Aspek Aplikasi KCKT KG

7/21/2019 Aspek Aplikasi KCKT KG

http://slidepdf.com/reader/full/aspek-aplikasi-kckt-kg 1/8

2013/4/

Aspek Aplikasi dan review

KCKT & KGIrmanida Batubara

KIM 234- TEKNIK PEMISAHAN 1

Kromatografi Metode fisik untuk pemisahan dengansenyawa yang akan dipisahkah terdistribusidiantara dua fase yaitu fase diam dan fasegerak dengan arah yang pasti (Definisi IUPAC

1993)

Jenis kromatografi

1. Kromatografi kolom

2. Kromatografi kertas

3. Kromatografi lapis tipis

4. Kromatografi gas-cair

5. Kromatografi cair kinerja tinggi (tekanan tinggi)

Review

TEORI KROMATOGRAFI KOLOM

Kromatografi didasarkan pada partisi komponen-komponen yangmerupakan suatu tipe kesetimbangan dimana komponen-komponen

akan terbagi diantara fase diam dan fase gerak

K = koefisien partisi/distribusi

CS = konsentrasi analit dalam fase diam

CM = konsentrasi analit pada fase gerak

K diinginkan konstan pada berbagai konsentrasi, jika tidak konstan kita

dapat bekerja pada kisaran yang lebih sempit saat K konstan

kromatografi linier

Pada kromatografi linier laju alir yang tetap dari fase gerak bergeraksepanjang kolom K cenderung konstan

Elusi: proses dimana analit akan melewati kolom dibawa oleh fase

gerak (dapat cair atau gas)

M

S

C

CK


waktu retensi/retention time (tR):

waktu yang dibutuhkan molekul yang

tertahan pada fase diam untuk

mencapai detektor

waktu mati/dead time (tM): waktu yang

dibutuhkan molekul yang tak tertahan

pada fase diam untuk mencapai detektor

volume retensi: volume fase gerak

yang dibutuhkan untuk menggerakkan

molekul dari saat injeksi hingga

mencapai detektor

Baseline width (w): lebar pita senyawa

yang terukur pada garis dasar


Faktor Kapasitas

Distribusi solut (S) diantara fase diam dan fase gerak dapat digambarkan

dengan reaksi kesetimbangan:

Sfase gerak Sfase diam

Sehingga akan berhubungan dengan koefisien partisi (KD)dan rasio

distribusi (D)

Selama solut tidak mengalami kesetimbangan dengan fase diam dan fasegerak maka koefisien partisi dan rasio distribusinya akan sama

Mol total solut akan konstan selama proses pemisahan

(mol solut)total = (mol solut)fase diam + (mol solut)fase gerak

totalgerak fase

totaldiamfase

gerak fase

diamfase

D

]S[

]S[D

]S[

]S[K


diamfasegerak fase

gerak fasegerak fasetotal

gerak fasegerak fase

diamfasegerak fasetotal

V)solutmol(

V)solutmol()solutmol(

V/)solutmol(

V/])solutmol()solutmol[(D

maka fraksi solut dalam fase gerak (f m):

diamfasegerak fase

gerak fase

total

gerak fase

mVDV

V

)solutmol(

)solutmol(f

Karena volume fase diam dan fase gerak tak dapat diketahui secara pastimaka persamaan di atas dapat disederhanakan dengan membagi pembilang

dan penyebut dengan Vfase gerak yang akan menghasilkan persamaan berikut:

'

gerak fasediamfase

mk 1

1

)V/V(D1

1f

gerak fase

diamfase'

V

VDk faktor kapasitas

Suatu ukuran seberapa kuat solut akan tertahan pada fase diam mengevaluasi pemisahan (optimal, k’= 2-10, tidak baik k’= 1, lambat, k’ < 1)



2013/4/


Faktor kapasitas solut dapat dihitung dari kromatogram denganmenghitung waktu mati (tM) dan waktu retensi (tR)

Laju alir rerata fase gerak () bernilai sama dengan pembagian antara

panjang kolom (L) dan solut yang tak tertahan pada fase diam (tM)

Dengan alasan yang sama maka laju alir rerata solut (v):

Solut hanya dapat bergerak melewati kolom saat terbawa oleh fase gerak.

Oleh karena itu laju alir reratanya merupakan produk dari laju alir rerata

fase gerak dan fraksi solut yang terdapat pada fase gerak

v = f m

Mt

L

R t

Lv


Substitusi dari beberapa persamaan diatas maka akan menghasilkan persamaan:

dengan adalah waktu retensi adjusted perbedaan antara waktu retensi

solut dan waktu mati

M

'R

M

MR '

'

MR

t

t

t

ttk

k 1

1

t

L

t

L

'

R t

Dalam analisis kromatografi senyawa asam berbobot molekul rendah, asam

butirat dielusi dengan waktu retenti 7.63 min. Waktu mati sebesar 0.31 min.Tentukan faktor kapasitas untuk asam butirat

K’ = tr -tm/tm


Selektivitas Kolom

Selektivitas relatif dari suatu kolom kromatografi untuk solut yang

berdekatan dapat dilihat dari nilai faktor selektivitasnya

Faktor Selektivitas rasio antara faktor kapasitas dari dua solut akan

menggambarkan selektivitas kolom untuk salahsatu solut ()

Semakin besar nilai maka pemisahan yang terjadi semakin baik

MA,R

MB,R

'

A

'

B

tt

tt

k

k

dari kromatogram


Dalam analisis kromatografi untuk asam berbobot molekul rendah sebelumnya,

waktu retensi asam isobutirat ialah 5.98 min. Berapa faktor selektivitas untuk

asam isobutirat dan asam butirat

Pertama tentukan faktor kapasitas untuk asam isobutirat, lalu tentukan

faktor selektivitasnya


Pelebaran Pita Kromatografi

Pita suatu solut dapat melebar saat bergerak melewati kolom. Salah satupenyebabnya yaitu adanya difusi


Tailing

Disebabkan oleh adanyasisi aktif yang cukup tinggi

pada fase diam

Fronting

Disebabkan oleh injeksisampel yang terlalu

banyak

Pita kromatogram yang nonideal



2013/4/

Isotherms and their resulting chromatographic band shapes

TEORI KROMATOGRAFI KOLOM TEORI KROMATOGRAFI KOLOM

Dengan mengkombinasikan persamaan-persamaan di atas makadiperoleh:

Jumlah pelat teoretis

Alternatif lainnya:

w1/2 = lebar pita pada setengah tinggi pita

2

R

2

R

2

w

t16 N

t16

wLH

2

2/1

R

w

t545,5 N


Dalam analisis kromatografi untuk pestisida terklorinasi Dieldrin didapat puncak

dengan waktu retensi 8.68 min dan lebar baseline 0.29 min. Berapa banyakpelat teoritis yang terlibat dalam pemisahan? Jika kolom yang digunakan untuk

analisis memiliki panjang 2.0 m, berapakah tinggi pelat teoritisnya


Kelemahan dari Teori Pelat:

1. Dengan asumsi bahwa K tidak dipengaruhi oleh konsentrasi

2. Dengan asumsi bahwa kesetimbangan akan diperoleh relatif cepat

terhadap laju alir fase gerak tidak benar, dalam kenyataannya solutmungkin melewati pelat tanpa memasukinya

3. Dengan asumsi tidak ada difusi longitudinal (= efek non ideal yangakan mempengaruhi pelebaran pita)

4. Tidak memperhatikan beberapa faktor yang dapat disebabkan olehkecepatan laju alir (cepat atau lambat) teori kecepatan

5. Dengan asumsi adanya pelat/unit diskret untuk menjelaskan proseskesetimbangan daripada proses semi kontinyu yang akan melewatikolom

1. Pompa

• Pompa tidak dapat memompa udara. Jika

udara terdapat dalam pompa apakah yang

akan rusak kolom atau pompa?

• Cek selalu: laju alir, tekanan minimum dan

maksimum, keran purge, dan pencampur fase

gerak




2013/4/

2. Sambungan aliran

• Cek apakah tabung pengalir berada di

tempatnya

• Apakah penyambung terikat kuat?

• Apakah penyambungnya cocok?

• Perhatikan kondisi nut dan ferrule


3. injektor

• Jangan gunakan jarumyang runcing

• Cuci selalu setelahmenggunakan bufer

• Hindari partikel masukdengan cara menyaringsampel sebelum injeksi

• Jangan gunakan wadahdari logam


3. injektor: kebocoran

• Bocor antara stator danstator ring

• Bocor pada needle portketika loading saja

• Cairan keluar olehsiphoning out

• Kebocoran terus

menerus pada needleport atau jalur vent

• Lepasnya set screwsatau kencangkan statorscrews

• Kencangkan seal needledengan mendorongdalam guide

• Tepatkan tinggi outlettubes

• Permukaan rotordilepas dan diganti


3 injektor: volume injeksi

• Jangan menginjeksilebih dari 50% volumeloop karena cairan akanberdifusi

• Mencuci needle porttube: gunakanrekomendasi daripembuat alat

• Cuci saat posisi injek

mengapa?

• Sample loopdicuci/didorong denganfase gerak

• Mengetahui injektorclogged


3. injektor: Mencuci stator dan stator

face

• Cuci ketika pompa mati,

• Lepaskan hubungan

dengan sample loop

dan ke kolom

• Gunakan syringe,

pompa dengan cairan

bersih (seperti metanol

atau air murni) melalui

ports


4. Pompa

• Cuci dengan air setelah menggunakan bufer

• Ganti seals pada waktunya

• Cek keran

• Jangan biarkan padatan masuk ke fase gerak




2013/4/

Kalibrasi

• Mengapa perlu kalibrasi

• Untuk detektor UV-Vis: Ketepatan panjang gelombang,

Keterulangan panjang gelombang, Linearitas absorban,Ketepatan absorban absolut

From column

To waste

Filter with a known

Absorbance(s)

Flow cell


Kalibrasi

• Mengapa perlu kalibrasi

• Untuk detektor UV-Vis: Ketepatan panjang gelombang,

Keterulangan panjang gelombang, Linearitas absorban,Ketepatan absorban absolut

From column

To waste

Filter with a known

Absorbance(s)

Flow cell


Kalibrasi

Linearity with a solution

of potassium dichromate,

0.01 to 0.20 mg/mL

Wavelength accuracywith a solution of

Holmium oxide

450 nm

640 nm

410 nm


Kalibrasi

• Harus ditulis dalamSOP/POB

• Jadwal kalibrasi harusditetapkan dandijalankan

• Semua standar dan alatharus dapat dilacakoleh NIST, seluruh alatelektrik, stopwatch dan

termometer harusdikalibrasi

• Orang yang melakukankalibrasi harusditraining dantrainingnya harusdidokumentasikan

• Seluruh peralatan harusdiletakkan tanggalkalibrasi, orang yangmengalibrasi dan

tanggal kalibrasiselanjutnya


Kalibrasi

• Lepas hubungan ke

kolom, langsung

sambungkan ke luar

kalibrasi laju alir pompa

menggunakan

stopwatch dan gelas

ukur terkalibrasi

• Kalibrasi injektor: injeksi

10 kali standar,

tentukan rerata luas

puncak dan standar

deviasi dari semua

ulangan, gunakan

volume yang cocok

sesuai dengan sample

loop


Contoh aplikasi pada industri

farmasi

• Check standar?

• System suitabilitystandar?

• Five-point calibration

• Bagaimana caramelakukan standarinternal

• as convictedcounterfeiter ElsworthRoston once observed

• “Quality is your security.”

• “The most important assets of

any business are intangible: itscompany name, brands,symbols, and slogans, and theirunderlying associations,perceived quality, nameassociations, customer base andproprietary resources such aspatents, trademarks, andchannel relationships.”

• -David Aaker, author of severalbooks on branding including:

• Managing Brand Equity, 1991




2013/4/

Contoh aplikasi pada industri

farmasi

Manufacturing

• Keseragaman isi

• Degradasi produk dan

senyawa yang

berhubungan

• Disolusi

• Stability studies

Discovery

• Kemurnian dan

konsentrasi

• Potensial redoks

• Konfirmasi struktur

Development and clinical

trials

• Metabolite monitoring

• Half life in the body

KIM 234- TEKNIK PEMISAHAN 31 32

Levothyroxine sodium is a synthetic

hormone used to treat thyroid disorders.

Hyperpotent dosage - cardiac pain

palpitations, cardiac arrhythmias,

Increased risk of osteoporosis

Subpotent dosage - depression,

lack of concentration, fatigue, weight gain,

edema, loss of concentration, and constipation

IDEAL DOSAGE LEVEL

KIM 234- TEKNIK PEMISAHAN

33

The Future of Instrumentation and the

FDA: 21CFR11

or…

Is a Paperless Laboratory Really

Practical?

KIM 234- TEKNIK PEMISAHAN

Troubleshooting: baseline noise

A) Selama injeksi terjadimasalah pada fasegerak

B) Dalam sistem terdapatgelembung udara yangmenyebabkan lajuirregular noisesetara dengan laju alir.Atau elektronik noise

pada detektor yangsetara dengan laju alir


Troubleshooting: masalah

gelembung udara

• Kecepatan poma berubah

secara teratur

• Degas fase gerak

• Prime pompanya lagi

• Lakukan pengecekatan

pompa secara rutin

• Masalah muncul walau tidak

dijalankan KCKTnya

• Cek detektor

• Cek lingkungan seperti sumber

arus, radio

• Apakah suhu kolom seragam?

Fitting failure

Air bubbles in system.

Good, stable baseline


Troubleshooting: peak fronting &

tailing

Fronting

• Kolom overloaded

• Channels pada fase padat

Tailing

• Intekasi dengan silanol

• Fase diam terdegradasi

• Tidak bersih volume pada void

atau formasinya di awal kolom

• Adanya material yang ikut terelusi

• Tidak cocok analat, fase gerak

dan polaritas kolom




2013/4/

Troubleshooting: Kolom overload

• Resolusi hilang

• Tailing

• Pelebaran puncak

• Pengurangan waktu

retensi

• Volume injeksi kurang

dari 15% volume

puncak• 0.5min x 0.3ml/min =

0.15ml

• 1uG sampel per cm

panjang kolom untuk

kolom dengan diameter

internal 4.6mm


Troubleshooting: Matrix overload

• Ketidakmurnian sampel

matrik menyelimuti

packing kolom danmengurangi resolusi

dan waktu retensi

• Terjadi karena sampel

adalah ekstrak dari

cairan biologis


Troubleshooting: Ghost peaks

• Kontaminasi kolom

• Elusi analat dari running

sebelumnya

• Ganti dan cuci kolom

• Gunakan waktu running

lebih lama, ganti cara

cuci atau gunakan

pelarut yang lebih kuat

pada akhir running

First run Second run


Troubleshooting: ghost peak atau

noise baseline acak

• Kadang muncul karena

perbedaan pelarut

preparasi dan fase gerak

• Kadang ditemukan

noise baseline acak

yang mirip dengan

ghost peaks, turn the

column around and

flush it


Troubleshooting: puncak terpecah

• Volume sampel terlalu

besar

• Injeksi terlalu lama

• Blocked column frit

• Unswept injector flowpath

• Siapkan sampel dengan

melarutkannya dalam fasegerak dengan volume total<15% dari puncak pertama

• Gunakan pelarut yang lebihlemah

• Ganti frit, tambahkanpenyaring, saring sampel

• Ganti injektor rotor


Troubleshooting: drifting baselines

• Terjadi perubahan

seketika baseline saat

pemisahan isokratik

kontaminasi pada

kolom atau detektor

• Perubahan secara

bertahap masalah

detektor

One run Days or weeks




2013/4/

Troubleshooting: gelembung udara

datang lagi

• Ciri-ciri

• Irregular baseline

• Peningkatan waktu

analisis

• Penurunan tekanan

• Cara mengatasi

• Degas fase gerak

• Gunakan in-line

degasser

• Buka keran purge dan

jalankan sistem


Troubleshooting: drifting retention

times

• Laju alir berganti (cek

pompa)

• Tidak terkalibrasinyagradien kontroler

• Gelembung udara

• Bocor

• Kolom rusak

• Perubahan komposisi

fase gerak

• Tidak cocoknya

mencampuran fase

gerak• Menguapkan fase gerak

yang volatil

• Tidak cocoknya pH


Strategi mengurangi waktu analisis

• Kurangi panjang kolom

• Pilih kolom yang pendek dengan partikel size

yang lebih kecil

• Tingkatkan suhu fase gerak

• Tingkatkan laju alir

• Tetap perhatikan resolusinya


TERIMA KASIH

Kromatografi selesai ……………………..


Aspek Aplikasi KCKT KG

Documents

Transcript of Aspek Aplikasi KCKT KG