PERKEMBANGAN ANALISA GULASECARA KLT DAN KCKT*)

Julia Kantasubrata dan Sri SumartlnlPuslitbang Kim!a Terapan - LlPI

INTI SARI

Analise gula memegang peranan penling, terutama dalam bidang pangan.Hingga saat ini masih selalu diusaluUcanmencari suatu metoda analisa gula yangspesifik; selekJif, telisi, cepat don tepat.

Gula dalam bahan makanan terdiri atas campuran monosakarida; disakaridadan trisakarida. Dengan metoda analisa konvensionaldan spektrofotometri yangdidasarkan pada sifat fislka atau reaksi kimia; kadar gula secara individual tidakdaptu ditentukan.

Dengan munculnya teknik kromatografi; analisa gula secara individual mulaidaptu dikembangkan Kromatografi lapisan tipis (KLT) banyak dipakai pada anallsagula. KLT selalu populer karena sederhana; murah; cepat dan merupokan satu-satunya teknik yang dilpat menganalisa beberapa cuplikan secara simultan.

Umumnya analisa gula pada KLT dilakukan di atas pelat silika. Pemisahanyang cukup memuaskan hanya dapat diperoleh apabila digunakan pelat silika yangsudah' diimpregnasi dan dilakukan proses elusi berulang kali: Dalam usahamempersingkat waktu analisa; telah dikembangkon jenis [asa diam yang baru untukkeperluan KLT, yairu pelat HPTLC Si 50000.

Sejalan tkngan perkembangan kolom [asa terikat, analisa gula dengan KCKl'(Kromatografi Cairan Kinerja Tinggi} mulai banyak: dilakukan, menggunakanantara lain kolom penukar ion, k%m fasa terikat amino, kolom dial diln kolom C-18. Suatu cara pemisahan gula yang relatif baru menggunokan kolom silika doneluen yang mengandung pereaksi poliomina telah dikembangkon beberapa tahunterakhir ini oleh WATERS: Teknik ini dinamakan "Silika Amine Modi[<er"(SAM),dimana reaksi pembenlukon basa Schiff daptu disiadakan; waktu hidup kolommenjadi lebih panjang dan dapa: memberikan hasil pemisahan monosakarida yanglebih balk daripada teknik KCKl' yang lain.

ABSTRACT

Analysis of sugars plays an important role, mainly in foods. Up to now, thesearch of spesific, selective, reproducible and accurate methods for sugar analysisis still being made.

Sugars in foods consist of monosacharides, disacharides and trisacharides.Using conventional and spectrophotometric methods, which are based on measure-men! of physical properties or chemical reactions, such individual amount of sugarscan not be determined.

The emergence of chromatographic techniques has initiated the development ofindividual sugar analysis. Thin layer chromatography (lie) is widely used in sugaranalysis, since is is simple, cheap, fast and ir has a capability to analyse severalsamples sinwltaneously.

Commonly, lie analysis of sugars is conducted using silica gel as stationaryphase. Satisfactory separation could only be produced with impregnated silica platesand multiple TLC runs. In order to reduce the separation time, new stationary phasewas developed. The rapid separation of sugars has been achieved by using Hl'Tl.Cplates Si 50000.

In line with the development of bonded phase column, analysis of sugar usingHPLC method has received considerable attention, using among others ionexchange columns, amino bonded silica phase, diol and e-18 columns.

A relatively new type of sugar separation with a silica based column and eluencontaining polyamine reagent has been developed by WATERS. This technique iscalled a SilicaAmine Modifier (5<\M), in which the formation of Schiff base can beeliminated, the life time of the column becomes longer and better monosacharideseparation can beproduced compared to other HPLC techniques.

PENDAHULUAN

Gula digolongkan dalam monosakarida, disakarida dan tri-sakarida, yang dalam bahan makanan umumnya jenis-jenis gulatersebut merupakan campuran. Analisa untuk menetapkan kadarberbagai jenis gula dalam bahan makanan merupakan suatu peker-jaan yang cukup sulit.

Metoda analisa konvensional dari sejumlah mono- di- dantrisakarida didasarkan pada pengukuran besaran fisika sepertiosmometri, polarometri, hidrometri, dan refraktometri ataupunpada reaksi kimia dari gugus-gugus fungsional gula tersebut.

Hasil analisanya hanya mampu menggambarkan kadar gulatotal atau semi total, dan tidak mungkin menentukan apakah gulatersebut glukosa, fruktosa, sakarosa atau bahkan campuran dariketiganya. Analisa Luff Schoorl, Fehling, ~omogyi dan Benedictmerupakan metoda analisa kimia yang didasarkan pada reaksigugus-gugus pereduksi dari gula (1,2). Untuk gula yang takmempunyai gugus pereduksi, analisa dapat dilakukan denganjalan menghidrolisanya terlebih dahulu sehingga dihasilkan gulapereduksi. Banyak laboratorium ternyata hingga sekarang masihmenggunakan semua metoda konvensional terse but di atas.Pemakaiannya terbatas pada analisa bahan makanan yang hanyamengandung satu atau dua macam gula saja, misalnya dalamindustri sirop, minuman ringan, susu dan hasil olahannya.

Sejalan dengan berkembangnya teknik kromatografi, analisayang selektif dari tiap jenis gula mulai dirintis (3) denganmenggunakan kromatografi lapisan tipis (KL1) dan kromatograficairan tekanan tinggi (KCK1). Penelitian metoda analisa gulatelah dikembangkan dengan menggunakan berbagai macamkolom. Jenis kolom yang digunakan pada analisa KCKT ini akandiuraikan secara lebih lengkap dalarn makalah ini.

ANALISA GULA DENGAN KROMATOGRAFILAPISAN TIPIS (KLT)

Analisa gula menggunakan metoda KLT dimulai oleh Stahldan Kaltenbach (4). Dua kelompok peneliti KLT lainnya Scherz(5) serta Ghebregzabher (6) kemudianmencoba merangkum hasilpenelitian analisa gula dengan KLT. Sampai tahun 1984,penelitian analisa gula dengan KLT masih terus berlangsung (7)

JKTI Vol. 2 No. 1-2 1992

*) Sebagian dari makalah pernah dipresentasikan pada Kongres Ilmu Pengetahuan NasionallV, Jakarta, 8-12 September 1986.

93

terutama dalam usaha mengoptimasikan kondisi pemisahan me-nuju pada metoda analisa yang cepat dan tepat.

Fasa diam yang sering dipakai dalam analisa gula denganKLT adalah tanah diatomea (kieselguhr), selulosa dan silika.Tanah diatomea mempunyai kelemahan karena mengandungpengotor yang dapat bereaksi dengan gula. Apabila dibandingkandengan kieselguhr dan selulosa, fasa diam silika mempunyaikelebihan yaitu waktu analisa relatif cepat dan kapasitas nodarelatif besar. Oleh sebab itu dari ketiga jenis fasa diam di atas,silika merupakan fasa diam yang paling banyak digunakan padaanalisa gula dengan KLT.

Walaupun penelitian dengan fasa diam silika telah banyakdilakukan, tetapi hasil yang diperoleh sangat tidak memuaskankarena noda-noda yang dihasilkan berekor, Oleh sebab itupenelitian dengan fasa diam silika kemudian dilanjutkan denganteknik impregnasi (8,9,10).

Impregnasi pada diam silika dapat dilakukan dengan men-campurkan impregnatan berupa garam anorganik atau asam lemahpada fasa diam. Garam-garam anorganik 'yang dipakai adalahgaram natriumbisulfit, borat, tetraborat, fosfat, dan tungstat,sedangkan asam yang biasa digunakan sebagai impregnatanadalah asam borat.

Dari berbagai macam impregnatan tersebut di atas perludiketahui impregnatan mana yang terbaik; Lato dan kawau-kawan (8) menyatakan bahwa masing-masing impregnatan mem-punyai kelebihan dan kekurangannya tergantung dari jenis gulayang dianalisa dan ~Iuen yang digunakan. Pemakaian natriumasetat dan dinatrium fosfat akan menghasilkan noda yang relatiflebih bundar dan efek difusi yang relatif lebih keci\. Selain itu,dinatrium fosfat menghasilkan warna noda yang lemah dan Rfyang lebih rendah. Pol a pemisahan yang terjadi pada fasa diamyang diimpregnasi dengan ketiga jenis garam tersebut di atas akanberbeda dengan pola pemisahan yang dihasilkan oleh asam borat.Oleh sebab itu pada KLT dua dimensi, sering digunakan garamasetat atau fosfat sebagai impregnatan pertama dan asam boratsebagai impregnatan kedua.

Untuk suatu pemisahan yang baik, konsentrasi impregnatandianjurkan antara 0,2-0,3 M. Konsentrasi yang lebih rendah ataulebih tinggi dapat menyebabkan pemisahan tidak efektif lagi.Akhir-akhir ini impregnatan tidak lagi dicarnpurkan pada fasadiam, melainkan dilarutkan dalam fasa gerak (7). Kelemahan daricara ini adalah waktu elusi menjadi lebih lama dibandingkandengan waktu elusi yang menggunakan sistim eluen tanpaimpregnatan. Teknik impregnasi pada KLT, yang dilakukandalam usaha mengefektifkan pemisahan ini hanya berlaku untukgula sederhana (mono, di dan tri sakarida).

Pelat fasa terikat dengan gugus fungsionil amina telah ditelitiuntuk analisa gula dengan menggunakan sistem eluen asetonitril/air. Ternyata dengan pelat amina dihasilkan noda yang berekor,hasil yang diperoleh ini menunjang hasil penelitian dari Brons &Olieman (11) yang menyebutkan bahwa penggunaan fasa diamamina untuk pemisahan gula mempunyai kendala, karena guguskarbonil bebas dari gula dapat bereaksi dengan gugus amina darifasa diam. Untuk menghambat terjadinya reaksi ini Doner dankawan-kawan (7) menambahkan sejumlah garam sebagai inhi-bitor, sehingga reaksi pembentukan basa Schiff antara guguskarbonil dari gula dan gugus amina dari pelat dapat dihambat.Hambatan pada reaksi pembentukan basa Schiff ini dapat terlihatdengan menghilangnya ekor dari noda yang semula tarnpak pad aanalisa gula di atas pelat amina tanpa penambahan garam.

Karena gula bersifat polar, maka eluen yang digunakanumumnya bersifat relatif polar. Pelarut organik yang digunakan

94

dalam sistim eluen biasanya merupakan campuran biner atautemer. Pada campuran biner atau temer tersebut seringditambahkan air sekitar 10-20%. Masing-masing pelarut tersebutselain mengambil bagian dalam interaksi kromatografi, jugaberfungsi untuk melarutkan komponen gula. Eluen yang biasadigunakan umumnya mengandung alkohol (propanol, isopro-panol, butanol), asam-asam lemah (asetat, borat, fosfat) atau basa-basa lemah (amenia, piridin). Eluen yang mengandung piridinbiasanya menghasilkan pemisahan yang paling efektif. (12).

Percobaan analisa glukosa, fruktosa dan sukrosa dalammolasse dari pabrik gula Palimanan Cirebon telah dilakukandengan menggunakan KLT pelat alumunium Sheets Silika gel60G - E. Merck dan campuran pelarut etil asetat/piridin/air{8/2/1} sebagai eluen (13): Sebelum digunakan, pelat diimpreg-nasi dengan larutan natrium fosfat 0,2 M sebanyak 3 kali. Setelahproses impregnasi, pel at dikeringkan pada temperatur 85°Cselama 45 menit dan didinginkan kembali pada temperatur kamarselama 2-3 jam.

Larutan standar gula (glukosa, fruktosa dan sukrosa) dibuatdengan konsentrasi 0,80; 1,60; 3,30; 4,00; 5,00; 6,00; 7,00; 8,00dan 10,00 mg/ml dalam etanol 20%, sedangkan larutan contohmolasse dibuat dengan konsentrasi ± 20 mg/ml dalam 20% etanol.Larutan standar dan contoh tersebut kemudian ditotolkan se-banyak 1-2 J.d,dengan diameter totolan tidak melebihi 1,5 mm.

Pelat kemudian dielusi sebanyak 3 kali; setiap akhir elusi pelatdikeringkan pada temperatur kamar selama ± 1 jam. Visualisasinoda dilakukan dengan menyemprot pelat dengan larutan yangmengandung 4g difenilamin, 4 ml anilin, 30 ml H3P04 85%dalam 200 ml aseton. Pelat kemudian dibiarkan di udara terbukaselama-15 menit dan setelah itu dipanaskan dalam oven, padatemperatur 110°C selama 20 menit. Selain pereaksi anilin-difenilamin, masih terdapat beberapa jenis bahan penampak nodayang lain, yang biasa digunakan untuk visualisasi noda padaanalisa gula yaitu: Anisaldehid-asam sulfat dan naftol-resorsinol-asam suI fat (Tabell).

Tabell. Reaksi Wama Senyawa Gula Pada Lapisan Tipis (14)

NaftolGula Anisaldehid asam resorsinol asam Anilin difenilamina

sulfat" sui fat'

L. Rhamnosa hijau hijau hijau pucatD-Ribosa biruD-Silosa abu-abu hijau muda biru terangL-Arabinosa hijau laming hijau biru biru terangL-Sorbosa ungu merahD-Fruktosa ungu merah hitam merah padamD-Manosa hijau biru mudaD-Glukosa biru muda biru ungu abu-abu hijauD-Gal aktosa hijau abu-abu biru ungu abu-abu hijauSukrosa ungu merah merah mudaMaltosa unguLaktosa kehijauan merah ungu biru ungu

a. Fasa diam Kieselguhr G yang diimpregnasi dengan 0,02 M natrium asetat.Pelarut: Etil asetat/isopropanol 65% [65/35].Silika gel G yang diimpregnasi dengan 0,1 N asam borat.Pelarut: Benzena/asam asetat glasiallmetanol [20/20/60]Silika gel G dibuferkan dengan asam borat atau natrium asetat.

b. Fasa diam

c. Fasa diam

Deteksi noda untuk analisa kuantitatif dilakukan denganmenggunakan Carnag KLT Scanner dengan parameter-parametersebagai berikut: panjang gelombang 365 nm, panjang slit 4 mm,lebar slit 0,6 mm, kecepatan kertas rekorder 40 mm/menit dankecepatan scanning 2 mm/detik. Luas puncak krornatograrndihitung dengan jalan mengalikan tinggi puncak dengan lebarpuncak pada setengah tinggi ,

JKTI Vol. 2 No. 1-2 1992

Aplikasi metoda ini untuk analisa gIukosa, fruktosa dansukrosa dalam molasse, memberikan harga simpangan baku relatifberturut-turut 7,6; 1,9 dan 11,6%. Perolehan kembali dari gIukosa,fruktosa dan sukrosa yang ditambahkan ke dalam molasse ber-turut-turut adalah 86,9; 99,8 dan 83,9%.

Dari uraian tersebut di atas, kelemahan yang paling menonjolpada analisa gula dengan KLT adalah elusi yang berulang kali(3X) dengan waktu elusi yang relatif panjang (setiap akhir elusipelat dikeringkan pada temperatur kamar selama % 1 jam). Dalamupaya mempersingkat waktu elusi, diperkenalkan "HPlLC platesSi 50000" (15). Sebelum digunakan, pelat harus dibersihkanterlebih dahulu, dengan jalan mengelusinya dengan campurankloroform/metanol [Ill] dan kemudian pelat diaktifkan kembalidengan jalan memanaskan dalam oven. selama 30 menit pad atemperatur 110 "C, Campuran mono-, di- dan trisakarida ditotol-kan pada pelat dan setelah itu pelat dielusi dengan campuranasetonitril/air [17/3] [v/v] dengan jarak migrasi 7 em. Pelatkemudian dikeringkan selama 5 menit dalam aliran udara panasdan elusi dilakukan 1 kali lagi, juga dengan jarak migrasi 7 ern.Dengan pelat jenis ini untuk jarak migrasi 2 x 7 cm dibutuhkanwaktu 2 x 10 menit. Limit deteksi yang dapat dicapai dengan caraini adalah 10 ng.

ANALISA GULA DENGAN KROMATOGRAFICAIRAN KINERJA TINGGI (KCKT)

Pemisahan gula pada kromatografi cairan mula-mula dilaku-kan dalam kolom penukar ion. Resolusi pemisahan yang lebihbaik diusahakan melalui pemakaian resin dengan ukuran partikelyang lebih keci!. Waktu analisa yang semula relatif lambat(beberapa hari) dapat dipersingkat menjadi hanya beberapa jamsaja.

Sejalan dengan perkembangan HPLC yang menggunakan fasadiam dengan butir partikel berukuran mikro, dikembangkan pulapembuatan penukar ion dengan bahan dasar silika. Dalam hal iniseparuh bagian dari penukar ion terikat secara kimia pada intisilika. Penukar ion dari bahan dasar silika lebih tahan terhadaptekanan. Dengan bahan ini dapat digunakan kecepatan aliraneluen yang relatif besar, sehingga waktu analisa dapat diper-singkat. .Selain itu, dengan bahan tersebut dapat dihasilkanselektifitas dan efisiensi pemisahan yang lebih baik.

Pemakaian : fasa terikat, baik yang polar maupun yang takpolar pada aplikasi KCKT, menjadi sangat populer, telah dicobapula pemakaian kolom amina, diol, C-18 dan kolom silika "aminemodifier".

KOLOM PENUKAR ION

Khym dan Zill (16) adalah peneliti-peneliti yang p~rtama kalimemperkenalkan metoda pemisahan campuran gula yang telahterkomplekskan dengan borat pada kolom penukar anion. Merekamemisahkan campuran kompleks gula yangbermuatan negatifdengan teknik elusi bertahap dengan menggunakan larutanpenyangga dari berbagai konsentrasi dan pH yang berbeda sebagaieluen. Selain kolom penukar anion, sering pula digunakan kolompenukar kation, seperti misalnya penukar kation Ca+2, Pb+2, danK+ (3,11,17,18). Tetapi ternyata analisa gula dengan penukar ionmemerlukan waktu analisa relatif panjang (60 jam). Penelitiananalisa gula dengan kromatografi ion ini masih terus dilanjutkanantara lain dengan cara menaikkan temperatur kolom dan

JKTI Vol. 2 No. 1-2 1992

mengganti resin dengan ukuran partikel yang lebih kecil, sampaiakhirnya waktu analisa dapat makin dipersingkat. Dengan alatkromatografi ion otomatis buatan Technicon, Kesler (19) dapatmelakukan analisa gula dalam waktu sekitar 5-6 jam.

Sejalan dengan perkembangan KCKT, muncul usaha untukmembuat fasa penukar ion yang stabil terhadap tekanan. Padaperalatan KCKT, kolom mengalami tekanan sebesar 1000-2000psi. Bahan resin yang sifatnya relatif lunak, kurang tahan terhadaptekanan, sehingga mempunyai keterbatasan untuk dipakai padakecepatan aliran eluen yang relatif tinggi. Dalam usaha membuatfasa penukar ion yang stabil terhadap tekanan, pertama-tamadicoba membuat penukar ion pelikular ("pellicular ionex-changers") dengan jalan melapisi butir gelas padat dengan lapisantipis penukar ion. Ternyata bahan ini tidak memiliki kapasitasmuat yang cukup memadai.

Kemudian dikembangkan bahan penukar ion yang dibuatdengan cara mengikat secara kimia gugus penukar ion padapermukaan silika. Partikel silika yang padat dan keras termasukbahan pengisi kolom yang cukup stabil terhadap tekanan. Olehkarena itu dengan fasa diam yang dibuat dari bahan dasar silikadapat digunakan kecepatan aliran eluen yang relatif tinggi gunamempersingkat waktu analisa.

Pada penukar ion jenis ini biasanya digunakan partikel silikayang berpori, yang berikatan dengan suatu polimer yang mem-punyai gugus-gugus fungsional berbentuk ion. Dengan bahankolom jenis ini, analisa gula pada KCKT dengan kolom penukarion dapat dilakukan dalam waktu yang relatif singkat yaitu 10-50menit. Akan tetapi, waktu hidup kolom penukar ion relatifpendek. Setelah 20-30 kali injeksi, bagian ujung kolom akariberubah menjadi hitam dan untuk itu perlu diganti dengansejumlah resin yang baru. Selain itu, kolom penukar ion setelahbeberapa waktu harus diregenerasi secara berkala (8 jam untuksetiap regenerasi), kapasitas muat kolom ini sangat rendah danmemerlukan temperatur operasi kolom yang cukup tinggi.

Contoh yang mempunyai kadar ion atau garam sangat tinggimemerlukan perlakuan pendahuluan karena kadar garam yangsangat tinggi akan mempengaruhi waktu elusi sehingga tidakdapat diperoleh puncak yang cukup memadai untuk keperluanpengukuran kuantitatif. Kolorn penukar ion kurang disukai,karena untuk mendapatkan hasil pemisahan yang baik dibutuhkantemperatur kolom yang tinggi. Selain itu kolorn penukar ionmemeriukan regenerasi secara berkala dan mempunyai waktuhidup yang relatif pendek.

KOLOM FASA TERIKAT AMINA

Pemisahan campuran gula sederhana pada kolom fasa terikatamina dilaporkan pertama kali pada tahun 1975 oleh Palmer (20)dan sejak itu kolom amina ban yak digunakan untuk keperluananalisa rutin gula-gula sederhana. Munculnya fasa terikat polaramina mengalihkan pemakaian kolorn penukar ion untuk analisagula pada kolom amina. Selama bertahun-tahun pemisahan guladilakukan dengan kolom ini dengan campuran asetonitril/air 75/25sebagai eluen (21,22).

Baru kemudian pada tahun 1983, Brons dan Olieman (11)dalam suatu publikasinya menyatakan bahwa pemisahan gulapada kolom amina dapat melibatkan reaksi antara gugus aminadari fasa diam itu sendiri dengan gugus karbonil dari molekul-molekul gula yang dianalisa membentuk basa Schiff. Terjadinyareaksi ini dapat menyebabkan kesalahan yang sangat besar karenasebagian gula tertinggal di dalam kolom. Dari hasil penelitianBrons terlihat bahwa kesalahan analisa yang diperoleh bcrkisar

95

Jenis Gula k'

Rhamnosa 0,55 Mooosakarida

Xylosa 0,72 - Triosa- Pentosa

Fruktosa 0,93

Glukosa 1,17 - Heksosa

Galaktosa 1,24

Sukrosa 1,88

antara 0-100%, tergantung dari jenis, temperatur dan umur kolom.Kesalahan yang relatif kecil didapatkan apabila digunakan kolomyang telah lama dipakai. Pada kolom tersebut, dapat dikatakanhampir tidak ada lagi gugus-gugus amina dari fasa diam yangmasih bebas bereaksi karena telah jenuh terhadap pembentukanbasa Schiff.

Brons kemudian menyimpulkan bahwa terjadinya reaksi diatas merupakan sebab utama dari waktu hidup kolom fasa terikatamina yang relatif pendek. Setelah sejumlah tertentu analisa/injeksi, puncak-puncak kromatogram yang dihasilkan kolom ter-sebut Makin menjadi tak simetris dan terjadi pula evolusi wakturetensi.

Sebenarnya kemungkinan terjadinya reaksi pembentukan basaSchiff antara fasa diam dan molekul-molekul gula telah banyakdibicarakan di kalangan ahli kromatografi, jauh sebelum hasilpenelitian Brons dan Olieman dilaporkan. Para peneliti mencobamencari kemungkinan penggunaan jenis fasa diam yang lainsebagai pengganti fasa terikat amina.

KOLOM FASA TERIKAT DIOL

Fasa terikat diol [Si-O-Si-(CH2h-O-CHr(OH)-CH2(OH)],telah dicoba untuk digunakan pada pemisahan gula, denganmaksud melibatkan interaksi antara gugus OH dari fasa dioldengan gugus-gugus OH dari gula ke dalam mekanisme retensi,Dengan adanya perbedaan letak gugus-gugus OH dari tiap jenisgula diharapkan akan terdapat perbedaan yang cukup selektif padaretensi masing-masingjenis gula tersebut.

Telah dicoba untuk menginjeksikan campuran larutan gula kedalam kolom Lichrosorb Diol-E Merck dan faktor kapasitas (k'yaitu tr-tJto) dari masing-masing jenis gula dapat dilihat padaTabel 2. Pemisahan yang diperoleh cukup baik, tetapi daripengamatan ternyata bahwa fasa diam Diol di dalam kolom dapatmembengkak (swelling), jika air dipakai sebagai salah satucampuran eluen. Pembengkakan tersebut diduga disebabkankarena terjadi reaksi polimerisasi pada pembuahan fasa Diol.

Tabel 2: k' Gula pada Kolom L1chrosorb Diol.

Herman (25) menerangkan bahwa pembuatan fasa diol dapatmenghasilkan bentuk polimer atau monomer tergantung dari carabagaimana fasa tersebut dibuat. Jika yang diharapkan terjadiadalah bentuk monomerik, maka reaksi antara gugus-gugussilanol dari permukaan silika dengan GOX (glisidoksipropiltrime-toksisilan) harus berlangsung dalam media toluen anhidrat. Tetapisebaliknya jika yang diharapkan bentuk polimerik, maka ke dalamcampuran reaksi hendaknya diteteskan sedikit air. Menurutketerangan perusahaan (E.Merck), Lichrosorb Diol yang diguna-kan hanya terdiri dari bentuk monomer, tetapi ditinjau darimekanisme reaksi pembuatannya terlihat bahwa reaksi yangberlangsung tidak cukup selektif dalam menghasilkan suatu fasa

96

terikat yang 100% monomer. Terjadinya sebagian bentuk polimerrupanya tidak dapat dihindarkan dan terdapatnya bentuk polimerinilah yang merupakan sebab utama terjadinya pembengkakan.

Secara visual, pembengkakan ini dapat diamati dengan naik-nya tekanan pada pompa secara terus-menerus, selama kolomdisetimbangkan dengan eluen. Tekanan yang selalu berubah initidak memungkinkan pengerjaan analisa yang tepat karena wakturetensi komponen selalu berubah.

Terjadinya pembengkakan ini sebenarnya dapat dikurangi jikaeluen tidak terlalu banyak mengandung air. Tetapi untuk pemisah-an gula ini, mengurangi jumlah air dari eluen berarti memperkecilkelarutan gula di dalam eluen. Hal ini justru harus dihindarkankarena dapat mengakibatkan puncak komponen melebar (ber-ekor) , resolusi pemisahan akan menjadi lebih buruk dan yanglebih parah lagi ada kemungkinan sebagian gula akan mengendapdi dalam kolom.

Selanjutnya dapat disimpulkan bahwa bila ternyata kolom dioltidak memberikan harapan, maka harus dipikirkan untuk mencarifasa diam lain. Kelihatannya kromatografi fasa terbalik dengankolom tak polar (C-2, C-8 dan C-18) dapat memberikan harapan.Di dalam kromatografl fasa terbalik, air selalu dipakai sebagaicampuran eluen dan hal ini sesuai jika kita kaitkan dengankelarutan yang baik dari gula dalam air.

KOLOM FASA TERIKAT C-18

Pemisahan guia invert, sukrosa dan rafinosa dilakukan padakolom CI8 (26). Di dalam suatupenelitian pendahuluan (27) telahdicoba melakukan pemisahan 10 jenis monosakarida, 5 jenisdisakarida dan rafinosa melalui kromatografi fasa terbalik padakolom RP-18, E, Merck: dengan menggunakan hanya air sebagaieluen (Tabel 3).

Ternyata pada kondisi ini masing-masing monosakarida tidakdapat dipisahkan karena setiap monosakarida keluar dalam waktuyang hampir bersamaan, segera setelah to (waktu retensi puncakpelarut). Jadi terlihat hampir tidak ada retensi komponen di dalamkolom.

Tabel3: k' Gula pada Kolom RP-18

lenis Gula k'

D. Gliseraldehid 0,87Silosa 0,23Ribosa 0,39Glukosa 0,31Galaktosa 0,31Sorbosa 0,31Fruktosa 0,34Mannosa 0,34Rharnnosa 0,48Digitosa 0,74Laktosa 0,35Melibiosa 0,42Trehalosa 0,48Selobiosa 0,58Sakarosa 0,74Rafinosa 1,38

- Disakarida

- Trisakarida

Yang perlu diusahakan selanjutnya adalah mencoba agarkolom dapat menahan lebih lama komponen gula, sekaligusmenghasilkan retensi yang lebih selektif untuk tiap jenis gula.Untuk maksud tersebut, yang periu dicoba adalah analisa guladengan kromatografi pasangan ion (suatu modifikasi dari kroma-

JKTI Vol. 2 No. 1-2 1992

tografi fasa terbalik). Dengan jenis kromatografi ini, diusahakanuntuk memodifikasi fasa diam (umumnya yang tak polar) agarsedikit berubah sifatnya sehingga dapat menahan komponendengan lebih kuat dan selanjutnya komponen dapat dipisahkansecara lebih selektif pada fasa tersebut (28). Persoalan utamaadalah mencari jenis pasangan ion yang sesuai, yang tampaknyaharus dicari dengan sistim coba-coba, karena praduga teori dalamhal ini belum dapat berbicara banyak.

KOLOM SlUKA •AMINE MODIFIER·Masih dalam usaha mengatasi kendala yang dihadapi dalam

pemakaian kolom fasa terikat amina dengan umur kolom yangrelatif pendek, beberapa penelitian berusaha mencari modifikasidari jenis kolom ini. Pada tahun 1978, Aitzetmuller (29,30)mencoba menggunakan pereaksi polifungsionil amina (NATECAmine Modifier 1) untuk memodifikasi permukaan suatu kolomsilika. Di dalam penggunaannya, pereaksi amina tersebut dicam-purkan pada eluen dan diharapkan selama kolom disetimbangkandengan eluen, pereaksi amina yang terdapat di dalarn eluentersebut dapat memodifiksi permukaan silika. Gugus polifungsi-onal amina yang terikat pada permukaan silika ini dianggap sudahtidak reaktif lagi, sehingga pembentukan basa Schiff dapatdihindari. Temyata kolom silika yang dimodifikasi ini mampumemisahkan campuran gula sederhana, sama baiknya seperti padafasa terikat amina. Wheals dan White (31) juga melaporkan hasilpenelitiannya dengan menggunakan berbagai jenis amina untukmelapisi/memodifikasi kolom silika. Mereka menyimpulkanbahwa setiap jenis amina menghasilkan retensi dan kemampuanyang juga berbeda dalam memisahkan komponen-komponen gula.

Salah satu jenis pereaksi polifungsional amina yang kemudianjuga banyak dipakai oleh para peneliti lain (31,32,33,34) adalahTEPA (Tetraetilenpentamin). Dalam usaha menggantikan pereaksiTEPA yang relatif sukar diperoleh dalam keadaan dan kualitasyang sama, WATERS (35) mencoba memproduksi pereaksiSAM-l dan SAM-2. Dilaporkan kemudianbahwa dengan pere-aksi SAM-l dapat diperoleh resolusi pemisahan yang sarnabaiknya seperti pada kolom amina atau kolom silika 'yangdimodifikasi dengan pereaksi TEPA. Selain itu dilaporkan bahwadengan pereaksi tersebut dapat diperoleh garis dasar (base line)yang relatif stabil. Pereaksi SAM-2 dibuat untuk memberikanpemisahan yang sedikit berbeda dari pereaksi SAM-I. PereaksiSAM-2 dikhususkan bagi pemisahan monosakarida dan pereaksiini mampu memisahkan fruktosa, galaktosa dan glukosa, suatu halyang tidak mungkin dapat dicapai baik oleh TEPA maupun SAM-1. Tetapi penggunaan pereaksi SAM-2 hanya efektif pada batasdaerah konsentrasi asetonitril yang relatif sempit (80-87%)dibandingkan terhadap batas konsentrasi asetonitril yang diguna-kan pereaksi SAM-l atau kolom amina (70-85%). Karena alasaninilah maka pereaksi SAM-2 hanya digunakan untuk memisahkanjenis-jenis gula yang tidak terpisahkan dengan baik pada kolom-kolorn yang lain.

Telah dicoba pemakaian pereaksi SAM-l pada- pemisahangula (36) dalam aplikasinya untuk berbagai macam keperluanseperti: memantau proses fermentasi jambu mete (37,38),memeriksa kandungan sukrosa, glukosa dan- fruktosa dalam gulanira (39) serta memantau proses degradasi sukrosa yang terjadipada air nira, pada saat penampungan dan selama waktu penyim-panan (sebelum air nira tersebut diproses menjadi gula). Ternyataair nira yang baru disadap dari pohonnya, hanya mengandungsukrosa saja. Oleh aksi mikroorganisme, sukrosa tadi dapat teruraimenjadi glukosa dan fruktosa. Kandungan glukosa dan fruktosayang relatif tinggi tidak dikehendaki karena dapat menjadikangula yang terbentuk tidak cukup keras. Untuk analisa gula ini

JKTI Vol, 2 No. 1-2 1992

telah dicoba pula untuk melakukan studi perbandingan metodaHPLC dengan cara Nelson Somogyi (spektrofotometer).Berdasarkan hasil yang diperoleh (37) dapat disimpulkan bahwaantara metoda HPLC dan metode Spektrofotometri terdapatkorelasi yang cukup baik, Selain itu metoda HPLC menawarkankeunggulan pemisahan dan penentuan gula secara individual.

KESIMPULAN

Penelitian di bidang analisa gula masih memerlukan banyakperhatian. Metoda kromatografi terlihat memberikan harapanuntuk dapat menyelesaikan masalah analisa yang cukup rumit ini.

Analisa gula menggunakan TLC banyak dilakukan pada pelatsilika yang telah diimpregnasi dan sejak tahun 1990 telah puladiperkenalkan pel at HPTLC Si 50000 yang diperuntukkan khususuntuk pemisahan gula.

Metoda pemisahan gula secara HPLC menggunakan kolomamina sempat merupakan metoda yang banyak dipakai selamabertahun-tahun. Baru kemudian keluar pemyataan bahwasanyapemisahan gula pada kolom amina dapat melibatkan reaksi antaragugus karbonil dari gula dengan gugus amina dari fasa diammembentuk basa Schiff. Dengan tujuan mengelimasipembentukan basa Schiff, pemisahan gula kemudian banyakdilakukan pada kolom yang mengandung gugus polifungsionalamina yang sudah tidak reaktif lagi.

DAFfAR PUSTAKA

i. A.M.L. Hart, H.l. Fischer, Modern Food Analysis, SpringIerVerlag, New York, 1972.

2. K. Robards, M. Whitelaw, Chromatography, of Monosaccha-rides and Disaccharides,J. Chromatogr., 373: 81-110 (1986).

3. E.C. Conrad, 1.K. Palmer, Rapid analysis of carbohydrates byHigh-Pressure Liquid Chromatography, Food Technology,30:84-92 (1976).

4. E. Stahl, U. Kaltenbach, Trace Analysis of Sugar Mixtures onlayers of Kieselguhr G.J. Chromatogr., 5: 50-61 (1961).

5. H. Scherz, G, Stehlik, E. Bancher, K. Kaindl, Thin LayerChromatography of Carbohydrate, Chromatogr Rev., 10: 1-30(1968)

6. M. Ghebregzabher, S. Rufini, G.M. Safia, M. Lato, Improvedthin-layer chromatography methods for sugar separations, J.Chromatogr., 180: 1-15 (1979).

7. L.W. Doner, L.M. Biller, High Performance Thin LayerChromatographic-separations of sugars; preparation and appli-cation of aminopropyl bonded phase silica plates impregnatedwith monosodium phosphate, J. Chromatogr., 287:391(1984).

8. M. Lato, B. Brunelli, G. Ciufanni, Thin layer chromatographyof carbohydrate on silica gel impregnated with sodiumacetate, monosodium acetate and disodium phosphate, J.Chromatogr., 39: 407-417 (1969).

9. L. Bruce, P. Welch, E. Martin, Quantitative analysis of sugarsby densitometric inspection of thin layer chromatogram;analysis methods,]. Chromatogr., 72: 359-364 (1972).

10. R. Gauch, U. Leuneunberger, E. Baumgartner, Quantitativedetermination of mono-, di- and trisaccharides by thin-layerchromatography,]. Chromatogr., 72: 359-364 (1972).

11. C. Brons and c., Olieman. Study of the high performanceliquid chromatography separation of reducing sugar applied to

97

the determination of lactose in milk. J. Chromatogr., 259: 79-86 (1983).

12. J.L. Kwan, N, David and Z. Albert, Determination of glucose,fructose and sucrose in molasses by high performance thinlayer chromatography,J. Chromatogr., 174 (1979) 187-193.

13. S. Sumartini, J. Kantasubrata, Analisa Glukosa, Fruktosa danSukrosa dari molasse menggunakan KLT yang di Impregnasi,Proceedings Kongres Nasional ke 3 dan Seminar IlmiahHimpunan Kimia Indonesia, Jakarta, Juli 7-9, 1988, haJ. 463-472.

14. E. Stahl, Thin layer Chromatography-A Laboratory Hand-book, Springier Verlag, 2nd edition, 1969.

15. W. Funk, F, Gilles, S. Netz, K. Patsch, Let's make things hotfor sugars,MERCK Spectrum, I : 14-15 (1990)

16. J.X. Khym, L.P. ZiJI, The separation of sugars by ionexchange J. Am. Chem, Soc., 74:2090 (1952).

17. R.R. Rojas, R.E. Lee, J.G. Baust, D.L. Hendrix, D. Friday, H.James, Comparative Separation of Low Molecular WeightCarbohydrates and Polyols by HPLC: Radially CompressedAmine Modified Silica Versus Ion Exchange". J. Chro-matogr., 261: 65-75 (1983).

18. R.C. Pettersen, V.H. Schwandt, JJ. Effiand, An Analysis ofthe Wood Sugar Assay using HPLC: A Comparison withPaper Chromatography,!. Chromo Sci., 22: 478-484 (1984).

19. R.B. Kesler, Rapid quantitative anion-exchange chromato-graphy of carbohydrates, Anal. Chem.,39: 1416-1422 (1967).

20. J.K. Palmer, W.B. Brandes, Determination of sucrose,glucose, and fructose by liquid chromatography, J.Agr. FoodChem., 22: 709-712 (1974).

21. Ripphahn. Chromatographie dans I'analyse alimentaire,Manuel pour Ie practicien, E. Merck, Darmstadt, 94 (1981).

22. V. Pechanek, G. Blaicher, W. Pannhauser, H. Woidich,Application of column Liquid Chromatography (HPLC) toSpecial Problems in Food Chemistry, Chromatographia, 13:421-427 (1980).

23. Julia Kantasubrata, Etude des Proprietes Chromatographiquesde la Phase Diol, Rapport de Stage de DEA (DiplimeD'Etudes Approfondies), Universite D'AIX Marseille III -France,1983.

24. AM. Siouffi, J. Kantasubrata, G. Guiochon, Evaluation ofthe potentialities of diol column in normal and reversed phaseliquid chromatography, Proceedings of the 15th internationalsymposium on chromatography, Nurnberg, 1984, pp.173.

25. D.P. Herman, L.R. Field and Abboth, The size exclusionchromatographic behavior of syntetic water-soluble polymerson diol bonded phase supports.J. Chromatogr. Sci. 19:470-76(1981).

26. G.. Palla, C18 reversed-phase liquid chromatographic

98

determination of invert sugar, sucrose, and raffinose, Ana~Chem. 53: 1966 (1981).

27. J., Kantasubrata, S. Sumartini, Problems on sugars analysis bychromatographic method. Proceedings of Ninth AustralianSymposium on Analytical Chemistry,1: 230-233 (1987).

28. J. Kantasubrata, tidak diterbitkan.29. K. Aitzetmuller, Sugar analysis by high performance liquid

chromatography using silica columns, J. Chromatogr.,156:156 (1978).

30. K. Aitzetmuller, M. Bohr, E. Arzberger, Separation of HigherSugars using HPLC Amine Modifier, J. of H.R.C. & C.C., 2:589 (1979).

31. B.B. Wheals, P.c. White, In-situ modification of silica withamines and its use in separating sugars by high-performanceliquid chromatography, J. Chromatogr., 176:421 (1979).

32. D.L. Hendrix, R.E. Lee Jr., J .G. Baust, H. James, Separationof Carbohydrates and polyols by a radially compresed highperformance liquid chromatographic silica column modifiedwith tetrathylenepentamine,J. Chromatogr., 210: 45 (1981).

33. J.G. Baust, R.E, Lee Jr., R.R. Rojas, D.L. Hendrix, D. Friday,H. James, Comparative separation of low-molecular weightcarbohydrates and polyols by high-performance liquid chro-matography: Radially compressed amine modified silicaversus ion exchange,!. Chromatogr., 261: 65 (1983).

34. R.E. Lee Jr., D. Friday, R.R. Rojas, H, James, J.G. Baust, Anevaluation of eluent recycling and column life for HPLCanalysis of carbohydrates, J. of Liq Chromatogr., 6:1139-1151(1983).

35. Choosing the right column chemistry -for carbohydrateanalysis. Notes Food & Beverage, Waters ChromatographyDivisionMillipore Corporation 2: 4-6 (1987).

36. S. Sumartini, J, Kantasubrata, The determination of sugars bychromatographic method, makalah dipresentasikan padaInternational Chemistry, Brisbance, 28 August-2 September1989.

37. J. Kantasubrata, AT. Karossi dan AS. Pramudi, HPLC in theanalysis of cashew apple juice fermentation broths, makalahdipresentasikan pada International Conference: Biotechnologyand Food, Stuttgart, 20-24 Februari 1989.

38. Julia Kantasubrata dan AT. Karossi, Alternative methodsused for monitoring cashew-apple fermentation process, FoodForum Proceedings, Chemistry International, Brisbane, 1989,haJ. 133.

39. Soemanto Imamkhasani, Julia Kantasubrata, Sri Sumartini,Analysis of Mono and Disaccharides in Indonesia PalmSugars using HPLC method, J. Chromatogr. Sci., 27:676-679(1989). .

JKTI Vol. 2 No. 1-2 1992