PCR Scelta dello stampo Scelta dei primer. PCR da DNA genomico.

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PCR •Scelta dello stampo •Scelta dei primer

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PCR

•Scelta dello stampo

•Scelta dei primer

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PCR da DNA genomico

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PCR da mRNA (RT-PCR)

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Uso dei “linkers”

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Vettori dA:dT

3’3’5’5’

3’5’3’

5’

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PCR da DNA genomico

EcoRIBamHI

BamHI EcoRI

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prom Tag o rep. cDNA term

trascrizionetraduzione

Proteine di fusione

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Elettroforesi di acidi nucleici

•Gel di agarosio

•Gel di acrilammide

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Elettroforesi su gel di agarosio

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Tamponi di elettroforesi

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Soluzioni di caricamento

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Soluzioni di caricamento

•Aumentano la densità del campione

•Colorano il campione

•Rendono visibile la corsa elettroforetica

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Migrazione del DNA su gel

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Fattori che influenzano la migrazione

•Peso molecolare

•Concentrazione di agarosio

•Conformazione DNA

•Voltaggio applicato

•Intercalanti

•Tampone di elettroforesi

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Visualizzazione del DNA

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Marcatori di peso molecolare

HindIII

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Fotodocumentazione

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Recupero DNA da gel

•Elettroeluizione

•Agarosio “low melting”

•Solubilizzazione agarosio

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Gel di acrilammide

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Apparato per gel di acrilammide

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Metodi di sequenziamento

•Sanger (enzimatico)

•Maxam e Gilbert

(chimico)

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Metodo di Sanger

primer

primernuovo DNA

dideossinucleotideterminatore

quattro dNTP (incluso 32PdNTP)DNA polimerasi

La catena neosintetizzata termina quando un ddNTP è incorporato al posto di un dNTP

Denaturare e separare su gel di poliacrilammide

ddTTP ddCTP ddGTP ddATP

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Metodo di Maxam e GilbertDNA singolo filamento marcato ad una estremità

4 o 5 reazioni di modificazione base-specifiche

Rottura del filamento in corrispondenza della base modificata mediante piperidina

Es. metilazione delle G con dimetilsolfato

Separare i frammenti marcati su gel di acrilammide

32P

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Gel di poliacrilammide di sequenza

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Fasi di un progetto di sequenziamento

•clonaggio e preparazione del DNA

•reazioni di sequenza

•elettroforesi su gel di

poliacrilammide

•interpretazione e raccolta dati

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Vettori a singolo filamento

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Fagemidi

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Strategie di sequenziamento

•Primer specifici consecutivi

•Delezioni progressive

•Frammenti casuali (shotgun)

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Reazioni base-specifiche

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Confronto metodi di sequenziamento

Sanger

rapida e semplice attuazione

disponibilità di kit

necessità di primer

sensibile a strutture secondarie

Maxam e Gilbert

lunga preparazione del DNA

reazioni da mettere a punto

relativamente economico

strutture non influenti

utilizzabile per oligonucleotidi

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Sequenziamento automatico

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Sequenziamento con Taq polimerasi


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