2005 Katedra molekulárnej biológie

Andrej Ficek

PolymorfizmPolymorfizmusus ľudskej DNAľudskej DNA

Genetický polymorfizmus

Definícia (Ford): Geneticky podmienený znak s najmenej dvomi diskontinuitnými variantmi v jednej populácii, pričom početnosť zriedkavejšieho variantu je vyššia ako 1%

Vylučuje: negenetické znaky, kontinuitnú variabilitu, polytypizmy, zriedkavé znaky (dedičné choroby)

Typy polymorfizmu:– morofologický – funkčný– serologický– biochemický– DNA: je najčastejší, lebo väčšina polymorfizmov

DNA nemá fenotypový prejav

Typy DNA polymorfizmov

Bodový polymorfizmus - substitúcie jednotlivých báz (SNP – single nucleotide polymorphism)

Variabilný počet tandemových repetícií– mikrosatelity (STR – short tandem repeat)– minisatelity (VNTR – variable number of tandem

repeats)

Prítomnosť/neprítomnosť sekvencie (Alu, L1 a i.) na špecifickom mieste (indel)

Bodový polymorfizmus (Single Nucleotide Polymorphism,

SNP) .... CTCGACTTT......

.... CTCGTCTTT......

Početnosť: 1 : 1000 bp; v genóme cca 3 mil., Výskyt: intróny, nekódujúce oblasti (väčšinou žiadny fenotyp); len asi 50 000 v kódujúcich sekvenciách génovVznik: mutácia + genetický drift; nepoznáme pôvodný stav, len nepriamo (zo sekvencie u primátov);Mutačná rýchlosť nízka: µ = 10-7 až 10-9 (najčastejšie v dinukl. CpG)Ak zámena spôsobí vznik/zánik restrikčného miesta, je možná analýza tohto polymorfizmu metódou RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)

......GGTATC..... ......GGTACC..... - vznik cieľového miesta pre restr. endonukleázu

KpnI

Detekcia SNP polymorfizmuRFLP (restriction fragment lenght polymorphism)

- restrikčné štiepenie genomickej DNA s následným Southern blottingom (dni)

- PCR amplifikácia s následným restrikčným štiepením (deň)DNA chip analýza až 100 tisíc SNP v jednej analýze

sonda

Polymorfizmus variabilného počtu tandemových opakovaní

....(TGAC)(TGAC)(TGAC)....... ....(TGAC)(TGAC)(TGAC)(TGAC)(TGAC).........

Detekcia PCR amplifikáciou konkrétneho polymorfizmu a separáciou v géli

Polymorfizmus variabilného počtu tandemových repetícií

Minisatelity (VNTR)Dĺžka základnej repetície >6bpPočet opakovaní repetície 10 – 100 (1000)Výskyt preferenčne v telomérických oblastiach (najmä bohaté na GC páry)Odhadovaný počet: cca 104

Jednoduchá detekcia: Southern, PCRVznik nových alel: nehomologický crossoverMutačná frekvencia: vysoká, až 10-3

Využitie: obmedzené; individuálna identifikáciaBiologický význam: neznámy, asi selfish DNAŠpec. prípad: minisatelit (TTAGGG)n - teloméry

Mikrosatelity (STR)Dĺžka základnej repetície 2-6bpPočet opakovaní repetície 1 – 100 Výskyt rovnomerne po genómeOdhadovaný počet rádovo 105

Jednoduchá detekcia: PCRVznik nových alel: replikačné chybyMutačná frekvencia: cca 10-3

Využitie: rozsiahle; individuálna identifikácia, nepriama DNA diagnostika, identifikácia génovBiologický význam: neznámy, asi selfish DNAVýnimka: expanzie trinukleotidov u niektorých ochorení Najčastejší: „CA-repeat“ (asi 50 000 x v genóme)

Inzerčno-delečný polymorfizmus (indel)

Indel od 1 bp po niekoľko Mbinzercie Alu, L1 – retrotranspozíciaVeľmi zriedkavý jav: unikátne udalosti Poznáme pôvodný stav (bez inzercie)Inzercie (Alu, L1) aj do kódujúcich sekvencií → patológia

Praktické využitie DNA polymorfizmov

identifikácia osôb a určovanie paternity,

identifikácia neznámych génov zodpovedných za genetické ochorenia,

nepriama dg. monogénnych ochorení,

evolučné štúdie (polymorfizmy mtDNA a Y-chrom. DNA

Individuálna identifikácia „DNA fingerprint“

Alec Jeffreys, 1984 Restrikčné štiepenie genomickej DNA → elektroforetická separácia → Southernov blotting s VNTR próbou (GGGCAGGAXG)

PCR amplifikácia VNTR polymorfizmu

analýza konkrétneho polymorfizmu/lokusu pomocou špecifických primerov

primery

Multiplex PCRAmplifikácia viacerých lokusov v jednej PCR reakcii

vľavo - separácia na akrylamidovom géli a vizualizácia striebrom

vpravo - fluorescenčné značenie polymorfizmov a kapilárová elektroforéza

Mikrosatelity variabilita v populácii Genotypy troch ľudí v štyroch STR polymorfizmoch

(fluorescenčné značenie a kapilárová elektroforéza)

Jedinci

1.

2.

3.

D8S1179 D21S11 D7S820 CSF1PO

Identifikácia osôb Multiplex PCR 16 fluorescenčne značných mikrosatelitových polymorfizmov Pravdepodobnosť identity dvoch náhodných jedincov 10-17

Polymorfizmy Y-chromozómu a mtDNA pri štúdiu evolúcie

H.sapiens

Mt a Y-DNA nepodstupuje rekombinácii, polymorfizmy sú prenášané spolu a tvoria haplotyp so samostatnou históriou,Dedia sa uniparentálne, poskytujú možnosť sledovať individuálne maternálne/paternálne línie – migrácie ľudských skupín,Mutačná rýchlosť ideálna pre relatívne krátku evolúciu anat. mod. človeka, umožnuje datovanie recentných udalostí, osídľovanie kontinentov (SNP, in-del aj STR polymorfizmy),

Štruktúra mtDNA

kruhová 2-vláknová molekula, 16 569 bp

predstavuje 1/200 000 veľkosti jadrového genómu

niekoľko 100-1000 kópií na bunku

Kódujúce oblasti - 93 % 37 tesne usporiadaných génovKontrolná oblasť - 7 % približne 1200bp hypervariabilné segmenty HVSI (CRS:np 16024-16383) a HVSII (np 57-372)

Štruktúra chromozómu Y

60 Mb dlhá lineárna molekula DNA

95% predstavuje NRY/NRPY – non-recombining region/portion of Y)

Heterochromatín: 6 rôznych typov sekvencii v tandemových zoskupeniach

Euchromatín: X-transponované, X-degenerované a amplikonické segmenty

156 transkripčných jednotiek, 27 proteínových rodín (12 vo všetkých tkanivách, 11 špecifických pre testes)

Polymorfizmy mt a Y-chr. DNA

Polymorfizmy mitochondriálnej DNA

SNP a in-del polymorfizmy v kódujúcej oblasti (definujú haploskupinu) a kontrolnej oblasti (HVSI a II – definujú haplotyp)

Celková mutačná rýchlosť je asi 10x vyššia ako v jadrovej DNA, výrazne varíruje v rámci molekuly

Synonymické pozície a oblasti HVSI,II sa menia 5-10x rýchlejšie (1,4x10-6/ bp/gen.) ako nesynonymické nps génových oblastí, tRNA a rRNA gény (3,4x10-7/bp/gen.)

„mutation hot-spots“ - spätné a paralelné mutácie (homoplázia)

Polymorfizmy na Y-chromozóme

Bialelické markery (binárne)

SNP, inzerčno-delečné polymorfizmy, vyskytli sa v evolúcii len raz – definujú jednotlivé haploskupiny

Nízka mutačná rýchlosť 10-8/báza/ generácia)

Multialelické markery

Mikrosatelity - STR polymorfizmy (menej ako 10bp) a minisatelity - VNTR polymorfizmy (10-100bp)

Vysoká mutačná rýchlosť (6,9 x 10-

4/ generáciu)

Počet opakovaní – definuje haplotyp

stanovenie diverzity, odhad veku haploskupiny

Prenos mtDNA, Y-chromozálnej DNA

a autozomálnej DNAmtDNA a Y-DNA: žiadna rekombinácia

prenos „en bloc“ cez generácie

Každý má práve jedného Y-predka a jedného mt predka v každej predošlej generácii

Pred Pred 55 generáciami mal každý jedinec 2 generáciami mal každý jedinec 255 = = 32 predkov, z nich len od jedného zdedil Y, 32 predkov, z nich len od jedného zdedil Y, od jedného mtDNA, ale od všetkých od jedného mtDNA, ale od všetkých autozomálnu DNAautozomálnu DNA

Otec

Dieťa

Matka

Koalescencia línií mtDNA a Y-DNA

„mitochondriálna Eva“Možno nájsť spoločného predka pre členov populácie, pretožev každej generácii dôjde k zániku a naopak k zmnoženiu niektorých línií,a po čase v rovnovážnej populácii prevládne mt/Y DNA odvodené od jedného spoločného predka

Rozšírenie H. sapiens – osídľovanie kontinentov

Hypotéza „Out of Africa“

spoločný predok všetkých dnešných ľudí žil v Afrike približne pred 150 000 rokmi,

posledný spoločný predok pre africké a neafrické mtDNA Y-DNA žil pred asi 100 000 rokmi – migrácia anatomicky moderných do Ázie a Európy pred cca 60 – 40 tis. rokmi,

nahradenie populácií H. erectus (H. ergaster, H. heidelbergensis, H. e. javensis atď) moderným H. sapiens afrického pôvodu,

celá súčasná variabilita mtDNA je najväčšia medzi africkými populáciami,

všetky ostatné mtDNA typy sú odvodené od pôvodných haploskupín nájdených v Afrike.

Osídlovanie kontinentov – podľa mtDNA Y-DNA