PKU - Fenilcetonuria
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UAS
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE SINALOA
Facultad de Ciencias Químico Biológicas
Biología Molecular Aplicada
Beltrán Agramón Juan Carlos, Camacho Ureta Elisa Analí, Colin Ojeda Arturo,
Espinoza Morales Lluvia Briseida, Gómez Rodríguez Alicia Vianey, Medina Bastidas
Diana Vanessa y Solis Medrano Silvia Carolina
Dr. Héctor Samuel López Moreno Grupo 5-1 (equipo #8)
ERRORES INNATOS DEL METABOLISMO
Deficiencia de G6PD Fibrosis quística Fenilcetonuria Distrofia muscular
Raimann, 2008
Alteración de un gen Defecto enzimático
Alteraciones bioquímicas Fenotipos desadaptativos propios de cada patología
Fenilcetonuria (PKU)
PKU es el desorden genético del metabolismo de aminoácidos más común causado principalmente por la deficiencia de la enzima fenilalanina hidroxilasa (PAH), como resultado de mutaciones en el gen PAH que codifica para dicha enzima.
Ramírez y colbs, 2007
Antecedentes de la fenilcetonuria
1934 Dr. Ivar Asbjorn Folling “imbecilitas fenilpirúvica” Años 70´s Jervis Bloqueo metabólico y deficiencia de la PAH 1996 Robert Guthrie Pruebas de detección para PKU
Williams et al. 2008
Deficiencia de PAH
Phe: 77 ± 18 μmol/l Tyr: 81 ± 23 μmol/l
PKU clásica (Phe: > 1200 μmol/L) PKU moderada (Phe: 600-1200 μmol/L) HPA leve (Phe: ≥250 , <600 μmol/L)
Williams et al. 2008
Vref
Bioquímica de la PKU
Williams et al. 2008
Fenilalanina Hidroxilasa
Williams et al. 2008
50 KDa, 452 aminoácidos
Fenilalanina Hidroxilasa
Williams et al. 2008
Estructura secundaria de PAH
Genética de la PKU
Williams et al. 2008
Variaciones del gen PAH
Williams et al. 2008
• Mutaciones puntuales
• Deleciones pequeñas o grandes • Defectos de empalme
• Polimorfismos silenciosos
• Mutaciones sin sentido
• Inserciones
• Mutaciones intrónicas que regulan el splicing de ARNm
• Mutaciónes en el promotor del gen PAH
Cromosoma 12
12q22-24.1
gen PAH
Correlación genotipo/fenotipo en el gen PAH
• Mutaciones que afectan tanto a la cinética de la PAH y su estabilidad.
• Mutaciones que alteran las propiedades cinéticas, pero no tienen ningún efecto sobre la estructura de PAH.
• Mutaciones que no alteran la cinética normal, pero demuestran menor la estabilidad in vitro e in vivo.
Fazeli y Vallian, 2011
PKU como desorden multifactorial
• Barrera hematoencefálica
• Grados de transaminación y descarboxilación
• Degradación de proteosoma por defectos de la proteína de la enzima PAH
• Efectos de polimorfismos en la transcripción del gen
Fazeli y Vallian, 2011
Epidemiología
Vela-Amieva 2009
Frecuencia de los errores innatos del metabolismo encontrados en una cohorte de pacientes en Monterrey, México.
Manifestaciones clínicas de la fenilcetonuria
Williams et al. 2008
Vómito Eccemas Retraso mental Irritabilidad Epilepsia Otros como: parkinsonismo, anormalidades en los ojos (hiperpigmentación), decoloración de la piel y el cabello, sensibilidad a la luz, diástasis dentaria e hipoplasia del esmalte, sindactilia, epicanto y pie plano.
Detección y diagnóstico de la PKU
Método de Guthrie
Barba, 2004
Detección y diagnóstico de la fenilcetonuria
• DGGE
• Secuenciación automática
• Marcadores de polimorfismos: • STR • VNTR • PCR-RFLP
• Análisis de MLPA (amplificación multiplex dependiente de ligación de
sondas) en pacientes con PKU
• RT-PCR
Detecta mutaciones puntuales en el gen PAH
DGGE
Michiels et al. 1996.
Secuenciación automática
Mediante el uso de primers específicos que flanqueen del exón 5 al 12 del gen PAH, y su posterior secuenciación para mutaciones puntuales.
Dworniczak et al.1989
Detección de mutaciones y diagnóstico prenatal de fenilcetonuria a partir de técnicas para detectar polimorfismos
• STR (Short Tandem Repeats) o microsatélites
• VNTR (variable Number of Tandem Repeats)
• RFLP
• ADN linfocitos de sangre periferica (PX con PKU y portadores) y ADN vellosidad corionicas (embriones).
Análisis de MLPA (amplificación multiplex dependiente de ligación de sondas) en pacientes con PKU
Schouten J.P. et. al, 2002, 1-13
Análisis realizado en pacientes p274 con una deleción en el gen PAH con 5 exones removidos (c.353 - ?_912 + ?del) (A) electroferograma con asteriscos sobre los picos indicando los exones con deleción (E4, E5, E6, E7 y E8) del ADN del paciente comparado con otro control de ADN. (B) la gráfica muestra los radios del paciente P274 y las áreas relativas del pico (RPA) determinada para cada exón del gen PAH. Utilizando los siguientes valores de referencia: radio de RPA – 1= dosis normal; radio de RPA – 0.5 = deleción de heterocigoto. IGF1 y ASCL1 son controles correspondientes a los genes de flanqueo para el gen PAH en el kit de MLPA.
Análisis de MLPA (amplificación multiplex dependiente de ligación de sondas) en pacientes con PKU
Calí F et al. 2010
Análisis CMDA realizado en el paciente P628 con una deleción del gen PAH removido del exón 6 (c.510 - _706 del +?). (A) En el electroferograma, el asterisco encima del pico indica el exón eliminado (E6) en el ADN del paciente en comparación con el ADN de control. (B) la gráfica muestra las proporciones del paciente P628 y el control del área relativa del pico (RPA) determinado por los exones del gen PAH. Los valores de referencia son los siguientes: radio de RPA- 1 = dosis normal; radio de RPA - 0,5 = eliminación heterocigota. MLH1 y MYE son sondas de control utilizados en el análisis CMDA.
CMDA
Calí F et al. 2010
RT-PCR
Calí F et al. 2010
Gracias