PORTADA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE NUEVO LEÓN …

PORTADA

UNIVERSIDAD AUTOacuteNOMA DE NUEVO LEOacuteN

FACULTAD DE CIENCIAS QUIacuteMICAS

CONTROL POBLACIONAL Y OSCILATORIO UTILIZANDO EL

Quorum sensing DE Staphylococcus aureus MEDIANTE UN

CIRCUITO GENEacuteTICO DE Escherichia coli

Por

MC DIEGO FRANCISCO BENIacuteTEZ CHAO

Como requisito parcial para obtener el Grado de DOCTOR EN

CIENCIAS con orientacioacuten en Microbiologiacutea Aplicada

2021

ii

iii

UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada iv

CONTRAPORTADA

RESUMEN

Diego Francisco Beniacutetez Chao Fecha de graduacioacuten 2021

Universidad Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten

Facultad de Ciencias Quiacutemicas

Tiacutetulo de Estudio Control poblacional y oscilatorio utilizando el Quorum Sensing

de Staphylococcus aureus mediante un circuito geneacutetico de Escherichia coli

Nuacutemero de paacuteginas 156 Candidato para el Grado de Doctor en Ciencias con

Orientacioacuten en Microbiologiacutea Aplicada

Aacuterea de estudio Microbiologiacutea Aplicada Biologiacutea Sinteacutetica y Bacteriocinas

Propoacutesito y Meacutetodo de Estudio El incremento de infecciones por S aureus

resistentes a meticilina (MRSA) ha ganado importancia en los sistemas de salud

puacuteblicos mundiales en las uacuteltimas deacutecadas Diversos agentes terapeacuteuticos

alternativos a los antibioacuteticos han sido desarrollados para el tratamiento de este

tipo de infecciones Recientemente bajo los principios de la Biologiacutea Sinteacutetica

se han habilitado ceacutelulas enteras que sirvan como biosensores detectando

moleacuteculas producidas por patoacutegenos y que como resultado liberen una

sustancia antimicrobiana que erradique al patoacutegeno como las bacteriocinas

Actualmente los peacuteptidos sentildeales y los peacuteptidos de fusioacuten han sido

ampliamente usados para mejorar la produccioacuten y purificacioacuten de bacteriocinas

en sistemas recombinantes En este trabajo presentamos el disentildeo in silico que

emula a E coli para que actuacutee como biosensor al detectar moleacuteculas de

Quorum Sensing (QS) de MRSA productoras de sentildeales AIP-II y que en

respuesta produzca Lacticina Q (LnqQ) una bacteriocina con antecedentes

contra ceacutelulas MRSA Adicionalmente experimentamos la capacidad del

peacuteptido sentildeal N-AmyE y el peacuteptido de fusioacuten SmbP para la produccioacuten

heteroacuteloga de LnqQ en el periplasma y el citoplasma de ceacutelulas de E coli

respectivamente

Contribuciones y Conclusiones En primera instancia se construyeron dos moacutedulos

geneacuteticos biosensor y de bacteriocina ambos moacutedulos fueron ensamblados en

el plaacutesmido Dual Biosensor-Killer Ambos moacutedulos fueron optimizados para su

expresioacuten en E coli para incrementar el rendimiento de produccioacuten de proteiacutenas

recombinantes El anaacutelisis predictivo del vector nos permite intuir que su efecto

en las ceacutelulas E coli las emulariacutea para detectar moleacuteculas de QS producidas

por MRSA productoras de AIP clase II y ademaacutes para producir y excretar LnqQ

en funcioacuten a la concentracioacuten externa al peacuteptido autoinductor de MRSA Los

resultados predictivos abren la posibilidad de disentildear antibioacuteticos terapeacuteuticos

UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada v

inteligentes que puedan atacar patoacutegenos de resistencia Con relacioacuten al

peacuteptido sentildeal N-AmyE y al peacuteptido de fusioacuten SmbP observamos que nivel

predictivo ambos eran candidatos potenciales para la produccioacuten periplaacutesmica y

citoplaacutesmica de LnqQ en ceacutelulas de E coli respectivamente Sin embargo

nuestros resultados experimentales demostraron que la bacteriocina LnqQ no

logroacute ser producida ni purificada cuando estuvo acoplada con N-AmyE o SmbP

Estos resultados enriquecen la literatura sobre ambas etiquetas proteicas asiacute

como tambieacuten descubrimos puntos a consideracioacuten que pudieran ser

importantes en afectar la produccioacuten y purificacioacuten cuando LnqQ es acoplada

con diferentes etiquetas proteicas en ceacutelulas de E coli

UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada vi

PRESENTACIOacuteN

CONTROL POBLACIONAL Y OSCILATORIO UTILIZANDO EL QUORUM

SENSING DE Staphylococcus aureus MEDIANTE UN CIRCUITO GENEacuteTICO

DE Escherichia coli

Presentado por

MC Diego Francisco Beniacutetez Chao

El presente proyecto fue mayormente realizado en las instalaciones del

Laboratorio de Biologiacutea Sinteacutetica y de Sistemas del Centro de Investigacioacuten en

Biotecnologiacutea y Nanotecnologiacutea de la Facultad de Ciencias Quiacutemicas de la

Universidad Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten con la asesoriacutea del Dr Joseacute Rubeacuten

Morones Ramiacuterez y en el menor medida en el Laboratorio de Expresioacuten y

Purificacioacuten de Proteiacutenas unidad perteneciente a la Facultad de Ciencias

Quiacutemicas de la Universidad Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten con apoyo del Dr Xristo

Zaacuterate Kalfoacutepulos Este proyecto fue auspiciado por el Consejo Nacional de

Ciencia y Tecnologiacutea (CONACYT) mediante el apoyo con el Beca Nacional de

Posgrado (nuacutemero de becario 289476)

UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada vii

AGRADECIMIENTOS

Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologiacutea (CONACYT) por el apoyo

brindado con la Beca Nacional de Posgrado con nuacutemero de becario 289476

(CVU no 516171) para la continuacioacuten de estudios

A la Facultad de Ciencias Quiacutemicas (FCQ) y a la Universidad Autoacutenoma de

Nuevo Leoacuten (UANL) por el apoyo otorgado con la aprobacioacuten de becas y por el

uso directo e indirecto de sus instalaciones materiales y equipos

Al Dr Joseacute Rubeacuten Morones Ramiacuterez mi asesor a quien agradezco por la

oportunidad de colaborar en el equipo de investigacioacuten Nanobiotechnology

Research Group (NBR) Externo mi agradecimiento por las asesoriacuteas y el uso

de instalaciones equipos y materiales en el Centro de Investigacioacuten en

Biotecnologiacutea y Nanotecnologiacutea (CIBYN) asiacute como el financiamiento para la

obtencioacuten de materiales de experimentacioacuten y ejecucioacuten de servicios y el

mejoramiento de mi vida profesional

Al MC Francisco de Jesuacutes Balderas Cisneros y al Dr Angel Leoacuten Buitimea

miembros del NBR y quienes fueron clave en la elaboracioacuten de este proyecto

asiacute como en los artiacuteculos cientiacuteficos redactados durante el proceso doctoral

Al Dr Xristo Zaacuterate Kalfoacutepulos miembro del comiteacute tutorial por su apoyo

teacutecnico y asesoriacutea por el equipo de investigacioacuten del Laboratorio de Expresioacuten y

Produccioacuten de Proteiacutenas (PEP) El agradecimiento se extiende a David Peacuterez

Bryan Santos y Jessica Goacutemez por sus importantes contribuciones

A los demaacutes miembros NBR asiacute como del comiteacute tutorial por sus comentarios

revisiones y asesoriacuteas en la elaboracioacuten de este proyecto

A mis padres Mariacutea Guadalupe Chao Soto y Alejandro Beniacutetez Villegas y a mi

hermano Angel Alejandro Beniacutetez Chao por su apoyo emocional e

incondicional en el transcurso de este proyecto

UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada viii

DEDICATORIA

Para Dios iexclGracias por el don de pensar

Para mi mamaacute Lupita y mi papaacute Alejandro

Para mis hermanos Angel Alejandro y Jesuacutes Alejandro (+)

Para mis mejores amigos Esthela Maldonado Ricardo ldquoMankisrdquo Garciacutea Ricardo ldquoCiegordquo

Garciacutea Edgar ldquoBomboacutenrdquo Villareal Gerardo ldquoPepisrdquo Villarreal Mayela ldquoMonkeyrdquo Maldonado

Aniluacute Maldonado Eduardo Mendoza Alejandra Villarreal Isaac ldquoBebordquo Gonzaacutelez Cristy Llanes

Salma Alemaacuten iexclGracias por ser tan importantes para miacute

Para mis colegas del NBR muy en especial para Paco Balderas Angel Leoacuten Javier Garza

Paco ldquoNegrordquo Rodriacuteguez Dago Torres Luis Cepeda Albert Lerma Jordy Lerma Ceacutesar Garza

Alex de la Garza Isabel Caamal Gricelda Mendiola Fatemehalsadat Tabatabaeifar Hossein

Alishaharatobotni Nahid Rafiei y otros maacutes Se extiende la dedicatoria a mis colegas en PEP en

especial para David Peacuterez Jessica Goacutemez Brayan Santos Evelyn Martiacutenez

Para los que fueron mis estudiantes de verano o de servicio social con mencioacuten especial para

Montse Villegas Rauacutel Garciacutea Cinthia Castillo Sarai Fierros Jessica Ojeda y otros maacutes

Para mis colegas de generacioacuten de doctorado en especial para Paco Balderas David Peacuterez y

Gaby Quintanilla

Para el equipo administrativo del CIBYN con menciones especiales para Karla Islas y Mayra

Sandoval asiacute como de todo el equipo de intendencia muy en especial para la Sra Antonia

ldquoTontildeitardquo Sandoval y la Sra Martha Flores asiacute como para el guardia Nehemiacuteas y el chofer

Ernesto

Para el equipo administrativo de la Unidad de Posgrado de la Facultad de Ciencias Quiacutemicas

con mencioacuten especial para Karina Navarro y para la Sra Edmunda de intendencia

Para mis queridos perros muy en especial para Lucky Toby (+) y Pelusa (+)

Para mis ex alumnos de preparatoria del Centro Escolar Gante iexclLo logreacute

Para todos los que han trabajado como meseros y repartidores para continuar con sus estudios

yo sostener una familia iexclUstedes tienen mis maacutes sinceros respetos

Para todos los que han roto rompen y romperaacuten los liacutemites de lo conocido

UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada ix

Si nos negamos categoacutericamente a reconocer que somos susceptibles de

cometer un error una equivocacioacuten profunda ndash nos acompantildearaacute siempre Pero

si somos capaces de evaluarnos con un poco de coraje por muy lamentables

que sean las reflexiones que podamos engendrarnos nuestras posibilidades

mejoran enormemente

Carl Sagan

El mundo y sus demonios La ciencia como una luz en la obscuridad (1995)

UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada x

TABLA DE CONTENIDO

PORTADA I

FIRMAS DE APROBACIOacuteN DE TESIS II

FIRMAS DE REVISIOacuteN DE TESIS III

CONTRAPORTADA IV

RESUMEN IV

PRESENTACIOacuteN VI

AGRADECIMIENTOS VII

DEDICATORIA VIII

TABLA DE CONTENIDO X

LISTA DE FIGURAS XIV

LISTA DE TABLAS XV

LISTA DE ABREVIATURAS XVI

CAPIacuteTULO 1 INTRODUCCIOacuteN 1

11 ERA DE LOS ANTIBIOacuteTICOS 1

12 INFECCIONES RESISTENTES A LOS ANTIBIOacuteTICOS AMENAZA MUNDIAL 2

13 PROBLEMA SANITARIO CON STAPHYLOCOCCUS AUREUS RESISTENTES 4

14 TRATAMIENTOS ACTUALES PARA EL COMBATE A INFECCIONES RESISTENTES 5

15 TRATAMIENTOS ALTERNATIVOS A LOS ANTIBIOacuteTICOS 6

CAPIacuteTULO 2 ANTECEDENTES 8

21 CONTROL BIOLOacuteGICO POBLACIONAL POR MICROORGANISMOS 8

22 BIOLOGIacuteA SINTEacuteTICA Y SU PAPEL EN PRODUCCIOacuteN DE BACTERIOCINAS 8

221 Introduccioacuten a la Biologiacutea Sinteacutetica 8

222 Definicioacuten de los biosensores 9

23 QUORUM SENSING COMUNICACIOacuteN ENTRE CEacuteLULAS 10

231 Quorum Sensing de Staphylococcus aureus 11

232 Sistema de biosiacutentesis de AIP AgrB y AgrD 12

233 Sistema biosensor AgrC y AgrA 12

234 Hipervariabilidad del AgrD y su relacioacuten con la comunicacioacuten cruzada 12

24 BIOSENSORES DE CEacuteLULAS ENTERAS BASADOS EN DETECCIOacuteN DE QS 13

25 LAS BACTERIOCINAS 15

251 Introduccioacuten a las bacteriocinas 15

252 Diferencia entre peacuteptidos antimicrobianos bacteriocinas y antibioacuteticos 17

UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada xi

253 Bacteriocinas utilizadas contra S aureus resistentes 19

254 Bacteriocinas contra patoacutegenos resistentes a los antibioacuteticos 19

255 Breve clasificacioacuten de las bacteriocinas 20

256 La bacteriocina Lacticina Q 21

257 Composicioacuten geneacutetica de la LnqQ y genes asociados 22

26 PRODUCCIOacuteN HETEROacuteLOGA DE BACTERIOCINAS 23

261 Peacuteptido sentildeal N-AmyE 24

262 Peacuteptido de fusioacuten SmbP 25

CAPIacuteTULO 3 JUSTIFICACIOacuteN HIPOacuteTESIS Y OBJETIVOS 26

31 Justificacioacuten 26

32 Hipoacutetesis 28

33 Objetivo General 28

34 Objetivos Especiacuteficos 28

35 Metas 29

36 Aportacioacuten cientiacutefica 29

CAPIacuteTULO 4 METODOLOGIacuteA 30

41 Concepto del biosensor basado en ceacutelulas enteras 30

42 Cepas bacterianas 30

43 Disentildeo de moacutedulos geneacuteticos biosensor y de bacteriocina 31

44 Estrategia general para el ensamblaje de moacutedulos 33

45 Optimizacioacuten de los codones nativos en las secuencias seleccionadas 33

46 Especificidad del biosensor por prediccioacuten de comunicacioacuten cruzada 34

47 Prediccioacuten de solubilidad de proteiacutenas 34

48 Prediccioacuten de localizacioacuten subcelular de proteiacutenas 34

49 Prediccioacuten de epiacutetopos de ceacutelulas tipo B 35

410 Prediccioacuten de alergenicidad 35

411 Disentildeo y anaacutelisis in silico de pETNL 35

412 Disentildeo y anaacutelisis in silico del pSmbP-LnqQ 37

413 Identificacioacuten de codones de paro en los disentildeos 38

414 Prediccioacuten de peso molecular de N-AmyELnqQ y SmbP-LnqQ 38

415 Prediccioacuten de solubilidad y localizacioacuten celular N-AmyELnqQ y SmbP-LnqQ 39

416 Prediccioacuten de estructura secundaria y tridimensional de N-AmyELnqQ y SmbP-LnqQ 39

417 Transformacioacuten de ceacutelulas de E coli con pET30(a)+ pETNL y pSmbP-LnqQ 39

418 Determinacioacuten de expresioacuten proteica por SDS-PAGE 44

419 Presuntas causas de la ausencia de bandas de proteiacutenas de intereacutes en los geles 48

UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada xii

CAPIacuteTULO 5 MATERIALES Y EQUIPOS 50

51 Materiales y reactivos 50

52 Equipos de laboratorio 51

53 Lugares de experimentacioacuten 53

54 Seguridad en el laboratorio y disposicioacuten de residuos 53

CAPIacuteTULO 6 RESULTADOS Y DISCUSIONES 54



63 Disentildeo de los moacutedulos biosensor y de bacteriocina 55


65 Optimizacioacuten de los codones nativos 60

66 Especificidad de biosensor por prediccioacuten de comunicacioacuten cruzada 61


68 Localizacioacuten subcelular de proteiacutenas 64











619 Presuntas causas de la ausencia de bandas de intereacutes en los geles de proteiacutenas 95

CAPIacuteTULO 7 CONCLUSIONES 105

ANEXOS 106

Divulgacioacuten de la investigacioacuten 106

Archivos de disentildeo 107

Resumen autobiograacutefico 108

REFERENCIAS 109

UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada xiii

UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada xiv

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1 CONCEPTO DEL BIOSENSOR BASADO EN CEacuteLULAS ENTERAS 30

FIGURA 2 SISTEMA QS PARA DETECCIOacuteN Y ELIMINACIOacuteN DE S AUREUS 54

FIGURA 3 MOacuteDULOS BIOSENSOR Y DE BACTERIOCINA 55

FIGURA 4 ESTRATEGIA DE CONSTRUCCIOacuteN IN SILICO 58

FIGURA 5 REPRESENTACIOacuteN ESQUEMAacuteTICA DEL VECTOR DUAL BIOSENSOR-KILLER 59

FIGURA 6 PREDICCIOacuteN DE LA ESTRUCTURA SECUNDARIA DE N-AMYELNQQ 76

FIGURA 7 PREDICCIOacuteN DE LA ESTRUCTURA SECUNDARIA DE SMBP-LNQQ 76

FIGURA 8 PREDICCIOacuteN DE ESTRUCTURA TRIDIMENSIONAL DE N-AMYELNQQ 77

FIGURA 9 PREDICCIOacuteN DE HEacuteLICES TRANSMEMBRANALES PARA N-AMYELNQQ 77

FIGURA 10 PREDICCIOacuteN DE ESTRUCTURA TRIDIMENSIONAL DE SMBP-LNQQ 78

FIGURA 11 TRANSFORMACIOacuteN DE E COLI DH5Α Y BL21 (DE3) CON PET30A(+) PETNL Y PSMBP-LNQQ 79

FIGURA 12 GEL DE AGAROSA CON PLAacuteSMIDOS PETNL Y PSMBP-LNQQ 80

FIGURA 13 SIMULACIOacuteN DE PCR PARA VECTORES DE EXPRESIOacuteN 83

FIGURA 14 PCR DE PETNL 84

FIGURA 15 PCR DE PSMBP-LNQQ 84

FIGURA 16 GEL DE E COLI BL21 (DE3) CON PETNL INDUCIDO A 25degC 87

FIGURA 17 GEL DE E COLI BL21 (DE3) PETNL INDUCIDO A 37degC 88

FIGURA 18 GEL DE E COLI BL21 (DE3) PSMBP-LNQQ INDUCIDO A 25degC Y 37degC 91

FIGURA 19 GEL DE E COLI ORIGAMI PSMBP-LNQQ INDUCIDO A 25degC Y 37degC 92

FIGURA 20 GEL DE E COLI BL21 (DE3) CON CONTROLES INDUCIDO A 37degC 93


UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada xv

LISTA DE TABLAS

TABLA 1 USO DE CODONES PREVIO Y DESPUEacuteS DE LA OPTIMIZACIOacuteN 61

TABLA 2 PREDICCIOacuteN DE COMUNICACIOacuteN CRUZADA 63

TABLA 3 PREDICCIOacuteN DE SOLUBILIDAD DE PROTEIacuteNAS 64

TABLA 4 PREDICCIOacuteN DE LOCALIZACIOacuteN SUBCELULAR DE PROTEIacuteNAS 65

TABLA 5 PREDICCIOacuteN DE EPIacuteTOPOS DE CEacuteLULAS B EN LNQQ 66

TABLA 6 SECUENCIA AMINOACIacuteDICA DE N-AMYELNQQ 69

TABLA 7 SECUENCIAS UTILIZADAS PARA PREDICCIOacuteN DE CORTE ENZIMAacuteTICO DE N-AMYELNQQ 70

TABLA 8 PREDICCIOacuteN DE CORTE ENZIMAacuteTICO DE PEacutePTIDO SENtildeAL N-AMYE 71

TABLA 9 SECUENCIA AMINOACIacuteDICA DE SMBP-LNQQ 73

TABLA 10 PREDICCIOacuteN DE SOLUBILIDAD N-AMYELNQQ Y SMBP-LNQQ 74

TABLA 11 PREDICCIOacuteN DE LOCALIZACIOacuteN CELULAR N-AMYELNQQ Y SMBP-LNQQ 74

UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada xvi

LISTA DE ABREVIATURAS

Abreviatura Significado

E coli Escherichia coli

S aureus Staphylococcus aureus

MRSA Staphylococcus aureus resistente a meticilina

L lactis Lactococcus lactis

ESKAPE Acroacutenimo de seis especies bacterianas Enterococcus faecium Staphylococcus aureus Klebsiella pneumoniae Acinetobacter baumannii Pseudomonas aeruginosa y Enterobacter spp

OMS Organizacioacuten Mundial de la Salud

QS Quorum Sensing (Percepcioacuten de Quoacuterum)

LnqQ Lacticina Q

agrBDCA Operoacuten agr de S aureus

agrB Gen que codifica AgrB

agrD Gen que codifica AgrD

HSL Moleacutecula homo serilactonado

AIP Moleacutecula autoinductora

agrC Gen que codifica AgrC

agrA Gen que codifica AgrA

AgrB Transportadora proteasa necesaria para la maduracioacuten de AgrD

AgrD Peacuteptido precursor a la moleacutecula autoinductora

AgrC Receptor transmembranal con actividad histidina quinasa

AgrA Proteiacutena reguladora de unioacuten al DNA de respuesta

AgrA-P AgrA fosforilado

pH Potencial de hidroacutegeno

pI Punto isoeleacutectrico

AMP Peacuteptidos antimicrobianos

kDA Kilo Dalton

MIC Concentracioacuten miacutenima inhibitoria

microM Micromolar

microgml Microgramo por mililitro

lnqRQBCDEF Cluacutester geneacutetico

AmyE Alfa-amilasa

N-AmyE Peacuteptido sentildeal de la AmyE

SmbP Proteiacutena pequentildea de unioacuten a metales

SmbP Regioacuten citoplaacutesmitica de la SmbP (peacuteptido de fusioacuten)

Ala33 Las letras indican el aminoaacutecido y los nuacutemeros la posicioacuten en la cadena

IPTG Isopropil-β-D-1-tiogalactopiranoacutesido

SBP Massachussets Institute of Technologyrsquos Registry of Standard Biological Parts

KEGG Kyoto Encyclopedia Genes and Genomes

FPB FP Base

UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada xvii

PDB Protein Data Bank

nm Nanoacutemetros

DBK Plaacutesmido Dual Biosensor Killer

CAI Caacutelculo de Iacutendice de Adaptacioacuten

CUD Codon Usage Database

BUSCA Bologna Unified Subcellular Component Annotador

PCR Reaccioacuten en cadena de la polimerasa

pET30(+)a Plaacutesmido tipo pET30(+)a sin modificaciones

pETNL Plaacutesmido que contiene N-AmyELnqQ6xHis

pSmPc-LnqQ Plaacutesmido que contiene SmbP-LnqQ

LB Medio de cultivo LB

OD600 Densidad oacuteptica

microl Microlitros

microg Microgramos

degC Grados Celsius

h Hora

ml Mililitro

g Gramo

g Fuerza centriacutefuga relativa

rpm Revoluciones por minuto

min Minuto

dNTPs Trifosfatos de desoxinucleoacutetidos

V Volts

SDS-PAGE Electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS

pv Peso volumen

NaCl Cloruro de sodio

Tris-HCl Solucioacuten de Tris ajustada con aacutecido clorhiacutedrico (HCl)

M Molar

SDS Dodecil Sulfato Soacutedico

APS Persulfato de amonio

TEMED Tetramethylethylenediamine

X Veces de concentracioacuten de trabajo

mm Miliacutemetros

lnqQ Gen de lacticina Q

P2 Promotor 2 inducible del operoacuten agr de S aureus

gfp Gen de GFP

GFP Proteiacutena verde fluorescente

J23110 Promotor J23110 constitutivo para E coli

AIP-I AIP clase I

AIP-II AIP clase 2

AIP-III AIP clase 3

AIP-IV AIP clase 4

UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada xviii

Ala Alanina (A)

Arg Arginina (R)

Asn Asparagina (N)

Asp Asparato (D)

Cys Cisteiacutena (C)

Gln Glutamina (Q)

Glu Glutamato (E)

Gly Glicina (G)

His Histidina (H)

Ile Isoleucina (I)

Leu Leucina (L)

Lys Lisina (K)

Met Metionina (M)

Phe Fenilalanina (F)

Pro Prolina (P)

Ser Serina (S)

Thr Treonina (T)

Trp Triptoacutefano (W)

Tyr Tirosina (Y)

Val Valina (V)

Pnl Liasa de pectina

AmyE Amilasa E

N-AmyEPnl Liasa de pectina asociada con el peacuteptido sentildeal N-AmyE

N-AmyEAmyE Amilasa E asociada con el peacuteptido sentildeal N-AmyE

VpDef Defensina de Venerupis philippinarum

Bin1b Defensina de Rattus norvegicus

LL-37 Catelicidina de humanoschimpanceacutes

SmbP-VpDef VpDef asociado con SmbP

SmbP-Bin1b Bin1b asociado con SmbP

SmbP-LL-37 LL-37 asociado con SmbP

SUMO-LnqQ LnqQ asociado con SUMO

AI Iacutendice alifaacutetico

GRAVY Iacutendice de hidrofobicidad

CAPIacuteTULO 1 INTRODUCCIOacuteN

A lo largo de nuestra historia los humanos hemos desarrollado soluciones a los

problemas del mundo que nos rodea No es extrantildeo que el combate a las

enfermedades sean uno de los temas maacutes recurrentes Existen referencias

histoacutericas entre las diferentes civilizaciones de la antiguumledad como los chinos

(Nicola amp Abagyan 2009) aztecas (Davidson amp De Montellano 1983) y los nubia-

sudaneses (Bassett Keith Armelagos Martin amp Villanueva 1980) del uso

empiacuterico de sustancias para tratar infecciones y enfermedades Hace unos

doscientos antildeos atraacutes se pensoacute que los subproductos de la revolucioacuten industrial

seriacutean tratamiento efectivo contra infecciones y aunque los resultados fueron

alentadores al principios los resultados observados ante otro tipo de infecciones

no tuvieron el mismo eacutexito (Gaynes 2017)

11 Era de los antibioacuteticos

En 1928 Alexander Fleming encontroacute una solucioacuten efectiva para contrarrestar las

infecciones al describir al hongo Penicillium notatum que teniacutea efectos antagoacutenicos

sobre diferentes cepas estafilocoacutecicas (Fleming 1929) inaugurando asiacute la

conocida era dorada en descubrimiento de los antibioacuteticos (Podolsky 2018) Las

virtudes observadas en los antibioacuteticos fueron raacutepidamente puestas en juicio

cuando el mismo Fleming vaticinoacute en su discurso de entrega al premio Nobel que

el abuso y uso excesivo de los antibioacuteticos podriacutea generar brotes de patoacutegenos

resistentes a los antibioacuteticos (Fleming 1945) Cada vez que un nuevo antibioacutetico

era liberado a los sistemas de salud puacuteblicos pronto se reportaba un brote de

resistencia relacionado a antibioacutetico (Clatworthy Pierson amp Hung 2007) Con el

boom de nuevas clases de antibioacuteticos desde los 1940s hasta principios de 1970s

la alerta por resistencia a los antibioacuteticos quedoacute praacutecticamente inadvertida De

hecho entre los 1960s y 1970s existe evidencia que la comunidad cientiacutefica

internacional fue apaacutetica y minimizoacute el hecho de que el abuso de los antibioacuteticos

fuera una causa de resistencia a los faacutermacos en las bacterias patoacutegenas

(Podolsky 2018)

UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 2

El tema de la resistencia a los antibioacuteticos no tuvo impacto suficiente hasta que

con el paso de las deacutecadas surgieron de brotes de patoacutegenos resistentes de

importancia cliacutenica como Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA

por sus siglas en ingleacutes) tanto en Reino Unido (Gardner Oxon Stamp Bowgen amp

Moore 1962) como en Estados Unidos (Barrett McGehee amp Finland 1968) y

ademaacutes las nuevas clases de antibioacuteticos empezaron a escasear desde los 1980s

hasta casi los 2000s Adicionalmente los inversionistas se motivaron a encontrar

nuevas clases antibioacuteticos al observar maacutes ganancias en descubrir compuestos

anticanceriacutegenos (Ventola 2015) los reglamentos sanitarios se volvieron maacutes

estrictos para la liberacioacuten de antibioacuteticos para prevenir la presentacioacuten de

infecciones multirresistentes emergentes (Davies 2006) Todos estos factores

incluyendo otros que tal vez no fueron mencionados allanaron el establecimiento

de poliacuteticas en salud puacuteblica para buscar o sintetizar alguacuten faacutermaco o sustancia

que contrarreste el avance de microorganismos patoacutegenos resistentes de

relevancia cliacutenica (World Health Organization 2017)

12 Infecciones resistentes a los antibioacuteticos amenaza mundial

Cifras de la Organizacioacuten Mundial de la Salud (OMS) mostraron el peligroso

ascenso de infecciones por bacterias resistentes en las uacuteltimas deacutecadas donde se

calcula un promedio de 700000 muertes anuales para el 2019 (World Health

Organization 2019b) y la advertencia de que si los gobiernos y organizaciones

responsables de la salud puacuteblica a nivel mundial no elaboran poliacuteticas efectivas

para el 2050 tendremos un promedio de 10 millones de muertes al antildeo por

consecuencias de este tipo de infecciones (Dadgostar 2019)

En Meacutexico carecemos de un sistema de recoleccioacuten de datos confiables en este

tipo de infecciones (Amabile-Cuevas 2010) pero en un estudio realizado durante

seis meses del 2019 se recuperaron 23000 cepas resistentes a faacutermacos en 47

centros de salud puacuteblicos de todo el paiacutes siendo algunas de las maacutes comunes E

coli Klebsiella sp Enterobacter sp Pseudomonas aeruginosa Acinetobacter sp

Enterococcus faecium resistente a vancomicina y Staphylococccus aureus

resistente a meticilina (MRSA) (Vazquez-Rodriguez et al 2018)


En todas las regiones del mundo las infecciones resistentes han tenido un

peligroso ascenso En Estados Unidos las muertas anuales por infecciones

resistentes pasaron de 23000 muertes en 2013 (Frieden 2013) a 35000 durante

el 2019 (CDC 2019) Por otro lado en Europa las muertes atribuibles a

infecciones resistentes aumentaron de 25000 en 2007 (European Centre for

Disease Prevention and Control 2009) a 33110 en 2015 (Cassini et al 2019) En

42 paiacuteses del continente africano se registraron 54000 casos atribuibles a

tuberculosis multirresistente (MDR multi-resistant) y en ocho paiacuteses se registraron

3200 muertes relacionadas a la variante extremadamente resistente (XDR

extreme resistant) en un periacuteodo del 2004 al 2011 (Ndihokubwayo et al 2013) En

el continente asiaacutetico en China por ejemplo el rango de bacterias aislados que

eran resistentes a los antibioacuteticos pasoacute de 22774 casos a 190610 de 2005 a

2017 respectivamente (Qu Huang amp Lv 2019) en la India un estudio reporta

que el 70 de aislados cliacutenicos tipo Gram negativos son resistentes a los

faacutermacos y entre ellos se podiacutean encontrar cepas de Escherichia coli Klebsiella

pneumoniae Acinetobacter baumannii y Pseudomonas aeruginosa (Taneja amp

Sharma 2019)

Las infecciones resistentes son material incluso de intereacutes para el sector

econoacutemico El Banco Mundial ha elaborado dos escenarios para predecir el

impacto econoacutemico de las infecciones resistentes para el 2050 en un escenario

de bajo impacto el Producto Interno Bruto (PIB) mundial podriacutea disminuir hasta un

11 Sin embargo en un escenario de alto impacto el dantildeo al PIB global podriacutea

representar hasta una disminucioacuten de 38 Los costos al sistema de salud

puacuteblico en el mundo podriacutean oscilar entre los $300 mil millones a $1 cuatrilloacuten

presentando incluso un serio riesgo para el sector ganadero ya que en el

escenario de bajo impacto esto representariacutea una disminucioacuten de 26 esperado

a un 75 en un escenario de alto impacto (The World Bank 2016)

Las infecciones resistentes representa un punto de intereacutes incluso para la

Organizacioacuten de la Naciones Unidas para la Alimentacioacuten y la Agricultura (FAO

Food and Agriculture Organization) ya que actualmente se presume que en 42


paiacuteses donde existen datos confiables de consumo de antibioacuteticos en el sector

ganadero y de agricultura se estima que en el 2010 el consumo era de 63000

toneladas de antibioacuteticoantildeo mientras que para el 2030 se estima un consumo

105600 toneladas de antibioacuteticoantildeo representando un incremento de 67 Los

iacutendices de metabolizacioacuten de antibioacuteticos tanto en ganado como en produccioacuten

pesquera presentan una baja metabolizacioacuten ya que entre un 70-80 y un 75-

90 respectivamente son excretados a las fuentes acuiacuteferas La produccioacuten de

cultivos consume entre un 02 a 04 del total de antibioacuteticos en relacioacuten con la

produccioacuten ganadera (FAO sf)

La relevancia sanitaria mundial de S aureus es porque se trata de un miembro del

grupo ESKAPE un grupo de patoacutegenos localizados en infraestructuras

hospitalarias asilos o en equipos e instrumentos meacutedicos como ventiladores y

cateacuteteres y que son habitualmente resistentes a los antibioacuteticos (Rice 2008) Esta

bacteria es la primera causa nosocomial tanto en Latinoameacuterica (26)

Norteameacuterica (260) y la segunda causa nosocomial de Europa (195)

(Biedenbach Moet amp Jones 2004) Se presume que un 30 de la poblacioacuten total

de humanos estaacute colonizado con al menos una subespecie de S aureus

(Wertheim et al 2005) y esto podriacutea ser porque el haacutebitat de esta bacteria en los

humanos es la parte anterior de las fosas nasales (Mulcahy amp McLoughlin 2016)

13 Problema sanitario con Staphylococcus aureus resistentes

S aureus es una bacteria Gram positiva y es considerada una de las principales

causas de enfermedades en piel (Foster 1996) Ademaacutes es capaz de desarrollar

biopeliacuteculas en dispositivos implantados en seres humanos y cateacuteteres causando

infecciones croacutenicas y persistentes (Dunne 2002) La osteomielitis y periodontitis

tambieacuten son producto de la biopeliacutecula este patoacutegeno estaacute involucrado en heridas

croacutenicas en pacientes diabeacuteticos con uacutelceras y estaacute relacionado a infecciones al

endocardio oculares y en casos de rinosinusitis croacutenica (Archer et al 2011) Se

considera que es un patoacutegeno de alto riesgo para pacientes con Fibrosis Quiacutestica

ya que es el maacutes reportado entre personas con 11 a 15 antildeos con esta condicioacuten

(Razvi et al 2009)


Ahora bien se estima que entre un 13 al 74 del total de infecciones resistentes

en el mundo son causados por una variante resistente de S aureus resistente a la

meticilina la cepa MRSA (Koumlck et al 2010) la cual estaacute es sentildealada desde el

2017 por la OMS como un patoacutegeno de alta prioridad al que debe encontrarse una

solucioacuten pronta y efectiva (World Health Organization 2017) Por ejemplo en

Estados Unidos el total de pacientes por infecciones nosocomiales tipo MRSA

ascendioacute de 24 en 1975 a un 29 en 1991 (Panlilio et al 1992) y hasta casi

57 para el antildeo 2000 (NNIS 2004) En la actualidad el MRSA es considerado

endeacutemico en ese paiacutes ya que se estima que el 2 de la poblacioacuten es acarreador

de este estafilococo (Kavanagh 2019)

En Meacutexico los primeros casos de MRSA asociado a comunidad (CA-MRSA) cepa

USA300 fueron reportados a inicios del 2008 (Mariacutea E Velazquez-Meza et al

2011) y durante el 2010 un estudio anuncioacute que la cepa de MRSA maacutes

frecuentemente aislada en nuestro paiacutes era la New YorkJapan (Rodriacuteguez-

Noriega et al 2010) Tambieacuten se conoce que cepas de MRSA en hospitales

puacuteblicos en nuestro paiacutes fluctuoacute entre un 7 al 30 en pacientes entre las

deacutecadas de 1980s a 2000s (M E Velazquez-Meza et al 2004) mientras que el

Instituto Nacional de Cancerologiacutea determinoacute que 17 de las cepas aisladas de

3000 hemocultivos recuperados entre el 2005 al 2015 de pacientes con caacutencer

correspondiacutean a MRSA (Velaacutezquez-Acosta Cornejo-Juaacuterez amp Volkow-Fernaacutendez

2018)

14 Tratamientos actuales para el combate a infecciones

resistentes

En la actualidad las clases maacutes comunes de antibioacuteticos para combatir

infecciones resistentes a los antibioacuteticos son las penicilinas cefalosporinas

quinolonas macroacutelidos tetraciclinas glucopeacuteptidos y monobactaacutemicos (Taylor

Stapleton amp Paul Luzio 2002) En las uacuteltimas dos deacutecadas se han aprobado una

gran variedad de antibioacuteticos para el tratamiento de infecciones causados por

bacterias tanto Gram positivos como Gram negativos Los antibioacuteticos maacutes

recientemente reportados para el tratamiento de bacterias multirresistentes Gram


positivas incluyen β-lactaacutemicos (ceftarolina y ceftobiprol) glicopeacuteptidos

(dalbavancin oritavancin y telavancin) oxazolidinonas (tedizolid fosfato)

quinolonas (besifloxacina delafloxacin y ozenoxacina) y tetraciclinas

(omadaciclina) (Koulenti et al 2019) Seguacuten la OMS hasta el 2019 se sabe de 50

agentes antimicrobianos que se encuentran en desarrollo cliacutenico donde 32 son

antibioacuteticos activos contra patoacutegenos de prioridad de la OMS diez son agentes

bioloacutegicos 2 son clasificados como agentes novedosos y dos pertenecen al grupo

de bacterias Gram negativas multirresistentes (World Health Organization 2019a)

15 Tratamientos alternativos a los antibioacuteticos

Los patoacutegenos resisten a los antibioacuteticos bajo tres grandes mecanismos de

resistencia intriacutenseca adaptativa yo adquirida (Arzanlou Chai amp Venter 2017

Blair Webber Baylay Ogbolu amp Piddock 2015 Sandoval-Motta amp Aldana 2016)

Es por ello que urge desarrollar una solucioacuten pronta y efectiva para contrarrestar

las infecciones causadas por patoacutegenos resistentes a los antibioacuteticos los cuales

son uno de los puntos que la OMS ha declarado como prioritarios (OrsquoNeill 2016)

En la guerra contra la resistencia a los antibioacuteticos nuestro grupo de investigacioacuten

ha participado en la creacioacuten de compuestos que puedan combatirlos como

tratamientos mixtos de antibioacuteticos (Montelongo-Peralta Leoacuten-Buitimea Palma-

Nicolaacutes Gonzalez-Christen amp Morones-Ramiacuterez 2019) nanopartiacuteculas de plata

asociados con metales de transicioacuten (Javier A Garza-Cervantes et al 2017)

nanomateriales asociados con nanopartiacuteculas de plata sintetizados con poliacutemeros

sensibles al ambiente (Ruben Morones amp Frey 2007) o producidos de manera

sustentable (Escaacutercega-Gonzaacutelez et al 2018) o a partir de un exopolisacaacuterido

producido por una levadura que actuacutea como agente reductor y que estaacuten

capeados por agentes con actividad antimicrobiana y antibiopeliacutecula (Javier

Alberto Garza-Cervantes et al 2019)

Otros grupos de investigacioacuten tambieacuten han desarrollado otro tipo de armas contra

la resistencia a los antibioacuteticos como el uso de teacutecnicas de decorado en

bacterioacutefagos (phage display) para producir vacunas en la caacutepside de

bacterioacutefagos inhabilitados (Bao et al 2019) o uso de agentes de control bioloacutegico


contra patoacutegenos de alimentos (Gutieacuterrez Fernaacutendez Rodriacuteguez amp Garciacutea 2019)

o para el tratamiento de aguas residuales (Jassim Limoges amp El-Cheikh 2016)

Los esfuerzos actuales se han focalizado en encontrar yo desarrollar nuevas

clases de antibioacuteticos y agentes antimicrobianos contra bacterias resistentes (Fair

amp Tor 2014) y de prioridad ante la OMS (World Health Organization 2017) Las

corrientes alternativas a los antibioacuteticos maacutes reconocidas en la actualidad estaacuten

clasificadas en dos grandes enfoques el enfoque de prevencioacuten a las

enfermedades donde se desarrollan y se utilizan vacunas probioacuteticos o

prebioacuteticos mientras que en el enfoque por tratamiento a las enfermedades se

utilizan la terapia de fagos la aplicacioacuten directa de endolisinas yo exolisinas el

uso de microorganismos depredadores vivos o el uso directo de bacteriocinas

(Allen Trachsel Looft amp Casey 2014) Tambieacuten la Biologiacutea Sinteacutetica se ha

involucrado en resolver la problemaacutetica de infecciones resistentes a los faacutermacos

al participar en el disentildeo de biosensores basados en ceacutelulas completas que sean

capaces de destruir patoacutegenos mediante la previa de deteccioacuten de moleacuteculas

excretadas por microrganismos de intereacutes (Beniacutetez‐Chao Balderas‐Cisneros

Leoacuten‐Buitimea amp Morones‐Ramiacuterez 2021)

La biosiacutentesis purificacioacuten y aplicacioacuten de bacteriocinas contra patoacutegenos Gram

negativos y Gram positivos ha sido punto central para diversos grupos de

investigacioacuten (Cabral Penumutchu Norris Morones-Ramirez amp Belenky 2018

McAuliffe et al 1998 Rea Ross Cotter amp Hill 2011 Sandiford amp Upton 2012

Wong et al 2015) asiacute como la siacutentesis de nanocompuestos como liposomas

quitosano y nanopartiacuteculas hechos a base de compuestos de plantas (Sidhu amp

Nehra 2017) o de nanofibras (Fahim Khairalla amp El-Gendy 2016) que esteacuten

acomplejados con bacteriocinas Maacutes adelante se describiraacuten detalles sobre las

bacteriocinas y su relacioacuten en el combate a las infecciones resistentes a los

antibioacuteticos


CAPIacuteTULO 2 ANTECEDENTES

21 Control bioloacutegico poblacional por microorganismos

En la Naturaleza todos los seres vivos estaacuten interactuando y compitiendo por

nichos ecoloacutegicos para sobrevivir crecer y reproducirse para una adaptacioacuten

efectiva en el ambiente donde se desarrollan Este fenoacutemeno es universal ya que

pueden encontrarse en estilos de vida unicelulares y multicelulares (Grice et al

2009) Para competir por los nutrientes los microorganismos contienen

compuestos que matan o limitan el crecimiento de otra poblacioacuten Estos

compuestos pueden ser antibioacuteticos peacuteptidos antimicrobianos moleacuteculas de bajo

peso molecular entre otros maacutes (Gonzalez et al 2011 2010)

Cuando microorganismos vivos por sus caracteriacutesticas bioloacutegicas son usados para

suprimir la densidad poblacional de un tipo especiacutefico de organismo hacieacutendolo

menos abundante o dantildeino se le conoce como control bioloacutegico Es importante

mencionar que esta definicioacuten solo incluye a especiacutemenes vivos como

depredadores paraacutesitos nemaacutetodos hongos bacterias protozoarios inclusive

virus Sin embargo genes sin un recipiente bioloacutegico o metabolitos producidos por

un organismo de control sin que eacuteste se encuentre presente durante el control

poblacional son excluidos de esta definicioacuten (Eilenberg Hajek amp Lomer 2001)

Por ejemplo cultivos de Candida albicans (Peters et al 2010) Pseudomonas

aeruginosa (Filkins et al 2015) Bacillus subtilis (Gonzalez et al 2011)

Enterococcus faecium (Viccedilosa et al 2018) Acanthamoeba polyphaga (de Souza

Soares Benitez amp Rott 2017) disminuyeron la expresioacuten de patogenicidad en S

aureus Incluso cultivos de E coli han mostrado actividad fungicida contra cultivos

de C albicans (Cabral et al 2018)

22 Biologiacutea Sinteacutetica y su papel en produccioacuten de bacteriocinas

221 Introduccioacuten a la Biologiacutea Sinteacutetica

La Biologiacutea Sinteacutetica consiste en disentildear libreriacuteas de elementos geneacuteticos como

promotores secuencias codificadoras terminadores factores de transcripcioacuten

entre otras maacutes asiacute tambieacuten se enfoca en el ensamblaje de circuitos geneacuteticos


hasta en el disentildeo y creacioacuten de organismos completos Este campo utiliza datos

cuantitativos para crear modelos bioloacutegicos y matemaacuteticos que permitan predecir

el comportamiento de un sistema bioloacutegico (Cameron Bashor amp Collins 2014

Garciacutea-Granados Lerma-Escalera amp Morones-Ramiacuterez 2019)

En la publicacioacuten de Brophy y Voigt se revisan los principios baacutesicos para el

disentildeo de circuitos geneacuteticos para que los sistemas bioloacutegicos sean emulados

para cumplir con tareas o puedan fabricar materiales es importante considerar la

correcta eleccioacuten de reguladores asiacute como puntos de control que cuantifiquen el

impacto en el rendimiento (Brophy amp Voigt 2014)

222 Definicioacuten de los biosensores

Un sensor quiacutemico es un dispositivo que transforma en una informacioacuten quiacutemica

en una sentildeal analiacutetica de utilidad y puede detectar desde la concentracioacuten de una

muestra especiacutefica hasta el anaacutelisis total de sus compuestos Este tipo de

sensores contiene dos unidades funcionales baacutesicas un receptor y un transductor

El receptor transforma la informacioacuten quiacutemica de la muestra en una forma de

energiacutea que puede ser medido por un transductor El transductor transforma la

energiacutea en una sentildeal analiacutetica uacutetil (Hulanicki Glab amp Ingman 1991) De esta

manera comprendemos que un biosensor es ldquoun dispositivo que a traveacutes de

reacciones especiacuteficas de enzimas aisladas sistemas inmunes tejidos organelos

o ceacutelulas enteras sirve para detectar compuestosrdquo (IUPAC 1992)

Asiacute en los biosensores basados en ceacutelulas completas un analito de intereacutes

ingresa al interior celular y es reconocido por un factor transcripcional el cual

controla la transcripcioacuten de un gen mediante el reconocimiento de un promotor

especiacutefico Estos biosensores pueden reconocer diferentes analitos como

hidrocarburos metales pesados antibioacuteticos (Garnier-Rocha 2019) Incluso

algunos modelos biosensores se han aprovechado del fenoacutemeno de quorum

sensing para crear sistemas de comunicacioacuten sinteacuteticos con la capacidad de

controlar poblaciones (Balagaddeacute et al 2008)


23 Quorum Sensing Comunicacioacuten entre ceacutelulas

El concepto QS refiere a que es un mecanismo de comunicacioacuten entre

microorganismos que dependen de sentildeales quiacutemicas (moleacuteculas sentildealizadoras)

que son excretadas al medio extracelular y que dependen la densidad celular

(Fuqua Winans amp Greenberg 1994) Las bacterias similares a organismos de

diferentes dominios se sostienen de mecanismos de comunicacioacuten y se valen de

diferentes moleacuteculas Esta interaccioacuten puede ser intriacutenseca (es decir intracelular o

adentro de la misma ceacutelula) o extriacutenseca (es decir extracelular o afuera de la

ceacutelula) y crea un fenotipo de respuesta en una poblacioacuten especiacutefica del mismo

(Fuqua et al 1994)

Mientras los cultivos productores de QS esteacuten creciendo eacutestos pueden producir

excretar acumular y detectar moleacuteculas de sentildealizacioacuten quiacutemicas externas

conocidas como autoinductores los cuales son producidos a niveles basales pero

que se acumulan en el exterior celular Cuando la densidad celular de bacterias y

la concentracioacuten de moleacuteculas autoinductoras alcanzan un umbral de

concentracioacuten especiacutefico el cultivo experimenta un cambio en su fenotipo (Garg

Manchanda amp Kumar 2014 Rutherford amp Bassler 2012) Esta respuesta variacutea

seguacuten el tipo de sentildeal emitido ya que su forma y composicioacuten quiacutemica es diferente

seguacuten la especie que la produzca (Fuqua et al 1994) siendo las respuestas maacutes

comunes la formulacioacuten de esporulados factores de virulencia asociados a

invasioacuten bioluminiscencia virulencia yo la creacioacuten biopeliacuteculas (Miller amp Bassler

2002)

El fenoacutemeno de QS sucede tanto en bacterias productoras Gram negativas y las

Gram positivas pero las moleacuteculas auto inductoras son de diferente composicioacuten

quiacutemica En las bacterias Gram negativas las moleacuteculas de sentildealizacioacuten son

conocidas como homoserina lactonada aciladas (HSL) mientras que en bacterias

Gram positivas el mecanismo es a traveacutes de peacuteptidos excretados (Miller amp

Bassler 2002)

En el modelo general de QS en Gram positivos en primera instancia el gen que

contiene el precursor de la moleacutecula sentildealizadora (tambieacuten conocido como


autoinductor inmaduro) es transcrito y traducido y eacutesta es posteriormente

parcialmente hidrolizada para crear un autoinductor maduro Eacuteste uacuteltimo es

enviado al exterior celular por un transportador tipo ABC Cuando la concentracioacuten

del autoinductor maduro alcanza un umbral miacutenimo de activacioacuten una proteiacutena

tipo quinasa sensor de histidina localizada en el exterior celular detecta la

presencia de eacutesta mediante un sistema a dos componentes El sensor quinasa se

auto fosforila en un residuo conservado de histidina (H) Despueacutes este grupo

fosforilo es transferido a una proteiacutena reguladora de respuesta adyacente la cual

es fosforilada en un residuo conservado de aspartato (D) La proteiacutena reguladora

de respuesta fosforilado activa la transcripcioacuten de los genes de intereacutes (Miller amp

Bassler 2002)

231 Quorum Sensing de Staphylococcus aureus

En S aureus estaacute gobernado por el operoacuten agr que es de un tamantildeo nucleotiacutedico

de 35 kb y se compone de dos unidades transcriptoacutemicas divergentes conocidos

como RNAII y RNAIII los cuales estaacuten gobernados por los promotores P2 y P3

respectivamente (Le amp Otto 2015) El promotor P2 estaacute involucrado en actividades

del QS mientras que el promotor P3 se encarga de la expresioacuten de factores de

virulencia (Miller amp Bassler 2002) como produccioacuten de hemolisinas proteasas

lipasas e indirectamente participan en la liberacioacuten de biopeliacuteculas (Quave amp

Horswill 2014) A nivel geneacutetico la induccioacuten del operoacuten agr depende

parcialmente por la unioacuten de los productos geacutenicos del operoacuten sar en los dos

promotores disponibles del operoacuten agr (Manna Bayer amp Cheung 1998)

El promotor P2 es el de importancia para el sistema QS debido a que el transcrito

resultante agrBDCA produce cuatro proteiacutenas AgrB AgrD AgrC y AgrA los

cuales son los componentes principales del sistema de QS de S aureus A

manera de resumen podemos en global que AgrC y AgrA participan como

elementos biosensores mientras que AgrB y AgrD son los elementos necesarios

para la biosiacutentesis de AIP El AgrD es un peacuteptido precursor a la moleacutecula

autoinductora (AIP por sus siglas en ingleacutes) y el AgrB funciona transportadora


como proteasa y estaacute involucrada en la maduracioacuten del AIP (Gomes-Fernandes

et al 2017 Horswill Stoodley Stewart amp Parsek 2007)

232 Sistema de biosiacutentesis de AIP AgrB y AgrD

El gen que produce AgrD se expresa y se traduce en una versioacuten propeacuteptido de la

moleacutecula AIP que sufre de una modificacioacuten postraduccionalmente para que sea

bioloacutegicamente activo La moleacutecula AIP inmadura se compone de tres secciones

conocidas como regioacuten del peacuteptido liacuteder regioacuten madura del AIP y secuencia de

reconocimiento que corresponden a las regiones N- central y C-terminales

respectivamente (B Wang amp Muir 2016)

El AgrD es inicialmente procesado en la regioacuten N-terminal (se compone de 32

residuos) y sirve de guiacutea Eacuteste es translocado a la cara externa de la membrana

celular Mientras la regioacuten peptidasa de la proteiacutena transmembranal AgrB

reconoce la regioacuten N-terminal del AIP inmaduro

233 Sistema biosensor AgrC y AgrA

AgrC y AgrA funcionan en conjunto con un sistema claacutesico de dos componentes

Donde la proteiacutena transmembranal tipo receptor con actividad histidina quinasa

AgrC se encarga de que detectar las moleacuteculas AIP liberadas al exterior por S

aureus una vez acoplado el AIP con el receptor eacuteste uacuteltimo causa una

autofosforilacioacuten del dominio citoplasmaacutetico del AgrC seguido de la transferencia

del grupo fosfato de la proteiacutena reguladora de respuesta de unioacuten al DNA AgrA

Una vez que AgrA es fosforilado (AgrA-P) eacuteste se une a la regioacuten intergeacutenica de

los promotores P2 y P3 del operoacuten agr (Gomes-Fernandes et al 2017)

234 Hipervariabilidad del AgrD y su relacioacuten con la comunicacioacuten cruzada

Bioquiacutemicamente el AgrD inmaduro tiene un tamantildeo entre 46 a 47 residuos seguacuten

su clase Despueacutes de procesamiento AgrD maduro tiene un tamantildeo final entre 7 a

8 aminoaacutecidos (que variacutea seguacuten la clase) y contiene un anillo tiolactonado

producto de la condensacioacuten entre un grupo tiol de una cisteiacutena interna ubicada

cuatro aminoaacutecidos antes del uacuteltimo aminoaacutecido y el grupo carboxilo del uacuteltimo


aminoaacutecido (que puede ser metionina o fenilalanina dependiendo la clase) (B

Wang Zhao Novick amp Muir 2015)

En AgrC el dominio que contiene los elementos para deteccioacuten del receptor de la

moleacutecula AIP produce diferentes formas de propeacuteptidos De esta manera se

deduce que cada moleacutecula de AIP producida depende de su propia proteiacutena

detectora AgrC Por tanto la presencia en el medio de moleacuteculas de AIP que no

estaacuten filogeneacuteticamente relacionadas resultan en la inhibicioacuten de QS Es decir

miembros productores del mismo tipo de AIP pueden inducir el comportamiento

tiacutepico por QS pero si los productores no pertenecen al mismo grupo se puede

inhibir su respuesta Este fenoacutemeno es conocido como comunicacioacuten cruzada

(Rutherford amp Bassler 2012) La regioacuten hipervariable del operoacuten agr estaacute ubicado

en el transcrito gobernado por el promotor P2 entre los genes agrC agrD y agrB

Consensualmente se ha determinado cuatro grandes clases de AIP y permite

clasificar a los tipos de S aureus en base a esta regioacuten (Shopsin et al 2003)

24 Biosensores de ceacutelulas enteras basados en deteccioacuten de QS

A continuacioacuten presentamos una compilacioacuten de publicaciones de diferentes

ceacutelulas que fueron modificadas para actuar como biosensores capaces de detectar

moleacuteculas producidas por organismos productores de sentildeales quiacutemicas tipo QS

algunos de los ejemplos mencionados cuentan con la capacidad de producir yo

liberar sustancias antimicrobianas capaces de destruir al productor de esas

sentildeales

Balagaddeacute y otros disentildearon un sistema de comunicacioacuten sinteacutetico conocido como

depredador y presa en la que dos ceacutelulas modificadas de E coli son capaces de

comunicarse -y matar a una de ellas- a traveacutes del sistema de QS En este modelo

las ceacutelulas asignadas como depredadoras producen y liberar moleacuteculas tipo QS

que se difunden en el medio y al llegar a la ceacutelula presa por sus mecanismos

internos activan la produccioacuten una toxina especiacutefica para la ceacutelula asignada como

presa provocaacutendoles la muerte celular Por otro lado las ceacutelulas presas para

evitar su muerte temprana deben producir constantemente una proteiacutena antitoxina

que anule la actividad de la toxina (Balagaddeacute et al 2008)


Saeidi y sus colaboradores crearon un biosensor de ceacutelulas enteras basados en la

deteccioacuten del QS al modificar ceacutelulas de E coli para que detectaran moleacuteculas

3OC12 HSL producidas por P aeruginosa En este sistema las moleacuteculas QS son

difundidas a traveacutes del medio y son reconocidas por un factor de transcripcioacuten en

E coli que activa una unidad transcripcional para producir piocianina un

antibioacutetico especiacutefico con actividad contra P aeruginosa y porina E7 un agente

liacutetico especiacutefico contra E coli a medida que aumenta la concentracioacuten de la

moleacutecula QS incrementa la concentracioacuten del antibioacutetico y de la porina Cuando

se acumula suficiente cantidad de porinas en el interior celular las ceacutelulas de E

coli son lisadas y se libera piocianina para finalmente atacar a las ceacutelulas de P

aeruginosa (Saeidi et al 2011) Dos antildeos maacutes tarde Gupta y sus colaboradores

modificaron este biosensor agregando un moacutedulo de excrecioacuten que libera una

sustancia antimicrobiana al exterior a traveacutes de un peacuteptido sentildeal y atacar

especiacuteficamente a P aeruginosa evitando la muerte de la ceacutelula productora de

antibioacutetico (S Gupta Bram amp Weiss 2013)

Marchand y sus colegas crearon un sistema de comunicacioacuten interespeciacutefico para

la interaccioacuten entre dos bacterias con oriacutegenes evolutivos diferentes Bacillus

megaterium (Gram positiva) y E coli (Gram negativa) utilizando el mecanismo del

operoacuten agr de S aureus En este reporte ceacutelulas de E coli fungieron como

productoras de moleacuteculas de QS al expresar las proteiacutenas AgrD y AgrB que en

condiciones nativas producen moleacuteculas de AIP en S aureus Mientras que

ceacutelulas de B megaterium fungieron como biosensores al producir las proteiacutenas

AgrC y AgrA que en condiciones nativas sirven como un sistema a dos

componentes que detectan la presencia externa de la moleacutecula de AIP y activan a

un factor de transcripcioacuten (Marchand amp Collins 2013)

Zeng y sus colaboradores crearon un modelo biomatemaacutetico a partir de una E coli

que funcionara como un biosensor de moleacuteculas de AIP producidas por S aureus

que seriacutea contrarrestado por accioacuten de la lisostafina una bacteriocina de actividad

contra S aureus La simulacioacuten del modelo indicoacute que una ceacutelula de E coli podriacutea

tardar hasta 25 horas en detectar las primeras moleacuteculas de AIP producidas de S


aureus al tiempo que generariacutea la suficiente concentracioacuten de bacteriocinas para

matar a ceacutelulas de S aureus (Zeng et al 2013)

Borrero y sus colegas crearon un biosensor de ceacutelulas enteras basado en la

deteccioacuten de moleacuteculas de QS para poder contrarrestar moleacuteculas de QS

producidos por un patoacutegeno de intereacutes cliacutenico resistente a los antibioacuteticos En este

caso ceacutelulas modificadas de Lactobacillus lactis fueron capaces de detectar las

moleacuteculas producidas por Enterococcus faecalis El lactobacilo modificado mostroacute

alta efectividad de tres bacteriocinas producidas para controlar el crecimiento de

este patoacutegeno incluyendo sus variedades multirresistentes (Borrero Chen Dunny

amp Kaznessis 2015)

Holowko y sus colegas desarrollaron ceacutelulas de E coli capaces de sentir

moleacuteculas de QS producidas por Vibrio cholerae (Holowko Wang Jayaraman amp

Poh 2016) Mientras que Lubkowicz y sus colaboradores modificaron ceacutelulas de

Lactobacillus reuteri con la capacidad para detectar moleacuteculas de AIP clase I

producidas por S aureus en rangos de concentracioacuten desde la escala nanomolar

hasta micromolar (Lubkowicz et al 2018)

25 Las Bacteriocinas

En contexto a la anterior seccioacuten una fraccioacuten del total de biosensores de ceacutelulas

enteras disentildeados son capaces de producir y excretar sustancias antimicrobianas

que afecten el crecimiento de ceacutelulas productoras de moleacuteculas QS Para fines de

este trabajo nos referimos a las bacteriocinas como sustancias antimicrobianas

que pertenece a un grupo de peacuteptidos con actividad antimicrobiana con origen

evolutivo en bacterias los cuales seraacuten descritos a continuacioacuten

251 Introduccioacuten a las bacteriocinas

Las bacteriocinas son un grupo de peacuteptidos de bajo peso molecular que son

producidos exclusivamente y excretados por bacterias y que tienen la capacidad

de inhibir el crecimiento de otra bacteria Las bacteriocinas pueden ser producidas

in situ por bacterias probioacuteticas Al ser de origen proteico las bacteriocinas son

sujetos a modificaciones por Ingenieriacutea Geneacutetica (Cotter Ross amp Hill 2013) Las


bacteriocinas usualmente actuacutean por permeabilizacioacuten por membrana causada por

su naturaleza catioacutenica al interactuar con la membrana Usualmente las

bacteriocinas son de caraacutecter hidrofoacutebico y anfipaacutetico Su estructura quiacutemica son

generalmente peacuteptidos acoplados con glicoproteiacutenas y lipoproteiacutenas Su punto

isoeleacutectrico estaacute habituado a 81 a 101 usualmente son termoestables y tiene un

rango de pH amplio entre 30 a 90 (Heredia-Castro Heacuternaacutendez-Mendoza

Gonzaacutelez-Coacuterdova amp Vallejo-Cordoba 2017) En la Naturaleza cuando las

bacterias comparten el mismo nicho ecoloacutegicos eacutestas deben luchar y defenderse

de otros y las bacteriocinas son uno de los mecanismos bioloacutegicos reconocidos

(Duffy Schouten amp Raaijmakers 2003)

La disponibilidad de datos en bacteriocinas en la Naturaleza es muy amplio ya que

se presume que un 99 del total de bacterias son productoras de al menos un tipo

de bacteriocina y muchos de ellos permanecen auacuten sin ser descubiertos

(Klaenhammer 1988) Hasta la fecha de acuerdo con datos de bases de datos

sobre bacteriocinas de calidad mundial (actualizado hasta la uacuteltima versioacuten 25 de

junio de 2021) indican que el University of Nebraska Medical Centerrsquos

Antimicrobial Peptide Database (ADP por sus siglas en ingleacutes)

(httpswangapd3commainphp) se mantienen registrados un total de 3257

peacuteptidos antimicrobianos de los seis reinos bioloacutegicos existentes de los cuales

181 son peacuteptidos con actividad anti-MRSA (G Wang Li amp Wang 2016) Aunque

Bactibase (httpbactibasehammamilaborgmainphp) es una base de datos de

bacteriocinas que no se ha actualizado desde 2017 sus datos siguen siendo muy

valiosos ya que nos ofrece una realidad en la ciencia de las bacteriocinas puesto

que la mayoriacutea de las bacteriocinas descubiertas han sido aisladas de bacterias

Gram positivas donde 206 pertenecen a este grupo y 19 a las cepas Gram

negativas El geacutenero maacutes reportado para las bacteriocinas de origen en Gram

positivas son los Lactobacillus seguido de Enterococcus Streptococcus

Lactococcus y el geacutenero Bacillus mientras que el geacutenero maacutes reportado para las

bacteriocinas de origen en Gram negativas es Escherichia El tamantildeo promedio de

las bacteriocinas es de 43 residuos (Hammami Zouhir Le Lay Ben Hamida amp

Fliss 2010)


Un buen nuacutemero de bacteriocinas han sido previamente reportadas como agentes

terapeacuteuticos puesto que se han utilizado en dosis hasta cien veces superiores al

valor de concentracioacuten miacutenima inhibitoria reportado sin presentar efectos

citotoacutexicos en liacuteneas celulares eucarioacuteticas (Hols Ledesma-Garciacutea Gabant amp

Mignolet 2019) ni en tejidos del hospedero (Kurlenda amp Grinholc 2012) Por

ejemplo la nisina la bacteriocina maacutes famosa en la industria y en el mundo ha

sido declarado por la Administracioacuten de Alimentos y Medicamentos de los Estados

Unidos (FDA por sus siglas en ingleacutes) como sustancia Generalmente Reconocida

como Segura (GRAS por sus siglas en ingleacutes) para su uso como conservador de

alimentos (Cotter Hill amp Ross 2005) Se sabe que la mayoriacutea de las bacteriocinas

han tenido un largo historial de seguridad (Silva Silva amp Ribeiro 2018) Sin

embargo a pesar de la gran disponibilidad de datos de ensayos en bacteriocinas

recientemente se ha manifestado la urgencia de incrementar y explorar su uso en

modelos in vivo para evaluar su eficacia como agentes antimicrobianos y evaluar

los posibles efectos secundarios los cuales son necesarios para asegurar su eacutexito

como candidatos potenciales a agentes terapeacuteuticos en su lucha contra

infecciones resistentes a los antibioacuteticos (Beniacutetez-Chao Leoacuten-Buitimea Lerma-

Escalera amp Morones-Ramiacuterez 2021)

252 Diferencia entre peacuteptidos antimicrobianos bacteriocinas y antibioacuteticos

Los peacuteptidos antimicrobianos bacteriocinas y antibioacuteticos son sustancias de origen

bioloacutegico que cumplen con el mismo papel de defensa lo cierto es que existen

claras diferencias entre ellas que dependen de su origen composicioacuten quiacutemica

entre maacutes factores A continuacioacuten se ofrece una breve explicacioacuten entre los

diferentes tipos de sustancias antimicrobianas

Los Peacuteptidos Antimicrobianos (AMP antimicrobial peptides) tambieacuten conocidos

como peacuteptidos de autodefensa (HDP host defense peptide) son peacuteptidos

producidos por un hospedero y son parte del sistema inmune al conferirles

capacidades defensivas Son de un rango de tamantildeo entre 10 a 60 residuos en

promedio 3326 residuos que estaacuten compuestas mayoritariamente por α-heacutelices

con cargas positivas (catioacutenicas) o anfipaacuteticas (cargas hidrofoacutebicas e hidrofiacutelicas)


tambieacuten existen referentes con carga anioacutenica Los AMP estaacuten clasificados seguacuten

su origen ya que estaacuten ubicuamente presentes en todos los reinos bioloacutegicos

como mamiacuteferos plantas microorganismos acuaacuteticos insectos yo anfibios

seguacuten su actividad ya que pueden ser antibacterianos antifuacutengicos

antiinflamatorios antivirales antiparasitarios yo anticanceriacutegenos seguacuten su

estructura como tipo lineal con estructurales secundarias con α-heacutelices y β-tiras

plegadas y por seguacuten por el tipo dominante de aminoaacutecidos como glicina arginina

prolina histidina y triptoacutefano (Huan Kong Mou amp Yi 2020 Lei et al 2019)

Si el AMP es de origen evolutivo bacteriano se les conoce como bacteriocinas Los

oriacutegenes pueden ser por bacterias Gram positivas como negativas incluyendo

miembros del dominio de las Archaea (Chikindas Weeks Drider Chistyakov amp

Dicks 2018) Sin embargo cuando el AMP es de origen eucarioacutetico existen tres

clasificaciones defensinas (Shafee Lay Hulett amp Anderson 2016) histatinas o

catelicidinas (De Smet amp Contreras 2005) Existen intermediarios evolutivos como

las bacteriocinas tipo defensina que son un grupo de bacteriocinas que comparte

los puentes de disulfuro en las mismas posiciones que podriacutean observarse en las

defensinas (Baindara et al 2016 Sugrue OrsquoConnor Hill Stanton amp Paul Ross

2020)

Tanto las bacteriocinas como los antibioacuteticos comparten funcionalidad bioloacutegica al

ser ambas sustancias que nulifican o matan a otras poblaciones pero existen

diferencias muy marcadas entre ellas puesto que las bacteriocinas son

sintetizadas como metabolitos primarios mientras que los antibioacuteticos son

secundarios El espectro de accioacuten de las bacteriocinas es mucho maacutes reducido

que los antibioacuteticos eacutestos uacuteltimos son muy amplios El grado de actividad es

mucho maacutes intenso entre bacteriocinas ya que su rango de accioacuten se encuentra

en el orden de los nano a micro molar mientras que los antibioacuteticos son rango de

accioacuten estaacute ranqueado entre los micro y milimolar Debido a su origen proteico las

bacteriocinas son altamente propensas a ser degradados por enzimas Sin

embargo las bacteriocinas son maacutes termodinaacutemicamente estables y con una

actividad maacutes amplia de pH que los antibioacuteticos Las bacteriocinas atacan


generalmente la membrana extracelular generando poros mientras que los

antibioacuteticos pueden atacar la membrana tambieacuten yo atacar blancos intracelulares

Se conoce que las bacteriocinas presentan baja o nula toxicidad en comparacioacuten

con los antibioacuteticos (Perez Zendo amp Sonomoto 2014)

253 Bacteriocinas utilizadas contra S aureus resistentes

En la actualidad diversos estudios enfocados en bacteriocinas se han enfocado

en su actividad contra cepas de S aureus resistentes a los antibioacuteticos Por

ejemplo la lisostafina fue utilizado el control de S aureus ATCC 29740 (Oldham amp

Daley 1991) mientras que la pentocina JL-1 ha sido efectivo para el control de S

aureus multirresistente (Jiang Zou Cheng Fang amp Huang 2017) La bacteriocina

entianina mostroacute actividad contra MRSA (ATCC 43300) (S W Fuchs et al 2011)

La epidermicina NI01 mostroacute actividad contra MRSA (Sandiford amp Upton 2012)

Asiacute tambieacuten como las enterocinas DD28 y DD93 con actividad anti estafilocoacutecica

contra ceacutelulas MRSA (Al Atya et al 2016)

254 Bacteriocinas contra patoacutegenos resistentes a los antibioacuteticos

Las bacteriocinas son un grupo muy bien definido de peacuteptidos antimicrobianos que

tienen su origen evolutivo en bacterias y en algunas arqueobacterias Por sus

caracteriacutesticas proteicas las bacteriocinas son elementos geneacuteticos que pueden

ser faacutecilmente modificados por teacutecnicas de Ingenieriacutea geneacutetica (Cotter et al

2013) Las caracteriacutesticas generales de las bacteriocinas son que su espectro de

accioacuten es actuar tanto en las bacterias Gram positivas como negativas Su modo

de actividad por actividad bactericida o bacteriostaacutetico Su mecanismo de accioacuten

es por permeabilizacioacuten de membrana creando lisis celular Su estructura

bioquiacutemica es muy variada que pueden ser peacuteptidos glicoproteiacutenas y

lipoproteiacutenas Son de peso molecular variable sin embargo las bacteriocinas de

origen en Gram positivas son de tamantildeo pequentildeo Debido a su naturaleza

proteica las bacteriocinas son susceptibles al corte proteoliacutetico y altamente

estables a altas temperaturas (Heredia-Castro et al 2017)

Entre algunas de las bacteriocinas que se han utilizado para el control de

patoacutegenos resistentes estaacute la bacteriocina AS-48 la cual ha sido ampliamente


utilizado contra cepas de referencia y cliacutenicos para Mycobacterium tuberculosis

(Aguilar-Peacuterez et al 2018) Otro ejemplo es la pentocina JL-1 ha demostrado

tener actividad contra diferentes cepas bacterianas (Jiang et al 2017) Entianina

ha mostrado actividad contra Enterococcus faecalis resistente a vancomicina

(ATCC 51299) (S W Fuchs et al 2011) Las klebcinas poseen actividad contra

especies resistentes y multirresistentes de cepas del geacutenero Klebsiella

(Denkovskienė et al 2019) La lista de bacteriocinas reportadas como efectivas

contra patoacutegenos resistentes de relevancia cliacutenica es muy larga y que puede ser

observada en la literatura correspondiente (Cui et al 2012 Gabrielsen Brede

Nes amp Diep 2014 Newstead Varjonen Nuttall amp Paterson 2020 Perez et al

2014)

255 Breve clasificacioacuten de las bacteriocinas

Las bacteriocinas pueden ser producidos tanto por microorganismos Gram

positivos como negativos inclusive por miembros del dominio Archaea (Chikindas

et al 2018)

Hasta el diacutea de hoy no hemos encontrado un oacutergano internacional que regule la

clasificacioacuten de las bacteriocinas maacutes que lo propuesto en grupos de investigacioacuten

ligados a la ciencia de las bacteriocinas Las bacteriocinas con origen evolutivo en

organismos Gram positivos estaacuten actualmente clasificados en cuatro grandes

clases la clase I corresponde a bacteriocinas modificadas postraduccionalmente

de muy bajo peso molecular (lt5 kDa) la clase II se refiere a bacteriocinas

termoestables no modificadas de bajo peso molecular (lt10 kDa) la clase III

contiene bacteriocinas termosensibles de alto peso molecular (gt10 kDa) y por

uacuteltimo la clase IV se compone de proteiacutenas acomplejadas con carbohidratos o

liacutepidos (Newstead et al 2020 Perez et al 2014)

Dada la diversidad de bacteriocinas para fines de este trabajo solo nos

enfocaremos en las bacteriocinas tipo II de las Gram positivas ya que se clasifican

en cuatro grandes subclases La clase IIa representa la familia de las

bacteriocinas con actividad antilisteria por su actividad especiacutefica contra cepas de

Listeria monocytogenes y ademaacutes porque se mantiene un dominio conservado


YGNGV conocido como la caja de pediocina y que ubica en extremo N-terminal

Uno de los ejemplos maacutes reconocidos es la enterocina NKR-5-3C La clase IIb

representa a las bacteriocinas compuestas por dos peacuteptidos que en siacute son dos

peacuteptidos diferentes que actuacutean sineacutergicamente para atacar a un blanco como

lactococcin Q que se compone de los peacuteptidos lactococcina Qα y lactococcin Qβ

La clase IIc se relaciona con las bacteriocinas circularizadas que estaacuten unidas de

extremo a extremo como lactociclina Q y leucociclina Q La clase IId se compone

de bacteriocinas sin peacuteptido liacuteder y que se sintetizan sin una secuencia liacuteder en su

extremo N-terminal Algunos ejemplos son la weissllicina Y weissllicina M

leucocina Q leucocina N lacticina Z y lacticina Q (Perez et al 2014)

256 La bacteriocina Lacticina Q

La lacticina Q (LnqQ) es una bacteriocina que fue por vez descubierta por Fujita y

sus colaboradores en el 2007 Esta bacteriocina fue aislada por primera vez por

Lactococcus lactis QU5 una cepa Gram positiva que fue aislada de una muestra

de maiacutez fresco recolectado en campos agriacutecolas de la comunidad de Aso en

Kumamoto Japoacuten La composicioacuten bioquiacutemica de LnqQ es que se trata de peacuteptido

lineal compuesto por 53 residuos y con un peso molecular de 592050 Da (Fujita

et al 2007) La estructura tridimensional descubierta por Acedo y otros revela

que es una proteiacutena globular que se compone de cuatro α-heacutelices cuya superficie

es altamente catioacutenica y su nuacutecleo hidrofoacutebico Esta secuencia presenta una

carga neta +6 y su pI = 108 (Acedo et al 2016)

Esta bacteriocina ha mostrado ser un peacuteptido antimicrobiano con alta efectividad

contra bacterias Gram positivas siendo antagonista de uno los principales

patoacutegenos reportados en cliacutenicas como S aureus Por ejemplo se han registrado

diversos rangos de concentracioacuten miacutenima inhibitoria (MIC) de la LnqQ como 8 microM

contra S aureus ATCC 6538 y 32 microM contra S aureus ATCC 29213 (Acedo et al

2016) Tambieacuten se ha reportado 18 microM (Fujita et al 2007) o 10 microgml (Ma Yu

Han Wang amp Zhang 2012) contra S aureus ATCC 12600

Se conoce que la LnqQ genera alta permeabilidad en la membrana sin necesidad

de anclarse sobre moleacuteculas especiacuteficas como el Liacutepido II (Yoneyama Imura


Ichimasa et al 2009) Posteriormente se determinoacute que el mecanismo de accioacuten

es a traveacutes de un modelo conocido como Poro Toroidal Enorme (HTP huge

toroidal pore) donde las estructuras α-heacutelices cargadas positivamente y presentes

en la LnqQ se unen covalentemente hacia la membrana celular que estaacute cargada

negativamente y entonces genera un poro en forma de toroide enorme de 46 a

66 nm de diaacutemetro generando una estructura conocida como lipid flip-flop lo que

permite el goteo de moleacuteculas intercelular de manera que la ceacutelula muere La

translocacioacuten del peacuteptido desde el exterior a la cara interna de la ceacutelula ocurre

sincroacutenicamente con la formacioacuten del poro toroidal (Yoneyama Imura Ohno

et al 2009) En un estudio a nivel in vitro se determinoacute que cuando LnqQ es

agregado a niveles MIC sobre cultivos bacterianos sensibles aumenta la

acumulacioacuten de radicales libres tipo hidroxilos y por consecuencia la ceacutelula muere

(Li et al 2013)

257 Composicioacuten geneacutetica de la LnqQ y genes asociados

Las bacteriocinas son sustancias toacutexicas que pueden atacar a su microorganismo

productor si eacuteste no cuenta con caracteriacutesticas que le permitan resistir (Ishibashi

et al 2014 Iwatani et al 2012 Ladjouzi Lucau-Danila Benachour amp Drider

2020 Mesa-Pereira et al 2017 Nascimento et al 2012) De manera que todos

los operones de las bacteriocinas se componen habitualmente de los siguientes

elementos geneacuteticos promotor gen estructural (bacteriocina) genes de

inmunidad genes de transporte una proteiacutena accesoria y un terminador de la

transcripcioacuten (Mesa-Pereira et al 2017)

La LnqQ no es ninguna excepcioacuten a la regla ya que similar a otras bacteriocinas

la produccioacuten secrecioacuten y autoinmunidad estaacute regulado por el cluacutester geneacutetico

lnqRQBCDEF que se encuentra en Lactococcus lactis QU5 y que descubierto por

Iwatani y otros en el 2012 (Iwatani et al 2012) Al diacutea de hoy auacuten no estaacute del todo

bien determinado la funcionalidad de los elementos que conforman el operoacuten pero

se sabe que el cluacutester lnqQBCDEF es esencial para la completa produccioacuten de

LnqQ mientras que los productos LnqEF son esenciales y los productos LnqBCD


estaacuten parcialmente involucrados en la inmunidad y secrecioacuten de la bacteriocina

(Iwatani Horikiri Zendo Nakayama amp Sonomoto 2013)

26 Produccioacuten heteroacuteloga de bacteriocinas

Entre las virtudes observadas en las bacteriocinas estaacuten en que gozan de una

excelente reputacioacuten en seguridad bioloacutegica (Silva et al 2018) y de una gran

diversidad de bancos de datos sobre bacteriocinas (Hammami et al 2010 G

Wang et al 2016) Estos datos pueden apoyar para el disentildeo y construccioacuten de

bacteriocinas de novo (Fields et al 2020) Sin embargo a la fecha una cantidad

raquiacutetica de bacteriocinas han sido capaces de ser producidos en masa siendo la

nisina y la pediocina PA-1 las uacutenicas bacteriocinas en destacar industrialmente

Una de las hipoacutetesis que maacutes planteada supone que las bacteriocinas no han

destacado en el mercado porque eacutestas deben de producirse en altas cantidades y

con suficiente actividad bioloacutegica y en los organismos nativos este proceso se

considera que es un desgaste energeacutetico significativo ya que el rendimiento

productivo es usualmente bajo (Mesa-Pereira Rea Cotter Hill amp Ross 2018)

Desde la fundacioacuten de la Ingenieriacutea Geneacutetica las proteiacutenas han sido objeto de

muacuteltiples modificaciones para aumentar su produccioacuten y purificacioacuten utilizando

diversos sistemas bioloacutegicos productores desde sistemas procariotas como E coli

hasta sistemas eucariotas como ceacutelulas de levaduras o inclusive en liacuteneas

celulares eucariotas A pesar del avance actual que existen ya en estas teacutecnicas

la produccioacuten de proteiacutenas puede presentar incluso problemas de rutina en

laboratorios dedicados a este campo como la formacioacuten de cuerpos de inclusioacuten

toxicidad o baja produccioacuten de proteiacutenas (Bell Engleka Malik amp Strickler 2013)

En este trabajo nos hemos enfocado en la exploracioacuten de un peacuteptido sentildeal N-

AmyE y un peacuteptido de fusioacuten SmbP para la expresioacuten heteroacuteloga de la bacteriocina

LnqQ tanto en la regioacuten periplaacutesmica y citoplaacutesmica de ceacutelulas de E coli Nuestro

objetivo es que la aplicacioacuten de las etiquetas en la produccioacuten de la bacteriocina

permita la produccioacuten y purificacioacuten de LnqQ en ceacutelulas de E coli mientras

mantiene su funcionalidad bioloacutegica bactericida contra cultivos de S aureus En

este capiacutetulo presentaremos antecedentes relacionados al peacuteptido sentildeal N-AmyE


y al peacuteptido de fusioacuten SmbP asiacute como los disentildeos bioinformaacuteticos utilizados para

la construccioacuten de las etiquetas con la bacteriocina se incluyen ensayos in silico

predictivos para estimar la estructura tridimensional de la bacteriocina con su

etiqueta asiacute como ensayos para estimar el corte

261 Peacuteptido sentildeal N-AmyE

El peacuteptido sentildeal N-AmyE es un dominio proteico localizado en la regioacuten N-terminal

de la α-amilasa (AmyE) (Yang Galiii amp Henner 1983) Bioquiacutemicamente la AmyE

es una enzima (1 4-α-D-glucano-glucanohidrolasa EC 3211) cuya funcioacuten es

catalizar la hidroacutelisis de enlaces glicosiacutedicos (α-14) del almidoacuten para producir

glucosa y dextrinas (R Gupta Gigras Mohapatra Goswami amp Chauhan 2003)

La secuencia nucleotiacutedica y aminoaciacutedica de algunas AmyE fueron reportadas

desde hace varias deacutecadas Por ejemplo en 1983 Yang y sus colaboradores

reportaron la secuencia nucleotiacutedica del AmyE de la cepa Bacillus subtilis 1A289

(Yang et al 1983) Antildeos maacutes tarde en 1988 Emori y sus colegas tambieacuten

reportaron la secuencia nucleotiacutedica completa de la variante producida por la cepa

de B subtilis 2633 (Emori amp Maruo 1988)

La existencia del peacuteptido sentildeal N-AmyE de la α-amilasa fue propuesta por Yang y

sus colaboradores cuando develaron la secuencia nucleotiacutedica completa del

mismo argumentando que el presunto peacuteptido sentildeal debiacutea tener un tamantildeo de 32

aminoaacutecidos Tambieacuten observaron que AmyE podriacutea expresarse en ceacutelulas de

otras especies como E coli manteniendo su actividad bioloacutegica (Yang et al 1983)

La utilidad biotecnoloacutegica del peacuteptido sentildeal N-AmyE es porque se ha reportado

que es funcionalmente activo tanto en Bacillus subtilis como en E coli ya que al

fusionarse eacutesta con la regioacuten N-terminal de una proteiacutena de intereacutes biotecnoloacutegico

estaacute puede ser liberado al medio extracelular Por ejemplo al fusionar el peacuteptido

sentildeal N-AmyE con una β-lactamasa eacutesta es capaz de excretarse al medio

extracelular tanto en ceacutelulas de B subtilis como de E coli Sin embargo el sitio de

reconocimiento para el corte del peacuteptido sentildeal difiere entre ambos tipos de ceacutelulas

(Nakazawa Takano Sohma amp Yamane 1986) Un anaacutelisis multivariado de datos


determinoacute que las secuencias nucleotiacutedicas que contienen el peacuteptido sentildeal N-

AmyE en su seccioacuten N-terminal tienden a ser excretados en el periplasma y en la

seccioacuten extracelular de E coli (Sjoumlstroumlm Wold Wieslander amp Rilfors 1987)

El mecanismo de corte hidroliacutetico por el que el peacuteptido sentildeal N-AmyE se separa de

la amilasa AmyE es debido a su estructura secundaria y a la presencia de un

dominio rico en alaninas (aminoaacutecido apolar) en el extremo C-terminal de del

peacuteptido N-AmyE Sin embargo el patroacuten de corte enzimaacutetico difiere seguacuten el tipo

organismo donde sea expresado ya que el sitio de corte oacuteptimo de este peacuteptido

se encuentra entre Ala33 y X34 cuando se expresa en B subtilis pero en E coli la

AmyE tiende a cortarse entre Ala31 y un aminoaacutecido cual sea (X) (Sakakibara

Tsutsumi Nakamura amp Yamane 1993)

En el 2005 el peacuteptido sentildeal N-AmyE reportado por Yang y otros fue acoplado en

la regioacuten N-terminal de una liasa de pectina para permitir su expresioacuten en ceacutelulas

de E coli (DE3) en la regioacuten periplaacutesmica Los resultados de ese estudio indicaron

que se logroacute la excrecioacuten efectiva de la liasa de pectina al medio extracelular

espacio periplaacutesmico citoplasma y a nivel membranal de E coli despueacutes de haber

sido inducido por con IPTG (R M Papi Chaitidou Trikka amp Kyriakidis 2005)

262 Peacuteptido de fusioacuten SmbP

La mayoriacutea de peacuteptidos de fusioacuten utilizados para la expresioacuten de proteiacutenas

recombinantes son el Dominio de Unioacuten a Celulosa (CBDcenA) Glutatioacuten-S-

Transferasa (GST) Proteiacutena de Unioacuten a Maltosa (MBP) tiorredoxina (TRX) y las

Proteiacutenas Modificadoras tipo Ubiquitina de Tamantildeo Pequentildeo (SUMO) (Mesa-

Pereira et al 2018) o la regioacuten citoplasmaacutetica del proteiacutena pequentildea de unioacuten a

metales SmbP (Vargas-Cortez Morones-Ramirez Balderas-Renteria amp Zarate

2016) a continuacioacuten ofrecemos maacutes informacioacuten relacionada al uacuteltimo peacuteptido de

fusioacuten

En el 2004 Barney y sus colaboradores describieron a la Proteiacutena Pequentildea de

Unioacuten a Metales en el periplasma de Nitrosomonas europaea Esta proteiacutena posee

un peso molecular de 99 kDa y presenta una inusual cantidad de residuos de


histidina (17) seguido de alanina (16) glutamato (14) glicina (11) y lisina

(9) los cuales componen el 67 de la composicioacuten total de residuos Esta

proteiacutena carece naturalmente de metionina y de cisteiacutenas Estructuralmente se

trata de una unidad monomeacuterica compuesta por 93 residuos cuya principal

caracteriacutestica es una regioacuten compuesta de 10 repeticiones secuenciales cada una

con motivo de siete aminoaacutecidos donde el cuarto residuo es una histidina

conservada estos motivos permiten la estabilizacioacuten de un nuacutecleo hidrofoacutebico

Como su nombre lo establece esta proteiacutena posee alta afinidad a metales

divalentes como Cu2+ Ni2+ Zn2+ y de otras valencias como Fe3+ (Barney LoBrutto

amp Francisco 2004) Esta proteiacutena ha sido utilizada para la expresioacuten periplaacutesmica

y posterior purificacioacuten de Hormona de Crecimiento Humano (hGH)

bioloacutegicamente activa (Perez-Perez et al 2020)

En 2015 el dominio periplaacutesmico de la SmbP que corresponde a la seccioacuten maacutes

proacutexima al extremo N-terminal en la estructura lineal del mismo fue removido por

Vargas y sus colaboradores manteniendo uacutenicamente el dominio citoplasmaacutetico

de la SmbP citoplasmaacutetica (SmbP) Eacutesta uacuteltima es uacutetil como etiqueta de afinidad

para teacutecnicas de cromatografiacutea de afinidad con iones metaacutelicos inmovilizados

(IMAC por sus siglas en ingleacutes) Esta proteiacutena fue reportada como efectiva para la

expresioacuten citoplaacutesmica de proteiacutenas en E coli como RFP GFP SHY2 NDPK2 y

LovR (Vargas-Cortez et al 2016)

Recientemente la SmbP fue utilizada por primera vez para la produccioacuten del

peacuteptido antimicrobiano Bin1b utilizando E coli como hospedero para la

sobreproduccioacuten El peacuteptido fue sobre producido y purificado mostrando actividad

antimicrobiana contra E coli y S aureus (Montfort-Gardeazabal Balderas-

Renteria Casillas-Vega amp Zarate 2021)

CAPIacuteTULO 3 JUSTIFICACIOacuteN HIPOacuteTESIS Y OBJETIVOS

31 Justificacioacuten

La idea de disentildear y utilizar un biosensor de ceacutelula para controlar cultivos de

MRSA es porque las moleacuteculas sentildealizadoras del QS se han reportado como

estiacutemulos quiacutemicos para ser reconocidos como ceacutelulas enteras vivas modificadas


para su reconocimiento Ademaacutes de que ya se han reportado diversos biosensores

completos de ceacutelulas que pueden producir y excretar bacteriocinas capaces de

matar a microorganismos multirresistentes productores de sentildeales QS

La decisioacuten de inclinarnos hacia las bacteriocinas como patoacutegenos es porque

atacan un espectro limitado de bacterias dentro de una comunidad microbioloacutegica

y no ocurre de manera simultaacutenea en un espectro amplio como ocurre

habitualmente con los antibioacuteticos lo que promueve una mayor probabilidad de

seleccioacuten de mutantes que puedan conferir resistencia Ademaacutes las bacteriocinas

estaacuten constantemente evolucionando y permiten a sus productores combatir

contra patoacutegenos de resistencia emergentes (Riley et al 2012)

Las bacteriocinas han mostrado ademaacutes ser potenciales agentes terapeacuteuticos ya

que no afectan tejidos del hospedero (Kurlenda amp Grinholc 2012) Incluso las

bacteriocinas se han administrado en concentraciones tan altas como 100 veces

superiores al MIC originalmente reportado con nulos efectos citotoacutexicos en liacuteneas

celulares eucarioacuteticas (Hols et al 2019) Ademaacutes la mayoriacutea de los productores

nativos en bacteriocinas poseen un excelente historial en seguridad (Silva et al

2018)

La propuesta de etiquetar bacteriocinas con un peacuteptido sentildeal es porque durante el

proceso de recuperacioacuten previo a la purificacioacuten es comuacuten encontrar una baja

cantidad de proteiacutenas y ademaacutes proteasas que disminuyen el rendimiento

productivo Con el peacuteptido sentildeal la purificacioacuten de las proteiacutenas se simplifica

porque son faacutecilmente recuperadas de la fraccioacuten periplaacutesmica seguido un choque

osmoacutetico sin la necesidad de lisar toda la ceacutelula (Ramanan et al 2010) mientras

que la decisioacuten de antildeadir peacuteptidos de fusioacuten en los disentildeos geneacuteticos es porque se

trata de etiquetas que se colocan en la regioacuten N-terminal o C-terminal de una

proteiacutena con intereacutes biotecnoloacutegico Estos peacuteptidos representan un meacutetodo

recurrente en la sobreexpresioacuten de bacteriocinas porque ayudan en la purificacioacuten

aumentan la expresioacuten proteica mejoran la solubilidad permiten que la proteiacutena

sea producida en un estado similar al nativo incrementan el rendimiento de

produccioacuten y disminuyen su degradacioacuten (Mesa-Pereira et al 2018)


32 Hipoacutetesis

El disentildeo de un biosensor construido a base de ceacutelulas enteras E coli modificadas

pronostica indica que funcionaraacute como alarma bioloacutegica al detectar moleacuteculas de

QS de S aureus En consecuencia liberaraacute un compuesto antimicrobiano con

actividad especiacutefica contra el organismo blanco El peacuteptido antimicrobiano seraacute

validado experimentalmente a traveacutes del peacuteptido sentildeal N-AmyE y el peacuteptido de

fusioacuten SmbP para la expresioacuten heteroacuteloga de LnqQ en E coli que seraacute producido

en la regioacuten periplaacutesmica y citoplaacutesmica respectivamente

33 Objetivo General

Presentar el disentildeo in silico de un mecanismo biosensor basado en el sistema de

quorum sensing de S aureus para producir Lacticina Q y producir

experimentalmente este peacuteptido antimicrobiano tanto en la regioacuten periplaacutesmica

como citoplaacutesmica de E coli

34 Objetivos Especiacuteficos

1 Disentildear el moacutedulo geneacutetico biosensor para detectar la presencia externa de

moleacuteculas autoinductoras (AIP) producidos por MRSA

2 Disentildear el moacutedulo geneacutetico de bacteriocinas para liberar lacticina Q (LnqQ)

en funcioacuten a la concentracioacuten externa de moleacuteculas AIP producidos por

MRSA

3 Disentildear un vector de expresioacuten que contenga ambos moacutedulos geneacuteticos

tanto biosensor como de bacteriocinas

4 Predecir la especificidad teoacuterica del biosensor completo de ceacutelulas enteras

entre diferentes sentildeales de QS

5 Predecir la solubilidad y localizacioacuten subcelular de cada una de las

proteiacutenas utilizadas para el disentildeo del moacutedulo biosensor y el moacutedulo de

bacteriocina

6 Predecir la existencia de epiacutetopos de ceacutelulas tipo B y nivel de alergenicidad

en la LnqQ producida en E coli

7 Disentildear el vector de expresioacuten pETNL que contenga el peacuteptido sentildeal N-

AmyE en conjunto con el LnqQ acoplado con una etiqueta de polihistidina


8 Disentildear el vector de expresioacuten pSmbP-LnqQ que contenga el peacuteptido de

fusioacuten SmbP en conjunto con el LnqQ

9 Construir los vectores de expresioacuten pETNL y pSmbP-LnqQ y transformar

ceacutelulas de E coli

10 Inducir y detectar la produccioacuten de LnqQ en la regioacuten periplaacutesmica de

ceacutelulas de E coli transformado con el vector de expresioacuten pETNL

11 Inducir y detectar la produccioacuten de LnqQ en la regioacuten citoplasmaacutetica de

ceacutelulas de E coli transformado con el vector de expresioacuten pSmbP-LnqQ

35 Metas

En un periacuteodo a tres antildeos nos propusimos alcanzar las siguientes metas

bull Disentildear in silico un sistema biosensor en E coli capaz de sentir moleacuteculas

de Quorum Sensing producidas por S aureus y producir una sustancia

antimicrobiana en funcioacuten a la concentracioacuten externa de las moleacuteculas QS

bull Predecir la capacidad del peacuteptido sentildeal N-AmyE y del peacuteptido de fusioacuten

SmbP para producir bacteriocinas en la regioacuten periplaacutesmica y citoplaacutesmica

de E coli respectivamente

bull Presentar los resultados obtenidos en al menos un artiacuteculo de investigacioacuten

con arbitraje internacional

bull Cumplir con eacutexito el examen predoctoral

bull Obtener el grado de Doctor en Ciencias con Orientacioacuten en Microbiologiacutea

36 Aportacioacuten cientiacutefica

Nuestra aportacioacuten consiste en presentar el disentildeo y el trabajo teoacuterico necesario

para la construccioacuten de un biosensor de ceacutelulas enteras basado en quorum

sensing capaz de producir bacteriocinas en funcioacuten a la concentracioacuten disponible

de moleacuteculas tipo QS evitando asiacute la sobreproduccioacuten yo goteo de bacteriocinas

que pueden contribuir a la resistencia en patoacutegenos Asiacute tambieacuten experimentamos

en peacuteptido sentildeal N-AmyE y al peacuteptido de fusioacuten SmbP para validarlos como una

herramienta bioloacutegica para la produccioacuten y purificacioacuten de bacteriocinas en ceacutelulas

modificadas de E coli


CAPIacuteTULO 4 METODOLOGIacuteA

41 Concepto del biosensor basado en ceacutelulas enteras

La idea de disentildear un biosensor basado en ceacutelulas enteras surge al yuxtaponer

dos enfoques usados para tratar enfermedades resistentes a los antibioacuteticos que

es mediante el uso de organismos bioloacutegicamente activos con bacteriocinas (Allen

et al 2014)

En este sentido tenemos dos ceacutelulas independientes que son reconocidas como α

y β respectivamente (Figura 1) las ceacutelulas α que corresponden a un productor

de sentildeales tipo QS liberan moleacuteculas de sentildealizacioacuten al medio externo mientras

que las ceacutelulas β que corresponden al biosensor son emulados para detectar

moleacuteculas de QS de las ceacutelulas α En respuesta a esta deteccioacuten los mecanismos

internos de las ceacutelulas β producen y excretan una toxina especiacutefica contra las

ceacutelulas α y asiacute controlar su crecimiento poblacional

Figura 1 Concepto del biosensor basado en ceacutelulas enteras

Ceacutelulas β fungen como sistema de deteccioacuten y destruccioacuten al reconocer moleacuteculas de reconocimiento tipo QS

producidos por ceacutelulas α y causar su muerte

42 Cepas bacterianas

Nosotros designamos a E coli (BL21) DE3 como chasis bioloacutegico porque ha sido

ampliamente reconocido para la sobreproduccioacuten de bacteriocinas recombinantes

(Mesa-Pereira et al 2018) Para el disentildeo del moacutedulo biosensor optamos por


utilizar los datos anotados del genoma de la cepa S aureus N315 una cepa

reconocida como MRSA y que ha sido reportado como unas de las principales

causas de infecciones resistentes a meticilina asociado a comunidad (CA-MRSA)

y a hospitales (HA-MRSA) (Kuroda et al 2001) Para el disentildeo del moacutedulo de

bacteriocina utilizamos los datos bioinformaacuteticos del cluacutester de genes lnqQBCDEF

de L lactis QU5 que permiten la produccioacuten y excrecioacuten la LnqQ asiacute como para su

autoinmunidad (Fujita et al 2007 Iwatani et al 2012) Abajo se presentan los

disentildeos de ambos moacutedulos asiacute como la estrategia general para su ensamblado en

un vector de expresioacuten

La cepa de E coli BL21 (DE3) fue seleccionada para ensayos de expresioacuten

proteica con el peacuteptido sentildeal N-AmyE o con el peacuteptido de fusioacuten SmbP La cepa E

coli DH5 fue utilizada para ensayos de clonacioacuten La cepa E coli Origami fue

escogida para produccioacuten de proteiacutenas problemaacuteticas

Un cultivo de E coli BL21 (DE3) fue amablemente donado por el Instituto

Tecnoloacutegico de Monterrey (Monterrey Nuevo Leoacuten) La cepa de E coli DH5α fue

recuperada de un stock de cultivos de nuestro laboratorio en el CIBYN (Apodaca

Nuevo Leoacuten) La cepa E coli Origami fue compartida por el Dr Xristo Zaacuterate de la

UANL (Monterrey Nuevo Leoacuten) Todas las cepas fueron mantenidas y crecidas en

caldo LB o suplementado con agar (2) a 37degC en condiciones aeroacutebicas

43 Disentildeo de moacutedulos geneacuteticos biosensor y de bacteriocina

Tanto los moacutedulos biosensor como el de bacteriocina fueron disentildeados de la

siguiente manera contienen un promotor un sitio de unioacuten al ribosoma gen

estructural y un terminador doble de transcripcioacuten Los disentildeos fueron elaborados

bajo la herramienta bioinformaacutetica SnapGene 113 en el formato correspondiente

Todos los datos bioinformaacuteticos utilizados para ambos disentildeos fueron recuperados

de alguna de las siguientes bases de datos Massachussets Institute of

Technologyrsquos Registry of Standard Biological Parts (SBP) (httppartsigemorg)

(Galdzicki Rodriguez Chandran Sauro amp Gennari 2011) Kyoto Encyclopedia

Genes and Genomes (KEGG) (httpswwwgenomejpkegg) (Kanehisa amp Goto


2000) FP Base (FPB) (httpswwwfpbaseorg) (Lambert 2019) y GenBank

(httpswwwncbinlmnihgovgenbank) (Clark Karsch-Mizrachi Lipman Ostell amp

Sayers 2016) y Protein Data Bank (PDB) (httpswwwrcsborg) (Berman et al

2000)

Para el disentildeo del moacutedulo biosensor usamos los datos del promotor constitutivo

de E coli J23110 (SBP no BBa_J23110) como regulador transcripcional de los

genes del operoacuten agrC y agrA Nosotros utilizamos la secuencia nucleotiacutedica y

aminoaciacutedica del agrC (KEGG no SA1843) que se compone de 1116 nucleoacutetidos

y 371 residuos respectivamente y tambieacuten de la informacioacuten disponible para la

agrA (KEGG no SA1844) que se compone de 717 nucleoacutetidos y 238 residuos Los

sitios de unioacuten a ribosoma (SBP no BBa_B0034) fueron colocados entre cada gen

estructural y al final de la unidad transcriptoacutemica se colocoacute un doble terminador de

transcripcioacuten (SBP no BBa_B0015) tanto el moacutedulo biosensor como en moacutedulo

de bacteriocina

Para el disentildeo del moacutedulo de bacteriocina utilizamos los datos del promotor

inducible P2 del MRSA para regular la expresioacuten del cluacutester geneacutetico lnqQBCDEF

y el gen reportero gfp Debido a que la secuencia del promotor P2 no se

encontraba disponible de manera que primero tuvimos que localizar la regioacuten en

el archivo genoacutemico de la MRSA (GenBank no BA0000183) los resultados de

este punto seraacuten explicados maacutes a fondo en la seccioacuten correspondiente

Para la seccioacuten estructural del moacutedulo de bacteriocina buscamos el archivo

bioinformaacutetico que contuviera los genes estructurales secrecioacuten y de auto

inmunidad del cluacutester lnqQBCDEF (GenBank no AB7123931) El archivo original

fue manipulado para seccionar los elementos geneacuteticos que pertenecen al cluacutester

esta informacioacuten seraacute explicada con maacutes detalle

Por uacuteltimo usamos la secuencia nucleotiacutedica y aminoaciacutedica del gen monomeacuterico

gfp (FPBase no QKFJN) como reportero de Aequorea victoria (Zacharias Violin

Newton amp Tsien 2002) Esta proteiacutena es monomeacuterica posee un peso molecular

en 270 kDa El valor maacuteximo de excitacioacuten es λ = 488 nm mientras que el valor

maacuteximo de emisioacuten es λ = 507 nm El coeficiente de extincioacuten es 56000 M-1cm-1


44 Estrategia general para el ensamblaje de moacutedulos

El plaacutesmido de AddGene (httpswwwaddgeneorg) (AddGene no 116850) fue

utilizado para la construccioacuten in silico de los moacutedulos biosensor y de bacteriocina

dentro de un plaacutesmido al cual nos referiremos a partir de ahora como plaacutesmido

Dual Biosensor Killer (DBK) Este plaacutesmido fue disentildeado en la aplicacioacuten

SnapGene versioacuten 113

45 Optimizacioacuten de los codones nativos en las secuencias seleccionadas

Para la optimizacioacuten de los codones de todas las secuencias nucleotiacutedicas se

utilizoacute la herramienta bioinformaacutetica GenSmart Codon Optimization Tool

(httpswwwgenscriptcomtoolsgensmart-codon-optimization) versioacuten Beta 10

Las secuencias nucleotiacutedicas yo aminoaciacutedicas recolectadas para el disentildeo de los

moacutedulos geneacuteticos funcionaron como datos de entrada La aplicacioacuten fue

configurada para ldquoEscherichia colirdquo como organismo para expresioacuten de proteiacutenas

Es importante mencionar que solicitamos la exclusioacuten de sitios de restriccioacuten

habitualmente localizados en la regioacuten muacuteltiple de clonacioacuten del vector de

expresioacuten pET30a(+) como BamHI (GGATCC) BglII (AGATCT) ClaI (ATCGAT)

EcoRI (GAATTC) HindIII (AAGCTT) KpnI (GGTACC) NcoI (CCATGG) NdeI

(CATATG) NheI (GCTAGC) NotI (GCGGCCGC) PstI (CTGCAG) SacI (GAGCTC) SacII

(CCGCGG) SalI (GTCGAC) SmaI (CCCGGG) SpeI (ACTAGT) SphI (GCATGC) XbaI

(TCTAGA) XhoI (CTCGAG) XmaI (CCCGGG)

Una vez optimizadas usamos CAI Tool (httpgenomesurvesCAIcal) para el

Caacutelculo del Iacutendice de Adaptacioacuten (CAI por sus siglas en ingleacutes) para determinar el

iacutendice de adaptacioacuten de las secuencias nucleotiacutedicas antes y despueacutes de la

optimizacioacuten Esta herramienta utiliza la secuencia nucleotiacutedica y el uso de

codones tanto del organismo nativo como el organismo productor heteroacutelogo (u

organismo recipiente) como entradas para la optimizacioacuten De acuerdo a los

autores el iacutendice tiene un rango de respuesta que oscila entre 0 hasta 1 donde el

valor correspondiente 1 indica si la secuencia de entrada usa los codones maacutes

frecuentemente utilizados por el organismo recipiente (Puigbograve Bravo amp Garcia-

Vallve 2008) Para esta aplicacioacuten los iacutendices de uso de codones de cada


organismo los datos de entrada deben ser descargados y posteriormente deben

ingresarse manualmente Todos los iacutendices fueron descargados de la base de

datos Codon Usage Database (httpswwwkazusaorjpcodon) y se descargaron

para los organismos E coli B (CUD no 413997) S aureus N315 (CUD

no158879) L lactis subsp cremoris (CUD no 1359) and A victoria (CUD no

6100)

46 Especificidad del biosensor por prediccioacuten de comunicacioacuten cruzada

Se realizoacute un alineamiento local entre pares probando de manera independiente

cada una las cuatro clases maacutes comunes de AgrD contra la secuencia

aminoaciacutedica del AgrD del MRSA seleccionada para determinar la especificidad

del biosensor y en consecuencia la existencia de un comportamiento de

comunicacioacuten cruzada El alineamiento se realizoacute en la aplicacioacuten EMBOSS Water

(httpswwwebiacukToolspsaemboss_water) (Madeira et al 2019) Las

secuencias aminoaciacutedicas de las cuatro clases maacutes representativas de AgrD

fueron descargadas de los datos publicados por Wang y otros (B Wang amp Muir

2016) mientras que la secuencia de AgrD de la cepa MRSA que seleccionamos

fue recuperada de una base de datos (KEGG no SAS066)

47 Prediccioacuten de solubilidad de proteiacutenas

La solubilidad de las proteiacutenas seleccionadas para su expresioacuten en E coli fue

predicha por la aplicacioacuten Protein-Sol (httpsprotein-solmanchesteracuk)

(Hebditch Carballo-Amador Charonis Curtis amp Warwicker 2017) La precisioacuten

general de la herramienta fue estimada en 706 De acuerdo con los autores

cualquier valor de solubilidad superior a 045 se considera que es soluble De esta

manera cualquier proteiacutena con valor inferior a 045 se infiere que no son solubles

Es importante mencionar que esta herramienta no es uacutetil para determinar el iacutendice

de solubilidad en proteiacutenas membranales

48 Prediccioacuten de localizacioacuten subcelular de proteiacutenas

La herramienta bioinformaacutetica BUSCA (httpbuscabiocompuniboit) (Savojardo

Martelli Fariselli Profiti amp Casadio 2018) predice la localizacioacuten subcelular de


una proteiacutena en E coli Esta aplicacioacuten nos permite distinguir entre proteiacutenas

globulares de proteiacutenas membranales Para fines de nuestro proyecto nosotros

configuramos a la aplicacioacuten para identificar ldquoProkarya ndash Gram negativerdquo debido a

que eacuteste es el origen taxonoacutemico de nuestro organismo productor heteroacutelogo

49 Prediccioacuten de epiacutetopos de ceacutelulas tipo B

Las aplicaciones BediPrep 20 y Discotope 20 fueron utilizados para calcular la

localizacioacuten de epiacutetopos para ceacutelulas tipo B Se utilizoacute a la LnqQ (PDB no 2N8P

GenBank no AB2352011) como dato de entrada para ambas aplicaciones

BediPrep 20 (httpwwwcbsdtudkservicesBepiPred) fue utilizado para

identificar epiacutetopos de ceacutelulas tipo B en la forma lineal del peacuteptido Esta

herramienta fue entrenada para usar el algoritmo Random Forest para predecir si

un residuo aminoaciacutedico puede ser parte de un epiacutetopo (Jespersen Peters

Nielsen amp Marcatili 2017) Mientras tanto la herramienta Discotope 20

(httpwwwcbsdtudkservicesDiscoTope) fue utilizado para la prediccioacuten de

epiacutetopos discontinuos de ceacutelulas tipo B en proteiacutenas reportadas con estructuras

tridimensionales (Kringelum Lundegaard Lund amp Nielsen 2012)

410 Prediccioacuten de alergenicidad

La alergenicidad de la LnqQ fue evaluada en la herramienta bioinformaacutetica

AllerCatPro versioacuten 17 (httpsallercatprobiia-staredusg) la cual permite

predecir si el componente es capaz de crear una respuesta aleacutergica tipo I mediada

a la inmunoglobulina tipo E (IgE) basada en el anaacutelisis estructural lineal y

tridimensional de la proteiacutena (Maurer-Stroh et al 2019)

411 Disentildeo y anaacutelisis in silico de pETNL

4111 Recuperacioacuten bioinformaacutetica del peacuteptido sentildeal N-AmyE

El archivo que contiene la secuencia nucleotiacutedica de la amilasa AmyE fue

descargado del cataacutelogo de GenBank (GenBank no V001011) El peacuteptido sentildeal

de este archivo fue manualmente extraiacutedo con la aplicacioacuten bioinformaacutetica

SnapGene 113 siguiendo las recomendaciones de la publicacioacuten de Papi y sus

colaboradores (R M Papi et al 2005)


4112 Disentildeo y acoplamiento del peacuteptido sentildeal N-AmyE con LnqQ

Para acoplar el peacuteptido sentildeal N-AmyE en la seccioacuten N-terminal de la LnqQ se

descargoacute el archivo nucleotiacutedico de la LnqQ (GenBank no AB2352011) El

acoplamiento fue manualmente resuelto utilizando la aplicacioacuten bioinformaacutetica

SnapGene 110 agregando sitios de restriccioacuten y algunos nucleoacutetidos tomando

en cuenta las recomendaciones de AddGene de dejar un espacio para asistir en la

clonacioacuten molecular por PCR (httpswwwaddgeneorgprotocolspcr-cloning)

Dos vectores de expresioacuten basados en pET-30a(+) fueron disentildeados in silico

donde uno de los vectores contiene exclusivamente el peacuteptido sentildeal N-AmyE y en

el siguiente estaacute el N-AmyE acoplado con la LnqQ

El documento que contiene los datos geneacuteticos del vector de expresioacuten pETNL fue

elaborado en SnapGene 113 y guardado en formato dna y enviado a BioBasic

Inc (Canadaacute) a traveacutes del tercero autorizado Productos y Equipos

Biotecnoloacutegicos SA de CV (Probiotek Nuevo Leoacuten) para su siacutentesis

4113 Prediccioacuten de corte proteoliacutetico de peacuteptido sentildeal N-

AymELnqQ6xHis

El iacutendice de prediccioacuten del corte proteoliacutetico del peacuteptido sentildeal N-AmyE del

conjunto LnqQ con etiqueta de polihistidina fue evaluado con la aplicacioacuten en liacutenea

SignalP 50 (httpwwwcbsdtudkservicesSignalP) el cual es un servidor que

determina la presencia de peacuteptidos sentildeales y la localizacioacuten de sus sitios de corte

proteoliacutetico en proteiacutenas de origen en Archaea bacterias Gram positivas y

negativas y organismos eucarioacuteticos (Armenteros et al 2019)

Esta herramienta puede distinguir entre tres tipos de peacuteptidos sentildeales tiacutepicos El

primer mecanismo es a traveacutes la viacutea Sec tipo I (SPI) que es conocido como el

mecanismo estaacutendar de excrecioacuten donde los peacuteptidos sentildeales son transportados

por el translocoacuten Sec y son escindidos por accioacuten de la Peptidasa de Sentildeal tipo I

(Lep) El segundo mecanismo corresponde a la viacutea Sec tipo II (SPII) donde los

peacuteptidos sentildeales lipoproteiacutecos son transportados por el translocoacuten Sec y cortados

mediante la Peptidasa de Sentildeal tipo II (Lsp) El uacuteltimo mecanismo corresponde a


la viacutea Tat donde los peacuteptidos sentildeales son transportados por el translocoacuten Tat tipo

y son escindidos por la Peptidasa de Sentildeal tipo I (Lep) (Armenteros et al 2019)

En la aplicacioacuten se puede elegir entre cuatro grupos de organismos para el

anaacutelisis de corte predictivo los cuales corresponden a organismos eucarioacuteticos

organismos Gram positivos organismos Gram negativos y en tipo Archaea Para

fines de nuestro proyecto dado que esta construccioacuten fue intencionada para ser

producida en ceacutelulas de E coli se eligioacute la opcioacuten para organismos Gram

negativos

Para comparar la probabilidad de corte enzimaacutetico de nuestra construccioacuten in silico

de N-AmyELnqQ6xHis se descargoacute los datos bioinformaacuteticos de seis secuencias

aminoaciacutedicas que contienen el peacuteptido sentildeal N-AmyE y cuyo corte proteoliacutetico fue

demostrado experimentalmente

412 Disentildeo y anaacutelisis in silico del pSmbP-LnqQ

4121 Recuperacioacuten bioinformaacutetica del peacuteptido de fusioacuten SmbP

El archivo que contiene la secuencia nucleotiacutedica del peacuteptido de fusioacuten SmbP fue

amablemente cedido por el Dr Xristo Zaacuterate de la Universidad Autoacutenoma de

Nuevo Leoacuten La secuencia nucleotiacutedica del SmbP estaacute contenida en un vector de

expresioacuten tipo pET30a(+) y guardado en formato dna

4122 Disentildeo y acoplamiento de peacuteptido de fusioacuten SmbP con LnqQ

Para acoplar el peacuteptido de fusioacuten con la seccioacuten N-terminal de la LnqQ se

descargoacute el archivo geneacutetico desde la base de datos biotecnoloacutegicos Este

acoplamiento fue manualmente resulto a traveacutes de SnapGene

El documento que contiene los datos geneacuteticos del vector de expresioacuten pSmbP-

LnqQ fueron elaborado en SnapGene 113 guardados en formato dna y enviado

a Gene Universal Inc (Estados Unidos) a traveacutes del tercero autorizado

Distribuidora Bakterlab SA de CV (Bakterlab Nuevo Leoacuten) para su siacutentesis


4123 Prediccioacuten de corte proteoliacutetico de peacuteptido de fusioacuten SmbP-

LnqQ

El iacutendice de prediccioacuten del corte proteoliacutetico del peacuteptido de fusioacuten SmbP del

conjunto LnqQ evaluado con la aplicacioacuten en liacutenea PeptideCutter

(httpswebexpasyorgpeptide_cutter) la cual predice sitios potenciales para ser

cortados por proteasas o por sustancias quiacutemicas en una secuencia de proteiacutena

determinada (Gasteiger et al 2005) Esta aplicacioacuten contiene una lista extensa de

reacciones enzimaacuteticas y quiacutemicas Para fines de nuestro proyecto se eligioacute la

opcioacuten de ldquoEnterokinaserdquo ya que nuestra construccioacuten contiene este dominio

413 Identificacioacuten de codones de paro en los disentildeos

Para descartar que la existencia de alguacuten codoacuten de paro no observado durante la

fase de post disentildeo optamos por analizar la secuencia nucleotiacutedica de la regioacuten

de intereacutes de pETNL y pSmbP-LnqQ en la aplicacioacuten en liacutenea ORF Finder

(httpswwwncbinlmnihgovorffinder) la cual es una aplicacioacuten que encuentra

marcos de lectura abiertos en una secuencia de nucleoacutetidos Los paraacutemetros

seleccionados correspondieron a ldquoATGrdquo exclusivamente como codoacuten de inicio y

como coacutedigo geneacutetico se utilizoacute la opcioacuten 1 correspondiente a ldquoStandardrdquo Esta

aplicacioacuten realiza una traduccioacuten de la secuencia nucleotiacutedica a partir de la

traduccioacuten de seis marcos de lectura y devuelve un graacutefico que indica la ubicacioacuten

donde se encuentra cada marco de lectura identificado (Wheeler et al 2003)

414 Prediccioacuten de peso molecular de N-AmyELnqQ y SmbP-LnqQ

El peso molecular estimado de los productos de los vectores pETNL y pSmbP-

LnqQ fueron estimado a traveacutes de la aplicacioacuten Compute pIMW de ExPasy

(httpswebexpasyorgcompute_pi) la cual permite estimar el punto isoeleacutectrico

(pI) teoacuterico y el peso molecular (MW) teoacuterico a partir de secuencias reportadas o

secuencias de aminoaacutecidos ingresados por el usuario (Gasteiger et al 2005)


415 Prediccioacuten de solubilidad y localizacioacuten celular N-AmyELnqQ y SmbP-

LnqQ

La solubilidad de los productos de los pETNL y pSmbP-LnqQ fueron analizados

por la aplicacioacuten Protein-Sol (httpsprotein-solmanchesteracuk) (Hebditch et al

2017) mientras que la localizacioacuten subcelular de las proteiacutenas fue determinada por

la herramienta BUSCA (httpbuscabiocompuniboit) (Savojardo et al 2018)

416 Prediccioacuten de estructura secundaria y tridimensional de N-AmyELnqQ

y SmbP-LnqQ

Phyre2 (httpwwwsbgbioicacukphyre2htmlpagecgiid=index) es una

aplicacioacuten en liacutenea para el anaacutelisis de modelado para estructuras secundarias y

tridimensionales Esta herramienta permite predecir y analizar la estructura de la

proteiacutena asiacute como funciones y mutaciones haciendo maacutes faacutecil la interfaz al usuario

para interpretar la estructura secundaria y terciaria de los modelos asiacute como la

composicioacuten de dominios y la calidad del modelo (Kelley Mezulis Yates Wass amp

Sternberg 2015)

417 Transformacioacuten de ceacutelulas de E coli con pET30(a)+ pETNL y pSmbP-

LnqQ

4171 Transformacioacuten de ceacutelulas de E coli con DNA exoacutegeno

Para transformar las ceacutelulas de E coli con el vector de expresioacuten pET30a(+)

pETNL o pSmbP-LnqQ se utilizoacute la teacutecnica de electroporacioacuten (Potter amp Heller

2003) que consiste en la introduccioacuten de DNA exoacutegeno al interior de las ceacutelulas

por meacutetodos fiacutesico-quiacutemicos A continuacioacuten describimos la teacutecnica

Se preparoacute un cultivo overnight de E coli en un tubo con caldo LB esteacuteril y se

incuboacute por 37degC en agitacioacuten constante por 18 h Al diacutea siguiente 20 microl del cultivo

preinoacuteculo fueron retirados y depositados en un microtubo con 1 ml de caldo LB

esteacuteril este proceso se realizoacute en seis tubos donde tres son etiquetados ldquoMuestrardquo

(M) ldquoAntibioacuteticordquo (A) ldquoViabilidadrdquo (V) y tres maacutes fueron reservados para anaacutelisis

espectrofotomeacutetricos Se incubaron todos los tubos a 37degC durante

aproximadamente 15 h (OD600 entre 04-06) en agitacioacuten constante Todos los


tubos asignados para anaacutelisis espectrofotomeacutetricos fueron usados para monitoreo

Una vez alcanzado el tiempo establecido los tubos M A y V fueron centrifugados

a 9000 rpm durante 2 min a temperatura ambiente El sobrenadante de los tubos

fue descartado y las ceacutelulas fueron resuspendidas en 1 ml de agua ultrapura

esteacuteril a temperatura ambiente Los tubos fueron centrifugados a 9000 rpm

durante 2 min a temperatura ambiente Este paso se repitioacute una vez El precipitado

celular en los tubos M A y V fue resuspendido en 35 microl de agua ultrapura esteacuteril y

se agregoacute al menos 2 a 3 microl de plaacutesmido (asymp 500 microg totales) o de agua seguacuten el

caso Finalmente se mezcloacute cuidadosamente con la micropipeta

En el tubo de viabilidad no se agregoacute plaacutesmido y fue sembrado en una placa LB

En el tubo etiquetado como antibioacutetico no se agregoacute plaacutesmido y el precipitado fue

sembrado en una placa de LB suplementado con kanamicina (50 microgml) Al tubo

de control positivo se agregoacute un plaacutesmido resistente a la kanamicina y eacutesta fue

sometida a electroporacioacuten y sembrada en una placa con LB con kanamicina En

la muestra se agregoacute alguno de los siguientes plaacutesmidos pET30a(+) pETNL o

pSmbP-LnqQ y posteriormente fue sometido a electroporacioacuten y sembrado en una

placa de LB con kanamicina

El volumen total de los tubos fue transferido a una celda de electroporacioacuten en el

espacio de 2 mm El equipo de electroporacioacuten (previamente irradiado con luz UV

por 15 min) fue encendido y configurado para electroporar a 2500 V

Posteriormente se agregoacute 1 ml de caldo LB esteacuteril a la celda de electroporacioacuten y

cuidadosamente mezclado (para evitar estresar a la ceacutelula) La mezcla es tomada

con mucho cuidado desde la celda y transferido a un tubo de 15 ml esteacuteril El tubo

fue incubado a 37degC por 1 h en agitacioacuten muy baja Cumplido el tiempo

establecido el tubo fue centrifugado a 9000 rpm durante 2 min Se retiroacute la mayor

parte del sobrenadante (asymp 950 ml) y el restante fue mezclado suavemente con el

precipitado celular hasta suspender la solucioacuten El volumen total resuspendido fue

sembrado en placas de LB agar o LB agar suplementado con kanamicina (50

microgml) dependiendo el caso Las placas fueron incubadas a 37degC en condiciones

de aerobiosis durante 16 h Al terminar las placas fueron revisadas y


seleccionadas Las ceacutelulas efectivamente transformadas con los plaacutesmidos fueron

resistentes a la accioacuten de la kanamicina mientras que las no transformadas fueron

eliminadas Las ceacutelulas transformadas fueron validadas posteriormente por

teacutecnicas moleculares como extraccioacuten de DNA plasmiacutedico yo identificacioacuten por

producto de PCR punto final

4172 Extraccioacuten y purificacioacuten de DNA exoacutegeno de ceacutelulas de E coli

Para la extraccioacuten y purificacioacuten utilizamos el Isolate II Plasmid Mini Kit de

Meridian Biosciencereg (Estados Unidos Cat BIO-52056) Se preparoacute un cultivo

overnight de E coli en un tubo 5 ml de caldo LB esteacuteril y se incuboacute por 37degC en

agitacioacuten constante por no maacutes ni menos de 16 h Al diacutea siguiente previo al

ensayo de extraccioacuten se precalentoacute la solucioacuten de buffer de lavado PW1 a 50degC y

la temperatura se mantuvo a esta temperatura hasta su uso Se verificoacute que el

buffer de lavado PW2 estuviera suplementado con etanol

El cultivo overnight fue centrifugado a 11000 x g por 30 minutos El volumen se

retiroacute y se mantuvo el precipitado celular al cual se agregoacute 250 microl del buffer de

resuspensioacuten P1 y el precipitado se resuspendioacute por completo por voacutertex Es

importante que no quede masa celular adherida en los tubos Posteriormente se

agregaron 250 microl de buffer de lisis P2 y se mezcloacute suavemente por inversioacuten unas

6 a 8 veces El tubo fue incubado a temperatura ambiente por 5 min o hasta que el

lisado celular se tornara claro Cumplido el tiempo anterior se adicionaron 300 microl

de buffer de neutralizacioacuten P3 y se mezcloacute suavemente por inversioacuten unas 6 a 8

veces Este procedimiento fue para evitar el rompimiento del DNA genoacutemico Los

tubos fueron centrifugados a 11000 x g durante 5 min a temperatura ambiente

Este paso fue repetido hasta que el sobrenadante quedara lo maacutes claro posible

Posteriormente se tomoacute una columna tipo spin y sobre eacutesta se agregoacute un tubo

colector y sobre eacutesta se antildeadioacute el volumen recuperado del paso anterior El tubo

con el volumen fue centrifugado a 11000 x g por 5 min a temperatura ambiente El

sobrenadante del tubo fue eliminado por decantacioacuten Sobre el tubo colector se

agregoacute 500 microl de buffer de lavado PW1 precalentado y se centrifugoacute a 11000 x g

por 5 min a temperatura ambiente El sobrenadante del tubo fue eliminado por


decantacioacuten Se adicionoacute 600 microl de buffer de lavado PW2 (suplementado con

etanol) y se centrifugoacute a 11000 x g por 5 min a temperatura ambiente El

sobrenadante del tubo fue eliminado por decantacioacuten Centrifugar de nuevo el tubo

colector a 11000 x g por 2 min a temperatura ambiente para remover etanol

residual

Debajo del tubo colector se colocoacute un tubo de 15 ml esteacuteril y se agregoacute 50 microl de

buffer de elucioacuten P directamente sobre la membrana de siacutelice Se incuboacute a

temperatura ambiente y se centrifugoacute a 11000 x g por 2 min a temperatura

ambiente Del tubo con DNA purificado se tomaron 2 microl y se analizaron por nano-

espectrofotometriacutea para el caacutelculo de concentracioacuten y de pureza del DNA

plasmiacutedico

4173 Oligonucleoacutetidos para identificacioacuten de plaacutesmidos por PCR

punto final

Para comprobar que las ceacutelulas de E coli fueran efectivamente transformadas con

el vector de expresioacuten pET30a(+) pETNL y pSmbP-LnqQ se realizoacute un

experimento de PCR punto final para identificar al plaacutesmido recuperado de las

ceacutelulas de E coli Para ello nos enfocamos en primer lugar a elegir un par de

oligonucleoacutetidos que cumplieran de identificar los vectores de expresioacuten

El par de oligonucleoacutetidos elegidos para el anaacutelisis de las construcciones

corresponden al T7 promoter primer (5rsquo- TAATACGACTCACTATAGGG-3rsquo) y al T7

terminal primer (5rsquo- GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3rsquo) los cuales son oligonucleoacutetidos

especiacuteficos para vectores construidos basados en pET30a(+) La secuencia de

ambos oligonucleoacutetidos fue recuperada de una compilacioacuten de AddGene para

ldquoSequencing Primersrdquo (httpswwwaddgeneorgmol-bio-referencesequencing-

primers)

Para determinar la temperatura de fusioacuten oacuteptima del par de oligonucleoacutetidos

utilizamos dos herramientas bioinformaacuteticas en liacutenea La primera aplicacioacuten fue

OligoAnalyzertrade (httpswwwidtdnacomcalcanalyzer) de la compantildeiacutea Integrated

DNA Technologies Inc (Estados Unidos) donde se ajustaron paraacutemetros como la


concentracioacuten de oligonucleoacutetido las concentraciones de iones monovalentes

(Na+) y divalentes (Mg2+) asiacute como la concentracioacuten de nucleoacutetidos (dNTPs) en la

reaccioacuten para el caacutelculo de formacioacuten de hairpin homodiacutemeros y heterodiacutemeros

La otra aplicacioacuten es Net Primer (httpswwwpremierbiosoftcomnetprimer) de

Premier Biosoft que tambieacuten contiene puntos como la aplicacioacuten anteriormente

mencionada pero contiene opciones como el caacutelculo de rating de eacutexito y

estabilidad en el extremo 3rsquo-terminal

Para realizacioacuten del ensayo de PCR punto final utilizamos el High-Stability PCR

kit (Cat No L00342 Manual No 0285 Versioacuten 08272013) de GenScript Inc

(Estados Unidos) De esta manera ajustamos las condiciones de reaccioacuten de PCR

seguacuten lo determinado por el fabricante para por la DNA polimerasa Green Taq La

reaccioacuten de PCR punto final se ajustoacute a una concentracioacuten de oligonucleoacutetidos de

trabajo para 10 microM concentracioacuten de monovalentes (Na+K+) a 500 mM

concentracioacuten de divalentes (Mg2+) a 15 mM y concentracioacuten de dNTPs a 05 mM

El protocolo general para ensayo de PCR punto final de acuerdo con el fabricante

consistioacute en que por cada 50 microl de volumen de reaccioacuten se agregariacutean 5 microl de 10

X de Reaction Buffer 10 microl de 10 mM de dNTPs 10 microl por el oligonucleoacutetido 5rsquo-

terminal a 20 microM 10 microl por el oligonucleoacutetido 3rsquo-terminal a 20 microM 20 microl de

plaacutesmido (de al menos 100 ngmicrol) 395 microl de agua ultrapura esteacuteril y 05 microl de la

DNA polimerasa Green Taq

4174 Corrida de DNA en gel de agarosa

Las muestras obtenidas fueron procesadas en un gel de agarosa (1 pv)

adicionada con Eco-Stain ready to use (Cat No DT81413) de BioBasic Inc

(Canadaacute) el cual es una sustancia que tiene un pico de excitacioacuten a λ = 490 nm y

dos picos de emisioacuten λ = 520 nm y λ = 635 nm y esta solucioacuten se agrega al gel en

una relacioacuten de 1 microl por 20 ml de solucioacuten de agarosa Las muestras fueron

corridas durante 1 h a 100 V en caacutemara para electroforesis Al terminar el tiempo

establecido el gel fue retirado e iluminado con luz UV en el transiluminador y se

tomoacute una fotografiacutea como evidencia Todos los geles fueron elaborados con su

respectivos controles positivos negativos y muestras


418 Determinacioacuten de expresioacuten proteica por SDS-PAGE

4181 Induccioacuten de IPTG en ceacutelulas de E coli modificadas

Brevemente cultivos con diferentes cepas de E coli transformados con

pET30a(+) pETNL o pSmbP-LnqQ fueron inducidos con IPTG Se realizoacute un

cultivo preinoacuteculo de E coli BL21 (DE3) transformado en un matraz con 25 ml de

caldo LB suplementado con kanamicina (conc final 50 microgml) a 37degC en agitacioacuten

constante durante toda la noche Al diacutea siguiente se registroacute el valor de OD600 del

cultivo preinoacuteculo Se inoculoacute un volumen de cultivo preinoacuteculo en un matraz

esteacuteril con 25 ml de caldo LB suplementado con kanamicina hasta llegar a un valor

inicial de OD600 asymp 01 Este matraz fue incubado a 37degC en agitacioacuten constante

hasta alcanzar un valor espectrofotomeacutetrico de OD600 asymp 04

Una vez que cultivo cumplioacute con punto anterior este cultivo fue inoculado con

IPTG (concentracioacuten final 01 mM) y se incuboacute durante 16 h en dos diferentes

temperaturas a 25degC y a 37degC Cumplido el tiempo el cultivo fue distribuido en

tubos de 50 ml esteacuteriles y enviados directamente a congelacioacuten Todos los tubos

usados fueron pesados previo a su llenado con los cultivos Los tubos fueron

propiamente etiquetados

4182 Extraccioacuten de proteiacutenas periplaacutesmicas en ceacutelulas de E coli

transformados con pETNL

Los cultivos de E coli transformados ya fuera con pET30a(+) pETNL o pSmbP-

LnqQ fueron inducidos por IPTG para la sobreproduccioacuten de proteiacutenas

Brevemente se realizoacute un cultivo preinoacuteculo de E coli BL21 (DE3) transformado

en un matraz con 25 ml de caldo LB suplementado con kanamicina (conc final 50

microgml) a 37degC en agitacioacuten constante durante toda la noche Al diacutea siguiente se

registroacute el valor de OD600 del cultivo preinoacuteculo Se inoculoacute un volumen de cultivo

preinoacuteculo en un matraz esteacuteril con 25 ml de caldo LB suplementado con

kanamicina hasta llegar a un valor inicial de OD600 asymp 01 Este matraz fue incubado

a 37degC en agitacioacuten constante hasta alcanzar un valor espectrofotomeacutetrico de

OD600 asymp 04 Una vez que cultivo cumplioacute con punto anterior este cultivo fue

inoculado con IPTG (concentracioacuten final 01 mM) y se incuboacute durante 16 h en dos


diferentes temperaturas a 25degC y a 37degC Cumplido el tiempo el cultivo fue

distribuido en tubos de 50 ml esteacuteriles y enviados directamente a congelacioacuten

Todos los tubos usados fueron pesados previo a su llenado con los cultivos Los

tubos fueron propiamente etiquetados

Para la extraccioacuten de proteiacutenas en la seccioacuten periplaacutesmica de ceacutelulas se utilizoacute el

protocolo de Santos y sus colaboradores (BD Santos et al 2019) que es un

procedimiento en un ensayo de lisozima con choque osmoacutetico Se descongeloacute los

tubos a baja temperatura y posteriormente fueron centrifugados a 8000 times g

durante 15 min a 4degC El sobrenadante de cada tubo fue eliminado y lavado dos

veces con buffer PBS 1X pH 74 (Gibco) friacuteo (8000 times g durante 10 min a 4degC) En

el uacuteltimo lavado los tubos con precipitado celular fueron pesados y sus pesos se

registraron Por uacuteltimo se calculoacute la diferencia entre los tubos con precipitado

celular contra los tubos cuando estaban vaciacuteos A cada uno de los tubos con

precipitado celular se le agregoacute solucioacuten hipertoacutenica friacuteo (sacarosa 20 trizma 20

mM EDTA 2 mM y lisozima 20 mgml pH 80) a una relacioacuten de 10 microl solucioacuten

hipertoacutenica por cada mg de peso huacutemedo de ceacutelulas Posteriormente el contenido

de cada tubo fue mezclado y fueron incubados por 40 min a 4degC Finalizado el

tiempo el cultivo fue centrifugado a 8000 times g durante 10 min a 4degC

El sobrenadante fue recuperado en nuevos tubos y etiquetados como ldquoFraccioacuten

periplaacutesmica hipertoacutenicardquo y se conservaron a -20degC hasta nuevo uso El

precipitado celular es reservado Una vez retirada la fraccioacuten anterior los tubos

con precipitado celular remanentes fueron pesados de nuevo y se agregoacute solucioacuten

hipotoacutenica (agua ultrapura esteacuteril) a una relacioacuten de 10 microl solucioacuten hipotoacutenica por

cada mg de peso huacutemedo de ceacutelulas Posteriormente el contenido de cada tubo

fue mezclado y fueron incubados por 40 min a 4degC Finalizado el tiempo el cultivo

fue centrifugado a 8000 times g durante 10 min a 4degC El sobrenadante fue

recuperado en nuevos tubos y etiquetados como ldquoFraccioacuten periplaacutesmica

hipotoacutenicardquo y se conservaron a -20degC hasta nuevo uso El precipitado celular se

eliminado


4183 Extraccioacuten de proteiacutenas citoplaacutesmicas en ceacutelulas de E coli

transformados con pSmbP-LnqQ

Para la extraccioacuten de proteiacutenas en la seccioacuten citoplaacutesmica de ceacutelulas se utilizoacute el

protocolo de Vargas y sus colaboradores (Vargas-Cortez et al 2016) junto con

recomendaciones de Peacuterez (D Peacuterez comunicacioacuten personal 2021) que es un

procedimiento basado en perlas de vidrio

Se descongelaron los tubos a baja temperatura y posteriormente centrifugados a

8000 times g durante 15 min a 4degC El precipitado celular de los tubos fueron

resuspendidos en buffer de lisis friacuteo (Tris-HCl 50 mM NaCl 500 mM pH 80) y se

agregaron 150 mg de perlas de vidrio limpios de 01 mm Los precipitados

celulares resuspendidos en perlas fueron mezclados por voacutertex durante 1 min Los

tubos fueron centrifugados a maacutexima velocidad por 15 min a 4degC El sobrenadante

fue recuperado con cuidado de cada tubo y fue etiquetado como ldquoFraccioacuten

citoplaacutesmicardquo

4184 Obtencioacuten de fracciones solubles e insolubles para SDS-PAGE

Para obtener las fracciones solubles e insolubles seguimos el protocolo de Santos

(Byran Santos 2017) Para la fraccioacuten soluble a partir del sedimento celular eacutesta

es resuspendida en 120 microl de agua ultrapura esteacuteril y despueacutes se le agregan 40 microl

de solucioacuten amortiguadora de carga SDS-PAGE 4X suplementado con β-

mercaptoetanol para una concentracioacuten final al 1X La solucioacuten fue hervida durante

10 min y posteriormente centrifugada a 13000 rpm por 10 min El sobrenadante

fue separado y guardado como ldquoFraccioacuten solublerdquo Luego al sedimento restante

se le agregaron 120 microl de solucioacuten de urea 8 M y se hierve de nuevo durante otros

10 min para solubilizacioacuten de los cuerpos de inclusioacuten Finalmente la solucioacuten fue

centrifugada a 13000 rpm por 10 min El sobrenadante fue separado y guardado

como ldquoFraccioacuten insolublerdquo Ambas fracciones fueron visualizadas posteriormente

en los geles de SDS-PAGE


4185 Preparacioacuten de gel de SDS-PAGE 16

Los geles de SDS-PAGE fueron preparados bajo las siguientes condiciones se

prepararon dos geles en dos tubos nuevos e independientes conocidos como

lower y upper con suficiente capacidad para almacenar el volumen de cada gel

Primero se preparoacute el lower gel y solo hasta haber terminado ese gel se procedioacute

a preparar el upper gel

Para preparar el lower gel a 16 preparamos una reaccioacuten considerando un

volumen de 10 ml Para ello mezclamos 350 ml de agua destilada 400 ml de

solucioacuten de BisAcrilamida 40 (291) 250 ml de lower buffer (para 25 ml Tris

1515 g SDS 01 g pH 68) 200 microl de APS 10 (pv) y TEMED 20 microl Para el

upper gel a 4 estaacute reaccioacuten fue montada con un volumen de 5 ml Para ello

mezclamos 325 ml de agua destilada 050 ml de solucioacuten de BisAcrilamida 40

(291) 125 ml de upper buffer (para 25 ml Tris 454 g SDS 01 g pH 88) 100 microl

de APS 10 (pv) y 20 microl de TEMED

Tanto la solucioacuten de BisAcrilamida 40 (291) del upper buffer y el lower buffer

fueron retirados del refrigerador y atemperados a temperatura ambiente cuando

menos unos 15 min antes de uso La solucioacuten de APS a una relacioacuten de 01 g por

1 ml (10 pv) debioacute prepararse al momento con agua destilada limpia Toda la

cristaleriacutea usada para preparar el gel de poliacrilamida debioacute ser lavada con agua

destilada limpia y secarse con suficiencia evitando rayar los vidrios

Una vez agregado el TEMED a la mezcla la solucioacuten fue inmediatamente vertido

sobre placas de vidrio Fue necesario esperar entre 20 a 30 minutos para que

completar el proceso de polimerizacioacuten En el lower gel se agregaron 200 microl de

isobutanol para el upper gel en la parte superior se agregoacute un molde para

pocillos Terminado el tiempo de polimerizacioacuten se agregaron las muestras de

proteiacutenas en los pocillos del gel de SDS-PAGE Los geles fueron puestos sobre

una caacutemara de electroforesis vertical y sumergidos en un buffer de corrida a 1X

(para 1000 ml Tris 3 g Glicina 144 g y SDS 1 g) El gel fue corrido a 150 V

durante 1 a 15 h dependiendo de la liacutenea de corrida de la solucioacuten

amortiguadora


4186 Tincioacuten de gel SDS-PAGE

Previo a tentildeir los geles se prepararon dos soluciones Para la solucioacuten de tincioacuten

se pesaron cuidadosamente y con guantes 50 mg de Coomasie Blue R-250 en un

tubo plaacutestico limpio para un volumen de 50 ml Despueacutes se agregaron 25 ml de

metanol absoluto y 5 ml de aacutecido aceacutetico absoluto Esta solucioacuten fue aforada hasta

50 ml con agua destilada limpia Mantener a temperatura ambiente y en

condiciones de obscuridad hasta su uso Mientras que para la solucioacuten de

destincioacuten se midieron 75 ml de metanol absoluto y 5 ml de aacutecido aceacutetico

absoluto Esta solucioacuten fue aforada hasta 50 ml con agua destilada limpia

Mantener a temperatura ambiente hasta su uso

Cuando terminado el paso de corrida por electroforesis los geles fueron

cuidadosamente separados de los vidrios El gel fue tentildeido con la solucioacuten de

tincioacuten durante toda la noche en agitacioacuten constante a temperatura ambiente y

posteriormente fue destentildeido con la solucioacuten de destincioacuten durante el resto del diacutea

siguiente bajo las mismas condiciones previas El gel fue puesto sobre un fondo

blanco y se fotografioacute como evidencia

419 Presuntas causas de la ausencia de bandas de proteiacutenas de intereacutes en

los geles

La presente seccioacuten fue desarrollada posterior a la conclusioacuten de la fase

experimental con el objetivo de explicar la ausencia de bandas tanto de N-

AmyELnqQ como de SmbP-LnqQ en los geles de SDS-PAGE Para abordar el

problema exploramos las propiedades fisicoquiacutemicas de las proteiacutenas por el

anaacutelisis de hidrofobicidad a traveacutes de la escala Kyte-Doolittle un anaacutelisis de perfil

aminoaciacutedico y finalmente a traveacutes de diferencias por su origen evolutivo

Las propiedades fisicoquiacutemicas de las proteiacutenas como el tamantildeo de proteiacutenas

peso molecular punto isoeleacutectrico nuacutemero total de residuos con carga positiva y

negativa iacutendice alifaacutetico (AI) e iacutendice de hidrofobicidad (GRAVY) fueron calculadas

a traveacutes de ProtParam de ExPasy (httpswebexpasyorgprotparamprotparam-

dochtml) (Gasteiger et al 2005) El iacutendice alifaacutetico (AI) estaacute principalmente

afectado por los cuatro aminoaacutecidos con cadena lateral alifaacutetico alanina valina


leucina e isoleucina El incremento del AI es directamente proporcional a la

termoestabilidad en proteiacutenas globulares (Atsushi 1980) El iacutendice de

hidrofobicidad (GRAVY) es el resultado del promedio que representa la suma total

de los valores de hidropatiacutea de cada uno de los residuos dentro de una cadena

lineal de aminoaacutecidos dividido por el tamantildeo del peacuteptidoproteiacutena Una proteiacutena

con valor GRAVY negativo una proteiacutena hidrofiacutelica mientras que una proteiacutena con

valor GRAVY positivo es hidrofoacutebica (Kyte amp Doolittle 1982)

El anaacutelisis de hidrofobicidad a traveacutes de la escala Kyte-Doolittle fue elaborado a

partir de ProtScale de ExPasy (httpswebexpasyorgprotscale) (Gasteiger et al

2005) Esta herramienta permite elaborar un perfil producido por cualquier escala

aminoaciacutedica a partir de una secuencia aminoaciacutedica Existen 57 escalas de

hidrofobicidad yo hidrofilicidad para fines de nuestro experimento utilizamos la

opcioacuten ldquoHphob Kyte amp Doolittlerdquo

El mapa de calor representa el porcentaje de aminoaacutecidos dada en una secuencia

lineal de aminoaacutecidos con el fin de elaborar un perfil aminoaciacutedico entre los

diferentes peacuteptidos antimicrobianos que fueron efectivamente sobreproducidos por

SmbP La graacutefica fue elaborada a traveacutes de Excel con datos descargados desde la

aplicacioacuten ProtParam de ExPasy


CAPIacuteTULO 5 MATERIALES Y EQUIPOS

Las actividades del proyecto fueron realizadas en los Laboratorios de Biologiacutea y de

Sistemas del Centro de Investigacioacuten en Biotecnologiacutea y Nanotecnologiacutea y el

Laboratorio de Expresioacuten y Purificacioacuten de Proteiacutenas ubicado en la Divisioacuten de

Estudios de Posgrado ambas infraestructuras pertenecientes a la Facultad de

Ciencias Quiacutemicas de la Universidad Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten

A continuacioacuten se presenta un listado completo de los materiales y equipos

utilizado

51 Materiales y reactivos

Nombre Compantildeiacutea Cataacutelogo

Microtubos de 15 ml 15 ml y 50 ml Distintas marcas No especificado

Cajas Petri de plaacutestico o vidrio Distintas marcas No especificado

Matraces tipo Erlenmeyer Distintas marcas No especificado

Celdas para espectrofotoacutemetro No especificado No especificado

Celdas de electroporacioacuten No especificado No especificado

Micropipetas (varios voluacutemenes) Distintas marcas No especificado

Medio de cultivo LB Difco 244620

Agar bacterioloacutegico MCD-LAB 9011

Agua grado Biologiacutea Molecular Invitrogen 10977-015

Kanamicina sulfato AG Scientific K-1022

Ampicilina soacutedica Sigma Aldrich A0166

Perlas de vidrio 01 mm Biospec 11079101

IPTG Bioline BIO-37036

LDS Sample Buffer 4X GenScript M00676-10

SDS IBI Scientific IB07062

Persulfato de Amonio (APS) BioBasic AB0072

TEMED Merck 110732

Glicina BioBasic GB0235

Bis-Acrilamida 40 (29109) Merck 100641

Coomasie Briliant Blue BioBasic CB0038

2-mercaptoetanol BioBasic MB0338

Isopropanol 100 DEQ No especificado


Aacutecido fosfoacuterico 85 Jalmek A1825-13

Hidroacutexido de sodio DEQ No especificado

Aacutecido clorhiacutedrico DEQ No especificado

Alcohol metiacutelico DEQ No especificado

Aacutecido aceacutetico glacial Jalmek A0925-13

Etanol anhidro Jalmek E5325-18

Urea BioBasic UB0148

Buffer de fosfatos salinos 1X (PBS) Gibco 10010-023

Cloruro de sodio Jalmek S2325-05

Tris BioBasic TB0196

Glicerol DEQ No especificado

Guantes de nitrilo Ambiderm No especificado

Solucioacuten estaacutendar amortiguadora pH 4 J T Baker S657-02



QuickClean II Plasmid Miniprep kit GenScript L00420-100

QuickClean II Gel Extraction Kit GenScript L00418-100

QuickClean II PCR Purification Kit GenScript L00419-50

52 Equipos de laboratorio

USO PERSONAL


Computadora personal Acer Aspire A515-51

LABORATORIO DE BIOLOGIacuteA Y DE SISTEMAS


Incubadora estaacutetica Lab Companion IB-11E

Incubadora de piso con agitacioacuten Lab Companion IS-971

Incubadora de agitacioacuten (microtubos) Eppendorf ThermoMixer C

Horno de secado Shel Lab SGO 6E

Horno de microondas Everstar P90D23AL-XF

Concentrador Thermo Fisher SpeedVac SPD


Bantildeo de ultrasonido VMR Symphony 97043-996

Contador de colonias Reichert 3327

Agitador orbital Labnet Orbit 1000

Agitador vertical Thermo Scientific Compact Digital Rocket

Termociclador miniPCR Mini8

Termociclador Techne 3Prime

Refrigerador de puertas deslizantes Thermo Scientific MH45PA-GAEE-TS GPR Series

Refrigerador a dos puertas Norlake Scientific LRF 201WW

Congelador de -20 degC MetalFrio Solutions

No especificado

Espectrofotoacutemetro UV-Vis Optizen 2120 UV Plus

Nanoespectrofotoacutemetro BioSpec Shimadzu

Gabinete bioseguridad clase II Labconco Delta Series

Centriacutefuga para microtubos Ohaus Frontier 5515

Centriacutefuga de piso Thermo Scientific Sorvall Legend XFR

Voacutertex Scientific Industries

Genie 2

Plancha de calentamiento con agitacioacuten magneacutetica

Lab Companion HP-3000L

Microscopio oacuteptico Fisher Scientific Micromaster

Autoclave Lab Companion ST-G Series

Caacutemara profesional Canon EOS M10

Transiluminador Maestro No especificado

Balanza analiacutetica AND GR-200

Balanza semianaliacutetica Ohaus Traveler

Electroporador Eppendorf Eppendorf

Fuente de Poder BioRad PowerPac Basic

Potencioacutemetro Ohaus Starter 5000

LABORATORIO DE EXPRESIOacuteN Y PURIFICACIOacuteN DE PROTEIacuteNAS


Cromatoacutegrafo GE Life Sciences Aumlktaprime Plus



53 Lugares de experimentacioacuten

Nuestro proyecto fue elaborado entre Febrero de 2018 a Mayo de 2021 y fue

mayoritariamente realizado en las instalaciones del Laboratorio de Biologiacutea

Sinteacutetica y de Sistemas (LBSS) a cargo del Dr Heacutector Javier Ameacutezquita Garciacutea

encontraacutendose en el interior del Centro de Investigacioacuten en Biotecnologiacutea y

Nanotecnologiacutea (CIBYN) dependencia de la Facultad de Ciencias Quiacutemicas

(FCQ) de la Universidad Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten El centro estaacute ubicado en la

autopista al Aeropuerto ldquoMariano Escobedordquo Km 10 Parque de Investigacioacuten e

Innovacioacuten Tecnoloacutegica (PIIT) CP 66628 en Apodaca Nuevo Leoacuten Meacutexico

En menor proporcioacuten nuestro trabajo tambieacuten fue realizado en el Laboratorio de

Expresioacuten y Purificacioacuten de Proteiacutenas (PEP) a cargo del Dr Xristo Zaacuterate

Kalfoacutepulos Esta unidad estaacute localizada en el interior de la Divisioacuten de Estudios de

Posgrado (DEP) de Facultad de Ciencias Quiacutemicas (FCQ) de la Universidad

Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten (UANL) La ubicacioacuten de la divisioacuten estaacute en la calle

Vicente Guerrero sn Col Trevintildeo CP 64570 en Monterrey Nuevo Leoacuten

Meacutexico

54 Seguridad en el laboratorio y disposicioacuten de residuos

Declaracioacuten de manejo y disposicioacuten de residuos

Todos residuos generados durante la realizacioacuten del proyecto de investigacioacuten

fueron gestionados de acuerdo con las caracteriacutesticas de estos siguiendo los

lineamientos establecidos por el Departamento de Medio Ambiente y Seguridad de

la Facultad de Ciencias Quiacutemicas utilizando los recipientes proporcionados por

este departamento en base a la Norma PR-CLB-SRR-000

Los residuos bioloacutegico-quiacutemicos fueron dispuestos en los contenedores

correspondientes en el interior de los laboratorios


CAPIacuteTULO 6 RESULTADOS Y DISCUSIONES


En esta seccioacuten nos centramos en el disentildeo in silico de ceacutelulas de E coli

configuradas para detectar moleacuteculas de AIP producidos por el sistema nativo de

QS de ceacutelulas de MRSA De acuerdo con nuestro disentildeo (Figura 2) las ceacutelulas α

corresponden a ceacutelulas de S aureus productoras de moleacuteculas AIP mientras que

las ceacutelulas β corresponden a ceacutelulas de E coli que han sido modificadas con un

par de moacutedulos geneacuteticos biosensor y bacteriocina que le permiten detectar

moleacuteculas de AIP y en respuesta destruyen ceacutelulas de S aureus en el medio A

manera de resumen las ceacutelulas de E coli modificadas producen y excretan LnqQ

en funcioacuten de la concentracioacuten externa de moleacuteculas de AIP

Nuestra determinacioacuten por elegir bacteriocinas como sustancias antimicrobianas

para nuestro sistema biosensor se explica en la siguiente numeracioacuten en primer

lugar consideramos que debido a su origen proteico son susceptibles a

modificaciones geneacuteticas (Cotter et al 2013)

Figura 2 Sistema QS para deteccioacuten y eliminacioacuten de S aureus

El moacutedulo biosensor conformado por agrC y agrA (azul marino y azul celeste respectivamente) estaacute regulado

por el promotor constitutivo J23110 La deteccioacuten del AIP-II (pentaacutegonos naranja) estaacute regulado por AgrC la

cual activa la fosforilacioacuten (ciacuterculos amarillo) de AgrA y activa la expresioacuten del moacutedulo bacteriocina a traveacutes

de la lnqQ lnqBCEDF y gfp (rojo amarillo y verde respectivamente) regulado por el promotor P2 LnqQ

destruye ceacutelulas de S aureus



La razoacuten de escoger a E coli como chasis bioloacutegico de produccioacuten es porque ya

ha sido reportado previamente como biosensor de ceacutelulas enteras basados en

deteccioacuten del QS (Sedlmayer Hell Muumlller Auslaumlnder amp Fussenegger 2018) y

ademaacutes porque es el organismo de produccioacuten heteroacuteloga maacutes usado en el campo

de las bacteriocinas (Mesa-Pereira et al 2018) Nuestro modelo estaacute disentildeado

para ser aplicado en E coli BL21 (DE3) ya que ha sido efectivamente reportado

para producir y secretar bacteriocinas de las clases IIa y IId eacuteste uacuteltimo es

importante ya que esta es la clase a la que pertenece la bacteriocina LnqQ (Mesa-

Pereira et al 2017)

63 Disentildeo de los moacutedulos biosensor y de bacteriocina

Para determinar el comportamiento in silico de nuestra ceacutelula de E coli fue

necesario disentildear un vector de expresioacuten con dos moacutedulos geneacuteticos y eacutestos

fueron referidos como moacutedulo biosensor y moacutedulo de bacteriocina

respectivamente Ambos moacutedulos fueron disentildeados de la siguiente manera

promotor-RBS-gene(s) estructural(es)-doble terminador (Figura 3)

Figura 3 Moacutedulos biosensor y de bacteriocina

El moacutedulo biosensor es configurado con agrC y agrA y estaacuten regulados transcripcionalmente por el promotor

J23110 (A) El moacutedulo de bacteriocina estaacute armado con los genes lnqQ y gfp y estaacuten regulados


transcripcionalmente por el promotor P2 (B) Por uacuteltimo se muestra el disentildeo del sistema detectar y destruir

con los promotores divergentes J23110 y P2 (C)

En primera instancia se debioacute localizar el locus geneacutetico del promotor P2 de

nuestra MRSA fue manualmente localizado puesto que no existiacutea informacioacuten

relacionada al mismo De acuerdo con Shao y otros el locus de un promotor se

encuentra evolutivamente conservado entre especies que estaacuten relacionadas

(Shao Price Deutschbauer Romine amp Arkin 2014) De esta manera utilizamos

la anterior premisa para localizar el promotor P2 en un primer enfoque

localizamos la secuencia nucleotiacutedica del agrB en el archivo genoacutemico de la

MRSA (564 nucleoacutetidos KEGG no SA1842) como referencia ya que se conoce

que este gen es conocido que eacutesta es la primera unidad transcripcional ubicada riacuteo

abajo del promotor P2 (Reynolds amp Wigneshweraraj 2011) Para el segundo

enfoque usamos la informacioacuten disponible del promotor P2 de S aureus NCTC

8325 (Rajasree Fasim amp Gopal 2016 Reynolds amp Wigneshweraraj 2011) una

cepa catalogada como estaacutendar para estudios bioinformaacuteticos (S Fuchs et al

2017 Herbert et al 2010) Al combinar lo mejor de ambos enfoques logramos

localizar la composicioacuten nucleotiacutedica del promotor P2 y su tamantildeo a traveacutes de la

identificacioacuten de los dominios

A continuacioacuten explicamos el principio del disentildeo de ambos moacutedulos En primer

lugar el moacutedulo designado como biosensor los genes agrC y agrA son

constitutivamente expresados por accioacuten del promotor J23110 Brevemente se

describe el principio del disentildeo donde inicialmente el AgrC anclado a membrana

de E coli detecta la presencia de moleacuteculas de AIP externas (Marchand amp Collins

2013) De esta manera AgrC sufre de un cambio conformacional y fosforila al

factor de transcripcioacuten AgrA Despueacutes el AgrA fosforilado (AgrA) actuacutea como

factor de transcripcioacuten del promotor P2 (Reynolds amp Wigneshweraraj 2011) Una

vez que AgrA-P se ha acoplado al promotor P2 el moacutedulo de bacteriocina es

expresado incluyendo los genes tipo estructural (lnqQ) excrecioacuten y

autoinmunidad (lnqBCEDF) del operoacuten lnq asiacute como del gen reportero gfp


Algunos autores han demostrado que mantener intacto el operoacuten nativo de una

bacteriocina cualesquiera (es decir que contenga los elementos geneacuteticos de su

estructura para su secrecioacuten y para autoinmunidad) en E coli eacutesta ceacutelula

modificada es capaz de excretar bacteriocinas Gram positivos al medio

extracelular (Mesa-Pereira et al 2017)


Los moacutedulos geneacuteticos fueron disentildeados para operar en el mismo sentido que el

ensamble por tipo BioBrick al yuxtaponer las propiedades del BioBrick (RFC 10) y

el BglBrick (RFC 21) La intencioacuten del disentildeo es que nuestros moacutedulos geneacuteticos

sean faacutecilmente ensamblados o removidos por teacutecnicas como In-Fusion (Sleight

Bartley Lieviant amp Sauro 2010) o ensamblado por clonacioacuten in vivo (Garciacutea-

Nafriacutea Watson amp Greger 2016) dado que los sitios de restriccioacuten actuacutean como

sitios homoacutelogos para la clonacioacuten

Cada moacutedulo estaacute flanqueado por sitios de restriccioacuten para que puedan ser

intercambiados de ser necesario El moacutedulo de promotores estaacute flanqueado por

los sitios de restriccioacuten BglII y XbaI manteniendo a EcoRI como unidad neutral

para cuando sean necesario el intercambio de piezas Los elementos del moacutedulo

biosensor estaacuten flanqueados por los sitios BglII y BamHI y los elementos del

moacutedulo de bacteriocinas estaacuten rodeados por los sitios de restriccioacuten XbaI y SpeI

(Figura 4)


Figura 4 Estrategia de construccioacuten in silico

El moacutedulo biosensor (seccioacuten A) estaacute constituido por el BglBrick RFC21 mientras que el moacutedulo bacteriocina

(seccioacuten C) estaacute representado por el BioBrick RFC10 La seccioacuten de promotores (seccioacuten B) fue colocado en

caso de que los promotores fueran cambiados Cada bloque contiene una regioacuten prefija y otra sufija y cada

bloque estaacute flanqueado en ambas direcciones por terminadores dobles de transcripcioacuten (BBa_B0015 ciacuterculos

rojos) La seccioacuten B estaacute bordeada por los sitios de restriccioacuten BglII y XbaI (G-X) con la regioacuten EcoRI como

neutral La seccioacuten A EcoRI y BglII (E-G) estaacuten anclados como prefijos mientras que BamHI y XhoI (B-X)

estaacuten puestos como sufijos Los sitios de restriccioacuten BglII y BamHI fueron usados para construir el promotor

constitutivo J23110 en conjunto a su parte estructural (RBS-gen) para el moacutedulo de biosensor Por otro lado

para la seccioacuten C el prefijo estaacute compuesto por los sitios EcoRI-XbaI (E-X) y los sitios SpeI-PstI (S-P) son

colocados como prefijos Los sitios de restriccioacuten XbaI y SpeI fueron usados para construir el promotor

inducible P2 y en conjunto a su parte estructural (RBS-gene) para el moacutedulo de bacteriocina

El plaacutesmido pSB1A3 (AddGene no 116850) (Dupin amp Simmel 2019) sirvioacute como

plantilla para la construccioacuten de los moacutedulos geneacuteticos Las secciones prefijo y

sufijo fueron manualmente remplazados por cualquiera de los moacutedulos disentildeados

El replicoacuten y los genes de resistencia a antibioacutetico del plaacutesmido fueron retenidos

pero el terminador de transcripcioacuten fue remplazado por terminadores dobles

Finalmente un par de plaacutesmidos fueron construidos y cada uno contiene

individualmente del moacutedulo de biosensor o de bacteriocina respectivamente

Finalmente ambos plaacutesmidos fueron manualmente mezclados para crear un


plaacutesmido que contiene un par de moacutedulos que estaacuten en direcciones divergentes

Este vector de expresioacuten fue nombrado Dual Biosensor-Killer (Figura 5)

Figura 5 Representacioacuten esquemaacutetica del vector Dual Biosensor-Killer

El moacutedulo biosensor contiene los genes agrC y agrA y estaacute rodeado por los sitios de restriccioacuten EcoRI BglII y

XhoI mientras que el moacutedulo de bacteriocina contiene los genes del cluacutester lnqQBCDEF y el gen reportero gfp

y estaacute flanqueado por los sitios de restriccioacuten EcoRI XbaI SpeI y PstI Este plaacutesmido contiene un marcador

de resistencia a ampicilina y se compone de un total de 8904 pb

Parte de la estrategia de nuestro disentildeo consistioacute en que los promotores J23110 y

P2 fueran colocadas en sentidos opuestos para regular de manera independiente

la actividad de los moacutedulos biosensor y de bacteriocina respectivamente La razoacuten

de aislar ambos moacutedulos es para evitar la expresioacuten por goteo que pudiera existir

por efecto de la fuerza de alguno de los promotores al mantenerse en la misma

direccioacuten transcripcional (Lubkowicz et al 2018) Todos los archivos generados

para la elaboracioacuten del vector de expresioacuten Dual Biosensor-Killer fueron


elaborados por SnapGene y estaacuten disponibles en los archivos anexos de esta

misma tesis

65 Optimizacioacuten de los codones nativos

De acuerdo con las observaciones (Tabla 1) todas las secuencias fueron

optimizadas para ser expresadas en E coli cepa tipo B Noacutetese que los sitios de

restriccioacuten tiacutepicos y los codones de paro de todas las secuencias utilizadas fueron

removidos El iacutendice CAI antes de la optimizacioacuten en AgrC AgrA LnqQ LnqB

LnqC LnqE LnqD y LnqQ era de 0407 0402 0532 0525 0518 0511 0503

and 0521 respectivamente Despueacutes de la optimizacioacuten los valores cambiaron a

0770 0766 0675 0735 0771 0773 0777 y 0747 respectivamente El valor

CAI para la GFP no pudo ser determinado por la aplicacioacuten antes de la

optimizacioacuten pero siacute despueacutes de la optimizacioacuten el cual correspondioacute a 0759 En

relacioacuten con el contenido de GC los valores antes de la optimizacioacuten fueron

282 272 333 225 231 305 y 245 respectivamente Despueacutes de

la optimizacioacuten los datos fueron 433 446 469 400 421 410

431 424 y 424 respectivamente El contenido GC para GFP despueacutes de

la optimizacioacuten fue de 491

Nuestros resultados el promedio del valor CAI y el promedio de contenido GC de

todas las secuencias aminoaciacutedicas antes de ser optimizadas era de 049 plusmn 005 y

2690 plusmn 371 respectivamente Despueacutes de la optimizacioacuten los valores

promedio fueron 075 plusmn 003 y 4361 plusmn 287 respectivamente Seguacuten las

especificaciones de la aplicacioacuten si el valor CAI es maacutes cercano a 1 eacuteste indica

que la secuencia de nucleoacutetidos utiliza los codones maacutes utilizados por el

organismo productor heteroacutelogo (Puigbograve et al 2008) Seguacuten los resultados los

valores CAI y el contenido GC de todas las proteiacutenas utilizadas como datos de

entrada fue substancialmente mejorados y estaacute optimizada para ser utilizado en E

coli heteroacuteloga La finalidad de optimizar el contenido nucleotiacutedico de las

secuencias utilizadas para disentildeo a las caracteriacutesticas requeridas del hospedero

es para incrementar el rendimiento de produccioacuten (Puigbograve et al 2008)


Tabla 1 Uso de codones previo y despueacutes de la optimizacioacuten

Paraacutemetros Previo a la optimizacioacuten Despueacutes de la optimizacioacuten

Gen Tamantildeo (pb) CAI GC CAI GC

agrC 1116 0407 282 0770 433

agrA 717 0402 272 0766 446

lnqQ 162 0532 333 0675 469

lnqB 240 0525 225 0735 400

lnqC 480 0518 231 0771 421

lnqE 1299 0511 259 0773 410

lnqD 678 0503 305 0777 431

lnqF 795 0521 245 0747 424

gfp NA NA NA 0759 491

El iacutendice de adaptacioacuten (CAI) y el contenido de guanidina y citosina (GC) La tabla se divide en dos

secciones previo a la optimizacioacuten y despueacutes de la optimizacioacuten La columna de gen representa el nombre del

dato de entrada y el tamantildeo que indica el total de nucleoacutetidos para cada entrada Los resultados en la tabla

representan la adaptabilidad de las secuencias de entrada usando a E coli como hospedero No fue posible

determinar el uso de codones antes de la optimizacioacuten para el gen gfp debido a que no hay suficiente

informacioacuten al computador el iacutendice CAI con esta tabla de referencia NA = No Aplica

66 Especificidad de biosensor por prediccioacuten de comunicacioacuten cruzada

Es conocido que S aureus posee cuatro grandes variantes de clases de

moleacuteculas de AIP (desde I hasta IV) la cual difiere entre uno a dos residuos en la

seccioacuten madura del AIP (Ji et al 2005 B Wang amp Muir 2016) La diferencia

estructural entre las clases de AIP pueden actuar como inhibidores competitivos

del QS cuando interactuacutean con cepas filogeneacuteticamente relacionadas Este

fenoacutemeno bioloacutegico es conocido como comunicacioacuten cruzada (Everett amp

Rumbaugh 2014)

Para predecir la probabilidad de comunicacioacuten cruzada de nuestro biosensor

descargamos las secuencias aminoaciacutedicas de las cuatro variantes maacutes


representativas de AgrD junto la informacioacuten anotada del AgrD de la cepa MRSA

estaacutendar Finalmente realizamos un alineamiento local bajo la herramienta

EMBOSS Water entre cada una de las secuencias aminoaciacutedicas representativas

contra la secuencia aminoaciacutedica de nuestra cepa Los resultados revelan (Tabla

2) que el AgrD de nuestro MRSA tuvo un porcentaje de identidad y de similitud con

el AgrD clase I de 478 y 652 respectivamente Para la clase II los

porcentajes fueron 100 y 100 respectivamente mientras que con la clase III

fueron de 326 y 500 respectivamente Finalmente con la clase IV los

porcentajes fueron de 457 y 609 respectivamente Seguacuten los resultados del

alineamiento podemos inferir que nuestro biosensor es uacutetil para detectar

moleacuteculas de QS producidos por S aureus N315 y por otros S aureus que sean

productores de AIP tipo II Al mismo tiempo nuestro sistema estariacutea limitado a no

detectar S aureus productores de AIP clases I III y IV

Bajo la prediccioacuten anterior nuestro biosensor completo de ceacutelulas estariacutea

capacitado para detectar ceacutelulas de S aureus N315 inclusive cepas de S aureus

USA100 las cuales son productoras naturales de moleacuteculas de AIP clase II

(Grundstad et al 2019) y estaacuten sentildealadas como entre las principales cepas tipo

MRSA que circulan a nivel mundial esta cepa es altamente letal y es una causa

de endocarditis infecciosa en la vaacutelvula nativa del corazoacuten A nivel in vitro se

reporta que es una productora de biopeliacuteculas fuertes (King Kulhankova Stach

Vu amp Salgado-Paboacuten 2016) A pesar de ser una cepa principalmente asociada a

infecciones adquiridas en hospitales (Limbago et al 2009 Tenover et al 2008)

tambieacuten se ha encontrado entre individuos que no han recibido cuidados meacutedicos

previos Noacutetese que esta cepa es resistente a vancomicina (Roberts 2013)


Tabla 2 Prediccioacuten de comunicacioacuten cruzada

Clase AIP Alineamiento de proteiacutenas Tamantildeo ID Similitud Gaps Score Ref

I MNTLFNLFFDFITGILKNIGNIAAYSTCDFIMDEVEVPKELTQLHE- 46 478 652 00 1700 1 2

II MNTLVNMFFDFIIKLAKAIGIVGGVNACSSLFDEPKVPAELTNLYDK 47 1000 100 00 24000 1 2

III MKKLLNKVIELLVDFFNSIGYRAAYINCDFLLDEAEVPKELTQLHE- 46 326 500 00 7200 1 2

IV MNTLYKSFFDFITGVLKNIGNVASYSTCYFIMDEVEIPKELTQLHE- 46 457 609 00 10500 2

MRSA MNTLVNMFFDFIIKLAKAIGIVGGVNACSSLFDEPKVPAELTNLYDK - - - - -

El alineamiento de proteiacutenas se realizoacute entre las cuatro clases mayoritarias de AIP contra el MRSA El alineamiento fue realizado en el programa Clustal Omega

mientras que la identificacioacuten (ID) similitud gaps y score fue determinado de la aplicacioacuten EMBOSS Water

1 (B Wang amp Muir 2016)

2 (Ji et al 2005)



El anaacutelisis de solubilidad y localizacioacuten subcelular entre todas las secuencias

aminoaciacutedicas utilizadas para construir biosensor de ceacutelulas enteras es necesario

para obtener un alto rendimiento productivo (Ghosh et al 2004) Seguacuten los

resultados obtenidos por la aplicacioacuten Protein-Sol (Tabla 3) para prediccioacuten de

solubilidad eacutestos indican que LnqQ LnqF AgrA y GFP son considerados solubles

mientras que los datos obtenidos para LnqB LnqC y LnqE no pudieron ser

considerados ya que la aplicacioacuten los clasificoacute como proteiacutenas de membrana

Tabla 3 Prediccioacuten de solubilidad de proteiacutenas

Gen Iacutendice Solubilidad

AgrC 0366 Invaacutelido

AgrA 0514 Soluble

LnqQ 0655 Soluble

LnqB 0655 Invaacutelido

LnqC 0644 Invaacutelido

LnqD 0388 Invaacutelido

LnqE 0609 Invaacutelido

LnqF 0607 Soluble

GFP 0592 Soluble

De acuerdo con la aplicacioacuten Protein-Sol reporta que cualquier valor de solubilidad con superior a 045 es

considerado soluble Los datos que fueron considerados como invaacutelidos con un iacutendice superior de 045 es

porque se consideraron proteiacutenas de membrana y son invaacutelidos para esta herramienta

68 Localizacioacuten subcelular de proteiacutenas

De acuerdo con las predicciones de la aplicacioacuten BUSCA (Tabla 4) la localizacioacuten

subcelular de las proteiacutenas AgrA LnqQ LnqE y GFP es en el citoplasma mientras

que AgrC LnqB LnqC LnqD LnqE y LnqF son producidos en la membrana

plasmaacutetica Los caacutelculos predictivos en las proteiacutenas a sobreproducirse en E coli

concuerda con lo observado en la literatura para los elementos geneacuteticos del

moacutedulo biosensor el AgrC actuariacutea como una proteiacutena transmembranal con


actividad histidina quinasa mientras que AgrA actuariacutea como factor de

transcripcioacuten que se mueve a traveacutes del citoplasma para anclarse al promotor P2

(Gomes-Fernandes et al 2017) En los elementos del moacutedulo de bacteriocina se

espera que la LnqQ actuacutee como una proteiacutena soluble de bajo peso molecular que

es producido y excretado al medio extracelular (Fujita et al 2007) Para los demaacutes

elementos estructurales de este moacutedulo se sabe que LnqB es una proteiacutena

membranal tipo permeasa mientras que LnqC y LnqD son proteiacutenas con dominios

franqueados en membrana asiacute como LnqE y LnqF son proteiacutenas transportadoras

tipo ABC-2 y ABC respectivamente (Iwatani et al 2012) Por uacuteltimo los valores

de predictivos indican que la GFP seraacute producida como una proteiacutena soluble y

monomeacuterica (Zacharias et al 2002)

Tabla 4 Prediccioacuten de localizacioacuten subcelular de proteiacutenas

Gen Valor Localizacioacuten subcelular

AgrC 075 Membrana plasmaacutetica

AgrA 07 Citoplasma

LnqQ 07 Citoplasma

LnqB 09 Membrana plasmaacutetica

LnqC 083 Membrana plasmaacutetica

LnqD 072 Membrana plasmaacutetica

LnqE 086 Membrana plasmaacutetica

LnqF 07 Citoplasma

GFP 07 Citoplasma

De acuerdo con la aplicacioacuten BUSCA las localizaciones subcelulares disponibles son membrana plasmaacutetica y

citoplasma


La determinacioacuten de la alergenicidad es un aspecto deseado durante la

construccioacuten del biosensor de ceacutelulas enteras debido a que nuestro sistema seriacutea

presentado en el futuro como un potencial candidato a agente terapeacuteutico Para

demostrar este punto fue necesario demostrar que la estructura tanto primaria


como secundaria de la LnqQ presentaba epiacutetopos para ceacutelulas tipo B dado que la

alergenicidad estaacute mediada tanto por ceacutelulas De acuerdo con los resultados de la

secuencia aminoaciacutedica de la LnqQ en su estructura en forma lineal (Tabla 5) se

indica que los potenciales residuos epiacutetopos corresponden a E13 S16-V19 y W21-

D31 Mientras tanto los anaacutelisis realizados por la aplicacioacuten Discotope 20 a la

secuencia aminoaciacutedica en su forma tridimensional indican que no se encontraron

residuos potencialmente epiacutetopos para ceacutelulas B ni se determinaron sitios de

alergenicidad

Tabla 5 Prediccioacuten de epiacutetopos de ceacutelulas B en LnqQ

Epiacutetopos EEEEEEEEEEEEEEEE

Secuencia lineal MAGFLKVVQLLAKYGSKAVQWAWANKGKILDWLNAGQAIDWVVSKIKQILGIK

Estructura CCHHHHHHHHHHHHCCHHHHHHHCCCCCHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHCCC

Superficie EEEBEEBBEBBBEBEEEBBEBBBEEEEEBBEBBEBBBBBEBBBEEBEEEEEEE

La prediccioacuten fue resuelta en la aplicacioacuten BediPrep En la seccioacuten de epiacutetopos si la posicioacuten estaacute arriba de

05 entonces es marcado con una letra ldquoErdquo La aplicacioacuten anexa NetsurfP fue usada para la prediccioacuten

estructural a partir de secuencia lineal y se divide en tres categoriacuteas ldquoHrdquo para heacutelice ldquoErdquo para hoja y ldquoCrdquo para

cadena En la seccioacuten de superficie se divide en dos secciones ldquoBrdquo para indicar que el aminoaacutecido estaacute

orientado hacia el interior de la proteiacutena (burial) mientras que ldquoErdquo para indicar que el aminoaacutecido estaacute

orientado hacia el exterior de la proteiacutena (exposed)














De acuerdo con el reporte realizado por la aplicacioacuten AllerCatPro la bacteriocina

LnqQ no posee elementos alergeacutenicos



El peacuteptido sentildeal N-AmyE fue seleccionado porque se ha demostrado que los

primeros 33 residuos de la α-amilasa (AmyE) de B subtilis pueden ser acoplados

a la regioacuten N-terminal a una proteiacutena de intereacutes para su produccioacuten periplaacutesmica

en ceacutelulas de E coli (R M Papi et al 2005)

En primer lugar descargamos la secuencia nucleotiacutedica de la AmyE desde la base

de datos de GenBank Despueacutes utilizamos los dos oligonucleoacutetidos reportados

por Papi y sus colaboradores (R M Papi et al 2005) que estaacuten modificados con

extremos overhangs Cada oligonucleoacutetido estaacute compuesto por un sitio de

restriccioacuten en su extremo 3rsquo-terminal que corresponden a NdeI y BamHI

respectivamente

En la aplicacioacuten SnapGene el archivo geneacutetico del AmyE fue abierto y sobre eacutesta

se incorporaron los dos oligonucleoacutetidos mencionados arriba despueacutes se corrioacute un

ensayo de PCR in silico para extraer el peacuteptido sentildeal N-AmyE de la amilasa El

producto in silico resultante corresponde a un tamantildeo 117 pb que estaacute ordenado

de la siguiente manera 5rsquo-NdeI-(N-AmyE)-BamHI-3rsquo

En la misma aplicacioacuten realizamos un ensayo in silico de restriccioacuten y ligacioacuten con

el producto de PCR in silico y el vector de expresioacuten ldquopET-30a(+)dnardquo Desde la

aplicacioacuten se abrioacute el archivo que contiene el vector de expresioacuten pET-30a(+) y se

cortoacute in silico por medio de las enzimas de restriccioacuten NdeI y BamHI

Posteriormente el producto de PCR compuesto con los extremos overhangs fue

cortado tambieacuten con el mismo conjunto de enzimas de restriccioacuten y procedimos a

clonar creando un vector de expresioacuten El vector fue nombrado y guardado como

ldquopET-30a(+)-N-AmyEdnardquo


6112 Disentildeo y construccioacuten de pETNL

En el extremo del peacuteptido sentildeal N-AmyE se le acoploacute la secuencia nucleotiacutedica de

la LnqQ por teacutecnicas de clonacioacuten molecular in silico Inicialmente el archivo

geneacutetico del gen lnqQ fue descargado (GenBank no AB2352011) y abierto en la

aplicacioacuten de SnapGene

A la secuencia nucleotiacutedica original de la lnqQ en el extremo 5rsquo-terminal

agregamos manualmente una secuencia que contiene el sitio de restriccioacuten BamHI

y riacuteo debajo de eacutesta agregamos un par de nucleoacutetidos (TT) Inmediatamente

despueacutes se colocoacute un codoacuten de inicio (ATG) y se antildeadieron los 52 residuos

restantes para un total de 53 de aminoaacutecidos que representan a LnqQ Justo en el

extremo C-terminal de esta bacteriocina se agregoacute una cola de polihistidina (H89-

H94) y un codoacuten de paro (TAG) En seguida se agregaron otro par de nucleoacutetidos

(TA) y se integroacute un sitio de restriccioacuten SalI Esta seccioacuten correspondioacute a un

fragmento lineal de 193 pb de la secuencia nucleotiacutedica que codifica para

LnqQ6xHis (Tabla 6)

Desde SnapGene realizamos un ensayo in silico de restriccioacuten y ligacioacuten entre el

fragmento lineal de 193 pb con el vector de expresioacuten ldquopET-30a(+)N-AmyEdnardquo

Desde la aplicacioacuten se abrioacute el archivo que contiene el vector de expresioacuten y se

cortoacute in silico por medio de las enzimas de restriccioacuten BamHI y SalI

Posteriormente el fragmento lineal fue cortado tambieacuten con el mismo conjunto de

enzimas de restriccioacuten y procedimos a clonar creando un vector de expresioacuten

nombrado y guardado como ldquopETNLdnardquo

El archivo geneacutetico del plaacutesmido pETNL estaacute guardando en formato dna bajo el

nombre ldquopETNLdnardquo En este plaacutesmido se observan por los elementos geneacuteticos

propios de un vector pET30(a)+ en conjunto con los genes necesarios para la

construccioacuten N-AmyELnqQ


Tabla 6 Secuencia aminoaciacutedica de N-AmyELnqQ

Plaacutesmido Secuencia aminoaciacutedica de N-AmyELnqQ (5rsquorarr3rsquo) Tamantildeo

pETNL MFAKRFKTSLLPLFAGFLLLFHLVLAGPAAASRILMAGFLKVVQL

LAKYGSKAVQWAWANKGKILDWLNAGQAIDWVVSKIKQILGIKHH

HHHH

94

Los residuos subrayados representan el peacuteptido sentildeal Los residuos en negritas representan a LnqQ


AymELnqQ6xHis

Los resultados obtenidos del corte proteoliacutetico en el peacuteptido sentildeal N-AmyE fueron

contrastados con los datos de seis secuencias aminoaciacutedicas (Tabla 7) que teniacutean

el reporte de que este mismo peacuteptido sentildeal N-AmyE era cortado de manera

efectiva en cada una de ellas Tres de las secuencias corresponden a las

secuencias aminoaciacutedicas totales de tres α-amilasas reportadas en diferentes

cepas de B subtilis (Emori amp Maruo 1988 Kunst et al 1997 Yang et al 1983)

Dos de eacutestas corresponden a secuencias que se utilizaron para investigar queacute

aminoaacutecidos eran los necesarios para cortar el peacuteptido sentildeal N-AmyE en ceacutelulas

de B subtilis o de E coli (Nakazawa et al 1986 Sakakibara et al 1993) La

uacuteltima corresponde a una construccioacuten sinteacutetica donde el peacuteptido sentildeal N-AmyE

fue utilizado para transportar liasa de pectina a la regioacuten periplaacutesmica de E coli (R

M Papi et al 2005)


Tabla 7 Secuencias utilizadas para prediccioacuten de corte enzimaacutetico de N-

AmyELnqQ

Nombre Secuencia aminoaciacutedica

gtYang1983

(CAA234371)

MFAKRFKTSLLPLFAGFLLLFHLVLAGPAAASAETANKSNELTAPSIKSGTILHAWNWSFNTLKHNMKDIHDAGYTA

IQTSPINQVKEGNQGDKSMSNWYWLYQPTSYQIGNRYLGTEQEFKEMCAAAEEYGIKVIVDAVINHTTSDYAAISNE

VKSIPNWTHGNTQIKNWSDRWDVTQNSLLGLYDWNTQNTQVQSYLKRFLDRALNDGADGFRFDAAKHIELPDDGSYG

SQFWPNITNTSAEFQYGEILQDSASRDAAYANYMDVTASNYGHSIRSALKNRNLGVSNISHYASDVSADKLVTWVES

HDTYANDDEESTWMSDDDIRLGWAVIASRSGSTPLFFSRPEGGGNGVRFPGKSQIGDRGSALFEDQAITAVNRFHNV

MAGQPEELSNPNGNNQIFMNQRGSHGVVLANAGSSSVSINTATKLPDGRYDNKAGAGSFQVNDGKLTGTINARSVAV

LYPDDIAKAPHVFLENYKTGVTHSFNDQLTITLRADANTTKAVYQINNGPDDRRLRMEINSQSEKEIQFGKTYTIML

KGTNSDGVTRTEKYSFVKRDPASAKTIGYQNPNHWSQVNAYIYKHDGSRVIELTGSWPGKPMTKNADGIYTLTLPAD

TDTTNAKVIFNNGSAQVPGQNQPGFDYVLNGLYNDSGLSGSLPH

gtNakazawa1986

(PTUE33)

MFAKRFKTSLLPLFAGFLLLFYLVLAGPAAASAQACPPETLVKVKDAEDQL

gtEmori1988

(CAA306431)

MFAKRFKTSLLPLFAGFLLLFYLVLAGPAAASAETANKSNELTAPSIKSGTILHAWNWSFNTLKHNMKDIHDAGYTA


VKSIPNWTHGNTQIKNWSDRWDVTQNSLLGLYDWNTQNTQVQSYLKRFLERALNDGADGFRFDAAKHIELPDDGSYG



MAGQHEELSNPNGNNQIFMNQRGSHGVVLANAGSSSVSINTATKLPDGRYDNKAGAGSFQVNDGKLTGTINARSVAV

LYPDDIEIRCNTFFQ

gtSakakibara1993

(PTUBE695)

MFAKRFKTSLLPLFAGFLLLFYLVLAGPAAASACAAPFNGTM

gtKunst1997

(NP_3881862)







LYPDDIAKAPHVFLENYKTGVTHSFNDQLTITLRADANTTKAVYQINNGPETAFKDGDQFTIGKGDPFGKTYTIMLK

GTNSDGVTRTEKYSFVKRDPASAKTIGYQNPNHWSQVNAYIYKHDGSRVIELTGSWPGKPMTKNADGIYTLTLPADT

DTTNAKVIFNNGSAQVPGQNQPGFDYVLNGLYNDSGLSGSLPH

gtPapi2005 MFAKRFKTSLLPLFAGFLLLFHLVLAGPAAASRIRMSYPESKLTGLTGFALAAKVTGGWAGPVVSITNLDQLKANIG

TVTPQVLVINSNISASSLTKVNMGANKTLIGSFQNRTLENIHLRATAQSQNIILQNLIFKHSANIKANDDIQVYLNY

GSKYWIDHCSFVGHSWSTTDGSEDKLLYIGEKADYATISNCFFGSHKYGLIFGHPADDNNAAFNGYPRLTLCHNRFD

NMEVRAPGLMRYGYFHVYNNYINKFHLGFTLAQNANILSESNYFGEGSQNNGMLDDKGSGTFTDTNSVPPITNQKSP

KAQWTATSNYAYTLKTAAQAKDFTQKNAGAQAAALVFGS

gtpETNL MFAKRFKTSLLPLFAGFLLLFHLVLAGPAAASRILMAGFLKVVQLLAKYGSKAVQWAWANKGKILDWLNAGQAIDWV

VSKIKQILGIKHHHHHH


En las bacterias existen dos mecanismos generales para la secrecioacuten de

proteiacutenas a traveacutes de la membrana citoplasmaacutetica En la viacutea de Secrecioacuten General

denominada como viacutea Sec las proteiacutenas son translocadas a la membrana en su

forma desnaturalizada y posteriormente son plegados en forma nativa en el lado

transversal de la membrana Mientras tanto en la viacutea de Translocacioacuten de

Gemelos Argininas conocida como viacutea Tat las proteiacutenas son translocadas en su

estado plegado nativo (Natale Bruumlser amp Driessen 2008)

De acuerdo con nuestros resultados (Tabla 8) el valor de calculado de prediccioacuten

de corte de peacuteptido sentildeal de las secuencias aminoaciacutedicas completas de tres α-

amilasas representan 09724 (Yang et al 1983) 09458 (Emori amp Maruo 1988) y

09724 (Kunst et al 1997) respectivamente De las secuencias parciales de

peacuteptidos sentildeales N-AmyE los resultados indican 08722 (Nakazawa et al 1986) y

06092 (Sakakibara et al 1993) Para la secuencia que se utilizoacute para exportar la

liasa de pectina al periplasma de E coli el valor calculado correspondioacute a 08262

(R M Papi et al 2005) en todas estas secuencias el mecanismo de secrecioacuten

general de proteiacutenas es el tipo Sec clase I Para nuestra proteiacutena N-AmyELnqQ

el valor calculado estimado fue de 04063 sin que fuera determinado su

mecanismo de corte predictivo Es decir nuestro valor calculado es mucho menor

a lo observado contra secuencias que habiacutean sido probados experimentalmente

Tabla 8 Prediccioacuten de corte enzimaacutetico de peacuteptido sentildeal N-AmyE

Identificacioacuten Prediccioacuten SecSPI TatSPI SecSPII Otro Pos

gtYang1983 SP(SecSPI) 09724 00104 00079 00092 33 y 34

gtNakazawa1986 SP(SecSPI) 08722 00359 00229 0069 33 y 34

gtEmori1988 SP(SecSPI) 09458 00122 0009 0033 33 y 34

gtSakakibara1993 SP(SecSPI) 06092 00428 01377 02103 31 y 32

gtKunst1997 SP(SecSPI) 09724 00104 00079 00092 33 y 34

gtPapi2005 SP(SecSPI) 08262 00183 00178 01377 31 y 32

gtpETNL Otro 04063 00249 00134 05554 Otro

SecSPI Translocoacuten Sec mediado por Peptidasa de Sentildeal I (Lep) TatSPI Translocoacuten Tat mediado por

Peptidasa de Sentildeal I (Lep) SecSPII Translocoacuten Sec mediado por Peptidasa de Sentildeal II (Lsp) Pos Sitio de

corte enzimaacutetico dentro de la estructura aminoaciacutedica lineal




El archivo geneacutetico del peacuteptido de fusioacuten SmbP estaacute guardado en formato dna

bajo el nombre ldquopET30a-SmbPdnardquo y estaacute flanqueado en el extremo 5rsquo-terminal

por el sitio de restriccioacuten NdeI y en el extremo 3rsquo-terminal por el sitio de restriccioacuten

NcoI El peacuteptido de fusioacuten estaacute dividido en dos secciones en el extremo N-terminal

estaacute compuesta por la regioacuten citoplasmaacutetica de la SmbP (SmbP) compuesta por

94 residuos seguido de dos residuos G95 y T96 riacuteo abajo inicia el extremo C-

terminal que estaacute compuesta por cinco residuos y representa al sitio de corte por

enteroquinasa (DDDDK)

6122 Disentildeo y construccioacuten de pSmbP-LnqQ

El archivo geneacutetico que contiene la bacteriocina LnqQ fue descargado de la base

de datos (GenBank no AB2352011) Inmediatamente en el extremo C-terminal

del peacuteptido de fusioacuten mediante la aplicacioacuten SnapGene antildeadimos manualmente

un residuo de alanina en la posicioacuten 102 y riacuteo debajo de eacutesta antildeadimos los 53

residuos que conforman el LnqQ iniciando con M103 En direccioacuten al extremo C-

terminal inmediatamente despueacutes del codoacuten de teacutermino (TAA) se agregoacute el sitio

de restriccioacuten XhoI Los elementos que componen la construccioacuten del pSmbP-

LnqQ (Tabla 9) estaacuten representados en el siguiente orden 5rsquo-NdeI-SmbP-DDDDK-

LnqQ-XhoI-3rsquo

El archivo geneacutetico del plaacutesmido pSmbP-LnqQ estaacute guardado en formato dna bajo

el nombre ldquopSmbP-LnqQ GFJBC01dnardquo En este plaacutesmido se observan por los

elementos geneacuteticos propios de un vector pET30(a)+


Tabla 9 Secuencia aminoaciacutedica de SmbP-LnqQ

Plaacutesmido Secuencia aminoaciacutedica del producto del vector de

expresioacuten (5rsquorarr3rsquo)

Tamantildeo

pSmbP-LnqQ MSGHTAHVDEAVKHAEEAVAHGKEGHTDQLLEHAKESLTHAKAAS

EAGGNTHVGHGIKHLEDAIKHGEEGHVGVATKHAQEAIEHLRASE

HKSHGTDDDDKAMAGFLKVVQLLAKYGSKAVQWAWANKGKILDWL

NAGQAIDWVVSKIKQILGIK

155

Los residuos subrayados representan el peacuteptido de fusioacuten Los residuos resaltados representan el sitio de

corte de enteroquinasa Los residuos en negritas representan a LnqQ


LnqQ

De acuerdo con los resultados de la aplicacioacuten de PeptideCutter se detectoacute un

uacutenico sitio de corte en la proteiacutena SmbP-LnqQ para la enzima enteroquinasa que

se encuentra ubicado en el residuo K101 lo cual coincide con lo esperado


Los resultados sobre la identificacioacuten de codones de paro post disentildeo en la

construccioacuten de pETNL y pSmbP-LnqQ indicaron que no existe evidencia de

codones de paro ya que la aplicacioacuten en liacutenea logroacute identificar un marco de lectura

abierto con un tamantildeo de 285 pb que codifican para 94 aminoaacutecidos cuya

secuencia coincide con exactitud con la secuencia aminoaciacutedica de N-AmyELnqQ

para el caso de pETNL Mientras tanto un marco de lectura compuesto por un

tamantildeo molecular de 488 pb que se traducen para 155 aminoaacutecidos y cuya

secuencia coincide en su totalidad con la secuencia aminoaciacutedica de SmbP-LnqQ


De acuerdo con los resultados calculados por la aplicacioacuten de Compute pIMw tool

de ExPasy el peso molecular teoacuterico estimado del producto N-AmyELnqQ de

pETNL es de 1053468 Da con un punto isoeleacutectrico pi = 1063 mientras que para


el producto SmbP-LnqQ de pSmbP-LnqQ el peso estimado es de 1669771 Da

con punto isoeleacutectrico pI = 645


LnqQ

Seguacuten los resultados los iacutendices de solubilizacioacuten (Tabla 10) de N-AmyELnqQ y

del SmbP-LnqQ es de 0575 y 0865 respectivamente La aplicacioacuten sin embargo

clasifica a los productos del vector pETNL como invaacutelidos mientras que los

productos de pSmbP-LnqQ fueron considerados como solubles La razoacuten porque

la N-AmyELnqQ es considerado como invaacutelido se debe a que fue identificado

como proteiacutena de membrana En el caso de localizacioacuten celular (Tabla 11) los

pronoacutesticos indican que los productos producidos por pETNL y pSmbP-LnqQ se

encontraraacuten en membrana plasmaacutetica y en el citoplasma respectivamente

Tabla 10 Prediccioacuten de solubilidad N-AmyELnqQ y SmbP-LnqQ

Producto Iacutendice Solubilidad

N-AmyELnqQ 0575 Invaacutelido

SmbP-LnqQ 0865 Soluble


considerado soluble Los datos que fueron considerados como invaacutelidos con un iacutendice de solubilidad superior

a 045 es porque son considerados proteiacutenas de membrana y son invaacutelidos para esta herramienta

Tabla 11 Prediccioacuten de localizacioacuten celular N-AmyELnqQ y SmbP-LnqQ

Producto Valor Localizacioacuten subcelular

N-AmyELnqQ 085 Membrana plasmaacutetica

SmbP-LnqQ 07 Citoplasma

Esto coincide con lo observado en los antecedentes ya que indican que las

proteiacutenas expresadas en E coli con el peacuteptido sentildeal N-AmyE en su regioacuten N-

terminal a menudo se localizan en el periplasma (Nakazawa et al 1986 R M

Papi et al 2005) Mientras que las proteiacutenas acopladas con el peacuteptido de fusioacuten


SmbP son reportadas para encontrarse en la regioacuten citoplasmaacutetica debido a que la

seccioacuten aminoaciacutedica que las orienta al periplasma fue removida de la secuencia

original de residuos quedaacutendose por tanto en el citoplasma celular de E coli

(Vargas-Cortez et al 2016)


y SmbP-LnqQ

El modelo estructural tanto en su forma secundaria (Figura 6) como tridimensional

(Figura 8) para N-AmyELnqQ asiacute como la presunta estructura secundaria (Figura

7) y tridimensional (Figura 10) para SmbP-LnqQ fueron revelados en este

documento En la estructura secundaria prevista para N-AmyELnqQ se espera

que el 96 de la secuencia esteacute compuesta por estructuras tipo α-heacutelices y se

estima que el 17 de la secuencia aminoaciacutedica total esteacuten embebidas en la

regioacuten transmembranal La evidencia predictiva de la N-AmyELnqQ (Figura 9) a

traveacutes de la aplicacioacuten Phyre2 indicoacute que los primeros 12 residuos del extremo N-

terminal estariacutean orientados en la regioacuten extracelular mientras que los residuos 15

al 30 estariacutean ubicados en regioacuten intermembranal entre el espacio extracelular y la

citoplasmaacutetica El resto de los residuos del extremo C-terminal estariacutean orientados

en la cara citoplasmaacutetica de la ceacutelula de E coli Mientras tanto la estructura

secundaria putativa para SmbP-LnqQ indica que el 85 de secuencia total estaacute

compuesta por α-heacutelices

En las estructuras tridimensionales putativas tanto para N-AmyELnqQ como en la

SmbP-LnqQ prevalece la formacioacuten de cuatro α-heacutelices Estos motivos

estructurales tipo α-heacutelices son comuacutenmente observados en bacteriocinas

similares a LnqQ (Lynch et al 2019) de manera que podemos predecir que la

estructura secundaria y tridimensional de la LnqQ no se ve afectada cuando estaacuten

acopladas tanto por N-AmyE como con SmbP


Figura 6 Prediccioacuten de la estructura secundaria de N-AmyELnqQ

La estructura secundaria predicha del N-AmyELnqQ en Phyre2

Figura 7 Prediccioacuten de la estructura secundaria de SmbP-LnqQ

La estructura secundaria putativa del SmbP-LnqQ en Phyre2


Figura 8 Prediccioacuten de estructura tridimensional de N-AmyELnqQ

La imagen fue elaborada en el programa Phyre2 y representa la estructura tridimensional putativa de N-

AmyELnqQ La imagen estaacute coloreada con los colores del arcoiacuteris de N- al C-terminal Las dimensiones

propuestas por modelo son de (Å) X29824 Y24988 Z25496

Figura 9 Prediccioacuten de heacutelices transmembranales para N-AmyELnqQ

La imagen es resultado de la prediccioacuten propuesta por Phyre2 para heacutelices transmembranales de N-

AmyELnqQ


Figura 10 Prediccioacuten de estructura tridimensional de SmbP-LnqQ

La imagen fue elaborada en el programa Phyre2 y representa la estructura tridimensional putativa de SmbP-

LnqQ La imagen estaacute coloreada con los colores del arcoiacuteris de N- al C-terminal Las dimensiones propuestas

por modelo son de (Å) X32655 Y24988 Z25496


LnqQ


Las ceacutelulas presuntamente transformadas fueron seleccionadas con kanamicina

De acuerdo con la evidencia presentada (Figura 11) los controles experimentales

cumplieron con su objetivo ya que no se registroacute crecimiento en placas de LB agar

esteacuteriles en el control negativo (Figura 11 a) en cuanto al control de viabilidad

eacuteste demostroacute que la electroporacioacuten no fue un factor significativo que causara la

muerte de ceacutelulas de E coli DH5α como BL21 (DE3) (Figura 11 b c) Por uacuteltimo

los controles con antibioacutetico demostraron que la kanamicina (50 microgml) era lo

suficientemente potente para seleccionar ceacutelulas (Figura 11 d e) Por uacuteltimo

demostramos bajo la teacutecnica de electroporacioacuten que las cepas de ceacutelulas de E

coli tanto BL21 (DE3) como DH5α fueron correctamente transformadas con los

vectores de expresioacuten pETNL (Figura 11 f g) pET30(a)+ (Figura 11 h j) y

pSmbP-LnqQ (Figura 11 i k) Los ensayos fueron realizados por triplicado


Figura 11 Transformacioacuten de E coli DH5α y BL21 (DE3) con pET30a(+)

pETNL y pSmbP-LnqQ

Roacutetulo Descripcioacuten

a Control negativo

b Control viabilidad DH5α

c Control viabilidad BL21 (DE3)

d Control kanamicina + DH5α

e Control kanamicina + BL21 (DE3)

f DH5α + pETNL

g BL21 (DE3) + pETNL

h DH5α + pET30a(+)

i DH5α + pSmbP-LnqQ

j BL21 (DE3) + pET30a(+)

k BL21 (DE3) + pSmbP-LnqQ

Las placas rotuladas del a-c son placas LB con agar mientras que las placas d-k son placas LB

con agar suplementadas con kanamicina (50 microgml concentracioacuten final)

80


Los ensayos para la extraccioacuten y purificacioacuten de los plaacutesmidos pET30(a)+ pETNL

y pSmbP-LnqQ de ceacutelulas de E coli que fueron observados en un gel de agarosa

1 (pv) Seguacuten la evidencia (Figura 12) nuestros controles demuestran que

tanto el plaacutesmido pETNL como el vector pSmbP-LnqQ se encontraban presentes

Los iacutendices de concentracioacuten y calidad de cada uno de los vectores fueron para

pET30(a)+ de 911 ngmicrol con A260A280 en 195 para el vector pETNL de 532 ngmicrol

con A260A280 en 194 y para el vector pSmbP-LnqQ de 2861 ngmicrol con A260A280 en

188 Seguacuten la literatura los iacutendices para considerar a un DNA plasmiacutedico como

puro deben tener valores espectrofotomeacutetricos de A260A280 entre 18-20 donde un

valor menor a 18 se considera como contaminacioacuten con proteiacutenas y un valor de

superior a 20 se considera contaminacioacuten por RNA (Koetsier Cantor amp Biolabs

sf) Podemos inferir que los vectores de expresioacuten pET30(a)+ pETNL y pSmbP-

LnqQ fueron recuperados en buena cantidad con un buen iacutendice de pureza

Figura 12 Gel de agarosa con plaacutesmidos

pETNL y pSmbP-LnqQ

Gel de agarosa 1 (pv) adicionado con Eco-

Stain corrido durante 1 h a 120 V en buffer

TBE 1 X


M Marcador de peso molecular (pb)

1 Control negativo

2 Plaacutesmido pETNL

3 Plaacutesmido pSmbP-LnqQ


Los plaacutesmidos fueron extraiacutedos de E coli

BL21 (DE3) transformados con los vectores

de expresioacuten pETNL o pSmbP-LnqQ

El marcador de peso molecular corresponde

a 100-5000bp DNA Marker Plus Ready to

Use (Cat No SGM03 BioBasic Canadaacute)



punto final

Seguacuten los resultados obtenidos por OligoAnalyzer Tool tras ajustar las

condiciones de los oligonucleoacutetidos a las especificaciones del fabricante del kit de

la polimerasa el tamantildeo molecular del oligonucleoacutetido T7 promoter primer es de

20 pb con un contenido GC a 40 y un valor Tm = 591degC con un hairpin de -036

kcalmol a una Tm de 316degC y un valor homodiacutemero de -416 kcalmol Mientras

tanto el tamantildeo molecular del oligonucleoacutetido T7 terminal primer es de 19 pb con

un contenido GC a 526 y un valor Tm = 61degC con un hairpin de 002 kcalmol a

una Tm de 248degC y un valor homodiacutemero de -474 kcalmol El valor heterodiacutemero

entre ambos oligonucleoacutetidos es de -438 kcalmol

De acuerdo con los resultados de la aplicacioacuten NetPrimer el oligonucleoacutetido T7

promoter primer tiene un rating de eacutexito en 860 y presenta un valor de estabilidad

en su extremo 3rsquo-terminal de -87 kcalmol y no se identificoacute al hairpin el valor

homodiacutemero se registroacute en -759 kcalmol En el caso del oligonucleoacutetido T7

terminal primer este presenta un rating de eacutexito en 870 con un valor de

estabilidad en su extremo 3rsquo-terminal de -1142 kcalmol y tampoco se identificaron

hairpins el valor homodiacutemero se registroacute en -574 kcalmol El valor heterodiacutemero


De acuerdo con los criterios habituales para seleccioacuten de oligonucleoacutetidos ambos

se mantuvieron en los estaacutendares ya que presentaron un tamantildeo entre 18 a 25 pb

con un hairpin cuyo valor de Tm fue menor a la Tm reportado para el

oligonucleoacutetido y los valores tanto de los homodiacutemeros y heterodiacutemeros nunca

fueron maacutes negativo o iguales a -9 kcalmol

En cuanto al caacutelculo de la Ta para ambos oligonucleoacutetidos utilizamos la regla

general de sustraer 5degC al Tm calculado para en ambos oligonucleoacutetidos Para el

caacutelculo de la Ta oacuteptimo para un par de oligonucleoacutetidos para un blanco en

particular se utilizoacute la siguiente foacutermula matemaacutetica TaOpt = 03 times (Tm de oligo) +

07 times (Tm producto) minus 149 donde el valor de Tm del oligonucleoacutetido es la

temperatura de fusioacuten del oligonucleoacutetido menos estable y la Tm es el valor del


temperatura de fusioacuten del producto de PCR (Rychlik Spencer amp Rhoads 1990)

De esta manera promediamos el valor de la Tm de ambos oligonucleoacutetidos y el

resultado fue 60degC A este valor le sustrajimos 5degC para un Ta ajustado en 55degC

en los ensayos de PCR punto final para la identificacioacuten de los plaacutesmidos

Por uacuteltimo calculamos el total de ciclos y el tiempo de extensioacuten para los ensayos

de PCR punto final De acuerdo con las especificaciones del fabricante se debe

agregar 1 minuto por cada kb por sintetizar en los ensayos De esta manera

calculamos en primera instancia el tamantildeo molecular de los productos de los

ensayos de PCR de los vectores de expresioacuten pET30(a)+ pETNL y pSmbP-LnqQ

para determinar el tiempo de extensioacuten Para lograr este objetivo realizamos una

reaccioacuten in silico de PCR punto final entre los dos oligonucleoacutetidos T7 con cada

uno de los vectores de expresioacuten utilizados

Los archivos geneacuteticos de los tres vectores de expresioacuten fueron abiertos desde la

aplicacioacuten de SnapGene y ejecutamos una PCR punto final in silico

Posteriormente corrimos una simulacioacuten de gel de agarosa al 1 De acuerdo con

los resultados de nuestra simulacioacuten (Figura 13) las bandas esperadas de los

productos lineales de PCR de los vectores de pET30(a)+ pETNL y pSmbP-LnqQ

se encontrariacutean entre 367 pb 488 pb y 651 pb respectivamente Con esto

confirmamos que ninguno de los productos de PCR esperados tendriacutea un tamantildeo

superior al 1 kb y procedimos a configurar la reaccioacuten para el ensayo de PCR

punto final


Figura 13 Simulacioacuten de PCR para

vectores de expresioacuten

Gel de agarosa 10 generado desde

SnapGene



1 Producto PCR de pET-30a(+)

2 Producto PCR de pETNL

3 Producto PCR de pSmbP-LnqQ

Las bandas corresponden a productos lineales

de PCR

El marcador de peso molecular in silico

corresponde a PCR DNA Ladder de GenScript

(Cat En desuso Estados Unidos) y fue tomado

desde la aplicacioacuten de SnapGene versioacuten 113

Asiacute pues configuramos las condiciones de corrida en el termociclador las cuales

fueron registradas de la siguiente manera una desnaturalizacioacuten inicial a 94degC por

180 s despueacutes 30 ciclos de desnaturalizacioacuten alineamiento y extensioacuten con

temperaturas en 94degC 55degC y 72degC respectivamente y sus respectivos tiempos de

reaccioacuten a 30 s 45 s y 30 s Finalmente se agregoacute una etapa de extensioacuten final

con una temperatura a 72degC por 420 s


Despueacutes de realizar la teacutecnica de PCR punto final y una posterior corrida en un gel

de agarosa al 1 con buffer TBE 1X observamos una banda con tamantildeo de 367

pb para el producto de PCR obtenida del vector pET30(a)+ al tiempo que

recolectamos una banda de 488 pb para el producto de PCR del vector pETNL

(Figura 14) y finalmente encontramos una banda de 651 pb para el producto de

PCR del vector pSmbP-LnqQ (Figura 15) Dado que los valores predichos en la

simulacioacuten coinciden con los observado experimentalmente confirmamos que

nuestras cepas de E coli estaban efectivamente transformadas con su respectivo

vector de expresioacuten


Figura 14 PCR de pETNL


Stain corrido durante 1 h a 120 V en buffer TBE

1 X



1 Control negativo

2 PCR de pET30(a) virgen

3 PCR de pETNL

Los plaacutesmidos fueron extraiacutedos de E coli BL21

(DE3) transformados con los vectores de

expresioacuten pETNL o pET30(a)

El marcador de peso molecular corresponde a

100-5000bp DNA Marker Plus Ready to Use

(Cat No SGM03 BioBasic Canadaacute)

Figura 15 PCR de pSmbP-LnqQ



1 X



1 Control negativo

2 Control positivo pET30(a) vaciacuteo

3 Control positivo pETNL

4 Control negativo PCR pUC57-DPQ

5 Muestra PCR pSmbP-LnqQ










Para los anaacutelisis de expresioacuten de proteiacutenas utilizamos algunos vectores de

expresioacuten que han sido exitosos en la produccioacuten de proteiacutenas Los vectores

pET30a-SmbP_LL-37 y pET30a-SmbP_MP1106 fueron amablemente compartidos

por David Antonio Peacuterez miembro del grupo de investigacioacuten PEP con sede en la

Unidad de Posgrado de la Facultad de Ciencias Quiacutemicas (FCQ) de la UANL


(Monterrey Nuevo Leoacuten) Similarmente el vector pET30NP-Hoc fue compartido

por Francisco de Jesuacutes Balderas Cisneros miembro del grupo de investigacioacuten

NBR con sede en el CIBYN (Apodaca Nuevo Leoacuten)

Dado que la informacioacuten de los tres plaacutesmidos se encuentra o se encontraba en

estado de revisioacuten al momento de redactar este documento por sus respectivos

comiteacutes de revisioacuten solo podemos limitarnos a mencionar los pesos moleculares

de los productos de cada vector de expresioacuten Para los dos vectores de David

Peacuterez (D Peacuterez comunicacioacuten personal 2021) el peso molecular estimado de

ambos productos es 15 kDa mientras que el vector de Francisco Balderas el peso

molecular de su producto es de 95 kDa (F Balderas comunicacioacuten personal

2021)


Para la induccioacuten por IPTG seguimos los protocolos preestablecidos para la

induccioacuten de proteiacutenas heteroacutelogas en ceacutelulas de E coli En nuestro ensayo la

concentracioacuten de IPTG elegida para la induccioacuten de N-AmyELnqQ y SmbP-LnqQ

correspondioacute a 01 mM Nosotros utilizamos esta concentracioacuten debido a que los

reportes indican que esta concentracioacuten es lo suficiente para saturar la reaccioacuten

bioloacutegica evitando la toxicidad celular por este compuesto (Malakar amp Venkatesh

2012) Los valores tiacutepicos de IPTG maacutes utilizados para la induccioacuten usualmente se

encuentran entre 05 mM y 10 mM (Mesa-Pereira et al 2018)

En nuestros cultivos el IPTG fue antildeadido en la fase exponencial tardiacutea (OD600 =

04-06) dado que el costo energeacutetico es maacutes alto durante la fase exponencial

temprana que en la tardiacutea (Malakar amp Venkatesh 2012) Ademaacutes se presume que

en esta fase el total de proteiacutenas producidas pueden alcanzar rendimientos

productivos superiores a 350 (Larentis et al 2014) Para nuestros ensayos

utilizamos dos temperaturas para inducir 37degC y 25degC y la razoacuten de utilizar una

temperatura maacutes baja es porque es un meacutetodo habitual para incrementar la

solubilidad de proteiacutenas recombinantes en E coli (Schein 1989)


6182 SDS-PAGE de proteiacutenas periplaacutesmicas de E coli modificadas

con pETNL

Nuestros estudios preliminares bioinformaacuteticos indicaban que la proteiacutena N-

AmyELnqQ seriacutea insoluble (Tabla 10) y que tanto por sus antecedentes

(Nakazawa et al 1986 R M Papi et al 2005 Sjoumlstroumlm et al 1987) por sus

caracteriacutesticas moleculares estariacutea presuntamente ubicada en la regioacuten

periplaacutesmica de E coli (Tabla 11) Sin embargo nuestros resultados por ensayos

de SDS-PAGE indicaron que la induccioacuten por IPTG en ceacutelulas de E coli BL21

(DE3) transformados con el vector pETNL para la produccioacuten de N-AmyELnqQ

tanto en la fraccioacuten soluble como insoluble de proteiacutenas a una temperatura de

induccioacuten 25degC (Figura 16) como a 37degC (Figura 17) en la fraccioacuten periplaacutesmica

no fue posible en ceacutelulas de E coli BL21 (DE3) esta manifestacioacuten fue reportado

en muacuteltiples ocasiones De acuerdo con nuestros resultados no logramos

determinar la presencia de bandas de proteiacutenas en la regioacuten esperada que seguacuten

los anaacutelisis predictivos la proteiacutena N-AmyELnqQ debiacutea tener un peso molecular

cercano a 105 kDa

Es de mencionar que el valor de prediccioacuten de corte de peacuteptido sentildeal de la

proteiacutena N-AmyELnqQ fue muy inferior a los valores de prediccioacuten observados en

secuencias que contienen el peacuteptido sentildeal N-AmyE y que habiacutean sido previamente

validados experimentalmente (Tabla 8) Otro aspecto para considerar es que los

residuos reconocidos para el corte enzimaacutetico difieren entre los diferentes tipos de

bacterias (Nakazawa et al 1986) Esto quedoacute demostrado cuando observamos

que los residuos utilizados para el corte de este peacuteptido sentildeal podiacutean diferir

inclusive en el mismo tipo de bacteria Por ejemplo en la secuencia total de

aminoaacutecidos de la α-amilasa reportada por Yang y otros (Yang et al 1983) Emori

y otros (Emori amp Maruo 1988) y Kunst y otros (Kunst et al 1997) los residuos

observados corresponden al 33 y 34 mientras que para las secuencias de

aminoaacutecidos a los que se les fue acoplado el peacuteptido sentildeal en su regioacuten N-terminal

como las reportadas por Sakakibara y otros (Sakakibara et al 1993) y Papi y

otros (R M Papi et al 2005) los residuos de corte se ubicaron en la posicioacuten 31 y

32


Figura 16 Gel de E coli BL21 (DE3) con pETNL inducido a 25degC


M Marcador de peso molecular (kDa)

1 E coli BL21 (DE3) sin plaacutesmido ni IPTG Fraccioacuten soluble

2 E coli BL21 (DE3) sin plaacutesmido + IPTG 01 mM a 25degC Fraccioacuten soluble

3 E coli BL21 (DE3) + pETNL sin IPTG a 25degC Fraccioacuten soluble

4 E coli BL21 (DE3) + pETNL + IPTG 01 mM a 25degC Fraccioacuten soluble

5 E coli BL21 (DE3) sin plaacutesmido ni IPTG Fraccioacuten insoluble

6 E coli BL21 (DE3) sin plaacutesmido + IPTG 01 mM a 25degC Fraccioacuten insoluble

7 E coli BL21 (DE3) + pETNL sin IPTG a 25degC Fraccioacuten insoluble

8 E coli BL21 (DE3) + pETNL + IPTG 01 mM a 25degC Fraccioacuten insoluble

9 Lisozima (144 kDa)

Gel de poliacrilamida 165 (pv) adicionado tentildeido con Coomasie Blue R-250 durante 2 h a 120 V en buffer

de corrida 1 X Las bandas son las fracciones solubles e insolubles que fueron extraiacutedas de E coli BL21 (DE3)

transformados con los vectores de expresioacuten pETNL El marcador de peso molecular corresponde a

HyperPAGE Prestained Protein Marker (10 kDa to 190 kDa) (Cat No BIO-33066 Meridian Life Science Inc

Estados Unidos)


Figura 17 Gel de E coli BL21 (DE3) pETNL inducido a 37degC
















Estados Unidos)


6183 SDS-PAGE de proteiacutenas citoplaacutesmicas de E coli modificadas

con pSmbP-LnqQ

Los estudios preliminares predictivos para la produccioacuten heteroacuteloga de SmbP-

LnqQ en E coli indicaban que la presencia del peacuteptido de fusioacuten SmbP

aumentariacutea la solubilidad de la proteiacutena recombinante solubilidad (Tabla 10) y que

ademaacutes seriacutea localizado en el citoplasma celular (Tabla 11) con un peso

molecular aproximado de 167 kDa Nuestros resultados por ensayos de SDS-

PAGE indicaron que no hubo produccioacuten citoplasmaacutetica de una banda esperada

de 15 kDa tras inducir con IPTG a ceacutelulas de E coli BL21 (DE3) transformados

con el vector pSmbP-LnqQ para la produccioacuten del peacuteptido SmbP-LnqQ tanto a

25degC como 37degC (Figura 18) Estos ensayos fueron realizados por triplicado

Esto nos orilloacute a plantearnos dos posibilidades con relacioacuten a la proteiacutena SmbP-

LnqQ la primera era que pudiera presentar problemas por plegamiento durante su

produccioacuten en ceacutelulas de E coli BL21 (DE3) y que la segunda fuera problemas

internos relacionados al IPTG Para demostrar la primera hipoacutetesis transformamos

ceacutelulas de E coli Origami con el vector de expresioacuten pSmbP-LnqQ y utilizamos el

vector pET30a-SmbP_MP1106 como control positivo este vector seguacuten su autor

produce una proteiacutena de un tamantildeo de 15 kDa en ceacutelulas de E coli Origami

debido a que es una proteiacutena problemaacutetica (datos no publicados) Nuestra

evidencia (Figura 19) sentildeala que el IPTG no es causa probable de la nula

produccioacuten debido a que se observoacute una banda muy definida en la regioacuten de los

15 kDa para las bacterias transformadas con el vector terminacioacuten MP1106 que

habiacutean sido inducidas por IPTG tanto a 25degC como 37degC Tampoco se observoacute

que la cepa Origami contuviera un factor bioloacutegico no considerado en la cepa

BL21 (DE3) que pudiera agilizar la produccioacuten de la proteiacutena SmbP-LnqQ ya que

no encontramos ninguna banda de un tamantildeo de 15 kDa en las ceacutelulas Origami

transformados

Ante los resultados previos consideramos posibilidad de que el problema se

encontrara especiacuteficamente en la cepa de E coli (DE3) presente en nuestro

laboratorio Para demostrar este punto procedimos a transformarla la cepa con el


vector de expresioacuten pET30NP-Hoc para fines de control positivo para nuestro

experimento Seguacuten su autor este vector de expresioacuten produce una proteiacutena lineal

de 95 kDa al inducirse por IPTG a 1 mM (datos no publicados) Nuestros

resultados en el gel SDS-PAGE muestran una banda de proteiacutenas extraiacutedas de E

coli transformados pET30NP-Hoc en la seccioacuten de 95 kDa y es producido tanto a

37degC (Figura 20) como a 25degC (Figura 21) Sin embargo no pudimos observar

ninguna banda sobre expresada de 10 kDa para las BL21 (DE3) transformadas

con pETNL ni una banda tampoco de 15 kDa para las bacterias transformadas con

pSmbP-LnqQ De esta manera descartamos la idea que existiera un problema

bioloacutegico procedente en la cepa de E coli BL21 (DE3) mantenida en nuestro

laboratorio

Se conoce que la bacteriocina LnqQ ya ha sido sujeta a modificaciones geneacuteticas

para incrementar su produccioacuten al ser clonada y expresada con eacutexito con el

peacuteptido de fusioacuten SUMO en ceacutelulas de E coli BL21 (DE3) registraacutendose

rendimientos hasta de 130 mg por litro de cultivo bacteriano (Ma et al 2012) Ante

la ausencia de una banda de proteiacutenas en la regioacuten de 15 kDa en nuestro vector

de expresioacuten con peacuteptido de fusioacuten SmbP-LnqQ se ha comentado que no existen

razones para suponer que todas las etiquetas de fusioacuten son aptas para todo tipo

de necesidades ya que es casi imposible determinar cuaacutel es el peacuteptido de fusioacuten

oacuteptimo para la produccioacuten Sin embargo una de las ventajas de utilizar peacuteptidos

de fusioacuten reconocidos es que son reconocidos sus ventajas y desventajas ya que

en algunos casos algunos peacuteptidos de fusioacuten pueden incrementar la solubilidad

de las proteiacutenas tales como TRX MBP NusA etc pero otros peacuteptidos sentildeales no

incrementan la solubilidad de la proteiacutena de intereacutes como GST BAP etc Incluso

algunos peacuteptidos de fusioacuten pueden incrementar la carga metaboacutelica en la ceacutelula

como GST MBP y NusA (Waugh 2005)

A pesar del buen registro experimental disponible sobre construcciones que

contienen el peacuteptido de fusioacuten SmbP (Vargas-Cortez et al 2016) suponemos en

nuestro caso en particular que dada las limitaciones de su corto historial

experimental auacuten no existe informacioacuten que determine las ventajas y desventajas


pertinente al peacuteptido de fusioacuten SmbP para observar si son viables para la

produccioacuten solubilidad yo purificacioacuten de maacutes tipos de bacteriocinas

Figura 18 Gel de E coli BL21 (DE3) pSmbP-LnqQ inducido a 25degC y 37degC



1 E coli BL21 (DE3) + pET30a-SmbP_MP1106 sin IPTG a 25degC Fraccioacuten soluble

2 E coli BL21 (DE3) + pET30a-SmbP_MP1106 + 01 mM IPTG a 25degC Fraccioacuten soluble

3 E coli BL21 (DE3)+ pSmbP-LnqQ + 01 mM IPTG a 25degC Fraccioacuten soluble

4 E coli BL21 (DE3) + pSmbP-LnqQ + 1 mM IPTG a 25degC Fraccioacuten soluble







de corrida 1 X Las proteiacutenas fueron extraiacutedas de E coli BL21 (DE3) transformados con el vector de expresioacuten

pET30a-SmbP_MP1106 como control positivo y el vector pSmbP-LnqQ como experimental El marcador de

peso molecular corresponde a Broad Multi Color Pre-Stained Protein Standard (5 kDa to 270 kDa) (Cat No

M00624 GenScript Estados Unidos)


Figura 19 Gel de E coli Origami pSmbP-LnqQ inducido a 25degC y 37degC



1 E coli Origami + pET30a-SmbP_MP1106 sin IPTG a 25degC Fraccioacuten soluble

2 E coli Origami + pET30a-SmbP_MP1106 + 01 mM IPTG a 25degC Fraccioacuten soluble

3 E coli Origami + pSmbP-LnqQ + 01 mM IPTG a 25degC Fraccioacuten soluble







de corrida 1 X Las proteiacutenas fueron extraiacutedas de E coli Origami transformados con el vector de expresioacuten





Figura 20 Gel de E coli BL21 (DE3) con controles inducido a 37degC



1 E coli BL21 (DE3) + pET30NP-Hoc 37degC

2 E coli BL21 (DE3) + pET30a-SmbP_LL-37 37degC

3 E coli BL21 (DE3) + pET30NP-Hoc + IPTG 1 mM 37degC

4 E coli BL21 (DE3) + pET30a-SmbP_LL-37 + IPTG 1 mM 37degC

5 E coli (DE3) + pETNL + IPTG 01 mM 37degC


7 E coli (DE3) + pSmbP-LnqQ + IPTG 01 mM 37degC



de corrida 1 X Las bandas son las fracciones solubles de las proteiacutenas extraiacutedas de E coli BL21 (DE3)

transformados con los vectores de expresioacuten pET30NP-Hoc y pET30a-SmbP_LL-37 como controles positivos

y los vectores pETNL y pSmbP-LnqQ como experimentales El marcador de peso molecular corresponde a

Broad Multi Color Pre-Stained Protein Standard (5 kDa to 270 kDa) (Cat No M00624 GenScript Estados

Unidos)


















Unidos)


619 Presuntas causas de la ausencia de bandas de intereacutes en los geles de

proteiacutenas

Seguacuten el anaacutelisis fisicoquiacutemico de las secuencias aminoaciacutedicas que fueron

utilizadas en las construcciones para N-AmyE (Tabla 12) todas son de gran

tamantildeo y de alto peso molecular este peacuteptido se ha reportado para la

sobreexpresioacuten de AmyE en E coli (Nakazawa et al 1986) Asiacute como para la

sobreexpresioacuten de una regioacuten de 39 kDa que codifica para una regioacuten N-terminal

de una liasa de pectina (Pnl) en E coli (R Papi amp Kyriakidis 2003) a la fecha no

hemos visto alguacuten reporte de que este peacuteptido sentildeal haya sido utilizado para

producir proteiacutenas de bajo peso molecular

Por otro lado las secuencias que fueron exitosamente producidos con peacuteptido de

fusioacuten SmbP (Tabla 14) tambieacuten han mostrado ser uacutetil para producir proteiacutenas de

alto peso molecular o peacuteptidos de bajo peso molecular con actividad

antimicrobiana como VpDef (Montfort-Gardeazabal Claudio Casillas-Vega amp

Zarate 2020) Bin1b (Montfort-Gardeazabal et al 2021) y muy recientemente LL-

37 (Perez-Perez et al 2021) el peacuteptido de fusioacuten tambieacuten ha demostrado ser

exitoso para la sobreproduccioacuten de proteiacutenas de alto peso molecular como GFP y

RFP (Vargas-Cortez et al 2016) De esta manera consideramos que tanto el

tamantildeo como el peso molecular no son factores que intervengan durante el

proceso sobreproduccioacuten mediado tanto N-AmyE como con SmbP El punto

isoeleacutectrico tampoco parece ser un factor importante ya que el valor de AmyE es

aacutecido (561) mientras que Pnl es baacutesico (877) Situacioacuten similar sucede entre los

peacuteptidos microbianos puesto que VpDef es ligeramente aacutecido (686) en cambio el

resto de los peacuteptidos (Bin1b 949 LL-37 1061) son baacutesicos similar a LnqQ

Sin embargo observamos que tanto el iacutendice alifaacutetico (AI) como los valores del

iacutendice de hidrofobicidad (GRAVY) siacute son diferentes entre los distintos tipos de

peacuteptidos antimicrobianos Individualmente el valor AI de LnqQ es de 12115

(Tabla 12) y es superior al resto de los demaacutes peacuteptidos antimicrobianos con una

media de 5363 plusmn 3321) El valor AI para N-AmyELnqQ es de 11947 (Tabla 13) y

para SmbP-LnqQ es de 8323 (Tabla 15) respectivamente


Tabla 12 Propiedades fisicoquiacutemicas entre las diferentes proteiacutenas antes de

ser acoplados con N-AmyE

ID AmyE Pnl LnqQ

L 627 316 53

MW 6929711 3448665 589810

pI 561 877 1010

R(-) 69 21 2

R(+) 55 25 8

AI 6694 7636 12115

GRAVY -0648 -0291 +0300

ID identidad del peacuteptido yo proteiacutena L tamantildeo MW peso molecular en Da pI punto isoeleacutectrico R(-) total

de residuos cargados negativamente (Asp + Glu) R(+) total de residuos cargados positivamente (Arg + Lys)

AI iacutendice alifaacutetico GRAVY iacutendice de hidrofobicidad

Tabla 13 Propiedades fisicoquiacutemicas entre las diferentes proteiacutenas despueacutes

de ser acoplados con N-AmyE

ID N-AmyEAmyE N-AmyEPnl N-AmyELnqQ

L 660 360 94

MW 7279942 3947961 1053468

pI 588 922 1063

R(-) 69 22 2

R(+) 58 30 12

AI 6982 8061 11947

GRAVY -0553 -0205 +0426






ser acoplados con SmbP-LnqQ

ID VpDef Bin1b LL-37

L 49 45 37

MW 543498 520906 449332

pI 686 949 1061

R(-) 6 3 5

R(+) 6 9 11

AI 2388 4756 8946

GRAVY -0996 -0571 -0724





de ser acoplados con SmbP-LnqQ

ID SmbP-VpDef SmbP-Bin1b SmbP-LL-37 SmbP-LnqQ

L 152 148 140 155

MW 1630268 1607675 1536102 1669471

pI 594 648 645 645

R(-) 26 23 25 22

R(+) 16 19 21 18

AI 5086 5878 1828 8323

GRAVY -0938 -0807 -0861 -0514





En cuanto al iacutendice de hidrofobicidad LnqQ mostroacute un valor GRAVY positivo

(+0300) mientras que el resto de los peacuteptidos antimicrobianos donde el valor

GRAVY promedio era de -073 plusmn 019 No es de sorprender que las bacteriocinas

del subgrupo de la familia de las aureocinas similares a A53 como LnqQ

aureocina A53 lacticina Z epidermicina NI01 lactolisterina BU y BHT-B tengan

valores GRAVY positivos (Perez Zendo amp Sonomoto 2018) Sin embargo cuando

LnqQ estaacute acoplado a N-AmyE el valor GRAVY se vuelve auacuten maacutes positivo con

+0426 (Tabla 13) y cuando estaacute fusionado con SmbP el valor GRAVY cambia a -

0514 (Tabla 15)

La literatura menciona que un peacuteptido o proteiacutena presenta un valor GRAVY

positivo debe considerarse como hidrofoacutebica mientras que un valor GRAVY

negativo significa que la proteiacutena es hidrofiacutelica (Kyte amp Doolittle 1982) De manera

que proteiacutenas con valores GRAVY negativos indican que la proteiacutena presenta una

estructura globular (hidrofiacutelicos) mientras que proteiacutenas con valores GRAVY

positivos indican la posibilidad que la proteiacutena guarde alguna relacioacuten con la

membrana (hidrofoacutebicos) (Enany 2014)

El valor GRAVY es considerado como el factor que maacutes influye en la movilidad de

las proteiacutenas en los geles de SDS-PAGE una proteiacutena con un valor GRAVY

negativo tiende a migrar maacutes lento que las proteiacutenas con valores positivos en los

geles para proteiacutenas (Shirai et al 2008) Las unioacuten de las moleacuteculas de SDS con

las proteiacutenas se produce a traveacutes de los aminoaacutecidos hidrofoacutebicos (Robinson amp

Tanford 2002) algunas estructuras hidrofoacutebicas son capaces de unir moleacuteculas

SDS hasta en un rango desde 34 a 10 g de SDS por 1 g de proteiacutena lo que

influiriacutea en una migracioacuten electroforeacutetica anoacutemala en los geles de SDS-PAGE

(Rath Glibowicka Nadeau Chen amp Deber 2009) LnqQ es una proteiacutena globular

(Acedo et al 2016) que utiliza la membrana especiacuteficamente para atacar

(Yoneyama Imura Ohno et al 2009) con lo que suponemos que el iacutendice de

hidrofobicidad pudiera estar afectando en el comportamiento electroforeacutetico de las

proteiacutenas Sin embargo tambieacuten la literatura sugiere que el comportamiento

anoacutemalo en las proteiacutenas de membrana en los geles de SDS-PAGE pudiera no


necesariamente relacionado a la carga neta de la proteiacutena ni a su iacutendice de

hidrofobicidad (Rath amp Deber 2013)

Al evaluar individualmente a LnqQ a traveacutes la escala Kyte-Doolittle observamos

que el peacuteptido posee dos secciones hidrofoacutebicas que se encuentran

aproximadamente entre los extremos del peacuteptido (entre residuos 5 al 15 y del 31 al

49) representando el 60 del total de la secuencia de LnqQ es hidrofoacutebica

(Figura 22) Si LnqQ estaacute acoplada con N-AmyE se observan las dos regiones

hidrofoacutebicas (entre residuos 9-50 y 66-85) que representa que el 6860 del total

de la secuencia sea hidrofoacutebica (Figura 23) Mientras tanto SmbP retiene sus dos

regiones hidrofoacutebicas que se ubican hacia la regioacuten C-terminal entre los residuos

103-117 y 133-151 componiendo el 2313 de total de la secuencia (Figura 24)

Dado que existe un reporte de produccioacuten exitosa entre la LnqQ acoplada con el

peacuteptido de fusioacuten SUMO (Ma et al 2012) decidimos evaluar su valor AI GRAVY

y su escala Kyte-Doolittle Seguacuten los resultados de ProtParam para SUMO-LnqQ

los valores AI y GRAVY son de 8337 y -0516 respectivamente los cuales son

similares a lo reportado para SmbP-LnqQ Por otro lado seguacuten la escala Kyte-

Doolittle cinco regiones hidrofoacutebicas fueron descritas a lo largo de toda la

construccioacuten y estaacuten aproximadamente repartidas en toda la estructura lineal

entre los residuos 16-18 53-70 87-91 119-134 y 150-168 lo que representa el

28 del total de la secuencia (Figura 25) El valor GRAVY positivo y el alto

porcentaje de residuos hidrofoacutebicos para N-AmyELnqQ nos permite suponer que

estaacute proteiacutena se encontrariacutea anclada en la membrana celular lo que dificultariacutea su

solubilizacioacuten en los geles de proteiacutenas


Figura 22 Perfil de hidrofobicidad Kyte-Doolittle para LnqQ

La imagen fue elaborada a partir de los resultados obtenidos en ProtScale de ExPasy y representa el perfil

hidrofobicidad de la LnqQ

Figura 23 Perfil de hidrofobicidad Kyte-Doolittle para N-AmyELnqQ


hidrofobicidad de N-AmyELnqQ

-2

-15

-1

-05

0

05

1

15

2

25

0 10 20 30 40 50 60

Valo

r

Posicioacuten

LnqQ

-3

-2

-1

0

1

2

3

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

N-AmyELnqQ


Figura 24 Perfil de hidrofobicidad Kyte-Doolittle para SmbP-LnqQ


hidrofobicidad de la SmbP-LnqQ

Figura 25 Perfil de hidrofobicidad Kyte-Doolittle para SUMO-LnqQ


hidrofobicidad de la SUMO-LnqQ

-3

-25

-2

-15

-1

-05

0

05

1

15

2

25

0 20 40 60 80 100 120 140 160

Va

lor

Posicioacuten

SmbP-LnqQ

-3

-25

-2

-15

-1

-05

0

05

1

15

2

25

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

Va

lor

Posicioacuten

SUMO-LnqQ


Ante la ausencia de una respuesta objetiva que explique la ausencia de bandas de

SmbP-LnqQ en los ensayos analizamos el perfil de aminoaacutecidos y detectamos

que la presencia de cisteiacutenas entre los peacuteptidos antimicrobianos tampoco fue un

factor determinante durante la sobreproduccioacuten con la SmbP ya que tanto VpDef

como Bin1b (que se caracterizan por ser abundantes en cisteiacutenas) como LL-37

(que no tiene cisteiacutenas) fueron exitosamente producidos El mapa de calor (Figura

26) sentildealoacute un alto porcentaje de Trp en LnqQ en comparacioacuten con los demaacutes

peacuteptidos antimicrobianos De acuerdo con la escala Kyte-Doolittle Trp es

considerado un residuo hidrofiacutelico (Kyte amp Doolittle 1982) cuando en realidad es

hidrofoacutebico por sus caracteriacutesticas uacutenicas (Mishra Choi Moon amp Baek 2018)

Este residuo funge como estabilizador de las proteiacutenas en la membranas anclaje

y orientacioacuten hacia el lado hidrofiacutelico de la bicapa lipiacutedica (Khemaissa Sagan amp

Walrant 2021) por eso son de alta importancia en proteiacutenas de membrana porque

apoyan en la estabilidad proteiacutena en la interfaz lipiacutedica por su forma riacutegida y plana

(Yau Wimley Gawrisch amp White 1998) Se presume que Trp permite que

peacuteptidos antimicrobianos similares a la aureocina A53 se mantengan unidos a la

membrana (Netz Bastos amp Sahl 2002) Sin embargo al analizar el porcentaje de

Trp entre N-AmyELnqQ SmbP-LnqQ y SUMO-LnqQ descubrimos que los

valores son muy similares 11 26 y 23 Por lo que Trp no seriacutea un factor

clave para que LnqQ sea producido en E coli

Ala Arg Asn Asp Cys Gln Glu Gly His Ile Leu Lys Met Phe Pro Ser Thr Trp Tyr Val

VpDef

Bin1b

LL37

LnqQ

Figura 26 Perfil aminoaciacutedico de los peacuteptidos antes de acoplarse con SmbPc

El mapa de calor representa la distribucioacuten de los residuos entre los peacuteptidos La intensidad del color negro

representa el porcentaje de residuos entre los peacuteptidos antes de ser acoplados con SmbP

Dada la similitud fisicoquiacutemica entre SmbP-LnqQ y SUMO-LnqQ abordamos el

problema desde el punto de vista analiacutetico otros autores demostraron que

proteiacutenas de peso molecular alto como N-AmyEPnl (R Papi amp Kyriakidis 2003) o


de peso molecular pequentildeo como SmbP-Bin1b (Montfort-Gardeazabal et al

2021) SmbP-VpDef (Montfort-Gardeazabal et al 2020) SmbP-LL-37 (Perez-

Perez et al 2021) eran faacutecilmente observables mediante la teacutecnica de SDS-

PAGE hechos que utilizamos para la visualizacioacuten preliminar tanto N-AmyELnqQ

como de SmbP-LnqQ en los ensayos electroforeacuteticos Sin embargo en el reporte

de sobreproduccioacuten por SUMO-LnqQ los ensayos electroforeacuteticos preliminares

fueron realizados bajo la teacutecnica SDS-PAGE con Tricina (Ma et al 2012) Esta

variante es utilizada para resolver proteiacutenas con pesos moleculares pequentildeos que

oscilan entre 1 a 30 kDa (Haider Reid amp Sharp 2012) pero tambieacuten es uacutetil para

analizar proteiacutenas hidrofoacutebicas (Schaumlgger 2006) lo cual seriacutea un candidato ad

hoc a las caracteriacutesticas fisicoquiacutemicas observadas de la LnqQ

Por uacuteltimo y no menos importante es tambieacuten de mencionar todas las

secuencias aminoaciacutedicas donde los peacuteptidos antimicrobianos tuvieron eacutexito con la

SmbP tienen su origen evolutivo en sistemas eucarioacuteticos las defensinas VpDef

(Zhang et al 2015) y Bin1b (Guo et al 2009) provienen del invertebrado

Venerupis philippinarum y del epidiacutedimo de la rata Rattus norvegicus

respectivamente mientras que la catelicidina LL-37 proviene del sistema inmune

de chimpanceacutes y humanos (Agerberth et al 1995) nuestra LnqQ posee un origen

procariota a traveacutes de Lactococcus lactis QU5 (Fujita et al 2007) Las defensinas

estaacuten compuestas por estructuras tipo beta plegadas mediadas por cisteiacutenas

conservadas mientras que los dominios antimicrobianos de las catelicidinas son

estructuralmente lineales carentes de puentes disulfuro y estaacuten compuestas por

varias heacutelices (Dorin McHugh Cox amp Davidson 2014) LnqQ es una estructura

lineal compuesta por dos heacutelices anfipaacuteticas (Perez et al 2014) por lo que el

factor estructural tampoco seriacutea un factor clave salvo por el hecho de que

provienen de oriacutegenes evolutivos distintos

A manera de conclusioacuten de acuerdo con la evidencia recolectada tanto a nivel

bioinformaacutetico como experimental encontramos que el marco de lectura de los

vectores para la produccioacuten de N-AmyELnqQ como SmbP-LnqQ estaban

correctamente orientados y dispuestos en sus marcos de lecturas


correspondientes los geles de poliacrilamida siacute fueron efectivos para detectar

proteiacutenas con un peso similar (lisozima 144 kDa) a los peacuteptidos de nuestras

construcciones (N-AmyELnqQ= 1053 kDa y SmbP-LnqQ= 1669 kDa)

Confirmamos que el IPTG siacute es capaz de inducir la sobreproduccioacuten de proteiacutenas

de control tanto en cepas de E coli BL21 (DE3) como de Origami tanto a 25degC

como a 37degC De manera que tanto N-AmyELnqQ como SmbP-LnqQ suponemos

que siacute son producidas pero por caracteriacutesticas fisicoquiacutemicas propias de la LnqQ

es posible que 1) dado su alta hidrofobicidad es posible que N-AmyELnqQ se

mantenga acoplada en la membrana celular lo que dificultariacutea su solubilizacioacuten en

los geles de SDS-PAGE 2) desde el punto de vista analiacutetico es posible que SDS-

PAGE no sea la teacutecnica oacuteptima para la visualizacioacuten de las proteiacutenas hidrofoacutebicas

3) no existe informacioacuten conclusiva que respalde soacutelidamente porqueacute SmbP-LnqQ

no logroacute ser sobreproducida utilizando E coli como organismo heteroacutelogo

productor


CAPIacuteTULO 7 CONCLUSIONES

El biosensor disentildeado de ceacutelulas de E coli basado en la deteccioacuten de moleacuteculas

de QS es capaz de producir LnqQ en base a la concentracioacuten externa de AIP

excretada por MRSA La capacidad del biosensor estaacute mediada por un vector de

expresioacuten disentildeado que lleva por nombre Dual Biosensor-Killer Este plaacutesmido

ademaacutes puede ser utilizado para la construccioacuten de otros biosensores que

compartan el objetivo de detectar y destruir otros patoacutegenos productores de

sentildeales tipo QS Seguacuten nuestros anaacutelisis bioinformaacuteticos in silico nuestro

biosensor estaacute capacitado para detectar y destruir cepas de S aureus que sean

productoras de moleacuteculas de sentildealizacioacuten tipo AIP clase II De acuerdo con

nuestros pronoacutesticos nuestra cepa modificada seriacutea capaz de producir secretar y

ser capaz de ser resistente a la produccioacuten de LnqQ debido a que la maquinaria

geneacutetica se mantuvo intacto Nuestros resultados revelan indican que la LnqQ

seraacute lo suficientemente soluble cuando sea sobreexpresado Por uacuteltimo

determinamos que no existen epiacutetopos para ceacutelulas tipo B ni riesgo de

alergenicidad De esta manera la LnqQ producida por este sistema bioloacutegico es

aparentemente seguro para ser utilizado como un potencial candidato a agente

terapeacuteutico Los resultados in silico motivan al desarrollo y disentildeo de nuevos

agentes antimicrobianos a traveacutes de biosensores de ceacutelulas enteras para eliminar

patoacutegenos tanto sensibles como resistentes a los antibioacuteticos A pesar de los

favorables resultados reportados en publicaciones anteriores y la evidencia

predictiva sobre el peacuteptido sentildeal N-AmyE y con el peacuteptido de fusioacuten SmbP para la

produccioacuten de proteiacutenas recombinantes como la bacteriocina LnqQ dichas

observaciones no pueden ser aplicadas para la produccioacuten expresioacuten y

purificacioacuten desde ceacutelulas de E coli BL21 (DE3)


ANEXOS

Divulgacioacuten de la investigacioacuten

Publicaciones

Beniacutetez-Chao DF Balderas-Cisneros FDJ Leoacuten-Buitimea A and Morones-

Ramiacuterez JR 2021 Design and in silico analysis of a whole-cell biosensor able to

kill methicillin-resistant Staphylococcus aureus Biotechnol Appl Biochem

httpsdoiorg101002bab2210

Beniacutetez-Chao DF Leoacuten-Buitimea A Lerma-Escalera JA and Morones-

Ramiacuterez JR 2021 Bacteriocins An Overview of Antimicrobial Toxicity and

Biosafety Assessment by in vivo Models Front Microbiol

httpsdoiorg103389fmicb2021630695


Archivos de disentildeo

Todos los archivos gestionados para los disentildeos estaacuten guardados en su formato

correspondiente adentro de la carpeta de ldquoDoctoral ndash Anexosrdquo la cual fue anexada

propiamente en el disco compacto

Se elaboroacute una carpeta nombrada ldquoBioBricks and Modulesrdquo que contiene

informacioacuten de los resultados para las secciones 61 hasta 610 y estaacute subdivida

en cuatro subcarpetas nombradas como ldquoBioBricks (secuencias originales)rdquo

ldquoModulesrdquo ldquoPlasmidsrdquo ldquoTemplatesrdquo y el ldquoDual Biosensor Killerdnardquo Estos archivos

fueron elaborados a traveacutes de la aplicacioacuten de SnapGene 113 y estaacuten guardados

en formato dna Tambieacuten entregamos dos documentos en formato PDF que

contienen la secuencia nucleotiacutedica optimizada de todos genes usados para el

moacutedulo de biosensor y para el moacutedulo de bacteriocina

Se creoacute una carpeta nombrada ldquoSignal and fusion peptidesrdquo que contiene

informacioacuten de los resultados para las secciones 611 hasta 618 y en esta se

encontraraacute la subcarpeta ldquoMapa Geneacutetico de vectores de expresioacuten de expresioacuten

pETNL y pSmbP-LnqQrdquo Ademaacutes se entregaron tres archivos PDF donde dos de

eacutestos archivos contienen datos predictivos de la estructura secundaria y terciaria

de los productos de pETNL ldquoPhyre2 pETNLpdfrdquo y de pSmbP-LnqQ ldquoPhyre2

pSmbP-LnqQrdquo a traveacutes de la aplicacioacuten en liacutenea Phyre2 y el otro archivo PDF

ldquoSimulacioacuten agarosa 1pdfrdquo que contiene una simulacioacuten en gel de agarosa 1

(pv) de los productos lineales de los vectores de expresioacuten pET30a(+) pETNL y

pSmbP-LnqQ En la carpeta de este capiacutetulo tambieacuten se entregaron cinco archivos

en formato dna que contienen la informacioacuten nucleotiacutedica de la construccioacuten de

los vectores de expresioacuten cuyos nombres son ldquopET30(a)-NAmyE-LnqQ

pETNLpdfrdquo ldquopET-30a(+)pdfrdquo ldquopET-30a(+)-N-AmyEpdfrdquo ldquopET30a-SmbPpdfrdquo y

ldquopSmbP-LnqQ GFJBC01pdfrdquo Todos los archivos estaacuten marcados con sus

respectivas caracteriacutesticas


Resumen autobiograacutefico


Candidato para el grado de

Doctor en Ciencias con orientacioacuten en Microbiologiacutea Aplicada

Tesis Control poblacional y oscilatorio utilizando el Quorum Sensing de

Staphylococcus aureus mediante un circuito geneacutetico de Escherichia coli

Edad 31 antildeos

Campo de estudio Desarrollo de agentes terapeacuteuticos y biologiacutea sinteacutetica

Biografiacutea Nacido en Monterrey Nuevo Leoacuten el diacutea 24 de julio de 1990 hijo de

Mariacutea Guadalupe Chao Soto y Alejandro Beniacutetez Villegas

Educacioacuten Egresado de Licenciado en Biotecnologiacutea Genoacutemica (UANL) en el

2013 y Maestro en Ciencias con Acentuacioacuten en Microbiologiacutea (UANL) en 2015


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Comparative Immunology 51(1) 29ndash38

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ii

iii


CONTRAPORTADA

RESUMEN


























respectivamente






















PRESENTACIOacuteN



DE Escherichia coli

Presentado por













AGRADECIMIENTOS



























DEDICATORIA
















Gaby Quintanilla




Ernesto













mejoran enormemente

Carl Sagan



TABLA DE CONTENIDO

PORTADA I



CONTRAPORTADA IV

RESUMEN IV


AGRADECIMIENTOS VII

DEDICATORIA VIII



LISTA DE TABLAS XV




































35 Metas 29

















































ANEXOS 106




REFERENCIAS 109



LISTA DE FIGURAS























LISTA DE TABLAS






















LnqQ Lacticina Q
















kDA Kilo Dalton


microM Micromolar



AmyE Alfa-amilasa








FPB FP Base



nm Nanoacutemetros











microl Microlitros

microg Microgramos

degC Grados Celsius

h Hora

ml Mililitro

g Gramo



min Minuto


V Volts


pv Peso volumen



M Molar





mm Miliacutemetros



gfp Gen de GFP



AIP-I AIP clase I

AIP-II AIP clase 2

AIP-III AIP clase 3

AIP-IV AIP clase 4


Ala Alanina (A)

Arg Arginina (R)

Asn Asparagina (N)

Asp Asparato (D)


Gln Glutamina (Q)

Glu Glutamato (E)

Gly Glicina (G)

His Histidina (H)

Ile Isoleucina (I)

Leu Leucina (L)

Lys Lisina (K)

Met Metionina (M)


Pro Prolina (P)

Ser Serina (S)

Thr Treonina (T)


Tyr Tirosina (Y)

Val Valina (V)


AmyE Amilasa E








































(Podolsky 2018)

















































Sharma 2019)












































(Razvi et al 2009)






















2018)


resistentes


































































antibioacuteticos






































































(Fuqua et al 1994)












2002)






Bassler 2002)














Bassler 2002)





































































sentildeales



















































amp Kaznessis 2015)



















































Fliss 2010)


















































2020)























































2014)




et al 2018)




























































(Li et al 2013)








































































































fusioacuten




















































2018)















32 Hipoacutetesis








33 Objetivo General










MRSA







bacteriocina














35 Metas



























et al 2014)

















































2000)










de bacteriocina






















































6100)






































































AymELnqQ6xHis






















negativos





















LnqQ



























LnqQ






y SmbP-LnqQ







Sternberg 2015)


LnqQ
















































































residual






plasmiacutedico


punto final












primers)
































































































eliminado



























































amortiguadora



















los geles








































utilizado



















TEMED Merck 110732


























USO PERSONAL





















No especificado







Genie 2
































Meacutexico










































Pereira et al 2017)




























































(Figura 4)







































misma tesis
































agrC 1116 0407 282 0770 433

agrA 717 0402 272 0766 446

lnqQ 162 0532 333 0675 469

lnqB 240 0525 225 0735 400

lnqC 480 0518 231 0771 421

lnqE 1299 0511 259 0773 410

lnqD 678 0503 305 0777 431

lnqF 795 0521 245 0747 424















Rumbaugh 2014)







































2 (Ji et al 2005)













AgrA 0514 Soluble

LnqQ 0655 Soluble





LnqF 0607 Soluble

GFP 0592 Soluble


























AgrA 07 Citoplasma

LnqQ 07 Citoplasma





LnqF 07 Citoplasma

GFP 07 Citoplasma


citoplasma














alergenicidad






































respectivamente





























LnqQ6xHis (Tabla 6)

















HHHH

94



AymELnqQ6xHis












M Papi et al 2005)



AmyELnqQ


gtYang1983

(CAA234371)










gtNakazawa1986

(PTUE33)


gtEmori1988

(CAA306431)







LYPDDIEIRCNTFFQ

gtSakakibara1993

(PTUBE695)


gtKunst1997

(NP_3881862)
















VSKIKQILGIKHHHHHH





















































LnqQ-XhoI-3rsquo








Tamantildeo





155




LnqQ





















LnqQ






























y SmbP-LnqQ

































AmyELnqQ







LnqQ
















pETNL y pSmbP-LnqQ


a Control negativo





f DH5α + pETNL


h DH5α + pET30a(+)


j BL21 (DE3) + pET30a(+)




80
















pETNL y pSmbP-LnqQ



TBE 1 X



1 Control negativo












punto final


















































punto final





SnapGene







de PCR

























1 X



1 Control negativo


3 PCR de pETNL










1 X



1 Control negativo






























2021)




















con pETNL














cercano a 105 kDa















32


















Estados Unidos)


















Estados Unidos)



con pSmbP-LnqQ

























transformados















laboratorio










































































Unidos)


















Unidos)



proteiacutenas
































ID AmyE Pnl LnqQ

L 627 316 53

MW 6929711 3448665 589810

pI 561 877 1010

R(-) 69 21 2

R(+) 55 25 8

AI 6694 7636 12115

GRAVY -0648 -0291 +0300







L 660 360 94

MW 7279942 3947961 1053468

pI 588 922 1063

R(-) 69 22 2

R(+) 58 30 12

AI 6982 8061 11947

GRAVY -0553 -0205 +0426








L 49 45 37

MW 543498 520906 449332

pI 686 949 1061

R(-) 6 3 5

R(+) 6 9 11

AI 2388 4756 8946

GRAVY -0996 -0571 -0724







L 152 148 140 155

MW 1630268 1607675 1536102 1669471

pI 594 648 645 645

R(-) 26 23 25 22

R(+) 16 19 21 18

AI 5086 5878 1828 8323

GRAVY -0938 -0807 -0861 -0514













0514 (Tabla 15)





















































-2

-15

-1

-05

0

05

1

15

2

25

0 10 20 30 40 50 60

Valo

r

Posicioacuten

LnqQ

-3

-2

-1

0

1

2

3

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

N-AmyELnqQ








-3

-25

-2

-15

-1

-05

0

05

1

15

2

25

0 20 40 60 80 100 120 140 160

Va

lor

Posicioacuten

SmbP-LnqQ

-3

-25

-2

-15

-1

-05

0

05

1

15

2

25

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

Va

lor

Posicioacuten

SUMO-LnqQ























VpDef

Bin1b

LL37

LnqQ




















































productor




























ANEXOS


Publicaciones












































Edad 31 antildeos







REFERENCIAS
























4(3) 126ndash131





































































































httpsdoiorg1010160378-8741(83)90051-X






httpsdoiorg101007s10529-005-0936-5




httpsdoiorg101007s00284-017-1196-z





51969-1





httpsdoiorg101016B978-0-12-397169-200030-5









httpsdoiorg101038s41557-018-0174-9



httpsdoiorg101023A1014193329979









































Recuperado de


5-0037pdf




lecturepdf









































httpsdoiorg101016s0140-6736(62)90520-2




013-0082-3









01017-7


















































































006-0720-y


























httpsdoiorg101007s11274-016-2028-1







httpsdoiorg101128JB18793139-31502005
















Crystals 2021 Vol 11 Page 1032 11(9) 1032







httpsdoiorg1010160300-9084(88)90206-4


























6736(00)04403-2



httpsdoiorg1010160022-2836(82)90515-0













671



























1425-x








httpsdoiorg101007s00253-011-3642-3



Bacteriology












445




httpsdoiorg101038s41598-017-02868-w
















httpsdoiorg101038s41598-019-42049-5









httpsdoiorg1021740929866527666200610133407

























httpsdoiorg101128AEM68115274-52802002

























httpsdoiorg101042








httpsdoiorg1010022211-546312808








httpsdoiorg1011861475-2859-13-S1-S3










httpsdoiorg101111j1574-695X201000710x





httpsdoiorg1010020471142727mb0903s62



httpsdoiorg1011861745-6150-3-38





























0132




httpsdoiorg101007978-1-4419-7692-5_3














httpsdoiorg1011862193-1801-2-133







































00176-4pdf




de Nuevo Leoacuten








1141











































httpsdoiorg101016S1359-6446(02)02498-4





















httpsdoiorg101038s41598-017-17908-8










3880 httpsdoiorg101128JCM4283877-38802004












































































iii


CONTRAPORTADA

RESUMEN


























respectivamente






















PRESENTACIOacuteN



DE Escherichia coli

Presentado por













AGRADECIMIENTOS



























DEDICATORIA
















Gaby Quintanilla




Ernesto













mejoran enormemente

Carl Sagan



TABLA DE CONTENIDO

PORTADA I



CONTRAPORTADA IV

RESUMEN IV


AGRADECIMIENTOS VII

DEDICATORIA VIII



LISTA DE TABLAS XV




































35 Metas 29

















































ANEXOS 106




REFERENCIAS 109



LISTA DE FIGURAS























LISTA DE TABLAS






















LnqQ Lacticina Q
















kDA Kilo Dalton


microM Micromolar



AmyE Alfa-amilasa








FPB FP Base



nm Nanoacutemetros











microl Microlitros

microg Microgramos

degC Grados Celsius

h Hora

ml Mililitro

g Gramo



min Minuto


V Volts


pv Peso volumen



M Molar





mm Miliacutemetros



gfp Gen de GFP



AIP-I AIP clase I

AIP-II AIP clase 2

AIP-III AIP clase 3

AIP-IV AIP clase 4


Ala Alanina (A)

Arg Arginina (R)

Asn Asparagina (N)

Asp Asparato (D)


Gln Glutamina (Q)

Glu Glutamato (E)

Gly Glicina (G)

His Histidina (H)

Ile Isoleucina (I)

Leu Leucina (L)

Lys Lisina (K)

Met Metionina (M)


Pro Prolina (P)

Ser Serina (S)

Thr Treonina (T)


Tyr Tirosina (Y)

Val Valina (V)


AmyE Amilasa E








































(Podolsky 2018)

















































Sharma 2019)












































(Razvi et al 2009)






















2018)


resistentes


































































antibioacuteticos






































































(Fuqua et al 1994)












2002)






Bassler 2002)














Bassler 2002)





































































sentildeales



















































amp Kaznessis 2015)



















































Fliss 2010)


















































2020)























































2014)




et al 2018)




























































(Li et al 2013)








































































































fusioacuten




















































2018)















32 Hipoacutetesis








33 Objetivo General










MRSA







bacteriocina














35 Metas



























et al 2014)

















































2000)










de bacteriocina






















































6100)






































































AymELnqQ6xHis






















negativos





















LnqQ



























LnqQ






y SmbP-LnqQ







Sternberg 2015)


LnqQ
















































































residual






plasmiacutedico


punto final












primers)
































































































eliminado



























































amortiguadora



















los geles








































utilizado



















TEMED Merck 110732


























USO PERSONAL





















No especificado







Genie 2
































Meacutexico










































Pereira et al 2017)




























































(Figura 4)







































misma tesis
































agrC 1116 0407 282 0770 433

agrA 717 0402 272 0766 446

lnqQ 162 0532 333 0675 469

lnqB 240 0525 225 0735 400

lnqC 480 0518 231 0771 421

lnqE 1299 0511 259 0773 410

lnqD 678 0503 305 0777 431

lnqF 795 0521 245 0747 424















Rumbaugh 2014)







































2 (Ji et al 2005)













AgrA 0514 Soluble

LnqQ 0655 Soluble





LnqF 0607 Soluble

GFP 0592 Soluble


























AgrA 07 Citoplasma

LnqQ 07 Citoplasma





LnqF 07 Citoplasma

GFP 07 Citoplasma


citoplasma














alergenicidad






































respectivamente





























LnqQ6xHis (Tabla 6)

















HHHH

94



AymELnqQ6xHis












M Papi et al 2005)



AmyELnqQ


gtYang1983

(CAA234371)










gtNakazawa1986

(PTUE33)


gtEmori1988

(CAA306431)







LYPDDIEIRCNTFFQ

gtSakakibara1993

(PTUBE695)


gtKunst1997

(NP_3881862)
















VSKIKQILGIKHHHHHH





















































LnqQ-XhoI-3rsquo








Tamantildeo





155




LnqQ





















LnqQ






























y SmbP-LnqQ

































AmyELnqQ







LnqQ
















pETNL y pSmbP-LnqQ


a Control negativo





f DH5α + pETNL


h DH5α + pET30a(+)


j BL21 (DE3) + pET30a(+)




80
















pETNL y pSmbP-LnqQ



TBE 1 X



1 Control negativo












punto final


















































punto final





SnapGene







de PCR

























1 X



1 Control negativo


3 PCR de pETNL










1 X



1 Control negativo






























2021)




















con pETNL














cercano a 105 kDa















32


















Estados Unidos)


















Estados Unidos)



con pSmbP-LnqQ

























transformados















laboratorio










































































Unidos)


















Unidos)



proteiacutenas
































ID AmyE Pnl LnqQ

L 627 316 53

MW 6929711 3448665 589810

pI 561 877 1010

R(-) 69 21 2

R(+) 55 25 8

AI 6694 7636 12115

GRAVY -0648 -0291 +0300







L 660 360 94

MW 7279942 3947961 1053468

pI 588 922 1063

R(-) 69 22 2

R(+) 58 30 12

AI 6982 8061 11947

GRAVY -0553 -0205 +0426








L 49 45 37

MW 543498 520906 449332

pI 686 949 1061

R(-) 6 3 5

R(+) 6 9 11

AI 2388 4756 8946

GRAVY -0996 -0571 -0724







L 152 148 140 155

MW 1630268 1607675 1536102 1669471

pI 594 648 645 645

R(-) 26 23 25 22

R(+) 16 19 21 18

AI 5086 5878 1828 8323

GRAVY -0938 -0807 -0861 -0514













0514 (Tabla 15)





















































-2

-15

-1

-05

0

05

1

15

2

25

0 10 20 30 40 50 60

Valo

r

Posicioacuten

LnqQ

-3

-2

-1

0

1

2

3

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

N-AmyELnqQ








-3

-25

-2

-15

-1

-05

0

05

1

15

2

25

0 20 40 60 80 100 120 140 160

Va

lor

Posicioacuten

SmbP-LnqQ

-3

-25

-2

-15

-1

-05

0

05

1

15

2

25

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

Va

lor

Posicioacuten

SUMO-LnqQ























VpDef

Bin1b

LL37

LnqQ




















































productor




























ANEXOS


Publicaciones












































Edad 31 antildeos







REFERENCIAS
























4(3) 126ndash131





































































































httpsdoiorg1010160378-8741(83)90051-X






httpsdoiorg101007s10529-005-0936-5




httpsdoiorg101007s00284-017-1196-z





51969-1





httpsdoiorg101016B978-0-12-397169-200030-5









httpsdoiorg101038s41557-018-0174-9



httpsdoiorg101023A1014193329979









































Recuperado de


5-0037pdf




lecturepdf









































httpsdoiorg101016s0140-6736(62)90520-2




013-0082-3









01017-7


















































































006-0720-y


























httpsdoiorg101007s11274-016-2028-1







httpsdoiorg101128JB18793139-31502005























httpsdoiorg1010160300-9084(88)90206-4


























6736(00)04403-2



httpsdoiorg1010160022-2836(82)90515-0













671



























1425-x








httpsdoiorg101007s00253-011-3642-3



Bacteriology












445




httpsdoiorg101038s41598-017-02868-w
















httpsdoiorg101038s41598-019-42049-5









httpsdoiorg1021740929866527666200610133407

























httpsdoiorg101128AEM68115274-52802002

























httpsdoiorg101042








httpsdoiorg1010022211-546312808








httpsdoiorg1011861475-2859-13-S1-S3










httpsdoiorg101111j1574-695X201000710x





httpsdoiorg1010020471142727mb0903s62



httpsdoiorg1011861745-6150-3-38





























0132




httpsdoiorg101007978-1-4419-7692-5_3














httpsdoiorg1011862193-1801-2-133







































00176-4pdf




de Nuevo Leoacuten








1141











































httpsdoiorg101016S1359-6446(02)02498-4





















httpsdoiorg101038s41598-017-17908-8










3880 httpsdoiorg101128JCM4283877-38802004













































































CONTRAPORTADA

RESUMEN


























respectivamente






















PRESENTACIOacuteN



DE Escherichia coli

Presentado por













AGRADECIMIENTOS



























DEDICATORIA
















Gaby Quintanilla




Ernesto













mejoran enormemente

Carl Sagan



TABLA DE CONTENIDO

PORTADA I



CONTRAPORTADA IV

RESUMEN IV


AGRADECIMIENTOS VII

DEDICATORIA VIII



LISTA DE TABLAS XV




































35 Metas 29

















































ANEXOS 106




REFERENCIAS 109



LISTA DE FIGURAS























LISTA DE TABLAS






















LnqQ Lacticina Q
















kDA Kilo Dalton


microM Micromolar



AmyE Alfa-amilasa








FPB FP Base



nm Nanoacutemetros











microl Microlitros

microg Microgramos

degC Grados Celsius

h Hora

ml Mililitro

g Gramo



min Minuto


V Volts


pv Peso volumen



M Molar





mm Miliacutemetros



gfp Gen de GFP



AIP-I AIP clase I

AIP-II AIP clase 2

AIP-III AIP clase 3

AIP-IV AIP clase 4


Ala Alanina (A)

Arg Arginina (R)

Asn Asparagina (N)

Asp Asparato (D)


Gln Glutamina (Q)

Glu Glutamato (E)

Gly Glicina (G)

His Histidina (H)

Ile Isoleucina (I)

Leu Leucina (L)

Lys Lisina (K)

Met Metionina (M)


Pro Prolina (P)

Ser Serina (S)

Thr Treonina (T)


Tyr Tirosina (Y)

Val Valina (V)


AmyE Amilasa E








































(Podolsky 2018)

















































Sharma 2019)












































(Razvi et al 2009)






















2018)


resistentes


































































antibioacuteticos






































































(Fuqua et al 1994)












2002)






Bassler 2002)














Bassler 2002)





































































sentildeales



















































amp Kaznessis 2015)



















































Fliss 2010)


















































2020)























































2014)




et al 2018)




























































(Li et al 2013)








































































































fusioacuten




















































2018)















32 Hipoacutetesis








33 Objetivo General










MRSA







bacteriocina














35 Metas



























et al 2014)

















































2000)










de bacteriocina






















































6100)






































































AymELnqQ6xHis






















negativos





















LnqQ



























LnqQ






y SmbP-LnqQ







Sternberg 2015)


LnqQ
















































































residual






plasmiacutedico


punto final












primers)
































































































eliminado



























































amortiguadora



















los geles








































utilizado



















TEMED Merck 110732


























USO PERSONAL





















No especificado







Genie 2
































Meacutexico










































Pereira et al 2017)




























































(Figura 4)







































misma tesis
































agrC 1116 0407 282 0770 433

agrA 717 0402 272 0766 446

lnqQ 162 0532 333 0675 469

lnqB 240 0525 225 0735 400

lnqC 480 0518 231 0771 421

lnqE 1299 0511 259 0773 410

lnqD 678 0503 305 0777 431

lnqF 795 0521 245 0747 424















Rumbaugh 2014)







































2 (Ji et al 2005)













AgrA 0514 Soluble

LnqQ 0655 Soluble





LnqF 0607 Soluble

GFP 0592 Soluble


























AgrA 07 Citoplasma

LnqQ 07 Citoplasma





LnqF 07 Citoplasma

GFP 07 Citoplasma


citoplasma














alergenicidad






































respectivamente





























LnqQ6xHis (Tabla 6)

















HHHH

94



AymELnqQ6xHis












M Papi et al 2005)



AmyELnqQ


gtYang1983

(CAA234371)










gtNakazawa1986

(PTUE33)


gtEmori1988

(CAA306431)







LYPDDIEIRCNTFFQ

gtSakakibara1993

(PTUBE695)


gtKunst1997

(NP_3881862)
















VSKIKQILGIKHHHHHH





















































LnqQ-XhoI-3rsquo








Tamantildeo





155




LnqQ





















LnqQ






























y SmbP-LnqQ

































AmyELnqQ







LnqQ
















pETNL y pSmbP-LnqQ


a Control negativo





f DH5α + pETNL


h DH5α + pET30a(+)


j BL21 (DE3) + pET30a(+)




80
















pETNL y pSmbP-LnqQ



TBE 1 X



1 Control negativo












punto final


















































punto final





SnapGene







de PCR

























1 X



1 Control negativo


3 PCR de pETNL










1 X



1 Control negativo






























2021)




















con pETNL














cercano a 105 kDa















32


















Estados Unidos)


















Estados Unidos)



con pSmbP-LnqQ

























transformados















laboratorio










































































Unidos)


















Unidos)



proteiacutenas
































ID AmyE Pnl LnqQ

L 627 316 53

MW 6929711 3448665 589810

pI 561 877 1010

R(-) 69 21 2

R(+) 55 25 8

AI 6694 7636 12115

GRAVY -0648 -0291 +0300







L 660 360 94

MW 7279942 3947961 1053468

pI 588 922 1063

R(-) 69 22 2

R(+) 58 30 12

AI 6982 8061 11947

GRAVY -0553 -0205 +0426








L 49 45 37

MW 543498 520906 449332

pI 686 949 1061

R(-) 6 3 5

R(+) 6 9 11

AI 2388 4756 8946

GRAVY -0996 -0571 -0724







L 152 148 140 155

MW 1630268 1607675 1536102 1669471

pI 594 648 645 645

R(-) 26 23 25 22

R(+) 16 19 21 18

AI 5086 5878 1828 8323

GRAVY -0938 -0807 -0861 -0514













0514 (Tabla 15)





















































-2

-15

-1

-05

0

05

1

15

2

25

0 10 20 30 40 50 60

Valo

r

Posicioacuten

LnqQ

-3

-2

-1

0

1

2

3

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

N-AmyELnqQ








-3

-25

-2

-15

-1

-05

0

05

1

15

2

25

0 20 40 60 80 100 120 140 160

Va

lor

Posicioacuten

SmbP-LnqQ

-3

-25

-2

-15

-1

-05

0

05

1

15

2

25

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

Va

lor

Posicioacuten

SUMO-LnqQ























VpDef

Bin1b

LL37

LnqQ




















































productor




























ANEXOS


Publicaciones












































Edad 31 antildeos







REFERENCIAS
























4(3) 126ndash131





































































































httpsdoiorg1010160378-8741(83)90051-X






httpsdoiorg101007s10529-005-0936-5




httpsdoiorg101007s00284-017-1196-z





51969-1





httpsdoiorg101016B978-0-12-397169-200030-5









httpsdoiorg101038s41557-018-0174-9



httpsdoiorg101023A1014193329979









































Recuperado de


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lecturepdf









































httpsdoiorg101016s0140-6736(62)90520-2




013-0082-3









01017-7


















































































006-0720-y


























httpsdoiorg101007s11274-016-2028-1







httpsdoiorg101128JB18793139-31502005























httpsdoiorg1010160300-9084(88)90206-4


























6736(00)04403-2



httpsdoiorg1010160022-2836(82)90515-0













671



























1425-x








httpsdoiorg101007s00253-011-3642-3



Bacteriology












445




httpsdoiorg101038s41598-017-02868-w
















httpsdoiorg101038s41598-019-42049-5









httpsdoiorg1021740929866527666200610133407

























httpsdoiorg101128AEM68115274-52802002

























httpsdoiorg101042








httpsdoiorg1010022211-546312808








httpsdoiorg1011861475-2859-13-S1-S3










httpsdoiorg101111j1574-695X201000710x





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0132




httpsdoiorg101007978-1-4419-7692-5_3














httpsdoiorg1011862193-1801-2-133







































00176-4pdf




de Nuevo Leoacuten








1141











































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httpsdoiorg101038s41598-017-17908-8










3880 httpsdoiorg101128JCM4283877-38802004
























































































PRESENTACIOacuteN



DE Escherichia coli

Presentado por













AGRADECIMIENTOS



























DEDICATORIA
















Gaby Quintanilla




Ernesto













mejoran enormemente

Carl Sagan



TABLA DE CONTENIDO

PORTADA I



CONTRAPORTADA IV

RESUMEN IV


AGRADECIMIENTOS VII

DEDICATORIA VIII



LISTA DE TABLAS XV




































35 Metas 29

















































ANEXOS 106




REFERENCIAS 109



LISTA DE FIGURAS























LISTA DE TABLAS






















LnqQ Lacticina Q
















kDA Kilo Dalton


microM Micromolar



AmyE Alfa-amilasa








FPB FP Base



nm Nanoacutemetros











microl Microlitros

microg Microgramos

degC Grados Celsius

h Hora

ml Mililitro

g Gramo



min Minuto


V Volts


pv Peso volumen



M Molar





mm Miliacutemetros



gfp Gen de GFP



AIP-I AIP clase I

AIP-II AIP clase 2

AIP-III AIP clase 3

AIP-IV AIP clase 4


Ala Alanina (A)

Arg Arginina (R)

Asn Asparagina (N)

Asp Asparato (D)


Gln Glutamina (Q)

Glu Glutamato (E)

Gly Glicina (G)

His Histidina (H)

Ile Isoleucina (I)

Leu Leucina (L)

Lys Lisina (K)

Met Metionina (M)


Pro Prolina (P)

Ser Serina (S)

Thr Treonina (T)


Tyr Tirosina (Y)

Val Valina (V)


AmyE Amilasa E








































(Podolsky 2018)

















































Sharma 2019)












































(Razvi et al 2009)






















2018)


resistentes


































































antibioacuteticos






































































(Fuqua et al 1994)












2002)






Bassler 2002)














Bassler 2002)





































































sentildeales



















































amp Kaznessis 2015)



















































Fliss 2010)


















































2020)























































2014)




et al 2018)




























































(Li et al 2013)








































































































fusioacuten




















































2018)















32 Hipoacutetesis








33 Objetivo General










MRSA







bacteriocina














35 Metas



























et al 2014)

















































2000)










de bacteriocina






















































6100)






































































AymELnqQ6xHis






















negativos





















LnqQ



























LnqQ






y SmbP-LnqQ







Sternberg 2015)


LnqQ
















































































residual






plasmiacutedico


punto final












primers)
































































































eliminado



























































amortiguadora



















los geles








































utilizado



















TEMED Merck 110732


























USO PERSONAL





















No especificado







Genie 2
































Meacutexico










































Pereira et al 2017)




























































(Figura 4)







































misma tesis
































agrC 1116 0407 282 0770 433

agrA 717 0402 272 0766 446

lnqQ 162 0532 333 0675 469

lnqB 240 0525 225 0735 400

lnqC 480 0518 231 0771 421

lnqE 1299 0511 259 0773 410

lnqD 678 0503 305 0777 431

lnqF 795 0521 245 0747 424















Rumbaugh 2014)







































2 (Ji et al 2005)













AgrA 0514 Soluble

LnqQ 0655 Soluble





LnqF 0607 Soluble

GFP 0592 Soluble


























AgrA 07 Citoplasma

LnqQ 07 Citoplasma





LnqF 07 Citoplasma

GFP 07 Citoplasma


citoplasma














alergenicidad






































respectivamente





























LnqQ6xHis (Tabla 6)

















HHHH

94



AymELnqQ6xHis












M Papi et al 2005)



AmyELnqQ


gtYang1983

(CAA234371)










gtNakazawa1986

(PTUE33)


gtEmori1988

(CAA306431)







LYPDDIEIRCNTFFQ

gtSakakibara1993

(PTUBE695)


gtKunst1997

(NP_3881862)
















VSKIKQILGIKHHHHHH





















































LnqQ-XhoI-3rsquo








Tamantildeo





155




LnqQ





















LnqQ






























y SmbP-LnqQ

































AmyELnqQ







LnqQ
















pETNL y pSmbP-LnqQ


a Control negativo





f DH5α + pETNL


h DH5α + pET30a(+)


j BL21 (DE3) + pET30a(+)




80
















pETNL y pSmbP-LnqQ



TBE 1 X



1 Control negativo












punto final


















































punto final





SnapGene







de PCR

























1 X



1 Control negativo


3 PCR de pETNL










1 X



1 Control negativo






























2021)




















con pETNL














cercano a 105 kDa















32


















Estados Unidos)


















Estados Unidos)



con pSmbP-LnqQ

























transformados















laboratorio










































































Unidos)


















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proteiacutenas
































ID AmyE Pnl LnqQ

L 627 316 53

MW 6929711 3448665 589810

pI 561 877 1010

R(-) 69 21 2

R(+) 55 25 8

AI 6694 7636 12115

GRAVY -0648 -0291 +0300







L 660 360 94

MW 7279942 3947961 1053468

pI 588 922 1063

R(-) 69 22 2

R(+) 58 30 12

AI 6982 8061 11947

GRAVY -0553 -0205 +0426








L 49 45 37

MW 543498 520906 449332

pI 686 949 1061

R(-) 6 3 5

R(+) 6 9 11

AI 2388 4756 8946

GRAVY -0996 -0571 -0724







L 152 148 140 155

MW 1630268 1607675 1536102 1669471

pI 594 648 645 645

R(-) 26 23 25 22

R(+) 16 19 21 18

AI 5086 5878 1828 8323

GRAVY -0938 -0807 -0861 -0514













0514 (Tabla 15)





















































-2

-15

-1

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0

05

1

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2

25

0 10 20 30 40 50 60

Valo

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Posicioacuten

LnqQ

-3

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0

1

2

3

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N-AmyELnqQ








-3

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-2

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0

05

1

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2

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0 20 40 60 80 100 120 140 160

Va

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Posicioacuten

SmbP-LnqQ

-3

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15

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25

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

Va

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Posicioacuten

SUMO-LnqQ























VpDef

Bin1b

LL37

LnqQ




















































productor




























ANEXOS


Publicaciones












































Edad 31 antildeos







REFERENCIAS
























4(3) 126ndash131





































































































httpsdoiorg1010160378-8741(83)90051-X






httpsdoiorg101007s10529-005-0936-5




httpsdoiorg101007s00284-017-1196-z





51969-1





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013-0082-3









01017-7


















































































006-0720-y


























httpsdoiorg101007s11274-016-2028-1







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6736(00)04403-2



httpsdoiorg1010160022-2836(82)90515-0













671



























1425-x








httpsdoiorg101007s00253-011-3642-3



Bacteriology












445




httpsdoiorg101038s41598-017-02868-w
















httpsdoiorg101038s41598-019-42049-5









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httpsdoiorg101128AEM68115274-52802002

























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httpsdoiorg1011861475-2859-13-S1-S3










httpsdoiorg101111j1574-695X201000710x





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0132




httpsdoiorg101007978-1-4419-7692-5_3














httpsdoiorg1011862193-1801-2-133







































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de Nuevo Leoacuten








1141











































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httpsdoiorg101038s41598-017-17908-8










3880 httpsdoiorg101128JCM4283877-38802004













































































AGRADECIMIENTOS



























DEDICATORIA
















Gaby Quintanilla




Ernesto













mejoran enormemente

Carl Sagan



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CONTRAPORTADA IV

RESUMEN IV


AGRADECIMIENTOS VII

DEDICATORIA VIII



LISTA DE TABLAS XV




































35 Metas 29

















































ANEXOS 106




REFERENCIAS 109



LISTA DE FIGURAS























LISTA DE TABLAS






















LnqQ Lacticina Q
















kDA Kilo Dalton


microM Micromolar



AmyE Alfa-amilasa








FPB FP Base



nm Nanoacutemetros











microl Microlitros

microg Microgramos

degC Grados Celsius

h Hora

ml Mililitro

g Gramo



min Minuto


V Volts


pv Peso volumen



M Molar





mm Miliacutemetros



gfp Gen de GFP



AIP-I AIP clase I

AIP-II AIP clase 2

AIP-III AIP clase 3

AIP-IV AIP clase 4


Ala Alanina (A)

Arg Arginina (R)

Asn Asparagina (N)

Asp Asparato (D)


Gln Glutamina (Q)

Glu Glutamato (E)

Gly Glicina (G)

His Histidina (H)

Ile Isoleucina (I)

Leu Leucina (L)

Lys Lisina (K)

Met Metionina (M)


Pro Prolina (P)

Ser Serina (S)

Thr Treonina (T)


Tyr Tirosina (Y)

Val Valina (V)


AmyE Amilasa E








































(Podolsky 2018)

















































Sharma 2019)












































(Razvi et al 2009)






















2018)


resistentes


































































antibioacuteticos






































































(Fuqua et al 1994)












2002)






Bassler 2002)














Bassler 2002)





































































sentildeales



















































amp Kaznessis 2015)



















































Fliss 2010)


















































2020)























































2014)




et al 2018)




























































(Li et al 2013)








































































































fusioacuten




















































2018)















32 Hipoacutetesis








33 Objetivo General










MRSA







bacteriocina














35 Metas



























et al 2014)

















































2000)










de bacteriocina






















































6100)






































































AymELnqQ6xHis






















negativos





















LnqQ



























LnqQ






y SmbP-LnqQ







Sternberg 2015)


LnqQ
















































































residual






plasmiacutedico


punto final












primers)
































































































eliminado



























































amortiguadora



















los geles








































utilizado



















TEMED Merck 110732


























USO PERSONAL





















No especificado







Genie 2
































Meacutexico










































Pereira et al 2017)




























































(Figura 4)







































misma tesis
































agrC 1116 0407 282 0770 433

agrA 717 0402 272 0766 446

lnqQ 162 0532 333 0675 469

lnqB 240 0525 225 0735 400

lnqC 480 0518 231 0771 421

lnqE 1299 0511 259 0773 410

lnqD 678 0503 305 0777 431

lnqF 795 0521 245 0747 424















Rumbaugh 2014)







































2 (Ji et al 2005)













AgrA 0514 Soluble

LnqQ 0655 Soluble





LnqF 0607 Soluble

GFP 0592 Soluble


























AgrA 07 Citoplasma

LnqQ 07 Citoplasma





LnqF 07 Citoplasma

GFP 07 Citoplasma


citoplasma














alergenicidad






































respectivamente





























LnqQ6xHis (Tabla 6)

















HHHH

94



AymELnqQ6xHis












M Papi et al 2005)



AmyELnqQ


gtYang1983

(CAA234371)










gtNakazawa1986

(PTUE33)


gtEmori1988

(CAA306431)







LYPDDIEIRCNTFFQ

gtSakakibara1993

(PTUBE695)


gtKunst1997

(NP_3881862)
















VSKIKQILGIKHHHHHH





















































LnqQ-XhoI-3rsquo








Tamantildeo





155




LnqQ





















LnqQ






























y SmbP-LnqQ

































AmyELnqQ







LnqQ
















pETNL y pSmbP-LnqQ


a Control negativo





f DH5α + pETNL


h DH5α + pET30a(+)


j BL21 (DE3) + pET30a(+)




80
















pETNL y pSmbP-LnqQ



TBE 1 X



1 Control negativo












punto final


















































punto final





SnapGene







de PCR

























1 X



1 Control negativo


3 PCR de pETNL










1 X



1 Control negativo






























2021)




















con pETNL














cercano a 105 kDa















32


















Estados Unidos)


















Estados Unidos)



con pSmbP-LnqQ

























transformados















laboratorio










































































Unidos)


















Unidos)



proteiacutenas
































ID AmyE Pnl LnqQ

L 627 316 53

MW 6929711 3448665 589810

pI 561 877 1010

R(-) 69 21 2

R(+) 55 25 8

AI 6694 7636 12115

GRAVY -0648 -0291 +0300







L 660 360 94

MW 7279942 3947961 1053468

pI 588 922 1063

R(-) 69 22 2

R(+) 58 30 12

AI 6982 8061 11947

GRAVY -0553 -0205 +0426








L 49 45 37

MW 543498 520906 449332

pI 686 949 1061

R(-) 6 3 5

R(+) 6 9 11

AI 2388 4756 8946

GRAVY -0996 -0571 -0724







L 152 148 140 155

MW 1630268 1607675 1536102 1669471

pI 594 648 645 645

R(-) 26 23 25 22

R(+) 16 19 21 18

AI 5086 5878 1828 8323

GRAVY -0938 -0807 -0861 -0514













0514 (Tabla 15)





















































-2

-15

-1

-05

0

05

1

15

2

25

0 10 20 30 40 50 60

Valo

r

Posicioacuten

LnqQ

-3

-2

-1

0

1

2

3

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

N-AmyELnqQ








-3

-25

-2

-15

-1

-05

0

05

1

15

2

25

0 20 40 60 80 100 120 140 160

Va

lor

Posicioacuten

SmbP-LnqQ

-3

-25

-2

-15

-1

-05

0

05

1

15

2

25

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

Va

lor

Posicioacuten

SUMO-LnqQ























VpDef

Bin1b

LL37

LnqQ




















































productor




























ANEXOS


Publicaciones












































Edad 31 antildeos







REFERENCIAS
























4(3) 126ndash131





































































































httpsdoiorg1010160378-8741(83)90051-X






httpsdoiorg101007s10529-005-0936-5




httpsdoiorg101007s00284-017-1196-z





51969-1





httpsdoiorg101016B978-0-12-397169-200030-5









httpsdoiorg101038s41557-018-0174-9



httpsdoiorg101023A1014193329979









































Recuperado de


5-0037pdf




lecturepdf









































httpsdoiorg101016s0140-6736(62)90520-2




013-0082-3









01017-7


















































































006-0720-y


























httpsdoiorg101007s11274-016-2028-1







httpsdoiorg101128JB18793139-31502005























httpsdoiorg1010160300-9084(88)90206-4


























6736(00)04403-2



httpsdoiorg1010160022-2836(82)90515-0













671



























1425-x








httpsdoiorg101007s00253-011-3642-3



Bacteriology












445




httpsdoiorg101038s41598-017-02868-w
















httpsdoiorg101038s41598-019-42049-5









httpsdoiorg1021740929866527666200610133407

























httpsdoiorg101128AEM68115274-52802002

























httpsdoiorg101042








httpsdoiorg1010022211-546312808








httpsdoiorg1011861475-2859-13-S1-S3










httpsdoiorg101111j1574-695X201000710x





httpsdoiorg1010020471142727mb0903s62



httpsdoiorg1011861745-6150-3-38





























0132




httpsdoiorg101007978-1-4419-7692-5_3














httpsdoiorg1011862193-1801-2-133







































00176-4pdf




de Nuevo Leoacuten








1141











































httpsdoiorg101016S1359-6446(02)02498-4





















httpsdoiorg101038s41598-017-17908-8










3880 httpsdoiorg101128JCM4283877-38802004












































































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