidor D/A (tecfen).

a) PROPUD: Este programa se utilizó para la promediación de la magnitud real del pulso aplicado, el cualcalcula la magnitud del pulso como un promedio obtenido a partir de la suma de voltajes (puntos) leídosdurante la duración del pulso, y dividido entre el número de estos. Para calcular el mímero de puntos,considera la duración del pulso (10 mseg) y lo divide entre la velocidad máxima de adquisición utilizada,que en nuestro caso fue de 4 pseg..

b) PROIMD: Este programa fue utilizado para calcular el promedio de la corriente de membrana registradadurante el pulso, y proporciona la lectura tanto de la corriente de membrana por unidad de ha (J.LAmp/cm2) registrada durante el establecimiento del potencial de membrana, como la corriente demantenimiento (nAmp) proporcionada por el sistema de fijación de corriente.

c) POTEND: Este programa ajusta el potencial de membrana que se registra a la apertura de un pulsoaplicado, a una función exponencial del tipo :

Em = Emax [l- Exp(-Thm)]

que corresponde a la ecuación No 1, cuyo desglose matemático se realizó en la sección correspondiente deecuaciones.

Con la función exponencial obtenemos los valores ajustados de la constante de tiempo de ladistribución (tm) y del potencial de membrana en el estado estable (Emax ) , pero una vez linearizadanuestra ecuación exponencial a la forma Y = mx + b y conociendo la corriente de membrana por unidad deárea (Im), podemos obtener los siguientes parámetros:

30

* Potencial de membrana (Em) expresado en mV.* Potencial de mantenimiento (Eh) en mV.* Capacitancia de membrana por unidad de área (Cm) en @/cm2* Resistencia lineal de la membrana (Rm) en R-cm2* Resistencia de entrada (Ro) en KS2* Coeficiente de correlación (r) a la función exponencial:

Estos parámetros son obtenidos con la siguiente función exponencial linearizada utilizada para elajuste del potencial de membrana:

ln(IR-E) = -T/CR + In (IR)

En ocasiones la duración del pulso no es suficiente para alcanzar el estado estable, sin embargonuestro programa de ajuste esta diseirado para proporcionarlo en un valor extrapolado, de tal manera que laEmax pueda ser calculada.

El programa “potend”, ademas de reportarme los valores ajustados, me genera un archivo con laextensión “pot” que me da opción a visualizarlo en pantalla o de imprimirlo.

d) REGRE: Este programa relaciona la corriente de membrana por unidad de área (uAmp/cm 2 enfunción del potencial de membrana (mV), utilizando para ello una función del tipo Y= mx + b con la cual,se obtienen los siguientes resultados:

m = Gm (mS/cm2)l/m = Rm (Ohm/cm2)b =ImcuandoEm=O

donde m representa la conductancia de la membrana por unidad de área; l/m representa la resistencia demembrana por unidad de área y b el valor de la corriente cuando el potencial de membrana es igual a cero.

3 1

2.6.2 PROGRAMAS UTILIZADOS PARA ANALIZAR EL CURSO DEL PERIODOREFRACTARIO

a) PPIND: Este programa promedia la magnitud de ambos pulsos a la salida de la fuente de estimulaciónconsiderando el intervalo de tiempo que existe entre los dos pulsos. Además, calcula la magnitud de lospulsos como un promedio de la suma de voltajes y los divide entre el numero de puntos existentes durantecada uno de los pulsos cuya duración es de 10 mseg. Para el calculo del número de puntos, considera laduración del pulso entre la velocidad máxima de adquisición (4 weg).

b) PERED: Este programa es utilizado para calcular la magnitud al pico de ambos potenciales de acción enrespuesta a los pulsos despolarizantes aplicados. Además, genera un archivo con la extensión “pot” que meda la opción de visualizarlo en pantalla o de imprimirlo.

c) PEREBOL: El curso temporal del periodo refractario, sigue un comportamiento exponencial que puedeser ajustado a la función utilizada para el ajuste del potencial de membrana:

Em = Emax [1- Exp(-Thm)]

Sin embargo, para un mejor ajuste de nuestros datos, se hicieron algunas modificaciones a estafunción manteniendo la esencia de la misma, es decir solamente se introdujo una constante para lograr unmejor ajuste, obteniendo la siguiente función :

Y = Ymax [l- Exp(-(x+a)h)]

la cual corresponde a la ecuación No. 2 estudiada en la sección correspondiente de ecuaciones.

Utilizando el programa “perebol”, calculamos la recuperación progresiva del segundo potencial deacción en función del intervalo de tiempo entre los pulsos de estimulación. A través del programa“perebol”, que maneja la expresión linearizada de la función exponencial No. 2, que se describe acontinuación:

1 aIn (Ymax-Y) = - --- x + [In (Ymax) - --- ]

b b

calculamos los siguientes parámetros:

r = coeficiente de correlación a la función exponencial.Ymax = magnitud al pico del primer potencial de acción menos el componente

electrotónico.b y a = constantes introducidas por la función exponencial.PRA = duración del periodo refractario absoluto (x = -a)

zm = constante de tiempo de la distribución (tm = b-a).

2.6.3. PROGRAMAS UTILIZADOS PARA ANALIZAR EL CURSO DE LA RELACIÓNINTENSIDAD VS DURACIÓN

La relación intensidad-duración puede ser utilizada para conocer la excitabilidad de las fibrasmusculares, la cual consta de dos importantes parámetros: : Reobase y Cronaxia. Estos dos eventos fueronexplicados en la sección de ecuaciones correspondiente.

A continuación solo se mencionaran los programas escritos en basic diseítados para manejar lainformación correspondiente a esta relación.

a) PROPUD: Este programa funciona exactamente igual al descrito en el anhlisis de las respuestaelectrotónicas de la membrana celular. Su función es, determinar la magnitud real del pulso que sale de lafuente de estimulación, para lo cual también lo calcula mediante un promedio de la suma de voltajesexistentes durante el pulso y lo divide entre el número de puntos voltajes. Igualmente para el calculo de lospuntos voltaje considera la duración del pulso y lo divide entre la velocidad de adquisición (4 pseg).

b) INDUD: Este programa proporciona el valor real del potencial de mantenimiento (Vh).

c) REGREID: El Curso de la curva de excitabilidad obtenida de la relación Intensidad VS Duración, sigueun comportamiento exponencial, el cual se ajusta a una función del tipo:

Y = Yo/[ 1- Exp(-kx + b)]

que corresponde a la función No 3 revisada y analizada en la sección correspondiente de ecuaciones.

El programa “regreid” ajusta los valores experimentales utilizando para ello la forma linearizada dela función , ya que el ajuste no puede realizarse directamente de la función exponencial utilizando esteprograma. La expresión linearizada es la siguiente :

Yo-YIn (----) = -kx+ b

Y

De esta manera los parámetros obtenidos y ajustados por el programa “regreid” utilizando la funciónlineal son:

Reobase = YoCrouaxia = tiempo en el cual Y = 2Yor = Coeficiente de correlación con la función exponencialk = representa la pendienteb = es una constante.

33

III. RESULTADOS

Sin duda alguna, la hipótesis mas apoyada experimentalmente para explicar el AEC en fibraesquelética, es el movimiento de carga intramembrana; en base a esto, se ha encontrado que el movimientode carga puede ser inhibido si la fibra es estirada a LS mayores de 4.2 pm (Uribe 1, Candia R y HernándezJ . 1992 ); también, se ha demostrado que en ausencia del movimiento de carga no se presenta liberación decalcio desde el RS (Pizarro G, Ríos E, Uribe 1 and Fitts 1991), muy probablemente por una alteración en elAEC.

Es importante considerar que el movimiento de carga se da dentro del campo eléctrico de lamembrana tubular durante la despolarización de la misma; la cual, en caso de lesionarse durante elestiramiento, explicaría por si misma la ausencia del movimiento de carga. Sin embargo, muyrecientemente (durante la realización de esta tesis), Uribe 1 y Valdiosera R (comentario personal) hanregistrado, mediante mediciones de impedancia, capacitancias del orden de 6-8 pF/cm2 en fibrasesqueléticas estiradas a LS de 4.5 pm, lo que sugiere una integridad y conexión del sistema tubular, por loque parece razonable pensar que dicha membrana se despolariza normalmente.

Por otro lado, no se tienen antecedentes sobre el estado que guardan las propiedades eléctricas de lamembrana a LS mayores de 4.2 pm, situación en la cual se inhibe la liberación de Ca++ desde el RS (TaylorS, Rudel R and Blinks J. 1974 y Baylor S, 1977), por lo que consideramos interesante conocer el estado delas mismas en fibras sometidas a LS de 4.2 lrm y mayores (4.56 pm). Lo anterior, aportaria informaciónsobre el estado que presenta la integridad de la membrana, la cual es necesaria para la adecuada transmisióndel impulso eléctrico hacia el interior celular.

Cuatro fueron las propiedades de la membrana estudiadas en fibras esqueléticas únicas, sometidas afijación de corriente con la técnica de dos sellos de vaselina (Kovacs y Schneider M F, 1978):

3.1) Propiedades electrotónicas.3.2 ) Potenciales de acción (PA).3.3 ) Relación intensidad-duración (I-D).

3.4 ) Refractariedad de la fibra. .

a) PRIMERA FASE EXPERIMENTALEn una primera fase la fibra, una vez depositada en la cámara de registro, fue inicialmente sellada y

posteriormente estirada a diferentes LS partiendo del reposo hasta el sobreestiramiento a 4.56 prn. En cadaLS se analizaron las caracteristicas de las propiedades anteriormente citadas.

Los resultados obtenidos en esta primera fase son los siguientes:

3.1 EFECTO DE LA LS SOBRE LAS PROPIEDADES ELECTROTÓNICAS DELA MEMBRANA EN UNA MISMA FIBRA MUSCULAR.

Se realizaron un total de 15 experimentos para estudiar esta propiedad, obteniéndose resultadossimilares. Para desencadenar las respuestas de la membrana se aplicaron pulsos subumbrales de diferentemagnitud y duración de 10 ms. Prácticamente en todas las fibras fue necesario aplicar un voltaje demantenimiento (WI) de -1OOmV para polarizarlas, el cual fue sustraído al realizar las figurascorrespondientes.

34

3.1.1) Estudio de propiedades electrotónicas

La figura 1 presenta la respuesta electrotónica en una fibra no estirada (2.28 pm de LS),desencadenada por un pulso subumbral despolarizante de 10 ms de duración. En este caso, el potencial demembrana en el estado estable (Emax) obtenido es de ll .25 mV. En esta figura se aprecian dos trazos: a)uno correspondiente a la respuesta experimental (linea delgada) y b) otro correspondiente a la respuestaajustada a la función Em = Emax(l-Exp(-Thm)) (linea gruesa). Como puede observarse, el punto en el cualse alcanza el valor de Emax, es prácticamente el mismo tanto en la respuesta experimental como en laajustada.

El objetivo básico de esta figura es demostrar que el estudio de una propiedad electrotónica de lamembrana (Emax) puede realizarse utilizando solamente los valores ajustados. Los criterios que justifícanla utilización exclusiva de los trazos ajustados con el fin de analizar el comportamiento de Emax adiferentes LS fueron los siguientes:

a) Evitar la sobreposición de trazos (experimentales y ajustados) en las figuras, que dificulten lainterpretación de los resultados.

b) Para el análisis de Emax solamente interesa el punto en el cual el valor del voltaje se mantieneestable.

c) Los índices de ajuste (r) proporcionados por la función antes citada, son confiables (mayores a0.988).

d) Las respuestas experimentales utilizadas para el análisis de Emax se muestranson grticadas.

2 5 -AJUSTE DE RESPUESTAS ELECTROT6NICASA LA FUNCIÓN: Em= Emax( l-EXP(-T/tm))

20 - EN FIBRA NO ESTIRADA

Emax= ll .25m

5-

- 5 I I I 40 4 6 12 16

.TIEMPO (ms)

ruidosas cuando

Figura 1. Emax obtenida en una fibra no estirada (LS de 2.28 pm) con una pulso subumbral de10ms de duración. Se muestra tanto el trazo experimental 0. delgada) como el ajustado (l. gruesa) a lafunción Em = Emax (1-Exp(-Tkm)). El potencial de mantenimiento (-100mV) ha sido sustraído.

35

La figura 2 muestra el efecto del estiramiento de la fibra a diferentes LS sobre los valores de Emax.Para generar las respuestas, se utilizan pulsos despolarizantes e hiperpolarizantes de diferente magnitud(misma para ambas LS) y 10 ms de duración. Las diferentes LS comparada en la figura son 2.28 (control)y 3.8 Pm y, como puede apreciarse, en comparación a los valores de Emax obtenidos en la condicióncontrol (linea delgada), se observa un franco decremento en los valores de Emax cuando la misma fibra seestira a 3.8 pm de LS (linea gruesa).

Esta figura es representativa de una población de 10 fibras cuyas características fueron similares.

5 0

4 0

3 0

2 0T

E 10

w2 0

5 - 1 0

:- 2 0

- 3 0

- 4 0

- 5 0 -I I I I 1

RESPUESTAS ELECTROTÓNICAS AJUSTADAS A LAFUNCIÓN: Em = Emax( 1-EXP(-T/tm)) EN UNA

UNA MISMA FIBRA.

Vmax== 35.98mV.

27.92mV

13.29mV

- 12.99mV~ 2.28 um DE LS

- 3.80 um DE LS

- 2 5 . 3 1mV.

0 4 0 12

TIEMPO (ms)

16

Figura 2. Análisis de Emax a diferentes LS en una misma fibra: 2.28 pm (linea delgada) y 3.8 pm (1. gruesa) de LS. El Vh de -1OOmV ha sido sustraído; se utilizaron solo valores ajustados por lafunción Em= Emax (1-Exp(-Tkm)).

36

El cuadro No. 1 resume los resultados de la figura anterior , es decir, las diferencias en los valores deEmax cuando la misma fibra es sometida a diferentes LS y ante un mismo patrón de estímulos cuyaduración es de 10 ms.

Emax (mV)pulso (mV) 2.28pm 3.8pm

____--------_-------___l____l____

52 35.98 28.85

40 27.92 21.00

20 13.29 10.90

-20 -13.00 -10.89

-40 -25.31 -21.04---------------------------------------------------

Cuadro 1. Compàración de Emax en una misma fibra sometida a diferentes LS. La magnitudy duración de los pulsos fue la misma en ambos casos.

Otras de las propiedades de membrana que fueron analizadas en la fibra anterior (y en 15 más)fueron la resistencia de entrada (Ro) obtenida a partir de la ley de Ohm (Ro = Emax/Io), la capacitancia(Co= zm/Ro) y la constante de tiempo (zm= CORO) cuyos valores fueron calculados a partir de la funciónexponencial: Em= Emax (1-Exp(-T/zm)) una vez que ha sido proporcionado el valor de Ro al software quemaneja dicha función.

Se analizaron las diferencias en la magnitud de estas propiedades ante el cambio de LS, desde elreposo hasta el estiramiento máximo a que fue sometida una misma fibra. El cuadro No.2 muestra losresultados promedios de tres fibras (n=3) que fueron estiradas desde 2.28 um hasta 3.8 pm de LS.

-_-_-__-----_-----___L__________________-------------------------------------------------------------

Constantes 2.28pm 3.8pm---------_------------------------------------------------------------------------

Cmo (W 1.88 (1.12) 1.33 (0.36)

Tm ( m s ) 1.16 (0.28) 1.17 (0.56)

* R, (KCZcm2) 0.454 (0.2) 0.447 (0.15)---------_--------_---------------------------------------------------------

Cuadro 2. Constantes de membrana promedio (n=3) obtenidas en fibras estiradas a diferentesLS (solo se muestran los valores de las LS extremas). Cmo y R, corresponden a valores por área demembrana total. Los números dentro del paréntesis corresponden a la desviación standart (DS) delas constantes promedio para cada una de las fibras estudiadas.

*Se obtiene a partir de la relación corriente de membrana-voltaje de membrana utilizada paracalcular la conductancia de membrana (Gm).

37

3.1.2) Efecto de la LS sobre Emax .

En la figura 3 se relacionan los valores de Emax obtenidos a LS de 2.28 VS 3.8 pm en una mismafibra. Como puede apreciarse, la relación sigue un comportamiento prácticamente lineal. De esta manerapodemos inferir que para una fibra sometida a varias LS el cambio de Emax, conforme incrementa la LS,es lineal y permite extrapolar valores a estiramiento mayores de3.8pm.; sin embargo, cuando se utilizan fibras sobreestiradas a 4.56 Pm de LS antes de ser selladas, el valorde Emax no difiere del encontrado en fibra no estirada (2.28 Pm) lo que sugiere una fuga de corriente enalgún sitio de la preparación, muy probablemente a nivel de sellos.

EFECTO DEL ESTIRAMIENTO SOBRE EmaxEN UNA MISMA FIBRA

40 40 ii 20 4’0

Emax (mV) A 2.28 um.

Figura No.3 Efecto de la LS sobre Emax. Los valores de Emax corresponden a unamisma fibra estirada desde 2.28 pm hasta 3.8 pm de longitud de sarcómera.

38

3.1.3 ) Efecto de la LS sobre la conductancia de membrana (Gm):

A partir del anáIisis de las respuestas electrotónicas, se obtuvieron las relaciones corriente demembrana-voltaje de membrana que se utilizaron para calcular el valor de Gm en cada una de las LSestudiadas. Los valores de Gm fueron obtenidos mediante uu análisis de regresión lineal ajustada a lafunción Im = (Gm)(Em)+b, donde el valor de Gm corresponde a la pendiente de la recta y b representa elintersepto.

En la figura 4 se muestra la relación coriente-voltaje de membrana para el calculo de Gm en unafibra que fue sometida a varias LS (solo se muestran las LS extremas, es decir, 2.28 y3.25 Pm); Se considera en la relación además de la corriente total de membrana (Im), la de mantenimiento

(Ih).Como puede observarse, la relación sigue un comportamiento prácticamente lineal en ambas

situaciones experimentales proporcionado una Gm de 2.937 mS/cm2 a 2.28 pm y de 2.633 mS/cm2 a 3.25Pm de LS. También se puede apreciar que para un mismo voltaje en ambas LS experimentales, se requieremayor cantidad de corriente a 3.25 que a 2.28pm de LS, lo cual podría sugerir un deterioro de la fibraconforme se estira (ver discusión); Los círculos llenos corresponden a los valores experimentales obtenidosa 2.28pm en tanto que los vacíos a los de 3.25 pm de LS. Las lineas continuasfunción: Im = (Gm)(Em)+b.

representan el ajuste a la

5 0 -

O -

sE - 5 0 -

P3v -lOO-

x

+ - 1 5 0 -

4

- 2 0 0 -

EFECTO DE LA LONGITUD DE SARCOMEKASOBRE LA CONDUCTANCIA DE MEMBRANA

EN UNA MISMA FIBRA.

l 2.26um; Gm=2.937mS/cme2o 3.25um; Gm=2.633mS/cm^2

- 1 4 0 - 1 2 0 - 1 0 0 - 6 0 - 6 0 - 4 0

E m ( m V )

Figura 4. Efecto de la LS sobre la conductancia de membrana en una misma fibra. Lossímbolos corresponde a los valores experimentales y las lineas a los ajustados a ia función Im =(Gm)(Em)+b .

39

El cuadro No. 3 muestra los resultados promedio de las relaciones corriente-voltaje de membranaobtenidas en un grupo de 3 fibras (n=3) que fueron estiradas desde 2.28 pm (reposo) hasta 3.8 p de LS

-----_----------------------------------------------------------------------

parhmetro 2.28pm. 3.80pm

Gm (mS/cm2) 2.63 (0.99) 2.52 (0.86)

R m (KLkm2) 0.454 (0.20) 0.447 (0.15)

b (Ncm’) 240.7 (90) 227.7 (83)

r 0.994 0.999

Cuadro 3. Parámetros ‘de membrana promedio (n=3) obtenidos a partir de las relacionescorriente-voltaje de membrana realizadas en tres fibras esqueléticas que se mantuvieron a las LSmostradas arriba. Los valores fueron obtenidos a partir de la expresión linearizada Im = GmEm + bdonde Gm corresponde a la conductancia de membrana; b representa la corriente cuando Em= Eh enausencia de pulso. Los números dentro del paréntesis corresponden a la DS de los parámetros demembrana promedios para cada una de las fibras estudiadas.

40

3.2 EFECTO DE LA LS SOBRE LOS POTENCIALES DE ACCIÓN EN FIBRASESQUELÉTICAS ÚNICAS DE ANFIBIO.

En la figura 5 se muestra el efecto que ejerce el cambio de LS en una misma fibra, desde 2.28 hasta3.8 pm de LS, sobre la amplitud y curso temporal del potencial de acción (PA). En el panel A se muestranlos PA graficados en el mismo intervalo de tiempo. En el panel B, se encuentran desplazados en el tiempo,haciéndose mas evidente sus diferencias.

Para la generación de los potenciales de acción se utilizaron pulsos supraumbrales de 60 mV yduración de 10 ms en todos los casos y como puede apreciarse, tanto en A como en B, existe una marcadadiferencia en el potencial al pico entre los potenciales de acción de las LS extremas ( 2.28 y 3.8 Frn ), asícomo un incremento en la duración de los mismos; esto podría sugerir que las conductancias iónicas‘responsables de la generación del PA son afectadas conforme la fibra se va estirando

A

160

120

9E- 00Wz!i

) 4 0

0

POTENCIALES DE ACCIÓN A DIFERENTESLONGITUDESDE SARCÓMERA EN UNA

MISMA FIBRA MUSCULAR.

- 2.26 um.

- 2.65- 3.25- 3.80

I I I I 1

0 5 10 1 5

TIEMPO (mr)

20 25

B

100

1 2 0

cE-: 00

3iz

40

0

POTENCIALES DE ACCIÓN A DIFERENTESLONGITUDES DE SARCÓMERA EN UNA

MISMA FIBRA

0 2 0 4 0 60 00

TIEMPO (mr)

Figura 5 . Potenciales de acción a diferentes LS en una misma fibra. El panel A muestra losPA graficados en un mismo intervalo de tiempo, en tanto el panel B, los muestra desplazados. Los PAfueron desencadenados con estímulos despolarizantes de 60 mV y 10 ms de durach.

41

3.3 EFECTO DE LA LS SOBRE LA RELACIÓN INTENSIDAD-DURACIÓN (I-D) ENFIBRA ESQUELÉTICA ÚNICA DE ANFIBIO.

Para analizar esta propiedad se realizaron 10 experimentos, los cuales presentaron uncomportamiento similar.

Las fibras fueron sometidas a pulsos de diferente duración (1,3,5,.. ms etc.) y la intensidad delestímulo se modificó hasta alcanzar el valor umbral en cada duración. Los datos experimentales semuestran como símbolos y los ajustados como lineas. El ajuste se realizó con la siguiente función: Y =Yo/(l -EXP(-kx + b)), donde Y representa la intensidad umbral, x la duración del pulso, Yo la reobase y ky b son constantes.

En la figura 6 se muestran 2 ,curvas que denotan el comportamiento de la relación I-D a diferentesLS en una misma fibra, siendo solamente graficadas las LS extremas, esto es, 2.53 Pm (círculos) y 3.8 Pm(cuadros). Es claro el decaimiento exponencial que siguen ambas curvas, sin embargo, es evidente como,ante una duración del estímulo en la cual se alcanzan las reobases para cada LS, los valores difierennotablemente, obteniéndose una reobase de 47.90 mV a 2.53 pm y 64.2 mV a 3.80 Pm de LS. Por otrolado, la cronaxia, que es el otro parámetro estudiado durante el análisis de la relación I-D, también se

modifica cuando incrementa la LS; este cambio se presenta como una reducción que va desde 0.502 msobtenidos a 2.53pm, hasta 0.067 ms a 3.8pm de LS. Las lineas continuas corresponden al ajuste a lafunción arriba citada.

60

RELACIÓN INTENSIDAD-DURACIÓN ADIFERENTES LONGITUDES DE SARCÓMERAEN UNA MISMA FIBRA.

0 2.53 um REOBASE= 47.90 mVCRONAXIA= 0.502 ms

n 3.80 um REOBASE = 64.2 mV.CRONAXIA = 0.067 ms

r=

r=

0 5 10 15 20

DURACIÓN (ms)

0.960

Figura 6. Relación intensidad-duración en una misma fibra estirada a diferentes LS. Lossímbolos representan a los valores experimentales y las lineas continuas a los ajustados a la funciónY= Yo/(l-Exp(-kx+b)).

42

3.4 EFECTO DE LA LS SOBRE LA REFRACTARIEDAD DE LA FIBRAESQUELÉTICA ÚNICA EN ANFIBIO.

Para el estudio de esta propiedad se realizaron 12 experimentos, cuyos resultados fueron similares.Los resultados que se muestran a continuación, corresponden a una misma fibra que fue sometida adiferentes LS, desde 2.53 (control) hasta 3.8 Pm, en cada una de las cuales se obtuvo la refractariedad de lafibra. Las figuras muestran la amplitud del segundo potencial de acción como una función del intervaloentre los 2 pulsos de estimulación, cuya duración y amplitud es la misma ( 5 ms y 65 mV respectivamente).

La magnitud de los dos potenciales de acción y el intervalo entre ambos pulsos se encuentrarelacionado por la siguiente función: Y = Yo (1-EXP(++a)/h)), donde Y es la magnitud del 20 potencialde acción, Yo es la magnitud del primero, x es el intervalo de tiempo de la distribución y a representa laduración del periodo refractario absoluto). Las respuestas electrotonicas generadas durante la aplicación delos pulsos fue sustraída para la realizacion de las figuras correspondientes.

En la figura 7 se muestran las características refractarias de una fibra que fue sometida a diferentesLS (2.53, 2.85, 3.25 y 3.8 pm). Los símbolos corresponden a los valores experimentales y las lineascontinuas a los ajustados a la función arriba citada. Los dos potenciales de acción fueron generados conpulsos supraumbrales de 65 mV y 5 ms de duración.

PERIODOS REFRACTARIOS A DIFERENTES LONGITUDESDE SARCÓMERA EN UNA MISMA FIBRA.

8 2.53um. P.R.A. = 0.435 msv 2.85um. P.R.A. = 1.170 ms.n 3.25um. P.R.A. = 1.83 ms.

* 3.80um. P.R.A. = 2.23 ms.

0 2 4 6 6 10 12 14

INTERVALO ENTRE LOS PULSOS (ms)

Figura 7. Periodos refractarios obtenidos a diferentes LS en una misma fibra. Las lineascontinuas representan los valores ajustados a la función Y= Yo(l-Exp(-(x+a)/b)). En todas las curvas,el componente electrotónico ha sido sustraído.

43

Como se observa, la refractariedad de la fibra presenta una relación creciente en función de la LS; esdecir que conforme aumenta la LS , aumenta el periodo refractario absoluto (FT¿A), con una diferencia de1.795 ms entre las LS menor y mayor, esto es:

2.53 pm el PRA es de 0.435 ms.2.85 Pm el PRA es de 1.170 ms3.25 pm el PRA es de 1.830 ms3.80 pm el PRA es de 2.230 ms

Estos resultados nos hacen pensar al igual que en anteriores casos, que la membrana se valesionando conforme se estira la fibra.

44

3.5 EFECTO DE LA LS SOBRE EL VOLTAJE Y SOBRE LA CORRIENTE DEMANTENIMIENTO (Eh e Ih RESPECTIVAMENTE) EN UNA MISMA FIBRA.

Tomando en consideración el comportamiento de los resultados previamente mencionados, los cualesexhiben una disminución gradual en la amplitud de todos los parámetros estudiados conforme se incrementala LS (siendo esto interpretado como una probable lesión de la membrana al estirar la fibra), procedimos aanalizar el estado que guardan tanto la corriente como el voltaje de mantenimiento, los cuales sonresponsables directos de la amplitud que presentan las propiedades de la membrana cuando esta esestimulada.

En la figura 8 se analiza el potencial de mantenimiento (Eh) y la corriente de mantenimiento (Ih) enuna fibra que es sometida a varias LS. Como puede apreciarse, conforme la fibra es estirada partiendo desdeuna LS de 2.28 (considerada como control) hasta 4.2 pm de LS, tanto el Eh como la Ih se modificannotablemente de manera lineal y antagónica, es decir, que mientras el Eh decrece a partir de un valor inicialde -100 mV, la Ih tiende a incrementarse notablemente. De esta manera demostrarnos que en nuestrosexperimentos estamos teniendo una fuga importante de corriente, la cual muy probablemente sea la causaresponsable de la disminución en la amplitud de las sellales estudiadas y no por lesión de la fibra.Probablemente, esta fuga de corriente se presenta a nivel de los sellos de vaselina en los cuales, laresistencia decrece importantemente conforme la fibra es estirada.

5 0

- 1 5 0

EXPERIMENTO 59. Eh e IhVS LONGITUD DE SARCÓMERA0 Ehv Ih

- 1 0 1 2 3 4 5 6

L O N G I T U D D E SARCdMERA ( u m )

Figura 8. Efecto de la LS sobre la corriente y el potencial de mantenimieoto (Ih y Ehrespectivamente) en una misma fibra esquelética. Los símbolos corresponden a los valoresexperimentales y las lineas al ajuste a una función del tipo Y = mx +b. Ambos parámetros fueronmedidos en un prepulso de 3 ms. El Vh inicial es de -100 mV.

45

El cuadro No.4 resume los resultados mostrados en la figura 8.

LS (w) Eh (mV) Ih WV_---------------------------------------------------------

2.28 -98.4 -78.8

2.85 -94.8 -77.3

3.25 -87.4 -83.4

3.80 -87.9 -89.8

4.07 -83.2 -146.5

Cuadro 4. Efecto de la LS sobre Eh e Ih en una misma fibra. Tanto Eh como Ib fueron medidosen el prepulso (3 ms). El Eh inicial es de -1OOmv. Estos resultados corresponden a una de las fibrascon la cual se obtuvieron las respuestas electrotónicas previamente analizadas.

46

Los resultados obtenidos hasta este momento no satisfacen el objetivo del trabajo planteadoinicialmente (ver introducción), debido a que en las respuestas y propiedades de la membrana estudiadasexisten variaciones (especificamente una disminución en la amplitud) que creemos, no son debidas a undeterioro de la fibra sino a una falla en la técnica que conduce a una fuga de corriente en el sistema; locual se infiere a partir de los resultados obtenidos en la figura No 8, donde se aprecia que durante elestiramiento de la fibra a diferentes LS se presenta un incremento en la Ih y una reducción en el Eh,parámetros que determinan importantemente la amplitud de las respuestas estudiadas y que en condicionesestables deben mantener un valor constante. Considerando lo anterior creemos que, probablemente, la fugase presenta a nivel de los sellos de vaselina (previamente colocados) cuya resistencia inicial es modificadaal momento de estirar la fibra. Por lo tanto, y en base a lo anterior, se procedió a realizar una segundafase experimental en la cual solamente modificamos el momento de aplicación de los sellos; es decir,primero se estiro la fibra a la LS deseada y posteriormente (a diferencia de la primera fase experimental)aplicamos los sellos de vaselina sin realizar maniobras posteriores, evitando así el efecto mecánico quesobre la integridad de los sellos pudiese tener la manipulación de la fibra al momento de estirarla. El restode la metodología es igual que en la situación experimental anterior.

Las respuestas de membrana estudiadas son exactamente las mismas que en la situaciónexperimental anterior, solo que en este caso se analizaron a 4.56 um de LS y se compararon con laspropiedades obtenidas en fibras diferentes las cuales no se estiraron.

b) SEGUNDA FASE EXPERIMENTAL

3.6) EFECTO DE LA LS (4.56 Pm) SOBRE LAS RESPUESTAS ELECTROTÓNICAS DELA MEMBRANA MUSCULAR ESQUELÉTICA EN DIFERENTES FIBRAS.

Para analizar esta propiedad de la membrana en fibra sobreestirada (4.56 um de LS) se realizaronun total de 8 experimentos obteniéndose resultados similares, los cuales fueron comparados con losobtenidos en fibras no estiradas. Se utilizaron pulsos subumbrales de diferente magnitud y 10 ms deduración para desencadenar las respuestas de la membrana. De la misma manera que en el caso anterior, seaplico a las fibras un voltaje de mantenimiento de -100 mV para polarizarlas, el cual fue sustraído durantela realización de las gráficas correspondientes.

47

3.6.1) Efecto del sobreestiramiento sobre las propiedades electrotónicas de lamembrana muscular esquelética.

La figura 9 muestra la repuesta electrotónica experimental (linea delgada) y ajustada (linea gruesa)de la membrana, desencadenada con un pulso hiperpolarizante de 10 ms de duración . En este caso no setrata de un fibra relajada sino sobreestirada a 4.56 pm antes de ser sellada y la Emax que proporciona es de-34.8 mV, valor que coincide en el estado estable de ambas respuestas. Esta figura, al igual que la No 1(mostrada en la primera fase experimental), es utilizada para demostrar que también en una fibra estirada a4.56um de LS es posible llevar a cabo el análisis de Ernax utilizando solamente los valores ajustados por lafunción exponencial, claro esta, tomando en cuenta los criterios mencionados previamente para ello.

40

20

cE

U

w2 0

30>

- 2 0

- 4 0

RESPUESTA ELECTROTÓNICA AJUSTADA A LAFUNCIÓN : Em= Emax (l-EXP(-T/tm)).FIBRA ESTIRADA A 4.56 um DE LONGITUD

DE SARCÓMERA.

V m a x = - 3 4 . 8 m V

r = 0 . 9 8 6

0 4 0 12 16

TIEMPO (ms)

Figura 9. Respuesta de la membrana en fibra sobreestirada a 4.56 pm de LS. La linea gruesacorresponde a la respuesta ajustada a la función exponencial Em=Emax(l-EXP(-Tkm)), y la delgadaa la experimental; El Vh de -1OOmV ha sido sustraído.

48

En la figura 10 se analizan las respuestas electrotónicas de la membrana (especificamente Emax) endiferentes fibras, las cuales son desencadenadas con pulsos subumbrales de diferente magnitud y duraciónde 1Oms. Una fibra no es estirada (linea delgada) y se mantiene a una LS de 2.28 pm, en tanto que la otrase sobreestira a 4.56 pm (linea gruesa) . Como puede apreciarse, las diferencias en los valores de Emaxentre ambas fibras son pequeíías (ver cuadro 6) respecto a las obtenidas cuando una misma fibra es estiradaa diferentes LS (ver figura 2). De esta manera, demostramos que el estiramiento a LS de 4.5 Pm, no afectade manera importante la magnitud en los valores de Emax, los cuales son similares a los obtenidos en unafibra sin estirar (2.28 Pm de LS).

RESPUESTAS ELECTROTÓNICAS AJUSTADAS AFUNCIÓN: Em=Emax( 1 -EXP( -T/tm)) ENDIFERENTES FIBRAS.

35.98 mV.

3 0

V m a x = - 2 5 . 3 1 m V

- 4 0

TIEMPO (ms)

LA

4.56um de LS

2.28um d e L,c

Figura 10. Análisis de Emax en dos fibras mantenidas a LS diferentes: 2.28 pm (linea delgada)y 4.56 (linea gruesa). Solamente se ha graficado los valores ajustados por la función Em=‘Emax(l-Exp(-Tkcm)). El potencial de mantenimiento de -1OOmV ha sido sustraído.

49

El cuadro No. 5 resume los resultados obtenidos en la figura anterior, que corresponden a los valoresde Emax obtenidos en dos fibras mantenidas a LS extremas.

Emax (mV)Pulso (mV) 2.28pm 4.56pm

-----_----------------------------------------------------

52 35.98 35.66

20 13.29 12.41

-20 -12.99 -13.72

-40 -25.31 -24.17__---------------------------------------------------------

Cuadro 5. Comparación de Emax obtenidos en diferentes fibras a LS extremas. Como puedeobservarse, la magnitud de los pulsos aplicados fue la misma en ambas fibras.

Otras de las constantes de membrana que fueron comparadas en dos grupos de fibras las cuales semantuvieron a las diferentes LS ya mencionadas anteriormente (2.28 um VS 4.56 pm ), fueron la resistenciade entrada (Ro= Emax/lo) obtenida a partir de la ley de Ohm, la capacitancia (Co= zm/Ro) y la constantede tiempo (zm= CORO) cuyos valores fueron calculados a partir de la siguiente función exponencial:Em = Emax(l-Exp (-Tkm)). La comparación en los valores de estas constantes se muestran en el cuadro

No. 6 el cual, muestra los resultados promedio (n=6) obtenidos en dos grupos de 6 fibras.

-------_-------_------------------------------------------------------

constantes 2.28pm 4.56pm--_----_----_-------______________I_____---------------------------

Cmo WI 2.59 (1.5) 2.58 (0.98)

Tm (ms) 0.976 (0.28) 0.969 (0.25)

*Rm, (KQcm2) 0.299 (0.21) 0.267 (0.09)

Cuadro 6. Valores promedio (n=6) de las constantes de membrana obtenidas en dos grupos defibras mantenidas a las LS arriba citadas. Los números dentro del paréntesis corresponde a las DS delas constantes de membrana promedio para cada una de las fibras estudiadas.

*Se obtiene a partir de la relación corriente-voltaje de membrana utilizada para el calculo dela conductancia de membrana (Gm).

50

Como se puede observar, a pesar de tratarse de dos grupos de fibras estiradas a diferentes LS (2.28 y4.56 Pm), los valores de las constantes en ambas grupos son muy cercanos entre sí, manteniéndose dentrode un mismo rango de valores; Esto respalda los hallazgos encontrados durante el análisis de Ema-x, esdecir, que el sobreestiramiento de la fibra (al menos hasta 4.56 Pm) ejerce poco efecto sobre las respuestaselectrotónicas de la membrana.

3.6.2 ) Efecto de la LS sobre la conductancia de membrana (Gm) en diferentes fibras.

A partir del análisis de las respuestas electrotónicas, se obtuvieron las relaciones corriente demembrana-voltaje de membrana las cuales se utilizaron para calcular el valor de Gm en las LS comparadas,siendo obtenida por un análisis de regresibn lineal que se ajusta a una función del tipo Im = GmEm + b,donde Gm corresponde a la pendiente de la recta.

En la Figura 11 se analiza el comportamiento de Gm en dos fibras que se mantienen en diferentessituación experimental: a) una es sellada y mantenida a LS de 2.28um y b) otra es sobreestirada hasta 4.56um y posteriormente sellada. Como se aprecia en la figura, la relación para cada LS sigue uncomportamiento lineal proporcionado una Gm de 2.76 mS/cm2 a 2.28 um (círculos) y de 2.64 mS/cm2 a4.56 Pm (triángulos); además, puede apreciarse que a diferencia de los resultados obtenidos en la primerafase experimental, se requiere inclusive menor cantidad de corriente para un mismo voltaje cuando la fibrase sobreestira a 4.56 um que cuando es mantenida a 2.28 um de LS. En ambos casos se gráfica también suajuste (linea continua) a la función lineal ya citada (ver arriba)

---~ \ I ._ . _ _ _ ., . . -.EFÉCTO tiE LA LONGITUD DE SÁRCdMERA SOBRE

.

LA CONDUCTANCIA DE MEMBRANA (Gm) EN1 5 0 7 DIFERENTES FIBRAS.

100

- 1 0 0

l . 2.28 um; Gm= 2.76 mS/cm-2

v 4.58 um; Gm= 2.64 mS/cm-2

140 - 1 2 0 - 1 0 0 - 6 0 - 6 0 - 4 0

Em (mV)- _ _ _

Figura ll. Conductancia de membrana en diferentes fibras mantenidas a LS extremas (2.28pmy 4.56pm de LS). Los símbolos representan los valores experimentales y las lineas los valores ajustadosa la función Im= GmEm+b.

5 1

El cuadro No 7 resume los resultados promedio (n=6) de las relaciones corriente-voltaje demembrana realizadas en dos grupos de 6 fibras las cuales se mantuvieron a diferente LS (2.28 pm VS 4.56

Pm ).

ParámetrosLS (crm)

2.28 4.56

Gm (mS/cm2) 4.16 (1.8) 4.30 (1.7)

Rm (Kfkm2) 0.299 (0.21) 0.267 (0.09)

b (Wcm2) 355.1 (149) 411.3 (150)

r 0.995 0.991-------_--------------------------------------------------------------------

Cuadro 7. Parámetros de membrana promedios (n=6) obtenidos en dos grupos de fibrasestiradas a LS diferentes (2.28 pm VS 4.56 Pm). Los valores fueron obtenidos a partir de la expresionIm=GmEm+b, donde Gm corresponde a la pendiente de la recta y b representa la corriente cuandoEm=Eb en ausencia de pulso. Los números dentro del paréntesis corresponden a la DS de losparámetros de membrana promedios para cada una de las fibras estudiadas.

5 2

3.7 EFECTO DE LA LS SOBRE LOS POTENCIALES DE ACCIÓN (PA) ENDIFERENTES FIBRAS MUSCULARES ESQUELÉTICAS.

Dadas las variaciones tan importantes de la magnitud y curso temporal de los PA obtenidos en laprimera fase experimental, fue preciso analizarlos en esta segunda fase en la cual comparamos los PAobtenidos en fibras sobrestiradas a 4.56 um contra los obtenidos en fibras no estiradas. Un mismo patrón deestímulos (misma magnitud y duración) se utilizo en ambos casos.

En la f&ura 12 se muestran dos PA obtenidos en diferentes fibras, manteniéndose una de ellas a2.28 Pm y la otra a 4.56 um de LS; Ambos PA son generados por pulsos supraumbrales de 60 mV y 10 msde duración y, como puede apreciarse en el panel A (donde los PA están desplazados en el tiempo), elaspecto de ambos a simple vista es muy similar en lo que se refiere a amplitud y curso temporal; en el panelB se muestran nuevamente los dos potenciales de acción, en este caso normalizados, haciéndose masevidentes sus similitudes; ambos presentan un potencial al pico de aproximadamente 140 mV; además,como puede observarse, las fases de despolarización y repolarización son normales, lo cual nos sugiere unaconductancia para sodio y potasio de características normales.

A

120

E 50

gf

ii 40

0

0

POTENCIALES DE ACCIÓN A DIFERENTESLONGITUDES DE SARCdMERA

:

2.26 um

‘,4 56 *

i:

El1.2

0.0 ,

POTENCIALES DE ACCIÓN A LONGITUDES DESARCÓUERA EXTREUAS EN DIFERENTES FIBRAS.VALORES NORUNl7,ADOS

- 2.26 “In DE LS- 4.56 un,. DE LS

I I I I 1 0 5 10 151 0 20 30

TIEYPO (mm)

40 50TIEMPO (mm)

Figura 12. Potenciales de acción en diferentes fibras obtenidos a LS extremas con pulsossupraumbrales de 60 mV y 10ms de duración. En el panel A los PA estan desplazados en el tiempo; enel B han sido normalizados

Lo anterior contribuye a descartar la posibilidad de que la disminución progresiva en el potencial alpico conforme se incrementa la LS en una misma fibra se deba a lesión de la propia fibra y al contrario,refuerza la hipótesis de una fuga de corriente probablemente a través de los sellos de vaselina.

5 3

3.8 EFECTO DE LA LS SOBRE LA RELACIÓN INTENSIDAD-DURACIÓN(I-D) EN DIFERENTES FIBRAS.

En vista de la variaciones observadas en una fibra estirada a varias LS, procedimos a realizar 1 0experimentos (cuyos resultados fueron similares) para analizar el comportamiento de esta relación endiferentes fibras mantenidas a LS extremas, es decir, una se mantuvo a 2.85 l.irn (reposo) y la otra a 4.56 nmde LS. Se utilizó la misma duración de los estimulos que en la situación experimental anterior y, de igualmanera, la intensidad se modificó hasta akanzar el umbral en cada duración. Los datos experimentales semuestran como símbolos y los ajustados como lineas. El ajuste fue realizado con la función: Y= Yo(l-Exp(-kx+b)).

En la figura 13 se muestra un experimento representativo (de una población de 10) que denota larelación I-D de dos fibras estiradas a diferentes LS y, como puede observarse, la relación presenta un francodecaimiento exponencial para ambas fibras obteniendo una reobase de 53.72 mV para la fibra no estirada(cuadros) y 53.0 mV para la fibra estirada a 4.56 nm de LS (círculos); esto contribuye a corroborar laintegridad de la fibra ante estiramientos extremos. El otro parámetro obtenido a partir de la relación es lacronaxia, cuyo valor obtenido es: 0.39 ms en fibra no estirada y 0. ll ms en fibra estirada a 4.56 nm de LS.Estas cronaxias difieren menos que los obtenidos en una fibra que ha sido sometido a varias LS (ver figura6). Las lineas continuas corresponden al ajuste a la función arriba citada.

120

z100

E

60

RELACION INTENSIDAD-DURACIÓN ALONGITUDES DE SARCÓMERA EXTREMAS

t EN DIFERENTES FIBRAS.0

0 4.56 um. REOBASE = 53.72 mV.CRONAXIA= 0.112 ms.

H 2.85 um. REOBASE = 53.0 mV.CRONAXIA= 0.39 ms

r= 0.955r= 0.995

DURACIÓN (ms)

Figura 13. Relación intensidad-duración en diferentes fibras mantenidas a LS extremas. Lossímbolos corresponden a los valores experimentales y las lineas continuas al ajuste a la función: Y=Yo/(l-Exp(-kx+b)) donde Y es la intensidad umbral, Yo la reobase, x la duración del pulso y k y bson constantes.

54

3.9 EFECTO DE LA LS SOBRE LA REFRACTARIEDAD EN DIFERENTESFIBRAS

En base a los resultados obtenidos en la fase experimental anterior respecto a esta propiedad de lamembrana, se procedió a analizar la refractariedad en fibras estiradas a 4.56 um de LS para lo cual serealizaron 8 experimentos encontrando resultados similares; los resultados fueron comparados con losobtenidos en fibras no estiradas, donde la características de los pulsos (magnitud y duración) utilizados parala generación de las respuestas, son las mismas que las usadas en las fibras sobreestiradas.

En la figura 14 se relaciona la amplitud de los dos PA y el intervalo entre ambos pulsos por lasiguiente función: Y = Ymax (l-Exp(-(x+a)/b)) donde Y es la amplitud del segundo PA, Ymax la delprimero, x el intervalo de tiempo entre ambos pulsos y a y b son constantes ( b-a corresponde a la constantede tiempo de la distribución y a representa el valor del periodo refractario absoluto (PRA)). En la figura(14) se muestran las características refractarias de dos fibras estiradas a diferentes LS. Cada relación en lafigura, muestra la amplitud del segundo potencial de acción como una función del intervalo entre los pulsoscuya magnitud y duración es la misma (65 mV y 5 ms respectivamente). Obsérvese como la duración delPM de la fibra no estirada (círculos) cuyo valor es de 0.915 ms, no difiere mucho al de la fibrasobreestirada a 4.56 pm de LS cuyo valor es de 1.23 ms; si comparamos la diferencia entre estos valores y lade los obtenidos en la fibra estirada a varias LS (ver figura 7) en la condición experimental anterior,tenemos los resultados mostrados en el cuadro 10.

PERIODOS REFRACTARIOS A LONGITUDES DESARCdMERA EXTREMAS EN DIFERENTES FIBRAS

00 -z‘J& 70 -

iõ 6 0 -

a0 5 0 -P

8 4 0 -:= 3 0 -P

5 20-c_¿ l o -

s

.A= 0.915 ms.v 4.56 um. P.R.A= 1.232 ms.

I I l I 10 2 4 6 0 10 12

INTERVALO ENTRE LOS PULSOS (ma)

Figura 14. Efecto de la LS sobre la refractariedad en diferentes fibras sometidas a LSextremas. En ambos casos, el compooente electrotónico fue sustraído. La linea continua representa elajuste a la función Y= Ymax (1-Exp(-(x+a)/b)).

55

El cuadro 8 resume los resultados mostrados en la figura anterior

PRA en fibra estirada PRA obtenido en diferentesvarias LS fibras a LS extremas

(ms) W--------------_-----_____c______________------------------------------------------

2.53 dePm LS = 0.43 ms 2.53 Pm de LS = 0.91 ms* 3.80 dePm LS = 2.23 ms 4.56 Pm de LS = 1.23 ms

---------- - - - -

diferencia: 1.795 ms 0.315 ms

----------------------------------------------------------------------------------

Cuadro 8. Diferencias en los periodos refractarios absolutos obtenidos en las dos condicionesexperimentales analizadas.

* Solo se muestran los PRA obtenidos en la condición de reposo y máximo estiramiento de la mismafibra.

En base a los resultados mostrados en el cuadro anterior, vemos que la diferencia existente entre losPRA obtenidos en dos fibras diferentes, es mucho menor que la obtenida en la primera condiciónexperimental, lo cual nos lleva a pensar que el estiramiento extremo influye poco sobre la refractariedad dela fibra lo que contribuye, junto con los hallazgos de las otras propiedades estudiadas en esta segundacondición experimental, de que el estiramiento al menos hasta 4.56 Pm de LS, no afecta las propiedadeseléctricas de la membrana (respuestas electrotónicas y PA).

56

3.10 EFECTO DE LA LS SOBRE EL VOLTAJE Y LA CORRIENTE DEMANTENIMIENTO EN DIFERENTES FIBRAS.

Se analiza la condición que presentan estos dos parámetros en dos fibras mantenidas a diferentesLS (2.28 um y 4.56 Pm) a las cuales una vez selladas no se les realizan maniobras posteriores(estiramientos) para no afectar la integridad de los sellos, de la cual , es bien sabido depende la resistenciade los mismos. En la figura 15, se muestra en el panel A, el estado que presenta el voltaje demantenimiento (Eh) de la fibra sobreestirada a 4.56 pm de LS en función del que presentan la fibra sinestirar y, en el panel B se analiza el estado que guarda la corriente de mantenimiento (Ih) de las fibrascitadas. Como puede verse, el Eh se mantiene a valores constantes con una diferencia no mayor de 1 mVtanto a 2.28 pm como a 4.56 um de LS en ambas fibras; Por otro lado, la Ih tambitn se mantienerelativamente estable a ambas LS con una diferencia no mayor de 5 nA, manteniéndose así durante larealización (2 hrs) de la mayoria de experimentos llevados a cabo; Los símbolos representan los valoresexperimentales y las lineas continuas a los ajustados a una función del tipo Y= mx+ b.

A B-85 -

POTENCIAL DE MANTENIMIENTO (Eh) EN-60 -

DOS FIBRAS MANTENIDAS A DIFERENTESCORRIENTE DE MANTENIMIENTO (Ih) EN

LONGITUDES DE SARCCkERADOS FIBRAS MANTENIDAS A DIFERENTES

LONGITUDES DE SARCÓMERA

E - 7 s -2

Y

3 3<o -lOO- - 7 0 -? z n+ .- . - 4 0 0 yr

.c) “0< 06 f

- 6 5 -/ - VALORES AJUSTADOS - VALORES AJUSTADOS0 VALORES EXPERIMENTALES 0 VALORES EXPERIMENTALES

- 1 0 5 -- 9 9 - 9 8

Eh D 2.28 um ( m V )

1- 9 7

- 6 0- 7 s

7-60 -El1 - 8 2 -63

Ih A 2 . 2 8 um (nA)

Figura 15. Corriente y voltaje de mantenimiento (Ih y Eh respectivamente ) en diferentesfibras. El panel A muestra la evolución del Eh durante dos horas de experimentación en dos fibrasdistintas mantenidas a diferente LS (2.28 pm y 4.56 Pm). El panel B muestra la evolución de la Ih enlas dos fibras y a las mismas LS ya citadas. Las fibras se sellaron una vez que fueron estiradas a la LSdeseada. Los símbolos corresponden a los valores experimentales y las lineas corresponden a losajustados a una función del tipo Y= mx + b. Ambos pariimetros fueron medidos en un prepulso de 3ms.

57

El cuadro No. 9 resume los resultados obtenidos en la figura anterior.

2.28 Pm de LS 4.56 Pm de LS

-82.04 -97.55 -69.31 -100.71-81.50 -97.74 -68.95 -100.65-80.66 -97.86 -68.69 -100.97-79.72 -98.33 -67.86 -100.79-80.10 -98.23 -68.07 -100.93-80.83 -98.49 -67.18 -101.01-79.95 -98.76 -68.66 -101.09

Cuadro No.9 Corriente y voltaje de mantenimiento en 2 fibras distintas mantenidas a LSextremas (2.28 y 4.56 Pm) durante 2 horas de experimentación. Ambos parámetros fueron medidos enel prepulso (3 ms).

Considerando estos resultados y comparando con los datos mostrados en la figura 8 de la primerafase experimental, podemos estar seguros que los resultados obtenidos en dicha fase son producto de unareducción en la resistencia de los sellos de vaselina la cual se presenta durante la manipulación al tratar deestirar a una misma fibra a diferentes LS. De esta manera, junto con los hallazgos de la segunda faseexperimental, descartamos que la fibra se lesiona cuando es sobreestirada, al menos hasta las LS aquíestudiadas ( 4.56 urn ).

58

3.11 EFECTO DE LA LS SOBRE EL DIÁMETRO EN FIBRAS ESQUELÉTICASANFIBIO.

Dado que la mayoría de las fibras estudiadas presentan diferentes diámetros (en um) cuando no sonestiradas, analizamos el cambio de diámetro en función de su LS, En fibras no estiradas, los diámetrososcilan entre 140 y 90 um sin embargo, cuando son sometidas a estiramiento hasta akanzar 4.Opm de LS (a las cuales se valora el efecto máximo del estiramiento sobre los eventos estudiados), el diámetro inicial delas fibras decrece hasta en un 50%; en vista de esto, nos propusimos demostrar dos puntos queconsideramos importantes:a) Como es este cambio?, es decir que tipo de comportamiento sigue.b) que tan confiable es la apreciación visual (realizada en nuestro caso con microscopio de luz) del cambiode LS y diámetro de la fibra con respecto a t&rkas que involucran la utilización de microscopía electrónicay rayo láser? (L. Moss, E. Swinford and L. Greaser 1983 ) y (Haruo Sugi and Takakazu Kobayashi 1983).Para responder a las anteriores preguntas procedimos de la siguiente manera:

1) se montaron 5 fibras (en diferentes tiempos) en la cámara de disección previamente preparada conla única finalidad de valorar el cambio de diámetro en función de la LS y, bajo control microscópico seestiró la fibra desde 2.28 hasta 4.56 Pm.

2) Los valores de los diámetros visualizados (en Pm) de las 5 fibras, fueron primeramenteporcentualizados y luego normalizados para posteriormente ser sometidos a un análisis de regresión linealque se ajusta a la función Y= mx + b , donde Y es el diámetro a calcular y X es la LS conocida. El análisispromedio proporciona los siguientes valores:

m = -0.193b = 1.4343r = 0.9972

Como puede verse en la figura 16, en base a los resultados del análisis, puede inferirse que cuandouna fibra es estirada el cambio de diámetro en función de su LS es lineal. De esta manera, es factiblecalcular el diámetro de cualquier fibra que ha sido estirada si previamente conocemos su LS e introducimoslos resultados del análisis de r;tr;esión lineal en una función del tino:

- 1EFECTO DEL CAMBIO DE LONGITUD DE

Ys;Rmt&SOBRE EL DIAHETRO. VALORES NORMALIZADOS

1.1

1 . o

E= 0.0L!j 0.6õ

0.7

Figura No 16. Efecto de la LS’Mgy,v”,Pdi~~“,:‘,O’“,êc;l,m)rror~ La linea continua representa elajuste a la función Y= mx + b a partir de la cual se obtuvieron los valores de m, b, y r mostrados en lafigura, y los símbolos corresponden a los valores experimentales.

59

En la figura 17 tenemos, en dos fibras, la comparación de los diámetros experimentales observados almicroscopio (medidos), con los diámetros calculados a partir de la función Y = mx + b. Como puedeobservarse, la diferencia entre ambas mediciones es mínima, con una desviación estandar de 1.5 pm en lafibra a, y 1.3 Pm en la fibra b.

EFECTO DEL CAMBIO DE LONGITUD DE

4 0 1SARdMERA SOBRE EL DdMETRO EN

DIFERENTES FIBRAS.

2 3 4 5

LONGITUD DE SARdMERA (um)

) DIAMETROSCALCULADOS

Fígura No 17. Comparación en dos fibras (a y b) de diámetros medidos experimentalmente con loscalculados a partir de la función Y= mx+b.

El cuadro 10 resume los resultados obtenidos en la figura 17.

-----__------_------______________I_____--------------

FIBRA A FIBRA BLS. D.E. D.C. D.E. D.C.(i-N (W (w)

-__---_----_---_---________II___________---------------------------------2.28 91.2 91.2 102.6 102.62.85 79.8 80.4 91.2 90.53.25 68.4 73.3 85.5 82.53.50 77.5 77.53.80 62.7 63.6 68.4 71.64.07 57.0 58.84.14 62.7 64.84.38 51.3 53.34.56 49.0 50.2 57.0 56.4

--------------------_________I__________------------------------------------

Cuadro 10. Comparación de diámetros medidos experimentalmente (D.E.) con los diámetroscalculados (D.C.) a partir de la regresión lineal y =mx + b en la cual se introducen los valores de m= -0.1937 b=y 1.4343.

60

IV. DISCUSIÓN:

Al estirar una fibra muscular, se producen cambios en la estructura de la superficie membranal de lacual, es bien conocida su forma a manera de plegamientos y foldeos; sin embargo, si el estiramiento norebasa una LS mayor a 7.0 pm, la integridad de la membrana no se ve afectada (Dulhunty A F, andFranzini-Armstrong C., 1975); se sabe que el estiramiento a LS menores de 4.0 um no alteran lascaracterísticas eléctricas de la membrana y la liberaci6n de Ca++ desde el RS se presenta con un cursonormal (Csemoch L, Pizarro G, Uribe 1 y Ríos E, 1991); sin embargo, cuando una fibra es estirada a LSmayores de 4.0 um, la liberación de Ca++ desde el RS se encuentra inhibida (Taylor S R, Rudel R andBlinks J R, 1974; tambien Baylor, 1977) lo cual sugiere una afección en el AEC. Este hallazgo y losobtenidos en 1992 por Uribe 1, Candia y Hernández quienes reportaron ausencia de movimiento de carga ypresencia de corriente de calcio de caracteristicas normales en fibras estiradas a 4.5 um de LS, nos sirvieronde base para el planteamiento de la hipótesis de trabajo mencionada previamente (ver introducción).

Pareceria lógico pensar que la inhibición de la liberación de Ca++ en fibras estiradas a 4.5 Pm de LSsea debida a una lesión de la membrana durante el estiramiento extremo, sin embargo, las característicaseléctricas (respuestas electrotónicas y potenciales de acción , ver resultados) de las fibras sobreestiradas sonsimilares a las obtenidas en fibras no estiradas, lo cual nos permite inferir que el sobreestiramiento (almenos a esta LS) no altera la integridad de la membrana y como consecuencia no es responsable de lainhibición de liberación de Ca++ desde el RS.

En el estudio de las respuestas electrotónicas realizado en una misma fibra estirada varias veces,puede observarse como el curso temporal ante un mismo patrón de estímulos es similar tanto en fibrasestiradas como no estiradas, sin embargo, la amplitud de la respuesta (Emax) difiere notablemente,tendiendo a disminuir conforme aumenta la LS, lo cual no sucede cuando se analizan las respuestaselectrotónicas de la segunda fase experimental. La relación corriente-voltaje de membrana exhibe uncomportamiento lineal con valores de conductancia que caen dentro de un mismo rango en ambas fasesexperimentales, sin embargo, las diferencias entre las pendientes de las relaciones podrían ser mayores a lasmostradas en las figuras 4 y ll si el voltaje de mantenimiento (Vh) y el diámetro de la fibras a las diferentesLS estudiadas fuera considerado, en el entendido de que a mayor LS es menor el Vh y el área de membranasometida a fijación de corriente. La capacitancia de nuestras fibras .estiradas fue calculada midiendo el ftreabajo la curva del transiente capacitivo proporcionando valores de 6-8 p.F/cm2, los cuales son similares a losobtenidos en fibras no estiradas; en apoyo a ello, muy recientemente, Uribe 1 y Valdiosera R (comentariopersonal), han obtenido mediciones más precisas de capacitancia mediante mediciones de impedancia conlas cuales se obtienen capacitancias del mismo orden que con nuestro procedimiento; lo anterior apoya unaintegridad (y conexión) del sistema tubular, por lo que parece razonable pensar que la membrana tubular sedespolarize normalmente y genere, como se aprecia en los resultados, potenciales de acción decaracterísticas normales para esta preparación, así como curvas de refractariedad y de excitabilidad cuyasamplitudes y cursos temporales son similares tanto en fibras no estiradas como en sobreestiradas a 4.56 umde LS.

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En cualquier caso, parece claro que cuando la libra es estirada a LS mayores de 4.2 um no sepresenta liberación de Ca++ desde el RS muy probablemente por una afección del AEC. Una causa quepodría explicar la ausencia del AEC, es que el estiramiento de la fibra a LS mayores de 4.2 um afecte aIsensor de voltaje (receptor a DHP) del AEX; respecto a esto, los hallazgos reportados por Uribe 1 y col en1992, contribuyen a reforzar esta hipótesis, ya que muestran una inhibición del movimiento de cargacuando la libra es estirada a 4.5 um de LS. De la misma manera, pensamos que la ausencia de movimientode carga en estas fibras sobreestiradas junto con el registro de corrientes de Ca++ de caracteristicasnormales (Uribe 1, Candia y Hernández 1992 ) podría ser una forma de disgregar la doble función que hasido atribuida al receptor a DHP de la membrana tubular, es decir, como sensor de voltaje para el AEC ycomo canal de Ca++, o bien, que el movimiento de carga no corresponda al sensor del AEC, es decir que nosea un evento capacitivo sino iónico.

Sin duda alguna la ausencia del movimiento de carga en fibra sobrestirada a 4.5 um asociado alhecho de que a esta longitud sarcomérica las fibras no liberan Ca++, contribuye a fortalecer las evidenciasque apoyan un acople mecánico entre ambas membranas de la triada como mecanismo para explicar elAEC; Por otro lado el registro de corrientes de Ca++ en estas condiciones experimentales dificulta, pero sindescartar, el sostenimiento de la hipótesis de liberación de Ca++ por Ca++ planteada por Endo en 1985como mecanismo para explicar el AEC en fibra muscular esquelética.

Pretendemos en un futuro analizar las corrientes iónicas y el movimiento de carga a LS de 4.5 umpara comprender mejor el efecto del estiramiento sobre las propiedades eléctricas de la membrana y poderexplicar por que a esta LS si se presenta carga de activación para los canales iónicos (como lo sugiere lapresencia de PA obtenidos) pero no para el movimiento de carga. En cualquier caso este trabajo apoya lahipótesis de un contacto mecánico entre las membranas de la triada para el AEC, pero no descarta unacomunicación de tipo eléctrico (Matías R T 1980) ni una interacción de tipo alostérico ( Ríos E andKarhanek 1993) entre ambas membranas de la triada para explicar el AEC.

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RELACIÓN LS-DIÁMETRO.

Valorar el cambio de longitud de sarcómera en una fibra cuyo diámetro promedio es de 100 pmutilizando un microscopio óptico cuyo objetivo de mayor aumento es de 40X, se antoja difícil y sujetable alecturas erróneas, sin embargo, como vimos en los resultados, además de demostrar que el cambio dediámetro en función de la LS sigue un comportamiento prácticamente lineal (ver figura 16), si comparamosnuestras lecturas sobre la LS realizadas con microscopía óptica con las de otros autores que utilizantécnicas que involucran la difracción óptica con rayo 1áse.r (Haruo Sugi and Takakazu Kobayashi, 1993) omicroscopía electrónica (R L Moss, A E Swinford, 1983), vemos que nuestras lecturas son muy semejantes.Un ejemplo se muestra en el cuadro No ll en el que comparamos nuestros resultados con las de los autoresque utilizan microscopía electrónica:

-_----------------------------------------------------------------------------------

LS (Pm) Diámetro óptico (Pm) Diámetro electrónico (Pm)----------------------------------------------------------------------------~-

2.52 78 762.83 67.3 663.10 63.3 583.36 57 553.61 53 5 1

Cuadro 11. Comparación de lecturas (LS y diámetro) con respecto a otros autores. Para llevara cabo la comparación, utilizamos fibras cuyo diámetro y LS en el reposo fuesen semejante alutilizado por los autores con los cuales comparamos nuestros resultados.

En la figura 17, podemos apreciar una comparación entre los resultados obtenidos en dos fibras pormedición óptica y los calculados por un análisis de regresión lineal, en donde puede apreciarse que ladiferencia de los valores obtenidos por ambos métodos es mínima.

En cualquier caso, y por cualquier método, la certeza de nuestras mediciones nos proporcionanconfianza para decir que el comportamiento que sigue el cambio de diámetro en función de la LS es lineal,independientemente de cual sea su razón, además respalda la afirmación de que conociendo la LS de unafibra es factible conocer su diámetro.

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V. CONCLUSIONES:

1) EL SOBREESTIRAMIENTO DE UNA FIBRA ESQUELÉTICA A LONGITUDES DESARCÓMERA MAYORES DE 4.0 pm NO AFECTA:

a) LA INTEGRIDAD NI EL ÁREA TOTAL DE LA MEMBRANA

b) LA MAGNITUD Y EL CURSO TEMPORAL DE LAS RESPUESTAS ELECTROTÓNICASDE LA MEMBRANA.

c) LA GENERACIÓN, VELOCIDAD, CURSO TEMPORAL Y AMPLITUD DE LOSPOTENCIALES DE ACCIÓN EN FIBRAS SOBREESTIRADAS.

d) LA RELACIÓN INTENSIDAD-DURACION DE LA FIBRA ESQUELÉTICA

e) LA REFRACTARIEDAD DE LA FIBRA ESQUELÉTICA

2) LA INHIBICIÓN DE LA LIBERACIÓN DE CALCIO DESDE EL RS VISTO ENFIBRAS ESTIRADAS A LS MAYORES A 4.0 Pm, SE DEBE PROBABLEMENTE AEFECTOS DEL ESTIRAMIENTO SOBRE EL SENSOR DE VOLTAJE Y NO A LESIÓNDE LA FIBRA.

3) APOYAMOS LA HIPÓTESIS DE UN CONTACTO MECÁNICO ENTRE AMBASMEMBRANAS DE LA TRIADA PARA EL AEC.

4) EL CAMBIO DE DIÁMETRO EN UNA FIBRA ESQUELÉTICA EN FUNCIÓN DESU LS ES PRÁCTICAMENTE LINEAL.

5) LA UTILIZACION DEL MICROSCOPIO DE LUZ CONVENCIONAL ESCONFIABLE PARA REALIZAR MEDICIONES DE LS.

6) EL ABORDAJE DE LA TÉCNICA EN FIBRAS SELLADAS Y SOMETIDASPOSTERIORMENTE A DIFERENTES LS FUE ERRÓNEA, SIN EMBARGO, LATÉCNICA DE FIJACIÓN DE CORRIENTE CON DOS SELLOS DE VASELINARESULTA SATISFACTORIA CUANDO SE UTILIZA EN FIBRAS SOBREESTIRADASANTES DE SER SELLADAS.

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