OBTINEREA PENICILINEI G

1. Domenii de utilizare și proprietațile produsuluiDintre penicilinele de biosinteză, în practica medicală au fost introduse

penicilina G, sub formă de săruri de porasiu, sodiu sau cu amine.

1.1 Domenii de utilizarePotrivit statisticilor, anual se produc cca. 26000 tone penicilina G la nivel mondial. Domeniile de utilizare ale acesteia sunt urmatoarele:

- utilizare în terapeutică: 13%- obținerea de acid 6-aminopenicilanic: 65%- obținerea de acid 7-desoxicefalosoranic și alți intermediari: 20%- alimentație: 2% (2,30)

În cazul utilizării terapeutice a penicilinei G, aceasta prezintă o toxicitate scăzută, fiind activă impotriva agențilot patogeni de tipul bacililor gram pozitivi, a cocilor gram pozitiv și negativ, fiind recomandată în angine streptococice, erizipel, scarlatină, pneumonie streptococică, otite, sinuzite, antrax, difterie, sifilis, blenoragie. Deasemenea este utilizată în profilaxia antitetanică și cea a infecțiilor prin mușcături de animale. Nu este utilizată în cazul infecțiilor cu agenților patogeni secretori de penicilinază (stafilococii ”de spital”) care sunt rezistenți la acțiunea antibioticului. (3,46)

Penicilina G se prezinta cu formula bruta: C16H18O4N2S, masa moleculara Mm=334 moli/g. In comert la noi in tara se gaseste sub denumirile „Penicilina G sodica” si „Penicilina G potasica” produse fabricate de S.C. Antibiotice S.A.

(2S,5R,6R)- 3,3-dimetill-7-oxo-6-(2-fenilacetamido)-4-thia-

1-aza- biciclo[3.2.0]heptan-2-carboxilat

1.2 Proprietățile produsului

Proprietăți fizicePenicilina G se prezintă sub forma unei substanțe albe, cristaline, solubile

in apă și solvenți organici, insolubilă în eter, cloroform, uleiuri grase, parafină. p.t .=80°C Miros slab, caracteristic, gust amar. Substanță higroscopică. (1,86)

Proprietăți chimice .Penicilinene sunt instabile în prezența acizilor, alcalilor, oxidanților,

alcoolilor, metalelor grele și la temperaturi ridicate. Penicilina iși pierde proprietățile in soluții cu pH acid mai mic de 5 sau bazic mai mare de 8. (4,3) In soluții apoase prezintă pH= 5,5-7,5. Prezintă trei atomi de carbon asimetrici (C 3 ,C5 ,C7), fiind optic activă cu αD

2 0 +241°Produsul inițial rezultat prin hidroliza nucleofilă (prezența β-

lactamazelor, a penicilinazelor sau a ionilor metalici) a penicilinei este acidul peniciloic, biologic inactiv, acesta prin acidulare pierde o moleculă de CO 2

trecând în acid peniloic.

ac. peniciloic ac. peniloic

Sub acțiunea clururii mercurice, acidul peniloic se degradează la aldehidă penilică și penicil amină.

Penicilinele reacționează nucleofil cu hidroxiamina formând acizi hidroxiaminici:

In reacția cu alcooli a penicilinelor se formează esteri:

In prezenta de alchilamine, penicilinele formeaza alchilamide.

In mediu acid, penicilinele (1) izomerizeaza la acid penicilinic (10), printr-un mecanism implicand structura de tranzitie oxazolonica(11). Daca concentratia acidului este mare atunci structura oxazolonica trece in acid penicilinic (12) care izomerizeaza rapid fie in acid penilic (10), fie in acid peniciloic(2), functie de pH-ul mediului. La o valoare mai mare a pH-ului, acidul penicilinic trece in aldehida penilica (5) si penicilamina (6).

Proprietați biologicePenicilina G se prezintă sub formă de săruri de sodiu sau potasiu fiind activă

bacteriostatic și bactericid față de bacili și coci grampozitivi. (1,86)În studiul acțiunii biologice a antibioticelor se urmărește stabilirea relației dintre structura

chimică a medicamentului și acțiunea sa farmacologică pe de o parte, iar pe de alta se caută determinarea naturii și a structurii chimice a receptorilor și modul de interacțiune între receptor și medicament.

De exemplu, cunoscându-se acțiunea anestezică a cocainei s-a sintetizat novocaina care este mai ieftină și mai accesibilă.

Proprietățile biologice a penicilinei sunt date de structura chimică, proprietățile fizice și chimice, conformația spațială, natura interacțiunilor cu receptorul, viteza de metabolizare. (1,25)

Penicilinele au ca mecanism de acțiune, impiedicarea formării peretelui celular, prin legarea transversală a lanțurilor aparținând unui polimer peptidoglicanic, format dintr-un lanț de

unități N-acetilglucozamină-acid N-acetilmuramic, cu lanțuri de pentapeptidă-entaglicină, atașate perpendicular. Legătura dintre glicina terminală a pentaglicinei și D-alanină o realizează transpeptidaza membranară. Penicilinele se cuplează cu transpeptidaza, o blochează, imiedicând astfel formarea legăturilor transversale , care asigură existența peretelui bacterian. Celulele microbiene, lipsite de perete, sunt expuse tensiunilor osmotice și mor. Bacteriile care nu au perete celular nu sunt sensibile la acțiunea penicilinelor.

Penicilinele pot acționa asupra funcției enzimatice a proteinelor, ducând la autoliza unora dintre bacterii, sau la inhibarea creșterii. (3, 44)

Administrarea penicilinei se face intramuscular, intravenos sau intrarahidian, la intervale de 6 ore. Eliminarea se produce pe cale renală, în formă nemodificată.

2. Descrierea procesului tehnologic

Procesul tehnologic de obținere a penicilinei G se realizează prin procedeul discontinuu de fermentație în profunzime care prezintă o serie de avantaje precum:

- pericolul de infectare a mediilor de cultură este redus- randament ridicat- procesul este omogen- costuri de investiție reduse

Hidrati de carbon

Extract de porumb Saruri nutritive

Aer nesteril

Abur, 5 a.t .a.

Penicillium crysogenumCondens

Ag. antispumantAcid fenilacetic

Masa celulara

Acetat de butilSol. dil. H 2SO4

Faza apoasa

Sol.NaCO 3

Butanol Solventi reziduali

`CH3Cl3

butanol

Pregatire mediu de cultura

Fermentatie

Filtrare

Extractie

Reextractie

Distilare azeotropa

Filtrare, spalare pe

Sterilizare aer

PenicilinaG

Sterilizare m.c.

Uscare

Descrierea procesului tehnic adoptat.Tehnologia de obtinere a Penicilinei G cuprinde urmatoarele faze:

1.Pregatirea mediilor de cultura 2.Sterilizarea mediilor de cultura si a aerului3.Fermentatia biochimica4.Filtrarea solutiilor native5.Separarea si purificarea penicilinelor

1.Pregatirea mediilor

Mediul de cultura reprezinta substratul nutritiv care contine complexul de substante folosite pentru cresterea si multiplicarea microorganismelor in conditii artificiale . Pregatirea mediului consta in dizolvarea in apa a componentilor acestuia conform retetei pentru fiecare faza a procesului de fermentatie. Mediul de cultura trebuie sa contina hidrati de carbon:, saruri minerale, surse de azot oragnic si anorganic, precursori si apa. Deoarece sterilizarea mediului de cultura de face cu abur direct, cantitatea de apa ce se adauga la prepararea mediului de cultura este mai mica cu o cantitate egala cu cea a aburului care condenseaza in timpul sterilizarii . Pregatirea mediilor de cultura se face in aparate destinate acestui scop, prevazute cu agitatoare, conducte pentru abur, serpentine de incalzire respectiv racire. In aceste aparate se introduce apa, se incalzeste la 50-60°C, apoi se adauga extractul de porumb –principala sursa de aminoacizi- si se fierbe timp de 30-60 minute.Dupa aceasta, solutia se raceste la 50-60°C si se adauga restul componentilor mediului in urmatoarea ordine: CaCO 3 , NH4NO3 , NaSO4 , MnSO4 ,

KH2PO4 , ZnSO 4 , lactoza, glucoza.

Componenții mediului de cultura pe faze de fermentație:

Mediul de cultură astfel realizat va cuprinde următoarele surse de carbon : lactoza și glucoza.

Glucoza, sau dextroza, reprezintă o excelentă sursă de carbon și energie, utilizatăpentru producerea de antibiotic. În special se folosește pentru stimularea creșterii microbiene, însă poate genera și efecte nedorite, de tipul inhibiției de substrat,indezirabile la producerea de metaboliți secundari, cum sunt penicilinele.

Aceste efecte pot fi diminuate prin două cai:

- modelarea adaosului de glucoză în etapa de creștere a biomasei, astfel încât să se ajungă la viteze maxime de creștere și să se reducă la minim concentrația glucozei;- utilizarea zaharurilor cu viteză lentă de metabolizare, cum este lactoza, care poate elibera glucoză și galactoză prin hidroliză enzimatică, în concentrații departe de valoarea inhibitorie. [5.61-62]

Lactoza, dizaharid reducător ( 4 – β – D – galactozido – D – glucoză ), se folosește în stare pură numai pentru biosinteza antibiotecelor, în mod deosebit la obținerea penicilinei. [5.63]

Surse de azot

Necesarul de azot pentru mediul de cultură este asigurat de sursele organice naturale sau sintetice și din sursele anorganice. Microorganismele sunt capabile, în mod obișnuit, să biosintetizeze toate tipurile de molecule de azot (aminoacizi, proteine) plecând de la ionul amoniu (NH4+) în funcție de energia existentă, timp și gradul de tratare mutagenă a sușei cultivate.

Viteza de creștere a microorganismelor atinge valori ridicate numai dacă mediul conține surse organice de azot.

Pentru culturile industriale folosite la obținerea de penicilina G, necesarul de azot este asigurat de extractul de porumb și făina de soia. Aceste surse natrale sunt bogate în proteine și aminoacizi, conținând și acizi nucleic, vitamine, oligoelemente, lipide, zaharuri, compuși cu sulf și fosfor.

Prezența ionului amoniu în mediile necesare fermentațiilor industriale favorizează metabolizarea proteinelor, dar și formarea de produse din categoria antibioticelor. [5.66]

Săruri minerale

În biosinteză, sărurile minerale sunt compuși folosiți drept surse de: - elemente constitutive ale produselor: Na2SO4, ZnSO4, MnSO4, tiosulfat de sodiu;- elemente constitutive ale biomaselor: CaCO3, KH2PO4, NH4NO3;

- modificatori ai presiunii osmotice și ai permeabilității membranelor celulare: CaCO3;- agenți de complexare și de precipitare: ionul sulfat SO4

2- ( Na2 SO4, Mg SO4, KH2SO4 ). [5.67-68]

Precursori

Precursorii sunt compuși organici sau anoganici, care atunci când sunt adăugați în mediul de cultură intervin ca molecule intermediare în biosinteză sau dirijează biosinteza către o anumită direcție.

Acidul fenilacetic dirijează procesul de biosinteză către obținerea de penicilină G, folosind ca microorganism producător Penicillium Chrysogenum. Astfel se favorizează atingerea unor randamente ridicate de biosinteză.

Prin activitatea lor, extrem de eficientă, în procesele de biosinteză, precursorii sunt considerați componente ce nu lipsesc din mediile de cultură, iar pentru a evita efectele inhibitorii aceștia se vor adăuga treptat, menținându-se o concentrație constantă. [5.68]

Reglatori ai proceselor de biosinteză

În biosinteza antibiotecelor se pot folosi unele molecule organice sau anorganice, ce acționează ca inductor, activatori sau represanți.

Un exemplu tipic este ionul fosfat (PO43-), prezent prin KH2 PO4, care după o anumită

concentrație devine un inhibitor pentru acumularea produselor utile. ). [5.69]

2.Sterilizarea este procesul prin care are loc distrugerea sau indepartarea microorganismelor patogene sau apatogene din substante, preparate, spatii inchise, obiecte etc.

Metodele diferite de sterilizare se pot clasifica dupa urmatoarele criterii:a. metode termice:

- sterilizare cu aer cald la 140-200°C- sterilizare cu vapori de apa sub presiune la 120-140°C- sterilizare prin incalziri repetate la 70-100°C

b. metode fizice:- filtrare prin umpluturi fibroase- filtare prin materiale poroase- filtrare prin membrane- utilizarea radiatiilor UV, IR, raze X, β etc.

c. metode chimice:- utilizarea agentilor chimici : oxid de etilena, formaldehida,

fenol, ozon, etc. [7,80]

Sterilizarea mediilor de cultura se poate realize prin metode mecanice(filtrare, centrifugare, flotatie, electrostatic), pe cale termica, cu agenti chimici sau cu unde electromagnetice. S-a ales ca posibilitate de sterilizare a mediului de cultura din industria de biosinteza, sterilizarea cu abur.

Procedeul de sterilizare cu abur este foarte simplu si permite obtinerea unui grad inalt de sterilitate. Acest procedeu prezinta totusi o serie de dezavantaje date de reactiile secundare pe care le sufera principalele componente ale mediului in timpul procesului:

- denaturarea proteinelor si inactivarea enzimelor - degradarea artiala a vitaminelor si a anumitor factori de crestere- supraincalziri ce pot initia reactii chimice.

Aceste dezavantaje sunt diminuate prin alegerea judicioasa a procesului, care este totusi cel mai sigur. Procedeul de sterilizare termica a mediului de cultura poate fi realizat prin procedeu continuu sau discontinuu, utilizand drept sursa de incalzire aburul sau energia electrica. Deoarece sterilizarea directa in fermentator prin proedeu discontinua la 120°C necesita un timp mare si degradarea mediului este mai avansata, se alege procedeul de sterilizare mediului de cultura in instalatia continua.Sterilizarea continua a mediilor de cultura la 120-125°C

Pentru sterilizarea unor cantitati mari de medii de cultura se recomanda utilizarea proceselor continue de sterilizare care prezinta o serie de avantaje:

o conservarea mai buna a proprietatilor nutritive ale mediului o control superior al calitatii o utilizarea rationala a consumului de aburo eficacitate si productivitate sporitao control automat

Realizarea in conditii optime a procesului impune un control al spumarii mediuliu si a vascozitatii acestuia. Pentru sterilizarea continua a mediilor de cultura se folosesc instalatii industriale care lucraza la 120-125°C.

Instalatia este compusa din trei parti distincte: coloana de sterilizare, mentinator si racitor.Coloana de sterilizare este formata din doua tevi concentrice: prin teava interioara trece aburul de 5 a.t .a, iar prin spatiu inelar circula mediul supus sterilizarii . In coloana de sterilizare are loc incalzirea mediului pana la 120°C, dupa care acesta este trecut prin mentinator si racitorul teava in teava, pentru desavarsirea procesului de sterilizare si racirea la 35-40°C.

Din diagrama timp-temperatura pentru sterilizarea continua la 120-125°C rezulta ca incalzirea mediului cu abur direct de 5 ata in coloana de sterilizare se face in 4-5 secunde, iar timpul de mentinere(15-20minute) permite o distrugere a tuturor microorganismelor patogene capabile de multiplicare in conditiile din fermentator. In acest procedeu, contributia perioadei de racire si de incalzire fiind de 5-6%, se poate considera ca procesul de sterilizare are loc numai in mentinator. [6,36]

Sterilizarea aerului. Procesele industriale de fermentatie sunt aproape in totalitate procese

aerobe si in marea lor majoritate aseptice. Necesarul orar de aer steril variaza intre 60-120 m 3 aer/m 3 mediu de cultura. In sterilizarea acestor debite mari de aer apar dificultati generate, pe de o parte de varietatea microoganismelor prezente si de rezistenta lor la temperaturi uscate si pe de alta de limitele largi ale dimensiunilor acestora. [5,110]

Pentru sterilizarea aerului au fost propuse urmatoarele metode:- sterilizare termica- sterilizare cu raze ionizante sau untra-violete- sterilizarea cu agenti chimici- sterilizarea prin filtrarePentru sterilizarea prin filtrare se pot folosi urmatoarele materiale filtrante:

- fibre de sticla cu diametru intre 5 si 18 μ- nitrat de celuloza pentru filtru cu membrana- teflon cu o rezistenta termica mare(300°C) si caracter hidrofob- poliamida

In sterilizarea prin filtrare exista trei tipuri de filtre cu aplicabilitate practica:- filtrul cu fribra de sticla- filtre disc cu membrana- filtre-lumanare

Filtrul cu fibre de sticla este alcatuit dintr-un strat de material filtrant fixat intre doua site, sustinute de doua placi perforate( cu diametrul perforatiilor de 0.7-0.8 cm). Filtrul este prevazut cu manta de incalzire, care permite uscarea materialului filtrant sterilizat cu abur direct. Acest tip de filtru ofera posibilitatea sterilizarii unor debite ridicate de aer, realizarea unui grad inalt de purificare si durata indelungata de functionare.

3.Fermentatia.Este faza fundamentala a procesului de biosinteza si se realizeaza in trei etape:

- inoculator- intermediar- regim Aceste etape corespund unor faze de dezvoltare a microorganismelor.

Astfel, in inoculator se petrece procesul de aclimatizare a Penicillium crysogenum la noile conditii de dezvoltare, in intermediar incepe cresterea exonentiala a numarului de microorganisme, iar in regim se termina procesul de crestere a microorganismelor si de formare a penicilinei.

Aceasta etapizare reprezinta o imagine generala si putin idealizata a procesului de biosinteza, deoarece chiar in intermediar incepe procesul de elaborare a penicilinelor ca rezultat al distributiei varstelor microorganismului. Acumularea unor cantitati mari de masa moleculara face ca volumele fermentatoarelor, in care are loc procesul, sa creasca in raport zecimal.

Eficacitatea procesului de biosinteza este determinata de conformatia genetica a tulpinei. Tulpina utilizata este P. Crysogenum Q176 a carei potenta a fost ridicata foarte mult prin procese de mutatie. O tulpina buna se caracterizeaza prin capacitatea mare de inmultire, utilizare rapida a azotului si a precursorului, lipsa pigmentilor in biomasa si miceliu fibros.

Procesul de fermentatie cuprinde trei faze distincte:- faza de crestere- faza de producere- faza autoliticaFaza de crestere se caracterizeaza prin acumularea de masa miceliana si

utilizarea intensiva a componentelor mediului de cultura. Glucoza este asimilata foarte rapid atat pentru formarea masei celulare, cat si pentru formarea energiei necesare. Cerintele de oxigen sunt maxime in aceasta perioada, iar activitatea respiratorie, volumul de CO 2 degajat este mare.

Faza de producere a penicilinelor se caracterizeaza prin incetinirea cresterii miceliului fie datorita epuizarii constituentilor usor asimilabili , fie altor conditii existente cum ar fi scaderea consumului de oxigen, mentinerea pH-ului la 6.8-7.5 si acumularea de penicilina. In aceasta faza lactoza este folosita lent de catre miceliu si furnizeaza energia necesara proceselor de biosinteza sau pentru formarea constituentilor celulari.

Faza autolitica corespunde stadiului in care microoganismele se epuizeaza ca urmare a activitatii metabolice prelungite, iar sursele de carbon din mediu sunt consumate. Continutul de azot al miceliului descreste considerabil si incepe procesul de autoliza al acestuia cu elibereare de amoniac si cresterea pH-ului peste 8. Producerea penicilinelor inceteaza si apare un proces de hidroliza alcalina a penicilinelor formate. In practica industriala nu este permisa prelungirea fermentatiei pana la aparitia autolizei.

Cantitatea de peniciline formate intr-o fermentatie biochimica normala este rezultatul imbinarii rationale a urmatorilor factori:

- conformatia genetica a tulpinii care decide caacitatea de producere a penicilinelor

- folosirea unor constituenti adecvati in mediu si un echilibru corect in proportiile acestora

- mentinerea pH-ului la un nivel optim in mediul de fermentatie- dozarea corecta a raportului intre hidratii de carbon- adaugarea de precursori care vor decide natura catenei laterale si tipul

de penicilina produsa- asigurarea necesitatilor de substante minerale- mentinerea temperaturii optime

Din datele existente in literatura se poate se poate trage concluzia ca pH-ul afecteaza vitezele reactiilor enzimatice, permeabilitatea membranelor celulare si gradul de ionizare a sarurilor.

Pentru faza de crestere a masei celulare pH-ul optim este de 4.5-5.0, iar pentru faza de producere a penicilinelor este de 7.0-7.5. Prin urmare, procesul va trebui condus inter cele doua etape in regim diferit . Nu se recomanda depasirea pH-ului de 7.5 deoarece incepe procesul de autoliza insotit de degradarea penicilinelor formate. Mentinerea pH-ului la valoarea 7 in ultima parte a ciclului de fermentatie asigura valori ridicate pentru vitezele de respiratie si elaborare de peniciline.

Regimul optim de temperatura este de 25°C cu o toleranta de un grad, iar necesarul de aer, deoarece este un proces aerob, este de 1-1.5 l aer/l mediu x min., la o turatie a agitatorului elicoidal de 110-140 rot/min. [6,182,183]

. Viteza de dizolvare a oxigenului creste cu turatia agitatorului, dar acesta

nu poate depasi anumite limite deoarece se ajunge la deteriorarea mecanica a

biomasei.

Mecanismul de transfer al oxigenului din bula de aer la celula in sistem

eterogen gaz-lichid-solid implica urmatoarele etape:

difuzia oxigenului molecular prin filmul de aer

dizolvarea oxigenului la interfata gaz-lichid

difuzia oxigenului solvit prin filmul de lichid

difuzia oxigenului solvit in intreaga masa

difuzia oxigenului solvit prin filmul de lichid de la suprafata

microorganismelor

difuzia oxigenului prin membrana celulara

reactia de consum a oxigenului

Din datele existente in literature de specialitate rezulta ca in sisteme

eterogene gaz-lichid-solid, bine agitate, viteza procesului de transfer de masa al

oxigenului este determinate de difuzia oxigenului dizolvat prin filmul de lichid.

[1,92]

Compozitia mediului de cultura are un rol hotarator in procesul de biosinteza deoarece, in dezvoltarea sa, microorganismele au nevoie de surse de hidrati de carbon, azot, substante minerale si precursori. Sursele de hidrati de carbon sunt necesare pentru dezvoltarea microorganismelor si pentru producerea penicilinei. Este necesar sa se mentioneze ca biomasa unei molecule asa de complexe, necesita un flux de energie din exterior, procesul fiind endoterm. Prin urmare, biosinteza penicilinelor se poate realiza numai daca se desfasoara simultan si procesele de oxidare ale hidratilor de carbon care constituie sursa principala de energie. Oxidarea lenta a lactozei elibereaza o energie ce depaseste cu 66kJ/l mediu de cultura energia necesara sistemului  ; din aceasta cauza procesul de biosinteza in ansamblu este exoterm.

Viteza de utilizare a hidratilor de carbon se inscrie in urmatoarea schema: glucoza acid lactic lactoza; fapt care confirma ca in faza de crestere a microorganismelor se consuma glucoza, iar in faza de producere a penicilinelor se consuma lactoza. Introducerea fructozei sau lactozei in locul glucozei are ca efect scaderea brusca a vitezei de crestere a masei celulare.

Sursele de azot sunt necesare pentru formarea grupelor aminice si obtinerea acozilor aminici. Se utilizeaza azot mineral din saruri de amoniu si azot organic furnizat de aminoacizii si peptidele din extractul de porumb.

Prezenta substantelor minerale este vitala in pocesul de crestere deoarece ele afecteaza direct permeabilitatea membranei sau intra in sistemele enzimatice. Astfel KH 2PO4 ofera K 3 - entru activarea unor sisteme enzimatice si PO + pentru fosforilare.

Necesarul de substante minerale pentru fazele de crestere a masei celulare si elaborarii de peniciline pentru P.crysogenum Q174 este urmatorul:

Element Valori exprimate in mg/l mediuCresterea ciuercii Producerea penicilinei

Potasiu 40 40Magneziu 8 8Fosfor 80 200Fier 0.2 7Sulf 70 100

Dirijarea procesului de biosinteza spre obtinerea Penicilinei G se face cu ajutorul cu ajutorul unei substante care este inglobata in catena laterala si poarta numele de precursor. Acesta este acidul fenilacetic . Precursorul se adauga in portiuni deoarece in concentratii mai mari de 0/1-0/2% sunt toxici pentru microorganisme.

Procesul de formare a penicilinelor fiind aseptic, sterilizarea aparatelor se face cu abur la 120-125°C, iar mentinerea sterilitatii in timpul procesului este asigurata de suprapresiunea creata prin barbotarea aerului steril necesar biosintezei.

Procesul de fermentatie se realizeaza in fermentatoare cilindrice verticale contruite din otel inoxidabil, echipate cu agitator elice sau turbina, serpentina pentru racire, conducta pentru aerare, dispozitive spargere-val, teaca termocuplu, filtru individual de aer si rezervor de antispumant. Fundurile fermentatoarelor sunt sudate pentru a asigura un grad sporit de securitate impotriva infectiilor, iar stuturile au garnitura metalica pe toata suprafata flanselor de legatura.

Dinamica procesului de fermentatie a penicilinelor

Controlul procesului de fermentatie se realizeaza prin determinarea sterilitatii mediului, a gradului de determinare mofologica a ciupercii, a pH-ului mediului, a activitatii l ichidului de cultura si a consumului de de zahar. Probele se iau la interval de 4-6 ore, iar procesul se considera terminat atunci cand continutul de zahar al biomasei ajunge la 0.2-0.6%, iar concentratia solutiei ramane aproape constanta intre doua determinari.

Perametrii procesului de fermentatie biochimica a penicilinei:Etapa de fermentatie

T[°C]

Agitarea [Rot/min]

Debit aer[l/l mediu x min]

Presiunea[ata]

Durata[h]

Inoculator 26±1 270 1.0 1.2-1.3 30-40Intermediar 26±1 170 1-1.2 1.2-1.3 20-40Regim 26±1 120 0.6-1 1.2-1.3 90-120

Concentratia penicilinelor in solutia nativa la terminarea procesului de fermentatie este cuprinsa intre 5%-6%. Valoarea exacta depinde de potenta susei folosite si de conditiile de realizare a procesului de fermentatie. [6,184,185]

4.Filtrarea solutiilor native

Filtrarea la nivel industrial a lichidelor de fermentatie intampina dificultati considerabile datorate naturii masei celulare. Alegerea utilajului pentru filtrare este conditionata de:

- caracterul suspensiei, - productivitate, - grad de recuperare- materialul de constructie al

suprafetei filtranteFiltrarea lichidelor care contin masa

celulara cu caracter fibros este o operatie relativ usoara, deoarece miceliul nu colmateaza materialul filtrant si se desprinde usor de pe acesta. Pentru aceste lichide, la nivel industrial sunt recomandate filtre rotative cu vid. Filtrele ofera o suprafata mare de filtrare, posibilitatea spalarii miceliului pe filtru, pentru recuperarea avansata a produselor utile si nu necesita operatii manuale.

Filtrul rotativ cu vid, denumit filtru celular Oliver, poate fi construit din otel-carbon, otel inoxidabil, otel captusit cu cauciuc sau teflon, din diferite aliaje. Alegerea materialului de constructie este determinata de caracterul agresiv al lichidelor supuse filtrarii .

Filtrul consta dintr-un tambur rotativ, cu lungimea 1-4.5, si diametrul 1.75-3m, construit din doi cilindrii orizontali coaxiali. Cilindrul exterior este perforat si acoperit cu material filtrant, iar spatiile dintre cei doi cilindrii este impartit in 10-12 celule etanse care functioneaza succesiv si independent ca un filtru nuce. Legatura dintre aceste celule si conductele de vid sau aer comprimat se realizeaza rin intermediul capului de distributie. Suprafata tamburului este impartita in mai multe zone corespunzatoare operatiilor de filtrare, spalare, uscare si indepartare a stratului de miceliu depus. In timpul unei rotatii a tamburului, fiecare celula trece prin toate aceste zone.

Indepartarea miceliului se realizeaza cu ajutorul unui cutit razuitor fix.[3,37,38]

. Soluția rezultată se trece printr-un răcitor tubular unde se răcește până la 3-5°C și se depozitează în rezervorul de așteptare, de unde este trimisă la extracție. Răcirea este absolut necesară pentru a reduce viteza reacțiilor de degradare a penicilinelor. În unele tehnologii de fabricație soluția răcită se tratează cu cetazol 10% pentru coagularea albuminelor, se filtrează și se trimite la extracție. [6,186]

5.Separarea si purificarea penicilinelorSepararea penicilinelor prin extractie fizica rerezinta singurul procedeu de

separare cu aplicabilitate industriala. Concentratia finala a penicilinei in lichidele de fermentatie este de 3-6%, in functie de tulpina utilizata. Datorita dilutiei foarte mari, este necesara concentrarea solutiei prin extractii repetate a penicilinelor cu solventi.

Fluxul general al separarii penicilinelor cuprinde urmatoarele etape:- filtrarea lichidului de fermentatie in scopul separarii biomasei- extractia penicilinelor din filtru cu solvent organic in doua sau

mai multe stadii, in functie de conc sa in solutie- reextractia penicilinelor din solventul organic cu o solutie de

carbonat de sodiu- cristalizarea si purificarea.

Extracția și reextracția

Extracția reprezintă operația de separare a componenților unui amestec lichid sau solid pe baza diferenței de solubilitate a acestora într-unul sau mai mulți solvenți. Dacă amestecul supus separării este lichid, operația este de extracție lichid-lichid, iar pentru solid, extracție solid-lichid. Atunci când procesul are loc prin intermediul operațiilor fizice, extracția este fizică, iar atunci când intervin reacții chimice, extracția este reactivă.

Extracția fizică lichid-lichid cuprinde 4 etape:1. contactarea soluției inițiale cu solventul (amestecarea)2. solubilizarea și difuzia solutului în faza solventului (transferul de masa a

solutului)3. separarea celor două faze rezultate (extractul-faza solventului care conține solutul,

rafinatul-soluția inițiala epuizată)4. recuperarea solventului atât din extract, cât și din rafinat. [3.52]

Viteza extracției depinde de 3 factori: aria interfacială de contact dintre cele 2 faze lichide, forța motrice a trasnferului de masă al solutului între soluția inițială și solvent, coeficienții de transfer de masă ai solutului în fiecare fază.

Operația de extracție prezintă capacitate maximă, atunci când se obține un contact intim între fazele din sistem, reflectat de gradul de dispersie ale uneia în cealaltă, respective de valoarea ariei interfaciale.

Produsele de biosinteză se găsesc în lichidul de fermentație în concentrații reduse (0.5-8%), fiind în general, compuși labile chimic și termic. În plus, în lichidele de fermentație se găsesc numeroși compuși secundari, unii cu caracterisitici fizico-chimice asemănătoare cu ale produselor utile, de aceea separarea și purificarea produselor de biosinteză sunt operații dificile, ce implică etape complicate. [8.48]

Extracția fizică reprezintă până în prezent singurul procedeu de separare industrial al penicilinei G. Concentrația finală a penicilinei G în lichidele de fermentație este cuprinsă între 3 și 6 %, în funcție de tulpina utilizată. Datorită diluției foarte mari este necesară concentrarea soluției prin extracție și reextracție. Penicilinele pot fi extrase fie din soluția apoasă rezultată în urma filtrării biomasei, fie direct din lichidul de fermentație. [7.61]

Fluxul general al separării penicilinelor de biosinteză este alcătuit din 4 etape:1. filtrarea lichidului de fermentație cu ajutorul filtrelor rotative cu vid, în scopul

separării biomasei de lichidul care conține penicilinele;2. extracția penicilinelor din filtrat cu un solvent organic în două sau mai multe

stadii, ăn funcție de concentrația lor în soluție;3. reextracția penicilinelor din solventul organic cu o soluție de carbonat de sodiu

sau de potasiu;4. cristalizarea și purificarea, în funcție de tipul de penicilină.

Extracția penicilinei G folosește ca mediu supus extracției fizice, lichidul de fermentație filtrate, iar ca solvent acetatul de butil la pH cu valoarea 2.

Extracția penicilinei G în acetat de butil decurge cu randamente maxime numai în condțtiile în care acest antibiotic se va găsi în soluția apoasă supusă extracției în formă nedisociată. Acesta deoarece acetatul de butil este un solvent nepolar sau cu polaritate redusă. Din analiza procesului de extractive fizica a penicilinei G cu acetat de butil s-a constat ca:

- în solvent sunt extrase numai molecule de penicilina nedisociată- între molecule de penicilinaă, în condțtiile în care se realizează extracția, nu are loc formarea unor asociații - în acetatul de butil penicilina G nu disociază

Schema de operații pentru separarea penicilinelor prin extracție este prezentată în schema următoare:

Pentru extracția penicilinei G se folosește extractorul Podbielniak.Acesta este construit dintr=o foaie metalică înfășurată în spiral în jurul unui arbore care se rotește cu 2000-5000rpm..Rotorul are forma unei spirale cu un număr variabil de spire( 6-33 spire) a căror secțiune formează canale paralele.

1. ansamblu rotor +ax 2. carcasă 3. lagăre 4. curea de tranmisie 5. foaie metalică spiralată perforată6. conducte de distribuţie a fazelor7. conductă pentru lichidele de spălare şi

curăţare8. ştuţuri de alimentare şi evacuare

Distilarea azeotropăÎn prezent pentru separarea sărurilor penicilinei G din soluția apoasă rezultată de la

reextracția în carbon de Na(K), se folosește procedeul antrenării azeotrope a apei cu butanol, la vid, astfel încat, odată cu îndepărtarea apei are loc cristalizarea sării respective, apoi, acesta se filtrează si se spală cu butanol și cloroform. Utilizarea butanolului, deși prezintă avantajul unui timp relativ scurt al fazei de cristalizare si al unei solubilitați relativ bune a impuritatilor are o serie de inconveniente cum ar fi:

- conduce la pierderi mari de butanol, datorita solubilitatii ridicate a acestuia in apa(7,45%), precum si datorita solubilitatii mari a apei in butanol (20,5%); acest aspect determina si cheltuilei sporite cu recuperarea solventului.

- posibilitatea degradarii termice a penicilinei, datorita temperaturii necesare evaporarii amestecului butanol-apa

- posibilitatea degradarii chimice a penicilinei in butanol.

UscareaUscarea este o operatie prin care se indeparteaza umiditatea dintr-un

material cu ajutorul energiei termice.Termenul de uscare se mai utilizeaza si in cazul indepartatii unui component in stare lichida sau de vapori dintr-un gaz sau dintr-un amestec lichid.

Uscatoarele se pot clasifica in functie de mai multe criterii:1) dupa regimul de fuctionare pot fi:

- continue- discontinue

2) dupa presiunea de lucru pot fuctiona:- la presiune atmosferica- la vid

3) dupa procedeul de uscare pot fi:

- cu agent termic gazos- cu incalzirea materialului

4) dupa sensul de circulatie a solidului si a gazului pot fi in  : - echicurent, - contracurent, - curent mixt - curent incrucisat

5) din punct de vedere constructive sunt: -uscatoare cu strat fix, -cu strat mobil, -cu strat fluidizat, -cu pulverizare, -de contact

Penicilina G precipitata se filtreaza pe filtrul Nuce si se usuca in uscator dulap la 35-45°C sub vid de 100-225 mmHg, timp de 16-20 ore.

2.4.2. Materii prime, Intermediare, Auxiliare.

Microorganismul producator

Mucegaiurile(ciuercile sau fungii) sunt microorganisme ce se prezinta sub forma de filamente, de diverse dimensiuni, ce formeaza un miceliu care provoaca degradarea mediului in care se dezvolta. Unele specii de mucegaiuri sunt producatoare de antibiotice cum ar fi Penicillium si Aspergillus, in special antibiotice β-lactamice

Mediul de cultura are in componenta urmatorii constituenti:

1. LactozaGeneralități:Formulă brută: C12H22O11

Masă moleculară: 360.30 g/molPrezinta o usoara solubilitate in apa si este insolubilă în alcool etilic, eter etilic și cloroform.Zerul și materialele auxiliare folosite la fabricarea lactozei trebuie să corespundă documentelor telenice normative ale produselor respective și să respecte dispozițiile legale sanitare și sanitar – veterinare în vigoare.

Condiții tehnice de calitate:

Denumirea caracteristiciiCondiții de admisibilitate

TipulLactoză rafinată Lactoză telenică

Calitatea I Calitatea a II-a

Aspect pulbere cristalinăCuloare albă albă - galbenă galbenă

Gust și miros slab dulceag, fără miros străinAspectul soluției apoase incolor, limpede galben deschis,

slab tulbureGalben

Puterea rotației specifice [α]20

20+52 ÷ +53 +51 ÷ +52 +47 ÷ +51

Pierderi prin uscare:-la 130°C, %, max.-la 100°C, %, max.

5.5-

-0.4

-2

Aciditatea exprimată a acidului lactic, %, max.

0.05 0.07 1

Cloruri, %, max. 0.004 - -Sulfați (SO4), %, max. 0.002 - -

Calciu lipsă în condițiile determinării

- -

Metale grele (Pb) lipsă în condițiile determinării

- -

Arsen, %, max. 0.01 - -Fier lipsă în condițiile

determinării- -

2. Extractul de porumbConditii tehnice de calitate

Constituienti g/100g extract de porumb %Substanta uscata 46-49,6

Cenusa 8,04-10,73N total 3,33-3,67

Zahar total (exprimat ca glucoza) 4,00-4,70Acid lactic 0,74-4,39

Aciditate(ml sol NaOH 0,1N/100g) extract de porumb 11,6-19,3Fe 0,009-0,02P 1,5-1,9

Ca 0,02-0,7Zn 0,05-0,012K 2,0-2,5

SO2 0,02Sedimente solide 38,4-52,9

Generalitati. Proprietati fizice.- Aspect: lichid cremos de culoare galben inchis- Miros: caracteristic unei fermentatii lactice

- Sedimentare dupa 24 ore intr-un cilindru de 100 ml de 100%- Aspect microscopic: in frontiu colorat prezinta o masa bacteriana tipica

bacililor lactic, in proportie de peste 90%- Substanta uscata: minim 50%- pH= 3.5-4- Continutul in acid lactic: minim 20g la 100g substanta uscata- Zahar total: maxim 2.5%

3. Faina de soiaGeneralitati:

Faina de soia este o sursa de azot naturala, bogata in proteine, aminoacizi continand si acizi nucleici, vitamine, oligoelemente, lipide, zaharuri, compusi cu sulf si fosfor dupa cum urmează:

4. Glucoza SR 13359-7Generalități:

Obiect și domeniu de aplicare:

Prezentul standard se referă la glucoza obținută din cartofi și din porumb, destinată pentru consum și scopuri industriale.

Tipuri de gluxoza:-glucoză lichidă

Proteine 42 %

Materii grase 3.5 %

Metionina 0.54 %

Cisteina 1.1 %

Lizina 2.4 %

Calciu 0.2 %

Sodiu 0.287 %

Potasiu 1.7 %

Magneziu 0.21 %

Sulf 0.32 %

Fosfor 0.6 %

-glucoză solidă:

- aromatizată

- nearomatizată

Glucoza aromatizată poate fi fabricată cu diferite adaosuri: esențe, aromatizanți și coloranți alimentari avizați din punct de vedere sanitar, miez de nucă, miez de floarea-soarelui etc., conform acordului între producător și beneficiar.

-Sirop de glucoză: soluție apoasă, concentrată și purificată de zaharuri nutritive, obținute din amidon de cartofi și de porumb.

-Glucoză solidă: masă de zaharuri nutritive, obținută prin hidroliză avansată a amidonului de cartofi și de porumb.

Condiții tehnice de calitate:

Pentru glucoza de cartofi și de porumb, materiile prime și auxiliare trebuie să corespundă standerdelor și normelor sanitare în vigoare

Proprietăți organoleptice:

CaracteristiciCondiții de admisibilitate

Metodă de

verificare

Tip de glucozăLichidă Solidă

Aromatizată NearomatizatăAspect Lichid vâscos Masă solidă,

sub formă de tablete

Masă solidă

SR

13359-1

Culoare Incolor până la galben

Crem până la galben sau specifică

colorantului adăugat

Crem până la galben

Miros Lipsă Caracteristic aromei

adăugate

Lipsă

Gust Dulce specific

Dulceag, ușor amărui

Corpuri străine

Lipsă

Proprietăți fizico – chimice:

CaracterisiticiCondiții de admisibilitate

Metodă de verificare

Tip de glucozăLichidă Solidă

Aromatizată NearomatizatăUmiditate, % max. 20 21 SR 13359-2

CuloareRBU, max. 200 - SR 13359-3ml iod soluție0.1 n/100 ml, max

1.5 -

Densitate 20/20°C, g/ml, min 1.42 - SR 13359-4Indice de refracție la 20°C 1.49 - SR 13359-5Aciditate, grade, max. 2.5 2.8 SR 13359-6Acizi minerali liberi, % Lipsă SR 13359-7pH, la o soluție 20 g/100 ml 4.5...5.5 SR 110-12Conținut de SO2 ml/100 g max.

-în produs nealbit

4 SR EN 1185

-în produs albit 40 15Conținut de cenușă conductometrică, raportată la s.u., %, max.

0.6 - SR 110-2

Conținut de dextroză raportat la s.u., (DE), %

32...49 min. 75

SR 13359-8sau

SR 13359-9sau

SR ISO 5377

5. CaCO3, Carbonatul de calciu STAS 1083-76Prezentul standard se refera la carbonatul de calciu precipitat, tehinic,

obtinut prin tratarea solutiei de var cu bioxid de carbon.Produsul se prepara sub forma de pulbere microcristalina.Formula chimica:CaCO3

Masa moleculara relativa: 100,09 g/molCarbonatul de calciu precipitat, tehnic se livreaza in patru tipuri:

- tipul I destinat, in special, la fabricarea pastei de dinti;- tipul A destinat, in special, industriei de produse cosmetice, industriei de antibiotice si industriei electrotehnice; - tipul B destinat, in special, industriei de material plastic si industriei cauciucului;- tipul C pentru alte utilizari;

Conditii tehnice de calitate a carbonatului de calciuTipul I A B C

Grad de alb, %min 97 92 92 -Finite:

-rest pe sita cu tesatura de sarma 0063 STAS 1077-67, %max

-rest pe sita cu tesatura se sarma 009 STAS 1077-67, %max

0,1

0,05

1,0

0,5

1,0

0,5

-

1

Densitate in gramada in stare tasata, g/cm3, max

0,45 0,45 0,45 0,47

Cifra de sedimentare, cm3, min 95 91 90 90Umiditate, % max 0,4 0,4 0,6 0,6

Substante insolubile in acid clorhidric, %max 0,1 0,2 0,2 0,2Oxizi de fier si de aluminiu (Fe2O3+Al2O3),

%max0,5 0,5 0,5 0,5

Carbonat de calciu (CaCO3),% min 99 99 98,5 97Alcalinitate[Ca(OH)2], % max 0,008 0,008 0,10 0,15

Limite de pH la un adaos de 1…30cm3 acid clorhidric n(capacitate de tamponare)

5,5….6,0 - -

pH-ul suspensiei 2% in apa, max 8,5 9,5 - -pH-ul suspensiei 10% in apa, max 9 10 - -

Cupru(Cu), %max 0,001 0,001 0,001 -Mangan(Mn), %max 0,003 0,003 0,003 -

Arsen - - - -

6. Fosfat monopotasic S.T.A.S 10497-76 Generalitati:

Prezentul standard se refera la fosfatul monopotasic tehnic utilizat, în principal, in mediu de cultura la fabricarea antibioticelor.Formula chimica: KH2PO4

Masa moleculara: 136,09 g/molCondiții tehnice de calitate

Aspect și culoare Cristale albeUmiditate , %, max. 0.3

Fosfat monopotasic (KH2PO4), %, min. 96Cloruri (Cl), %, max. 0.25

Fier (Fe), %, max. 0.003Metale grele (Pb), %, max. 0.01

Substanțe insolubile în apă, %, max. 0.5

Observații:- Caracteristicile din tabel, cu exceptia umiditatii, se refera la fosfatul monopotasic uscat la 105 ± 2°C- Cu acordul beneficiarilor produsul se poate livra si cu max. 0.05 % fier.

7. Sulfat de sodiu S.T.A.S 2126-84Generalitați

Prezentul standard se refera la sulfatul de sodiu, anhidru, tehnic, intrebuintat in industria de medicamente.

Formula chimică: Na2SO4

Masa moleculara relativă: 142.044 g/molCalități

Sulfatul de sodiu, anhidru, tehnic se livrează în trei calitați:

calitatea I – produs secundar la băile de filare, de la obținerea fibrelor artificiale; calitatea II – obținut prin tratarea fosfogipsului rezidual cu sodă calcinată (Na2CO3), urmată prin uscarea produsului prin atomizare.- calitatea III – produs secundar din fabricația acidului formic din formiat de sodiu și acid

sulfuric.

Condiții tehnice de calitateCalitatea I II IIIAspect praf neaglomerabil praf neaglomerabil praf aglomerabilCuloare Alb alb Alb cenușiu

Sulfat de sodiu (Na2SO4), %, max.

99 97.5 97

Umiditate, %, max. 0.3 0.1 0.5Substanțe insolubile

în apă, %, max.0.3 0.3 0.5

Acid sulfuric liber(H2SO4)

Lipsă lipsă %, max. 1.0

Clorură de sodiu (NaCl), %, max.

0.1 1.2 1.2

Fier (Fe), %, max. 0.001 0.001 0.03Acizi organici

(HCOONa)lipsă - %, max. 1.5

Densitate în stare netasată kg/dm3 0.7...1.55 0.4...0.7 1.26...1.30

Observație: - toate valorile din tabel, exceptând umiditatea si densitatea în stare netasată, sunt raportate la produsul uscat la 105 ± 2°C.

8. Sulfat de zinc S.T.A.S. 2367-80Generalitati :Prezentul standard se refera la sufatul de zinc tehnic cristalizat, granulat si lichid. Sulfatul de

zinc tehnic cristalizat si granulat se livreaza in 3 calitati:- calitatea I- calitatea II- calitatea III

Sulfatul de zinc tehnic lichid se livreaza in 2 calitati:- calitatea I- calitatea II

Formula chimica: ZnSO4

Masa moleculara: 161 g/mol

La data aprobarii standardului, sulfatul de zinc tehnic granulat si lichid se importa.

Conditii tehinice de calitate a sulfatului de zinc tehnic cristalizat, calitatea I:

Calitatea I II III

Aspect cristale mici

Culoare Alba alba sau alb-galbui alb-galbuie-cenusie

Zinc(Zn) %min. 22,5 22,1 21,6

Substante insolubile in apa, %max.

0,05 0,1 0,5

Fier(Fe), %max 0,035 0,5 1,0

Cupru(Cu), %max 0,005 - -

Acid sulfuric liber(H2SO4), %max

0,1 0,5 -

Arsen Lipsa - -

Cloruri, %max 0,2 - -

Observatii: - pentru industria chimico-farmaceutica se va folosi sulfat de zinc tehnic cristalin, calitatea I.

9. Azotat de amoniu S.T.A.S. 450-30Generalitați Standardul cu nr. 450-30 se refera la azotatul de amoniu tehnic, granulat obținut prin neutralizarea acidului azotic cu amoniac utilizat la fabricarea explozivilor și în alte scopuri industriale.Formula chimica: NH4NO3

Masa moleculară relativă: 80.04 g/mol

Azotatul de amoniu tehnic granulat, se livrează în două tipuri:- tip I – folosit la fabricarea explozivilor;- tip II – folosit în alte scopuri industriale.

Condiții tehnice de calitateTip I IIAspect Granule neaglomerabile granule neaglomerabileCuloare alb alb-rozGranulație:granule între 1...3 mm, %, min.

95 95

granule sub 1 și peste 3 mm, %, max. 5 5Umiditate, %, max. 0.2 0.3Aciditate liberă (HNO3), %, max.

0.02 0.02

Azotat de amoniu, %, min. 98.8 99.4Azotat de magneziu, %, min. 0.2 -Azotat total, %, min. 34.6 34.8Reziduu de calcinare, %, max.

0.2 -

Observație:- conținutul de azotat de amoniu, azotat de magneziu, azot total și aciditatea liberă sunt raportate la produsul uscat.

Precursor in obtinerea Penicilinei G:

Acidul fenilacetic. Generalitati :Formula chimica: C6H5CH2COOHMasa moleculara: 136.15 g/molProprietati fizice :

- pulbere alba, alba-galbuie - punctul de topire la 77-78.5°C,

- temperatura de fierbere: 265°C, - densitate 1.081 g/cm3 , - solubilitate moderata in apa - stabil in conditii normale.

Descriere generala si aplicatii:Acidul fenilacetic se prezinta sub forma de cristale albe, cu un miros neplacut,

caracteristic, solubil in alcool si eter. El serveste ca ingredient in parfumuri oferind un miros asemanator mierii. Se gaseste in concentratie mica in unii alcaloizi si hormoni din plante. Acidul fenilacetic substituit in pozitie alfa si esterii acidului fenilacetic sunt folositi in medicina, de asemenea acidul fenilacetic este folosit ca precursor in obtinerea penicilinei G.

In comert se gaseste sub forma de pudra galbuie de puritate minim 99% si umiditate maxima 1%, livrat in saci de 25kg.

Agent antispumant:

Ulei de floarea soarelui tehnic STAS 2710-70

Generalități:

Standardul cu numarul 2710-70 se referă la uleiul tehnic obținut din semințele de floarea soarelui.

Uleiul tehnic de floarea soarelui se livrează în două calități:

-calitatea I, obținută prin presare sau extracție cu solvenți și prelucrare ulterioară;

-calitatea II, obținută prin presare sau extracție cu solvenți.

Proprietăți fizice și chimice:

Calitatea I II Metode de analizăAspect, la 60°C Limpede

fără impurități mecanice

- STAS 145/1-67

Densitate relativă la 20°C 0.914...0.927 STAS 145/3-67Indice de refracție la 20°C 1.4710...1.4760 STAS 145/4-67Culoare de iod, mg I/ 100 cm3 max. 20 - STAS 145/2-67Impurități insolubile în eter etilic, % max. 0.1 1 STAS 145/11-67Umiditate și materii volatile, % max. 0.2 1 STAS 145/10-67 cap 1Indice de aciditate, mg KOH/g max. 2 12 STAS 145/16-67 cap 1Substanțe organice nesaponificate, % max. 1.2 1.2 STAS 145/15-67Indice de iod, g I/100g min. 119...135 STAS 145/19-67 cap 1Cenușă, % max. 0.05 - STAS 145/13-67Indice de saponificare, mg KOH/g 186...198 STAS 145/17-67Substanțe mucilaginoase lipsă - STAS 18-70Punct de inflamabilitate (Penki-Martens), °c min. 165 135 STAS 145/6-67 cap 1

Observatii:- la uleiul rafinat de floarea soarelui tip A, imbuteliat pe linii fara uscare, se admite un

continut de apa si substante volatile de max 0.15%- indicele de peroxid pentru uleiul destinat pastrarii indelungate se stabileste prin intelegere

intre parti

Acetat de N-butil S.T.A.S 904-89Generalitati:Standardul cu numarul 904-89 se refera la acetatul de n – butil tehnic obtinut prin

esterificarea acidului acetic cu alcool n – butilic sau prin transesterificarea acetatului de metil.Formula chimica: CH3CO2(CH2)3CH3

Masa moleculara relativa: 116.16 g/molAcetatul de n – butil tehnic este un produs inflamabil, avand punctul de inflamabilitate de cca. 28°C.

Acetatul de n–butil tehnic se livrează în trei tipuri, funcție de continutul de ester si anume:- tipul 98- tipul 92- tipul 88

Condiții tehnice de calitate

Denumirea caracteristiciiCondiții de admisibilitate

Tipul98 92 88

Aspect Lichid limpede, fară substanțe în suspensieCuloare , mg K2Cr2O7/ l, max. 16

Miros caracteristicDensitate relativa, d20

20 0.878...0.884 0.872...0.880 0.868...0.874Distilare (la presiunea de 1013,2 mbar)*:- interval de distilare, °C...- în intervalul de distilare distila, % vol.,

min...

120...127

95

116...128

95

113...130

95Acetat de n–butil, %, min. 98.0 92.0 88.0

Aciditate (acid acetic), %, max. 0.01 0.03 0.03Reziduu la evaporare, %, max. 0.01 0.02 0.02

Apă , %, max. 0.2 0.35 0.5

* 1013.2 mbar = 760 mm HgObservație:

- tipul 98 destinat industriei de antibiotice trebuie să aibă intervalul de distilare 123...127°C.

Acid sulfuric tehnic. S.T.A.S 97-80

Generalitati:Formula chimica:H2SO4

Masa moleculara: 98,08 g/molDupa contiuntul de acid sulfuric monohidrat, acidul sulfuric fehnic se livreaza in 4 tipuri: -tipul 98

-tipul 96 -tipul 92 -tipul 73

Conditiile tehnice de calitate a acidului sulfuricTipul 98 96 92 73Aspect lichid nicios, limpede sau opalescentCuloare Conform STAS 9482-74Densitate g/cm3, min 1,836 1,835 1,821 1,634Acid sulfuric monohridat(H2SO4), % max

98 96 92 73

Dioxid de sulf(SO2), % max 0,1 0,1 0,1 -Fier(Fe), % max 0,02 0,02 0,02 -Reziduu la calcinare, % max 0,1 0,15 0,15 -Arsen(As), % max 0,001 0,001 0,001 -Cloroform S.T.A.S. 3306-82Generalitati:Formula chimica:HCCl3

Masa moleculara: 119,38 g/molCloroformul se livreaza in urmatoarele tipuri si calitati:

-tipul A, stabilizat cu 0,6…1% alcool etilic absolute, utilizat in industria de medicamente: -calitatea I -calitatea II

- tipul B, nestabilizat tehnic utilizat ca solvent

Conditii tehnice de calitate Denumirea caracteristicii Tipul

A (stabilizat)B(nestabilizat)

calitate I calitatea IIAspect lichid limpede, incolor, volatilMiros CaracteristicGust dulceag, arzatorDensitatea relativa 1,473-1,480 1,473-1,490Cloroform, %min 98,0 97,0 -Distilare:-punct initial de fierbere, 0C, min-punct final de fierbere, 0C, max-intre punctual initial si final de

5962

5763

5763

fierbere distilata, %vol, min 97 96 94Reziduu la evaporare, % max 0,002 0,002 0,015Clor liber -Cloruri(Cl), % max 0,0008 0,0008 -Aciditate -Substante organice straine - 15mg l/100cm3

Substante volatile straine - -Apa -

Observatii: Cloroformul este greu solubil in apa, miscobil in orice proportie cu alcoolul etilic absolute, eterul etilic, benzina si majoritatea uleiurilor,Este neinflamabil.

2.4.3 Mecanismul reactiilor biochimice

Desi mecanismul biosintezei penicilinelor nu este pe deplin elicudat, totusi tinand seama de faptul ca in molecula lor se gasesc trei componente de baza: d-valina, l-cisteina si un acid substituir, precum si identificarea in miceliul de Penicillium crtsogenum a unei tripeptide, se pot concepe etapele care intervin in biosinteza. Prima etapa consta in formarea, din glucoza, a l-cisteinei si d-valinei, iar din aceasta a δ-amino-adipil-cisteinil-valinei conform urmatoarei scheme:

Componenţii mediului de cultură

Inoculator Intermediar Regim

Extract de porumb 2 2-3 2,5-2,8Lactoză 0,5-0,6 3-3,5 6-7Glucoză 3-3,5 1,2 2-3Făină de soia - - 0,3CaCO3 0,7-0,8 0,7 1,2-1,3KH2PO4 0,1 0,2-0,3 0,5-0,6NH4NO3 - 0,12 0,3Na2SO4 - 0,06 0,06ZnSO4 - - 0,002MnSO4 - - 0,002

Acid fenilacetic - 0,2 0,4Tiosulfat de sodiu - 0,016 0,8Apă până la 100%

Dupa aceasta schema sinteza nucleului de baza al penicilinei, acidul 6-aminopenicilanic ar rezulta din acidul α-amino-adipic, l-cisteina si l-valina trecand prin faza tripeptidei. In ultima etapa se formeaza enicilina G sau acid 6-aminopenicilanic prin pierderea grupei acil.

Aceasta ipoteza nu este, deocamdata, confirmata deoarece toate incercarile de a schimba in tripeptida acidul amino-adipic au acidul fenilacetic, necesar formarii penicilinei G, au esuat.

Penicilinele s-ar putea forma si direct din l-cisteina su l-valina printr-o serie de faze intermediare, despre care nu se stie daca se formeaza in stare libera, asa cum sunt redate in schema de mai sus. In esenta, se distung in aceasta schema urmatoarele faze in formarea penicilinei: condensarea aminoacizilor, dehidrogenarea peptidei, hidrogenarea si ciclizarea intermediarului la acid 6-aminopenicilanic si introducerea catenei laterale.

Formarea acidului 6-AP in lipsa precursorului, recum si obtinerea diferitelor peniciline in functie de recursorul folosit, demonstreaza ca rocesul de biosinteza oate decurge si dupa aceasta schema.

2.4.4. Cinetica reactiilor de biosinteza

Prin metoda cinetica, se face studiul mecanismului reactiilor enzimatice, a proceselor metabolice și a vitezei de transformare a substratului în produs. Aceasta metoda este singura modalitate de studiu a proceselor enzimatice, deoarece numarul enzimelor pure separate pâna în prezent este relativ redus.

Viteza de fermentatie este definita prin variatia momentana a concentratiei produsului, a intensitatii respiratiei sau a concentratiei masei celulare. Viteza volumetrica este definita prin cantitatea de produs obtinuta, cantitatea de substrat utilizata, consumul de oxigen sau cantitatea de celule obtinute pe unitatea de volum de mediu de cultura și în unitatea de timp.

A- viteza de utilizare a oxigenului, g/l.hB- viteza de creștere a masei celulare, g/l.hC- viteza de consum a zaharurilor, g/l.hD- viteza de producere a penicilinei, g/l.h

Fig. Vitezele volumetrice la fermentatia penicilinei

Viteza specifica se definește prin raportul dintre viteza volumetrica și densitatea bacteriana, fiind exprimata în grame produs obtinut în unitatea de timp și pe gram de masa celulara.

A- viteza de producere a penicilinei, g/g.hB- viteza de utilizare a oxigenului, g/g.hC- viteza de consum a zaharurilor, g/g.h

Fig.Vitezele specifice la fermentatia penicilinei

Procesele metabolice ce se desfașoara în interiorul celulelor vii sunt catalizate de enzime.Enzimele sunt macromolecule organice cu structura proteica care catalizeaza procesele

biochimice. Din punct de vedere stuctural, enzimele sunt compuși de natura heteroproteica cu sensibilitate deosebita la toti factorii care afecteaza proteinele. Activitatea enzimelor este influentata de temperatura, pH, presiune osmotica, concentratia substratului, concentratia produșilor rezultati în reactie etc. Activitatea enzimatica este inhibata de anumiti agenti specifici precum: sulfamidele, antibioticele, narcoticele, colorantii, apa oxigenata, dioxidul de carbon, dezinfectantele.

Substratul este acea substanta asupra careia se excercita actiunea enzimelor. Prezenta enzimelor permite transformarea sustratului la temparatura normala a materiei vii, oferind astfel, energia necesara desfașurarii procesului de biozinteza.

Functia esentiala a enzimelor este de a accelera viteza reactiilor metabolice la temperatura normala a organismelor. Având activitatea catalitica foarte ridicata (de mii de ori mai mare comparativ cu activitatea catalizatorilor anorganici uzuali), enzimele reduc considerabil barierele de potential ale reactiilor de transformare a substratului, facilitând astfel deplasarea echilibrului spre formarea produsului.

Mecanismul prin care enzimele transforma substratul poate fi descris cu ajutorul teoriei starii de tranzitie. Aceasta teorie presupune ca substratul se combina cu enzima formând un complex activat, instabil, care ulterior se descompune în produs și enzima. Enzima eliberata reia ciclul de transformare a substratului conform schemei:

E S E S* P E k 1

k 1

k2

in care: E enzima libera

S substrat

P produs

S*E complex activat enzima substrat

k

k

k2

constanta de viteza a reactiei de formare a complexului enzima substrat

constata de viteza a reactiei de formare a substratului si a enzimei din complexul enzima substrat 1

constanta de viteaza a reactiei de formare a produsului din complexul enzima substrat

- se admite ca între enzima și substrat, cât și între complexul enzima-substrat exista un echilibru descris de ecuatia:

iar viteza specifica de descompunere a complexului enzima-substrat în produs este redata

prin intermediul urmatoarei expresii:

Viteza de formare a produsului este prezentata în relatia:

Reformulând se obtine:

Constanta de echilibru a formarii complexului activat se poate exprima functie de energia libera standard ΔG*:

ΔG* = ΔH* - T∙ΔS* = -R∙T∙lnKC* (6)

Din aceasta relatie rezulta expresia constantei de echilibru:

KC* =

Modele cinetice pentru viteza de formare a procesului

Michaelis si Menten au dezvoltat modelul cinetic al vitezei de formare a produsului în functie de concentratia susbtratului și a enzimei. Dupa acestia, se considera ca reactia dintre enzima și substrat se desfașoara în doua etape: în prima etapa viteza de reactie este dependenta direct de cantitatea de substrat, iar în a doua etapa are loc formarea produsului și eliberarea enzimei, care este capabila sa reia ciclul descris de sistemul de reactie, viteza depinde de concentratia complexului enzima – substrat:

E

E

S

S

E S

P E

k 1

k 1

k2

Viteza de formare a produsului în procesul enzimatic descris de sistem este : dCp

Vp = ― = k2 * Cc dτPentru determinarea concentratiei complexului enzima – substrat, Cc, se utilizeaza

expresia vitezei de formare a acestuia, pentru cazul în care Cs>>CE.

Vp=dCpd τ

= k 1* (CE Cc Cs k 1 Cc k2 Cc)* * *

În regim stationar, concentratia complexului nu variaza în timp, iar expresia devine :

k 1*(C E Cc)*Cs k 1 * Cc k2*Cc= 0

Cc = CE* Cs

k 1 k2Cs

k 1

De mai sus rezulta ca:

= kτ d

dCpVp= 2 *Cc =

k2 * C * CsE

1kCs

k21k=

V * Cs

Ks k2

k 1Cs

Unde avem:

V= k2*CE : viteza maxima de formare a produsului ce corespunde stadiului în care întreaga cantitate de enzima formeaza complexul enzima – substratul;

Ks 1k

k2= : constanta de echilibru la disocierea complexului enzima substrat

KM= Ks

k2

k 1: constanta Michaelis Menten

Constanta KM este egala cu constanta KS numai atunci cand k2<<k +1 Cu cat valoarea lui KM este mai mica, cu atat este mai mare afinitatea enzimei pentru

substrat. Introducand constanta KM se obtine :

τ d dCp

= Vp=V*Cs

KM Cs

Aceasta relatie este denumita ecuatia Michaelis-Menten și descrie viteza de formare a produsului într-un proces enzimatic, reprezentând modelul ideal pentru viteza proceselor enzimatice în regim stationar, lipsite de procese secundare de inhibitie.

Ecuatia Michaelis-Menten a fost stabilita în ipoteza ca CS>>CE Creșterea concentratiei enzimei din mediul de fermentatie peste o anumita limita atrage dupa sine anularea ipotezei, si in consecinta viteza reactiei enzimatice nu va mai fi direct proportionala cu concentratia enzimei.

Din reprezentarea grafica a ecuatiei Michaelis–Mentin, se vede ca KM este acea valoare a concentratiei substratului CS pentru care reactia pornește cu jumatate din viteza maxima V.

Reprezentarea grafica a ecuatiei Michaelis-Menten

Deoarece valoarea vitezei maxime de reactie este limita asimptotei la curba, ea nu poate fi determinata cu exactitate. Pentru determinarea constantei KM și a vitezei maxime V, se utilizeaza metode de linearizare. Una din aceste metode este metoda Lineweaver – Burk, care folosește inversul relatiei

τ d dCp

= Vp=V*Cs

KM Cs

.

1

Vp=

KM

V*

1

Cs

1

V

Prin reprezentarea grafica a ultimei relatii în coordonate 1/Vp și 1/Cs conduce la obtinerea diagramei Lineweaver–Burk, ce permite determinarea constantelor V și KM în functie de variatia concentratiei substratului și de valorile experimentale ale vitezei de formare a produsului.

Fig. Reprezentarea grafica a ecuatiei Lineweaver – Burk

In literatura se mai intalnesc si alte reprezentari ale ecuatiei Michaelis-Menten: Edaie-Hofstee sau Woolf.

Modelul Michaelis–Menten a fost conceput ca un model ideal și descrie viteza de formare a produselor în procese de fermentatie perfecte. Totusi, acest model, ce abordeaza cinetica enzimatica în regim stationar, poate fi extins și la procese în care, alaturi de transformarea enzimatica a substratului în produs, intervin reactii de inhibitie competitiva sau necompetitiva a enzimelor. Prezenta inhibitorilor nu se poate evita, deoarece ei apar ca urmare a degradarii mediului nutritiv în timpul sterilizarii, a unor reactii secundare și nu numai.Principalele tipuri de inhibitii întâlnite curent în procesele de fermentatie sunt :

-inhibitie competitiva;-inhibitie necompetitiva;-inhibitie de substrat;-inhibitie de produs.

Procesul de transformare enzimatica a substratului însotit de inhibitie competitiva este descris prin reactiile:

E SKs

E S

Cck2

P E

E I

K IE I

CD

Caracteristic pentru procesul de transformare enzimatica însotit de inhibitie competitiva este faptul ca enzima pusa în libertate prin disocierea complexului enzima- inhibitor, E-I, îsi pierde capacitatea de a cataliza transformarea substratului in produs.

Viteza de formare a produsului este proportionala cu concentratia complexului enzima-substrat, de aceea este necesara cunoasterea valorii acesteia in regim stationar.

E SKs

E Sk2

P E

E I

KIE I

E I SKS

'

E S I

E S IK I

'

E S I

Fig.Reprezentarea grafica a vitezei reactiei enzimatice însotita de inhibitie competitiva dupa metoda Lineweaver – Burk.

In cazul in care inhibitorul nu actioneaza competitiv, afinitatea enzimei pentru substrat sau inhibitor ramâne neschimbata, indiferent daca enzima este libera sau fixata în complex.

Reactiile ce au loc în sistemul cu inhibitie necompetitiva sunt:

Fig.Reprezentarea grafica a vitezei reactiei enzimatice însotita de inhibitie necompetitiva dupa metoda Lineweaver – Burk.

Cinetica procelesor de biosinteza poate fi studiata și sub aspectul creșterii masei celulare functie de concentratia substratului.

Astfel, Monod, analizand procesul de crestere bacteriana în corelatie cu variatia concentratiei unui singur substrat (substrat limitativ), a stabilit pentru faza de creștere logarit

mica a masei celulare urmatoarea expresie de calcul a vitezei specifice:

µ = µmax *Cs

Ks Cs

În care:

dτ

dCx= max µ *

Cs

Ks CsCx* Ecuatia lui Monod

µ - viteza specifica de creștere a masei celulare când substratul este limitat µmax –viteza maxima de creștere a masei celulare când substratul nu este

limitatKS – constanta de saturatie (corespunde concentratiei substratului la care

viteza specifica de creștere este jumatate din viteza maxima ).

Dependenta dintre viteza specifica de creștere a masei celulare și concentratia substratului limitativ este redata în figura de mai jos, din care se constata ca viteza specifica de creștere tinde asimptotic catre valoarea maxima.

Fig Dependenta dintre viteza specifica de creștere și concentratia substratului limitativ.

Substratul limitativ poate fi sursa de carbon si energie (glucoza, alcool, n-parafine), un aminoacid esential (triptofan, arginina), oxigenul, fosforul sau azotul anorganic.

- ecuatia de creștere a masei celulare în functie de concentratia substratului limitativ, Cs:

Trebuie remarcat faptul ca ecuatia Monod este valabila numai în cazul în care creșterea este limitata de un singur substrat, ceea ce în conditiile industriale se întâmpla foarte rar. De obicei, în aceste procese intervine și un al doilea substrat, care, de cele mai multe ori, este chiar oxigenul. În aceste conditii, vitezele specifice de creștere a masei celulare sunt descrise prin ecuatia lui Monod modificata sau prin ecuatia Monod - Cantois :

max= µ µ CL

KL CL

Cs

Ks Cs* *

*CLKL

CL µ= µmax *Cs

B Cx Cs*

În care: CL, CS- concentratiile substraturilor limitative;

KL, KS – constantele de saturatie corespunzatoare substraturilor limitative; B – constanta Cantois;

Pentru culturi industriale discontinue, Monod a introdus o constanta caracteristica Y, denumita constanta de exploatare sau de creștere:

dCx

τ d= Y *

τ d

dCs

În functie de valorile constantelor cinetice KS, µmax, Y stabilite de Monod, se pot caracteriza cantitativ culturile microbiene discontinue.

2.4.5. Termodinamica reactiilor biochimice

Procesul de fermentatie se încadreaza, din punct de vedere termodinamic, în grupa sistemelor termodinamice deschise, sisteme ce sunt specifice organismelor vii, caracaterizate prin schimb de energie și de materie cu mediul înconjurator, pe care îl transforma. Sistemele termodinamice deschise au drept conditie de baza, faptul ca ele nu pot fi în echilibru cu mediul lor. Organismele vii se afla, de obicei, intr-o stare stationara care reprezinta conditia de baza a sistemelor deschise în care viteza transferului de materie și energie din mediu în sistem este compensata total de viteza transferului de materie și energie din sistem în afara lui.

Faptul ca celula definita ca un sistem deschis, care nu se gasește în echilibru cu mediul sau, un mecanism ce capteaza energie libera din mediu, producâmdu-i simultan o creștere oarecare a gradului de dezordine, a entropiei, face arte din logica moleculara a starii vii.

O caracteristica a sistemelor deschise aflate in aceasta stare stationara este capacitatea de a efectua un lucru, deoarece sunt departe de conditia de echilibru. In starea stationara viteza de producere a entropiei are valoare minima, iar în aceste conditii sistemul va opera la valoarea maxima de eficienta in conditiile date.

Însa, organismele vii fiind obligate sa respecte principiul al doilea al termodinamicii, și anume sa produca entropie, au ales sa faca acest lucru dar folosind o viteza minima, mentinându-se astfel într-o stare stationara în care reactiile din celulele vii decurg cu o viteza foarte mare. Ca urmare, studiul entropiei în termodinamica proceselor de biosinteza este foarte important.

Analiza acestor fapte arata ca sistemele termodinamice deschise sunte traversate de un flux de energie ce determina autoorganizarea sistemului , și astfel se mentine la valori minime viteza de producere a entropiei.De asemeni, microorganismele se remarca printr-o eficienta deosebita în prelucrarea energiei și a materiei, eficienta ce depașește cu mult majoritatea mașinilor cunoscute de omenire.

Analiza acestor aspecte evidentiaza ca celulele vii functioneaza ca mașini izoterme ce absorb energia din mediul lor, energie pe care o transforma în energie chimica, folisita apoi pentru realizarea functiei chimice de biosinteza a componentelor celulare, a functiei osmotice, necesara transportului de materiale în celula, și a functiei mecanice, de contractie și locomotie, toate aceste functii fiind realizare la temperatura constanta.

Sursa de energie a sistemelor termodinamice deschise sunt energie hidratii de carbon, lipidele, alcoolii, proteinele etc., care prin combustie chimica elibereaza o mare cantitate de energie. O parte din aceasta energie se elimina din sistem, iar o parte este înmagazinata de sistem în compuși organici macroenergetici, dintre care se remarca acidul adenozintrifosforic(ATP), compusul responsabil cu rezerva energetica a celulei. Din structura ATP-ului, prezentata in continuare, rezulta ca legaturile dintre gruparile fosfat adiacente din ATP și ADP(acidul adenozindifosforic) sunt legaturi de tip anhidrida, notate cu (.....), în timp ce legatura dintre acidul fosforic și riboza din AMP(acidul adenozinmonofosforic) este o legatura esterica, notata cu linie dreapta.

În acest context, trebuie subliniat faptul ca energia libera standard de hidroliza a

legaturilor tip anhidrida este mult mai mare comparativ cu cea a legaturilor esterice. Chiar daca ATP-ul are în structura doua legaturi macroergice (~), în reactiile enzimatice intervine, de obicei, doar fosfatul terminal. În plus, ATP-ul nu are doar functia de a înmagazina energie chimica, ci este, în primul rând un transmitator sau trasnportor de energie chimica în celulele vii. Prin acest proces de transport al energiei la alte molecule,ATP-ul pierde gruparea fosfat terminala, trecând în ADP, care, la rândul sau, poate accepta energie chimica și reface ATP-ul, primind o grupare fosfat.

Prin reunirea acestor observatii asupra ATP-ului, s-a postulat ca ATP-ul functioneaza ciclic ca transportor de energie chimica de la reactiile de ardere, ce furnizeaza energia chimica, la diferite procese celulare care necesita un consum energetic

CO2 ATP H2

O2 P sursa de energie

O2\ P

Energie rezultată la oxidarea moleculei

combustibile

Biosinteză(lucru

chimic)

Transport activ

(lucru osmotic)

Contracție musculară

(lucru mecanic)

ADPSurse de energie

Fig. Ciclul ATP-ADP și modalitatile de utilizare a energiei eliberate de ATP

S-a demonstrat experimental ca indiferent de natura substratului limitativ, folosit drept sursa de energie, sau molecule de combustibil(exceptiile fiind foarte rare), raportul dintre cantitatea în grame a celulelor microbiene obtinute în stare uscata și numarul de molecule de ATP sintetizate este aproximativ constant și are valoarea de 10.5. În plus, s-a aratat și ca în procesul de cultivare a bacteriilor în conditii aerobe 60±5% din cantitatea de carbon din mediu este asimilata de celule și numai 40±5% este oxidat de CO2. Analizând din punct de vedere energetic, circa 62% din energia libera de oxidare a substratului reprezinta energia libera de ardere a componentelor masei bacteriene, astfel încât ΔHC=22kJ/g s.u. masa microbiana.

Daca substratul furnizor de energie este glucoza, ce se consuma într-un proces de fermentatie aerob prin catabolism, atunci se formeaza, conform urmatoarei reactii, 38 moli ATP, ce pot înmagazina 1159kJ din cei 2870 kJ obtinuti prin combustia unui mol de glucoza:

Glucoza + 6 O2 --> 6CO2 + 6H2O + 38 moli ATP

Moleculele de ATP și ADP fiind puternic ionizate, datorita faptului ca pH-ul lichidului intracelular are valoarea 7, vor forma în prezenta ionilor Mg2+, complecși de tipul celui prezentat mai jos, complecși ce constituie, de altfel, chiar forma activa a ATP-ului.

2.4.6 Bilantul de materiale

Determinarea productiei pe sarje (Pan)

Pan = 26 tone/an = 26*103 kg/an

Numarul de sarje (ns)

FAT = fondul anual de timp

FAT = 330 zile = 330 * 24 h

ts = tf + taux

tf = durata fermentatiei

tf = 140 h

taux = timpii auxiliari = [10-15] h se adopta taux = 13 h

ts = 140 + 13 = 153 ore

Productia pe sarje (Ps)

Productia in fermentator

ηg – randament global

Randamentele specifice pentru fiecare etapa a procesului tehnologic sunt urmatoarele :

- filtrare : 80% - cristalizare + distilare azeotropa : 94%

- extractie : 94% - filtrare + spalare : 95 %

- reextractie 90% - uscare : 98%

ηg = 0,59229 %

Productivitatea microorganismului

Productivitatea microorganismului pentru penicilina este de 80000 ui/ml, iar

activitatea standard este de 1670 ui/ml

1 mg................................1670 ui/ml x = 47,9041 mg/ml = 47,9041 kg/m3

x mg..............................80000 ui/ml

P = productivitatea microorganismului ; P = x

P = 47,9041 kg/m3

Vu = volumul util

Mmdc = masa mediului de cultura

Mmdc = Vu * ρ

ρ = densitatea apei la temperatura de 25°C

ρ = 997,047 kg/m3

Mmdc = 17,9676 * 997,047 = 17914,581 kg/sarja

1. Pregatirea mediului de cultura

In fermentatorul de regim, compozitia mediului de cultura este urmatoarea:

Componentii mediului de cultura Fermentatorul de regim (%)

1 Extract de porumb 2,6

2 Lactoza 6,5

3 Glucoza 2,5

4 Faina de soia 0,3

5 CaCO3 1,25

6 KH2PO4 0,55

7 NH4NO3 0,3

8 Na2SO4 0,06

9 ZnSO4 0,002

10 Acid fenilacetic 0,4

11 Tiosulfat de sodiu 0,8

12 MnSO4 0,002

13 Apa 84,736

Apa = 100 - ∑xi

100 kg M.d.c. ..................................2,6 kg extract de porumb

17914,581 kg M.d.c.........................x1 kg extract de porumb

x1 = 465,779 kg extract de porumb/sarja

100 kg M.d.c.......................................6,5 kg lactoza

17914,581 kg M.d.c............................x2 kg lactoza

x2 = 1164,448 kg lactoza/sarja

100 kg M.d.c...........................2,5 kg glucoza

17914,581 kg M.d.c.................x3 kg glucoza

x3 = 447,865 kg glucoza/sarja

100 kg M.d.c.............................0,3 kg faina de soia

17914,581 kg M.d.c..................x4 kg faina de soia

x4 = 53,744 kg faina de soia/sarja

100 kg M.d.c...............................1,25 kg CaCO3

17914,581 kg M.d.c.....................x5 kg CaCO3

x5 = 223,932 kg CaCO3/sarja

100 kg M.d.c..............................0,55 kg KH2PO4

17914,581 kg M.d.c....................x6 kg KH2PO4

x6 = 98,53 kg KH2PO4/sarja

100 kg M.d.c.............................0,3 kg NH4NO3

17914,581 kg M.d.c……….....x7 kg NH4NO3

x7 = 53,744 kh NH4NO3/sarja

100 kg M.d.c…………………..0,06 kg Na2SO4

17914,581 kg M.d.c……………x8 kg Na2SO4

x8 = 10,748 kg Na2SO4/sarja

100 kg M.d.c..............................0,002 kg ZnSO4

17914,581 kg M.d.c...................x9 kg ZnSO4

x9 = 0,358 kg ZnSO4/sarja

100 kg M.d.c..............................0,4 kg Acid fenilacetic

17914,581 kg M.d.c..................x10 kg Acid fenilacetic

x10 = 71,658 kg Acid fenilacetic/sarja

100 kg M.d.c........................0,8 kg Tiosulfat de sodiu

17914,581 kg M.d.c.............x11 kg Tiosulfat de sodium

x11 = 143,316 kg Tiosulfat de sodium/sarja

100 kg M.d.c........................0,002 kg MnSO4

17914,581 kg M.d.c............x12 kg MnSO4

x12 = 0,358 kg MnSO4/sarja

Materiale intrate % kg/sarja Materiale iesite % kg/sarja

1 Extract de porumb 2,6 465,779 Extract de porumb 2,6 465,779

2 Lactoza 6,5 1164,448 Lactoza 6,5 1164,448

3 Glucoza 2,5 447,865 Glucoza 2,5 447,865

4 Faina de soia 0,3 53,744 Faina de soia 0,3 53,744

5 CaCO3 1,25 223,932 CaCO3 1,25 223,932

6 KH2PO4 0,55 98,53 KH2PO4 0,55 98,53

7 NH4NO3 0,3 53,744 NH4NO3 0,3 53,744

8 Na2SO4 0,06 10,748 Na2SO4 0,06 10,748

9 ZnSO4 0,002 0,358 ZnSO4 0,002 0,358

10 Acid fenilacetic 0,4 71,658 Acid fenilacetic 0,4 71,658

11 Tiosulfat de sodiu 0,8 143,316 Tiosulfat de sodiu 0,8 143,316

12 MnSO4 0,002 0,358 MnSO4 0,002 0,358

13 Apa 84,736 15180,099 Apa 84,736 15180,099

TOTAL 100 17914,575 TOTAL 100 17914,575

Deoarece in timpul sterilizarii o parte din componentii mediului de cultura se degradeaza,

urmatoarele componente se iau in exces de 10% : extractul de porumb, lactoza, faina de soia.

Componentii in exces:

- extract de porumb: 1,1 * 2,6 = 2,86 % ; 1,1 * 465,779 = 512,357 kg/sarja

- lactoza : 1,1 * 6,5 = 7,15% ; 1,1 * 1164,448 = 1280,891 kg/sarja

- gluzoca : 1,1 * 2,5 = 2,75% ; 1,1 * 447,865 = 492,65 kg/sarja

- faina de soia : 1,1 * 0,3 = 0,33% ; 1,1 * 53,744 = 59,118 kg/sarja

Materiale intrate % kg/sarja Materiale iesite % kg/sarja

1 Extract de porumb 2,86 512,357 Extract de porumb 2,86 512,357

2 Lactoza 7,15 1280,891 Lactoza 7,15 1280,891

3 Glucoza 2,75 492,65 Glucoza 2,75 492,65

4 Faina de soia 0,33 59,118 Faina de soia 0,33 59,118

5 CaCO3 1,25 223,932 CaCO3 1,25 223,932

6 KH2PO4 0,55 98,53 KH2PO4 0,55 98,53

7 NH4NO3 0,3 53,744 NH4NO3 0,3 53,744

8 Na2SO4 0,06 10,748 Na2SO4 0,06 10,748

9 ZnSO4 0,002 0,358 ZnSO4 0,002 0,358

10 Acid fenilacetic 0,4 71,658 Acid fenilacetic 0,4 71,658

11 Tiosulfat de sodiu 0,8 143,316 Tiosulfat de sodiu 0,8 143,316

12 MnSO4 0,002 0,358 MnSO4 0,002 0,358

13 Apa 83,546 14966,915 Apa 83,546 14966,915

TOTAL 100 17914,575 TOTAL 100 17914,575

Datorita componentilor care se degradeaza si adaugarii lor in exces, cantitatea de apa este : Apa

= 100 - ∑xi = 83,546%

2. Sterilizarea

In aceasta etapa se degradeaza compusii care la etapa precedenta au primit un excedent de 10%.

Marimi intrate % kg/sarja Marimi iesite % kg/sarja

1 Extract de porumb 2,86 512,357 Extract de porumb 2,6 465,779

2 Lactoza 7,15 1280,891 Lactoza 6,5 1164,448

3 Glucoza 2,75 492,65 Glucoza 2,5 447,865

4 Faina de soia 0,33 59,118 Faina de soia 0,3 53,744

5 CaCO3 1,25 223,932 CaCO3 1,25 223,932

6 KH2PO4 0,55 98,53 KH2PO4 0,55 98,53

7 NH4NO3 0,3 53,744 NH4NO3 0,3 53,744

8 Na2SO4 0,06 10,748 Na2SO4 0,06 10,748

9 ZnSO4 0,002 0,358 ZnSO4 0,002 0,358

10 Acid fenilacetic 0,4 71,658 Acid fenilacetic 0,4 71,658

11 Tiosulfat de sodiu 0,8 143,316 Tiosulfat de sodiu 0,8 143,316

12 MnSO4 0,002 0,358 MnSO4 0,002 0,358

13 Apa 83,546 14966,915 Apa 84,736 15180,099

TOTAL 100 17914,575 TOTAL 100 17914,575

3. Fermentatia

In etapa de fermentatie este necesar calculul a 3 cantitati : necesarul de aer, cantitatea de

biomasa si cantitatea de apa evaporata.

Aer.

Necesarul de aer pentru etapa de fermentatie se considera a fi 1 Laer / 1 Lm.d.c * min

1L = 10-3m3 M.d.c................................1L = 10-3m3 aer

Vu = 17,9676 m3 M.d.c.........................x m3 aer

x=17,9676 m3 aer/min

1 min.........................................17,9676 m3 aer

tf = 140 * 60 = 8400 min..........y

y = 150927,84 m3 aer/sarja

Maer = Vaer * ρaer ρ0 = 1,293 kg/m3

T0 = 273 K

T = 298 K

P = 1 atm

P0 = 1,1 atm

Maer = 196508,047 kg/sarja

Biomasa.

cx = 20 g s.u./l M.d.c

Celulele vii contin 20% substanta uscata si 80% apa.

1L = 10-3 m3 M.d.c.......................................100 g celule

17,9676 m3 .................................................cx g celule

cx = 1796,76 kg biomasa/sarja

Apa evaporata.

- 1 kg de aer trecut prin mediul de cultura preia 0,01 kg de apa ;

1 kg aer.............................0,01 kg apa evaporata

196508,047 kg aer............x kg apa evaporata

x = 1965,080 kg apa evaporata/sarja

Minocul = 0,1 * Mm.d.c = 1791,458 kg/sarja

Mmediu = 0,9 * Mm.d.c = 16123,122 kg/sarja

Ldf – masa lichidului de fermentatie

Ldf = Minocul + Mmediu – Mapa evaporata - Mbiomasa

Ldf = 17914,581 – 1965,080 – 1796,76

Ldf = 14152,740 kg/sarja

Marimi intrate kg/sarja Marimi iesite kg/sarja

1 Mediu de cultura 16123,122 Lichid de fermentatie

(Penicilina G)

14152,740

(860,722)

2 Inocul 1791,458 Biomasa 1796,76

3 Aer 196508,047 Apa evaporata 1965.080

4 Aer 196508,047

TOTAL 214422,627 TOTAL 214422,627

4.Filtrarea

η = 80%

- precipitatul retine 20% din lichidul de fermentatie

Mpp - masa precipitatului

Mpp = Mbiomasa + 0.2 * Mpp = Mbiomasa / 0,8

Mpp = 2245,95 kg/sarja

Mfiltrat = Ldf – 0,2 * Mpp

Mfiltrat = 14152,140 – 0,2 * 2245,950 = 13703,55 kg/sarja

Marimi intrate kg/sarja Marimi iesite kg/sarja

1 Lichid de fermentatie

(Penicilina G)

14152,740

(860,722)

Precipitat 2245,95

2 Biomasa 1796,76 Filtrat

(Penicilina G)

13703,55

(688,577)

TOTAL 15949,5 TOTAL 15949,5

5. Extractia

η = 94%

- extractia se realizeaza utilizand acetat de butil in raport de 1:3 fata de filtrat

Madb = Mfiltrat / 3

Madb = 4567,85 kg/sarja

- reactia chimica dupa care are loc extractia este urmatoarea:

2PCOOK + H2SO4 2PCOOK + K2SO4

2 * 372 98 2 * 334 174

688,577 x y z

x = 90,699 kg H2SO4/sarja

y = 618,238 kg PCOOH/sarja

z = 161,038 kg K2SO4/sarja

Fermentatia are loc la un pH 6,7. Extractia are loc la pH 2. In acest scop se adauga acid sulfuric.

pH=6,7

pH=2 ΔpH=4,7

pH = -log[H+] 4,7 = -log[H+] [H+] = 10 -4,7 [H+] = 1,995 * 10 -5 H+/mol

1 mol H2SO4.....................2 H+

t moli H2SO4................................1,995 * 10-5 H+

t = 9,975 * 10-6 moli/l

1L filtrat……………………9,975 * 10 -6 moli H2SO4

13744 L filtrat ……………..u moli H2SO4

u = 0,13709 moli H2SO4

kg H2SO4/sarja = 0,13709 * 98 * 10-4 +90,699 = 90,7124

Pentru extractie, acidul sulfuric folosit va avea concentratia de 4%

md = 90,7124 kgH2SO4/sarja

mapa din acid = 2267,8180 – 90,7124 = 2177,098 kg apa/sarja

mextract = 0,98 * madb + PGextrasa = 0,98 * 4567,85 + 618,415 * 0,94 = 5057,6367 kg/sarja

mrafinat = 0,02 * madb + mK2SO4 + mapa din acid + mPen neextrasa + mfiltrat – mpen extrasa

mrafinat = 0,02 * 4567,85 +161,084 +2177,098 + 34,87 + 13703,55 – 688,577

mrafinat = 15481,5602 kg/sarja

Marimi intrate kg/sarja Marimi iesite kg/sarja

1 Filtrat

(Penicilina G)

13703,55

(688,577)

Extract

(Penicilina G)

5057,6361

(b=581,310)

2 Acetat de butil 4567,85 Rafinat 15481,5602

3 H2SO4 4% 2267,818

TOTAL 20539,218 TOTAL 20539,1962

6. Reextractia

η = 90%

- reextractia se realizeaza cu solutie de K2CO3 10% in exces de 10%

- are loc dupa urmatoarea reactie:

2PCOOH + K2CO3 2PCOOK + CO2 + H2O

2*334 138 2*372 44 18

581,310 x y` z` t`

y` *0,9 = y

t` * 0,9 = t

z` * 0,9 = z

x = 120,091 kg K2CO3/sarja

y`= 647,44 * 0,9 = 582,7023 kg PCOOK/sarja

z`= 38,289 * 0,9 = 34,460 kg CO2/sarja

t`= 14,664 * 0,9 = 14,097 kg H2O/sarja

MK2CO3 exces = MK2CO3 nereactionat =12,0091 kg/sarja

MK2CO3 10% = 1321,001 kg/sarja

mapa din carbonat = 1188,9009 kg/sarja

Msolvent = Mextract – MPen. reextrasa – 0,02 * (Madb * 0,98)

MPen reextrasa = b* 0,9 = 523,179

Msolvent = 4444,9341 kg/sarja

Msol carbonat = MPen. reextrasa + mapa din carbonat + MK2CO3 nereactionat + MK2CO3 exces +Mapa din reactie + + MCO2

din reactie + 0,02 * (Madb * 0,98)

Msol carbonat = 1933,8712

Marimi intrate kg/sarja Marimi iesite kg/sarja

Extract

(Penicilina G)

5057,636

(581,310)

Solvent 4444,9341

2 K2CO3 10% 321,001 Solutie carbonat

(Penicilina G)

1933,8712

(c=582,7023)

TOTAL 6378,637 TOTAL 6378,805

7. Cristalizare. Distilare azeotropa.

η = 0,94

- compozitia azeotropului apa:butanol este de 32:68

32 kg H2O.............................68 kg BuOH

Msol carbonat-c............................x`

Msol carbonat - c = 1933,8712 – 582,7023 = 1351,1689

x` = 2871,2339 kg/sarja BuOH x = x` *1,2 = 3445,4807 kg BuOH/sarja

BuOHI = BuOHex + PGnecristalizata = x` * 0,2 + c *0,06 = 609,2088 kg/sarja

MPGnecrist = c * 0,94 = 582,7023 * 0,94 = 547,7401 kg/sarja

Mazeotrop = MH2O sol de carbonat + MBuOH = 4222,4082 kg/sarja

Marimi intrate kg/sarja Marimi iesite kg/sarja

1 Solutie carbonat

(Pen. G)

1933,8712

(582,7023)

Penicilina G

Precipitat

547,7401

2 BuOH 3445,4807 Azeotrop 4222,4082

3 BuOHI 609,2088

TOTAL 5379,351 TOTAL 5379,3517

8. Filtrare

η = 0,95

- cristalele se spala pe filtru cu BuOH si CHCl3 in raport de 1:5 fata de masa pecipitatului

MBuOH = MCHCl3 = Mpp/5 = 109,5482 kg/sarja

MBuOH I` = BuOHI + d – Mpp = 578,7788 kg/sarja

Marimi intrate kg/sarja Marimi iesite kg/sarja

1 Penicilina G pp 547,7401 Precipitat 578,1701(e=520,353)

2 BuOH 109,5482 BuOH 109,54823 CHCl3 109,5482 CHCl3 109,54824 BuOHI 609,2088 BuOHI` 578,7788

TOTAL 1376,0453 TOTAL 1376,0349

9. Uscareη = 0,98

- umiditatea retinuta este de 10%

MCHCl3 = 0,1 * Mpp + Mpp pierdut = 68,224 kg/sarja

Mpp pierdut = e * 0,02 = 10,407 kg/sarja

Penicilina G = e *0,98 = 520,353 * 0,98 = 509,9459 kg/sarjaMarimi intrate kg/sarja Marimi iesite kg/sarja

1 Precipitat 578,1701 Penicilina G 509,94592 CHCl3 68,224

TOTAL 578,1701 TOTAL 578,1699