PCR- diagnostiikan

mahdollisuudet

infektiotautien diagnostiikassa

02.03.2016 Sisätautimeeting

Kerttu Saha, sairaalamikrobiologi

Seinäjoen keskussairaala, Kliininen mikrobiologia

PCR diagnostiikka Seks

• 2013 käyttöön PCR -menetelmä

(GeneXpert)

– C.difficile toksiinigeeni ulosteesta

– InfA/B nenänielueritteestä tai imulimasta; uusin testi

löytää myös RS-viruksen

– St.aureus ja MRSA nopea tunnistus veriviljelystä

– MTB- kompleksin varmistus ja rifampisiini-

resistenssigeeni ysköksestä

– B-ryhmän streptokokin nopea tunnistus ennenaikaisten

tai riskisynnytysten yhteydessä

– Norovirus ulosteesta

– Chlamydia trachomatis – ja gc virtsasta ja genitaaleista

– Suunnitelmissa aloittaa HPV-osoitus v. 2016

• 2016 uusi multiplex-PCR (FilmArray)

– Veriviljelypaneeli (BCID)

– Meningittipaneeli (ME)

– Respiratorinen paneeli (RP)

– Gastropaneeli (GI)

Veriviljelynäytteenoton muutos

• Uusimpien tutkimusten mukaan ihokontaminaatiot

vähenevät, kun näyte otetaan yhdellä pistolla (2

aerobia ja 2 anaerobia pulloa)

• Tärkein tekijä bakteremian/sepsiksen dg:ssa on veren

määrä -> aina tulee ottaa 2 x 2 pulloa (8-10 ml/plo)

• Erityistilanteissa kuten endokardiitissa tulee

kuitenkin ottaa 3 x 2 veriviljelypulloa tietyin väliajoin

• Sentraalista katetri-infektiota epäiltäessä näyte sekä

perifeerisestä suonesta että kanyylista

• Hiivaepäilyt hyvä mainita lähetteessä

• Veriviljelypullot muuttuvat muovisiksi ja

anaerobipullon koostumus muuttuu -> kasvattaa

hiukan nopeammin mikrobeja

FilmArray-PCR bakteremiassa

• Värjäyspositiiviset veri-viljelyt:

PCR pullosta

• Tulos 65 min:ssa

• Käyttö: fulminantit sepsikset,

tehohoitopotilaat

• Voi soveltua veriviljelyiden

lisäksi muiden steriilien

nesteiden (esim. pleura)

testaukseen

• Vaikutus antimikrobi-

lääkitykseen ja hoitoon

2.3.2016 K.Saha 4

Clinical Evaluation of the FilmArray Blood Culture Identification Panel in Identification of Bacteria and Yeasts from Positive

Blood Culture Bottles, Osman Altun, Mohammed Almuhayawi, Måns Ullberg, Volkan O¨zenci, Journal of Clinical Microbiology Dec 2013 Vol 51 Number 12

Veriviljelypaneelin testaustulokset/ Seks

• Positiivisista rutiini-

veriviljelyistä tehtyä Film-

Array-PCR-tulosta verrattiin

viljelylöydökseen

• Löytää tärkeimmät

veriviljelystä löytyvät

kannat ainakin sukutasolla,

mutta ei löydä kaikkia veri-

viljelystä eristettäviä

kantoja esim. anaerobeja

• MUTTA: Veriviljelypullojen

elatusaineen DNA-jäämät

antoivat joitakin vääriä

positiivisia tuloksia (oikean

löydöksen lisäksi)

FilmArray- PCR-tulos Referenssitulos

Streptococcus: 9 Str.equisimilis (C tai G-ryhmä): 3

Str.viridans 3, Str.anginosus-ryhmä 2

Str.gallolyticus: 1

Streptococcus pneumoniae: 3 Streptococcus pneumoniae 3

Streptococcus pyogenes: 2 Streptococcus pyogenes 2

Escherichia coli: 6 Escherichia coli: 6

Enterococcus: 3 Enteroc. faecalis: 2, Enteroc. faecium 1

Pseudomonas aeruginosa: 2 Pseudomonas aerguniosa: 2

Candida glabrata: 2

Candida albicans 1

Candida glabrata: 2

Candida albicans 1

Klebsiella pneumoniae: 1

Klebsiella oxytoca 1

Klebsiella pneumoniae: 1

Klebsiella oxytoca 1

Enterobacter cloacae complex: 1 Enterobacter clocae complex: 1

Proteus: 2 Proteus mirabilis: 2

Staphylococcus aureus: 1

Staphylococcus 2

Staphylococcus aureus: 1

S. epidermidis 1, S. hominis 1

Haemophilus influenzae 2 Haemophilus influenzae 1,

Haemophilus parainfluenzae 1

Negatiivinen 10

(eristetyt mikrobit eivät ole

FilmArrayn paneelissa)

Acinetobacter lwoffii 1, Salmonella sp. 1,

Moraxella catarrhalis 1, anaerobit: 7

(Bacteroides fragilis-ryhmä 2,

Fusobacterium sp.1, Eggerthella lenta 1,

Actinomyces radingae 1, Actinom.

meyerii+Peptrostr. 1, Clostridium

clostrioforme 1)

Taulukko 1. Veriviljelypositiiviset, Seks, PCR vs viljely (n = 48)

FilmArray- PCR meningiitti/enkefaliitti-dg:ssa

• Meningiitin/enkefaliitin aiheuttajina bakteerit ja virukset, sienet

• Viruksista yleisimmät herpes simplex-virus ja enterovirus ja

bakteereista pneumokokki ja meningokokki

• Kattava paneeli tärkeimpiä meningiitin/enkefaliitin aiheuttajia

• ≤ 200 µL likvoria; tulos valmiina runsaassa tunnissa

• Testattujen näytteiden määrä vielä vähäinen (vasta 12 näytettä)

FilmArray-PCR respiratorisissa infektioissa

• Respi-mikrobien seulonta 65 min

• Käyttö: vakavissa infektioissa ja jos

InfABNhO tai RVirAg neg tai jos vahva

epäily muusta respirat.infektiosta

• Influenssa A/B- ja RS-infektioepäilyissä

kannattaa pyytää –InABNhO

Löydös

FilmArray-PCR/

referenssimenetelmä

RSV 13/12

Influenssa A virus 8/8

Rinovirus 6/7

Adenovirus 3/3

Parainfluenssavirus 3/3

Influessa B virus 2/2

Koronavirus 2/2

Mycopl. pneum. 2/2

Negatiivinen 34/34

RVirNhO

Mukana

myös

bakteereita

Taulukko 2. Seks, resp.löydökset PCR vs referenssi (n= 70)

0

5

10

15

20

25

30

35

vko 45 vko 46 vko 48 vko 49 vko 50 vko 51 vko 52 vko 53 vko 1 vko 2 vko 3 vko 4 vko 5 vko 6 vko 7 vko 8

Influenssa A 2 4 10 2 9 8 27 16 35 35 19 25 20

RS-virus 1 1 1 2 6 8 7 4 9 20 15 24 14 7 17

Influenssa B 1 1 2 2

2

4

10

2

9 8

27

16

35 35

19

25

20

1 1 1 2

6

8 7

4

9

20

15

24

14

7

17

1 1 2 2

Infl

ue

nss

a A

/B-

ja R

S-lö

ydö

ste

n m

äärä

(lk

m)

Influenssa A/B- ja RS-löydökset 2015-16, EPSHP viikoittain (vain 1 löydös/pot)

Influenssaepidemia alkoi marraskuulla 2015 ja huippu todennäköisesti

helmikuussa 2016, myös RS-virusta runsaasti

FilmArray GI-diagnostiikassa

2.3.2016 K.Saha 10

• Suolistoinfektioita aiheuttaa laaja kirjo viruksia, bakteeria ja parasiitteja

• Monet GI-patogeenit epideemisiä

• Viljelyt vievät aikaa 3-4 vrk, mutta mahdollistavat herkkyyden

• PCR:llä voidaan löytää mikrobeja, jotka eivät kasva viljelyssä

• viljelyä tarvitaan kuitenkin esim. salmonellan diagnostiikassa ja kantojen

herkkyyden määrittämiseen

GI-patogeenien seulonta

65 min:ssa

Multicenter Evaluation of the BioFire FilmArray Gastrointestinal Panel for Etiologic Diagnosis of Infectious Gastroenteritis Sarah N. Buss,* Amy Leber,Kimberle Chapin,cPaul D. Fey,a Matthew J. Bankowski,Matthew K. Jones,Margarita Rogatcheva,Kristen J. Kanack,Kevin M.

Bourzac, Journal of Clinical Microbiology March 2015 Vol 53 Number 3

F-BaktVIP-tutkimus (PCR ja viljely)

• tutkimusta kannattaa pyytää

erityisesti, jos

– F-BaktVi1, F-NoroNhO, F-

CldiViT jääneet negatiiviseksi

– jos epäillään EHEC:iä tai

muita ripuli-E.coli-kantoja

kuten ETEC:iä (ns. turisti-

ripuli) tai tai muita

harvinaisempia aiheuttajia

• Ensisijaiset tutkimukset

– bakteeripuliepäilyissä F-BaktVi1 ja

– antibioottiripulissa F-CldiVT ja

– virusripuliepäilyissä F-NoroNhO ja

Rota-AdenAg

Multiplex- PCR-menetelmät

• Multiplex-PCR-testit sopivat nopeaan diagnostiikkaan, osa jopa

päivystyskäyttöön

• Monien mikrobien seulonta samanaikaisesti mahdollista

• Nopeuttavat kriittisten näytteiden tulosten saantia

• Vaikutus hoitoratkaisuihin ja eristyksiin

– veriviljelyt, meningiitti/enkefaliitti, respiratoriset infektiot,

suolisto-infektiot

• Multiplex-PCR-testien hinta noin 100 € (mening.paneeli 150 €)

• Nopea tulos vähentää hoitokustannuksia

• eivät korvaa perinteisiä menetelmiä kuten viljelyä, mutta

täydentävät ja nopeuttavat diagnostiikkaa

– Viljely tarvitaan löydöksen varmistamista ja

herkkyysmääritystä varten

Multiplex-PCR:n mahdollisia etuja ja haittoja

• Enemmän löydöksiä

• Optimoi hankalasti saatavien

näytteiden diagnostiikkaa (likvor,

nivelneste ym)

• Yksinkertaistaa pyyntökäytäntöjä

(vain 1 testipyyntö monille

erillisille tutkimuksille)

• Virtaviivaistaa hoitoprosesseja ja

laboratorion toimintaa

• Kustannussäästöt

hoitokustannuksissa ja

testauksessa

• Multiplex-PCR-menetelmien

kehitys monimutkaista

• Mahdolliset väärät positiiviset

tulokset tai ristireaktiot

• Väärät negatiiviset tulokset

• Herkkys hieman matalampi kuin

yksittäisissä PCR:issä

• PCR-testien tulosten tulkinta voi

olla joskus hankalaa

• laitteet ja testit suhteellisen

kalliita

• Kustannusten nousu, mikäli

pyydetään tarpeettoman laajaa

paneelia, vaikka yksi spesfifinen

tutkimus riittäisi

http://www.epshp.fi/1/yksikoiden_sivut/sairaanhoidolliset_palvelut/kliininen_mikrobiologia/mikrobiloydostilastot

Kysyttävää?

Puh. 415 4881

sairaalamikrobiologi

Kerttu Saha