8/7/2019 pcr_ayhan

1/79

PCR&REAL TIMEPCR&REAL TIMEPCRPCR

Ara.Gr.AyhanAra.Gr.Ayhan

NLNL

8/7/2019 pcr_ayhan

2/79

1866

.Bitkilerde kaltmnesaslar

1953 DNA nn kimyasal yaps

1957

Kornberg: test tpnde DNA.1963 Sanger :sekans prosdr.

1966

Genetik kod

1972 Berg:ilk recombinat DNA molekl.

1980s

PCR

ilk konvansiyonel DNA bazldeneyler

1990s

lk gen tedavileri 2000Genetik gda mhendislii

Dolly

insan genomunun sekanslanmas

8/7/2019 pcr_ayhan

3/79

lk kez 1985'de bilim dnyasna sunulduundanlk kez 1985'de bilim dnyasna sunulduundan

itibaren polimeraz zincir reaksiyonu (PCR); hemitibaren polimeraz zincir reaksiyonu (PCR); hemaratrmada hem de klinik laboratuarlarda tanda yeniaratrmada hem de klinik laboratuarlarda tanda yenibir r amstr. ABD'de Cetus irketin'de alisanbir r amstr. ABD'de Cetus irketin'de alisanHenry A. Erlich, Kary Mullis ve Randall K. SaikiHenry A. Erlich, Kary Mullis ve Randall K. Saikitarafindan gelistirilmistir. Metod basite tpte nkleiktarafindan gelistirilmistir. Metod basite tpte nkleikasitlerin uygun kosullarda ogaltilmasidir.asitlerin uygun kosullarda ogaltilmasidir.

(Science,1985:230,1350).(Science,1985:230,1350).

8/7/2019 pcr_ayhan

4/79

PCR Reaksiyonu?PCR Reaksiyonu?

PCR reaksiyonunda temel basamakPCR reaksiyonunda temel basamakvardr ve oaltlm rn miktar, bu vardr ve oaltlm rn miktar, bu admn tekrarna baldr.admn tekrarna baldr.

1)1) Denatrasyon (90-95Denatrasyon (90-95 C)C)2)2) Primer balanmas (50-70Primer balanmas (50-70 C)C)

3)3) DNA sentezi (70-75DNA sentezi (70-75 C)C)

Bu adm bir PCR siklsn olutururBu adm bir PCR siklsn oluturur(Genetik Kavramlar S-515)(Genetik Kavramlar S-515)

8/7/2019 pcr_ayhan

5/79

lk admda, oaltlacak DNAlk admda, oaltlacak DNAdenatre edilerek tek zincirlidenatre edilerek tek zincirlihale getirilir. Bu DNA temizhale getirilir. Bu DNA temizolmak zorunda deildir veolmak zorunda deildir vegenomik DNA, kurumu kangenomik DNA, kurumu kangibi adli tp rnekleri, uzungibi adli tp rnekleri, uzunsre saklanm tbbisre saklanm tbbirnekler,, tek bir sa teli,rnekler,, tek bir sa teli,

mumya kalntlar, fosil gibimumya kalntlar, fosil gibideiik kaynaklardan eldedeiik kaynaklardan eldeedilebiliredilebilir

ift zincirli DNA stlarak tek zincirli hale getirilir.

((Genetik Kavramlar SGenetik Kavramlar S

515)515)http://www2.mtroyal.ab.ca/~tnickle/3311/supplement/PCR.jpg

8/7/2019 pcr_ayhan

6/79

Scaklk 50 ile 70Scaklk 50 ile 70 C arasnda birC arasnda birdeere drlr ve primerlerindeere drlr ve primerlerintek zincirli hale getirilmi DNAyatek zincirli hale getirilmi DNAyabalanmas salanr. Bu primerlerbalanmas salanr. Bu primerler

yapay oligankleotidlerdir (15-30yapay oligankleotidlerdir (15-30nkleotid uzunluunda) venkleotid uzunluunda) veoaltlacak DNA ksmnnoaltlacak DNA ksmnnularndaki tamamlayc dizilereularndaki tamamlayc dizilerezgl olarak balanr.zgl olarak balanr.

Bu primerler, kalp DNA nn sentezi iin balanggrevi yapar.

((Genetik Kavramlar SGenetik Kavramlar S515)515)http://www2.mtroyal.ab.ca/~tnickle/3311/suppleme

nt/PCR.jpg

8/7/2019 pcr_ayhan

7/79

DNA polimerazn syaDNA polimerazn syadayankl bir eklidayankl bir eklireaksiyon karmnareaksiyon karmnailave edilir ve DNAilave edilir ve DNAsentezi 70 ile 75sentezi 70 ile 75 CCarasndaki scaklktaarasndaki scaklkta

gerekleir.gerekleir.

Bu primerler, kalp DNA nn sentezi iin balanggrevi yapar.

((Genetik Kavramlar SGenetik Kavramlar S515)515)http://www2.mtroyal.ab.ca/~tnickle/3311/suppleme

nt/PCR.jpg

8/7/2019 pcr_ayhan

8/79

8/7/2019 pcr_ayhan

9/79

8/7/2019 pcr_ayhan

10/79

PCR d k ll l l lPCR d k ll l l l

8/7/2019 pcr_ayhan

11/79

PCR da kullanlan malzemelerPCR da kullanlan malzemeler1)1) Kalp DNAKalp DNA2)2) Reaction buffer (x 2,5Reaction buffer (x 2,5 l)l)3)3) forward primer (x 0,5forward primer (x 0,5 l)l)

4)4) reverse primer (x 0,5reverse primer (x 0,5 l)l)5)5) dNTP (x 4dNTP (x 4 l)l)6)6) MgClMgCl22 (x 2,5(x 2,5 l)l)

7)7) Taq Polimraz (x 0,25Taq Polimraz (x 0,25 l)l)

8/7/2019 pcr_ayhan

12/79

PCRn SnrlarPCRn Snrlar

Ksa rnlerin elde edilmesiKsa rnlerin elde edilmesi Kontaminasyona ak olmaKontaminasyona ak olmaTaq DNA polymerase giderek inaktiveTaq DNA polymerase giderek inaktive

olur. Taq DNA Polimerazin, yari mrolur. Taq DNA Polimerazin, yari mr92.5'de 130 dk; 95C'de 40 dk'dir. Bu92.5'de 130 dk; 95C'de 40 dk'dir. Bunedenledir ki PCR'in sonlarina dogru olannedenledir ki PCR'in sonlarina dogru olansikluslarda aktivitesi sinirlanmaktadir.sikluslarda aktivitesi sinirlanmaktadir.

Ortamda Fenol kalntlarnn bulunmasOrtamda Fenol kalntlarnn bulunmasPCR inhibe eder.PCR inhibe eder.

8/7/2019 pcr_ayhan

13/79

Real Time PCRReal Time PCR

Son ylllarda PCR reaksiyonlarnda scaklk dngleriSon ylllarda PCR reaksiyonlarnda scaklk dnglerisalamak iin kullanlan cihazlarn (thermocycler)salamak iin kullanlan cihazlarn (thermocycler)hassas lm aletleriyle birletirilmesi, real-time PCRhassas lm aletleriyle birletirilmesi, real-time PCRolarak adlandrlan yeni bir yntemin gelimesineolarak adlandrlan yeni bir yntemin gelimesineneden olmutur. Real-time PCRda rnlerin analizineden olmutur. Real-time PCRda rnlerin analizi

reaksiyon srasnda yaplmaktadr. Bu nedenle,reaksiyon srasnda yaplmaktadr. Bu nedenle,agaroz jel elektroforezi, DNA bantlarnn mor tesiagaroz jel elektroforezi, DNA bantlarnn mor tesik altnda grntlenmesi gibi ilemlerink altnda grntlenmesi gibi ilemlerinuygulanmasna gerek kalmamaktadr. Real-time PCRuygulanmasna gerek kalmamaktadr. Real-time PCRrnlerinin kalitatif ve kantitatif analizlerinde, diziyernlerinin kalitatif ve kantitatif analizlerinde, diziye

zgn olmayan floresan boyalardan ya da diziyezgn olmayan floresan boyalardan ya da diziyezgn problardan yararlanlmaktadr.zgn problardan yararlanlmaktadr.

8/7/2019 pcr_ayhan

14/79

Real-Time PCRReal-Time PCR

Real-time PCR monitors the fluorescence emitted during

the reaction as an indicator of amplicon production at

each PCR cycle (in real time) as opposed to the endpoint

detection

Real-Time PCRReal-Time PCR

Real-time PCR Reaksiyon esnasnda her bir PCR siklsndeyeterli miktarda rnn verdii floresans a gre alp

reaksiyonu aama aama sonuna kadar oluan rn kontroleden bir sistemdir.

8/7/2019 pcr_ayhan

15/79

Gerek Zamanl PCRGerek Zamanl PCR( Real Time PCR )( Real Time PCR )

Ima zelliine sahipIma zelliine sahipmolekller kullanarak PCRmolekller kullanarak PCRoluurken izleme ve miktaroluurken izleme ve miktar

belirleme yntemidir.belirleme yntemidir.

8/7/2019 pcr_ayhan

16/79

Gerek zamanl

PCR*Sinyal retimiAmplikon miktarn PCRn

linear faznda izlemekPrimer/prob/amplikonlarn

florojenik molekllerlearetlenmesi

*Cihaz

Sinyali saptamak vedeerlendirmekThermal cycler +Eksitasyon-Emisyon sistemleri+Bilgisayar

8/7/2019 pcr_ayhan

17/79

Gerek Zamanl PCR

DNAya balanan Fluoroforlar aretli Oligoproblar

5 - eksonkleaz problar

Ardk oligoproblarMolecular beacon lar

aretli primerler

8/7/2019 pcr_ayhan

18/79

GEREK ZAMANLI PCR

Kantitasyon

Erime erisi (Tm) analizi

Multipleks uygulamas

8/7/2019 pcr_ayhan

19/79

8/7/2019 pcr_ayhan

20/79

KLASK PCRKLASK PCR PCR sonundaki rnler (amplikonlar)PCR sonundaki rnler (amplikonlar)

saptanr; analiz edilir.saptanr; analiz edilir.

REAL TIME PCRREAL TIME PCR(GEREK ZAMANLI PCR)(GEREK ZAMANLI PCR)

PCR devam ederken ortaya kanPCR devam ederken ortaya kanrnler saptanmaya balad andarnler saptanmaya balad anda

deerlendirmeye alnr.deerlendirmeye alnr.

8/7/2019 pcr_ayhan

21/79

Real-time PCRn Prensipleri

Bir flresan rporterin kantitasyonu

ve tans zerine kurulu

PCR rnlerinin miktarndaki ilk nemli

art (CT- threshold cycle) hedef templatein

balang miktar ile orantldr

8/7/2019 pcr_ayhan

22/79

Primer seimi ve dizaynPrimer seimi ve dizaynTermalcycler programlarTermalcycler programlar

Reaksiyon artlarReaksiyon artlarZaman alan analiz ilemleriZaman alan analiz ilemleriBir testin optimizasyonuBir testin optimizasyonu

Agaroz jel elektroforezi, BlotlamaAgaroz jel elektroforezi, BlotlamaKontaminasyon riskiKontaminasyon riski

Klasik PCRdaKlasik PCRdaProblemlerProblemler

8/7/2019 pcr_ayhan

23/79

Real-time PCRReal-time PCRn avantajlarn avantajlar Spesifik olmayan amplifikasyonlardan etkilenmiyorSpesifik olmayan amplifikasyonlardan etkilenmiyor Reaksiyon boyunca veri toplanarak ayn anda analizReaksiyon boyunca veri toplanarak ayn anda analiz

imkanimkan PCRPCR sonras rnlerinsonras rnlerin ikincil bir ilemi gerekmiyorikincil bir ilemi gerekmiyor

((yksek verimlilikyksek verimlilik,,dk kontaminasyon riskidk kontaminasyon riski)) ultra-rapidultra-rapid siklussiklus (30(30 dak.dak. to 2to 2 saatsaat)) 1010 kat bulan geni dinamik aralkkat bulan geni dinamik aralk ki kat deiiklii hzla tanmlayabilmekteki kat deiiklii hzla tanmlayabilmekte Spesifik erime erisi analizleri ile spesifikSpesifik erime erisi analizleri ile spesifik

amplifikasyonlarn tanmlanmasamplifikasyonlarn tanmlanmas Duyarll, zgll ve tekrarlanabilirlii yksekDuyarll, zgll ve tekrarlanabilirlii yksek

Konvensiyonel PCRdan daha pahal deilKonvensiyonel PCRdan daha pahal deil

8/7/2019 pcr_ayhan

24/79

Real-time PCRReal-time PCRnn ddezezavantaavantajlarjlar

teknik donanm, alt yap, beceri veteknik donanm, alt yap, beceri vetecrbe gerektiriyortecrbe gerektiriyor

Yksek ekipman ihtiyacYksek ekipman ihtiyac

Ayn ve farkl laboratuvarlarAyn ve farkl laboratuvarlararasnda sonular aras fakllklararasnda sonular aras fakllklar

Standardizasyon problemiStandardizasyon problemi

8/7/2019 pcr_ayhan

25/79

Tp iinde oluan

fluorescence saptanr

Amplifikasyon srasndasaptama yaplr

Real-Time PCR

8/7/2019 pcr_ayhan

26/79

(www)

http://www.the-scientist.com/2006/12/1/68/1/http://www.the-scientist.com/2006/12/1/68/1/

8/7/2019 pcr_ayhan

27/79

Sk kullanlanReal-Time PCR

Systemleri

8/7/2019 pcr_ayhan

28/79

8/7/2019 pcr_ayhan

29/79

BioRad iCycler

8/7/2019 pcr_ayhan

30/79

Corbett Research Rotor-Gene 3000

8/7/2019 pcr_ayhan

31/79

SmartCycler

8/7/2019 pcr_ayhan

32/79

MJ Research Chromo4

8/7/2019 pcr_ayhan

33/79

Idaho Technology Rapid Cycler

8/7/2019 pcr_ayhan

34/79

RocheLightTyper & LightCycler

8/7/2019 pcr_ayhan

35/79

Stratagene

8/7/2019 pcr_ayhan

36/79

Stratagene

8/7/2019 pcr_ayhan

37/79

Exponential FazExponential Faz

Linear Faz (yksek farkllk)Linear Faz (yksek farkllk)

Plateu Faz (End-point)Plateu Faz (End-point)

PCRn TEMEL FAZLARIPCRn TEMEL FAZLARI

8/7/2019 pcr_ayhan

38/79

8/7/2019 pcr_ayhan

39/79

Exponential FazExponential Faz

PCR rn miktar her siklusta tamPCR rn miktar her siklusta tamolarak iki kat artarolarak iki kat artar

Reaksiyon spesifik ve tamdrReaksiyon spesifik ve tamdrReaksiyonun Etkinlii %100 drReaksiyonun Etkinlii %100 drReaksiyonun tm bileenleri tazedir.Reaksiyonun tm bileenleri tazedir.

8/7/2019 pcr_ayhan

40/79

8/7/2019 pcr_ayhan

41/79

i ( k kLi F ( k k

8/7/2019 pcr_ayhan

42/79

Linear Faz (yksekLinear Faz (yksekfarkllk)farkllk)

Reaksiyonun kompanenetleriReaksiyonun kompanenetleritkenmeye balartkenmeye balar

Reaksiyon yavalarReaksiyon yavalarOluan PCR rnleri derade olmayaOluan PCR rnleri derade olmaya

balarbalar

8/7/2019 pcr_ayhan

43/79

8/7/2019 pcr_ayhan

44/79

Plateu Faz (End-point)Plateu Faz (End-point)

Geleneksel PCR larda jel bazl tanGeleneksel PCR larda jel bazl tan Reaksiyon sonlanmaktaReaksiyon sonlanmaktaYeni PCR rn olumamaktaYeni PCR rn olumamakta PCR rnleri derade olmasPCR rnleri derade olmasartmaktaartmakta

8/7/2019 pcr_ayhan

45/79

8/7/2019 pcr_ayhan

46/79

CYCLENUMBER AMOUNTOFDNA0

8/7/2019 pcr_ayhan

47/79

0

1

2

3

4

5

67 12

8 25

9 51

10 1,024

11 2,048

12 4,096

13 8,192

14 16,384

15 32,768

16 65,536

17 131,072

18 262,144

19 524,288

20 1,048,576

21 2,097,15222 4,194,304

23 8,388,608

24 16,777,216

25 33,554,432

26 67,108,864

27 134,217,728

28 268,435,456

29 536,870,912

30 1073741824

CYCLE NUMBER AMOUNT OF DNA0 1

8/7/2019 pcr_ayhan

48/79

0

200000000

400000000

600000000

800000000

1000000000

1200000000

1400000000

1600000000

0 5 10 15 20 25 30 35

PCR CYCLE NUMBE

AMOUNTOFDNA

1

10

10 0

1000

10000

100000

1000000

10000000

100000000

1000000000

10000000000

0 5 10 15 20 25 30 35

AMOUNTOFDNA

0 1

1 2

2 4

3 8

4 16

5 32

6 647 128

8 256

9 512

10 1,024

11 2,048

12 4,096

13 8,192

14 16,384

15 32,768

16 65,536

17 131,072

18 262,144

19 524,288

20 1,048,576

21 2,097,15222 4,194,304

23 8,388,608

24 16,777,216

25 33,554,432

26 67,108,864

27 134,217,728

28 268,435,456

29 536,870,912

30 1 073 741 82

8/7/2019 pcr_ayhan

49/79

8/7/2019 pcr_ayhan

50/79

Floresan Prob SistemleriFloresan Prob Sistemleri

HHidrolizasyonidrolizasyon probproblarlar (TaqMan(TaqMan ((PE Biosystem)), Beacons,, Beacons,

Scorpions)Scorpions)

HHiibridibridizzaasysyon probon problarlar (Light Cycler(Light Cycler ((Roche))

DNADNA

ya balanan (ya balanan (

bindingbinding

))boyalarboyalar

(SYBR Green)(SYBR Green)

8/7/2019 pcr_ayhan

51/79

8/7/2019 pcr_ayhan

52/79

LightCycler sisteminin bir uygulamasnda; yalnzca ift zincirliDNAya balandklarnda floresans veren boyalar (Cyber green I)kullanlarak, amlifikasyona bal DNA art, ortaya kanfloresansn miktar ile llmektedir. Primerin balanmasn

takiben

gerekletirilen uzama aamasnda hedef DNAnn ift sarmalhale

gelmesiyle DNAya balanan cyber green miktar artmakta vebuna bal olarak yaylan floresans miktarnda art

gzlenmektedir.

8/7/2019 pcr_ayhan

53/79

8/7/2019 pcr_ayhan

54/79

8/7/2019 pcr_ayhan

55/79

SYBR GreenSYBR Green((ift zincirli DNA ya balanmakta)ift zincirli DNA ya balanmakta)

ift zincirli DNA ya balanmaktaift zincirli DNA ya balanmakta)) ift zincirli DNA ya balandklarift zincirli DNA ya balandklar

srece floresan emisyonusrece floresan emisyonuolmaktaolmakta SpeSpesifik olmayan balanmalarsifik olmayan balanmalar

gereklemektegereklemekteyoun optimizasyona ihtiyac yokyoun optimizasyona ihtiyac yok

8/7/2019 pcr_ayhan

56/79

TaqmanTaqmanLightCyclern dier bir uygulama ekli, hedefe zgl problarkullanmaktr. Burada problarla testin zgll artrlmtr.Problardan biri 3 ucundan floresans boya ile iaretli (donr boya),dieri 5 ucundan alc boya (acceptor dye) ile iaretlenmitir.Problar hedef amplikonlar zerinde birbirine yakn (1-5 nkleotituzaklkta) yere balanmakta ve iaretli ular yan yana gelmektedir.ki boyann yan yana gelmesiyle aa kan enerji ikinci probzerindeki alc boyay etkileyerek floresans oluumuna yolamaktadr. Fluoresance resonance energy transfer, (FRET)olarak adlandrlan bu enerji transferi sonucunda oluan floresansmiktar, ortamdaki hibridizasyonun derecesine dier bir ifade ilePCR siklusu sresince oluan amplikonlarn miktarna bal olarakartmaktadr.

8/7/2019 pcr_ayhan

57/79

TaqMan sisteminde 5 ve 3 ularndan florokrom maddelerleiaretli prob kullanlmaktadr. Probun 5 ucunda raportrflorokrom (6-carboxyfluorescein =6-FAM), 3 ucunda isebasklayc florokrom (6-carboxy-tetramethyl-rhodamine=TAMRA) bulunmaktadr. Prob, tek sarmal hale getirilen hedefmolekl zerinde, primerlerin balanma blgesinin arasndakalan yere balanr. Prob-hedef molekl arasndakihibridizasyon devam ettii srece raportr florokrom maddeninsinyal oluturmas, 3 utaki basklayc florokrom tarafndanengellenmektedir. Primerlerin hedef nkleik asite balanmasntakiben balatlan primer uzamas probun baland noktayakadar geldiinde, sentezin devam edebilmesi iin Taq DNApolimeraz enzimi 53 nkleaz aktivitesini kullanarak probu 5utan ykmaya balar. Bylece raportr florokrom serbest halegeer ve sinyal oluturur (ekil 5). Her siklusta retilenamplikon miktarna paralel olarak sinyal iddeti de artmaktadr

8/7/2019 pcr_ayhan

58/79

TaqMan FRETTaqMan FRET

Fluorescent Resonant Energy TransferFluorescent Resonant Energy Transfer

8/7/2019 pcr_ayhan

59/79

Nigel Walker, NIEHS(www)

http://dir.niehs.nih.gov/microarray/realtime.pdfhttp://dir.niehs.nih.gov/microarray/realtime.pdf

8/7/2019 pcr_ayhan

60/79

8/7/2019 pcr_ayhan

61/79

SpeSpessifiifitete

TaqManTaqMan

Yksek spesifiklikYksek spesifiklik

SYBR GreenSYBR Green

Dk spesifiteDk spesifite

8/7/2019 pcr_ayhan

62/79

Molecular BeaconsMolecular Beacons

molecular beaconsmolecular beacons l ti real-time

8/7/2019 pcr_ayhan

63/79

Amplicon

molecular beaconsmolecular beacons

A

B

C

FRET

real-timereal-timereal-timereal-timereal-time

Reporter

Non-fluorescentQuencher

Excitation

ANNEALING

ScorpionScorpion

8/7/2019 pcr_ayhan

64/79

ScorpionScorpion

8/7/2019 pcr_ayhan

65/79

8/7/2019 pcr_ayhan

66/79

Yeni Prob SistemleriYeni Prob Sistemleri

Peptide nucleic acids (PNAs)Peptide nucleic acids (PNAs)nkleikasit anologlar (Tm 15)nkleikasit anologlar (Tm 15)

Minor Groove Binding (MGB)Minor Groove Binding (MGB)Locked Nucleic acid (LNA)Locked Nucleic acid (LNA)

Oligonklotid riboz anololarOligonklotid riboz anololar

Threshold CycleThreshold Cycle

8/7/2019 pcr_ayhan

67/79

Threshold CycleThreshold Cycle

threshold cyclethreshold cycle veyaveya CTCT deerideeri RnRn de nemli artn olduu ilkde nemli artn olduu ilksiklusu ifade edersiklusu ifade eder

nedir CT?

8/7/2019 pcr_ayhan

68/79

nedir CT?

RR (R +) (R )(R +) (R )

8/7/2019 pcr_ayhan

69/79

RnRn = (Rn+)- (Rn-)= (Rn+)- (Rn-)(normalize reporter signal)(normalize reporter signal)

Rn+Rn+ Templatide ieren reaksiyona girenTemplatide ieren reaksiyona girentm komponentlerin floresan emisyonutm komponentlerin floresan emisyonu

Rn- negatif kontroln (pasif Boya) veRn- negatif kontroln (pasif Boya) vereaksiyone olmayan rneklerin floresanreaksiyone olmayan rneklerin floresanemisyonuemisyonu

RnRn Rn+ ve Rn- arasndaki fark olupRn+ ve Rn- arasndaki fark olup CTCTDeerinin hesaplanmasnda kullanlan temelDeerinin hesaplanmasnda kullanlan temelgstergedirgstergedir

8/7/2019 pcr_ayhan

70/79

0 10 20 30 40

cycle number

Rn

CT

Threshold Rn

Sample

No Template

Control

Nedir Rn?

Rn

+Rn

8/7/2019 pcr_ayhan

71/79

(www)

Geri (Revers)Geri (Revers)

http://www.the-scientist.com/2006/12/1/68/1/http://www.the-scientist.com/2006/12/1/68/1/

8/7/2019 pcr_ayhan

72/79

Geri ( Revers )Geri ( Revers )Transkripsiyon PCRTranskripsiyon PCR

RNA PCR olarak ta bilinen RT-PCR ikiRNA PCR olarak ta bilinen RT-PCR ikiaamal olup RNAdan tamamlayc DNAaamal olup RNAdan tamamlayc DNAsentezi (geri transkripsiyon) vesentezi (geri transkripsiyon) vetamanlayc DNA(cDNA)nn da standarttamanlayc DNA(cDNA)nn da standartPCR yoluyla oaltlmas aamalarnPCR yoluyla oaltlmas aamalarnkapsar.RT-PCR tek aamal birkapsar.RT-PCR tek aamal birreaksiyonla da gerekleebilir.reaksiyonla da gerekleebilir.

T.thermophilus (Tth) DNA polimeraz gibiT.thermophilus (Tth) DNA polimeraz gibibaz polimerazlar mangan varlndabaz polimerazlar mangan varlndahem RNA hem de DNA kalp ipliklerinihem RNA hem de DNA kalp ipliklerinikullanabildiinden tm ilem ayn tptekullanabildiinden tm ilem ayn tptetek aamada yaplabilmektedir. RT-PCR,tek aamada yaplabilmektedir. RT-PCR,mRNA veya viral RNA miktarlarnnmRNA veya viral RNA miktarlarnnbelirlenmesi ile RNA dzeyinde genbelirlenmesi ile RNA dzeyinde genanlatmnda olduka duyarl biranlatmnda olduka duyarl bir

yntemdir.yntemdir.

IN SITU PCR

8/7/2019 pcr_ayhan

73/79

IN SITU PCRPCR ile ilgili almalarda dier nemli bir aama, lam zerine tespit edilenenfekte hcrede bulunan mikroorganizmaya ait hedef DNAnnamplifikasyonu ve sonucun in situ hibridizasyon ile

gsterilmesidir. Ksaca; lam zerine doku veya hcreler konduktan sonra,havada kurutulur ve 105Cde 30 saniye bekletilir. Paraformaldehitli fosfattamponlu tuzlu su (%2lik) ile bir saat ileme alnr. 3 x 0.1 M PBS(Phosphate buffer saline) ile bir kere, 1 x 0.1 M PBS ile defa ykanr.Proteinaz K enzimi (5 g/ml) ile 55Cde iki saat muamele edildikten sonra,96Cde iki dakika tutularak Proteinaz K inaktive edilir.Lam su ile ykanr ve havada kurutulur. Sonra lamn zerine amplifikasyonsolsyonu eklenir ve plastik kapakla kapatlr. Plastik kapan etraf oje ile

evrilir. Lam, otomatik termal cycler zerine konulur. Aluminyum katile kapatldktan sonra amplifikasyon balatlr. Amplifikasyondan sonralam absol etil alkol iinde 3-5 dakika tutulur. Sonra 92Cde 30 saniyedenatrasyon salanr ve 2 x SSC (Sodyum klorr + Sodyumsitrat)tamponu ile ykanr. Bunu takiben zgl problarla in situhibridizasyon yaplarak amplifikasyon sonucu gzlenir

8/7/2019 pcr_ayhan

74/79

ALIMA RAPORUALIMA RAPORU

G-Aktin yapmG-Aktin yapm1)1) G-aktin tamponu hazrand.G-aktin tamponu hazrand.

- 5 mM K-Fosfat- 5 mM K-Fosfat- 0,5 mM ATP- 0,5 mM ATP- 0,1 mM CaCl- 0,1 mM CaCl22- 0,5 mM DTT- 0,5 mM DTT

- 1 mM NaN- 1 mM NaN33

2)2) Hazrlanan tamponun iinde Tavann izgili kas hcrelerinden eldeHazrlanan tamponun iinde Tavann izgili kas hcrelerinden eldeedilen lifler 4-5 saat manyetik kartrcda zlr.edilen lifler 4-5 saat manyetik kartrcda zlr.

3)3) zlen rnek Tlbent bezden szldkten sonra 0,5 lik filtredenzlen rnek Tlbent bezden szldkten sonra 0,5 lik filtredengeirildi.geirildi.

4)4) Elde edilen rneklerin hacmine gre 10 mM NaCl ve 3 mM MgClElde edilen rneklerin hacmine gre 10 mM NaCl ve 3 mM MgCl22eklenerek gece polimerlemeye brakld.eklenerek gece polimerlemeye brakld.

8/7/2019 pcr_ayhan

75/79

Aktin YapmAktin Yapm

5) rnekler 80.000 x g de 4 saat santrafj edildi.5) rnekler 80.000 x g de 4 saat santrafj edildi.6) Pelet alnr ve zerine 2,5 ml depolimerleme tamponu6) Pelet alnr ve zerine 2,5 ml depolimerleme tamponu

eklenir ve vortex ile pelet tampon iinde zld.eklenir ve vortex ile pelet tampon iinde zld.

7) 29.000 x g de 45 dakika santrifj edilen rneklerden7) 29.000 x g de 45 dakika santrifj edilen rneklerdenspernatant alnr.spernatant alnr.

8) Alnan rnek G aktin tamponunda 4 saat dialize yatrlr.8) Alnan rnek G aktin tamponunda 4 saat dialize yatrlr.

9) Dializ edilen rnekler elektroforez yaplarak G-aktinin9) Dializ edilen rnekler elektroforez yaplarak G-aktininoluup olumad gzlendi.oluup olumad gzlendi.

8/7/2019 pcr_ayhan

76/79

G-Aktin den F-AktinG-Aktin den F-Aktin

8/7/2019 pcr_ayhan

77/79

G Aktin den F AktinG Aktin den F Aktineldesieldesi

Elde edilen aktine 10Elde edilen aktine 10mM NaCl ve 3 mMmM NaCl ve 3 mMMgClMgCl22 eklenerekeklenerek

polimerlemeyepolimerlemeye

brakldbrakld PolimerlemePolimerleme

srasnda 0, 5, 10, 20,srasnda 0, 5, 10, 20,60 dakilarda rnein60 dakilarda rnein

vizkosluu lld.vizkosluu lld.

G-Aktin - F-Aktin

0,6

0,7

0,8

0,9

1

0 20 40 60 80

zaman (dk)

Viskozite(

Viskozite

k id ld i

8/7/2019 pcr_ayhan

78/79

Bakteriden EF-2 EldesiBakteriden EF-2 Eldesi

1. Daha nceden 180 C'de 2 saat kuru etvde otoklavlanan cam kap iine 100 ml1. Daha nceden 180 C'de 2 saat kuru etvde otoklavlanan cam kap iine 100 mlLS (50 ug/ml ampisilin) kondu. Bug'dan pipet ucuyla alnarak, 100 ml LB (w/amp)LS (50 ug/ml ampisilin) kondu. Bug'dan pipet ucuyla alnarak, 100 ml LB (w/amp)iine kontamine edildi. Gece boyunca 37 C'de shakerda sallanmaya braklacakd.iine kontamine edildi. Gece boyunca 37 C'de shakerda sallanmaya braklacakd.

2. Ertesi sabah nceden otoklavlanm cam kaplar iine 500 ml LB (w/ampisilin)2. Ertesi sabah nceden otoklavlanm cam kaplar iine 500 ml LB (w/ampisilin)kondu. Gece boyunca oalan bakterilerden her 500 ml'ye 1 ml gelecek ekildekondu. Gece boyunca oalan bakterilerden her 500 ml'ye 1 ml gelecek ekildekonulduktan sonra 37 C'de shakerda sallanmaya brakld.konulduktan sonra 37 C'de shakerda sallanmaya brakld.

3. oalan bakterinin yarm saatlik zaman dilimlerinde 600 nm'de OD deerleri3. oalan bakterinin yarm saatlik zaman dilimlerinde 600 nm'de OD deerlerilld. OD deeri 600 nm dalga boyunda 0,5 - 0,6 deerine ulanca 0.1 mMlld. OD deeri 600 nm dalga boyunda 0,5 - 0,6 deerine ulanca 0.1 mMolacak ekilde IPTG ve 20 ugolacak ekilde IPTG ve 20 ug/ml/ml olacak ekilde 500 ml ampisilinli LB medyumuolacak ekilde 500 ml ampisilinli LB medyumu

ierisine 2 ul chloroamphenicol eklendi. IPTG ve cloroamphenicol eklemedenierisine 2 ul chloroamphenicol eklendi. IPTG ve cloroamphenicol eklemedenhemen nce daha sonra poliakrilamid jelde kontrol edebilmek amacyla 0. saat iinhemen nce daha sonra poliakrilamid jelde kontrol edebilmek amacyla 0. saat iin1 ml rnek alnd.1 ml rnek alnd.

4. Shaker'da 25 C'de 4 saat boyunca inkbasyona brakldktan sonra, 4. saatin4. Shaker'da 25 C'de 4 saat boyunca inkbasyona brakldktan sonra, 4. saatinsonunda poliakrilamid jelde kullanmak zere 1 ml rnek alnd.sonunda poliakrilamid jelde kullanmak zere 1 ml rnek alnd.

5. Buz iinde konulan veya santrifj godelerine aktarlan bakteriler 3500 rpm'de 45. Buz iinde konulan veya santrifj godelerine aktarlan bakteriler 3500 rpm'de 4C'de 10 dakika boyunca santrifj edilip bakterilerin kmesini salandktan sonraC'de 10 dakika boyunca santrifj edilip bakterilerin kmesini salandktan sonra2 ml lyzis bufferda zld.2 ml lyzis bufferda zld.

6. Sonikatrde buz iindeyken 40-60 saniye kadar st beyaz rengine olana dek6. Sonikatrde buz iindeyken 40-60 saniye kadar st beyaz rengine olana dektutulup daha sonra -20 C'ye kaldrld.tutulup daha sonra -20 C'ye kaldrld.

7. Poliakrilamid jelde O. saat ve 4.saat iin aldn rnekleri yrtp coommassie7. Poliakrilamid jelde O. saat ve 4.saat iin aldn rnekleri yrtp coommassieboyama yaparak protein elde edilip edilmediini kontrol edildi.boyama yaparak protein elde edilip edilmediini kontrol edildi.

8. istenen protein poliakrilamid jelde grldkten sonra, prfikasyon aamasna8. istenen protein poliakrilamid jelde grldkten sonra, prfikasyon aamasnageildi.geildi.

8/7/2019 pcr_ayhan

79/79