Optické biosenzory pro studium biomolekul a jejich interakcí · Jiří Homola Optické biosenzory...
-
Upload
nguyenliem -
Category
Documents
-
view
227 -
download
0
Transcript of Optické biosenzory pro studium biomolekul a jejich interakcí · Jiří Homola Optické biosenzory...
www.ufe.cz
Jiří Homola
Optické biosenzory pro studium biomolekul a jejich interakcí
16. června 2015
Ústav fotoniky a elektroniky AV ČR, v. v. i.
Optické biosenzory: cíl výzkumu
Cílem našeho výzkumu je vyvinout nové optické biosenzory
pro studium biomolekul a jejich interakcí a pro kvantifikaci
biologických a chemických látek.
Oblasti využití biosenzorů:
1. Biologický výzkum
2. Bioanalytika
Rychlá a citlivá detekce biologických a chemických látek je
potřebná v řadě oblastí:
■ medicinální diagnostika,
■ monitorovaní životního prostředí,
■ kontrola kvality potravin,
■ ochrana proti chemickému a biologickému terorismu.
Pochopení komplexních biologických procesů (například
molekulárních procesů souvisejících se vznikem a rozvojem
chorob) umožní přesnější diagnostiku a účinnější léčbu.
2 J. Homola: Optické biosenzory pro studium biomolekul a jejich interakcí
Optické afinitní biosenzory
3
Optické afinitní biosenzory jsou optická zařízení, která se skládají z
molekulárních receptorů a optického systému, který transformuje interakci
mezi detekovanou biomolekulou a receptorem na výstupní signál.
J. Homola: Optické biosenzory pro studium biomolekul a jejich interakcí
4
Hlavní typy optických afinitních biosenzorů
Senzory založené na spektroskopii vedených vln kovově-
dielektrických vlnovodů - senzory s povrchovými
plasmony.
Senzory založené na fluorescenčních značkách a měření
fluorescence.
1. Afinitní optické biosenzory využívající molekulární značky
2. Bezznačkové optické afinitní biosenzory
Interferometrické senzory (Mach-Zehnderův integrovaně-
optický interferometr, Fabry-Perotův interferometr).
Senzory založené na spektroskopii vedených vln
dielektrických vlnovodů (mřížkový vazební člen,
rezonanční zrcadlo).
J. Homola: Optické biosenzory pro studium biomolekul a jejich interakcí
Povrchové plasmony
Šířící se povrchové plasmony
(ŠPP)
Lokalizované povrchové plasmony
(LPP)
Pole nanoděr.
Pole nanotyček.
Hloubka vniku pole:
Ldiel = 150 - 400 nm
Hloubka vniku pole:
Ldiel = 10 - 40 nm
m d
m d
ε εωβ=
c ε +ε
Kov Dielektrikum
Konstanta šíření:
Pole nanopyramid.
E-pole
Oblak e -
Kovováčástice
+++
- - - +++
- - -
5 J. Homola: Optické biosenzory pro studium biomolekul a jejich interakcí
6
Princip činnosti optických senzorů s povrchovými
plasmony
Optický hranol
Vrstva kovu
Optické záření
Dielektrikum
600 700 800 9000.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Odra
ziv
ost
Vlnová délka [nm]
Povrchový plasmon předává optické vlně informaci o změnách indexu lomu prostředí.
Změna parametrů optického
záření: intenzita, fáze,
polarizace
Změna konstanty
šíření povrchového
plasmonu
Změna
indexu
lomu
Senzory založené na rezonanci povrchových plasmonů (Surface Plasmon
Resonance - SPR).
J. Homola: Optické biosenzory pro studium biomolekul a jejich interakcí
vol
dn
dn
cK
Princip činnosti optického afinitního biosenzoru s povrchovými plasmony.
II. Interakce I. Před interakcí Povrchová
koncentrace Změna indexu
lomu
Změna parametrů
optického záření
Změna konstanty
šíření povrchového
plasmonu
7
Index lom
u
Čas
Optická excitace povrchových plasmonů
J. Homola: Optické biosenzory pro studium biomolekul a jejich interakcí
Optický systém senzoru Čip s
ukotvenými
receptory
Systém pro
přípravu a
distribuci
vzorku
Biosenzory s povrchovými plasmony: hlavní
technologické komponenty
8 J. Homola: Optické biosenzory pro studium biomolekul a jejich interakcí
Plasmonické
nanostruktury
Funkční
molekulární
pokrytí
Mikrofluidní
systémy
Biologické
aplikace
Optické
senzorické
systémy
Optické biosenzory: hlavní směry výzkumu v ÚFE
Simulace
a design Příprava
Realizace Simulace
9
Příprava Charakterizace
Simulace
a design Realizace
-500 0 500 1000 1500
0.0
0.1
0.2
0.3
Studium
biomolekul.
interakcí
Biodetekce
J. Homola: Optické biosenzory pro studium biomolekul a jejich interakcí
Plasmonické nanostruktury: teorie, design, realizace
TEORIE
PŘÍPRAVA Interfereční UV litografie
Litografie elektronovým svazkem (EBL)
Nanoobrábění iontovým svazkem (FIB)
Kolodiní litografie
Boční pohled
Pohled shora
Dimer
nanočástic
Metody konečných diferencí v časové oblasti
(FDTD)
Zobecněná multičásticová Mie teorie
Rigorózní metoda vázaných vln (RCWA)
Integrální řešení Maxwellových rovnic
10 J. Homola: Optické biosenzory pro studium biomolekul a jejich interakcí
Optické systémy pro plasmonické biosenzory
Vysoce paralelizovaný senzor založený na zobrazení povrchových plasmonů a polarizačním kontrastu.
Laboratorní 6-kanálový senzor založený na spektroskopii povrchových plasmonů.
Mobilní kanálový senzor založený na spektroskopii povrchových plasmonů a multiplexování vlnových délek.
Kompaktní 6-kanálový senzor založený na nové metodě spektroskopie povrchových plasmonů (SPRCD).
11 J. Homola: Optické biosenzory pro studium biomolekul a jejich interakcí
12
Laboratorní senzor s povrchovými plasmony
Polychromaticradiation
Prism
Channel A Channel B
SP 1 SP 2
Metal layer
Sample
4-kanálový laboratní senzor s povrchovými plasmony (nahoře)
Detail SPR čipu (vpravo)
CITLIVOST:
7000 nm/RIU
ROZLIŠENÍ:
< 2×10-7 RIU
ROZSAH:
1.32-1.45 RIU
Excitace povrchových
plasmonů pomocí
optického hranolu.
Modulace vlnové délky.
Čtyři nezávislé optické
a mikrofluidní kanály.
Teplotní stabilizace.
J. Homola: Optické biosenzory pro studium biomolekul a jejich interakcí
13
Laboratorní senzor založený na zobrazování SPR
pro současnou detekci velkého počtu látek
Laboratorní prototyp zobrazovacího SPR senzoru.
ROZLIŠENÍ:
2x10-7 RIU
VELIKOST DETEKČNÍ
OBLASTI:
~ 150μm
POČET DETEKČNÍCH
KANÁLŮ:
100-300
M. Piliarik, M. Bocková, J. Homola, Biosensors and Bioelectronics, 26, 1656–1661 (2010).
CCD kamera
Kolimátor
Hranol a průtoková cela
J. Homola: Optické biosenzory pro studium biomolekul a jejich interakcí
14
Senzor založený na lokalizovaných plasmonech
(LSPR) a zobrazování v polarizačním kontrastu
600 700 800 900 1000
0
20
40
60
80
100
120
Op
era
tin
g w
ave
len
gth
of S
PR
im
ag
ing
Experiment
Wavelength [nm]
Po
lari
ton
(a) (b)
600 700 800 900 1000
0
20
40
60
80
100
120
1.33
Glass
xy
z
x
y40nm × 110nm
30 nm
1.33
1.43
Theory
Po
lari
za
tio
n c
on
tra
st [a
.u.]
Wavelength [nm]
Koncept optického senzoru založeného na excitaci povrchových plasmonů na poli zlatých nanotyček pomocí úplného vnitřního odrazu v
polarizačním kontrastu.
Spektrum odraženého světla v polarizačním
kontrastu (FDTD).
600 700 800 900 1000
0
20
40
60
80
100
120
Op
era
tin
g w
ave
len
gth
of S
PR
im
ag
ing
Experiment
Wavelength [nm]
Pola
rito
n
(a) (b)
600 700 800 900 1000
0
20
40
60
80
100
120
1.33
Glass
xy
z
x
y40nm × 110nm
30 nm
1.33
1.43
Theory
Pola
riza
tio
n c
on
tra
st [a
.u.]
Wavelength [nm]
Pole zlatých nanotyček na skleněné podložce
Rozměry nanotyček: 40 × 110 × 30 nm Perioda: 250 nm
M. Piliarik, H. Šípová, P. Kvasnička, N. Galler, J. R. Krenn, J. Homola, Optics Express, 20, 672 (2012).
J. Homola: Optické biosenzory pro studium biomolekul a jejich interakcí
6 8 10 12 14 16
0
10
20
30
40
50
60
70
0
2
4
6
8
10
12
Sensor
response [
DN
A/p
art
icle
]
Time [min]
100nM
10nM
5nM
1nM
0.5nM
Buffer
DNA
Buffer
Se
nso
r re
sp
on
se
[p
g/m
m2]
Minimální rozlišitelné pokrytí povrchu:
35 fg/mm2 <1 DNA/nanorod
Odezva LSPR senzoru na různé koncentrace krátkých oligonukleotidů.
Detekční limit: ~200 pg/ml
LSPR senzor
Detekční limit: ~100 pg/ml
SPR senzor
M. Piliarik, H. Šípová, P. Kvasnička, N. Galler, J. R. Krenn, J. Homola, Optics Express, 20, 672 (2012).
Senzor založený na lokalizovaných plasmonech
(LSPR) a zobrazování v polarizačním kontrastu
20 J. Homola: Optické biosenzory pro studium biomolekul a jejich interakcí
Mikro-SPR systém:
Detekovaný počet biomolekul může být snížen minimalizací
detekční oblasti.
P. Kvasnička, K. Chadt, M. Vala, M. Bocková , J. Homola, Optics Letters, 37, 163–165 (2012).
SPR senzor s minimalizovanou detekční oblastí pro
detekci malého počtu molekul
SPR senzory měří změny povrchového pokrytí ~ 0.1 pg/mm2, 105 proteinů.
21 J. Homola: Optické biosenzory pro studium biomolekul a jejich interakcí
17
SPR senzor s minimalizovanou detekční oblastí
pro detekci malého počtu molekul
40 50 60 70 80 90 100
755.5
756.0
756.5
757.0
SP
R d
ip p
ositio
n (
nm
)
Time (min)
Streptavidin50 μg/mL
Buffer
220 222 224 226 228 230
756.684
756.685
756.686
Pozorování vzniku monovrstvy tvořené molekulami streptavidinu.
Detekční oblast:
4 x 16 = 64 μm2
Rozlišení indexu lomu:
5 x 10-7 RIU
Rozlišení povrchového pokrytí:
0.7 pg/mm2
450 molekul
Časová odezva SPR senzoru na formování streptavidinové monovrstvy.
P. Kvasnička, K. Chadt, M. Vala, M. Bocková, J. Homola, Optics Letters, 37, 163–165 (2012).
J. Homola: Optické biosenzory pro studium biomolekul a jejich interakcí
18
Kompaktní SPR senzory: nová metoda
spektroskopie povrchových plasmonů
SPRCD (Surface Plasmon Resonance Coupler and Dispenser) excituje
povrchový plasmon druhým difrakčním řádem a spektrálně rozkládá
světlo difragované do prvního řádu na prostorově citlivý detektor.
O. Telezhnikova, J. Homola, Optics Letters 31, 3339-3341 (2006).
J. Homola, O. Telezhnikova, J. Dostálek, US Patent # 7,973,933 (2011).
820 830 840 850 860 870 880 890
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
n=1.34n=1.32
Účin
nost v 1
. řá
du
(T
M/T
E)
Vlnová délka [nm]
Povrchovýplasmon
SPRCD
Polychromatickézáření
Detektor
1. difrakční řádVýhody:
Kompaktní a jednoduchý.
Čipy připravitelné postupy
sériové výroby.
J. Homola: Optické biosenzory pro studium biomolekul a jejich interakcí
19
Kompaktní 6-kanálový senzor založený na principu SPRCD.
Licencováno Phenogenomics, Inc. (USA)
O. Telezhnikova, M. Piliarik, M. Vala, I. Tichý, J. Homola, Biosensors & Bioelectronics, 24, 3430 (2009).
J. Homola, M. Piliarik, I. Tichý, M. Vala, P. Adam, J. Hepnar, US Patent # 8,094,316 (2012).
Kompaktní SPR senzor
ROZLIŠENÍ:
< 3×10-7 RIU
ROZSAH:
1.33-1.35 RIU
J. Homola: Optické biosenzory pro studium biomolekul a jejich interakcí
Transport molekul
Disperze vzorku
Adsorpce na stěnách
Odezva biosenzoru s konvenčním a bezdisperzním mikrofluidním systémem.
Mikrofluidní systémy pro SPR biosenzory
0 5 10 15 20 25
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
Pufr
Pufr
Analyt
Od
ezva
se
nzo
ru [
nm
]
Čas [min]
Prototyp průtočné komory pro bezdisperzní mikrofluidní systém.
Výzvy:
Průtočná komora s mísícími strukturami pro zvýšení transportu molekul analytu.
Simulace difuzního toku analytu.
20 J. Homola: Optické biosenzory pro studium biomolekul a jejich interakcí
21
Hlavní požadavky:
Samoorganizující se monomolekulární vrstva alkanthiolů s funkčními skupinami.
Biomolekulární receptory používané v biosenzorech s povrchovými
plasmony zahrnují: protilátky, peptidy, proteiny, DNA, RNA,....
Volba metody pro imobilizaci biomo-
lekulárních receptorů závisí na:
typu receptoru a detekované látky a
detekčních podmínkách.
■ Vysoká hustota receptorů.
■ Vhodná orientace receptorů.
■ Zachování struktury a funkčních vlastností receptorů.
■ Minimální nespecifická interakce vzorku s povrchem.
Funkční molekulární pokrytí: molekulární receptory a jejich imobilizace
J. Homola: Optické biosenzory pro studium biomolekul a jejich interakcí
22
Imobilizace molekulárních receptorů na povrchu senzoru
Metody imobilizace:
Kovalentní vazba
Elektrostatická vazba
Affinitní interakce
• Protein A, Protein G
• Streptavidin – biotin
• Komplementární
oligonukleotidy
Nukleové kyseliny zakončené biotinem a jejich vazba na povrch prostřednictvím interakce
biotin-streptavidin.
J. Homola: Optické biosenzory pro studium biomolekul a jejich interakcí
Hlavní postupy při imobilizaci receptorů
23
Čištění povrchu zlata Vytvoření samoorganizující vrstvy alkanethiolů
Aktivace karboxylových skupin (NHS/EDC)
Navázání proteinů
Upravený povrch (dextran, lyzin)
Adsorbované proteiny
II. Fyzikální adsorpce III. Ukotvení pomocí proteinů A a G
I. Kovalentní uchycení na samoorganizující monovrstvy (SAM)
J. Homola: Optické biosenzory pro studium biomolekul a jejich interakcí
24
I. Konvenční vrstvy minimalizující nespecifickou adsorpci
Poly(ethylene glycol) (PEG) a jeho deriváty
+ jednoduchá příprava
+ různorodost dostupných funkčních skupin
- 2D struktura limituje počet vazebných míst
II. Pokročilé funkční vrstvy
Zwitterionické polymery, hydrogely nebo
polymerní kartáče
+ vyšší odolnost proti nespecifické adsorpci
+ 3D struktury s vysokým počtem vazeb. míst
- složitější příprava
- požadovaná minimální tloušťka (10-15 nm)
Potlačení nespecifické adsorpce pomocí pokročilých
funkčních vrstev
J. Homola: Optické biosenzory pro studium biomolekul a jejich interakcí
Potlačení nespecifické adsorpce pomocí pokročilých
funkčních vrstev
25
0
500
1000
1500
PolyHEMAAT-SAM
Povrc
hové p
okry
tí [
pg
/mm
2]
PolyCBAA
Nespecifická adsorpce ze 100% lidské krevní plazmy na tři různé povrchy funkcionalizované protilátkami (anti-E.coli, anti-Salm).
H. Vaisocherová et al., Biosensors and Bioelectronics, 51, 150–157 (2014).
(polyHEMA)
Hydroxy-funkční poly(2-
hydroxyethyl methacrylate)
(polyCBAA)
Karboxy-funkční zwitterionic
poly(carboxybetaine acrylamide)
J. Homola: Optické biosenzory pro studium biomolekul a jejich interakcí
Prostorově rozlišená funkcionalizace pro SPR
senzory s vysokým počtem kanálů
26
Sensor surface
Sensor surface
flow
SPR snímek odpovídající oblasti 2×1 mm2.
• Matice ~ 100 detekčních kanálů
• Rozměry kanálů: 150 x 150 µm
• Koncentrace DNA: (3-8) x 1012 DNA/cm2
M. Piliarik, J. Ladd, T. Allen, M. Piliarik, J. Homola, S. Jiang, Anal. Chem., 80, 4231 (2008).
Vlastnosti:
J. Homola: Optické biosenzory pro studium biomolekul a jejich interakcí
Oblasti využití biosenzorů s povrchovými plasmony
27
1. Biologický výzkum
Studium molekul a jejich interakcí v reálném čase.
Stanovení interakčních modelů, kinetických rychlostí,
rovnovážných konstant, termodynamických konstant,
mapování vazebných míst, atd.
J. Homola: Optické biosenzory pro studium biomolekul a jejich interakcí
Analýza biomolekul a biomolekulárních interakcí
28
BkBRCkt
BdTa
)(
Kinetická rovnice:
Sensorgram ukazující typický průběh odezvy na molekulární interakci na povrchu senzoru.
0 500 1000 1500-0.05
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
Odezva
sen
zo
ru [n
m]
Čas [s]
ka = 2 x 10
4 M
-1s
-1
kd = 3.5 x 10
-3 s
-1
KD = 175 nM
Prostor rychlostních konstant (ka – kd) pokrytý biosenzory s povrchovými plasmony.
10 fM 100 fM 1 pM 10 pM 100 pM
1 nM
10 nM
100 nM
1 M
10 M
100 M
1 0-6
1 0-5
10-4
10- 3
10-2
10- 1
100
103
104
105
106
107
108
109
1 010
ka
[M-1
s-1
]k
d[s
-1]
J. Homola: Optické biosenzory pro studium biomolekul a jejich interakcí
29
0
1
2
3
4
0
1
2
3
4
0
1
2
3
4
0
1
2
3
4
100 120 140
0
1
2
3
4
100 120 140 100 120 140 100 120 140 100 120 140 100 120 140
1.
2. 3. 4. 5.
7.
8. 9. 10. 11. 12.
6.
13.
Sen
so
r re
sp
on
se [
nm
]
14. 15. 16. 17. 18.
19. 20. 21. 22. 23. 24.
25.
26.
27.
Time [min]
28. 29.
30.
Přirozené
dT15
Čas [min]
Odezva
senzoru
[nm
]
Analýza vlastností modifikovaných oligonukleotidů
J. Homola: Optické biosenzory pro studium biomolekul a jejich interakcí
Oblasti využití biosenzorů s povrchovými plasmony
30
1. Biologický výzkum
2. Bioanalytika
Rychlá a citlivá detekce biologických a chemických
látek :
■ medicinální diagnostika (biomarkery onemocnění a zdraví),
■ monitorovaní životního prostředí (kontaminanty),
■ kontrola kvality a bezpečnosti potravin (patogenní bakterie a toxiny).
Studium molekul a jejich interakcí v reálném čase.
Stanovení interakčních modelů, kinetických rychlostí,
rovnovážných konstant, termodynamických konstant,
mapování vazebných míst, atd.
J. Homola: Optické biosenzory pro studium biomolekul a jejich interakcí
Markery poškození orgánů Micro RNA Anal Chem 10110 (2010)
Genové mutace antisensní ON, jednobodové mutace v genu TP53 Anal Bioanal Chem 2343 (2011) Biopolymers 394 (2006)
Enzymatická aktivita HIV integráza, Ribonukleáza H Biosens Bioel 1605 (2010) Anal Bioanal Chem 1165 (2009)
Bakterie v potravinách (Escherichia coli , Salmonella enterica, Listeria monocytogenes, Campylobacter jejuni Sensors Actuat B 59 (2009) Biosens Bioel 752 (2006)
Malé org. molekuly
NHN
Cl Cl
OHOH
OO
O
Nukleové kyseliny
Proteinové biomarkery
Patogenní bakterie
10 – 1000 pg/mL mléko, med, odpadní vody
0.2 - 2 pM
vzorky tkání
Alzheimerova choroba Amyloid β, protein Tau Sensors Actuat B 69 (2009) Curr Alzheimer Res 10 (2013)
Rakovina CEA, ALCAM, hCG
Anal Bioanal Chem 2869 (2012) Biosen Bioel 1656 (2010) Anal Bioanal Chem 2869 (2012)
Myelodysplastický syndrom VEGFR Anal Bioanal Chem 381 (2012)
Mononukleóza Protilátky proti EB viru Biosen Bioel 1020 (2007)
0.1 – 100 ng/mL mozkomíšní mok, krevní
plasma
10 - cfu/ml mléko, džus, maso,
okurka
31
Bioanalytické aplikace optických biosenzorů s
povrchovými plasmony
J. Homola: Optické biosenzory pro studium biomolekul a jejich interakcí
32
Monitorování životního prostředí: detekce
bisphenolu A
I. Inkubace
II. Detekce
Kompetiční detekční formát.
0 5 10 15 20 25 30
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
5 ng/ml
1 ng/ml
0.1 ng/ml
0 ng/ml
Od
ezva
se
nzo
ru [
nm
]
Čas [min]
Detekce BpA s využitím kompetičního detekčního formátu.
Protilátka
Detekovaná látka
Bisphenol A se užívá při výrobě polykarbonátových plastů.
Bisphenol A narušuje činnost žláz s vnitřní sekrecí.
J. Homola: Optické biosenzory pro studium biomolekul a jejich interakcí
33
0.1 1 10 100 1000
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
LOD = 0.14 ng/ml
Koncentrace BpA [ng/ml]
Norm
aliz
ovaná o
dezva s
enzoru
Kalibrační křivka pro BpA v odpadní vodě. Stanovení BpA v odpadní vodě pomocí SPR biosenzoru, HPLC a ELISA.
K. Hegnerová, M. Piliarik, M. Šteinbachová, Z. Flegelová, H. Černohorská, J. Homola, Analytical & Bioanalytical Chemistry, 398, 1963–1966 (2010).
0.01 0.1 1 10 100 1000 10000 100000
0.01
0.1
1
10
100
1000
10000
100000
LOD = 0.14 ng/ml
LOD = 10 ng/ml
LOD = 16 ng/ml
Urč
en
á k
on
ce
ntr
ace
Bp
A [
ng
/ml]
Koncentrace BpA [ng/ml]0.01 0.1 1 10 100 1000 10000 100000
0.01
0.1
1
10
100
1000
10000
100000
Monitorování životního prostředí: detekce
bisphenolu A v pitné a odpadní vodě
140 pg/ml (odpadní voda)
40 pg/ml (pitná voda)
Detekční limity:
SPR HPLC ELISA
J. Homola: Optické biosenzory pro studium biomolekul a jejich interakcí
Bezpečnost potravin: detekce reziduí veterinárních
léčiv v mléce
34
• Používání veterinárních léčiv může vést k jejich přenosu
do potravního řetězce.
• Rezidua léčiv negativně ovlivňují kvalitu potravinářských
produktů i zdraví spotřebitelů. Channels 1-2
10-3 10-2 10-1 100 101 102 103
0
25
50
75
100
Milk 1/5
PBSCa
[ERFX] / g L-1
%sig
nal
Channels 5-6
10-3 10-2 10-1 100 101 102 103
0
25
50
75
100 PBSCa
Milk 1/5
[CAP] / g L-1
% s
ign
al
Detekční limity v mléce (20%):
Enrofloxacin (ERFX), Sulfapyridine (SPY), Chloramphenicol (CAP) < 300 pg/ml
Kalibrační křivky pro ERFX, SPY a CAP v pufru a ve vzorcích mléka.
Channel 2-3
10-3 10-2 10-1 100 101 102 103
0
25
50
75
100
[SPY] / g L-1
PBSCa
Milk 1/5
% s
ign
al
F. Fernández, K. Hegnerová, M. Piliarik, F. S. Baeza, J. Homola, M.-Pilar Marco, Biosensors & Bioelectronics, 26, 1231–1238 (2010).
J. Homola: Optické biosenzory pro studium biomolekul a jejich interakcí
35
Medicinální diagnostika: detekce mikroRNA
• MikroRNA hrají důležitou roli v řadě biologických procesů.
• Hladiny mikroRNA mohou odrážet závažné choroby
(srdeční choroby a rakoviny).
Druhá fáze detekce mikroRNA – detekce protilátky.
II. Zesílení signálu protilátkou
I. Detekce miRNA-122
J. Homola: Optické biosenzory pro studium biomolekul a jejich interakcí
36
Medicinální diagnostika: detekce miRNA ve vzorcích
tkání
Odezva senzoru na vzorky z tkání. Stanovení koncentrace mikroRNA.
Vzorky tkání: RNA extrahovaná z jaterních tkání myší.
H. Šípová, S. Zhang, A. M. Dudley, D. Galas, K. Wang, J. Homola, Anal. Chem. 82, 10110 (2010).
SPR qPCR
Vzorek s poškozením jater: 1.2 nM 1.46 nM
Kontrolní vzorek: 0.85 nM 1.05 nM
J. Homola: Optické biosenzory pro studium biomolekul a jejich interakcí
37
0 5 10 15
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
Pufr
200 ng/ml
1000 ng/ml
500 ng/ml
50 ng/ml
10 ng/mL
Odezva s
enzoru
[m
RIU
]
Čas [min]
ALCAM
Pufr
10 100 1000
0.00325
0.00550.00775
0.01
0.0325
0.0550.0775
0.1
0.325 ALCAM
hCG
Sensor
response
[m
RIU
]
Koncentrace [ng/mL]
LOD
Odezva senzoru na různé koncentrace biomarkeru ALCAM v pufru.
Detekce biomarkerů ALCAM a hCG: kalibrační křivka.
M. Piliarik, M. Bocková, J. Homola, Biosensors and Bioelectronics, 26, 1656–1661 (2010).
Detekční limity (v pufru)
ALCAM: 7 ng/ml hCG : 13 ng/ml
ALCAM (activated leukocyte cell adhesion molecule) a hCG (human chorionic
gonadotropin) mají vztah k nádorovým onemocněním (např. rakovině prsu).
Medicinální diagnostika: detekce proteinových
biomarkerů
J. Homola: Optické biosenzory pro studium biomolekul a jejich interakcí
Medicinální diagnostika: detekce proteinových
biomarkerů
38
Detekce ALCAM a hCG v krevní plazmě.
0 5 10 15 20
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
Pufr
1000 ng/mL
500 ng/mL
200 ng/mL
Odezva s
enzoru
[m
RIU
]
Time [min]
50 ng/mL
Zm
ěn
a R
I
Pufr
ALCAM
(10% plasma)
Zm
ěn
a R
I
10 100 1000
0.00325
0.00550.00775
0.01
0.0325
0.0550.0775
0.1
ALCAM
hCG
Sensor
respo
nse
[m
RIU
]
Koncentrace [ng/mL]
ALCAM LOD
hCG LOD
Odezva senzoru na různé koncentrace biomarkeru ALCAM v krevní plazmě (10%).
Detekce biomarkerů ALCAM a hCG: kalibrační křivka v krevní plazmě (10%).
M. Piliarik, M. Bocková, J. Homola, Biosensors and Bioelectronics, 26, 1656–1661 (2010).
Detekční limity (v plazmě)
ALCAM: 45 ng/ml hCG: 100 ng/ml
J. Homola: Optické biosenzory pro studium biomolekul a jejich interakcí
Medicinální diagnostika: detekce proteinových
biomarkerů
Detekce karcino-embryonálního antigenu (CEA) v krevní plazmě.
Detekce biomarkeru CEA: kalibrační křivka v krevní plazmě (50%).
T. Špringer, J. Homola, Analytical and Bioanalytical Chemistry, 404, 2869-2875 (2012).
0.1 1 10 100 1000
0.01
0.1
1
10
Od
ezva
se
nzo
ru [
nm
]
Koncentrace [ng/ml]
LOD ~ 100 pg/ml
LOD ~ 8 ng/ml
Au-NP zesílená detece
(50 % plazma)Přímá detekce
(pufr)
Detekční limit: 100 pg/ml
Zesílení odezvy: x 200
Vrstva kovu
Au
Streptavidin
Au
Primární protilátka
Biotinylovaná
protilátka
Abumin
Zlatá
nanočástice
CEA biomarker
39 J. Homola: Optické biosenzory pro studium biomolekul a jejich interakcí
Bezpečnost potravin: detekce bakteriálních
patogenů - E.Coli a Salmonella
40
230 240 250 260 270
0
10
20
30
40
50
60
Time [min]
Buffer
Buffer
Detection
Reference
S-AuNPs
III.~250x
Odezva SPR senzoru na E. coli O157:H7 (7.5x105 cfu/mL).
200 210 220 230
0
1
2
3
Time [min]
Buffer
Buffer
II.
Ab2
~13x
0 10 20 30
0
2
4
6
8
Time [min]
Buffer
Sensor
response [
nm
]
I.
Buffer
Hamburger
with E.coli
• Z hlediska bezpečnosti potravin jsou ze všech
mikroorganismů bakterie tou největší hrozbou.
• V některých potravinách, se bakterie mohou
snadno namnožit z poměrně nízkých a
neškodných hladin do hladin způsobujících
závažná onemocnění.
• Některé bakterie mohou vytvářet toxiny.
Detekční formát:
J. Homola: Optické biosenzory pro studium biomolekul a jejich interakcí
180 190 200 210 220
0
10
20
30
40
50
60
Pufr S-AuNPs
Pufr
Od
ezva
se
nzo
ru [
nm
]
Čas [min]
E. coli koncentrace [cfu/mL]
1.5x101
1.5x102
1.5x103
1.5x104
1.5x105
7.5x105
1.5x106
1.5x107
41
101
102
103
104
105
106
107
108
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Odezva s
enzoru
[nm
]
Koncentrace (cfu/mL)
E.coli v hamburgeru
E.coli v okurce
Salmonella sp. v okurce
Detekce E.coli O157:H7 ve vzorku okurky. Odezva senzoru na funkční zlaté nanočástice.
Kalibrační křivky pro E.coli O157:H7 a Salmonellu ve vzorcích hamburgeru a okurky.
Detekční limity:
Hamburger: E. coli O157:H7: 24 cfu/ml
Salmonella sp.: 7.5x103 cfu/ml
Okurka: E. coli O157:H7: 31 cfu/ml
Salmonella sp.: 1.5x103 cfu/ml
Bezpečnost potravin: detekce bakteriálních
patogenů ve vzorcích potravin
J. Homola: Optické biosenzory pro studium biomolekul a jejich interakcí
Závěr
42
jsou schopné detekovat malé a středně velké molekuly s detekčním limitem 10 pg/ml - 100 ng/ml.
představují vyspělý nástroj pro pozorování a kvantifikaci molekulárních interakcí v reálném čase.
Propojení mikrofluidních a plasmonických struktur pro management/zpracování vzorku přímo na čipu.
Nanobiosenzory pro lokalizovanou analýzu extrémně malých objemů.
mohou detekovat široké spektrum molekul a uplatnit se proto v řadě oblastí (medicinální diagnostika, monitorování životního prostředí, kontrola kvality potravin, atd.).
SOUČASNOST Biosenzory s povrchovými plasmony:
BUDOUCNOST Vyšší výkon, nové vlastnosti a aplikace:
(i) Studium komplexních biomolekulárních procesů a molekulárních
interakcí v nativním prostředí.
(ii) Detekce biomolekul a jejich komplexů v reálných vzorcích.
J. Homola: Optické biosenzory pro studium biomolekul a jejich interakcí
Poděkování: hlavní výzkumní partneři
■ Matematicko-fyzikální fakulta UK
■ Fakulta jaderná a fyzikálně inženýrská ČVUT
■ Ústav makromolekulární chemie AV ČR, v. v. i.
■ Ústav organické chemie a biochemie AV ČR, v. v. i.
■ Ústav hematologie a krevní transfuze
■ Národní ústav duševního zdraví (Psychiatrické centrum Praha)
■ VIDIA, spol. s r.o.
■ University of Washington, Seattle, USA
■ Austrian Institute of Technology, Vídeň, Rakousko
■ Imperial College, Londýn, Velká Británie
■ Ewha Womans University, Soul, Jižní Korea
■ University of Graz, Graz, Rakousko
■ CNR-National Institute of Optics, Neapol, Itálie
■ ESF Research Network PLASMON-BIONANOSENSE
43 J. Homola: Optické biosenzory pro studium biomolekul a jejich interakcí
www.ufe.cz
www.ufe.cz
Děkuji za pozornost.