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P r o c . N a t i A c a d . S c i . U S AV o l . 8 0 , p p . 3 0 0 5 - 3 0 0 9 , M a y 1 9 8 3G e n e t i c s

O r g a n i z a t i o n a n d e x p r e s s i o n o f R h i z o b i u m m e l i l o t i n i t r o g e nf i x a t i o n g e n e s -( n i f g e n e / T n 5 m u t a g e n e s i s / n u c l e a s e S I m a p p i n g )

D A V I D C O R B I N , L E S L I E B A R R A N * , AND G A R Y D I T T AD e p a r t m e n t o f B i o l o g y , U n i v e r s i t y o f C a l i f o r n i a a t S a n D i e g o , L a J o l l a , C a l i f o r n i a 9 2 0 9 3C o m m u n i c a t e d b y D o n a l d R . H e l i n s k i , F e b r u a r y 9 , 1 9 8 3A B S T R A C T T h e b o u n d a r i e s o f a n i f g e n e c l u s t e r i n R h i z o -b i u m m e l i l o t i w e r e d e t e r m i n e d b y T n 5 m u t a g e n e s i s . T h e s e g e n e sa r e c l u s t e r e d w i t h i n a 1 4 - t o 1 5 - k i l o b a s e ( k b ) r e g i o n t h a t i n c l u d e st h e n i t r o g e n a s e s t r u c t u r a l g e n e s . S e q u e n c e s w i t h i n 1 0 k b o n e i t h e rs i d e o f t h i s r e g i o n a r e d e v o i d o f s y m b i o t i c a l l y e s s e n t i a l - g e n e f u n c -t i o n . RNA b l o t a n a l y s i s i d e n t i f i e d a 5 - t o 6 - k b t r a n s c r i p t t h a t c o r -r e s p o n d s t o t h e n i t r o g e n a s e s t r u c t u r a l g e n e o p e r o n . T h e 5 ' e n do f t h i s t r a n s c r i p t a n d i t s p o l a r i t y w e r e d e t e r m i n e d b y n u c l e a s e S im a p p i n g . T h e 5 ' e n d o f a n o t h e r n i f t r a n s c r i p t w a s a l s o i d e n t i f i e db y n u c l e a s e S I m a p p i n g . T h e p r o m o t e r r e g i o n s f o r t h e s e t w o n i ft r a n s c r i p t s c o n t r o l t r a n s c r i p t i o n i n d i v e r g e n t d i r e c t i o n s a n d a r es e p a r a t e d b y 1 . 9 k b o f s y m b i o t i c a l l y u n e s s e n t i a l D N A . O n e T n 5i n s e r t i o n w i t h i n t h e n i t r o g e n a s e o p e r o n d i d n o t c r e a t e a p o l a r m u -t a t i o n . T h e i m p l i c a t i o n s o f t h i s f i n d i n g a n d t h e o v e r a l l e m e r g i n gp i c t u r e o f t h e g e n e t i c o r g a n i z a t i o n o f t h i s n i f r e g i o n a r e d i s c u s s e d .G r a m - n e g a t i v e s o i l b a c t e r i a o f t h e g e n u s R h i z o b i u m h a v e t h eu n i q u e a b i l i t y t o f o r m n i t r o g e n - f i x i n g n o d u l e s o n t h e r o o t s o fl e g u m i n o u s p l a n t s . T h i s i s a c o m p l e x p r o c e s s i n v o l v i n g r e c -o g n i t i o n a n d i n v a s i o n o f t h e a p p r o p r i a t e l e g u m e b y t h e b a c -t e r i a , s t i m u l a t i o n o f p l a n t c e l l d i v i s i o n , m u l t i p l i c a t i o n a n d d i f -f e r e n t i a t i o n o f b a c t e r i a w i t h i n r o o t c o r t i c a l c e l l s i n t o m o r -p h o l o g i c a l l y a l t e r e d f o r m s c a l l e d b a c t e r o i d s , a n d t h e r e d u c t i o no f a t m o s p h e r i c n i t r o g e n t o a m m o n i a , w h i c h i s t h e n a s s i m i l a t e db y t h e p l a n t ( 1 , 2 ) .M u t a n t s o f R h i z o b i u m t h a t a r e d e f e c t i v e a t v a r i o u s s t a g e s o fs y m b i o t i c d e v e l o p m e n t m a y b e p h e n o t y p i c a l l y c a t e g o r i z e d a se i t h e r N o d - o r F i x - ( 3 , 4 ) . N o d - m u t a n t s a r e b l o c k e d p r i o r t on o d u l e m e r i s t e m i n d u c t i o n s o t h a t n o d u l e s a r e n o t f o r m e d . F i x -m u t a n t s f o r m v i s i b l e n o d u l e s , b u t t h e s e n o d u l e s d o n o t f i x e n o u g hn i t r o g e n t o s u p p o r t n o r m a l p l a n t g r o w t h . I n s o m e r h i z o b i a , N o da n d F i x g e n e s a r e c l o s e l y l i n k e d a n d r e s i d e o n l a r g e i n d i g e n o u sp l a s m i d s ( 5 - 8 ) .F i x g e n e s h a v e b e e n s h o w n t o b e c l u s t e r e d a r o u n d a r e g i o no f DNA t h a t e n c o d e s t h e t h r e e s t r u c t u r a l p o l y p e p t i d e s o f t h ek e y n i t r o g e n f i x a t i o n e n z y m e , n i t r o g e n a s e ( 9 , 1 0 ) . P r e l i m i n a r yc h a r a c t e r i z a t i o n o f t h i s s y m b i o t i c a l l y e s s e n t i a l g e n e c l u s t e r h a ss u g g e s t e d t h a t t h e r e a r e s e v e r a l o p e r o n s ( 9 , 1 0 ) a n d a t l e a s t s o m eo f t h e g e n e s a r e t r a n s c r i b e d o n l y d u r i n g s y m b i o s i s ( 9 ) . T h i s s i t -u a t i o n i s s i m i l a r t o t h a t f o u n d i n t h e w e l l - s t u d i e d n i t r o g e n - f i x -i n g e n t e r i c b a c t e r i u m K l e b s i e l l a p n e u m o n i a e i n w h i c h 1 7 n i fg e n e s , i n c l u d i n g n i t r o g e n a s e , a r e s p e c i f i c a l l y e x p r e s s e d u n d e rn i t r o g e n - l i m i t e d a n a e r o b i c g r o w t h ( 1 1 ) . T h e s e g e n e s a r e t i g h t l yc l u s t e r e d i n s e v e n o r e i g h t o p e r o n s a l o n g a 2 4 - k i l o b a s e ( k b ) s e g -m e n t o f t h e g e n o m e a n d e n c o d e e n z y m e s i n v o l v e d i n t h e b i o -s y n t h e s i s a n d p r o c e s s i n g o f n i t r o g e n a s e p e p t i d e s , s y n t h e s i s o fa n i r o n / m o l y b d e n u m c o f a c t o r n e c e s s a r y f o r n i t r o g e n a s e a c t i v -i t y , t r a n s p o r t o f e l e c t r o n s t o n i t r o g e n a s e , a n d r e g u l a t i o n o f t h eo p e r o n s ( s e e r e f . 1 2 f o r r e v i e w ) . B i o c h e m i c a l f u n c t i o n s f o r n i fT h e p u b l i c a t i o n c o s t s o f t h i s a r t i c l e w e r e d e f r a y e d i n p a r t b y p a g e c h a r g ep a y m e n t . T h i s a r t i c l e m u s t t h e r e f o r e b e h e r e b y m a r k e d " a d v e r t i s e -m e n t " i n a c c o r d a n c e w i t h 1 8 U . S . C . 1 7 3 4 s o l e l y t o i n d i c a t e t h i s f a c t .

g e n e s o t h e r t h a n n i t r o g e n a s e h a v e n o t b e e n d e t e r m i n e d i n R h i -z o b i u m .I n t h i s r e p o r t , w e d e s c r i b e e x p e r i m e n t s i n w h i c h t r a n s p o s o nm u t a g e n e s i s w a s u s e d t o d e f i n e t h e l i m i t s o f t h i s c l u s t e r o f R h i -z o b i u m m e l i l o t i n i f g e n e s . We s h o w t h a t t h e r e g i o n i s l i m i t e dt o a 1 4 - t o 1 5 - k b s e g m e n t o f t h e g e n o m e . s u r r o u n d i n g t h e n i -t r o g e n a s e g e n e s . I n a d d i t i o n , w e h a v e d e f i n e d t w o - n i f p r o m o t e rr e g i o n s b y m a p p i n g t h e 5 ' e n d s o f t w o d i v e r g e n t l y t r a n s c r i b e dR N A s . O n e o f t h e s e p r o m o t e r s c o n t r o l s t h e s y n t h e s i s o f a 5 - t o6 - k b t r a n s c r i p t t h a t c o v e r s t h e e n t i r e n i t r o g e n a s e s t r u c t u r a l g e n er e g i o n .

M A T E R I A L S AND METHODSS t r a i n s a n d P l a s m i d s . R . m e l i l o t i 1 0 2 F 3 4 w a s p r o v i d e d b yN i t r a g i n , M i l w a u k e e , W I . T h e E s c h e r i c h i a c o l i s t r a i n s u s e d w e r eH B 1 0 1 ( p r o l e u t h i l a c y e n d o I r e c A h s d R h s d M S t r r ) a n dH B 1 0 1 : : T n 5 . R e c o m b i n a n t p l a s m i d s f r o m o u r R . m e l i l o t i g e n eb a n k c a r r y l a r g e s e g m e n t s o f t h e n i f r e g i o n c l o n e d i n t o t h e b r o a dh o s t r a n g e c l o n i n g v e c t o r p R K 2 9 0 ( 9 , 1 3 ) . C l o n e d s e q u e n c e sf l a n k i n g t h o s e p r e v i o u s l y o b t a i n e d w e r e i d e n t i f i e d b y o v e r l a p -p i n g h o m o l o g y .T n 5 M u t a g e n e s i s . T n 5 i n s e r t i o n s i n t o r e c o m b i n a n t p l a s m i d sw e r e o b t a i n e d a s d e s c r i b e d ( 1 4 ) e x c e p t t h a t H B 1 0 1 : : T n 5 w a st h e s o u r c e o f t h e t r a n s p o s o n . M u t a t e d s e q u e n c e s w e r e r e c o m -b i n e d i n t o t h e R h i z o b i u m g e n o m e b y a m a r k e r - e x c h a n g e p r o -c e d u r e ( 1 5 ) a s d e s c r i b e d ( 9 ) . T h e f i d e l i t y o f t h e e x c h a n g e e v e n t sw a s c o n f i r m e d b y p r o b i n g S o u t h e r n b l o t s o f r e s t r i c t i o n e n z y m ed i g e s t s o f t h e m u t a t e d g e n o m i c D N A s w i t h c l o n e d h o m o l o g o u sDNA l a c k i n g T n 5 . I n e v e r y c a s e , t h e r e s t r i c t i o n p a t t e r n w a sa l t e r e d a s e x p e c t e d f o r a T n 5 i n s e r t i o n a t t h e m a p p e d p o s i t i o n .T h e s y m b i o t i c p h e n o t y p e o f e a c h m u t a t e d R h i z o b i u m s t r a i nw a s d e t e r m i n e d b y m o n i t o r i n g p l a n t g r o w t h a n d a c e t y l e n e r e -d u c t i o n ( 1 6 ) a s d e s c r i b e d ( 9 ) .N o d u l e RNA I s o l a t i o n . N o d u l e s w e r e o b t a i n e d f r o m a l f a l f ar o o t s ( M e d i c a g o s a t i v a c v . M o a p a ) 4 - 6 w k a f t e r g e r m i n a t i o n ,a n d 5 0 0 m g w a s p u l v e r i z e d i n l i q u i d n i t r o g e n w i t h a m o r t a r a n dp e s t l e . T h e r e s u l t i n g p o w d e r w a s t r a n s f e r r e d t o 5 m l o f 0 . 5 M

m a n n i t o l / 2 0 mM N a O A c , pH 5 . 5 / 1 mM EDTA c o n t a i n i n g 0 . 1 %d i e t h y l p y r o c a r b o n a t e . T h i s s u s p e n s i o n w a s h o m o g e n i z e d a t l o ws p e e d a t 4 0 C i n a P o t t e r - E l v e h j e m t i s s u e g r i n d e r . T h e h o -m o g e n a t e w a s i m m e d i a t e l y p o u r e d i n t o 1 0 m l o f 0 . 5 M m a n -n i t o l / 2 0 mM s o d i u m a c e t a t e , p H 5 . 5 / 1 mM E D T A / 3 % N a -D o d S O 4 t h a t h a d b e e n p r e h e a t e d t o 1 0 0 0 C . T h e m i x t u r e w a sh e a t e d a t 1 0 0 ' C f o r 2 - 5 m i n , u n t i l t h e l y s a t e b e c a m e n o n v i s -c o u s . I t w a s t h e n e x t r a c t e d w i t h p h e n o l a n d C H C l 3 / i s o a m y la l c o h o l ( 2 4 : 1 ) , a n d RNA w a s p r e c i p i t a t e d a s d e s c r i b e d ( 9 ) . R e -s i d u a l DNA w a s r e m o v e d b y p a s s i n g t h e p r e p a r a t i o n t h r o u g hA b b r e v i a t i o n s : k b , k i l o b a s e ( s ) ; M o p s , 3 - ( N - m o r p h o l i n o ) p r o p a n e s u l f o n i ca c i d ; b p , b a s e p a i r ( s ) .* P r e s e n t a d d r e s s : C h e m i c a l a n d B i o l o g i c a l R e s e a r c h I n s t . , A g r i c u l t u r eC a n a d a , O t t a w a , O n t . , K l A O C 6 .

3 0 0 5

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P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A 8 0 ( 1 9 8 3 )a n i t r o c e l l u l o s e c o l u m n ( 9 ) o r b y p e l l e t i n g i t t h r o u g h a C s C l s o -l u t i o n ( 1 7 ) .H y b r i d i z a t i o n P r o b e s . DNA u s e d t o p r o b e R N A o r S o u t h e r nb l o t s w a s l a b e l e d w i t h 3 2 P b y n i c k - t r a n s l a t i o n ( 1 8 ) . F r a g m e n t st o b e 5 ' - e n d l a b e l e d w e r e t r e a t e d w i t h c a l f i n t e s t i n a l a l k a l i n ep h o s p h a t a s e t o r e m o v e 5 ' p h o s p h a t e r e s i d u e s a n d t h e n l a b e l e dw i t h [ y - 3 2 P ] A T P ( 5 , 0 0 0 C i / m m o l ; 1 C i = 3 7 G B q ) b y u s i n gp o l y n u c l e o t i d e k i n a s e . F r a g m e n t s w i t h 5 ' o v e r h a n g s w e r e 3 ' -e n d l a b e l e d b y u s i n g [ a - 3 2 P ] d N T P s ( 3 , 0 0 0 C i / m m o l ) a n d t h eK l e n o w f r a g m e n t o f DNA p o l y m e r a s e I .R N A B l o t A n a l y s i s . F i v e m i c r o g r a m s o f t o t a l n o d u l e RNAw a s s u s p e n d e d i n 2 0 A . l o f 2 0 mM 3 - ( N - m o r p h o l i n o ) p r o -p a n e s u l f o n i c a c i d ( M o p s ) , p H 8 / 5 mM N a O A c / 1 mM E D T A /5 0 % f o r m a m i d e ( d e i o n i z e d w i t h A m b e r l i t e M B - 1 i o n e x c h a n g er e s i n ) / 6 % f o r m a l d e h y d e a n d h e a t e d a t 6 0 ' C f o r 5 m i n . T h e s u s -p e n s i o n w a s c o o l e d o n i c e , 2 t t l o f 2 5 % F i c o l l / 0 . 3 % b r o m -p h e n o l b l u e / 0 . 3 % x y l e n e c y a n o l w a s a d d e d , a n d t h e s a m p l ew a s e l e c t r o p h o r e s e d t h r o u g h a v e r t i c a l 1 % a g a r o s e / 6 % f o r m -a l d e h y d e g e l f o r m e d i n 2 0 mM M o p s , p H 8 / 5 mM N a O A c / 1mM E D T A . O n e l a n e w a s s t a i n e d w i t h e t h i d i u m b r o m i d e t ov i s u a l i z e t h e r i b o s o m a l R N A s t h a t s e r v e d a s m o l e c u l a r s i z es t a n d a r d s ( 1 9 ) . T h e r e m a i n d e r o f t h e g e l w a s w a s h e d f o r 5 m i nw i t h H 2 0 a n d f o r 5 m i n w i t h 3 . 0 M N a C l / 0 . 3 M N a c i t r a t e a n dt r a n s f e r r e d t o n i t r o c e l l u l o s e b y s t a n d a r d b l o t t i n g t e c h n i q u e s ( 2 0 ) .T h e s e b l o t s w e r e h y b r i d i z e d t o n i c k - t r a n s l a t e d p r o b e s a s d e -s c r i b e d ( 9 ) .N u c l e a s e S 1 M a p p i n g . T h i s t e c h n i q u e h a s b e e n d e s c r i b e db y B e r k a n d S h a r p ( 2 1 ) a n d a l l o w s t h e p h y s i c a l m a p p i n g o f R NAt r a n s c r i p t s o n a s p e c i f i c DNA f r a g m e n t . DNA f r a g m e n t s a r ee n d l a b e l e d a n d h y b r i d i z e d t o RNA u n d e r c o n d i t i o n s t h a t a l l o wR N A - D N A h y b r i d s t o f o r m b u t p r e v e n t DNA-DNA h y b r i d i z a -t i o n ( 2 2 , 2 3 ) . W h e n a RNA t r a n s c r i p t t h a t o v e r l a p s t h e l a b e l e de n d o f o n e s t r a n d o f t h e f r a g m e n t h y b r i d i z e s t o t h e p r o b e , t h a tp o r t i o n o f t h e f r a g m e n t h y b r i d i z e d w i l l b e r e s i s t a n t t o t h e s i n -g l e - s t r a n d - s p e c i f i c n u c l e a s e S i a n d y i e l d a r a d i o a c t i v e " p r o -t e c t e d " f r a g m e n t a f t e r S i d i g e s t i o n . T h e s i z e o f t h i s p r o t e c t e df r a g m e n t i s t h e d i s t a n c e f r o m t h e e n d o f t h e R NA t r a n s c r i p t t ot h e e n d o f t h e o r i g i n a l f r a g m e n t . U s e o f a 5 ' - e n d - l a b e l e d p r o b ew i l l m a p 5 ' e n d s o f t r a n s c r i p t s , w h i l e u s e o f a 3 ' - e n d - l a b e l e dp r o b e w i l l m a p 3 ' e n d s . A f u l l y p r o t e c t e d f r a g m e n t i n d i c a t e st h a t o n e s t r a n d o f t h e e n t i r e f r a g m e n t h a s b e e n t r a n s c r i b e d .T h e d i r e c t i o n o f t r a n s c r i p t i o n o f t h e f r a g m e n t c a n b e d e t e r -m i n e d b y c l e a v i n g t h e o r i g i n a l l a b e l e d f r a g m e n t i n t o t w o d i s -t i n g u i s h a b l e e n d - l a b e l e d f r a g m e n t s b e f o r e h y b r i d i z a t i o n a n dt h e n d e t e r m i n i n g w h i c h l a b e l e d e n d i s p r o t e c t e d .I n o u r e x p e r i m e n t s , e n d - l a b e l e d DNA f r a g m e n t s w e r e h y -b r i d i z e d t o t o t a l n o d u l e R NA b y s u s p e n d i n g t h e n u c l e i c a c i d si n 2 0 , u l o f h y b r i d i z a t i o n b u f f e r [ 8 0 % f o r m a m i d e ( B a k e r ; r e -c r y s t a l l i z e d t h r e e t i m e s ) / 0 . 4 M N a C I / 5 0 mM P i p e s , p H 7 / 1mM E D T A ] , d e n a t u r i n g t h e d o u b l e - s t r a n d e d p r o b e b y h e a t i n gt h e m i x t u r e a t 7 3 C f o r 1 0 m i n , a n d t h e n i m m e d i a t e l y t r a n s -f e r r i n g i t t o 5 3 - 5 6 0 C f o r h y b r i d i z a t i o n . A f t e r 6 - 8 h r , t h e s a m -p l e s w e r e d i l u t e d t o 2 2 0 , u l b y a d d i t i o n o f i c e - c o l d S 1 b u f f e r a n dd i g e s t e d w i t h 3 0 u n i t s o f n u c l e a s e S 1 ( B e t h e s d a R e s e a r c h L a b -o r a t o r i e s ) f o r 3 0 m i n a t 3 7 C . T h e d i g e s t i o n p r o d u c t s w e r e r e -s o l v e d b y e l e c t r o p h o r e s i s t h r o u g h a l k a l i n e a g a r o s e g e l s ( 2 4 ) a n dv i s u a l i z e d b y a u t o a d i o g r a p h y . 3 2 P - L a b e l e d b a c t e r i o p h a g e A DNAd i g e s t e d w i t h C l a I o r H i n d I I I a n d b a c t e r i o p h a g e 4 X 1 7 4 r e p -l i c a t i v e f o r m DNA d i g e s t e d w i t h H a e I I I s e r v e d a s m o l e c u l a rs i z e s t a n d a r d s .

RESULTST n 5 M u t a g e n e s i s C o m p l e t e l y D e f i n e s a D i s c r e t e n i f G e n eC l u s t e r . We u s e d s i t e - d i r e c t e d T n 5 m u t a g e n e s i s ( 1 5 ) t o d e t e r -m i n e t h e f i l l l e x t e n t o f a p r e v i o u s l y i d e n t i f i e d c l u s t e r o f n i f g e n e si n R . n m l i l o t i ( 9 ) . M u t a g e n e s i s g a v e 7 0 i n d e p e n d e n t T n 5 i n -

s e r t i o n s d i s t r i b u t e d t h r o u g h o u t a 3 5 - k b s e g m e n t o f t h e g e n o m et h a t e n c o m p a s s e s t h e n i t r o g e n a s e s t r u c t u r a l g e n e s ( F i g . 1 ) . N o n eo f t h e i n s e r t i o n s w e r e i n g e n e s i n v o l v e d i n e a r l y s t a g e s o f r o o ti n f e c t i o n o r n o d u l e f o r m a t i o n s i n c e a l l 7 0 T n 5 - c o n t a i n i n g s t r a i n si n d u c e d t h e f o r m a t i o n o f n o d u l e s o n a l f a l f a r o o t s . T h e m u t a -g e n i z e d s t r a i n s w e r e c l a s s i f i e d i n t o t h r e e c a t e g o r i e s b a s e d o nt h e a p p e a r a n c e o f t h e n o d u l e s a n d t h e i r a b i l i t y t o r e d u c e a c e t -y l e n e a n d s u p p o r t p l a n t g r o w t h . T h i r t y s t r a i n s , d e s i g n a t e d F i x - ,f o r m e d s m a l l w h i t e n o d u l e s t h a t c o m p l e t e l y l a c k e d n i t r o g e n a s ea c t i v i t y a s m e a s u r e d b y t h e a c e t y l e n e r e d u c t i o n a s s a y . I n t h e s ec a s e s , t h e p l a n t s g r e w n o b e t t e r t h a n t h e u n i n o c u l a t e d c o n t r o l s .T h r e e s t r a i n s , d e s i g n a t e d F i x + , f o r m e d s m a l l n o d u l e s t h a t w e r ed e t e c t a b l y p i n k b u t h a d l e s s t h a n 1 0 % o f t h e n i t r o g e n a s e a c -t i v i t y o f n o r m a l n o d u l e s . E v e n t h o u g h p l a n t g r o w t h w a s s e -v e r e l y r e d u c e d , l e a f c o l o r w a s n o t i c e a b l y g r e e n e r t h a n u n i n o c -u l a t e d c o n t r o l s . T h e s e t h r e e F i x + i n s e r t i o n s ( n o s . 2 1 8 , 2 1 9 , a n d2 2 0 ) m a p p e d w i t h i n 1 5 0 b a s e p a i r s ( b p ) o f e a c h o t h e r . T h e r e -m a i n i n g 3 7 s t r a i n s w e r e d e s i g n a t e d F i x ' . T h e y f o r m e d n o d u l e st h a t w e r e i n d i s t i n g u i s h a b l e f r o m w i l d t y p e o n t h e b a s i s o f s i z e ,c o l o r , n i t r o g e n a s e a c t i v i t y , a n d a b i l i t y t o s u p p o r t p l a n t g r o w t h .A l l 3 3 i n s e r t i o n s t h a t c a u s e d p a r t i a l o r c o m p l e t e i n a b i l i t y t o f i xn i t r o g e n m a p p e d w i t h i n a 1 4 - t o 1 5 - k b s e g m e n t o f DNA t h a ti n c l u d e s t h e n i t r o g e n a s e g e n e s . T w e n t y - e i g h t i n s e r t i o n s t h a tm a p p e d a s f a r a s 1 0 k b t o t h e r i g h t o r t h e l e f t o f t h i s 1 4 - t o 1 5 -k b r e g i o n y i e l d e d o n l y F i x ' p h e n o t y p e s .N i n e F i x + T n 5 i n s e r t i o n s m a p p e d w i t h i n t h e n i f g e n e c l u s t e r( F i g . 1 ) . S i n c e T n 5 i n s e r t i o n s n o r m a l l y c r e a t e p o l a r m u t a t i o n s( 2 5 ) , t h e s e F i x ' i n s e r t i o n s p r e s u m a b l y d e f i n e r e g i o n s b e t w e e no p e r o n s . T h e l a r g e s t s u c h r e g i o n t h a t i s a p p a r e n t l y d e v o i d o fe s s e n t i a l n i f f u n c t i o n s i s d e f i n e d b y a g r o u p o f f i v e F i x ' i n -s e r t i o n s ( n o s . 3 1 2 , 3 0 3 , 3 0 5 , 3 0 4 , a n d 5 0 5 ) t h a t s p a n 1 . 1 k b o fDNA ( F i g . 1 ) . F i x + i n s e r t i o n s 3 2 6 , 2 9 2 , 2 1 5 , a n d 2 6 4 w o u l d b ee x p e c t e d t o d e f i n e a d d i t i o n a l s m a l l e r r e g i o n s b e t w e e n a d j a c e n to p e r o n s . F i x + i n s e r t i o n 3 2 6 , h o w e v e r , a p p e a r s t o b e a n e x c e p -t i o n a n d i s d i s c u s s e d i n d e t a i l b e l o w .R NA B l o t A n a l y s i s I d e n t i f i e s t h e N i t r o g e n a s e T r a n s c r i p t .RNA b l o t s o f t o t a l n o d u l e RNA w e r e p r o b e d w i t h t w o 3 2 P - l a -b e l e d DNA f r a g m e n t s t h a t c o n s t i t u t e a c o n t i g u o u s 1 1 . 7 - k b s e g -m e n t o f t h e n i f g e n e c l u s t e r . H y b r i d i z a t i o n t o t h e l a b e l e d 3 . 6 -k b B g l I I n i t r o g e n a s e g e n e f r a g m e n t ( 9 , 1 0 ) r e v e a l e d a p r o m -i n e n t t r a n s c r i p t o f 5 - 6 k b t h a t we p r e s u m e i s t h e m a j o r n i t r o -g e n a s e t r a n s c r i p t a n d a n u m b e r o f l e s s i n t e n s e m i n o r b a n d s ( F i g .2 , l a n e s a a n d b ) . F o u r o f t h e l a t t e r b a n d s c o r r e s p o n d e d i n p o -s i t i o n t o t h e p l a n t a n d b a c t e r i a l r i b o s o m a l R N A s t h a t were v i s -i b l e i n t h e e t h i d i u m b r o m i d e - s t a i n e d g e l ( d a t a n o t s h o w n ) . T h e s eR N A s c o n s t i t u t e t h e b u l k o f t h e RNA i n s u c h p r e p a r a t i o n s a n d 'a l w a y s y i e l d f a i n t h y b r i d i z a t i o n b a n d s r e g a r d l e s s o f t h e p r o b eu s e d . T h e s i g n i f i c a n c e o f t h e o t h e r b a n d s i s n o t c l e a r .W h e n i d e n t i c a l b l o t s w e r e p r o b e d w i t h t h e l a b e l e d 8 . 1 - k bB g l I I f r a g m e n t t o t h e r i g h t o f t h e n i t r o g e n a s e g e n e s , c l e a r l yd i s t i n g u i s h a b l e t r a n s c r i p t s were n o t o b s e r v e d ( F i g . 2 , l a n e s ca n d d ) . M a n y o f t h e m i n o r b a n d s d i s c u s s e d a b o v e were a l s oo b s e r v e d . T r a n s c r i p t s f r o m t h i s r e g i o n a r e , t h e r e f o r e , l e s sa b u n d a n t o r m o r e d e g r a d e d t h a n t h e n i t r o g e n a s e t r a n s c r i p t .N u c l e a s e S i M a p p i n g A p p l i e d t o t h e N i t r o g e n a s e O p e r o n .T h e t h r e e n i t r o g e n a s e s t r u c t u r a l g e n e s - n i f H , n i f D , a n d n i f K -a r e w i t h i n a s i n g l e o p e r o n o f a b o u t 6 k b i n R . n m l i l o t i ( 1 0 ) . T om o r e t h o r o u g h l y c h a r a c t e r i z e t r a n s c r i p t i o n f r o m t h i s o p e r o n ,w e u s e d t h e n u c l e a s e S 1 m a p p i n g t e c h n i q u e t o l o c a t e t h e e n d so f t h e R NA o n t h e p h y s i c a l m a p . F i g . 1 s h o w s t h e f r a g m e n t su s e d i n t h e a n a l y s i s a n d s u m m a r i z e s t h e r e s u l t s . W h e n t h e 2 . 1 -k b H i n d I I I f r a g m e n t w as 5 ' e n d l a b e l e d a n d u s e d i n S 1 m a p -p i n g e x p e r i m e n t s , a f r a g m e n t o f 1 . 1 k b was p r o t e c t e d ( F i g . 3 ,l a n e s a a n d b ) . C l e a v a g e o f t h i s l a b e l e d 2 . 1 - k b H i n d I I I ' f r a g m e n tw i t h B g l I I i n t o 1 . 2 - a n d 0 . 9 - k b f r a g m e n t s p r i o r t o h y b r i d i z a t i o na l s o r e s u l t e d i n t h e p r o t e c t i o n o f a 1 . 1 - k b f r a g m e n t ( l a n e s c a n d

3 0 0 6 G e n e t i c s : C o r b i n e t a l .

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3/5

P r o c . N a t . A c a d . S c i . USA 8 0 ( 1 9 8 3 ) 3 0 0 7- 4 3 5 3 0

1 1 2 8 3 1 01 7 3 0 6 I 3 1 22II3093 1 - 3 0 3II i|| ||t533B1 3 0 5N i 3 2 3 g e n 4a s eN i t r o g e n a s e

- 2 0 22 9 6- 2 9 S - 2 2 1 9210202 0 6-26f6ggfi52 5 6 n 2 2 1 - 2 2 - 2 2 4 - 2 5 2 2 7 - 2 3 9 2 3 1i E i 2 9 2 i 2 1 7 2 2 2 f S z t f 2

aI * I*I a a2 . 4 3 . 8 1 . 6 2 . 7 3 . 6 8 . 2 2 . 4

I aI . * a4 . 0 0 . 9 3 . 4 2 . 1 4 . 3 3 . 8.. a. I I1 . 7 0 . 6 3 . 8

1 2 . 3 aa I I

8 . 3 4 . 9b 1 . 6 2 . 6

I a0 . 7 0 . 9 3 . 0 1 .7

RA_ A2PI2 -R N A 1 R N A 2 1 k b- ~ ~ ~ ~F I G . 1 . P h y s i c a l map o f t h e R . m e l i l o t i n i f r e g i o n . R e s t r i c t i o n enzyme map: B g , B g i H ; H , H i n d l ; R , E c o R I ; B m , B a m H I ; X , X h o I . S i z e s o ff r a g m e n t s are i n d i c a t e d b e l o w i n k b . T h e h o r i z o n t a l l i n e s r e p r e s e n t t h e p o r t i o n s o f D NA t h a t w er e m a p p e d f o r t h e r e s p e c t i v e enzymes. N u m b e r e dc i r c l e s d e s i g n a t e l o c a t i o n s o f s p e c i f i c T n 5 i n s e r t i o n s : o , F i x ' p h e n o t y p e ; e, F i x - p h e n o t y p e ; a , F i x ' p h e n o t y p e . T h e b a r a b o v e t h e 3 . 6 - k b B g i I If r a g m e n t i n d i c a t e s t h e r e g i o n t h a t i s h o m o l o g o u s t o t h e n i t r o g e n a s e genes o f K . p n e u m o n i a e : E,e g i o n c o n t a i n i n g p r i m a r i l y n i f H h o m o l o g y ; E 2 ,r e g i o n c o n t a i n i n g p r i m a r i l y n i f D h o m o l o g y . B a r s d e s i g n a t e d 5 ' b e l o w t h e r e s t r i c t i o n enzyme map c o r r e s p o n d t o r e s t r i c t i o n enzyme f r a g m e n t s u s e df o r 5 ' n u c l e a s e S 1 m a p p i n g : p o i n t e d e n d s i n d i c a t e d i r e c t i o n o f t r a n s c r i p t i o n ; M, a r t s o f f r a g m e n t s p r o t e c t e d f r o m S 1 d i g e s t i o n ; R NA 1 a n d R NA

2 , n i f t r a n s c r i p t s d e d u c e d f r o m S 1 m a p p i n g e x p e r i m e n t s u s i n g 5 ' - e n d - l a b e l e d D NA f r a g m e n t s ; d o t t e d e x t e n s i o n s o f t h e b a r s s h o w t h a t t r a n s c r i p t i o nc o n t i n u e s p a s t arrows b u t a u n i q u e 3 ' e n d h a s n o t b e e n m a p p e d . P 1 a n d P 2 , p u t a t i v e n i f p r o m o t e r r e g i o n s .d ) . A s s h o w n i n F i g . 1 , t h e 5 ' e n d o f t h i s t r a n s c r i p t t h e r e f o r emaps a p p r o x i m a t e l y 1 0 0 b p t o t h e l e f t o f B g l I I s i t e a , w i t h t r a n -s c r i p t i o n p r o c e e d i n g l e f t w a r d i n t o t h e n i t r o g e n a s e g e n e s , a s e x -p e c t e d . I n t h e a b s e n c e o f R NA p r o c e s s i n g , t h i s 5 ' e n d d e f i n e s

a b c d

3.9-3 . 0 - !2.1-1.5-

F I G . 2 . R NA b l o t analysis o f R . m e l i l o t i n i f g e n e s . L a n e s a a n d b :r e s u l t s o f h y b r i d i z a t i o n o f the 3 P - l a b e l e d 3 . 6 - k b B g i II n i t r o g e n a s e genef r a g m e n t t o R N A b l o t s o f t o t a l n o d u l e R N A f r o m 3 - a n d 6 - w k n o d u l e s .L a n e s c a n d d : r e s u l t s o f h y b r i d i z a t i o n o f t h e 3 2 P - l a b e l e d 8 . 1 - k b B g i IIf a g m e n t t o R NA b l o t s o f t o t a l n o d u l e R NA f r o m 3 - a n d 6 - w k n o d u l e s .M o l e c u l a r s i z e m a r k e r s were r i b o s o m a l R NA m o l e c u l e s i n t h e R NAp r e p a r a t i o n ; t h e i r p o s i t i o n s are m a r k e d i n kb . T h e arrow i n d i c a t e s t h ep o s i t i o n o f t h e p r o m i n e n t n i t r o g e n a s e t r a n s c r i p t .

t h e p r o m o t e r r e g i o n , P 1 , f o r t h e n i t r o g e n a s e t r a n s c r i p t ( R N A 1 ) .T h e presence o f a F i x ' T n 5 i n s e r t i o n ( T n 5 3 2 6 ) 1 k b d o w n -s t r e a m f r o m t h e n i t r o g e n a s e p r o m o t e r r a i s e s t h e q u e s t i o n o fw h e t h e r or n o t t h e r e c o u l d b e a n o t h e r p r o m o t e r i m m e d i a t e l yd o w n s t r e a m o f t h i s i n s e r t i o n t h a t maps w i t h i n t h e n i f H - n i f Di n t e r g e n i c r e g i o n ( 2 6 ) . N u c l e a s e S 1 m a p p i n g a n a l y s i s o f t h e 5 ' -

a b c d e f g h

3.0-1 . 1 - sgo 2 . 4 X r

ii

1.9

F I G . 3 . N u c l e a s e S 1 m a p p i n g o f n i f t r a n s c r i p t s . L a n e s : a a n d b ,2 . 1 - k b H i n d I M l faent; c a n d d , 2 . 1 - k b H i n d I I I fragment dig w i t hB g l E ; e a n d f , 3 . 0 - k b X h o I fragment; g a n d h , 3 . 0 - k b Xho I f r a g m e n td i g e s t e d w i t h E c o R I ; i a n d j , 1 . 9 - k b Xho I / E c o R I f i a g m e n t . L a n e s a , c ,e , g , a n d i s h o w r e s u l t s o f m o c k h y b r i d i z a t i o n o f p r o b e w i t h o u t R N A o rn u c l e a s e S 1 t r e a t m e n t . L a n e s b , d , f , h , a n d j s h o w p r o t e c t e d f r a g m e n t sr e s u l t i n g f r o m h y b r i d i z a t i o n w i t h R NA a n d t r e a t m e n t w i t h n u c l e a s eS i .

I f 2 3 4 i

B gHRB mx

G e n e t i c s : C o r b i n e t a l .

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P r o c . N a t l A c a d . S c i . U S A 8 0 ( 1 9 8 3 )e n d - l a b e l e d 1 . 9 - k b E c o R I / X h o I f r a g m e n t t h a t o v e r l a p s t h i sp o i n t y i e l d s o n l y f u l l - f r a g m e n t p r o t e c t i o n ( F i g . 3 , l a n e s i a n dj ) , w i t h t r a n s c r i p t i o n p r o c e e d i n g l e f t w a r d a s e x p e c t e d ( d a t a n o ts h o w n ; r e s u l t s s u m m a r i z e d i n F i g . 1 ) . T h i s s u g g e s t s t h a t d e -t e c t a b l e t r a n s c r i p t i o n f r o m a p r o m o t e r w i t h i n t h e n i f H - n i f Di n t e r g e n i c r e g i o n d o e s n o t n o r m a l l y o c c u r i n 4 - t o 6 - w k n o d u l e sa n d t h a t n i t r o g e n a s e g e n e s a r e e x p r e s s e d b y t r a n s c r i p t i o n o r i g -i n a t i n g a t P 1 . O t h e r p o s s i b l e e x p l a n a t i o n s f o r t h e F i x ' p h e -n o t y p e o f T n 5 3 2 6 a r e d i s c u s s e d b e l o w .T h e 3 . 4 - k b H i n d I I I f r a g m e n t w a s u s e d i n s i m i l a r 5 ' - e n dm a p p i n g e x p e r i m e n t s t o e x t e n d t h e a n a l y s i s t h r o u g h t h e n i t r o -g e n a s e g e n e r e g i o n . W e o b s e r v e d f u l l - f r a g m e n t p r o t e c t i o n a n dl e f t w a r d p o l a r i t y ( d a t a n o t s h o w n ; r e s u l t s s u m m a r i z e d i n F i g .1 ) , i n d i c a t i n g t h a t t r a n s c r i p t i o n f r o m P 1 d o e s c o n t i n u e t h r o u g ht h e n i t r o g e n a s e g e n e s .T h e s i z e o f t h e n i t r o g e n a s e t r a n s c r i p t o b t a i n e d f r o m R NAb l o t s s u g g e s t s t h a t t h e 3 ' e n d o f t h e t r a n s c r i p t s h o u l d b e b e -t w e e n F i x ' T n 5 1 3 a n d F i x - T n 5 5 0 2 w i t h i n t h e 2 . 7 - k b B g l I If r a g m e n t . H o w e v e r , w h e n e i t h e r t h e 2 . 7 - k b B g l I I f r a g m e n t o rt h e 0 . 9 - k b H i n d I I I f r a g m e n t w a s 3 ' e n d - l a b e l e d a n d u s e d i n S 1m a p p i n g e x p e r i m e n t s , s t r o n g f u l l - f r a g m e n t p r o t e c t i o n w a s o b -s e r v e d ( d a t a n o t s h o w n ) . I n a d d i t i o n , s e v e r a l f a i n t s m a l l e r b a n d sw e r e d e t e c t e d . D e c r e a s i n g t h e RNA c o n c e n t r a t i o n i n t h e h y -b r i d i z a t i o n m i x t u r e r e s u l t e d i n a c o n c o m i t a n t d e c r e a s e i n i n -t e n s i t y o f a l l b a n d s w i t h n o e f f e c t o n t h e r e l a t i v e i n t e n s i t i e s .T h i s i n d i c a t e s t h a t t h e h y b r i d i z a t i o n s w e r e i n e x c e s s DNA a n dt h a t d e t e c t i o n o f a u n i q u e 3 ' e n d w a s n o t p r e v e n t e d b y d i s -p l a c e m e n t o f t h e 3 ' e n d s f r o m t h e p r o b e b y h y b r i d i z a t i o n w i t ha l e s s - a b u n d a n t r e a d - t h r o u g h t r a n s c r i p t . M o c k h y b r i d i z a t i o nw i t h o u t R N A d i d n o t p r o t e c t f r a g m e n t s , i n d i c a t i n g t h a t t h e h y -b r i d i z a t i o n c o n d i t i o n s w e r e n o t p e r m i t t i n g DNA-DNA p r o b er e h y b r i d i z a t i o n . V e r y d i f f e r e n t r e s u l t s w e r e o b t a i n e d w h e n t h e4 . 0 - k b H i n d I I I f r a g m e n t w a s u s e d t o m a p t h e 3 ' e n d s . I n t h i sc a s e , t h e r e w a s v e r y l i t t l e f u l l - f r a g m e n t p r o t e c t i o n a n d a l a r g ec o l l e c t i o n o f f a i n t b a n d s r a n g i n g i n s i z e f r o m 3 . 9 t o 0 . 9 k b ( d a t an o t s h o w n ) . T h e r e f o r e , a l t h o u g h - t h e d a t a s u g g e s t t h a t t r a n -s c r i p t i o n f r o m P 1 t e r m i n a t e s s o m e w h e r e n e a r F i x ' T n 5 1 3 , wew e r e u n a b l e t o i d e n t i f y a u n i q u e 3 ' e n d .I d e n t i f i c a t i o n o f a S e c o n d n i f P r o m o t e r R e g i o n . RNA b l o ta n a l y s i s f a i l e d t o r e v e a l a n y u n i q u e t r a n s c r i p t s d e r i v e d f r o m t h es y m b i o t i c a l l y e s s e n t i a l r e g i o n t o t h e r i g h t o f t h e n i t r o g e n a s eo p e r o n ( s e e a b o v e ) . H o w e v e r , w e h a d p r e v i o u s l y s h o w n t h a tt h i s r e g i o n i s t r a n s c r i b e d i n m a t u r e n o d u l e s b y h y b r i d i z i n g t o t a lR N A l a b e l e d i n v i t r o t o S o u t h e r n b l o t s o f t h e 8 . 2 - a n d 2 . 4 - k bB g l I I f r a g m e n t s ( 9 ) . W e h a v e n o w a p p l i e d n u c l e a s e S 1 m a p p i n gt o t h i s r e g i o n a n d f o u n d t h a t t h i s a p p r o a c h i s s e n s i t i v e e n o u g ht o d e t e c t t h e 5 ' e n d o f a t l e a s t o n e t r a n s c r i p t . A n a l y s i s o f t h e5 ' - e n d - l a b e l e d 3 . 0 - k b X h o I f r a g m e n t i n d i c a t e d p r o t e c t i o n o fa 2 . 4 - k b f r a g m e n t ( F i g . 3 , l a n e s e a n d f ) , a n d a n a l y s i s o f t h e0 . 3 - a n d 2 . 7 - k b f r a g m e n t s f o r m e d b y c l e a v a g e o f t h e o r i g i n a lf r a g m e n t w i t h E c o R I a l s o i n d i c a t e d p r o t e c t i o n o f a 2 . 4 - k b f r a g -m e n t ( l a n e s g a n d h ) . T h i s i d e n t i f i e s a n o t h e r t r a n s c r i p t ( R N A2 ) t h a t o r i g i n a t e s f r o m a p r o m o t e r ( P 2 ) a p p r o x i m a t e l y 0 . 6 k b t ot h e r i g h t o f X h o I s i t e a a n d i s t r a n s c r i b e d r i g h t w a r d a t l e a s t a sf a r a s X h o I s i t e b ( F i g . 1 ) . G e n e t i c d a t a o f R u v k u n a n d A u s u b e l( 1 0 ) s u g g e s t t h a t t h e r i g h t - h a n d b o u n d a r y o f t h i s o p e r o n m a p sn e a r t h e s i t e o f i n s e r t i o n o f F i x ' T n 5 2 9 2 . H o w e v e r , w h e n t h e1 . 7 - k b X h o I f r a g m e n t w a s u s e d t o m a p t h e 3 ' e n d , we o b s e r v e ds t r o n g f u l l - f r a g m e n t p r o t e c t i o n r e l a t i v e t o s e v e r a l s m a l l e r p r o -t e c t e d f r a g m e n t s ( d a t a n o t s h o w n ) . A u n i q u e 3 ' e n d w a s n o td e t e c t e d .

D I S C U S S I O NWe h a v e u s e d T n 5 m u t a g e n e s i s o f a 3 5 - k b s e g m e n t o f t h e R .m e l i l o t i g e n o m e t o i d e n t i f y t h e b o u n d a r i e s o f a l a r g e c l u s t e r o fn i f g e n e s . T h e s e g e n e s a r e l o c a t e d w i t h i n a 1 4 - t o 1 5 - k b r e g i o n

t h a t i s f l a n k e d o n b o t h s i d e s b y a t l e a s t 1 0 k b o f DNA t h a t i ss y m b i o t i c a l l y u n e s s e n t i a l . T h e d a t a p r e s e n t e d h e r e e x t e n d t h ea n a l y s i s o f R u v k u n e t a l . ( 1 0 ) , w h i c h w a s c o n f i n e d t o a 1 2 - k br e g i o n c o r r e s p o n d i n g a p p r o x i m a t e l y t o t h a t b o u n d e d b y o u r F i x 'T n 5 i n s e r t i o n s 1 3 a n d 2 1 5 . T h r e e n i f o p e r o n s w e r e i d e n t i f i e di n t h a t w o r k , b u t t h e f u l l e x t e n t o f t h e n i f c l u s t e r w a s n o t d e -t e r m i n e d . O u r d a t a s h o w t h a t t h e r e e x i s t s a t l e a s t o n e a d d i -t i o n a l o p e r o n o f u p t o 2 . 3 k b b e t w e e n T n 5 i n s e r t i o n s 2 6 4 a n d2 9 9 .N o n e o f t h e 7 0 T n 5 i n s e r t i o n s d e s c r i b e d i n t h i s p a p e r i n -t e r f e r e d w i t h t h e e a r l y s t a g e s o f n o d u l e f o r m a t i o n . C o n s i d e r i n gt h e l a r g e n u m b e r o f i n s e r t i o n s a n a l y z e d , i t s e e m s u n l i k e l y t h a ts u c h g e n e s a r e l o c a t e d i n t h i s c l u s t e r o r w i t h i n 1 0 k b o n e i t h e rs i d e . E a r l y n o d u l a t i o n g e n e s h a v e b e e n i d e n t i f i e d i n R . m e l i -l o t i , b u t t h e y - m a p 2 0 - 3 0 k b d o w n s t r e a m f r o m t h e n i t r o g e n a s eo p e r o n ( 2 7 ) .I n t h e s t u d y o f R u v k u n e t a l . ( 1 0 ) , c o m p l e m e n t a t i o n a n a l y s i so f T n 5 - m u t a g e n i z e d R . m e l i l o t i i n d i c a t e d t h a t t h e n i t r o g e n a s eo p e r o n i s a b o u t 6 k b i n s i z e a n d p a r t i a l DNA s e q u e n c e a n a l y s i si n d i c a t e d t h a t t h e g e n e s a r e t r a n s c r i b e d i n t h e o r d e r n i f HD Ka s t h e y a r e i n K . p n e u m o n i a e . R u v k u n e t a l . a l s o r e p o r t e d t w oT n 5 i n s e r t i o n s n e a r t h e n i f H - n i f D i n t e r g e n i c r e g i o n t h a t w e r ew e a k l y n o n p o l a r . We h a v e i d e n t i f i e d b y p h y s i c a l a n a l y s i s a s i n -g l e 5 - t o 6 - k b n i t r o g e n a s e RNA i n r o o t n o d u l e s t h a t i s t r a n -s c r i b e d l e f t w a r d f r o m a p r o m o t e r ( P 1 ) a b o u t 1 0 0 b p t o t h e l e f to f B g l I I s i t e a ( F i g . 1 ) . I n l i g h t o f t h e a b o v e i n f o r m a t i o n s u p -p o r t i n g a s i n g l e t r a n s c r i p t f o r t h e n i t r o g e n a s e g e n e s , w e weres u r p r i s e d t o f i n d a T n 5 i n s e r t i o n b e t w e e n n i f H a n d n i f D t h a td i d n o t s i g n i f i c a n t l y a l t e r s y m b i o t i c n i t r o g e n f i x a t i o n ( T n 5 3 2 6 ) .O n e p o s s i b l e r e a s o n f o r t h e s t r o n g n o n p o l a r i t y o f t h i s p a r t i c u l a rT n 5 i n s e r t i o n i s t h a t u n d e r c e r t a i n c i r c u m s t a n c e s T n 5 i s c a p a b l eo f p r o m o t i n g t r a n s c r i p t i o n o f a d j a c e n t s e q u e n c e s . We h a v e e v i -d e n c e f r o m s t u d i e s w i t h t w o s t r a i n s o f R . m e l i l o t i t h a t T n 5 i n -s e r t i o n s n e a r t h e s i t e o f i n s e r t i o n o f T n 5 3 2 6 c a n r e s u l t i n h i g hl e v e l s o f e x p r e s s i o n o f a p r o m o t e r l e s s c h l o r a m p h e n i c o l a c e t y l -t r a n s f e r a s e g e n e c a r t r i d g e ( 2 8 ) i n s e r t e d i n t o t h e H i n d I I I s i t en e a r t h e n i f H / n i f D j u n c t i o n ( u n p u b l i s h e d d a t a ) . A n o t h e r p o s -s i b l e r e a s o n f o r t h i s n o n p o l a r i t y c o u l d b e t h a t , a l t h o u g h w e d i dn o t d e t e c t a 5 ' e n d i n t h i s r e g i o n b y n u c l e a s e S 1 m a p p i n g , t h e r em i g h t b e a w e a k s e c o n d a r y p r o m o t e r i n t h e i n t e r g e n i c r e g i o n .I t s h o u l d b e n o t e d t h a t B e r g e t a l . ( 2 5 ) h a v e r e p o r t e d o c c a s i o n a lw e a k n o n p o l a r i t y o f T n 5 i n s e r t i o n s i n t h e l a c Z g e n e o f E . c o l i .B a s e d o n t h e e s t i m a t e d s i z e s o f n i t r o g e n a s e p o l y p e p t i d e s f r o mo t h e r s p e c i e s o f R h i z o b i u m ( 2 9 - 3 1 ) , a p p r o x i m a t e l y 3 . 6 k b o fDNA w o u l d b e r e q u i r e d t o e n c o d e a n i t r o g e n a s e c o m p l e x o fs i m i l a r s i z e i n R . m e l i l o t i . T h e r e f o r e , a n i t r o g e n a s e t r a n s c r i p to f 5 t o 6 k b c o u l d p o s s i b l y e n c o d e o t h e r f u n c t i o n s , a s d o e s t h en i t r o g e n a s e o p e r o n i n K . p n e u m o n i a e .A n o t h e r n i f o p e r o n i s s e p a r a t e d f r o m t h e n i t r o g e n a s e o p e r o nb y 1 . 9 k b o f D N A . T h i s o p e r o n i s t r a n s c r i b e d i n t h e o p p o s i t ed i r e c t i o n f r o m t h e n i t r o g e n a s e o p e r o n . T h e v e r y f a i n t b a n d r e -s u l t i n g f r o m S 1 m a p p i n g e x p e r i m e n t s , a s w e l l a s t h e i n a b i l i t yt o d e t e c t a n o t h e r p r o m i n e n t t r a n s c r i p t b y R NA b l o t a n a l y s i ss u g g e s t s t h a t t h e a b u n d a n c e o f i n t a c t R NA f r o m t h i s o p e r o n i sl o w e r t h a n t h a t o f t h e n i t r o g e n a s e o p e r o n .We h a v e n o t b e e n a b l e t o d e t e c t u n i q u e 3 ' e n d s f o r e i t h e rRNA 1 o r RNA 2 a l t h o u g h g e n e t i c s t u d i e s ( 1 0 ) h a v e e s t a b l i s h e dt h e a p p r o x i m a t e b o u n d a r i e s o f e a c h o p e r o n . T h e reason f o r t h i si s u n k n o w n .T h e 1 . 9 - k b r e g i o n b e t w e e n R NA 1 a n d R NA 2 d o e s n o t con-t a i n g e n e s t h a t are e s s e n t i a l f o r n i t r o g e n f i x a t i o n . W e h a v em a p p e d f i v e F i x ' T n 5 i n s e r t i o n s i n t h i s r e g i o n , a n d R u v k u n e ta l . ( 1 0 ) h a v e m a p p e d e i g h t F i x + T n 5 i n s e r t i o n s i n t h e corre-s p o n d i n g r e g i o n o f a n o t h e r s t r a i n o f R . m e l i l o t i . H o w e v e r , weh a v e d e t e c t e d t r a n s c r i p t i o n w i t h i n t h i s r e g i o n i n m a t u r e n o d -u l e s b y S o u t h e r n b l o t h y b r i d i z a t i o n s ( u n p u b l i s h e d d a t a ) . I f t h i s

3 0 0 8 G e n e t i c s : C o r b i n e t a l .

8/7/2019 pnas00636-0204

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P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A 8 0 ( 1 9 8 3 ) 3 0 0 9r e g i o n e n c o d e s a p r o t e i n , e i t h e r i t i s u n r e l a t e d t o n i t r o g e n f i x -a t i o n o r i t i s p o s s i b l y a n e g a t i v e r e g u l a t o r y e l e m e n t o f t h e R h i -z o b i u m n i f s y s t e m . I f t r a n s c r i p t i o n a l o n e p l a y s a r e g u l a t o r y r o l e ,e i t h e r i t m u s t b e a n e g a t i v e o n e o r t h e T n 5 i n s e r t i o n s w i t h i n t h er e g i o n , w h i l e d i s r u p t i n g n o r m a l p a t t e r n s o f t r a n s c r i p t i o n , p r o -v i d e r e n e w e d t r a n s c r i p t i o n f r o m t h e i r t e r m i n i a s h y p o t h e s i z e da b o v e .N o w t h a t t h e s i z e o f t h e R . m e l i l o t i n i f g e n e c l u s t e r h a s b e e nd e t e r m i n e d , i t i s i n t e r e s t i n g t o c o m p a r e c e r t a i n f e a t u r e s w i t ht h o s e o f t h e K . p n e u m o n i a e n i f g e n e c l u s t e r . T h e m o s t s t r i k i n gd i f f e r e n c e a t t h i s t i m e i s t h a t , w h i l e t h e 1 7 c l o s e l y s p a c e d g e n e so f t h e K . p n e u m o n i a e n i f r e g i o n s p a n a 2 4 - k b s e g m e n t o f DNA( 3 2 ) , t h e n i f r e g i o n o f R . m e l i l o t i o c c u p i e s o n l y 1 4 t o 1 5 k b , 1 . 9k b o f w h i c h a p p e a r s t o b e u n e s s e n t i a l f o r n i t r o g e n f i x a t i o n . T h i sl e a v e s a m a x i m u m 1 2 t o 1 3 k b o f i n d i s p e n s i b l e n i f f u n c t i o n i nt h i s r e g i o n . I f g e n e s a n a l o g o u s i n f u n c t i o n t o a l l o f t h e n i f g e n e so f K l e b s i e l l a a r e p r e s e n t i n R h i z o b i u m , t h e n s o m e o f t h e g e n e sm u s t b e l o c a t e d i n a n o t h e r r e g i o n o f t h e g e n o m e . O n t h e o t h e rh a n d , f e w e r g e n e s m a y b e r e q u i r e d i n R h i z o b i u m t o e l a b o r a t ea f u n c t i o n a l n i t r o g e n a s e c o m p l e x d u r i n g s y m b i o s i s . F i n a l l y , i nK . p n e u m o n i a e , a l l n i f o p e r o n s a r e t r a n s c r i b e d f r o m o n e s t r a n do f DNA ( 1 1 , 3 3 ) . T h e f i n d i n g s o f t w o p r o m o t e r s t h a t c o n t r o ld i v e r g e n t t r a n s c r i p t i o n i n R h i z o b i u m i n d i c a t e s s u b s t a n t i a l d i f -f e r e n c e s i n t h e g e n e t i c o r g a n i z a t i o n o f n i f f u n c t i o n s i n t h e s e t w on i t r o g e n - f i x i n g o r g a n i s m s .We a r e i n d e b t e d t o D r . D o n a l d R . H e l i n s k i i n w h o s e l a b o r a t o r y t h i ss t u d y w a s c o n d u c t e d . We g r a t e f u l l y a c k n o w l e d g e t h e e x c e l l e n t t e c h -n i c a l a s s i s t a n c e o f M a r t y Y a n o f s k y a n d P a t t y T o o k e r . T h i s w o r k w a ss u p p o r t e d b y N a t i o n a l S c i e n c e F o u n d a t i o n G r a n t PC M 8 2 - 0 4 7 3 0 .

1 . V i n c e n t , J . M . ( 1 9 8 0 ) i n N i t r o g e n F i x a t i o n 2 , e d s . N e w t o n , W . E .& O r m e - J o h n s o n , W . H . ( U n i v e r s i t y P a r k P r e s s , B a l t i m o r e ) , p p .1 0 3 - 1 2 9 .2 . N e w c o m b , W . ( 1 9 8 1 ) i n B i o l o g y o f t h e R h i z o b i a c e a e , e d s . G i l e s ,K . L . & A t h e r l y , A . G . ( A c a d e m i c , Ne w Y o r k ) , p p . 2 4 7 - 2 9 8 .3 . B u c h a n a n - W o l l a s t o n , A . V . , B e r i n g e r , J . E . , B r e w i n , N . J . , H i r s c h ,P . R . & J o h n s t o n , A W . B . ( 1 9 8 0 ) M o l G e n . G e n e t . 1 7 8 , 1 8 5 - 1 9 0 .4 . M e a d e , H . M . , L o n g , S . R . , R u v k u n , G . B . , B r o w n , S . S . & A u -s u b e l , F . M . ( 1 9 8 2 ) J B a c t e r i o l . 1 4 9 , 1 1 4 - 1 2 2 .5 . H o m b r e c h e r , G . , B r e w i n , N . J . & J o h n s t o n , A . W . B . ( 1 9 8 1 ) M o lG e n . G e n e t . 1 8 2 , 1 3 3 - 1 3 6 .6 . P r a k a s h , R . K . , S c h i l p e r o o r t , R . A . & N u t i , M . P . ( 1 9 8 1 ) J B a c -t e r i o l 1 4 5 , 1 1 2 9 - 1 1 3 6 .

7 . B a n f a l v i , Z . , S a k a n y a n , V . , K o n c z , C . , K i s s , A . , D u s h a , I . & K o n -d o r o s i , A . ( 1 9 8 1 ) M o l G e n . G e n e t . 1 8 4 , 3 1 8 - 3 2 5 .8 . R o s e n b e r g , C . , B o i s t a r d , P . , D e n a r i e , J . & C a s s e - D e l b a r t , F . ( 1 9 8 1 )M o l . G e n . G e n e t . 1 8 4 , 3 2 6 - 3 3 3 .9 . C o r b i n , D . , D i t t a , G . & H e l i n s k i , D . R . ( 1 9 8 2 ) 1 B a c t e r i o l 1 4 9 ,2 2 1 - 2 2 8 .1 0 . R u v k u n , G . B . , S u n d a r e s a n , V . & A u s u b e l , F . M . ( 1 9 8 2 ) C e l l 2 9 ,5 5 1 - 5 5 9 .1 1 . M a c N e i l , D . , Z h u , J . & B r i l l , W . J . ( 1 9 8 1 ) J B a c t e r i o l 1 4 5 , 3 4 8 -3 5 7 .1 2 . R o b e r t s , G . P . & B r i l l , W . J . ( 1 9 8 1 ) A n n u . R e v . M i c r o b i o l 3 5 , 2 0 7 -2 3 5 .1 3 . D i t t a , G . , S t a n f i e l d , S . , C o r b i n , D . & H e l i n s k i , D . R . ( 1 9 8 0 ) P r o c .N a t l . A c a d . S c i U S A 7 7 , 7 3 4 7 - 7 3 5 1 .1 4 . L e o n g , S . A . , D i t t a , G . S . & H e l i n s k i , D . R . ( 1 9 8 2 ) J B i o l C h e m .2 5 7 , 8 7 2 4 - 8 7 3 0 .1 5 . R u v k u n , G . B . & A u s u b e l , F . M . ( 1 9 8 1 ) N a t u r e ( L o n d o n ) 2 8 9 , 8 5 -8 8 .1 6 . H a r d y , R . W . F . , B u r n s , R . C . & H o l s t e n , R . D . ( 1 9 7 3 ) S o i l B i o lB i o c h e m . 5 , 4 7 - 8 1 .1 7 . K a s s a v e t i s , G . A . & G e i d u s c h e k , E . P . ( 1 9 8 2 ) E M B O J 1 , 1 0 7 - 1 1 4 .1 8 . R i g b y , P . W . J . , D i e c k m a n n , M . , R h o d e s , C . & B e r g , P . ( 1 9 7 7 ) JM o l . B i o l 1 1 3 , 2 3 7 - 2 5 1 .1 9 . L o e n i g , U . E . ( 1 9 6 8 ) J M o l B i o l 3 8 , 3 5 5 - 3 6 5 .2 0 . S o u t h e r n , E . M . ( 1 9 7 5 ) 1 M o l . B i o l 9 8 , 5 0 3 - 5 1 7 .2 1 . B e r k , A . J . & S h a r p , P . A . ( 1 9 7 7 ) C e l l 1 2 , 7 2 1 - 7 3 2 .2 2 . T h o m a s , M . , W h i t e , R . L . & D a v i s , R . W . ( 1 9 7 6 ) P r o c . N a t i A c a d .S c i . U S A 7 3 , 2 2 9 4 - 2 2 9 8 .2 3 . C a s e y , J . & D a v i d s o n , H . ( 1 9 7 7 ) N u c l e i c A c i d s R e s . 4 , 1 5 3 9 - 1 5 5 2 .2 4 . M c D o n e l l , M . W . , S i m o n , M . H . & S t u d i e r , F . W . ( 1 9 7 7 ) J M o l .B i o l . 1 1 0 , 1 1 9 - 1 4 6 .2 5 . B e r g , D . E . , W e i s s , A . & C r o s s l a n d , L . ( 1 9 8 0 ) 1 J B a c t e r i o l 1 4 2 ,4 3 9 - 4 4 6 .2 6 . T o r o k , I . & K o n d o r o s i , A . ( 1 9 8 1 ) N u c l e i c A c i d s R e s . 9 , 5 7 1 1 - 5 7 2 3 .2 7 . L o n g , S . R . , B u i k e m a , W . J . & A u s u b e l , E . M . ( 1 9 8 2 ) N a t u r e( L o n d o n ) 2 9 8 , 4 8 5 - 4 8 8 .2 8 . C l o s e , T . J . & R o d r i q u e z , R . L . ( 1 9 8 2 ) G e n e 2 0 , 3 0 3 - 3 1 4 .2 9 . I s r a e l , D . W , H o w a r d , R . L . , E v a n s , H . J . & R u s s e l l , S . A . ( 1 9 7 4 )J B i o l C h e m . 2 4 9 , 5 0 0 - 5 0 8 .3 0 . W h i t i n g , M . J . & D i l w o r t h , M . J . ( 1 9 7 4 ) B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a3 7 1 , 3 3 7 - 3 5 1 .3 1 . S c o t t , D . B . , H e n n e c k e , H . & L i m , S . T . ( 1 9 7 9 ) B i o c h i m . B i o -p h y s . A c t a 5 6 5 , 3 6 5 - 3 7 8 .3 2 . C a n n o n , F . C . , R i e d e l , G . E . & A u s u b e l , F . M . ( 1 9 7 9 ) M o l G e n .G e n e t . 1 7 4 , 5 9 - 6 6 .3 3 . J a n s s e n , K . A . , R i e d e l , G . E . , A u s u b e l , F . M . & C a n n o n , F . C .( 1 9 8 0 ) i n N i t r o g e n F i x a t i o n 1 , e d s . N e w t o n , W . E . & O r m e - J o h n -s o n , W . E . ( U n i v e r s i t y P a r k P r e s s , B a l t i m o r e ) , p p . 8 5 - 9 3 .

G e n e t i c s : C o r b i n e t a l .