Факултет „Техника и строителни технологии в транспорта”

Катедра “Механика”

Доц. д-р инж. СВЕТОСЛАВ ГАНЧЕВ НИКОЛОВ

МОДЕЛНО БАЗИРАНИ ПОДХОДИ ЗА ИЗСЛЕДВАНЕ НА

ВРЕМЕЗАКЪСНИТЕЛНИ ДИНАМИЧНИ СИСТЕМИ В

БИОМЕХАНИКАТА

А В Т О Р Е Ф Е Р А Т на дисертация за присъждане на научна степен “ДОКТОР на НАУКИТЕ”

Област на висшето образование: 5. Технически науки,

Професионално направление: 5.11 Биотехнологии,

Специалност: Биомеханика

София, 2013 г.

2

Дисертационният труд съдържа 370 страници, 126 фигури и 4 таблици. Библиографията съдържа 365 заглавия, от които 12 на кирилица и 353 на латиница.

Дисертационният труд е обсъден и насочен за защита от заседание на разширен катедрен съвет на катедра “Механика” при ВТУ “Тодор Каблешков”, Протокол No 236 от 13 Юни 2013 година.

Дисертантът е доцент в катедра „Механика” на ВТУ „Тодор Каблешков” и доцент в направление “Биомеханика” при Института по Механика на БАН.

Изследванията от дисертационния труд са извършени в Института по Механика на БАН, Рощокски Университет- Германия, ВТУ „Тодор Каблешков” и Макс-Планк Института по Молекулярна Генетика- Берлин, Германия, и са финансирани по Европейски проект Computational Systems Biology of Cell Signaling – COSBICS Grant No.512060 на FP6, Grant 0315264 на Германското федерално министерство на образованието и науката (BMBF)- част от проекта CALSYS-FORSYS и Grant DOO02-23/05.03.2009 между DAAD-МОМН.

Официални рецензенти:

Проф. дтн инж.-мат. Стефан Бъчваров

Проф. д-р Гинка Генова

Проф. дтн инж.-мат. Петър Колев

Защитата на дисертационния труд ще се състои на .................2013 година от ............. часа в зала ............ на ВТУ „Тодор Каблешков”- София на открито заседание на научното жури.

Материалите по защитата се намират в канцеларията на катедра „Механика”, ВТУ „Тодор Каблешков”, стая 1225. Автор: доц. д-р инж. Светослав Ганчев Николов Заглавие: Моделно базирани подходи за изследване на времезакъснителни динамични системи в биомеханиката

3

Обща характеристика на дисертационния труд Актуалност на темата. В съвременната медицина и биология на клетъчно ниво се изследват явления, предизвикващи болести като рак, паркинсон, метаболитни заболявания, заболяване на имунната система и др. Изхожда се от разбирането, че от познаването на съответната молекулярна структура, може да се получи информация за механизма пораждащ тези заболявания [11, 12]. При изследване на злокачествените тумори е необходимо преди всичко да се изясни механизмът на клетъчното функциониране. Клетката непрекъснато обменя информация с обкръжаващата я среда, както и с други клетки. Генерирането на сигнали и преносът на информация се осъществява чрез каскади от биохимични реакции между молекулите [30, 31]. Междуклетъчните и вътрешноклетъчните взаимодействия и функциите на клетката са нелинейни динамични процеси. Ето защо за моделиране и изследване на клетъчните функции се използва теорията на динамичните системи (ДС) [30, 31]. Разглеждането на рака в термините на теорията на динамичните системи означава да се създадат математични модели, описващи пренасянето на информация от рецепторите на клетката до нейните гени в ядрото, както и активирането на гените от последователни биохимични реакции, наречени сигнални пътеки (signal pathways). Тези пътеки са свързани в сложни сигнални мрежи (signal networks) и въздействат пряко върху развитието и здравословното състояние на организъма [30, 31]. Прилагайки качествената теория на динамичните системи, можем да открием общите закономерности на моделирания обект, а количественото описание е симулация на изследвания процес.

Предавайки изключително важно значение на борбата с рака Европейската комисия финансира проекта COSBICS по 6-та рамкова програма, Германското федерално министерство на образованието и науката (BMBF) финансира проекта CALSYS-FORSYS, а DAAD-МОМН финансираха Grant DOO02-23/05.03.2009. В проектите участваха следните страни: Германия, Испания, Великобритания и България. Участието от българска страна в проектите имаше за цел да засили теоретичното моделиране и анализ на математичните модели, и да предизвика нови познания в механизмите на клетъчното сигнализиране. В проектите, ракът се разглежда като болест на вътрешноклетъчно равнище и се цели да се установи и приложи нова изчислителна схема в изследването на динамичните взаимодействия на молекулите вътре в клетките. Цели на дисертацията. Основните цели на дисертационния труд са: Цел 1. Да се създадат и тестват моделно базирани подходи (стратегии) за изследване

на динамични системи със закъсняващи аргументи в молекулярната биомеханика.

Цел 2. Да се създаде обобщена теория за стабилност и поява на бифуркация на Андронов-Хопф в система от три автономни обикновени диференциални уравнения с три дискретни времезакъснения.

Цел 3. Изследване на влиянието на закъснението(ята) върху динамичното поведение на модели на базови сигнални пътеки.

Задачи и структура на дисертацията. В съответствие с поставените цели се

решават следните задачи: Задача 1.1. Създаване на интегрирана стратегия за определяне на критични

биохимични процеси в сигналните пътеки от биомолекулярни взаимодействия.

4

Задача 1.2. Създаване на моделно базирана стратегия за изследване ролята на микро-РНК регулирането в ракови сигнални пътеки.

Задача 1.3. Тестване на създадените стратегии върху: 1) модел описващ регулирането на динамиката на раковата сигнална пътека c-Myc/E2F от микро-РНК 17-92 клъстера и 2) мултиразмерен модел комбинаращ сигналната и клетъчно популационната динамика.

Задача 2.1. Моделиране на микро-РНК модел с три закъснения и неговото качествено и числено изследване.

Задача 2.2. Качествен и числен анализ на мултиразмерен модел на еритропоезата. Задача 3.1. Качествен и числен анализ на:

- сигналната пътека JAK2-STAT5, - генно-регулационната система, описваща взаимодействието между ензим и репресор, - модел описващ взаимодействието между протеините ERK и STAT5, - модел на генно-регулационна система с периодично форсиране, - модел на РНК замълчаването (потискането) с едно и две закъснения, - модел на РНК замълчаването с периодично форсиране, - модел на рака на дебелото черво, - модел на микро-РНК с две закъснения, - модел на JAK2-STAT5 сигналното модулиране върху еритропоезата, - мултиразмерен модел на еритропоезата с екзогенно инжектиране на Еро.

Задача 3.2. Сравняване на теоретичните резултати от бифуркационния и числен анализ на изброените времезакъснителни модели с известните от научната литература данни за поведението им, като се разкрие динамичната природа на времезакъснението(ята) в тях.

Във връзка с поставените цели и задачи, дисертационният труд се състои от увод, пет глави и заключение.

В увода са изложени основните обстоятелства налагащи създаването и използването на моделно базирани стратегии (подходи) за изследване на динамичното поведение на времезакъснителни модели, описващи вътрешноклетъчни сигнални пътеки от биомолекулярни взаимодействия посредством прилагане на качествената теория на динамичните системи, биоинформатиката и числените симулации.

Глава първа на дисертацията има обзорен характер. Направен е анализ на постигнатите до момента резултати в областта на моделирането на вътрешноклетъчни сигнални пътеки и мрежи от биомолекулярни взаимодействия, генно-регулационни системи, чрез динамични системи и по конкретно времезакъснителни динамични модели. Основните изводи от направения литературен преглед са: 1) липсват утвърдени подходи за моделиране и качествено изследване на динамичните модели със закъсняващ аргумент(и) на сигналните пътеки; 2) времезакъсненията в сигналните мрежи са големи числа (от порядъка на няколко минути до няколко дни), което прави невъзможно представянето им като малък параметър при математичното изследване на тяхното влияние върху съответните биологични процеси. Липсват точни математични доказателства и изследвания на устойчивостта и появата на бифуркации при високо размерни (n>2) динамични системи с две и повече дискретни времезакъснения; 3) необходимо е да се

5

изследва устойчивостта и динамичното поведение на различни базови сигнални пътеки и взаимодействието между тях.

В глава втора са представени два нови подхода за моделиране и изследване на времезакъснителни динамични системи в молекулярната биомеханика, т.е. интегрирана стратегия за определяне на критични биохимични процеси в сигналните пътеки и моделно базирана стратегия за изследване ролята на микро-РНК регулирането в ракови сигнални пътеки.

В глава трета се изследват качествено и количествено динамични модели с едно времезакъснение, като в подточка 3.7 се прилага новата моделно базирана стратегия за изследване на регулацията на динамиката на раковата сигнална пътека c-Myc/E2F от miRNA17-92 клъстера. Нагледно се виждат основните предимства на използвания моделно базиран подход.

В глава четвърта се изследват: 1) модел на система с обратна връзка; 2) модел на замълчаването на РНК; 3) модел на рака на дебелото черво и 4) модел на микро-РНК. Всички те са с две дискретни закъснения. Правят се редица доказателства за тяхната устойчивост и поява на бифуркация на Андронов-Хопф.

В глава пета от дисертацията се изследват динамични системи с три дискретни закъсняващи аргумента. Първоначално се разглежда обобщена система от три автономни обикновени диференциални уравнения с три дискретни закъснения. Получен е критерии, при изпълнението на който не настъпва промяна в устойчивостта. Дестабилизирането на обобщената система става чрез бифуркация на Андронов-Хопф. Получените теоретични резултати се прилагат върху конкретна система описваща регулационните функции на микро-РНК. В подточка 5.3 се моделира, калибрира и анализира числено един нов мултиразмерен модел от обикновени диференциални уравнения с постоянно времезакъснение. В следващите две части от тази глава на дисертацията, освен физиологичните процеси включени в този модел, се изследва в детайли и ефектът на конкуренцията между сигналните пътеки включени в еритропоезата. В последната подточка 5.5 се изследва мултиразмерен модел комбиниращ сигналната и клетъчната популационна динамика. На практика се показва как може да се приложи новата интегрирана стратегия за определяне на критични биохимични процеси в сигналните пътеки. Едновременно с това се разкриват и нейните основни предимства.

В заключението са дадени основните резултати постигнати от направените в дисертационния труд изследвания. Характеристика на научната методика. Идеята за анализиране на времезакъснителни динамични модели, описващи пътеки от биомолекулярни взаимодействия и генно-регулационни системи, възникна непосредствено от констатацията, че тези модели описват много точно вътрешноклетъчните процеси и предсказват отговора на клетката. До сега в научната литература липсват утвърдени моделно базирани подходи за тяхното изследване. Отсъства физичен анализ и не е изследвано влиянието на времезакъснението върху поведението на тези модели. Ето защо досега не е получена задълбочена представа за принципите на действие и динамичното поведение на тези пътеки от биомолекулярни взаимодействия и свързания с тях отговор на клетката. За извършването на качествен и количествен анализ на времезакъснителните модели в дисертационния труд са възприети физичните закони за запазване на масата, законите на биохимичната кинетика на Михаелис-Ментен и специфични емпирични зависимости.

6

Приложена е качествената теория на динамичните системи със закъсняващи аргументи, биоинформатични подходи, както и числени симулации за изследване на динамичното поведение на времезакъснителните модели. С помощта на бифуркационния и числен анализ е разкрито влиянието на времезакъсненията върху поведението на изследваните модели.

Характеристика на приносите. Една част от изводите в дисертацията са получени благодарение на новосъздадените два подхода за изследване на времезакъснителни модели, а другата част са в резултат на извършения качествен и числен анализ на: модел на сигналната пътека JAK2-STAT5; модел на генно-регулационна система, описваща взаимодействието между ензим и репресор; модел описващ взаимодействието между протеините ERK и STAT5; модел на генно-регулационна система с периодично форсиране; модел на РНК замълчаването (потискането) с едно и две закъснения; модел на РНК замълчаването с периодично форсиране; модел на рака на дебелото черво; модел на микро-РНК с две и три закъснения; модел на JAK2-STAT5 сигналното модулиране върху еритропоезата; мултиразмерен модел на еритропоезата с екзогенно инжектиране на Еро. Произтичащите от направените изследвания следствия са: 1) задълбоченото разбиране на сложните биологични системи, изисква интегрирането на експериментални, биоинформатични и теоретични изследвания. Прилагането на качествената теория на динамичните системи позволява да се създават и анализират математични модели описващи вътрешноклетъчни сигнални процеси от биомолекулярни взаимодействия; 2) закъсняващите аргументи в изследваните модели имат ключова роля върху нормалното им функциониране; 3) появата на нерегулярно (хаотично) поведение в изследваните биологични системи може да се свърже с необратими тежки патологии.

Практическо значение. Получените в дисертацията резултати имат фундаментален характер с приложна насоченост поради обстоятелството, че този дисертационен труд е пряко свързан с целите и задачите на Европейския проект COSBICS, финансирания от Германското федерално министерство на образованието и науката (BMBF)- част от проекта CALSYS-FORSYS и проекта между DAAD-МОМН (DOO02-23/05.03.2009). Изградените нови подходи изискват тясно сътрудничество между биоинформатиката, молекулярните биолози, клиници и био-медицинските работници и математици, интегриращи цялата информация в надеждни модели. Подобни интегративни подходи може да са парадигма към нова, междудисциплинна наука, необходима за изследване на сложните феномени на рака.

Апробация на дисертацията. Основните резултати на дисертацията са докладвани на следните научни форуми: 1. 10th Jubilee National Congress on Theoretical and Applied Mechanics, 13-16 September

2005, Varna, Bulgaria. 2. Отчетно–научна сесия на ИМех–БАН, Януари, 2006. 3. CESISB 2006, 14-15 September 2006, Rostock – Warnemunde, Germany. 4. 19th International Symposium Bioprocess Systems, 24-25 October 2006, Sofia, Bulgaria.

7

5. Общ (БАН-СУ) междудисциплинарен научен семинар по нелинейна динамика, хаос и фрактали, 27.10.2006, София.

6. Отчетно–научна сесия на ИМех–БАН, Януари, 2007. 7. FOSBE – 2007, September 9-12, 2007, Stuttgart, Germany. 8. 20th Anniversary International Symposium Bioprocess Systems 2007, November 6-7,

2007, Sofia, Bulgaria. 9. COSBICS 2007, November 21-22, 2007, Rostock, Germany. 10. 6th Conference on Computational Methods in Systems Biology (CMSB), October 2008,

Rostock-Warnemunde, Germany. 11. The 2nd International Conference on Bioinformatics and Systems Biology (BSB 2009),

Leipzig, Germany, 23-25 March 2009. 12. The 2009 International Workshop on „Computational and Integrative Biology” (CIB

2009), Zhejinag University, Hangzhou, China, 18-20 September 2009. 13. Национална конференция „Дни на биомеханиката”, 3-5 Ноември 2011, София. 14. Отчетна научна сесия на BG-SIAM, 21-22 December 2011, Sofia 15. Отчетно–научна сесия на ИМех–БАН, Януари, 2012. 16. International Scientific Conference on Mechanics-MECH2012, 19-22 November 2012,

Sofia. 17. Разширен научен семинар на катедра “Механика” при ВТУ „Тодор Каблешков”,

13 Юни 2013 г.

Съдържание на дисертацията

Увод В този параграф от дисертационния труд се дава най-обща представа за

съвременните постижения на молекулярната биомеханика (системната биология), клетъчното сигнализиране и приложението на времезакъснителните модели при изследване на вътрешноклетъчни сигнални процеси предизвикващи ракови заболявания [37]. Моделите със закъсняващи аргументи много често се използват при изследване на динамичното поведение на сигнални пътеки, генно-регулационни системи и свързаните с тях обратни връзки [27, 32]. Ролята на времезакъснението е най-силно изразена в процесите на транскрипция и транслация. Глава първа. Динамични задачи в молекулярната биомеханика- основни принципи и общи сведения

В тази глава е направен литературен преглед на използваните досега динамични системи в молекулярната биомеханика, и в частност времезакъснителните модели [13, 30, 31]. От направения анализ следва, че: 1) липсват утвърдени подходи за моделиране и качествено изследване на динамичните модели със закъсняващ аргумент на сигналните пътеки; 2) времезакъсненията в сигналните мрежи са големи числа (от порядъка на няколко минути до няколко дни), което прави много трудно (а в определени случаи и невъзможно) математичното изследване на тяхното влияние върху съответните биологични процеси. Липсват точни математични доказателства и изследвания на устойчивостта и появата на бифуркации при високо размерни (n>2) динамични системи с две и повече дискретни времезакъснения; 3) времезакъснителните динамични системи [30, 31], описват много точно вътрешноклетъчните сигнални пътеки и мрежи, генно-регулационните системи,

8

взаимодействия между сигналните пътеки и други физиологични процеси; 4) влиянието на микро-РНК върху клетъчните процеси е съществено. Глава втора. Подходи за моделиране и изследване на времезакъснителни динамични системи в молекулярната биомеханика 2.1. Интегрирана стратегия за определяне на критични биохимични процеси в сигналните пътеки 2.1.1. Основни положения. В последните години, различни изследователи предлагат математичното моделиране да бъде използвано за определяне на разликата между нормалната и патологичната конфигурация на биологичните пътеки. По този начин системно-биологичният подход може да определи ключовите съставки регулиращи основните елементи на сигналните пътеки (и други биохимични системи), свързани с превръщането им в ракови [20] или развитието на метаболитни и дегенеративни заболявания. Основната стратегия е да се използват не само някои от утвърдените методи, но и да се създаде работна мрежа между тях, която да координира начините на обмяна на информация (данни, резултати) между отделните стъпки. 2.1.2. Материали и методи. Представя се нова интегрирана стратегия (подход) между чувствителния (на англ. sensitivity) анализ и бифуркационния анализ за определяне на критичните стъпки в сигналните пътеки. Критичен процес (напр. такъв процес е модулацията) е този, при който чрез промяна на стойностите на параметрите му се предизвиква съществено влияние (изменение) върху реалните биологични отговори (изходи) на пътеката. Новата стратегия е съставена от следните стъпки (виж Фиг. 2.1*):

1. Математично моделиране (на англ. Mathematical modelling): на базата на количествените данни получени от експеримента се съставя едно множество от ОДУ описващо динамиката на разглежданата пътека. Съставя се списък на реалните биологични отговори на модела и се дефинира тяхната математична формулировка.

2. Чувствителен анализ (на англ. Sensitivity analysis): пресмята се чувствителността на поведението на системата към промяната на моделните параметри. Последните се класират (нареждат) според тяхната чувствителност към определените биологични поведения (сценарии).

3. Бифуркационен анализ (на англ. Bifurcation analysis): Параметрите, които са напред в класирането (направено от чувствителния анализ) и имат висока чувствителност предизвикваща качествени промени в поведението на изучаваната система се изследват, за да се определи тяхната точна критична (бифуркационна) стойност. Определят се областите на устойчивост във фазовото пространство на системата.

4. Предсказващи симулации (на англ. Predictive simulations): информацията получена (генерирана) в предходните три стъпки се използва за селектирането на тези параметри в модела, чиито модулации (изменения) провокират чувствителни промени в изходните сигнали на клетъчните пътеки. Качественото поведение на системата се изследва с помощта на предсказващия систематичен анализ.

Информацията получена чрез предложената нова методология трябва да се използва по-нататък за доуточняване на математичния модел.

*Номерацията на фигурите и уравненията, е както в дисертационния труд.

9

Фигура 2.1. Схема на интегрирана стратегия за определяне на критични биохимични процеси

в сигнални пътеки.

2.2. Моделно базирана стратегия за изследване ролята на микро-РНК регулирането в ракови сигнални пътеки

2.2.1. Микро-РНК регулиране в клетъчното сигнализиране. Микро-РНК-те (на англ. miRNA) са малки регулаторни РНКи с дължина от 18 до 25 нуклеотида (за човек са с размерност ≈22nt), чиято функция е да регулират активността и устойчивостта на специфичните мРНК обекти [3]. До днес се знае много малко за регулационните процеси на микро-РНК. Смята се, че микро-РНКите имат участие при някои видове рак. В зависимост от регулирания протеин микро-РНК може да играе роля на тумор-супресор, когато потиска експресията на онкоген [15].

Счита се, че математичното моделиране може да се окаже удобен инструмент при изследването на разликите между здрави и патогенни конфигурации на сигналните пътища в клетката. Така, системно-биологичният подход би довел до идентифицирането на ключови регулаторни елементи в свързаните с рака сигнални пътеки [19].

В изложението по-нататък се представя една нова методология за изследване на микро-РНК регулирането в сигнални системи. 2.2.2. Материали и методи. Изложената нова методология се състои в изследване на сигнални пътеки с многостепенни регулаторни структури (т.е. положителни и отрицателни обратни връзки). Използват се съществуващата информация и хипотези (извлечени по биоинформатичен път или ръчно), като за съответната система се превеждат в диференциални уравнения. Използват се биологични данни (взети от литературата или специфично генерирани), с цел да се опише и настрои математичният модел. Накрая системата се изследва чрез числови симулации или качествени аналитични методи. Основната цел на стратегията е: 1) да подпомогне експерименталната работа на биолози, биохимици и медици; 2) да се създаде формален модел за изследване на нелинейните свойства на взаимно влияещите си обратни връзки, включващи гени, микро-РНКи и протеини. Основните стъпки на новия подход са показани на Фигура 2.4 и те са:

10

• Съставяне на мрежа от протеин-протеинови взаимодействия. Съставя се списък от подходящи протеини и основни взаимодействия. За целта се използва био-медицинска литература, биологични бази-данни описващи протеин-протеиновите взаимодействия. • Идентифициране на miRNA информация от бази данни. Използва се за откриване на важни микро-РНКи, регулиращи транскрибтите на протеините от мрежата в изследвания биологичен контекст. Всички предсказвания и някои експериментално потвърдени микро-РНКи могат да се открият в базите от данни като: miRbase (http://www.mirbase.org/) и ARGONAUTE2 (http://www.ma.uni-heidelberg.de/apps/zmf/argonaute/).

Фигура 2.4. Скица на моделиращия подход- биоинформатични методи се използват за събиране на количествени данни за взаимодействия между протеини и РНКи и след това те се интегрират с използването на инструменти от системната биология.

• Регулиране на микро-РНК. В момента се знае твърде малко за механизмите на регулиране на микро-РНК. С цел да се индентифицират прицелните гени на микро-РНК са предложени различни алгоритми, например: RNAhybrid, TargetScan, DIANA-micro и miRanda. • Математично моделиране. На базата на взаимовръзките конструирани в предишните стъпки и евентуална допълнителна информация се създава структурата на модела. Не съществува уникален (универсален) подход за моделиране, така че изборът зависи от естеството на изследваната мрежа, експерименталните данни и въпроси засягащи динамиката, която ще се изследва. Утвърденият подход за математично моделиране на вътрешноклетъчните процеси се основава на ОДУ. Съществуват няколко възможности за определяне на конкретната структура на уравненията, включително масовата кинетика [4], експоненциалните (на англ. Power-

11

low) модели и различни начини за моделиране на формализми вземащи пред вид кооперативността, насищането и сигмоидалността. • Извличане, генериране на динамични данни и калибриране на модела. Извличат се количествени данни и друга информация засягаща динамиката на реагентите в мрежата, като допълнително се дефинират и провеждат количествени експерименти. Всички тези данни (заедно с компютърните техники за изпробването им) се използват за калибриране и доуточняване на математичния модел. • Моделен анализ и предсказване. След като веднъж се калибрира, моделът може да се използва за предсказване. Моделната редукция, изчислителните симулации и аналитичните методи, като качествен (бифуркационен) анализ, могат да се използват за изследване на ролята на miRNA в регулацията на дадената сигнална пътека [33]. 2.3. Изводи Новите подходи изискват тясно сътрудничество между биоинформатиката, клетъчните биолози, клиници и био-медицинските работници и математици, интегриращи цялата информация в надеждни модели.

Глава трета. Модели с едно закъснение 3.1 Изследване на динамичното поведение на времезакъснителен модел на

сигналната пътека JAK2-STAT5 3.1.1. Физиология на раковото заболяване. Онкологичните заболявания представляват основен медицински проблем. Борбата с рака е изключително трудна, защото злокачествените туморни клетки притежават множество различни свойства, основните от които са: неконтролируема или слабо контролируема пролиферативна способност; способност да се разполагат между клетките на една нормална тъкан и да я увреждат (инвазност); способност да създават вторични тумори (метастази) в различни органи.

В злокачествените ракови новообразувания, клетките показват голямо различие в цитологичните, морфологичните и биохимичните си свойства, както и ниска степен на диференцираност [36]. В следващата подточка 3.1.2 от дисертацията се формулират основните принципи на моделирането в естествознанието. Използва се казаното по въпроса от Андронов и съавтори в класическата им монография [6]. В подточка 3.1.3 се дава подробна информация за математичните модели на протеин кинази в сигналната трансдукция. 3.1.4. Биомолекулярна пътека от взаимодействия JAK-STAT. Описание и основни положения. Сигналната пътека Janus kinase-Signal transducers and activators of transcription (JAK2-STAT5) е една от основните каскади от биомолекулярни взаимодействия [11, 12] служещи за пренос на множество сигнали влияещи върху основни клетъчни процеси. В публикациите [30, 31] е предложен времезакъснителен модел, описващ сигналната пътека JAK2-STAT5. Този модел е съставен след обработка на експериментални резултати съгласно закона за действие на масите и ензимната кинетика фиг.3.4. Валидността на модела се потвърждава от експерименталните резултати. Този модел има следния вид:

12

(3.20)

( )

( )( ),

,5.0

,2

,2

34334

.

2223

'333

.

2223

'3112

.

34111

.

τ

τ

−−=

++−=

−+=

−+−=

txkxkx

xkxkkx

xkxkcxkx

txkcxkx

където с е количеството на активирания рецептор ЕpoRА, x1 - нефосфорилиран мономерен SТАТ5, x2 - фосфорилиран димерен SТАТ5, х3 - фосфорилиран димерен SТАТ5 в цитоплазмата, x4 - фосфорилиран димерен SТАТ5 в ядрото,

4'3321 ,,,, kkkkk са скоростни константи с дименсия [min-1].

Фигура 3.4. Схема на биомолекулярната пътека от взаимодействия JAK2-STAT5 активирана от

хормона еритропоетин (Еро).

За да се изследва динамичното поведение на времезакъснителния модел, той се апроксимира с еквивалентна система ОДУ, използвайки подхода Liner chain trick [21]. Така в този случай времезакъснителната функция се заменя с два апериодични линейни възела и се получава системата (3.24)-(3-29), т.е.

(3.24) ,2 24111

.

zkcxkx +−=

(3.25) ,2 2223

'3112

.

xkxkcxkx −+=

(3.26) ( ) ,5.0 2223

'333

.

xkxkkx ++−=

(3.27) 24334

.

zkxkx −= ,

(3.28) ( )131

. 1 zxz −=τ

,

(3.29) ( )212

. 2 zzz −=τ

.

13

Проверяваме с каква степен на точност апроксимиращата система от ОДУ (3.24)-(3-29) описва оригиналния времезакъснителен модел (3.20), като решаваме числено двете системи.

3.1.6. Качествен анализ на времезакъснителния модел на сигналната пътека JAK2-STAT5. Решенията на оригиналния времезакъснителен модел (3.20) и на апроксимиращата система от обикновени диференциални уравнения (ОДУ) (3.24)-(3-29) са показани на фиг.3.7. От тази фигура се вижда, че числените решения на двете системи (3.20) и (3.24)-(3-29) са много близки в интервала [0, 60] минути. Този факт ни позволява да направим заключението, че апроксимацията (приближението) на времезакъснителния модел (3.20) със системата ОДУ (3.24)-(3-29) е достатъчно точна. Следователно съгласно теорията [13] двете системи имат еднакво качествено поведение и всички изводи направени за еквивалентната система ОДУ (3.20) ще бъдат валидни и за системата диференциални уравнения с времезакъснение (3.24)-(3-29).

От биологична гледна точка, за да протече нормално сигналния процес чрез пътеката JAK2-STAT5 (STAT5 да активират гените) трябва да е изпълнено неравенството 43 kk > т.е. когато системата има една равновесна точка в нулата

(3.42) .02

_

1

_

3

_

2

_

1

_

===== ZZXXX

Фигура 3.7. Решения на времезакъснителния модел (3.20) (тънките линии) и на

апроксимиращата система (3.24)-(3.29) (дебелите линии).

Изследваме устойчивостта на това равновесно състояние, чрез функцията на Ляпунов (3.48) 2

22

123

22

212 ZZXXXV ++++= .

Изследването за устойчивост в случая, когато 43 kk = се извършва по аналогичен начин. Устойчивостта на пътеката JAK2-STAT5 зависи от знака на производната на (3.48). Пресмятаме производната и тя има вида:

14

Време t min

(3.50) ( )[ ( )( ) ( ) ( )].2

2

21019219381227363

2253413222111

.

2

ZaZaZZaXaZXaXaXXaXaXaXZaXaXV

−+−++−+

+−+++−=

3.1.7. Числени симулации. Решението на производната (3.50) е показано на фиг. 3.8. От фигурата се вижда, че производната променя знака си в интервала от 0 до 60 мин., като в този интервал протича процесът на функциониране на пътеката JAK2-STAT5. Фигура 3.8. Производна на функцията на Ляпунов

.

2V (3.50) в интервала ]60,0[∈t .

Фигура 3.10б. Изменение на производната на функцията на Ляпунов спрямо времето в ]14,0[∈t , 3.10в. Изменение на производната спрямо времето в ]60 ,14[∈t .

На фиг.3.10б и 3.10в е показано по-нагледно как се изменя производната на функцията на Ляпунов ( 2V& ). Вижда се, че в началото и края на интервала на предаване на сигнала, пътеката е устойчива, защото производната е отрицателна. 3.1.8. Изводи 1. В пътеката от биомолекулярни взаимодействия JAK2-STAT5 основно влияние

оказват параметрите к3 и к4. Времезакъснението не оказва влияние върху устойчивостта и.2. Когато е изпълнено условието к3>к4:

2.1. Сигналната пътека JAK2-STAT5 е в устойчив режим в интервалите:

2V&

.

2V

Време t [min]

.

2V

Време t [min]

15

∈t [0, 20.5] и ]60 ,50[∈t . 2.2. Сигналната пътека JAK2-STAT5 е в неустойчив режим в интервала:

]50 ,5.20[∈t . 3. Пътеката JAK2-STAT5 ще предизвика нормален клетъчен отговор защото в

началния и крайния етап от функционирането си, тя е в устойчив режим. 3.2. Времезакъснителен модел на генно-регулационна система 3.2.1. Общи сведения за генно-регулационните системи. Времезакъснителен модел. Взаимодействието между ензим и репресор, при синтеза на протеини е пример за генно–регулационна система предложена от Джакоб и Моно в прокариотните (безядрените) клетки- фиг.3.11б. В модела се показва как продукцията на мРНК- у1 e обратна връзка която се регулира от репресора – у3.

Фигура 3.11б. Лактозен оперон в случай на индукция, при наличие на лактоза.

С въвеждането на времезакъснителна функция към базовия модел на Джакоб и

Моно се отразява извършването на процеса на генна експресия (транскрипция и транслация) в еукариотните клетки на висшите организми. Освен това се изследва влиянието на степента на репресия. Модифицираният модел добива вида:

(3.51) ( )

,

,

,

38273

26152

14332

11

1

ykykdtdy

yktykdtdy

ykykk

kdtdy

p

−=

−−=

−+

=

τ

където 1y е концентрацията на мРНК, 2y е концентрацията на ензима b-галактосидаза, 3y е концентрация на репресора, дименсиите на променливите са микромолове [ Mμ ], ( )8.,..,2,1=iki [min-1] са скоростни константи, а p1 е мярка за кооперативността (свързването) на крайния продукт на репресия.

Времезакъснителната функция ( )τ−ty1 изразява допускането, че скоростта на синтезиране на ензима е пропорционална на концентрацията на мРНК в ядрото в

16

предходен момент ( )τ−t . Времезакъснението τ е времето необходимо да се придвижи мРНК от ядрото до рибозомите в клетката. В нашите изследвания анализираме случаите на ниска 0.11 =p и висока 0.21 =p степен на репресия в системата, когато крайният продукт на репресия се получава във вид на функция на Михаелис – Ментен.

За да изследваме качественото поведение на модела, времезакъснителната функция се апроксимира с трансцендентна, след което се извършва локален и глобален анализ чрез използване на бифуркационната теорема на Хопф.

Намирането на равновесното състояние на системата (3.51) става при 0=τ . След това се линеаризира в околността на това състояние и се получава характеристичното уравнение (3.56) τχχχχ −−=+++ lArqp 1

23 , където

(3.57) . ,, ,2

75318641868464864 δ

kkkkAkkkrkkkkkkqkkkp ==++=++=

Видът на равновесното състояние, а от там и устойчивостта на модела, зависи от знаците на реалните части на корените на характеристичното уравнение. Тъй като уравнението (3.56) е трансцендентно, то може да има неопределен брой корени. В такъв случай имаме две възможности за неговото изследване [10, 18]: 1) числен анализ; 2) качествен анализ, при малки стойности на времезакъснението ( min1≈τ ) се извършва линейно устойчив анализ, а при големи стойности на времезакъснението се прави глобален бифуркационен анализ, като се използва теоремата на Хопф. 3.2.3.1.2. Локално устойчив анализ при малко времезакъснение. Изследваме качественото поведение на модела, приемайки времезакъснението за бифуркационен параметър. Експоненциалната (трансцендентната) функция в (3.56) се развива в ред на Тейлър и по този начин характеристичното уравнение добива следния вид: (3.58) ( ) 023 =+−++ rAqp χτχχ , където Arr += 1 . За да изследваме качественото поведение на линеаризираната система използваме бифуркационната теорема на Хопф. Съгласно тази теорема и условията на Раус–Хурвиц за устойчивост, бифуркация на Андронов-Хопф се появява при стойност bττ = , ако са удовлетворени условията [6, 22] (3.59) ( ) .0,0,0,0 =−−=>>−> rAqpRrAqp bb ττ

Съставяме неявната функция ( )τχ ,h за малки времезакъснения, т.е. (3.60) ( ) ( ) rAqph +−++= χτχχτχ 23, .

Съгласно теоремата на Хопф [22] пресмятаме производната на (3.60) спрямо времезакъснението, т.е.:

(3.64) ( ) 02Re22

22 >

+=⎟

⎠⎞

⎜⎝⎛

ILApk

dd b

ττχ .

Полученото неравенство (3.64) е достатъчно условие, че тангентата на реалната част на собствената стойност ( )τχ2 при bττ = има положителен наклон. В този случай в

17

системата ще се появи устойчив граничен цикъл, при преминаване на параметъра времезакъснение през бифуркационата си стойност bττ = .

3.2.3.1.3. Глобален анализ при големи стойности на времезакъснението. За по-големи стойности на времезакъснението τ , линейно устойчивият анализ е невалиден и се налага да се използва друг подход за изследване на качественото поведение на линеаризираната система. Ето защо извършваме глобален бифуркационен анализ. Приемаме, че характеристичната стойност χ е комплексно число, т.е. inm +=χ , където m и n са реални числа. Заместваме χ в (3.56) и след разделяне на реалната от имагинерната част получаваме:

(3.66) .0sin23

,0cos332

12223

=+++−

=+++−+−−

−

ττ

τ

τ

nAqnpmnnnmnArqmpnpmmnm

m

m

l

l

Дефинираме неявната функция (3.73) ( ) τχχχχτχ −++++= lArqpH 1

23, . За да определим качественото поведение на системата в околност на равновесното състояние, при изменение на параметъра времезакъснение, пресмятаме производната на собствените стойности при bττ = , т.е.

(3.75) ( ) 0Re2

121

2'2

>+

=⎟⎠⎞

⎜⎝⎛= == IL

ngndd

ddm bb

bb ττττ τχ

τ,

където bbbb nAqnL ττ cos3 21 −+−= , а bbbb nApnI ττ sin21 += .

Следователно съгласно теоремата на Хопф, когато производната (3.75) на реалната част на комплексно спрегнатите корени на характеристичното уравнение (3.56) спрямо параметъра времезакъсниние τ е различна от нула, при bττ = се гарантира, че се появява бифуркация на Андронов-Хопф [6, 10, 18]. От направения до тук качествен анализ, следва че в системата може да се появи граничен цикъл с малка амплитуда около равновесното положение. От този анализ е невъзможно да се определи, дали тези трептения са устойчиви или неустойчиви. Ето защо е необходимо да изчислим така наречената Първа ляпунова величина ( 1L ) на границата на равновесната област R=0 на системата (3.51) [6, 7].

3.2.3.1.5. Бифуркационен анализ с използване на първата ляпунова величина. Изчисляваме първата ляпунова величина, като отново приемаме времезакъснението за бифуркационен параметър. Извършваме линейно приближение на времезакъснителния модел (3.51) при 2;11 =p , след което развиваме времезакъснителната функция ( )τ−ty1 в ред на Тейлор и получаваме:

18

(3.77)

.

,2

,

38273

26

..

1

2

1152

14332

11

1

ykykdtdy

ykyyykdtdy

ykykk

kdtdy

p

−=

−⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛+−=

−+

=

⋅ ττ

Запазваме само първия, втория и третия член (т.е. до квадратно уравнение спрямо τ ). Известно е, че заместването на ( )τ−ty1 с членове по-високи от трета степен в реда на Тейлър не е по-точно от прилагането на приближения от по-нисък ред [13].

Определянето на 1L за тримерна автономна динамична система е показано в [23]. По този начин за системата (3.77) 1L има вида:

(3.91) ( ) ( ) 043

1331222

0

22

01 <+Δ

= cSSSSL πλ ,

където 0λ е определена при 6321 ,,, SSSS и 13c , когато е изпълнено условието 0=R .

( ) qSSS 31220 +=Δ е определена в съответствие с [23].

От (3.91) се вижда, че когато 1,0 1 == pτ , то 1L е винаги отрицателна, и тогава системата (3.77) ще загуби меко устойчивостта си, т.е. обратимо. Когато се повишава количеството на репресора, във фазовото пространство на системата ще се появи устойчив граничен цикъл и системата става автотрептяща.

Ако 0≠τ и 11 =p , то за първата ляпунова величина на границата 0=R се получава:

(3.100) ( ) ( ) ( )[ ]⎭⎬⎫

⎩⎨⎧

−+++Δ

Δ= 212

231

32

020

43231

01 834

BBBqpBpBqq

Lα

απαλ ,

където ( ) ( )713323322363126'322

'311 3 , ,2 ccBccBccB αααααα −=−=−= . От (3.99) се вижда,

че в този случай 1L може да бъде положителна или отрицателна, т.е системата може да загуби устойчивостта си необратимо - “твърдо” или обратимо – “меко“. Така, времезакъснението се явява ключов фактор в бифуркационното поведение на системата (3.77). 3.2.4. Числен анализ. Изхождайки от получените аналитични резултати, извършваме числен анализ на модела (3.51). Стойностите на параметрите използвани за числения анализ са взети от експерименталните източници [30, 31] и са:

(3.110) ].5.6,5.2[

],[min65.0],[min2.0],[min62.0],[min4.0],[min3.0],[min1.1],[min05.0],[min250

18

17

16

15

14

13

12

11

∈====

====−−−−

−−−−

τkkkkkkkk

На фиг.3.14. е показано численото решение на оригиналния времезакъснителен модел (3.51)

19

Фигура 3.14а. Устойчиво решение на системата при 5.2=τ ; Фигура 3.14б. Неустойчиво решение на системата при 5.6=τ . y1 - концентрация на мРНК, y2 -концентрация на ензима галактосидаза, y3 - концентрация на репресора. Вижда се, че при bττ < системата има устойчиво решение- фиг.3.14а. При нарастване на τ и преминаване на през bτ възниква периодично решение- фиг.3.14б. На фиг. 3.16 са показани периодичните решения на системата (3.51) в случай на висока кооперативност на репресия.

Фигура 3.16. Периодични решения на системата (3.51), при p1=2 и 5.6=τ . а) y1 - концентрация на мРНК., б) y3 - концентрация на репресора.

3.2.5. Изводи 1. Времезакъснението оказва дестабилизираща роля върху модела. При неговото нарастване и преминаване през определена бифуркационна стойност, в системата възниква бифуркация на Андронов – Хопф, вследствие на което времезакъснителната система става автотрептяща. 2. Съгласно изчислената първа Ляпунова величина, моделът може да загуби устойчивостта си меко (обратимо) или грубо (необратимо). В генно–регулационните системи необратимата загуба на устойчивост се свързва с появата на патологични изменения на клетките, причиняваки ракови заболявания.

3.3. Комплексно поведение на времезакъснителен модел на генно-регулационна система с периодично форсиране. В тази подточка продължаваме изследването на

(а) (б)

(а) (б)

20

времезакъснителния модел (3.51), като отчитаме факта, че пропускливостта на клетъчната мембрана може да има периодичен характер [1]. Така системата (3.51) придобива вида:

(3.111) ( ),

,

,

338273

226152

1332

1141

aykyky

ayktyky

aykk

kykyp

+−=

+−−=

++

+−=

⋅

⋅

⋅

τ

където количествата 31 aa ÷ представляват външни периодични смущения, описващи променливата пропускливост на клетъчната мембрана. От математична гледна точка това е пример за периодично форсиране [2]. За периодичните смущения 31 aa ÷ приемаме, че имат вида: (3.112) tAa iii ωsin= ( ).3,2,1=i Известно е, че нелинейните динамични системи са чувствителни на структурни промени, които променят глобалното поведение на дадената система. Най-общо казано, предварително не може да бъде предсказано как ще се промени глобалният отговор на системата (3.111) в резултат на влиянието на допълнителните периодични смущения ia . За да изучим този ефект, ще изследваме динамичното и бифуркационно поведение на системата (3.110). Така, на разглеждане подлежат следните седем случая: 1) 0,0 321 ==≠ AAA ; 2) 0,0 231 ≠== AAA ; 3)

0,0 321 ≠== AAA ; 4) 0,0,0 321 =≠≠ AAA ; 5) 0,0,0 321 ≠=≠ AAA ; 6) 0,0,0 321 ≠≠= AAA ; 7) 0,0,0 321 ≠≠≠ AAA . При разглеждането на тези седем

случая се показва, че съществува преход от регулярно към хаотично поведение в 3D пространството. За целта, в хаотичните зони на поведение на системата (3.111) се пресмята максималната експонента на Ляпунов (на англ. the maximal Lyapunov exponent). Първоначално се доказва, че в общия случай системи от вида (3.110) при размерност ∞→n притежават периодични решения, т.е. (3.113) ( ) ( )( ) ( )( )( ) ( ),...,,, 1 tstxtxtftx k

n =+ ττ където с n е отбелязан редът на производната относно времето t, т.e. ∞= ...,,2,1n . Приемаме, че [ )( )nn RtCs ,,0 ∞∈ и нека ( ) [ )( )nn RtCtS ,,0 ∞∈ , така че ( ) ( )tstS n = за

0tt ≥ . За уравнение (3.113) може да бъде доказана следната теорема, даваща критерии за неговото осцилиращо поведение: Теорема 3.5. Нека i) kIisf ki ...,,2,1,,, =∈τ , са непрекъснати, ii) ∞=

∞→tiτlim ,

iii) за tTt ≤≤0 , ( ) 0...,,,, 21 >kn uuutfu винаги, когато 0>inuu , а за фиксирани t, f е ненамаляваща относно iu , iv)

21

(3.114) ( )( ) ( )( )( )

( )( ) ( )( )( ) ,...,,,

,...,,,

1

1

−∞=−−

∞=

−−

∞

∞

++

∫

∫

dttStStf

dttStStf

k

k

ττ

ττ

τ

τ

където ( ) ( ) ( )( ) ( ) ( ) ( )( ).21,

21 tStStStStStS −=+= −+ Тогава всяко решение на (3.113) е

осцилиращо. 3.3.2. Числени симулации. За числените симулации на модела (3.111), се използват стойностите на параметрите от (3.110). Поради липса на точни стойности за параметрите iA и iω , при числените симулации за тях използваме стойностите: (3.120) ]6.0,3.0[],5.1,1.0[ ∈∈ iiA ω . В автореферата е показана само бифуркационната диаграма за основния случай, когато 0,0,0 321 ≠≠≠ AAA , и така бифуркационните параметри (заедно с τ ) стават четири.

На фигура 3.32 е показана бифуркационната диаграма на системата (3.111): стойностите на променливата 3y , ( )ny3 , са изобразени относно изменението на непрекъснато променящият се бифуркационен параметър τ . При нарастване на τ от

5.4=τ (до )2.5=τ системата (3.111) има периодични решения с период едно. При по-нататъшното нарастване на τ , от едно-периодичната орбита в резултат на удвояващи се бифуркации след 5.5>τ се появява хаотично поведение.

Фигура 3.32. Бифуркационна диаграма на системата (3.111) за 7.0321 === AAA , ]8,5.4[∈τ . 3.3.3. Изводи 1. Появата на хаос в биологичните системи свързани с клетъчното сигнализиране и процесите на синтез на протеини е индикация за болестно състояние (патология), като в повечето случаи е свързано с възникването на рак. 2. Преходът към хаос и появата на хаотични трептения в системата (3.111) стават чрез удвояващи периода бифуркации.

( )ny3

τ

22

3. В случай пет, пресметнатата максимална Ляпунова експонента е най-голяма. Обратното, в случаи 1 и 2 тя е най-малка.

3.4. Времезакъснителен модел описващ взаимодействието между протеините ERK и STAT5

3.4.1. Общи сведения. През последните години се наблюдава изключителен интерес към изследването на взаимодействието между протеините ERK и STAT5 [11, 26]. Експериментално е установено, че активирането на пътеката Ras/Raf/MEK/ERK от рецептора EGFR (epidermal growth factor receptor), води до фосфорилиране по серин на STAT5 [11], в дегеративно променените клетки на млечните жлези и на чернодробните клетки. Така, пътеката от биомолекулярни взаимодействия MAPK влияе върху пътека JAK-STAT. 3.4.2. Времезакъснителен модел на взаимодействието на ERK и STAT5. Въз основа на диаграмата на биомолекулярните взаимодействия между ERK и STAT5 [26] (фиг. 3.34), авторите на статия [25] предлагат динамичен модел за взаимодействие между ERK и STAT5a в CHOA (Chinese hamster ovary cells) клетките .

Фигура 3.34. PPGH – биокинетична диаграма на взаимодействие между STAT5a и ERK.

Въвеждаме времезакъснителна функция към модела, за да отчетем времето което е необходимо да се активират протеините ERK и STAT5. Така получаваме:

(3.122) ,)()(,

,)()(,

231112

231111

221102

221101

AsktstekdtdsAsksek

dtds

IektstekdtdeIeksek

dtde

−−−−=++−=

+−−−=−+−=

ττ

ττ

където 1e е концентрацията на неактивираната киназа ERK, 2e е концентрацията на активираната киназа ERK, 1s е концентрацията на нефосфорилирания STAT5a, 2s е концентрацията на нефосфорилирания STAT5a.

Скоростните константи 0k и 1k са пропорционални на честотата на взаимодействие на протеиновите молекули на ERK и STAT5a и представляват

23

постоянната скорост на реакциите на присъединяване; 2k и 3k са константи на експоненциалните нараствания и разпадания на ERK и STAT5a; I>0 и A>0 са съответно инхибиращи и активиращи източници. Източник I>0 инхибира неактивирания ERK. A активира дефосфорилацията на фосфорилираната STAT5a [12, 13, 33, 37, 38]. 3.4.3.1. Локално устойчив анализ. Локално устойчивия анализ е подходящ за изследване на качественото поведение на времезакъснителни системи [10, 18] при малки стойности на времезакъснението τ ( 1<τ ). За тази цел развиваме функция

τχ2−e в ред на Маклорен и запазваме само линейния член, т.е. извършваме линейно приближение. След алгебрични пресмятания получаваме характеристичното уравнение на системата в първо приближение

(3.128) 012

13

14 =++++ srqp χχχχ ,

където )2( 11 τapp += , )2( 1111 τcabq +−= , )( 111 cdr −= и s=0. Условията на Раус-Хурвиц за устойчивост на равновесното състояние не са в сила и системата е структурно неустойчива, т.е равновесното състояние може да изчезне. Съгласно теорията, в този случай видът на равновесното състояние може да е сложно седло-фокус или сложно седло-възел [6, 7]. Видът на това неустойчиво равновесно състояние се определя от следния израз

(3.136) 21

211

31

31111

21 441827 qprpqrqpr −++−=Ω .

Ако: a) условия 0<Ω , 0R0,s ,0r ,0q ,0 111 >=>>>p са удовлетворени, то уравнението (3.128) има един корен равен на нула и три отрицателни реални корени- сложно седло-възел; б) 0>Ω

0>Ω

, 0R0,s ,0r ,0q ,0 111 >=>>>p , то тогава (3.128) освен един нулев корен има също един отрицателен реален корен и два комплексни корена с отрицателни реални части- сложно седло-фокус.

3.4.4. Числен анализ. Илюстрираме числено аналитичните резултати, които бяха получени от качествения анализ на система (3.122). Поради липса на количествени данни за параметрите на модела описващ взаимодействието между протеините ERK и STAT5a, задаваме интервалите на тяхното изменение на базата на данни за пътеките JAK-STAT и MAPK [37, 38]. При числените симулации приемаме, че: ]4 ,5.0[0 ∈k min-1, ]4 ,7.0[1 ∈k min-1, ]4 ,1.0[2 ∈k min-1, ]0.6 ,2.0[3 ∈k min-1, (3.139) ]1 ,1.0[∈τ min, ]1.10 ,10.1[ -23

0−∈e mM, ]1.10 ,10.1[ -12

0−∈s mM,

]1.10 ,10.1[ -34−∈I mM, ]1.10 ,10.1[ -45−∈A mM. На фиг. 3.35 е показан видът на корените на характеристичното уравнение

(3.128), като функция на e0 (нулевият корен уравнението не е показан). Виждаме, че в интервала ]013.0,001.0[0 ∈e , Ω е положително и в този случай типа на равновесното състояние е сложно седло-фокус. Когато параметрите 0k и τ се изменят в техните интервали, първоначално Ω е отрицателно и (3.128) има 3 реални отрицателни корена съответно в интервали

2.6] ,5.0[0 ∈k и 0.3] ,1.0[∈τ . Когато Ω стане положително при 4] 2.6, [0 ∈k и 1]3, 0.[∈τ характеристичното уравнение има един реален отрицателен и два

комплексно спрегнати корена с отрицателна реална част. Когато параметри 0s , 2k ,

24

3k се променят, вида на равновесното състояние е сложно седло-фокус. А когато се променят параметрите k1, I, A, типа на равновесното състояние е сложно седло-възел.

Фигура 3.35. Корени на характеристичното уравнение, за ]013.0,001.0[0 ∈e , 0>Ω и

]04.0,013.0[0 ∈e , 0<Ω . 3.4.5. Изводи 1. Времезакъснителният модел описващ взаимодействието между протеините ERK и STAT5 има едно неустойчиво равновесно състояние. Видът на това равновесно състояние може да се променя от сложно-седло фокус в сложно седло-възел. 2. Моделът е структурно неустойчив, а това съгласно теорията на Ляпунов-Андронов е свързано с изчезване на равновесното му състояние. 3. Когато видът на равновесното състояние е от тип сложно – седло фокус, клетката се трансформира трайно в ракова. 4. Времезакъснението оказва дестабилизиращо влияние върху динамичното поведение на модела.

3.5. Времезакъснителен модел на РНК замълчаването (потискането)

3.5.1. Общи сведения за механизма на замълчаване на РНК. РНК замълчаването (или също известно като интерференция на РНК (на англ. RNA interference)) потиска експресията на гените следтранскрипционално (на англ. posttranscriptionally). Интерференцията на РНК (RNAi) е относително нов механизъм за селективно замълчаване на гените в различни видове организми- растения, плесени (гъби) и червеи. Този механизъм придобива все по-голямо предимство при определяне и валидиране на нови лекарства и лечебни терапии. Има един вид siRNA, специфичността на който се състои в това, че заедно със съответните протеини формира така наречения РНК индуциран замълчаващ комплеск (на англ. RNA-induced silencing complex (RISC)). Този комплекс е способен да разпознава прицелната мРНК чрез хибритизация и индуциране на ендоклетъчно разделяне (виж Фиг. 3.38).

25

Фигура. 3.38. Схематична диаграма на основен процес на замълчаване на РНК (взет от

www.calandopharma.com). До сега е известно, че генното замълчаване е с продължителност около една

седмица при бързо делящи се клетки и около три седмици в неделящи се клетки, in vitro и in vivo. 3.5.2. Модели 3.5.2.1. Основен (базов) модел на замълчаването на РНК.Математичното описание на един концептуален модел на процеса на замълчаване на РНК е дадено в [9]. На фигура 3.39 е показана схемата от основните елементи съставящи този модел.

Фигура. 3.39. Схематична диаграма на основния модел на замълчаването на РНК. Процесите включени в модела са отбелязани с черно, докато светлите (сивите) стрелки отчитат крайните входни и изходни сигнали на системата.

26

Отделните стъпки показани на фигура 3.39 могат да бъдат моделирани и в резултат се получава автономна система от ОДУ, в която независимите променливи са

MCRD ,,, , които представляват концентрациите dsRNA, RISC, RISC-mRNA комплекса и мРНК (mRNA) за време t . 3.5.2.2. Модел с времезакъснение. В тази подсекция се изследва следната система:

(3.148)

( )

( ) ( )

,.

,..

,...

,..

RMbMdhdt

dM

tCdgRMbdtdC

RMbRdDandtdR

tCgDadtdD

M

C

R

−−=

−+−=

−−=

−+−=

τ

τ

където времезакъснителната функция ( )τ−tC представя приемането, че общата скорост на деградация на dsRNA с Dicer (както и основният процес), и общата скорост на загуба на dsRNA са пропорционални на процеса на свързване на mRNA за формиране на RISC-mRNA комплекса за момента ( )τ−t . Това приемане е във връзка с факта, че регенерирането (или деградирането) на RISC-mRNA комплекса се нуждае от някакво крайно време τ . Ограниченото време τ на регенерация може да бъде различно от това на дегенерация. Тук се приема, че двете времена са равни.

В по-нататъшния анализ се изследва бифуркационната структура (в частност появата на бифуркацията на Андронов-Хопф) на системата (3.148), като се приема че времезакъснението е бифуркационен параметър. След линеаризиране в околността на

равновесното състояние на системата (3.148)- ⎟⎠⎞

⎜⎝⎛ >>>> 0,0,0,0

_____

MCRDE , от

устойчивата и матрица се получава характеристичното уравнение (3.152) ( )43

22

313

22

31

4 TTTTKKK +++=+++ − χχχχχχχ τχl , където

(3.153) ( ) ( )

( ) ( )[ ]( ) ( )[ ].

,,,,,,

523325144

3251454341341241

325133251512511

aagnaaaaaaaTaaaaaaangaaaaTaKTaT

aaaaaKaaaaaaaKaaaK

−+−−=−++−−=−=−=−=−++=++=

3.5.3. Бифуркация на Андронов-Хопф за времезакъснителния модел 3.5.3.1. Линейно устойчив анализ. В случай, че времезакъснението τ е малко ( )1<τ , за намирането на бифуркационната точка е най-подходящ линейно устойчивия анализ. Тогава ,1 χτχτ −≈−l и характеристичното уравнение има вида: (3.154) .0234 =++++ srqp χχχχ Нека (3.156) ( ) srqph ++++= χχχχτχ 234, . Диференцирайки неявно ( )( )ττχ ,h , то за производната и относно bτ , имаме

(3.164) ( ) ( ) ( )( )[ ] ,42222

2''22''221

ILikqskqkprpkkNk

dd b

+−−+−+

=ττχ

27

където ( )ikqkIpkL 22 42,2 −=−= , а ( ) ( )( )'2'22'' 4 rkpkqkqspN −−+−= . Реалната част на (3.164) има вида:

(3.165) ( )22

21 2Re

ILNk

dd b

+=⎟

⎠⎞

⎜⎝⎛

ττχ .

За реалната част на (3.165) се получава, че е винаги положителна ако 0>N , т.е. ако са изпълнени следните условия (3.166) '2'22'' ,4, rkpkqkqs >>> , или '2'2 ,4 rkpkq << . По този начин, неравенствата (3.166) се явяват необходими условия за съществуването на положителна реална част на корена ( )τχ1 . Съгласно бифуркационната теорема на Хопф, това условие гарантира раждането на устойчив граничен цикъл след бифуркация на Андронов-Хопф [22] за bττ = . 3.5.3.2. Глобален анализ чрез теоремата на Хопф. Нека inm +=χ ( )Rnm ∈, . Така (3.152) записано в термините на неговата реална и имагинерна част ще има вида:

(3.167)

( ) ( )( ) ( )[ ]

( )[ ] [ ] ( ) ( ) ( )

( ) ( )[ ]( )[ ] [ ] .sinsincoscos2sin

cos3sin3234

,cossincossin2cossin3cos3

36

4322

2

32321

3232

122

4322

2

32231

322

223

12244

τττττττ

τττττττ

τ

τ

nTnmnnTnmnnmnTnnnmnmmnT

nKmnKnnmKnmmnnTnnnmTnmnnnmT

nnnmnmnmTmKnmKmnmKnmnm

m

m

−−++−+

+−+−=

=++−+−

++++−+

+−+−=

=+−+−+−+

−

−

l

l

За намирането на първата бифуркационна точка се приема, че 0=m . Така, горните две уравнения от (3.166) се редуцират до вида:

(3.168) ( ) ( )( ) ( ) .sincos

,sincos

42

233

133

1

33

142

22

24

ττττ

nTnTnnTnTnKnKnnTnTnTnTnKn

−++−=+−

+−++−=−

След повдигане на квадрат на двете уравнения в (3.168) и събирането им, то следва че: (3.170) ( ) ( ) ( ) 02222 2

42

422

323

4223131

22

6212

21

8 =−+−+−+−+−−+ TnTTTKnTTTKKKnTKKn . Вижда се, че (3.170) е биквадратно уравнение относно 2n и неговата лява страна е положителна за големи стойности на 2n , а е отрицателна за 0=n , т.е. за (3.170) може да твърдим, че има поне един положителен реален корен. От бифуркационната теорема на Хопф (съгласно [18]) следва, че в този случай може да бъде формулирана следната теорема: Tеорема 3.6. Нека bn е последният положителен прост корен на (3.170). Тогава ( ) bb inin =τ е прост корен на (3.152), а ( ) ( )ττ inm + е диференцируемо относно τ в

малка околност около bττ = . За да установим съществуването на бифуркация на Андронов-Хопф за bττ = , ние трябва да покажем, че

(3.171) .0≠= b

ddm

τττ

От извършените пресмятания се получава, че това е винаги изпълнено. Така може да бъде дефинира следната теорема:

28

Tеорема 3.7. Ако bn е последният положителен корен на (3.170), то тогава възниква бифуркация на Андронов-Хопф при преминаването на τ през bτ .

3.5.4. Числен анализ на времезакъснителния модел. В тази подсекция се анализира числено поведението на времезакъснителния модел (3.148), в който са включени концентрациите на двойно-нишкова РНК (dsRNA)- ( )tD , РНК индуцирания замълчаващ комплекс (RNA-induced silencing complex (RISC)- ( )tR ), RISC-mRNA комплекса- ( )tC , и mRNA за време t. Съответните числени стойности на параметрите на модела са 5;05.0;1.0;5.0;1.0;2;1.0;10 ======== ndddghba CRM [9]. От това, че не е точно известно, в кой момент започва създавенето (разпадането) на комплекса RISC-mRNA, то се приема, че 10=τ или 13 часа.

На фигури 3.40 и 3.41 се демонстрира зависимостта на поведението на модела от параметъра τ , който от гледна точка на качествената теория играе ролята на бифуркационен параметър. На фигура 3.40 са показани устойчивите решения на dsRNA, RISC, RISC-mRNA комплекса и mRNA за 10=τ .

На фигура 3.41 е показан случаят, когато 13=τ . Вижда се, че за същите стойности на скоростните константи, като резултат от бифуркация на Андронов-Хопф, се появява устойчив граничен цикъл, т.е. системата (3.148) притежава периодични решения. Следователно, времезакъснението има дестабилизираща роля върху процеса на РНК замълчаването.

Фигура 3.40. Устойчиви решения на системата (3.148) за 10=τ . Времето е в часове. 3.5.5. Изводи

На базата на получените резултати следва, че: - моделът открива и деградира началната доза на dsRNA чрез съществено начално спадане в dsRNA концентрацията; - моделът демонстрира бързо генериране на последователност от специфична siRNA, чрез бързо увеличаване на RISC в по-ранните етапи на реакцията; - времезакъснението τ е ключов фактор в поведението на модела (3.147). В този случай, то има дестабилизираща роля върху процеса на замълчаване.

29

Фигура. 3.41. Неустойчиви периодични решания на системата (3.148) за 13=τ след като е

използвана голяма (висока) доза на dsRNA.

3.6. Динамика и комплексно поведение на времезакъснителен модел на РНК замълчаването с периодично форсиране

3.6.1. Времезакъснителен модел на РНК замълчаването с периодично форсиране. Разглежда се модификация на динамичната система (3.148) с едно времезакъснение, т.е.

(3.175)

( )

( ) ( )

..

,..

,...

,..

RMbMddt

dM

tCdgRMbdtdC

RMbRdDandtdR

tCgDadtdD

M

C

R

−−Ω=

−+−=

−−=

−+−=

τ

τ

Трябва да се отбележи, че константата Ω представлява периодична функция на времето t, т.е. това е външно периодично смущение, което описва объркването (нарушаването) в синтеза на прицелната мРНК. От математична гледна точка това е пример за периодично форсиране [2]. Така, за Ω се приема, че има вида (3.176) thh εsin1+=Ω . По-долу се изследва динамиката и бифуркационното поведение на системата (3.175). 3.6.2. Бифуркационен анализ. Нека (3.177) .cos,sin tutv εε ==

Очевидно ,, vdtduu

dtdv εε −== и така неавтономната четиримерна времезакъснителна

система (3.175) се привежда до автономна шест мерна имаща вида:

30

(3.179)

( )

( ) ( )

.

,

,.

,..

,...

,..

1

vdtdu

udtdv

RMbMdvhhdt

dM

tCdgRMbdtdC

RMbRdDandtdR

tCgDadtdD

M

C

R

ε

ε

τ

τ

−=

=

−−+=

−+−=

−−=

−+−=

Вижда се, че системата (3.179) има две равновесни състояния. След линеаризиране

около равновесното състояние ⎟⎠⎞

⎜⎝⎛ ==>>>> 0,0,0,0,0

_______

uvMRCDE се получава

характиристичното уравнение (3.182) ( )65

24

33

42

51

24

33

42

51

6 TTTTTTKKKK +++++=++++ − χχχχχχχχχχ τχl , където (3.183)

( ) ( )( ) ( ) ( )

( ) ( )( ) ( ) ( )[ ].,

,,,,

,,,

34154322

612

545

5142412

5432541534324

2551132433325151

23

532512

4322

51512511

ngaaaangaaaaTaaaaTaaaaTaTaaangaaaaangaaaaaT

aaaaaaaaaangaTaaaaaaaaKaaaaaaKaaaaaaaKaaaK

−+−=−=

++−=−=−−−+=

−−−−+=−+++=

+−=−+++=++=

εεε

εεεε

Устойчивостта на равновесното състояние зависи от знака на реалната част на корените на (3.182). Нека inm +=χ ( )Rnm ∈, . Тогава (3.182) може да бъде записано в термините на неговата реална и имагинерна част като: (3.184)

( ) ( )( ) ( )

( ) ( )[ ]( ) ( )[ ]( ) ( )[ ] ( )[ ][ ]

( ) ( ) ( )( ) ( )[ ]

( ) ( )[ ]( ) ( )[ ] ( )[ ]( ) .sinsincos

sincos2sin3cos3sin6cos4

sin510cos1052341056206

,cossincossin2cossin3cos3

sin4cos6sin105cos510

365101515

65

224

23323

2244332

4235324514

323

332

32451

5335

65

224

32233

3322442

324542351

224

233

22442

42351

422466

τττττττ

ττττ

τττττττ

ττττ

τ

τ

nTnmnnTnnmnmnTnmnmnnnmT

nnmnmnmnnmTnmnnmmnnmnmnTmnK

nnmKmnnmKnmnmnKmnnmnmnTnnnmT

nmnnnmTnnnmnmnmTnmnnmnnmnmT

nnmnmnnmnnmmTnmKmnmK

nmnmKmnnmmKnmnmnm

m

m

−−++−−+−−−+

+−+−−+

++−−−+=+

+−+−+−+++−

+++++−+−+−+

+−+−++

+−+++−=

=−+−+

+−+++−++−−

−

−

l

l

31

За намирането на първата бифуркационна точка се приема, че 0=m . Тогава, горните две уравнения в (3.184) се редуцират до вида:

(3.185) ( ) ( )

( ) ( ) .sincos,cossin

62

44

253

35

13

35

1

62

44

253

35

12

44

26

ττττ

nTnTnTnnTnTnTnKnKnTnTnTnnTnTnTnKnKn

−+−++−=−

+−++−=−+−

Ако се повдигнат на квадрат двете уравнения в системата (3.185) и след това се съберат, то следва че n трябва да бъде корен на следното уравнение:

(3.187) ( ) ( )[ ]

( )[ ] ( )[ ]( ) .02

2222

26

22564

46253

24

24

6514242

23

23

831314

22

22

102

21

21

12

=−−+

+−+−+−−+−+

++−+−+−−+

TnTTTnTTTTTKnTTKKTTTK

nTTKKKTKnKTKn

Вижда се, че (3.187) е уравнение от шеста степен относно 2n и, че лявата му страна е положителна за големи стойности на 2n , и е отрицателна за 0=n , т.е. (3.187) има поне един положителен реален корен. За използването на бифуркационната теорема на Хопф е приложима следната теорема: Tеорема 3.8. Нека bn е последният положителен прост корен на (3.187). Тогав, ( ) bb inin =τ е един прост корен на (3.182), а ( ) ( )ττ inm + е диференцируемо относно

τ в малка околност на bττ = . За да се установи дали съществува бифуркация на Андронов-Хопф за bττ = , то

трябва да се покаже, че е в сила трансверсалното условие 0≠= b

ddm

τττ. От направените

пресмятания се вижда това условие е винаги изпълнено, и следователно е в сила следната теорема: Tеорема 3.9. Ако bn е последният положителен корен на (3.187), то тогава се появява бифуркация на Андронов-Хопф за случая, когато τ преминава през bτ . 3.6.3. Числен анализ. Тук се илюстрира числено предсказаното в 3.6.2 поведение на модела (3.174). Съответните числени стойности на параметрите на модела са като тези в модела (3.148), където ].13,1[∈τ

На фигура 3.44 е показано решението на системата (3.175) в случая, когато параметърът τ е по-малък от бифуркационната си стойност. Вижда се, че променливите описващи dsRNA- D, RISC- R, RISC-mRNA комплекса- C и mRNA- M имат постоянни стойности, т.е. системата притежава устойчиво равновесно състояние, което отговаря на нормален потискащ процес.

На фигура 3.45 е показан ефектът на дестабилизиране на поведението на системата (3.175) от страна на времезакъснението. Вижда се, че за същите стойности на скоростните константи, след бифуркация на Андронов-Хопф, се появява устойчив граничен цикъл с период близък до едно.

На фигура 3.47 е показана бифуркационната диаграма на системата (3.175): стойностите на координатата C, ( )nC , са изчертани относно непрекъснато променящия се бифуркационен (контролен) параметър τ . Когато той намалява от

4.12=τ (до приблизително 3.12=τ ) системата (3.175) трепти с различен период. Когато τ продължава да намалява и след тези стойности, поведението на системата става квазипериодично. Трябва да се отбележи, че и обратни бифуркации също имат

32

място. Това комплексно поведение в термините на нашия модел може да бъде свързано с напълно нарушен процес на потискане.

Фигура. 3.44. Устойчиво решение на системата (3.175) за 01.01 =h и 1=τ .

Фигура 3.45. Периодични (авто-трептения) решения на системата (3.175), за 01.01 =h и

4.12=τ . 3.6.4. Изводи

Динамиката на системата (3.175) беше анализирана с помощта на

бифуркационната теорема на Хопф. Ако системата (3.175) се намира в устойчиво

равновесно състояние, то това отговаря на нормален процес на потискане на РНК. От

друга страна, появата на неустойчиви равновесни състояния, устойчиви гранични

цикли (авто-трептения), или сложно осцилиращо поведение, в този случай отговаря

на патология, т.е. на ненормален процес на потискане (замълчаване) на РНК. От

направените аналитични и числени изследвания на модела (3.175) става ясно, че

времезакъснението τ е ключов фактор в поведението на системата; тук то има

дестабилизиращ ефект върху процеса на замълчаване.

M

C

33

Фигура 3.47. Бифуркационна диаграма ( )nC относно τ получена след числени пресмятания

на системата (3.175) при ,1.0,5.0,1.0,2,1.0,10 ====== RM ddghba ]4.12,8.11[,5,05.0 ∈== τndC и 25.01 =h .

3.7. Изследване на регулацията на динамиката на c-Myc/E2F от miR17-92 Транскрибционните фактори E2F и Myc участват в контрола на клетъчната пролиферация и апоптоза. Тези гени могат да действат като тумор-супресори или онкогени в зависимост от нивото им на експресия, наличието и вида на между-клетъчния сигнал и сложни взаимодействия включващи обратни връзки [3, 24]. Предполага се, че miRNA клъстера 17-92 има отношение към регулирането на сигнала и е в състояние на свръх-експресия при някои тумори. Други микро-РНКи участващи в регулацията на този сигнален път са mir-21, mir-145 и mir126-143. По-нататък използваме методиката описана в подточка 2.2 от дисертацията. 3.7.1. Моделиране. Като първа стъпка, от биомедицинската литература се намират най-важните протеини свързани с регулацията на клетъчния цикъл от c-Myc и се съставя подробен списък- фигура 3.48.

Фигура 3.48. Протеини включени в регулирането на клетъчния цикъл чрез c-Myc.

C

τ

34

След това се търсят протеин-протеинови взаимодействия в литературата и специализираните бази данни, с цел да се положи основата на мрежа от взаимодействия между съответните протеини. Информацията се подбира ръчно и в концептуалната карта на системата се включват и входящите сигнали- фигура 3.49.

Фигура 3.49. Взаимодействия между протеините участващи в цикъла на c-Myc.

По същия начин се включват и мРНКи регулиращи транслацията на протеините участващи в същата мрежа- фигура 3.50.

Фигура 3.50. Микро-РНК и семейства от мРНКи контролиращи протеините от с-Myc цикъла.

Изследва се влиянието на miRNA, като се взема пред вид не само конкретния протеин, чиято транслация се регулира, но и се търси влиянието на протеините върху

35

експресията на miRNA (miRNA-mRNA-протеин), така че да се формират обратни връзки (протеин-miRNA). Такъв е случаят с клъстера mir17-92, чиято експресия се регулира от C-Myc и от своя страна инхибира експресията на E2F- фигура 3.51.

Фигура 3.51. Взаимодействйя между протеини и микро-РНКи в системата за регулиране на

клетъчната пролиферация с c-Myc. Така получената мрежа от взаимодействия се превръща в математичен модел от обикновени диференциални уравнения с или без времезакъснение. С цел демонстриране на този процес, ще разгледам само ядрото на тази мрежа, състоящо се от с-Myc, E2F, и miRNA17-92. Това е адаптация на модела описан в [3] и разширен с цел да се вземе предвид влиянието на входящи сигнали контролиращи системата: пролиферативни сигнали предавани от растежни фактори (GF, входящ) и инхибиращ сигнал при увреждане на ДНК, предаван от p53. С цел да се намали сложността на изходната мрежа от взаимодействия получаването на опростения модел се илюстрира на фигура 3.52.

Фигура 3.52. Опросетен модел описващ взаимодействията в ядрото на с-Myc/miRNA17-92/E2F

системата.

36

Моделът на Агуда [3] се състои от две уравнения с времезакъснение, описващи нивата на експресия на c-Myc/E2F ( p ) и miRNA17-92 ( v ). Времезакъснението τ отразява идеята, че степента на синтез на протеините не е функция на моментната концентрация, а на концентрацията за известно време (τ ) в миналото. Уравненията на този модел са:

(3.194)

( )[ ]( )[ ] ( )

,

,

2

22

1

21

vpkdtdv

ptvtp

tpkdtdp

γβ

δττ

τα

−+=

−−Γ+−+Γ

−+=

α е константа описваща конститутивната експресия на белтъците (протеините) в следствие на сигналите предавани чрез растежни фактори от и извън-клетъчното пространство, 1k , 2k , β , δ и γ са скростни константи, 1Γ е коефициента на експресия на белтъците, 2Γ е степента на инхибиране на експресията от miRNA. Допълнително променям този модел, така че стойността на α да зависи от баланса между пролиферативни (GF) и (DD) сигнали за увреждане, което моделираме чрез логаритмична зависимост [33]:

(3.195) ( )[ ]( )[ ] ( ) p

tvtptpkDDGF

dtdp g δ

τττ

α −−Γ+−+Γ

−+⋅⋅= −

22

1

21

0 .

3.7.2. Анализ и симулиране на модела. Моделът (3.193) (като се отчита (3.195)) се използва за изследване, чрез симулация на взаимодействията между растежните фактори (входния сигнал на системата) и сигнала от увреждания на ДНК (инхибиращ синтеза на протеини). За тази цел итеративно се изчисляват равновесните състояния на системата за различни нива на растежни фактори и медиатори на ДНК увреждания в интервал от десетократно по-малък до десетократно по-голям от номиналната стойност на променливите GF, DD, 1=0GF и 1=0DD - фигура 3.53.

10-1

100

101

10-1

100

101

Pmax

DNA Damage (normalised)

Gro

wth

fac

tor

(nor

mal

ised

)

2

4

6

8

10

12

Фигура 3.53. Симулация отчитаща влиянието на растежни фактори и ДНК повреди.

37

Симулацията на фигура 3.53 показва нивата на експресия на белтъците (протеините) при стабилно състояние на системата. Състоянието в горния ляв ъгъл показва засилване на нивата на експресия на p . Вертикалната прекъсната линия съответства на потенциални онкогенни състояния, при които растежните хормони са свръх-експресирани, докато ДНК уврежданията (или медиаторите на сигнала) са с ниска концентрация или липсват.

3.7.3. Динамика на времезакъснението при експресията на протеини и микро-РНКи. Времезакъснението, в комбинация с положителни и отрицателни обратни връзки и нелинейността на биохимичните процеси, може да доведе до поява на силно нелинейна динамика в биохимичните системи. 3.7.3.1. Бифуркационен анализ. Първо се намират равновесните състояния на системата (3.193), )),( νpE , които могат аналитично да се получат от следната система алгебрични уравнения, включващи константите на модела (3.196) 0=23 cpbpap +++ ,

(3.197) γ

βν

pk2= + ,

където )(1= 22 αγ

δδ

−Γka , ))((1= 22

1 γαδβ

δδ

kb −Γ+Γ и )(1= 2

1 γαβ

αδ

Γ+Γc .

Съответното характеристично уравнение има следния вид: (3.202) ( ) ( ) χτγχδγχδγχ −−+=+++ l2211

2 ckcc . Уравнението (3.202) в термините на реалната и имагинерната си части има вида:

(3.204) ( ) ( )[

]( ) ( )[ ].cossin2

,sincos

12211

1

221122

ττγδγτ

τγδγδγ

τ

τ

nncnkccmcnmnnnc

nckcmcmnm

m

m

−−+=++

++−+=+++−

−

−

l

l

За намирането на първата бифуркационна точка се прави проверка за съществуване на чисто имагинерни корени на (3.202), т.е. приема се, че .0=m Така получаваме:

(3.205) ( )

( ) ( ) .cossin,sincos

1221

12212

ττγδγττγδγ

nncnkccnnncnkccn

−−=++−=+−

Ако се повдигнат на квадрат двете уравнения в (3.205) и след това се съберат, то се получава: (3.206) ( ) ( ) .0222

22122

1224 =+−−−++ γδγδγ kccncn

Тъй като се разглежда само случаят, когато системата (3.194) е неустойчива за 0=τ , то от това следва, че корените на съответното характеристично уравнение (3.207) ( ) ( ) ,02211

2 =+−−−++ δγγχδγχ kccc трябва да имат положителни реални части. От условията на Раус-Хурвитц за квадратен полином в този случай се получава: (3.208) ( ) .0,0 1221 <−+>−− ckcc δγγδγ Уравнението (3.206) има най-малко един прост корен и 2n е последният прост положителен корен на това уравнение. Освен това, съгласно [18], за да се приложи бифуркационната теорема на Хопф, трябва да е в сила следната теорема:

38

Tеорема 3.10. Нека bn е последният положителен прост корен на (3.206). Тогава, ( ) bb inin =τ е прост корен на (3.202) и ( ) ( )ττ inm + е диференцируемо относно τ в малка околност на .bττ = За да съществува бифуркация на Андронов-Хопф за bττ = , то трябва да се

покаже, че е в сила следното трансверсално условие 0≠= b

ddm

τττ.

По-долу се дефинира основният аналитичен резултат от тази подточка на дисертацията, т.е.: Tеорема 3.11. Ако bn е последният положителен корен на (3.206), то тогава се появява бифуркация на Андронов-Хопф, когато τ преминава през bτ , тогава и само

тогава когато ( )2' 2 δγ +<g .

Следствие 3.11. Когато bττ > , то тогава равновесното състояние _

E на системата (3.194) е локално асимптотично устойчиво, при така дадените условия на Теорема 3.11. 3.7.3.2. Числен анализ. Числените стойности на параметрите са взети от [3] и са:

(3.217) [ ] [ ] ( )[ ][ ] [ ] [ ][ ] [ ].02.0,3.0

,4.0,26.0,01.0,033.0,0,056.0,1.0

112

11

11

12

21

−−

−−−

−

==

===

∈=Γ=Γ

hhkMhkhMh

MhMM

γμδμβ

μαμμ

Точната стойност на времезакъснението не е известна. Приема се [0.005,3]∈τ в часове. На фигура 3.55 се вижда зависимостта на амплитудата и периода на осцилацията от стойността на времезакъснението. Вижда се, че амплитудата и периодът нарастват с нарастване на времезакъснението, за стойности на α по-ниски от точката на бифуркация.

0 200 400 600 800 1000 12000

2

4

6

8

10

12

14

time

prot

ein

mod

ul (

p) ,

miR

clu

ster

(v)

Фигура 3.55. Периодични решения на система (3.194) при различни стойности на

времезакъснението- т.е 0.05=τ (плътната линия) и 1.8=τ - прекъснатата линия. 0.017=α , а времето е в часове.

39

3.7.4. Изводи В тази подточка се използва новият системно биологичен подход за изследване на регулирането с микро-РНК. С помощта на системната биология се анализира динамиката на времезакъснителния модел на взаимодействие между miRNA-17-92 и транскрибционните фактори Myc и E2F. Методологията използвана тук може да се използва за проверка на биологични хипотези с цел да се даде възможност на клетъчните биолози да създават по-надеждни експерименти и откриват критични процеси подаващи се на медикаментозно лечение.

Глава четвърта. Модели с две закъснения 4.1. Модел на система с обратна връзка съдържаща две закъснения. Матричната РНК (мРНК) се транскрибира приблизително от 1000 нуклеотида. Ето защо генната експресия (или мРНК транскрипцията) се контролира от протеините произведени от другите гени. Регулирането на генната експресия се извършва на няколко нива, като транслационното регулиране играе съществена роля в регулацията на определени много дълги гени, за които транскрипцията и мРНК процесите траят няколко часа.

На фигура 4.1 е показана структурата на система с обратна връзка, съдържаща транскрипционно и транслационно времезакъснение.

Обикновено, системата действа по следния начин: протеинът y контролира (управлява) собствения си синтез чрез потискане на мРНК, x. В една опростена форма, тази система може да бъде преставена чрез математичен модел с времезакъснение, т.е.

(4.1) ( )

( ) ,

,

212

121

ytxkdtdy

xtykdtdx

γτ

γτ

−−=

−−=

където 0, 21 >kk са скоростни константи на продукция, 0, 21 >γγ са скоростни константи на деградация, 01 >τ е времезакъснението за транскрипция, а 02 >τ е времезакъснението за транслация.

Фигура 4.1. Опростена схема на времезакъснителен контрол (чрез обратна връзка) на синтеза

на даден протеин.

протеин

мРНК

ген

τ1

τ2

40

Този модел притежава само едно равновесно състояние в нулата, т.е. ( )0,0 . Така, за характеристичното уравнение на системата (4.1) получаваме вида: (4.3) ( ) ,0212121

2 =−+++ −χτγγχγγχ lkk където 21 τττ += .

От бифуркационната теорема на Хопф и условията на Раус-Хурвиц следва, че бифуркацията на Андронов-Хопф се появява при (4.5) ( ) ,0212121 =+++ ττγγ kk (4.6) .02121 >− kkγγ Но от (4.5) се вижда, че то е винаги положително. Следователно за тази система не е възможна появата на бифуркация на Андронов-Хопф и времезакъснението

21 τττ += не оказва влияние върху загубата на устойчивост- виж Фиг. 4.2.

Фигура 4.2. Устойчиви решения за концентрацията на протеина (непрекъснатите линии) и за

концентрацията на мРНК (прекъснатите линии) като функции на времето, за различни стойности на времезакъсненията, т.е. 3.0,1.0 21 == ττ (ляв панел) и

5.0,4.0 21 == ττ (десен панел). За двата случая са в сила 6.0,5.0,5.0,3.0 2121 ==== γγkk и условията (4.6).

4.2. Модел на потискане на РНК с две времезакъснения. В предходната трета глава (подточка 3.5) моделът на РНК замълчаването беше разгледан и изследван. Тук ограниченото време 1τ на регенериране е различно от това за дегенериране 2τ . Така се получава:

(4.7)

( )

( ) ( )

,.

,..

,...

,..

2

1

RMbMdhdt

dM

tCdgRMbdtdC

RMbRdDandtdR

tCgDadtdD

M

c

R

−−=

−+−=

−−=

−+−=

τ

τ

където отново независимите променливи MCRD ,,, представляват концентрации на dsRNA, RISC, RISC-mRNA комплекса, и mRNA, респективно за време t. Системата

41

(4.7) има две равновесни състояния. Оригиналната система от ОДУ има същите равновесни състояния, които са винаги устойчиви.

Тук се използва интегрираната стратегия за определяне на критични биохимични процеси в сигналните пътеки. От гледна точка на биомедицинското изучаване, тези критични процеси могат да бъдат разгледани като нови обекти на лекарствените препарати.

Съответното характеристично уравнение на (4.7) в околността на равновесното

състояние ⎟⎠⎞

⎜⎝⎛ >>>> 0,0,0,0

_____

MRCDE има следната форма:

(4.9) ( ) ( )432

23

16532

23

14 21 TTTTTTKKK +++++=+++ −− χχχχχχχχ χτχτ ll ,

където

(4.10) ( ) ( )

( )[ ]( ) ( ).,,

,,,,,,

253635513244

3251514341241

325133251512511

aangaaTngaaTaaaaaaTaaaaaaaaTaKTaT

aaaaaKaaaaaaaKaaaK

−==−=−++−=−=−=

−=−++=++=

При две времезакъснения в (4.7) анализът на знака на реалните части на корените на характеристичното уравнение (4.9) е много сложно [8]. Така, за анализирането на бифуркационното поведение се използва метод, който определя устойчивостта на равновесното състояние, когато едното от времезакъсненията е равно на нула [28, 35]. 4.2.1. Бифуркационен анализ 4.2.1.1. Случай при 01 =τ и 02 >τ . Нека ограниченото по големина времезакъснение 2τ на деградиране е по-голямо от времето на регенериране на комплекса RISC-mRNA, 1τ . Поставяйки 01 =τ в (4.9), за характеристичното уравнение се получава: (4.11) ( )43

22

31631

22

31

4 2 TTTTTKKK +++=−+++ − χχχχχχχ χτl , където 5331 TKK −= .

Нека ( )Rnminm ∈+= ,χ . Така (4.11) записано в термините на реалната и имагинерната си части има вида: (4.24)

( ) ( ) ( )[( ) ] ( )[ ] ( )

( ) ( ) ( ) ( )[ ]( )[ ] ( ) .sinsincossincos2

sin3cos3234,cossincossin2cossin3

cos336

24223222

22

222

222

131222

122

242232222

2222

222

163122

222

12244

2

2

τττττττττττττ

τ

τ

τ

nTnmnnTnmnnmnTnmnmnnmnTnKmnKnnmKnmmnnTnnnmTnmnnnmTnnmn

nnmmTTmKnmKnmmKnmnm

m

m

−−+−++

+−+−=++−+−

++++−+−+

+−=−+−+−+−+

−

−

l

l

Намирането на първата бифуркационна точка става, като се провери за съществуването на чисто имагинерни корени Rnin ∈±= ,χ на (4.11), т.е. приема се, че .0=m Тогава, горните две уравнения се редуцират до формата

(4.25) ( ) ( )( ) ( ) .sincos

,cossin

242

2233

1313

1

242

2233

162

24

ττττ

nTnTnnTnTnKnKnTnTnnTnTTnKn

−++−=+−

+−++−=−−

След като се повдигнат на квадрат двете уравнения на системата (4.25) и се съберат, то следва че:

42

(4.27) ( ) ( )[ ]

( )[ ] .0222

26

24

24262

23

231

4631131

22

22

6212

21

8

=+−++−+

+−−+−+−−+

TTnTTTKTKnTKKTTTKnTKKn

Вижда се, че (4.27) е биквадратно уравнение относно 2n и лявата му страна е положителна за големи стойности на 2n и отрицателна за 0=n , т.е. уравнение (4.27) има поне един последен положителен корен. Така, съгласно [18] може да се приложи следната теорема: Tеорема 4.1. Нека приемем, bn е последният положителен прост корен на (4.27). Тогава, ( ) bb inin =τ е прост корен на (4.11) и ( ) ( )22 ττ inm + е диференцируемо относно

2τ в малка околност на bττ =2 . За да съществува бифуркация на Андронов-Хопф за bττ =2 , то трябва да се

покаже, че е в сила следното трансверсално условие, 02

≠= b

ddm

τττ

. След извършване

на съответните пресмятания се вижда, че това условие е изпълнено и е в сила следната тоерема: Tеорема 4.2. Ако bn е последният положителен корен на (4.27), то тогава се появява бифуркация на Андронов-Хопф, когато 2τ преминава през bτ .

Следствие 4.2. Когато bττ <2 , то тогава равновесното състояние _

E на системата (4.7) е локално асимптотично устойчиво.

4.2.1.2. Случай при 0, 21 >ττ . Връщаме се към изучаването на (4.9), когато 0, 21 >ττ . Първо се доказва резултатът отнасящ се до знака на реалните части на корените на характеристичното уравнение (4.9), чрез следната теорема: Tеорема 4.3.

Ако всички корени на (4.11) са с отрицателни реални части за 02 >τ , то тогава съществува ( ) 021 >ττ bif такова, че всички корени на характеристичното уравнение (4.9) имат отрицателни реални части за ( )211 τττ bif< , т.е. когато

( ))[ 211 ,0 τττ bif∈ . Следствие 4.3. Ако bif

2τ е дефинирано както в теорема 4.2, то тогава за произволно

),0[2 bττ ∈ съществува ( ) 021 >ττ bif такова, че равновесното състояние _

E на системата (4.7) е локално асимптотично устойчиво, когато ( ))[ 211 ,0 τττ bif∈ . 4.2.2. Числен анализ. Тъй като не са известни точните стойности, при които RISC-mRNA комплекса започва да регенерира (или да деградира), то се приема, че

)13,1[],16,1[ 21 ∈∈ ττ в часове. На Фигура 4.3 е показана диаграма на устойчивите и неустойчивите зони на

системата (4.7), когато времезакъсненията се изменят в по-горе споменатите интервали. Вижда се, че за стойности на 2τ по-малки от критичната стойност, за която се появява бифуркация на Андронов-Хопф (посочена като bif

2τ в Теорема 4.2), системата е винаги устойчива. Трябва да се отбележи, че за използваните интервали на изменение на 1τ и 2τ системата има биологично смислени решения. За стойности

43

на 2τ близки до bif2τ , съгласно Теорема 4.3, системата е устойчива за малки

стойности на 1τ . Този резултат е илюстриран на фигура 4.4, където се наблюдават осцилации с намаляваща амплитуда до равновесното състояние.

Фигура 4.3. Устойчива диаграма на системата (4.7), като функция на 1τ and 2τ .

Фигура 4.5 показва случая, когато 1τ и 2τ се по-големи от бифуркационните

стойности. Математически, това отговаря на загуба на устойчивост на системата,

което може да се свърже с ненормален процес на замълчаване (потискане). С други

думи, от показаните резултати на фигури 4.4 и 4.5, може да се направи извода, че

времезакъсненията имат дестабилизиращ ефект върху процеса на потискане на РНК.

Фигура. 4.4. Устойчиви решения на системата (4.7) за 11 =τ и 92 =τ . Непрекъснатата линия в

левия панел е на концентрацията на RISC- R(t), а прекъснатата линия за RISC-mRNA комплакса- C(t). На десния панел, непрекъснатата линия е за концентрацията на матричната РНК (mRNA)- M(t), а прекъснатата линия е за dsRNA- D(t). Времето е в часове.

Устойчива зона

н е устойчив а

з o н а

τ2

τ1

R M

44

Фигура 4.5. Периодично (авто-трептение) решение на системата (4.7) за 121 =τ and 132 =τ .

Непрекъснатите линии са за концентрациите на RISC -R(t) и mRNA -M(t). 4.2.3. Чувствителен анализ. Пресмятането на локалната чувствителност на независимите променливи става в зависимост от параметрите на модела. Съответните стойности на моделните параметри в нормализирана скала са показани на фигура 4.8. D, R, и C показват най-вече една идентична чувствителност, в която параметърът a (Dicer-mediated FDSRNA деградация) заедно с параметъра n (отношението на siRNA продукцията за всяка вторична FDSRNA молекула) са най-силно чувствителни.

D R C M0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1

State Variable

Sen

sitiv

ity I

ndex

Sensitivity analysis plot of RNAi pathyway for different State variables

a

bh

g

dM

dRdC

n

Фигура 4.8. Локална чувствителност на независимите променливи на модела (4.7) относно

неговите параметри. 4.2.4. Изводи. В тази подточка се изследва ролята на времезакъсненията и протеинната регулация върху след-транслационното (на англ. posttranslational) протеинно регулиране чрез РНК интерференция. За целта се използваха бифуркационен анализ, чувствителен анализ и предсказващи симулации съгласно подхода изложен в глава втора от дисертацията. Бяха получени редица нови резултати от динамична и биологична гледна точка.

45

4.3. Моделиране и анализ на рака на дебелото черво 4.3.1. Общи сведения за рака на дебелото черво. Последните изследвания на рака на дебелото черво показват, че над един милион човека всяка година в света, като около 33 % от хората в развитите страни умират от него [34]. Базирайки се на текущите изследвания, става ясно, че при рака на дебелото черво настъпва неконтролирано нарастване на ненормални клетки във вътрешността. Това неконтролирано нарастване е мултистъпков процес, включващ в себе си няколко генетични изменения, които променят средата на протеините в клетката и водят до злокачествени трансформации.

4.3.2. Математично моделиране на рака на дебелото черво. Johnston и съавтори в [18, 19] предлагат един модел и дискутират неговите параметри и адекватност. Параметрите на годишно структурирания модел са пропорции на броя на стволовите клетки в криптата, 0N ; броя на полу-диференцируемите клетки, 1N ; и броя на напълно-диференцируемите клетки, 2N . Параметрите на непрекъснатия модел са скорости с размерност часове-1. По-долу на фигура 4.15, е показана схема на крипта в дебелото черво.

Фигура 4.15. Илюстрация на крипта в дебелото черво: стволовите клетки преминават в полу-

диференцируеми клетки, които след диференциране се превръщат в напълно-диференцируеми клетки. (Взета от [16, 17]).

Съгласно фигура 4.15 се получава динамичен модел от три обикновени

диференциални уравнения. Според [16], в този модел могат да бъдат включени дискретни времезакъснения 1τ и 2τ - виж Фиг. 4.16. Така се получава: Фигура 4.16. Сатурираща обратна връзка.

N0

-(α2+α1)N1

α3 –delay τ2

N2

-(β1+β2)

β3 –delay τ1

46

(4.64)

( ) ( ) ( )( )

( ) ( ) ( )( )

( )( )

( )( ) ,1

,11

,1

111

12

11212

2

200

2200

111

12

1111312102

1

200

2200

2030210

ττ

γβ

ττ

ττ

τβββα

ττ

τααα

−+−

+−=

−+−

+−+

−−−++−=

−+−

−−++−=

tNmtNkNN

dtdN

tNmtNk

tNmtNktNNN

dtdN

tNmtNktNN

dtdN

където 1α , 2α , 3α , 1β , 2β и 3β представляват скоростни константи. 4.3.3.2.1 Устойчивостта като функция на времезакъсненията. Характеристичното уравнение след линеаризиране на системата (4.64) в равновесното състояние

⎟⎠⎞

⎜⎝⎛ >>> 0,0,0

_

2

_

10

__

NNNE , има вида:

(4.67) ( )[ ]++++=+++ − γχγχχχχ χτ4114

2432

21

3 1 aaaaaKKK l + ( ) ( )[ ] ( )( ).4242212212

22

212 γχγββχγββχ ττχχτ aaaaaaa −−++++++ +−− ll Тук ( )( ) ( )γββγββγγββ 2113121122111 ;; +=+++=+++= aKaaKaK . При анализа отново ще се използва методът за определяне на устойчивостта на равновесното състояние, когато едното от времезакъсненията е равно на нула [27, 35]. Така се приема, че ограниченото времезакъснение 2τ на подновяване на стволовите клетки е по-дълго от времето за подновяване на полу-диференцираните клетки, 1τ . Случай при 01 =τ , 02 >τ . Поставяйки 01 =τ в (4.67), за характеристичното уравнение се получава: (4.68) ( )21

223021

212

3 2 TTaKKK ++=+++ − χχχχχ χτl , където

(4.69) ( )

( ) ( ) .,,,,

4212242121

41330142214112

γββγββγγ

aaTaaTaaKKaaKKaKK

−+=−++=−=+−=−=

Добре е известно, че за голямо времезакъснение 2τ (а в нашия случай 2τ е между 24 и 96 часа) линейно устойчивия анализ не е приложим и е необходим друг подход [8, 28]. Приемайки, че ( )Rnminm ∈+= ,χ , то (4.68) може да се запише в термините на неговата реална и имагинерна части като:

(4.70)

( ) ( )[( ) ( ) ]

( )[( ) ( ) .sinsin

cos223,sin2cos

cos3

221222

2

21221123

212221

222

2302122

1223

2

2

τττ

τττ

τ

τ

nTmTnmnanTmannKmnKmnn

nTmannTmTnnmaKmKnmKmnm

m

m

+−−+

++=+++−

+++++−=++−+−

−

−

l

l

Нека b2τ бъде такова, че ( ) 02 == b

b mm τ . Тогава уравненията (4.70) се редуцират до

(4.71) ( )

( ) .sincos,sincos

222

221213

2122

22302

12

bbb

bbbbb

bbb

bbbb

nTnanTnnKnnTnnnaTKnKττττ

−+=+−

+−=+−

След повдигане на квадрат на двете уравнения в (4.71) и последващо събиране, се получава: (4.72) ( ) ( ) .0222 2

302

222

1301222221

42221

212

6 =+−−−++−−+ KTnTKKTaKnaKKn bbb

47

Когато ⎟⎠⎞

⎜⎝⎛ >>> 0,0,0

_

2

_

10

__

NNNE е локално асимптотично устойчиво за 02 =τ , то за

уравнението (4.73) ( ) ( ) ( ) 0230121

2221

3 =−+−+−+ TKTKaK χχχ са в сила условията на Раус-Хурвитц за кубичен полином. Съгласно [18] е в сила следната Лема: Лема 4.1. (I) Необходимите и достатъчни условия за кубичното уравнение (4.74) 032

21

3 =+++ bbb λλλ да има поне един прост положителен корен за λ са: (i) (a) 0,0 21 ≥< bb , 02 ≥b , и 2

21 3bb > или (b) 02 <b ; и (ii) 01 <Δ .

(II) Необходимите и достатъчни условия за кубичното уравнение (4.74) да има неположителни реални корени за λ са, (i) ,3 2

12 bb > (ii) 2123 bb = , (iii) 2

21 3bb > и 01 >Δ или (iv) 2

21 3bb > и 01 ≤Δ , 01 >b и

.02 >b Ако уравнението (4.72) има неположителни реални корени, то тогава

( ) 02 ≠τm за произволно 2τ . От това, че равновесното състояние

⎟⎠⎞

⎜⎝⎛ >>> 0,0,0

_

2

_

10

__

NNNE е локално асимптотично устойчиво (когато 02 =τ ), то

корените на характеристичното уравнение имат отрицателни реални части. От тук, ако ( ) ( ) ( )222 τττχ inm += е корен на (4.68), то трябва ( ) 02 <τm за всички 02 ≥τ . Така,

равновесното състояние _

E е локално асимптотично устойчиво за всички 2τ . Този извод може да бъде обобщен в следната теорема: Теорема 4.5. Нека условията на Лема 4.1 (I) са изпълнени и bn е последният прост положителен корен на уравнение (4.72). Тогава се появява бифуркация на Андронов-Хопф, когато 2τ преминава през b

2τ . От друга страна, ако са в сила условията на Лема 4.1, то тогава уравнение(4.72) има неположителни реални корени и

равновесното състояние ⎟⎠⎞

⎜⎝⎛ >>> 0,0,0

_

2

_

10

__

NNNE е локално асимптотично

устойчиво за всички стойности на 2τ . Случай при 0, 21 >ττ . В този случай се доказва, че: Теорема 4.6. Ако всички корени на (4.68) имат отрицателни реални части за 02 >τ , то тогава съществува ( ) 021 >ττ b такова, че всички корени на характеристичното уравнение (4.67) имат отрицателни реални части за ( )211 τττ b< , т.е. когато

( )[ )211 ,0 τττ b∈ . 4.3.4. Числен анализ на времезакъснителния модел. Получените резултати в предишната подточка ни дават възможност да предскажем, как с промяната на параметрите на модела (4.64) ще се изменя и поведението му.

На фигура 4.19 са показани устойчивите решения на броя на стволовите клетки 0N в криптата, броят 1N на полу-диференцираните клетки и броят 2N на напълно-

диференцираните клетки, когато 21 =τ и 362 =τ . С други думи, в този случай са в

48

сила условията на лема 4.1 (II) и съгласно втората част на теорема 4.5, равновесното състояние на системата (4.64) е локално асимптотично устойчиво за всички стойности на 2τ . При симулациите се използваха следните фиксирани стойности за параметрите:

(4.75) .0004.0,0003.0,1.0,139.0,397.0,69.0,3.0,1.0

1100

332211

===========

mkmkγβαβαβα

Фигура 4.19. Устойчиви решения на системата (4.64) за 21 =τ и 362 =τ . Времето е в часове.

4.3.5. Изводи Математичното моделиране на рака на дебелото черво е изключително важно

за откриване и напълно разбиране на механизмите на възникване и равитие на това заболяване. Появата на този вид рак се разглежда като резултат от серия изменения на генетично и епигенетично нива в соматичните клетки. Моделите на рака на дебелото черво разгледани тук отчитат тази доктрина чрез включването на времезакъснение в подновяването на стволовите и полу-диференцираните клетки в една определена крипта на дебелото черво (на англ. colon crypt). Основен (важен) извод от направения анализ е факта, че за възникването на авто-трептения (осцилаци с постоянна амплитуда) е необходимо не само включване на времезакъснения в подновяването на стволовите и полу-диференцираните клетки, а и включване на нелинейна зависимост на нарастване в нетната скорост на тези две популации.

4.4. Модел на микро-РНК с две закъснения

4.4.1. Общи положения и математично моделиране. Микро-РНК веригите са комплексни нелинейни системи. Комплексността е резултат от наличието на обратни връзки, относително големият брой на включените в тях протеини и нелинейното естество на връзките между отделните протеини.

Приема се, че системата действа като обратна връзка, където протеинът 2y , контролира собствения си синтез чрез репресия (потискане) на матричната РНК (mRNA) 1y . Съгласно [38], съществуват два възможни начина, при които микро-РНК играе съществена роля в генната експресия. Първият е, че микро-РНК може да ускори деградирането на мРНК, докато другият е, че тя може да репресира транслацията чрез формиране на замълчаващи (потискащи) комплекси (виж Фиг.

N1

49

4.22). Тук се конструира едно уравнение, което описва скоростната промяна на концентрацията на микро-РНК 3y , като се вземе под внимание само първият механизъм (т.е. микро-РНК ускорява деградирането на мРНК). Приема се също, че продукцията на микро-РНК става при постоянна скорост l, а се дефинира 6k като нейна скорост на деградация. Съгласно първия механизъм, се добавя един допълнителен член на деградация 314 yyk От тук системата се представя в следния вид:

(4.76)

( )

( )

,

,

,

314363

222152

314111232

11

1

yykykldtdy

ytykdtdy

yykytykk

kdtdy

n

−−=

−−=

−−−+

=

γτ

γτ

Фигура 4.22. Схема на контрол на протеиновия синтез чрез времезакъснителна отрицателна

обратна връзка. където 1τ е времезакъснението за транслация, 2τ е времезакъснението за транскрипция, 1n е коефициентът на Хил, ( )6...,,1=iki и 21, γγ са скоростни константи. Съгласно [39] 21 =n . 4.4.2. Бифуркационен анализ. Системата (4.76) има една физиологично валидна

фиксирана точка ⎟⎠⎞

⎜⎝⎛= 3

_

2

_

1

_

,, yyyE . В случая, когато 21 =n характеристичното

уравнение на (4.76) в околността на това равновесно състояние има вида: (4.82) ( ),2132

21

3 TTKKK +=+++ − χχχχ χτl където

(4.83) ( ) ( )

.,,,,,

216252251

536123536212122611

τττγγγγ

+=−=−=−=−++=++=

cckTckTccccKcccccKccK

gene

mRNA

protein

Време- закъснителна обратна връзка

miRNA

mRNA

RISC

τ2

τ1

50

Случай при 0=τ . Ясно е, че при 021 === τττ , характеристичното уравнение (4.82) може да бъде записано като полимиално уравнение от трета степен, т.е. (4.84) .03121

21

3 =+++ KKK χχχ В този случай, множеството от необходимите и достатъчни условия за всички корени на (4.84) да имат отрицателна реална част, се дава от критерия на Раус-Хурвиц във вида: (4.85) ,0,0,0,0 3121131211 >−>>> KKKKKK където 1221 TKK −= и 2331 TKK −= . Вижда се, че 1K , 21K и 31K са винаги положителни. Случай при 021 >+= τττ . Нека inm +=χ и тогава (4.82) се презаписва в термините на реалната и имагинерната си части, т.е.

(4.86) ( ) ( )

( ).sinsincos23,cossincos3

2112123

2113222

123

ττττττ

τ

τ

nTnmTnnTnKmnKnmnnTnnTnmTKmKnmKmnm

m

m

−−=+++−

++=++−+−−

−

l

l

За да се намери първата бифуркационна точка, първоначално се проверява за съществуване на чисто имагинерни корени in±=χ на (4.82), т.е. приема се, че

0=m . Тогава, горните две уравнения се редуцират до следното:

(4.87) .cossin,sincos

1223

1232

1

ττττ

nnTnTnKnnnTnTKnK

+−=+−

+=+−

След повдигане на квадрат на двете уравнения в (4.87) и събирането им, се получава (4.89) ( ) ( ) .022 2

32

222

13122

42

21

6 =+−−−+−+ KTnTKKKnKKn Вижда се, че (4.89) е кубично уравнение относно 2n и описва устойчивостта на системата. На базата на получените тук резултати се дефинира следната теорема: Теорема 4.7. Ако bn е последният положителен прост корен на (4.89), то тогава се появява бифуркация на Андронов-Хопф, когато τ преминава през bτ . 4.4.3. Числен анализ. Някои от съответните числени стойности на моделните параметри са взети от [27, 38] и имат вида:

(4.96) [ ] [ ] [ ] [ ][ ] [ ] [ ] [ ] [ ].35,12,8,1,min2.0,min1.0,min3.0

,min5.0,min01.0,min1,min3.0

211

21

11

6

15

14

132

11

∈∈===

=====−−−

−−−−

ττγγkkkkkk

За параметъра l липсват стойности в научната литература. Ето защо тук се варира с неговите стойности в следния интервал в минути- [ ]35.0,1.0∈l . На фигура 4.23 се илюстрира зависимостта на поведението на модела от промяната в стойностите на времезакъсненията. Фигура 4.23 (ляв панел) показва симулация на динамиката на 21, yy и 3y , когато времезакъснението 21 τττ += е по-малко от критичната.

51

Фигура. 4.23. Ляв панел: устойчиво решение на системата (4.76) за τ1=5, τ2=12 и 1.0=l ; десен

панел: периодично поведение (авто-трептене) на системата (4.76) за τ1=5, τ2=25 и 1.0=l .

(бифуркационната) си стойност. Системата (4.76) се намира в устойчивата зона на нейното параметрично пространство. От друга страна, фигура 4.23 (десен панел) показва динамиката на изследваната система, когато времезакъснението има стойност по-голяма от критичната bτ . Тук се наблюдават осцилиращи решения, с периоди изменящи се между 80-90 минути.

На следващата фигура 4.25 се демонстрира зависимостта на амплитудата на miRNA осцилациите от параметъра l. Този параметър определя продукцията на miRNA. Вижда се, че за по-големи негови стойности, амплитудата на трептенията (а също и нивото на осцилациите) е по-голяма, така нивото на miRNA регулирането е най-голямо за 35.0=l .

Фигура 4.25. Амплитуда и ниво на miRNA осцилациите получени от системата (4.76) за

35.0;25.0;1.0=l .

4.4.4. Изводи. В тази подточка беше разработен и изследван нов времезакъснителен модел с обратна връзка описващ регулирането с микро-РНК. Полученият модел е от три нелинейни диференциални уравнения с времезакъснения. Получената система е класически пример за изучаване на основните поведения на микро-РНК и

mRNA

protein

protein

l=0.1

l=0.25

52

генетичните регулаторни механизми. Основното приемане, че времезакъснението 21 τττ += е ключов фактор в динамичното поведение на системата (4.76) беше

направено на базата на аналитичните пресмятания и числените симулации. В този случай времезакъснението има дестабилизираща роля. От физиологична гледна точка, загубата на устойчивост може да бъде свързана с появата на нови конфигурации в регулаторната генна верига, което би могло да доведе системата до патологични състояния.

Глава пета. Модели с три закъснения 5.1. Основни положения и доказателства. През последните години в редица статии [5, 14, 35] се разглеждат системи с две или три дискретни времезакъснения. За случаите на повече от едно времезакъснение в уравненията, локалната теория за устойчивост не е напълно завършена. Липсва обобщена теория за стабилност и поява на бифуркация на Андронов-Хопф в система от три автономни обикновени диференциални уравнения с три дискретни времезакъснения. Тук се разглежда този въпрос. Нека имаме три-мерна система от автономни обикновени диференциални уравнения с три дискретни времезакъснения, т.е.

(5.1) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( )( )( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( )( )( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( )( ),,,,,,

,,,,,,,,,,,,

'

'

'

μξζηξζηξζ

−−−=

−−−=

−−−=

tztztytytxtxhtztztztytytxtxgtytztztytytxtxftx

където ( ) RRRRRRRhgfdtd →×××××= :,,,' .

5.1.1. Получаване на характеристичното уравнение Нека: 1) gf , и h са непрекъснати първи частни производни на техните

аргументи, и 2) съществува уникално равновесно състояние 0,0__

>> yx и 0_

>z ,

такова че .0,,,,,,,,,,,,,,,__________________

=⎟⎠⎞

⎜⎝⎛=⎟

⎠⎞

⎜⎝⎛=⎟

⎠⎞

⎜⎝⎛ zzyyxxhzzyyxxgzzyyxxf Вариационната

система относно равновесното състояние _

E има вида:

(5.2) ( )( )( )

( )( )( )

( )( )( )

.

642

642

642

531

531

531

'

⎟⎟⎟

⎠

⎞

⎜⎜⎜

⎝

⎛

−−−

⎟⎟⎟

⎠

⎞

⎜⎜⎜

⎝

⎛+

⎟⎟⎟

⎠

⎞

⎜⎜⎜

⎝

⎛

⎟⎟⎟

⎠

⎞

⎜⎜⎜

⎝

⎛=

⎟⎟⎟

⎠

⎞

⎜⎜⎜

⎝

⎛

ηρξζ

ρρ ttvtu

hhhgggfff

ttvtu

hhhgggfff

ttvtu

Търси се решение на (5.2) във вида ( ) ( ) tt ctvctu χχ ll 21 , == и ( ) .3tct χρ l= За

нетривиалните решения, това води до следното характеристично уравнение относно χ , т.е.

(5.3) ( ) ( )

( ) ( )( ) ( )( )( )( ) ( ) 0191812

171116101592

6

1482

51372

4322

13

=+++

++++++++

++++++++++

++−+−

+−+−−

−−

ηξζχηξχ

ηζχξζχχη

χξχζ

χχχχχχχχχχχχ

ll

lll

ll

aaaaaaaaaa

aaaaaaaaa

където

53

(5.4)

( ) ( )( ) ( ) ( )

( )( ) ( )

( ) ( ) ( )( ) ( ) ( )( ) ( ) ( )( ) ( ) ( )( ) ( ) ( )( ) ( ) ( )( ) ( ) ( )42246266246446219

41146166146446118

32236266236336217

42245255245445216

31136166136336115

41145155145445114

32235255235335213

466412266211244210

3616316945145148

25235327664524

3113515513533513

3553151353125311

,,,

,,,,,,

,,,,,,

,,,

hghgfhghgfhghgfahghgfhghgfhghgfahghgfhghgfhghgfahghgfhghgfhghgfa

hghgfhghgfhghgfahghgfhghgfhghgfahghgfhghgfhghgfa

hghgahfhfagfgfahghfgfhahggfhfga

hfgfhgfahagafahghgfhghgfhghgfa

hghghfgfhgfahgfa

−+−+−=−+−+−=−+−+−=−+−+−=−+−+−=−+−+−=−+−+−=−=−=−=

−−+=−−+=−−+=−=−=−=

−+−+−=−+−−+=++−=

Забележка 5.1. 0=χ е корен на (5.3), тогава и само тогава, ако .0191817161514133 ======== aaaaaaaa

Ако inm +=χ ( )Rnm ∈, удовлетворява (5.3), то тогава m и n са реални решения, т.е (5.3) може да се запише в термините на неговите реални и имагинерни части като: (5.5)

( ) ( )[( ) ] ( )[( ) ] ( )[( ) ] ( ) ( ) ( )( )[

( )] ( ) ( ) ( )( ) ( )[ ]( ) ( ) ( )( ) ( )[ ]

( ) ( )( )[

( ) ] ( )[( ) ] ( )[( ) ] ( ) ( ) ( )( )[

( )] ( ) ( ) ( )( ) ( )[ ]( ) ( ) ( )( ) ( )[ ]

( ) ( ) .0sinsinsincos

sinsincossinsincossinsincos

sincos2sinsincossincos2sinsincos

sincos223,0cos

cossincoscossincoscos

sincoscossincossin2coscossincossin2coscossincos

sin2cos3

19

1812

171116

10159

2266148

2255137

224421

32

19

1812

171116

10159

622

6148

522

5137

422

43222

123

=++−

−+−+−++

++−+−+++−

−+−++−−+

+−−+−−+

+−−+−−+

+−−+++−

=+++

++++++

+++++++++

++++++++

++−++++

++−++++

++−+++−+−

++−

+−

+−

+−

−

−

−

++−

+−

+−

+−

−

−

−

ηξζηξηξηξ

ηζηζηζξζξζξζηηη

ηηξξξξξζζζ

ζζηξζ

ηξηξηξηζηζηζξζξζξζηηη

ηηξξξξξζζζ

ζζ

ηξζ

ηξ

ηζ

ξζ

η

ξ

ζ

ηξζ

ηξ

ηζ

ξζ

η

ξ

ζ

nananmna

nanmnnananmnnananmnna

nnmanmnananmnnannmanmnananmnna

nnmanmnanamnannmna

nannnmanannnmana

nnnmanannnmanmnannmanannnmanmnannmanannnma

nmnannmaamanmamnm

m

m

m

m

m

m

m

m

m

m

m

m

m

m

l

l

l

l

l

l

l

l

l

l

l

l

l

l

При липса на времезакъснения, то _

E е локално асимптотично устойчиво, ако

(5.6) .0,0

,0,0

191817161514133

12111098726541

>−=>+++++++=>++++++=>+++=

rpqRaaaaaaaaraaaaaaaqaaaap

Тук при анализа се използва следният подход за определяне на стабилността на равновесното състояние: първо двете времезакъснения са равни на нула, след това

54

само едното е равно на нула, а най-накрая и трите времезакъснения са различни от нула. 5.1.2. Случай, при който ,0== ξζ и 0>η . След заместване на 0== ξζ в (5.3), за системата (5.5) се получава:

(5.7)

( )( ) ( )( )[ ]

( ) ( )( )[ ] ,0sinsincos23

,0sin2cossincos3

22621

2432

622

621

3222

123

=−+−−+

+++−

=+−++++

+++−+−

−

−

nmaTnnmnnTnKmnKnnm

nmnanmaTnnnnmTKmKnmKmnm

m

m

ηηη

ηηηη

η

η

l

l

където

(5.8) .,,,,,

19181715212119165414

161413331087225411

aaaaTaaaTaaaaKaaaaKaaaaKaaaK

+++=++=+++=+++=+++=++=

При намирането на първата бифуркационна точка, се търсят чисто имагинерни корени Rnin ∈±= ,χ на (5.3) (когато 0== ξζ ), т.е. приема се, че .0=m Тогава, горните две уравнения се редуцират до вида:

(5.9) ( )( ) .sincos

,cossin2

62123

26213

21

ηηηη

nnaTnnTnKnnnaTnnTKnK

−+−=+−

−−−=+−

След повдигане на квадрат на уравненията в системата (5.9) и последващо тяхно събиране, то се получава: (5.11) ( ) ( ) .0222 2

223

226

2131

22

4262

21

6 =−++−−+−−+ TKnTaTKKKnaKKn Уравнение (5.11) е кубичен полином относно 2n и лявата му страна е положителна за много големи стойности на 2n , както и за 0=n . Допускайки, че условията на Лема 1(I) в [28] са удовлетворени, то тогава (5.11) има поне един положителен прост реален корен. За да се приложи теоремата на Хопф [28], то трябва да е в сила следната теорема: Теорема 5.1. Нека bn е последният положителен прост корен на (5.11). Тогава, ( ) bb inin =η е прост корен на (5.3) (за 0== ξζ ), а ( ) ( )ηη inm + е диференцируемо

относно η в дадена малка околност на bηη = . За да съществува бифуркация на Андронов-Хопф за bηη = , то трябва да се

покаже, че е удовлетворено трансверсалното условие 0≠= b

ddm

ηηη

.

Съгласно теоремата на Хопф [18], тук се дефинира следната Теорема 5.2, т.е. Теорема 5.2. Ако bn е последният положителен корен на (5.11), то тогава се появява бифуркация на Андронов-Хопф, когато η преминава през bη .

Следствие 5.2. Когато bηη < , то тогава равновесното състояние _

E на системата (5.1) е локално асимптотично устойчиво. 5.1.3. Случай, при който 0,;0 >= ηξζ . Нека се върнем към изучаване на (5.3), когато 0, >ηξ . То в този случай ще има вида: (5.19)

( ) ( ) ( ) ,0712652

6432

5652

413 321 =++++++++++++ −−− TaTTaTTaKKK χχχχχχχχ χτχτχτ lll

55

където ,,,,,, 119516144108313367254141 aaTaaTaaTaaKaaKaaK +=+=+=+=+=+=

1918717156 , aaTaaT +=+= , а [ ]Tηξτητξττ +==== 321 ,, . ( )0>nin е корен на (5.19), тогава и само тогава, ако n удовлетворява равенството:

(5.20) ( )( )

( )( ) ( )( ) .0sincossincossincos

71233652

622

432

511652

413

=+−+++−−+

+++−−+++−−

TnianinTniTnaninTniTnaninKniKnKinττττ

ττ

След извършване на някои математични действия и преобразувания се получава: (5.22)

( ) ( )[ ]( )( ) ( )( )[

( )( ) ( ) ( ) ( )( ) ( ) ( )].cossin

sincossincossincos2

22

212

53212

663

2142

552162

642

5

3731252

3123762

412

726

2646645

25

23

212

25

45

26

25

241

6

ττττττττ

ττττ

−+−−+

+−−+−−−+

+−−++−=++

+−++−−++−−−+

nnTTnnaTnTnTnanTnTnaTna

nTnnaKnnnnanTKnKTKnKKTaTaTTaKnKaaKn

След съответното реаранжиране на членовете, то може да се запише така: (5.26)( ) ( ) ( ) ( )

( ) ( ) ( ) ( )( ) .2

72

62

422

1222

53

22663

2

542

5

2

62

642

522

52

3

2

62

6

2

42

5

2

712522

12762

41

TTTaTT

aTTTTaTaTaTT

TaTaTaKaTKK

++++++

+−+++−+−+−>++

+−+−+−−−++−−

ωω

ωωωωωωω

ωωωωωωω

От тук може да бъде дефинирана следната теорема: Теорема 5.3. Нека 0... 1914133 ≠++++ aaaa и е в сила (5.26). Тогава, няма изменение

в устойчивостта на _

E . Забележка 5.2. Ако ηξ = , то характеристичното уравнение (5.19) придобива вида: (5.27) ( ) ( ) ,0712

24635

25665

241

3 11 =++++++++ −− TaTTTKKK χχχχχχ χτχτ ll където 53356556 , TTTaaT +=+= , а 6446 TTT += . Следователно, този случай е частен на Теорема 5.3. Следствие 5.3. Ако условията на Теорема 5.3 не са валидни и bif

2τ е дефинирано както в Теорема 5.2, то съгласно Лема 5.1, за произволно [ )bττ ,02 ∈ , съществува

( ) 023 >ττ bif ( ( ) 021 >ττ bif респективно) такова, че равновесното състояние _

E на системата (5.1) е неустойчиво, когато ( )[ )233 ,0 τττ bif∈ ( ( )[ )211 ,0 τττ bif∈ респективно), и бифуркацията на Андронов-Хопф се появява. 5.1.4. Основен случай 0,, >ηξζ . Приема се, че ( )0>= ninχ е корен на (5.3) тогава и само тогава, ако n удовлетворява

(5.28)

( )( )( )( ) ( )( )( )( ) ( )( )( )( ) ( ) ,0sincossincos

sincossincossincossincos

sincos

7719181266

17115516644

1592

6331482

522

1372

411322

13

=−++−+++−++−+

+++−−+++−−+

+++−−+++−−

ττττττττ

ττττττ

ninaanianinanianinanianin

aniananinaniananinaniananinanianain

56

където с [ ]Tηξζτηξτηζτξζτητξτζττ ++=+=+=+===== 7654321 ,,,,,, е

отбелязана една точка от времезакъснителното пространство, т.е. 7+⊂Ω∈ Rτ . След

разделяне на реалната и имагинерни части се получава:

(5.29) ,sin,cos

71922222223

71911111132

1

ττ

naFEDCBAnannaFEDCBAana

+++=++++−

−−−−=−−−+−

където

(5.30)

( ) ( )( )

( ) ( )( )

.sincos,sincos,sincos,cossin

,cossin,cossin,cossin,cossin

,cossin,sincos,sincos,sincos

61861225175112

4164102393152

62

282142

52171132

42

61861215175111

4164101393152

61

282142

51171132

41

ττττττττ

ττττττττ

ττττττττ

nannaFnannaEnannaDnnananaC

nnananaBnnananaAnannaFnannaE

nannaDnnananaCnnananaBnnananaA

−=−=−=+−=

+−=+−=

+=+=+=−−=

−−=−−=

След събиране на повдигнатите на квадрат уравнения в (5.29) се получава: (5.31)

( ) ( ) ( )[ ]( ) ( )[ ] ( )

( ) ( ) ( )[ ] ( )( ) ( )[ ] ( )

( ) ( ) ( )[ ] ( )[( ) ( ) ( ) ( ) ( )[ ]

( ) ( )[ ] ( ) ( )[ ]( ) ( ) ( ) ( )[ ] ( )[

( )] ( ) ( )[ ] ( )[( ) ( )] ( ) ( ) ( ) ( )[ ]

( ) ( )[ ] ( ) ( )[ ]( ) ( ) ( )[ ] ( ) ( )[

( )] ( ) ( ) ( )[ ]( ) ( ) ( )[ ]321183211232

32117321113132116

32110211932142

53289

32173211163217321110

32142

5328152

631132

4

317931123118163118

31121031132

4317152

6

21182112112112211817

21132

4217142

5323

32

139323

32

13152

6

31631019223

22

138

21721119223

22

13142

5

11811219123

12

137

123

12

13132

432

24

16

sincossinsincossinsin

cossin4sincoscossinsincoscossinsincossincossin

coscossinsincossincos

cossincossinsincos

cossincossincossinsincos

cossincossinsincos2

τττττττττττττττττττ

τττττττττττττττττττττττττττττττ

ττττττττττττττ

ττττττττττττ

ττττττττττ

++−+++++++−++++++−

−++++−−+−−

−−−−−−+−++−−−−−+−−+

+−−−−−+−++−+−−−−−+

+−+−+−−−++−−−−−++−+

+−++−−−−+

++++−+−+

++++−−−−+

++++−+−+

++−−−−=+++

nannannannanna

nnanananannananannaanannanananannaanananannanannanaana

nnanananannaananannanannanaa

nanannaanannannnaanannannnaaana

nannaannannnaananannaannannnaaana

nannaannannnaanannannnaaanaSnSnSn

където

(5.32)

( ) ( )( )

.,,2

,,,,2,2,2,2

219

218

217

216

215

214

213

233

212

211

210

29

28

27

2222

26

25

24

211

21653164325432176

312753216532174

aaaaaaaaSaaaaaaaSaaaaaS

−−−−+++=

−−−+++=−+++=

−=−−=−−=−++=+++=+++=+++=+

ττττττττττττττττττττττττττττττττ

След реаранжиране на членовете в (5.31) и извършване на съответните преобразувания може да се формулира следната теорема: Теорема 5.4. Нека 0... 1914133 ≠++++ aaaa и е валидно (5.37). Тогава, няма

промяна в устойчивостта на _

E . Забележка 5.3. Ако ηξζ == , то характеристичното уравнение (5.3) придобива вида:

57

(5.38) ( ) ( )[ ]

( )[ ] .0319181716121110

2

1514139872

654322

13

=+++++++

+++++++++++++−−

−

χηχη

χη

χχχχχχ

ll

l

aaaaaaaaaaaaaaaaaaa

От тук следва, че този случай е частен на Теорема 5.4. Следствие 5.4.

Ако условията на Теорема 5.4 не са изпълнени и bif3τ е дефинирано, както в

Теорема 5.2, то тогава съгласно Лема 5.1, за произволно [ )bττ ,03 ∈ , съществува ( ) 01 >ττ bif ( ( ) ( ) ( ) ;0;0;0 353432 >>> ττττττ bifbifbif ( ) ( ) 0;0 3736 >> ττττ bifbif , респективно)

такова, че равновесното състояние _

E на системата (5.1) е неустойчиво, когато ( )[ )311 ,0 τττ bif∈ ( ( )[ ) ( )[ ) ( )[ ) ( )[ );,0;,0;,0;,0 366355344322 ττττττττττττ bifbifbifbif ∈∈∈∈ ( )[ )377 ,0 τττ bif∈ , респективно), и бифуркацията на Андронов-Хопф се появява.

5.1.5. Изводи Тук беше разгледана обобщена система от три автономни ОДУ с три дискретни

закъснения. Допускайки, че системата притежава поне едно реално положително равновесно състояние, се изследва как влияе промяната в големината на времезакъсненията върху неговата(ите) локална асимптотична устойчивост. Беше получен критерии, при изпълнението на който не настъпва промяна в устойчивостта. Основното виждане, че времезакъсненията ξζ , и η са ключови фактори в динамиката на системата (5.1) беше потвърдено с помощта на аналитични пресмятания.

По-долу се разглежда един реален частен случай на системата (5.1), в който се потвърждава верността на резултатите получени и доказани тук.

5.2. Изследване на комплексното поведение на микро-РНК модел с три закъснения

5.2.1. Модел. В нашето изследване се използва моделът получен в подточка 4.4. (системата (4.76)), като той се модифицира чрез прибавяне на трето закъснение, 3τ , което представлява осредненото времезакъснение за деградация на микро-РНК (на англ. miRNA), т.е.

(5.39)

( )

( )

( ) ,

,

,

3143363

222152

314111232

11

1

yyktykldtdy

ytykdtdy

yykytykk

kdtdy

n

−−−=

−−=

−−−+

=

τ

γτ

γτ

където всички останали скоростни константи и променливи, са както при (4.76). 5.2.2. Качествен анализ. При изследването на бифуркационната структура на (5.39), се използват времезакъсненията 21,ττ или 3τ като бифуркационни параметри.

Фиксираните точки на системата (5.39), ⎟⎠⎞

⎜⎝⎛= 3

_

2

_

1

__

,, yyyE , са същите като тези в

подточка 4.4.2, т.е. съществува само една физиологично валидна фиксирана точка. Вижда се, че означенията от подточка 5.1.1 тук имат вида:

58

(5.43) .,,,,,

,,,0

666551235235

24114326541632

khchchgkgcfcfcfhhhggggfff

−=−=−=−==−=−=−===========

γ

Характеристичното уравнение на (5.41) има вида: (5.45) ( ) ( )( ) ( )321213

654322

1322

13 τττχττχχτ χχχχχχ ++−+−− +++++=+++ lll TTTTTTKKK ,

където

(5.46) ( ) ( )

( ) .,,,,,,;,

2656325525416231262

615132351231223121

ckkTcckTckTckTckTkTcccKccccKccK

−=−=−=−=+−=−=−=−++=++=

γγγγγγ

Забележка 5.4. Трябва да се отбележи, че 0=χ е корен на (5.45), тогава и само тогава, ако .06533 ==== TTTK Случай при .0,0 231 >== τττ Нека, ограниченото време на транскрипция 2τ е по-дълго от времезакъснението 1τ на транслация, и от ограниченото време 3τ на деградиране на miRNA . Заместваме 031 ==ττ в (5.45), и за характеристичното уравнение се получава: (5.48) ( ),5143121

211

3 2 TTKKK +=+++ − χχχχ χτl където (5.49) .,,, 6551333122211111 TTTTKKTKKTKK +=−=−=−= В този случай се доказва следната теорема: Теорема 5.6.

Ако bn е последният положителен корен на (5.53), то тогава се появява бифуркация на Андронов-Хопф, когато 2τ преминава през bτ . Следствие 5.6.

Когато bττ <2 , то тогава равновесното състояние _

E на системата (5.39) е локално асимптотично устойчиво.

Случай при .0,;0 321 >= τττ Връщаме се към изследването на (5.45), което при

0, 32 >ττ има вида: (5.63) ( ) ( ) ,2323

654322

1322

13 χτχτχτ χχχχχχ −−− +++++=+++ lll TTTTTTKKK

където [ ]T322332 ,, ττττττ +== представлява точка от времезакъснителното пространство, т.е. .3

+⊂Ω∈ Rτ В този случай е валидна следната теорема, която е частен случай на Теорема 5.3, т.е. Теорема 5.7. Нека 06533 ≠−−− TTTK и е изпълнено(5.70). Тогава не настъпва

промяна в устойчивостта на равновесното състояние _

E . Забележка 5.5. В специалния случай 32 ττ = , характеристичното уравнение (5.63) има вида: (5.71) ( ) ,22 2

635242

1322

13 χτχτ χχχχχ −− +++=+++ ll TTTTKKK

където 5335 TTT += , а .4224 TTT += Следователно, този случай е частен на Теорема 5.3.

59

Следствие 5.7. Ако условията на Теорема 5.7. (Теорема 5.3) не са изпълнени и bif

2´τ е дефинирано, както при Теорема 5.6 (Теорема 5.2), то тогава съгласно Лема 5.1, за произволно [ )bττ ,02 ∈ , съществува ( ) 0223 >ττ bif ( ( ) 021 >ττ bif респективно), такова че

равновесното състояние _

E на системата (5.39) е неустойчиво, когато ( )[ )233 ,0 τττ bif∈ ( ( )[ )211 ,0 τττ bif∈ респективно), и се появява бифуркация на Андронов-

Хопф.

Общ случай при .0,, 321 >τττ В този случай се доказва следната теорема: Tеорема 5.8. Нека са в сила 06533 ≠−−− TTTK и (5.79). Тогава не настъпва

промяна в устойчивото поведение на равновесното състояние _

E . Забележка 5.6.

В специалния случай, когато 321 τττ == , то характеристичното уравнение (5.45) придобива вида: (5.80) ( ) ( ) 333 3

6542

322

1322

13 χτχτχτ χχχχχχ −−− +++++=+++ lll TTTTTTKKK .

Ето защо, този случай е частен на Теорема 5.8 (Теорема 5.4). Следствие 5.8. Ако условията на Теорема 5.8 не са изпълнени и bif

3τ е дефинирано, както при Теорема 5.6, то тогава съгласно Лема 5.1 за произволно

[ )bττ ,03 ∈ съществува ( )( ) 031 >ττ bif ( ( ) ( ) ;0;0 3432 >> ττττ bifbif ( ) 035 >ττ bif респективно),

такова че равновесното състояние _

E на системата (5.39) е неустойчиво, когато ( )[ )311 ,0 τττ bif∈ ( ( )[ ) ( )[ ) ( )[ )355344322 ,0;,0;,0 τττττττττ bifbifbif ∈∈∈ респективно), и се

появява бифуркация на Андронов-Хопф. 5.2.3. Числен анализ. Стойностите на всички параметри (с изключение на закъснението 3τ ) са същите, както при модела от подточка 4.4- виж (4.96).

На фигура 5.2 са показани устойчивите решения на концентрацията на матричната РНК- mRNA ( 1y ), концентрацията на протеина ( 2y ) и концентрацията на микро-РНК- miRNA ( 3y ), при липса на времезакъснение, т.е. ( 0321 === τττ )- виж Фиг. 5.2, ляв панел, и за 12,0 231 === τττ - виж Фиг. 5.2, десен панел. В първия случай системата е в устойчивост, което отговаря на един нормален регулационен процес от страна на микро-РНК (miRNA). Това заключение е в съгласие с Теорема 5.6 (Следствие 5.6) доказана в предишната подточка.

60

Фигура 5.2. Устойчив режим на системата (5.39) за 0321 === τττ -десен панел и за

12,0 231 === τττ - десен панел. Параметрите на модела са: .1.0;2;05.0;5.0;2.0;1.0;1;3.0 165213241 ========== lnkkkkkk γγ

Времето е в минути.

На фигура 5.3 са показани случаите, когато се варира със стойностите на 2τ и

3τ . Вижда се, че за по-големи стойности на 2τ (виж Фиг. 5.3а) и 3τ (виж Фиг. 5.3б) от бифуркационните се появява устойчив граничен цикъл (авто-трептения), т.е. не са изпълнени условията на теорема 5.7 и теорема 5.8.

Фигура 5.3. Динамично поведение на системата (5.39). Неустойчив режим (периодични

осцилации) за 031 == ττ , 202 =τ (a); и 10,13,0 321 === τττ (б).

Моделът (5.39) демонстрира път към хаос, чрез удвояване на периода. При нарастване на 3τ , от 13 =τ (до 63 =τ ), системата (5.39) притежава осцилации с период едно. При по-нататъщно нарастване на 3τ , се появява утрояваща периода бифуркация, и за 3.83 >τ (до 93 =τ ) системата има само решения с период две. Най-накрая, за 93 >τ (след удвояващи периода бифуркации), поведението на системата става хаотично. С други думи, в този случай процесът на miRNA регулирането е също ненормален (на англ. abnormal), но е по сложен.

(a) (б)

61

Фигура 5.5. Бифуркационна диаграма на системата (5.39) за ,3.041 == kk ,132 == kk ,5.05 =k 3.06 =k , ,1.01 == lγ ,2.02 =γ 21 =n , ,51 =τ 202 =τ ,

[ ]785.10,13 ∈τ .

5.2.4. Изводи Основните изводи, които могат да се направят тук са: 1. Основното виждане, че времезакъсненията 21, ττ и 3τ са ключов фактор в динамичното поведение на системата беше потвърдено от аналитичните и числените пресмятания. 2. За времезакъснения по-големи от бифуркационните си стойности bτ , системата регулирана от микро-РНК, притежава периодично поведение. Следователно в този случай, времезакъсненията имат дестабилизираща роля. От физиологична гледна точка, загубата на устойчивост може да бъде свързана с появата на нови конфигурации в генно-регулационните вериги, водещи до патологични състояния. 4. За определена комбинация от стойности на закъснителните параметри на системата, тя притежава хаотично поведение.

5.3. Изследване ефектите на JAK2-STAT5 сигналното модулиране върху

еритропоезата

5.3.1. Еритропоеза и еритропоетин. Общи сведения. Еритропоезата е процес, при

който мултипотентните хематопоетични стволови клетки (HSC) под действие на

хормона еритропоетин (Epo) се диференцират в зрели безядрени еритроцити (виж

Фиг. 5.7). Чувствителността към Еро е в пряка зависимост от експресията на

еритропоетиновия рецептор, която се активира от най-ранния етап на развитие на

клетките предшественици- burst forming unit-erythroid (BFU-E).

y3

τ3

62

Фигура 5.7. Процес на еритропоезата.

5.3.1.1. Фактори включени в регулирането на еритропоезата. Еритропоезата се регулира от няколко цитокина. Растежните фактори участващи в еритропоезата са: granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF), interleukin (IL)-6, stem cell factor (SCF), IL-1, IL-3, IL-4, IL-9, IL-11, granulocyte-macrophage (GM)-CSF, insulin growth factor-1 (IGF-1), и Eро. 5.3.1.2. Eро рецептора. Eро се свързва със своя рецептор на клетъчната повърхност. Еро рецепторът се експресира основно между етапите на CFU-E и пронормобластта в развитието на еритроцитните клетки. 5.3.2. Времезакъснителен мултиразмерен модел отчитащ ефектите на JAK2-STAT5 сигналното модулиране на еритропоезата. През време на еритропоезата хематопоетичните стволови клетки (HSCs) се диференцират в зрели безядрени еритроцити под действието на хормона еритропоетин (Еро), като се образуват колониално формирани единици (CFUs). Процесът на диференциация и последваща пролиферация се контролира с помощта на обратна връзка включваща кислиродните нива в организма. Този процес се модулира чрез генериране на Еро (виж Фиг. 5.11). Обратната връзка осигурява баланс между продукцията на нови еритроцити в костния мозък и разрушаването на старите и повредени такива в дълака, като се гарантира необходимото количество кислород на човешкото тяло и мозък.

63

Фигура 5.11. Схема на обратна връзка контролираща диференциацията/пролиферацията на

червените кръвни клетки, през време на модулирането на нивата на хипоксия от хормона еритропоетин, който се произвижда/пренася с JAK2-STAT5 сигнализирането.

По-долу се моделира, калибрира и анализира числено един нов мултиразмерен модел от обикновени диференциални уравнения с постоянно времезакъснение. Базирайки се на количествени експериментални данни се изследват ефектите на JAK2-STAT5 сигналното модулиране върху пролиферацията на червените кръвни клетки. Освен това, моделът се използва за анализиране на това, какво влияние оказват патологичните ефекти на дерегулацията в нивата на Epo, рецепторния комплекс EpoR/JAK2 и STAT5 върху динамиката на еритроцитната популация. Този феномен може да се свърже с патологичните условия необходими за появата на няколко вида левкимиии и анемии. 5.3.3. Обобщен механоматематичен модел. Тук се моделира един обобщен мултиразмерен модел описващ физиологичните аспекти на еритропоезата, както и сигналните процеси протичащи в нея (виж Фиг. 5.12). В модела са отчетени три основни аспекти на еритропоезата: i) регулирането на диференциацията/пролиферацията на червените кръвни клетки става чрез стимулиране на Еро динамиката в пътеката JAK2-STAT5; ii) ефектите върху динамиката на еритроцитната клетъчна популация от страна на осреднения STAT5 става с помощта на опростен подмодел; и iii) за отчитането на осреднения синтез на хипоксията и кръвното ниво на хормона еритропоетин се използват нелинейни уравнения. Моделът включва осем диференциални уравнения имащи вида:

(5.81) EJEpoEpoEJEJdtd

inj ⋅−+⋅⋅−= 120 )( γγγ ,

64

(5.82) pEpJEpoEpoEJpEpJdtd

inj ⋅−+⋅⋅= 32 )( γγ ,

(5.83) ( ) DpSpEpJDpSDpSSDpSdtd

ncTOT ⋅−⋅⋅−⋅−⋅= 65 22 γγ ,

(5.84) ncnc DpSDpSDpSdtd

⋅−⋅= 46 γγ ,

(5.85) 2987 PCDpSPCPCPC

dtd

nc ⋅−⋅⋅−⋅= γγγ ,

(5.86) ( ) ( ) RBtDpStPCRBdtd

nc ⋅−−⋅−⋅= 1110 γττγ ,

(5.87) mEpoRB

mEpodtd

g⋅−= 13

12 γγ ,

(5.88) EpomEpoEpodtd

⋅−⋅= 1514 γγ ,

Фигура 5.12. Структура на обобщения мултиразмерен модел описващ ефектите на Epo

сигнализирането върху диференциацията и пролифирацията на озрели червени кръвни клетки.

65

5.3.4. Калибриране на модела. Определянето на числените стойности на параметрите на модела става по следния начин: i) от зрели прародителни (BAF3) клетки, чрез симулации, се определят параметрите в уравенията свързани с JAK2-STAT5 сигнализирането, т.е. уравнения (5.81-4)- виж Фиг. 5.13; ii) от публикуваните в научната литература данни се съставя времеви ред на хематокрита (RB), Epo и нивата на mEpo след като в мишки е индуцирана анемия; iii) параметърът γ2 се приспособява през определена стъпка.

Оценяването на параметрите и показването на симулациите се извършва с помощта на SBToolbox2 [29], който е в средата на Matlab. Времето за оценяване на параметрите е в минути. Стойностите на параметрите се намират в Таблица 5.1 от дисертацията.

0 50 100 1500

1

2

3

4

5

6

7

Time (min)

Ep

o (

un

its/m

l)

[Epo]

0 50 100 150 200 2500

0.2

0.4

0.6

0.8

1

Time (min.)

Obs

erva

bles

(nor

m. u

nits

)

[pEpoR]

0 50 100 150 200 2500

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4

Time (min.)

Obs

erva

bles

(nor

m. u

nits

)

[pSTAT5cyt

]

Фигура 5.13. Оценка на данните за уравненията на JAK2-STAT5 сигнализирането. Входен

сигнал (ляв панел): Експериментални данни (точките) и сплайна (черната плътна линия); централен панел: активиран рецепторен комплекс; десен панел: активиран цитозолен STAT5. Количествените данни- кръстовете за експеримент 1, и точките за експеримент 2, са сравнени с решението на модела (линиите).

За да се потвърди качествено ли е решението получено чрез параметричното

оценяване, то се извършва параметричен корелационен анализ с помощта на SBToolbox2 [29] функция за анализ на идентичността на даден параметър. На фигура 5.16 са показани стойностите на параметрите подредени в зависимост от корелацията им. Перфектната корелация (белите боксове) разположени по второстепенния диагонал са свързани с ефекта, който оказва върху себе си, за да се получи некорелиране (черните боксове).

5.3.5. Изводи

В тази подточка от дисертацията, се моделира и калибрира един нов мултиразмерен модел от ОДУ с постоянно времезакъснение, който се базира на количествени експериментални данни. При моделирането бяха получени уравнения отговарящи за: a) Epo-стимулираната активация на JAK2-STAT5 сигналната пътека в прародителите на червените кръвни клетки произведени в костния мозък; б) диференцирането на осреднения STAT5 на прародителите на червените кръвни клетки; и в) регулирането на осреднената хипоксия на хормона еритропоетин в различни кръвни нива.

66

γ 2 γ 7 γ 8 γ 9 γ 10

γ 11

γ 12

γ 13

γ 14

γ 15 g τ

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1τgγ15γ14γ13γ12γ11γ10γ9γ8γ7γ2

Фигура 5.16. Параметрично-корелационна матрица. Белият цвят е индикация за перфектно

корелиране, а черният цвят за липсваща корелация между параметрите.

5.4. Времезакъснителен мултиразмерен модел на еритропоезата с екзогенно инжектиране на Еро

Тук се модифицира полученият в предходната подточка 5.3 от дисертацията мултиразмерен модел, като се включват допълнителни уравнения, описващи инжектирането на екзогенен Еро- основно лечение при болни от анемия (Фиг. 5.17).

Фигура 5.17. Структура на математичния модел описващ Еро-зависимото сигнализиране в

процесите на диференциация и пролиферация на еритроцитите

Моделът включва шест ДУ имащи вида:

67

(5.89) EJEpoEJEJdtd

⋅−⋅⋅−= 120 γγγ ,

(5.90) pEpJEpoEJpEpJdtd

⋅−⋅⋅= 32 γγ ,

(5.91) ( ) DpSpEpJDpSDpSSDpSdtd

ncTOT ⋅−⋅⋅−⋅−⋅= 65 22 γγ ,

(5.92) ( )( )146 τγγ −⋅−⋅= tDpSDpSDpSdtd

ncnc ,

(5.93) ( ) ( )[ ] ( ) NNFtDpStNNdtd g

nc ⋅−⋅−⋅⋅−= 813735 γτγτ ,

(5.94) ( ) ( )tEpoNFEpodtd

injγγγ +⋅−= 1029 ,

където ( ) ( )31

11 11

1

τβ

−+=

tNkkNF gg

g

, ( ) ( )222 21

1τ−+

=tNk

NFg

, 1τ (в min) е времето на

престой на Stat5 в ядрото, 2τ (в min) е времето свързано със зависимия от хипоксия

процес на синтез, освобождаване и транспорт на Еро, 3τ (в дни) е закъснението

свързано с процесите на пролиферация и диференциация на еритроцитите от техните

предшественици. 1γ - 10γ , 21, kk и β са положителни константи, 21, gg и 5g са

кинетични членове.

5.4.1. Анализ на времезакъснителните ефекти върху устойчивостта на модела чрез бифуркационен анализ. Нека NyDpSyDpSypEpJyEJy nc ===== 54321 ,,,, , а

Epoy =6 . Така, след някои алгебрични пресмятания за фиксираните точки на системата (5.89)-(5.94) се получава: (5.95)

( )

( )( ) ( )

( )[ ]( ) ( )

( )( ) ( )[ ]( ) ( )

( )( ) ( )[ ]( ) ( )

,,0,2

,2

,,

10

91

6

_1

5

_

92101643964520

965201

4

_

92101643964520

954201

3

_

921013

9201

2

_

92101

1001

1

_

γγγ

γγγγγγγγγγγγγγγγγγγγγ

γγγγγγγγγγγγγγγγγγγγγ

γγγγγγγγγγ

γγγγγγγ

inj

injinj

injTOT

injinj

injTOT

inj

inj

inj

yyS

y

Sy

yy

+==

+++++

+=

+++++

+=

++

+=

++=

68

(5.96)

( ) ( ) ( )( )

( )( )

( ) ( ) ( )

( ) ( )

( )( )

( )

( )

( )

.,1

1,1

,2

,,2

,1

7

82

4

_

72

5

_

2

9

10

2

6

_3

8

2

4

_

71

2

5

_

64

62

4

_2

4

_

6

42

3

_

2

4

_

6465

2

4

_

642

2

_2

2

_

301

2

1

_

βγγ

γγ

γγβγ

γγγ

γγ

γγγγ

γγγγ

γ

>

⎥⎥⎥⎥⎥

⎦

⎤

⎢⎢⎢⎢⎢

⎣

⎡

+

⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛+

=−=

−+

==+−

=⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛−=

ytykyk

yyky

SSyyyyS

yyyy

inj

TOT

TOT

По-нататък, характеристичното уравенние на системата (5.89)-(5.94) се получава след като се направи линеаризация в околността на равновесното състояние, т.е.

(5.100) ( )( ) ( )

( ) ( ) ( ) ( ),212019182

173

164

15

2141312

211

310

49

58

2765

24

33

42

51

652

43

34

25

16

3231

213

21

TTTTTTTTTTTTTT

TTTTTTTKKKKKK

+++++++

++++++++

+++++++=

=++++++

+−+−

+−−

−−

χχχχχχχχχχχ

χχχχχχχχχχχχ

χττχττ

χττχτ

χτχτ

ll

ll

ll

където (5.101)

( ) ( ) ( )( ) ( ) ( )

( ) ( )( ) ( ) ( ) ( )[ ]( ) ( )( ) ( ) ( ) ( ) ( )[ ]

( ) ( )( ) ( ) ( )

( ).,,,,,

,,,,,,,,

,,,,,,

,,,,

,,

131785262117852620

961104319110964318103964176139416

9415175241497110631311097631261376376911

64107610636103191061103993117727

98611084361081101864351081038313644

1086108610836108314361108342

411081101876356110618786714346108

10876108610687637610861086103836313

10810866108361083121083611

ccccccTccccTcccTcccTccTcccT

cTcccTcccTcccTcccccTccccccTcccTcccccT

cTccTcccTccTccccTccT

TcccKcccccccKcccccccccccK

ccccKccK

−=−=−=+=+=++=

==−=+=−−−=+++++++=+++=−=

==++−=+++−=+++++++++−=++++−=

−=++=+++=++++++++++++++=

+++++++++=++++=

γγγγγγγγγγγγγ

γγγγγγγγγγγγγγγγγγγγγ

γγγγγγγγγγγγγγγγγγγγγγγγγγγγγγγγγ

γγγγγγγγγγγγγγγγγγγγγγγγγγγγγγγγγ

γγγγγγγγγγγγγ

Случай при 0321 === τττ . Нека 0321 === τττ . Тогава характеристичното уравнение (5.100) може да бъде записано като едно полимиално уравнение от шеста степен във вида: (5.102) ,0*

6*5

2*4

3*3

4*2

5*1

6 =++++++ KKKKKK χχχχχχ където (5.103)

.,,,,,

21191366*620181255

*5171411

744*4161033

*315922

*2811

*1

TTTTKKTTTTKKTTTTTKKTTTKKTTTKKTTKK

−−−−=−−−−=−−−

−−−=−−−=−−−=−−=

Съгласно критерия на Раус-Хурвиц може да се дефинира следната Лема:

Лема 5.2. Ако ,0* >ik 61÷=i , то тогава равновесните състояния (5.95) и (5.96) на системата (5.89)-(5.94) са локално асимптотично устойчиви.

69

Случай при 021 ==ττ и 03 >τ . Тук се разглежда случаят, при който 021 ==ττ и 03 >τ . Така, замествайки 021 ==ττ в (5.100), за характеристичното уравнение се

получава:

(5.105) ( ),542

33

24

15

8

652

43

34

25

16

3 MMMMMTBBBBBB

+++++=

=++++++− χχχχχ

χχχχχχχτl

където .,,

,,,,,,,,

2119135201812417113

161021591666555

147444333222111

TTTMTTTMTTMTTMTTMTKBTKB

TTTKBTKBTKBTKB

++=++=+=+=+=−=−=

−−−=−=−=−=

Използвайки утвърдената тук методика, се дефинира следната теорема:

Tеорема 5.10. Ако bn е последният положителен корен на (5.109), то тогава се появява бифуркация на Андронов-Хопф, когато 3τ преминава през bτ .

Следствие 5.10. Ако bττ <3 , то тогава равновесното състояние _

E ((5.95) или (5.96)) на системата (5.89)-(5.94) е локално асимптотично устойчиво.

Случай при .0,, 321 >τττ Сега се връщаме към изследването на (5.100), когато .0,, 321 >τττ Тук се доказва следната теорема:

Tеорема 5.11. Ако всички корени на (5.105) са с отрицателни реални части за 03 >τ , то тогава съществува ( ) 032 >ττ bif (или ( ) 031 >ττ bif ) такова, че всички корени на характеристичното уравнение (5.100) имат отрицателни реални части за

( )322 τττ bif< (или ( )311 τττ bif< ), т.е. когато ( )[ )322 ,0 τττ bif∈ (или ( )[ )311 ,0 τττ bif∈ ) респективно.

Следствие 5.11. Ако bif3τ е дефинирано, както в теорема 5.10, то тогава за

произволно [ )bττ ,03 ∈ , съществува ( ) 032 >ττ bif (или ( ) 031 >ττ bif такова, че

равновесното състояние _

E на системата (5.89)-(5.94) е локално асимптотично устойчиво, когато ( )[ )322 ,0 τττ bif∈ (или ( )[ )311 ,0 τττ bif∈ ).

5.4.2. Числени симулации на ефектите на Еро-дозираното модулиране върху регулирането на Stat5 и ЕроR. На фигура 5.18 е показан ефектът от модулирането на STOT и 0y върху средната стойност на клетъчната популация, N. С намаляването на регулацията на един от двата параметъра, се намалява и средната стойност на N, което се тълкува като редукция в хематокритните нива на индивида. Получените резултати са интересни, тъй като комбинираната силно увеличаваща се регулация на двата параметъра предизвиква значително повишаване на средната стойност на N, като се появяват продължителни трептения с голям период от няколко дни.

70

Mean Value plot of N

10-1 100 101

γ10

γ 8

10

15

20

25

30

35

40101

10-1

100

Фигура 5.18. Симулация на средната стойност на клетъчната популация N при различни стойности на параметрите STOT и y0.

От фигура 5.19 се вижда, че необходимостта от продължително инжектиране

на Еро се увеличава, когато намаляващата регулация на STOT или рекрутирането от EpoR са повишени. Двата ефекта се допълват и е необходимо да се вкара по-голямо количество инжектиран Еро за възстановяване на нормалните стойности, когато двата параметъра са намаляващо регулирани по едно и също време. Бялата част на фигура 5.19 представлява интервала от стойности на намаляващата регулация на STOT и y0, за които продължителното инжектиране на Еро (в определения физиологичен интервал) е недостатъчно за възстановяване на първоначалното средно число на популацията от кръвни клетки.

0.1 0.25 0.5 10.1

0.25

0.5

1

γ0 (normalized)

Required continuos Epo injection (normalized)

Sto

t (n

orm

aliz

ed

)

0

2

4

6

8

10

Фигура 5.19. Минимална стойност на постоянно инжектиране на Еро- yinj, необходимо за възстановяване на първоначалната стойност на средното число на еритроцитната популация N.

71

5.4.3. Изводи

Тук беше изследван качествено и количествено един мултиразмерен модел, модификация на обобщения модел от подточка 5.3.3. Допълнителното разширение представлява включването на уравнения отговарящи на инжектирания екзогенен Еро.

Бяха изследвани две особености на модела: 1. Анализ на промените в стабилността на системата вследствие на наличието на времезакъснение.

Нашите анализи показват, че други, по-малки времезакъснения, включени в нашия модел, свързани с ядрено-цитоплазмената совалка на Stat5 или влиянието на хипоксията върху контрола на синтеза на Еро, са недостатъчни за индукция на собствени осцилации в системата.

2. Анализ ефектите от намаляващата регулация на субклетъчно ниво на ЕроR и Stat5 върху динамиката на еритроцитната популация.

В резултат на направените анализи и симулации на директния ефект от намаляващата регулация на основната стойност на циркулиращите еритроцити, N, стана ясно, че с намаляването на регулирането на един от двата параметъра, силно се понижава стойността на N, което може да се разглежда като патологично понижаване на хематокрита на даден индивид. За компенсиране на редукцията на хематокрита, беше симулиран ефект на инжектиране на екзогенен Еро в системата, при по-различни експериментални условия.

5.5. Интегриране на чувствителния и бифуркационен анализи за определяне на

критичните процеси в един модел комбинаращ сигналната и клетъчно популационната динамика

В тази подточка на дисертацията се изследва мултиразмерен модел комбиниращ сигналната и клетъчната популационна динамика. Съгласно фигура 5.22, този модел има математичен запис подобен с този на модела (5.89)-(5.94). Единствената разлика е само в последното уравнение описващо изменението на концентрацията на еритропоетина, т.е.

(5.119) ( ) EpoNFEpodtd

⋅−= 1029 γγ ,

където ( ) ( )222 21

1τ−+

=tNk

NFg

.

Основната цел тук е да се покаже, как в действителност може да се приложи подхода предложен в точка 2.1 от дисертацията, т.е. интегрирана стратегия за определяне на критични биохимични процеси в сигналните пътеки, като се разкрият неговите основни предимства. Освен това се интересуваме и от ефектите на свръх експресията и/или намаляващото регулиране на Epo рецептора, и STAT5 транскрипционния фактор, върху динамиката на червените кръвни клетки.

Следвайки представената методика в точка 2.1, то първата стъпка в нея е извършването на чувствителен анализ (на англ. Sensitivity analysis). 5.5.1. Чувствителен анализ. Изледването на чувствителността на модела при варирането на неговите параметри става за два различни изхода на системата: разпадането на активирания STAT5 в клетъчното ядро (DpSnc) и поведението на популацията на пролиферираните еритропоетични клетки (N).

72

Фигура 5.22. Структура на математичния модел описваш Epo сигнализирането отнесено към

диференциацията и пролиферецията на червените кръвни клетки.

Първо се изучава закъснението 3τ . При анализа се запазват стойностите на всички останали параметри на модела в техните номинални стойности, а се модифицира 3τ от много малки (нереалистични) времезакъснения до много големи закъснения, в патологичните случаи. Интервалът за физиологично приемливото изменение на 3τ е от три до осем дена. Чувствителността на DpSnc беше пресметната за няколко релевантни стойности и е показана на фигури 5.23 и 5.24. Всеки стълб представлява множество от чувствителности пресметнати за дадената стойност на времезакъснението 3τ , която сума е взета в предвид при сравняването на чувствителността за различни стойности на изследвания параметър. В резултат от нашия чувствителен анализ, по-долу е показан списъка със съществено критичните параметри (SARK) на модела, т.е.

,,,,,,,,, 057431083 γγγγγγγτ TOTSSARK = .

Системата е екстремно (съществено) чувствителна спрямо варирането на γ8 и 3τ , като за 3τ това важи за границите дискутирани по-горе. Вторият по важност параметър е 10γ , който е свързан със скоростта на деградация на Epo.

73

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 150

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1

τ3 (days)

Sen

sitiv

ity In

dex

γ0

γ1

γ2

γ3

γ4

γ5

γ6

γ7

γ8

γ9

γ10

Stot

τ3

τ2

Фигура 5.23. Чувствителност на променливата DpSnc относно промените на

времезакъснението свързано с процесите на клетъчната диференциация-пролиферация ( 3τ ).

DpSnc N

0.1 0.25 0.5 1 2.5 5 10

0.1

0.25

0.5

1

2.5

5

10

γ 0

Stot

γ

0

γ1

γ2

γ3

γ4

γ5

γ6

γ7

γ8

γ9

γ10

Sto

τ3

τ2

0.1 0.25 0.5 1 2.5 5 10

0.1

0.25

0.5

1

2.5

5

10

γ 0

Stot

γ0

γ1

γ2

γ3

γ4

γ5

γ6

γ7

γ8

γ9

γ10

Sto

τ3

τ2

Фигура 5.24. Чувствителност на променливите DpSnc и N относно промените на нивата на експресия на EpoR (γ0) и STAT5 (Stot). Стойностите на параметрите са нормализирани относно оригиналните получени в [33].

74

Всички останали параметри в SARK са в тесния интервал на много близки средни стойности на чувствителност. На основата на съществуващата биологична информация, то се създава втори параметричен списък (BFL) включващ тези параметри, промените в стойностите на които са потенциално свързани с патологични условия, такива като левкемия или други заболявания на кръвта, т.е.

8103620 ,,,,,, γγτγγγ TOTSBFL = . За извършването на последващия анализ се прави сечение между двата списъка от параметри, т.е SARK и BFL, което сечение има вида:

81030 ,,,, γγτγ TOTSBFLSARK =I .

С помощта на бифуркационния анализ се изследва модулацията на параметъра 3τ , докато за изследването на влиянието на другите параметри се използват числени симулации. 5.5.2. Бифуркационен анализ. Целта на бифуркационния анализ е да определи ролята на различните времезакъснения ( )321 ,, τττ в появата на бифуркационни точки. От направения чувствителен анализ стана ясно, че единствено 3τ е критичен параметър. Видът на изследваната система е същият като този на системата (5.97), т.е. от качествена гледна точка ще се получат същите резултати като в подточка 5.4.1. Ето защо тук този анализ се пропуска. 5.5.3. Числен анализ. Тук се правят числени симулации на модела (5.89)-(5.93)-(5.119). Използват се числените стойности за параметрите от таблица 5.2 (не е дадена в автореферата).

Фигура 5.27 потвърждава резултатите от качествения (бифуркационен) анализ. При номинални стойности на моделните параметри, в системата (5.89)-(5.93)-(5.119) се появяват осцилации за стойности на 3τ по-големи от 3.9 дена, като амплитудата им е с определени модулации.

1 2 3 4 5 65

10

15

20

N

τ3 (days)

MaxMinMean

Фигура 5.27. Бифуркационен анализ свързан с модулирането на 3τ , когато стойностите на

параметрите са номинални.

75

Направеният анализ показва, че комбинираното нарастване в стойностите на γ8 и γ10 може да предизвика осцилации в системата, въпреки че τ3 е по-малко от бифуркационната си стойност. 5.5.4. Изводи

От методологична гледна точка, беше тествана стратегията от подточка 2.1, в която се комбинират и структурират няколко аналитични средства за изследване на биохимични модели със различни характиристики. Това направи изследването на системата (5.89)-(5.93)-(5.119) доста по-лесно (от бифуркационна гледна точка), но същевременно и доста по-задълбочено от биологична гледна точка. От направения анализ следва изключителната важност на времезакъснението свързано с процесите на пролиферация-диференциация (τ3) върху динамиката на модела. Превръщането на използваната стратегия в софтуерен продукт представлява една следваща задача.

Заключение Приносите в дисертацията са следните:

Научни приноси 1. Разработена е нова интегрирана стратегия за определяне на критични биохимични

процеси в сигналните пътеки. Подходът се състои от следната последователност от стъпки – математично моделиране, чувствителен анализ, бифуркационен анализ и предсказващи симулации.

2. Разработена е нова моделно базирана стратегия за изследване ролята на микро-РНК регулирането в ракови сигнални пътеки. В този системно-биологичен подход се използват съществуващата информация и хипотези (извлечени по био-информатичен път или ръчно), като за съответната система се превеждат в динамични системи. Използват се биологични данни (взети от литературата или специфично генерирани) с цел да се опише и настрои математичният модел. Накрая системата се изследва чрез числови симулации или качествени аналитични методи.

3. Модифициран е моделът на Джакоб и Моно за генно-регулационна система при прокариотни клетки чрез въвеждане на времезакъснителна функция. По този начин се дава теоретично обяснение на влиянието на времезакъснението при нормалното и патологично синтезиране на протеини в еукариотните клетки.

4. Получен е критерий за устойчивост и поява на бифуркация на Андронов-Хопф на обобщена система от три автономни обикновени диференциални уравнения с три дискретни закъснения.

5. Създаден е нов биоматематичен модел на микро-РНК регулирането с два и три закъсняващи аргумента.

6. Създаден е нов мултиразмерен модел със закъсняващи аргументи, описващ ефектите на JAK2-STAT5 сигналното модулиране върху еритропоезата.

7. Модифициран е моделът на рака на дебелото черво на Джонстън и съавтори с въвеждането на закъснения за времената на подновяване на стволовите клетки и полудиференцираните клетки в криптата.

76

Научно-приложни приноси 8. Показано е, че времезакъснението/ята е бифуркационен параметър в: 1) модела на

генното регулиране; 2) модела на РНК потискането; 3) модела, описващ динамичното регулиране на раковата сигнална пътека c-Myc/E2F от miRNA17-92 клъстера; 4) модела на микро-РНК регулирането и 6) модела, описващ ефектите на JAK2-STAT5 сигналното модулиране върху еритропоезата, което води до дестабилизиране на нормалното им функциониране.

9. Установено е, че появата на нерегулярно (хаотично) поведение в генно-регулационните системи отговаря на съществено нарушаване на техните функции, което може да доведе до тежки патологии и увреждания на клетката.

10. Установено е, че времезакъснението не оказва влияние върху устойчивостта на пътеката JAK2-STAT5.

11. Показано е, че времезакъсненията имат стабилизираща роля в модела на рака на дебелото черво.

12. Показано е, че системата от взаимодействието между ERK и JAK2-STAT5 е структурно неустойчива, като е възможно изчезване на равновесното ù състояние, отговарящо на необратимо раково заболяване.

13. Показано е, че намаляването на регулацията на субклетъчно ниво на ЕроR и STAT5 върху динамиката на еритроцитната популация води до патологично понижаване на хематокрита на даден индивид.

Приложни резултати: Разработените подходи са приложени при моделирането на времезакъснителен модел на ракова сигнална пътека и на този, комбиниращ сигналната и клетъчната популационна динамика, както и при анализа на критичните процеси в тях. Изградените нови подходи изискват тясно сътрудничество между биоинформатиката (предоставяща достъп до данните и инструментите за техния анализ), молекулярните биолози (проектиращи и извършващи количествените експерименти, даващи информация за експресията и динамиката на протеини и микро-РНК), клиниците и биомедицинските работници (изясняващи връзката между конкретните форми на рак и определени експресионни профили на микро-РНК и протеини) и математиците, интегриращи цялата информация в надеждни модели. Подобни интегративни подходи може да са парадигма към нова междудисциплинна наука, необходима за изследване на сложните феномени на рака.

Списък на публикациите, свързани с дисертационния труд 1. Nikolov S, Kotev V, Petrov V, An alternative approach for investigating a time delay

model of the JAK-STAT signaling pathway, Comptes rendus de l’Academie bulgare des Sciences (IF 0.219), vol. 58, No 8, pp. 889-896, 2005.

2. Nikolov S, Kotev V, Petrov V, Stability analysis of a time delay model of the JAK-STAT signaling pathway, X Congress of Theor and Applied Mech, Varna, pp. 156-162, 2005.

3. Nikolov S, Kotev V, Georgiev G, Petrov V, The dynamical roles of time delays in protein cross talk models, Comptes rendus de l’Academie bulgare des Sciences (IF 0.219), vol. 59, No 3, pp.261-268, 2006.

4. Nikolov S, Kotev V, Petrov V, Bifurcation behavior of a time delay model of enzyme and repressor cross talk, BioPS’06, October 24-25, III.47-56, 2006.

77

5. Nikolov S, Kotev V, Petrov V, Influence of time delay on bifurcation behavior in the protein synthesis model, BioPS’06, October 24-25, III.37-46, 2006.

6. Nikolov S, Vera J, Wolkenhauer O, Yankulova E, Petrov V, Chaos in a delayed protein cross talk model with periodic forcing, Comptes rendus de l’Academie bulgare des Sciences (IF 0.219), vol. 60, No 2, pp. 127-132, 2007.

7. Nikolov S, Georgiev G, Kotev V, Wolkenhauer O, Stability analysis of a time delay model for the JAK-STAT signaling pathway, Series on Biomechanics, vol. 23, No 1, pp. 52-65, 2007.

8. Nikolov S, Petrov V, Time delay model of RNA silencing, J. of Mechanics in Medicine and Biology (IF 0.493), vol. 7, No 3, pp. 297-314, 2007.

9. Nikolov S, Petrov V, Kotev V, Georgiev G, Mathematical description of time delays in pathways cross talk, In: Handbook of Research on Systems Biology Applications in Medicine, Chapter 3, ed Dr. Daskalaki, IGI Global Publication, pp. 27-73, 2009.

10. Kotev V, Nikolov S, Stability analysis of time delay model of crosstalk between ERK and STAT5a interaction, Int. J. Bioautomation, vol. 7, October, pp. 90-98, 2007.

11. Nikolov S, Vera, J., Kotev, V., Wolkenhauer, O., Petrov, V., Dynamic properties of a delayed protein cross talk model, BioSystems (IF 1.491), vol. 91, pp. 51-68, 2008.

12. Nikolov S, Stability and bifurcation behavior of genetic regulatory systems with two delays, Comptes rendus de l’Academie bulgare des Sciences (IF 0.219), vol. 61, No 5, pp. 585-594, 2008.

13. Nikolov S, Dynamics and complexity in a time delay model of RNA silencing with periodic forcing, Int. J. Bioautomation, vol. 10, pp. 1-12, 2008.

14. Nikolov S, Bifurcation analysis of genetic control network models with two delays, Series on Biomechanics, vol. 24, No 1, pp. 59-73, 2009.

15. Nikolov S, Lai X, Wolkenhauer O, Vera J, Time delay and Epo dose modulation in a multilevel model for erythropoiesis, Int. J. Bioautomation, vol. 12, pp. 53-69, 2009.

16. Nikolov S, Lai H, Wolkenhauer O, Vera J, Time delay and protein modulation analysis in a model of RNA silencing, Communications of SIWN Journal, vol. 6, pp. 111-117, 2009.

17. Nikolov S, Complex oscillatory behavior in a delayed protein cross talk model with periodic forcing, Chaos, Solitons & Fractals (IF 1.267), vol. 42, pp. 85-395, 2009.

18. Nikolov S, Lai X, Liebal U, Wolkenhauer O, Vera J, Integration of sensitivity analysis and bifurcation theory to detect critical biochemical processes in cell signalling pathway, International Journal of Systems Sciences (IF 0.948), vol. 41, No 1, pp. 81-105, 2010.

19. Lai X, Nikolov S, Wolkenhauer O, Vera J, A multi-scale model accounting for the effects of JAK2-STAT5 signalling modulation in erythropoiesis, Computational Biology and Chemistry (IF 1.476), vol. 33, No 4, pp. 312-324, 2009.

20. Nikolov S, Vera J, Herwig R, Wolkenhauer O, Petrov V, Dynamics of microRNA regulation of cancer network, Comptes rendus de l’Academie bulgare des Sciences (IF 0.219), vol. 63, No 1, pp. 61-70, 2010.

21. Nikolov S, Vera J, Schmitz U, Wolkenhauer O, A model based strategy to investigate the role of microRNA regulation in cancer signalling networks, Theory in Biosciences (IF 1.264), vol. 130, No 1, pp. 55-69, 2011.

22. Nikolov S, Ullah M, Nenov M, Gonzalez JV, Raasch P, Wolkenhauer O, Modeling colorectal cancer- a stability analysis approach, In: Medical Advancements in Aging and Regenerative Technologies: Clinical Tools and Applications, ed. Andriani Daskalaki, pp. 53-75, 2013.

78

23. Nikolov S, Nenov M, Time delay model of miRNA regulation, Series of Biomechanics, vol. 26, No 1-2, pp. 49-55, 2011.

24. Nikolov S, Yankulova E, Wolkenhauer O, Petrov V, Principal difference between stability and structural stability (robustness) as used in systems biology, Nonlinear Dynamics, Psychology, and Life Sciences (IF 0.96), vol. 11, No 4, pp. 413-433, 2007.

25. Nikolov S, Stability and Andronov-Hopf bifurcation of a system with three time delays, Journal of Mathematics (ISSN: 2314-4785), vol. 2013, art. ID 347071 (11 pages), 2013.

26. Nikolov S, Vera J, Nenov M, Wolkenhauer O, Dynamics of a miRNA model with two delays, Biotechnology & Biotechnological Equipment (IF 0.76), vol. 26, No 5, pp. 3315-3320, 2012.

27. Nikolov S, Complex behaviour of a miRNA model with three delays, Series on Biomechanics, submitted.

Списък на литературата, цитирана в автореферата [1] Дочев Д, Колчаков К, Сираков Л. Биохимия и клинична химия. Булвест-2000, София, 1993. [2] Панчев С, Теория на хаоса. акад.изд. “проф. Марин Дринов”, София, 2001. [3] Aguda B, Kim Y, Piper-Hunter M, Friedman A, Marsh C, MicroRNA regulation of a cancer

network: consequences of the feedback loops involving miR-17-92, E2F and Myc. PNAS 105(50): 19678-19683, 2008.

[4] Albridge B, Burke J, Lauffenburger D, Sorger P, Physicochemical modelling of cell signalling pathways. Nature 8(11): 1195-1203, 2006.

[5] Almodaresi E, Bozorg M, Stability crossing surfaces for linear time-delay systems with three delays. Int J Control 82(12): 2304-2310, 2009.

[6] Andronov A, Vitt A, Khaikin S, Theory of oscillations. Reading MA, Addison-Wesley, 1966. [7] Bautin N, Behavior of dynamical systems near the boundary of stability. Moscow, Nauka, 1984. [8] Bellman R, Cooke K, Differential-difference equations. New York, Academic Press, 1963. [9] Bergstrom C, McKittrick E, Antia R, Mathematical models of RNA silencing: Unidirectional

amplification limits accidental self-directed reactions. PNAS 100: 11511-11516, 2003. [10] Cai H, Hopf bifurcation in the IS-LM business cycle model with time delay. Electr J of Diff

Equations 15: 1-6, 2005. [11] Clevenger C, Roles and regulation of Stat family Transcription Factors in human breast cancer.

Amer J of Pathology 165: 1449-1460, 2004. [12] Darnell J, STATs and gene regulation. Science 277: 1630-1635, 1997. [13] Elsgolz L, Norkin S, Introduction in time delay equations. Moscow, Nauka, 1974. [14] Guo Sh, Huang L, Wang L, Linear stability and Hopf bifurcation in a two-neuron network with

three delays. Int J of Bifurcation and Chaos 14(8): 2799-2810, 2004. [15] Iorio M, Ferracin M, Liu C, Veronese A, Spizzo R, Sabbioni S, et al., MicroRNA gene

expression deregulation in human breast cancer. Cancer Res 65: 7065-7071, 2005. [16] Johnston M, Edwards C, Bodmer W, Maini Ph, Chapman S, Mathematical modelling of cell

population dynamics in the colon cancer initiation. Proc Nat Acad Sci USA (PNAS) 104: 4008-4013, 2007.

[17] Johnston M, Edwards C, Bodmer W, Maini Ph, Chapman S, Examples of mathematical modelling: tales from the crypt. Cell Cycle 6(17): 2106-2112, 2007.

[18] Khan Q, Greenhagh D, Hopf bifurcation in epidemic models with a time delay in vaccination. IMA J of Math Applied in Medicine and Biology 16: 133-142, 1999.

[19] Kholodenko B, Cell-signalling dynamics in time and space. Nature Reviews Mol Cell Biol 7(3): 165-176, 2006.

[20] Kitano H, Cancer robustness: tumour tactics. Nature 426: 125, 2003.

79

[21] Krasovski N, On the approximation of one problem of the analytic construction of a regulator in a system with delay. Prikl Mat Mekh 28: 716-725, 1964.

[22] Marsden J, McCracken M, The Hopf bifurcation and its applications. NY, Springer-Verlag, 1976.

[23] Nikolov S, First Lyapunov value and bifurcation behavior of specific class of three-dimensional systems. Int J of Bifurcation and Chaos 14(8): 2811-2823, 2004.

[24] O'Donnel K, Wentzel E, Zeller K, Dang Ch, Mendell J, c-Myc-regulated microRNAs modulate E2F1 expression. Nature 435: 839-843, 2005.

[25] Petrov V, Georgiev N, Dynamical model of ERK and STAT proteins interaction. Comptes Rendus de l’ Acad Bulg Sci 59(3): 269-276, 2006.

[26] Pircher T, Petersen H, Gustafson J, Haldosen L, Extracellular Signal-Regulated Kinase(ERK) interacts with Signal Transducer and Activator of Transcription (STAT)5a. Mol Endocr 13: 555-565, 1999.

[27] Rateitschak K, Wolkenhauer O, Intracellular delay limits cyclic changes in gene expression. Math Biosciences 205: 163-179, 2007.

[28] Ruan Sh, Wei J, Dynamics of continuous, discrete and impulsive systems. Series A: Math Analysis 10: 863-874, 2003.

[29] Schmidt H, Jirstrand M, Systems Biology Toolbox for MATLAB: A computational platform for research in Systems Biology, Bioinformatics 22(4): 514-515, 2006. (www.sbtoolbox2.org)

[30] Swameye I, Mueller T, Timmer J, Sandra O, Klingmueller U, Proc Natl Acad Sci USA (PNAS) 100(3): 1028-1033, 2003.

[31] Timmer J, Muller T, Swameye L, Sandra O, Klingmuller U, Modeling the nonlinear dynamics of cellular signal transduction. Int J of Bifurcation & Chaos 14: 2069-2079, 2004.

[32] Tyson J, Chen K, Novak B, Network dynamics and cell physiology. Molecular Cell Biology 2: 908-916, 2001.

[33] Vera J, Bachmann J, Pfeifer A, Becker V, Hormiga J, Torres N, et al., A systems biology approach to analyse amplification in the JAK2-STAT5 signalling pathway. BMC Systems Biology 2: 38, 2008.

[34] Walther A, Johnstone E, Swanton Ch, Midgley R, Tomlinson I, Kerr D, Genetic prognostic and predictive markers in colorectal cancer. Nature Reviews Cancer 9: 489-499, 2009.

[35] Wei J, Ruan Sh, Stability and bifurcation in a neural network model with two delays. Physica D 130: 255-272, 1999.

[36] Wodarz D, Komarova N, Computational biology of cancer: lecture notes and mathematical modelling. Singapore, World Scientific, 2005.

[37] Wolkenhauer O, Defining Systems biology: an engineering perspective. IET Syst Biol 1(4): 1-4, 2007.

[38] Xie Zh, Yang H, Liu W, Hwang M, The role of microRNA in the delayed negative feedback regulation of gene expression. Bioch Bioph Research Comm 358: 722-726, 2007.

[39] Zeiser S, Liebscher H, Tiedemann H, et al., 2006. Number of active transcription factors binding sites is essential for the Hes7 oscillator. Theor Biol Med Model 3: 11, 2006.

Model based approaches for the investigation of time delay dynamical models

in biomechanics (Summary)

Modern medicine and biology study, on cell level, phenomena that cause diseases such as cancer, Parkinson, metabolic disorders, disease of the immune system, etc. Intercellular and intracellular interactions and functions of the cell are nonlinear dynamic processes. For that reason, for modeling and analysis of the cell functions, the theory of dynamical systems is used.

80

In relation to the objectives and tasks set, the dissertation consists of an Introduction, five Chapters and a Conclusion.

The Introduction sets out the main circumstances, necessitating the creation and use of model-based strategies (approaches) to study the dynamical behavior of time delay models describing intracellular signaling pathways of biomolecular interactions through application of the qualitative theory of dynamical systems, bioinformatics and numerical simulations.

Chapter One of the dissertation has an overview character. An analysis of results achieved so far is made in the field of modeling of intracellular signaling pathways and networks of biomolecular interactions, gene regulation systems by means of dynamical systems and particularly time delay dynamical models. The major conclusions from the literature review are: 1) lack of approbated modeling approaches and qualitative study of dynamical models with lagging argument(s) of the signal paths; 2) time delays in signaling networks are large numbers (of the order of several minutes to several days), which makes impossible their presentation as a small parameter in the mathematical study of their effect on the relevant biological processes; lack of precise mathematical evidence and studies on the stability and the occurrence of bifurcations in high-dimensional (n> 2) dynamical systems with two or more discrete time delays; 3) it is necessary to examine the stability and the dynamic behavior of the different signal paths and the interaction between them.

The Second Chapter presents two new approaches to modeling and analysis of time delay dynamical systems in molecular biomechanics, i.e. an integrated strategy for the determination of critical biochemical processes in the signaling pathways and a model-based strategy for testing the role of micro-RNA regulation in cancer signaling pathways.

Chapter Three examines qualitatively and quantitatively dynamic models with a single time delay, as in subsection 3.7 a new model based strategy is applied to study the regulation of the dynamics of the cancer signaling pathway c-Myc/E2F of the miRNA17-92 cluster. The main advantages of the applied model-based approach are visualized.

Chapter Four investigates: 1) the model of a system with a feedback, 2) a whist RNA model, 3) a model of colon cancer, and 4) a model of micro-RNA. All of them have two discrete delays. There are also a number of proofs of their stability and the occurrence of an Andronov-Hopf bifurcation.

Chapter Five of the dissertation explores dynamic systems with three discrete delayed arguments. Initially, a generalized system of three autonomous ordinary differential equations with three discrete delays is considered. A criterion, in the performance of which no change in resistance occurs, is obtained. The destabilization of the generalized system occurs through an Andronov-Hopf bifurcation. The theoretical results obtained, are applied to a specific system describing the micro-RNA regulatory functions. In subsection 5.3 a new multidimensional model of ordinary differential equations with constant time delay is calibrated and numerically analyzed. In the next two sections of this chapter of the dissertation, besides the physiological processes involved in this model, the effect of competition between the signaling pathways involved in the erythropoiesis is examined in detail. The last subsection 5.5 examines a multidimensional model combining the signaling and the cell population dynamics. It is practically shown how to implement the new integrated strategy for defining critical biochemical processes in the signaling pathways. Simultaneously, its main advantages are revealed, as well.

The Conclusion presents the main results obtained by the research accomplished in the dissertation work.