‘‘PCR- Полимеразын гинжин урвал’’

• 1983 онд Кэрри Мюллис( Kary Mullis) шинжилгээний аргыг боловсруулж 1993 онд нобелийн шагнал хүртжээ

Полимеразын гинжин урвал гэж юу вэ ?

Амьтан ургамал, бактери, вирусийн удмын мэдээллийг ДНХ (зарим нь РНХ) агуулдаг.

ДНХ- нь нуклеотидууд гэж нэрлэгдэх нэгжээс тогтоно. Нуклеотидууд тогтсон дарааллын дагуу залгагдан ДНХ-г бүтээдэг. Нуклеодидуудын тоо ихсэх тусам, ДНХ уртасна. ДНХ нэг эсээс нөгөөд, эцэг эхээс үр хүүхдэд хуулбарлагдан дамжиж байдаг. Бидний биед шинэ эс үүсэх тоолонд шинэ ДНХ нийлэгжиж байдаг. Энэхүү ДНХ-ийн хувилагдах үйл явцыг лабораторт хуруу шилэнд явуулахыг л полимеразын гинжин урвал (ПГУ) гэж нэрлэдэг.

PCR гэдэг нь Polymerase chain reaction буюу полимеразын гинжин урвал гэсэн үгний товчлол. PCR нь оношлогоо нь халдварт өвчнийг, түүний дотор БЗХӨ-г лабораторын нөхцөлд оношлох арга юм.

PCR-ын төрөлRT-PCR •РНХ-ээс ДНХ олшруулах арга.

•Энэ аргад урвуу транскиптаз ферментийн тусламжтайгаар РНХ-ээс кДНХ үүсгэх ба үүний дараа энгийн ПГУ-ийн адил кДНХ-ээс бай дараалал олшруулна.

In Situ-PCR •Эсийн түрхэц урьдчилан бэлтгэх ба ПГУ-ыг эс дотор явуулах арга

Allele Specific-PCR •Аллeль өвөрмөц ПГУ•Нэг нуклеотидийн хэлбэршлийг илрүүлэх зорилгоор тодорхой нэг аллэлд өвөрмөцөөр ПГУ явуулах арга

D-PCR• Doppel PCR(Олон бүтээгдэхүүнт ПГУ)• Олон тооны хос праймер ашиглан

хэмжээгээр ялгаатай хэд хэдэн бай дарааллыыг нэг зэрэг олшруулах арга

Real time-PCR

• Бодит хугацааны ПГУ• Энэ арга нь ПГУ-аар олширсон бүтээгдэхнүүнийг

флюоресцэнт бодисын тусламжтай бүтргэдэг тул тоон анализ хийх боломжтой, шинжилгээний дараа гэлийн элекртофорез шаардлагагүй

Урт ПГУ •Энгийн ПГУ-аас илүү урт буюу 5кб-10кб урт ДНХ-ийн хэсгийг олшруулах арга•Энгийн ПГУ-аар олшруулж чадахгүй том хэмжээний гэнийн клонин хийхэд ашигладаг

Methylation specific-PCR• Метилжилт өвөрмөц ПГУ• ДНХ-ийн дараалал дахь метилжсэн

хэсгийг судлах зорилгоор хэрэглэдэг ПГУ

Nest-PCR

• Үүрэн ПГУ• ПГУ-ын өвөрмөц чанарыг ихэсгэх зорилгоор

хэрэглэдэг ба хоер хос праймер ашиглан дараалсан хоёр ПГУ-аар бүтээгдэхүүн олшруулна. Эхний ПГУ-аар бүтээгдэхүүн олширсон тохиолдолд дараагийн ПГУ-д уг олширсон бүтээгдэхүүнээс дахин арай богино хэмжээтэй бүтээгдэхүүн олширно

Энэ шинжилгээ нь тухайн халдварыг үүсгэсэн байж болох өвчин үүсгэгч бичил биетийн ДНХ-ийн жижиг хэсгийг судалгааны материал дотроос илрүүлэх дээр суурилдаг. ДНХ-ийн жижиг хэсэг гэдэг нь ДНХ-д зөвхөн өөрийн гэсэн дахин давтагдашгүй дарааллын дагуу байрлаж байдаг хэдэн зуун сууриуд юм. Халдварыг PCR шинжилгээгээр оношлоход ДНХ-ийн жижиг хэсэг байхад л хангалттай.

PCR шинжилгээг хийх явцад зөвхөн тухай өвчин үүсгэгчид байдаг ДНХ-ийн хэсгийг хайдаг. Өөрөөр хэлбэл өөр ямар ч нян, вируст байхгүй, зөвхөн тухай нянд л байдаг хэсгийг хайдаг. Үүний дараа полимеразын урвалыг ашиглан ДНХ-ийн эдгээр хэсгүүдийн клонжин үржүүлдэг. Энэ урвал дуусах үед ДНХ-ийн тухай хэсгүүд нь 1012 ширхэгээс цөөнгүй болсон нөхцөлд ДНХ-ийн тухай хэсгийг зөв танисан гэж үздэг.

Репликацийн үед ДНХ полимераз эсгэг ДНХ-ийг хуулбарлахад праймер заавал шаарддаг бөгөөд праймаз эсгэг праймерийг нийлэгжүүлдэг.

Өөрийн судлах гэж буй ДНХ-ийн тодорхой дараалалд тохирсон праймерийг үйлдвэрийн аргаар нийлэгжүүлэн бэлтгээд праймерийг тусламжтайгаар ДНХ-ийн тодорхой хэсгийг сонгон олшруулах боломжтой.

ПГУ-ын праймер нь богинохон, дан утаслаг ДНХ бөгөөд голдуу 15-35 нуклеотидийн урттай байдаг. ПГУ-ыг явуулахын тулд ДНХ-ийн хос утаслаг тус бүрийг олшруулах 2 төрлийн праймер, полимераз эсгэг, нуклеотид (А, Т, Г, Ц), нэг болон хоёр валенттай ион бүхий буфер уусмалыг тодорхой харьцаагаар хольж бэлтгэнэ. Бэлтгэсэн ПГУ-ын холимгийг бага хэмжээгээр савлаж, дээр нь сорьц нэмэн, ПГУ-ын Машинд байрлуулдаг.

PCR нь 3 үе шаттай1. Денатураци- ДНХ-ийн хос гинж салан дан гинжин хэлхээ болох. 90c

2. Эрлийзжих- Праймер холбогдож эрлийзжинэ 55c-72c

3. Уртсах- Полимерази 1сек-д 35-100 нуклеотид холбоно. 70c

Денатурацийн үе шатанд ДНХ-тэй холимгийг халааж, дан утаслаг болгоно (Денатураци). Энэ үед праймерийн дараалалтай эсрэг комплементар дараалал бүхий ДНХ-ийн хэсэг (бай дараалал) сорьц дотор байвал праймер ДНХ-ийн хооронд устөрөгчийн холбоо үүсгэнэ. Хэрэв ДНХ-ийн утаслаг дээр праймер холбогдсон бол тохиромжтой температурт полимераз эсгэг ДНХ-ийг хуулбарлана.

Денатураци темпертур ихэвчлэн 94c-95c байх ба праймер холбогдох температур нь 55c-60c байна. Уртсах үе шат нь полимераз ферментийн хувьд 72c байх ба энэ гурван үе шат дахин дахин (25-39цикл) давтагдсанаар ДНХ-ийн тодорхой хэсэг олон дахин олширдог.

Денатураци Temperature: 92-95c ДНХ-ийн хос утаслаг ---------> ДНХ-ийн дан утаслаг

Праймер холбогдох

Уртсах

PCR Шинжилгээний материал Эпитель эсийн хусам / эрэгтэй эмэгтэй хүмүүсийн шээсний сүвнээс

авсан/ Цус сийвэн Биологийн шингэн / түрүү булчирхайн шингэн, нугасны шингэн, ураг

орчмын шингэн, үений шингэн, шүлс, гялтангийн шингэн/ Шээс Ходоод, 12 хуруу гэдэсний биопатууд

PCR-ын бүрэлдэхүүн хэсгүүд

1. ДНХ, РНХ матриц- Олшруулахаар төлөвлөсөн ДНХ хэсэг 2. Хос Праймер- нуклеотид молекул нийлэгжилтийг эхлүүлэх гарааны

молекул 3. dNTPs (дизоксирибонуклеотид)- тулгуур өрөгч ДНХ полимеразаар

шинэ ДНХ хэлхээг нийлэгжүүлдэг. 4. Дулаанд тэсвэртэй ДНХ полимераза- Термус Акуатикус бактериас

гаргаж авсан фермент 5. Mg++ион- ферментийн кофактор, катализын идвэхижилтийг

эрчимжүүлдэг. 6. Буфер уусмал- РН нөхцөлдүүлэх 7. Ионы хамаарал- NaCl, KClэнерги үүсэлтийг хангах

PCR Параметр үзүүлэлт ДНХ матриц- шугаман жижиг фрагмент (0,5-50ng) Олигонуклеотид праймер (0.025- 0,2μg) Дизоксинуклеотид (20-200μg) Дулаанд тэсвэртэй ДНХ полимераза (1-2,5 unit) Mg (1,5-2,5mM) Ионы концентраци (40mM NaCl, 50mM KCl) Буфер уусмал PH=7-8

ThermocyclersТермал циклер PCR-ын дээжийг тодорхой температурын шатлалуудын дагуу

явуулах үүднээс ээлжлэн халааж, хөргөх процессыг явуулдаг.

PCR tube Thermocyclers

PCR-ын шинжилгээнд нөлөөлөх бусад хүчин зүйлс: Харь ДНХ-ийн контаминаци илрэх Үүнээс сэргийлэхийн тулд: тусгаар өрөөнд явуулах Ариун нөхцөлд ажиллах Урвалжыг стандарт хэмжээгээр хэсэгчлэн авах Эерэг сөрөг хяналтыг тогтмол тавих Зааврын дагуу гүйцэтгэх