1

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ УКРАИНЫ Харьковский национальный медицинский университет

ОБЩАЯ МИКОЛОГИЯ

Методические указания по дисциплине "Микробиология,

вирусология и иммунология" для студентов II–III курсов специальности

"Лечебное дело", "Педиатрия", "Медико-профилактическое дело", "Стоматология"

Утверждено

ученым советом ХНМУ.

Протокол № 12 от 17.12.2015.

Харьков ХНМУ 2016

2

Общая микология : метод. указ. по дисциплине "Микробиология,

вирусология и иммунология" для студентов II–III курсов специальности

"Лечебное дело", "Педиатрия", "Медико-профилактическое дело", "Сто-

матология" / cост. В. В. Минухин, Т. Н. Замазий, Н. И. Коваленко,

Е. В. Кочнева. – Харьков : ХНМУ, 2016. – 28 с.

Составители В. В. Минухин

Т. Н. Замазий

Н. И. Коваленко

Е. З. Кочнева

3

Тема: Общая микология

Количество часов: 2. Обоснование темы. В настоящее время грибковые инфекции – одна

из важнейших проблем здравоохранения. Грибы, имеющие медицинское значение, представляют многочисленную группу возбудителей, вызываю-щих микозы. Среди огромного количества грибов около 50 видов пато-генные, большее количество видов относится к условно-патогенным.

Медицинская микология до настоящего времени остается в тени бактериологии и вирусологии, однако грибковые поражения относятся к числу наиболее распространенных инфекций человека. По данным ВОЗ, каждый пятый житель нашей планеты поражается грибковой инфекцией, и только 5 % всех микозов являются первичными заболеваниями, а в остальных случаях это вторичные процессы, которые развиваются на фоне основных расстройств различного генеза. Наблюдается рост заболе-ваемости дерматомикозами на фоне возрастающих иммунодефицитов, нейтропений, ВИЧ-инфекции; учащаются случаи глубоких оппортунис-тических микозов; расширяется спектр возбудителей, появляются новые нозологические формы, возрастает устойчивость грибов к противогрибко-вым препаратам. Большое влияние на здоровье человека оказывают по-следствия воздействия грибов и продуктов их жизнедеятельности, такие, как микогенная аллергия, микотоксикозы.

Цель: – общая: овладеть микробиологической диагностикой заболеваний,

обусловленных грибами; – конкретная: а) знать: – правила безопасности при работе с биологическим материалом

(Державні санітарні правила – ДСП 9.9.5.03599); б) уметь: 1. Соблюдать правила работы и техники безопасности с инфи-

цированным материалом, культурами микроорганизмов, аппаратурой. 2. Проводить микроскопическое исследование. 3. Давать оценку результатам исследования. Материальное и методическое обеспечение темы: музейные

микропрепараты, микроскоп, иммерсионное масло, дезинфицирующий раствор, маркер, таблицы, атлас.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПАТОГЕННЫХ ГРИБОВ

В настоящее время грибы относят к царству Fungi или Mycota (Mycetes). Недавно грибы и простейшие были разделены на самостоя-тельные царства: Eumycota (настоящие грибы), Chromista и Protozoa. Не-которые микроорганизмы, ранее считавшиеся грибами или простейшими, были перемещены в новое царство Chromista (хромовики).

4

Царство грибов Eumycota включает 4 типа (Phylum) настоящих грибов, имеющих медицинское значение: Zygomycota, Ascomycota, Basidiomycota и Deiteromycota. He имеют медицинского значения хитри-диомицеты (тип Chytridiomycota) – водные сапрофитные грибы, поража-ющие водоросли. Ранее относимые к грибам оомицеты (организмы, родст-венные водорослям, паразиты высших растений) теперь относят к царству Chromista (Stramenopila), типу Oomycota.

В жизненном цикле грибов представлены две фазы: половая (ре-продуктивная) – телеоморфная и бесполая (вегетативная) – анаморфная, которая образует структуры бесполого размножения (спорангиоспоры, конидии). Анаморфы и телиоморфы грибов представляют собой этапы развития одного и того же вегетативного тела, которые могут отличаться или не отличаться друг от друга по плоидности. Явление чередования анаморфы и телеоморфы в жизненном цикле грибов получило название плеоморфизма, а грибы, для которых характерно такое чередование, названы плеоморфными. Таковыми являются многие патогенные Ascomycota.

Тело гриба называется "таллом". В вегетативной фазе таллом сос-тоит из ветвящихся нитей – гиф и их совокупности – мицелия.

К анаморфным грибам относятся большинство патогенных Asco-mycota (Aspergillus, Epidermophyton, Exophiala, Fonescea, Fusarium, Micro-sporum, Trichophyton и др.), а также некоторые Basidiomycota (Crypto-coccus, Malassezia). Телеоморфа у этих организмов установлена при куль-тивировании на питательных средах (иногда с использованием генетиче-ских методов) или не установлена вовсе. Таким образом, идентификация патогенных грибов практически всегда основана на изучении бесполых спороношений.

Основные группы грибов (в клинической микологии):

Плесневые (гифальные) – способны образовывать тонкие, вет-вящиеся гифы, которые сплетаются в грибницу (мицелий) (рис. 1). Гифы могут быть:

– вегетативные; – воздушные или репродуктивные.

Рис. 1. Гифальные грибы:

а) рода Aspergillus;

б) рода Penicillium

5

Гифальные грибы, или гифомицеты, состоят из тонких гифов тол-щиной 2–50 мкм, которые сплетаются в мицелий (плесень). Различают де-мациевые (пигментированные – коричневые или черные) и гиалиновые (непигментированные) гифомицеты. Гифы, врастающие в питательный субстрат, отвечают за питание гриба и называются вегетативными. Гифы, растущие над поверхностью субстрата, называются воздушными или ре-продуктивными (отвечают за размножение). Колонии из-за воздушного мицелия имеют пушистый вид (рис. 2). Различают низшие и высшие грибы: гифы высших грибов разделены перегородками или септами с отверстиями. Гифы низших грибов не имеют перегородок, представляя собой много-ядерные клетки, называемые ценоцитными (от греч. koenos – единый, общий).

Рис. 2. Колонии плесневых грибов

Каждая гифа является функционально полноценным фрагментом грибной клетки: она содержит протопласт с одним или многими ядрами, покрыта цитополазматической мембраной и защищена клеточной стенкой.

Дрожжевые грибы (дрожжи) – одноклеточные грибы (аско-мицеты, базидиомицеты). Дрожжевой таллом образуется в результате де-генерации мицелия. В ходе этого процесса каждый новообразующийся фрагмент мицелия, отделяясь септой от материнской клетки, обособляется и далее функционирует как самостоятельный одноклеточный организм.

Дрожжевые грибы (дрожжи) в основном представлены отдельными овальными клетками диаметром 3–15 мкм (рис. 3), колонии, в отличие от гифальных грибов, имеют компактный вид (рис. 4).

Рис. 3. Дрожжевые грибы Рис. 4. Колонии дрожжевых грибов

6

По типу полового размножения они распределены среди высших

грибов – аскомицет и базидиомицет. При бесполом размножении дрожжи

образуют почки или делятся. Могут образовывать псевдогифы и ложный

мицелий (псевдомицелий) в виде цепочек удлиненных клеток «сарделек»

(рис. 3). Псевдомицелий является разновидностью дрожжевого таллома

и, образованный системой дрожжеподобных клеток, соединен между собой

клеточными стенками. Протопласты клеток при этом полностью обособ-

лены друг от друга, однако структурная взаимосвязь между клетками со-

храняется. Псевдомицелий наблюдается в некоторых условиях у предста-

вителей Ascomycota (патогенный род Candida) и Basidiomycota (Ustilago).

Грибы, аналогичные дрожжам, но не имеющие полового способа

размножения, называют дрожжеподобными. Они размножаются только

бесполым способом – почкованием или делением. Понятие «дрожжепо-

добные грибы» часто идентифицируют с понятием «дрожжи». К дрожже-

подобным грибам относят Candida albicans (рис. 5).

А Б

Рис. 5. Candida albicans: А – псевдомицелий; Б – почкующиеся клетки

Многие грибы обладают диморфизмом – способностью к гифаль-

ному (мицелиальному) или дрожжеподобному росту в зависимости от ус-

ловий культивирования. В инфицированном организме они растут в виде

дрожжеподобных клеток (дрожжевая фаза), а на питательных средах об-

разуют гифы и мицелий (рис. 6). Диморфизм связан с температурным

фактором: при комнатной температуре образуется мицелий, а при 37 °С

(при температуре тела человека) – дрожжеподобные клетки.

Диморфные грибы могут существовать в тканевой и культуральной

форме. Выделяют три вида диморфизма:

• диморфизм, который сопровождается разнообразием тканевых

форм и постоянством культуральных (возбудитель кокцидиоидоза);

• диморфизм, который сопровождается разнообразием культураль-

ной фазы (большая часть диморфных грибов);

• грибы, у которых культуральная и тканевая формы совпадают

(возбудители плесеней, кандидоза, криптококкоза).

7

Грибы В культуре (25 °С) В ткани (37 °С)

Рис. 6. Схематическое изображение культуральной

и инвазивной форм патогенных грибов

Грибы, имеющие медицинское значение:

Совершенные грибы (имеющие половой способ размножения):

– зигоминеты – Zygomycota;

– аскомицеты – Ascomycota;

– базидиомицеты – Basidiomycota.

Несовершенные грибы (имеют только бесполый способ размно-

жения): дейтеромицеты – Deuteromycota.

Патогенные и условно-патогенные грибы.

Дрожжевые грибы: Candida spp., Cryptococcus neoformans,

Blastoschizomyces capitatus, Geotrichum candidum, Rhodotorula spp.,

Trichosporon spp., Pneumocystis carinii.

Диморфные грибы: Blastomyces dermatitidis, Coccidioides immitis,

Coccidioides posadasii, Bistoplasma capsulatum, Paraсoccidioides brasiliensis,

Penicillium marneffei, Sporothrix schenckii.

Дерматомицеты: Epidermophyton floccosum, Microsporum audouinii,

Microsporum canis, Microsporum gypseum, Exophiala werneckii, Pedraria

hortае, Trichophyton concentricum, Trichophyton Omentagrophytes,

Trichophyton rubrum, Trichophyton schoenleinii, Trichophyton verrucosum,

Trichophyton violaceum.

Зигомицеты: Absidia corymbifera, Basidiobolus ranarum, Conidiobolus

coronatus, Cunninghamella bertholletiae, Mucor spp., Rhizomucor spp.,

Rhizopus spp., Saksenaea vasiformis.

8

Возбудители мицетомы: Acremonium spp., Curvularia spp., Madurella grisea, Pseudallescheria boydii.

Монилиевые (непигментированные) гифомицеты: Aspergillus spp., Fusarium spp., Penicillium spp., Scopulariopsis spp.

Демациевые (непигментированные) гифомицеты: Alternaria spp., Bipolaris spp., Cladosporium spp., Curvularia spp., Fonseсaea spp., Phialophora spp., Phoma spp., Exophiala dermatitidis.

МОРФОЛОГИЯ ГРИБОВ

Грибы – многоклеточные или одноклеточные нефотосинтезирующие (бесхлорофильные) эукариотические микроорганизмы с толстой клеточной стенкой (рис. 7). Они имеют ядро с ядерной оболочкой, цитоплазму с ор-ганеллами, цитоплазматическую мембрану и многослойную ригидную клеточную стенку, состоящую из нескольких типов полисахаридов (ман-наны, глюканы, целлюлоза, хитин), а также белка, липидов и др. Некото-рые грибы образуют капсулу. Цитоплазматическая мембрана содержит гликопротеины, фосфолипиды и эргостеролы (в отличие от холестерина – главного стерола тканей млекопитающих).

Большинство грибов – облигатные или факультативные аэробы. Грибы широко распространены в природе, особенно в почве. Некоторые грибы содействуют производству хлеба, сыра, молочнокислых продуктов и алкоголя. Другие продуцируют антимикробные антибиотики (например, пенициллин), ииммунодепрессивные лекарства (например, циклоспорин). Грибы используют генетики и молекулярные биологи для моделирования различных процессов. Фитопатогенные грибы наносят значительный ущерб сельскому хозяйству, вызывая грибковые болезни злаковых расте-ний и зерна. Инфекции, вызываемые грибами, называются микозами.

Рис. 7. Строение клетки

гриба

Клетки грибов покрыты плотной клеточной оболочкой, состоящей

из полисахаридов, близких к целлюлозе, и азотистых веществ, подобных

хитину. У большинства грибов вегетативное тело (мицелий) состоит

9

из системы тонких ветвящихся нитей, называемых гифами. Переплетаясь,

мицелий образует грибницу. Гифы способны расти в длину и развиваются

на поверхности или внутри питательного субстрата. Соответственно раз-

личают мицелий субстратный (вегетативный), врастающий в питательную

среду, и воздушный. Концы нитей мицелия могут быть закручены в виде

спиралей, завитков и т. д. Грибы размножаются половым или бесполым способом. Половое

размножение грибов происходит с образованием гамет, половых спор

и других половых форм. Половые формы называются телеоморфами.

При образовании половых спор имеет место мейоз, а конидии яв-

ляются неполовыми репродуктивными органами. Половые стадии обна-

ружены у многих патогенных грибов, принадлежащих к классам Ascomycetes

и Zygomycetes. У других патогенных грибов, которые относятся к дейтеро-

мицетам, половые формы размножения не выявлены. У грибов, имеющих

медицинское значение, существуют следующие разновидности половых спор:

а) зигоспоры – у некоторых зигомицетов верхушки расположенных

близко друг к другу гиф сливаются, происходит мейоз, и образуются

крупные зигоспоры с толстыми стенками (рис. 8, а);

б) аскоспоры – в специальных клетках, называемых асками (сумка-

ми), в которых произошел мейоз, образуется 4–8, иногда 16 и более спор,

размеры, форма и поверхность которых могут быть весьма разнообразны-

ми у разных видов грибов (рис. 8, б);

в) базидиоспоры – после мейоза на поверхности особой клетки,

называемой базидиумом, на вершине каждой из четырех стеригм развива-

ется по одной круглой или слегка удлиненной базидиоспоре различных

размеров (рис. 8, в).

Рис. 8. Половые споры грибов:

а – зигоспоры; б – аскоспоры,

в – базидиоспоры

Бесполое размножение грибов происходит с образованием соответ-

ствующих форм, называемых анаморфами. Такое размножение происхо-

дит почкованием, фрагментацией гифа, бесполыми спорами. Эндогенные

споры (спорангиоспоры) созревают внутри специализироанного участка

мицелия округлой формы – спорангия. У большинства грибов спорангии

а

б

в

10

представляют собой вздутия верхушки гифы, отделенные от нее септой.

В ходе спорообразования, протопласт спорангия многократно делится,

распадаясь на сотни и тысячи спор. Затем споры покидают спорангий через

отверстия в его оболочке (крышечки, трещины, поры) или при разруше-

нии последней. Экзогенные споры (конидии) формируются на кончиках

плодоносящих гифов, так называемых конидиеносцах (рис. 9).

Рис. 9. Органы бесполого размножения

грибов:

А – конидии; Б – спорангии;

1 – конидиеносец; 2 – стеригмы;

3 – конидиоспоры; 4 – спорангий;

5 – спорангиоспоры

К бесполым формам грибов относят также хламидоконидии, или

хламидоспоры (толстостенные крупные покоящиеся клетки или комплекс

мелких клеток).

У большинства грибов, имеющих медицинское значение, обнару-

живаются разнообразные конидии (или экзоспоры), являющиеся формами

неполового размножения. Если у гриба не известны половые стадии,

классификация основывается на морфологических особенностях конидий.

Они могут образовываться на специальных конидиофорах (конидиеносцах),

по бокам или на концах обычных неспециализированных гиф или из ги-

фальных клеток. В одной и той же колонии гриба может происходить об-

разование нескольких типов конидий; в этом случае мелкие одноклеточные

конидии называются микроконидиями, а крупные, часто многоклеточные, –

макроконидиями.

Наиболее частыми типами конидий являются следующие виды спор:

а) бластоспоры – простые структуры, которые образуются в резуль-

тате почкования с последующим отделением почки от родительской клет-

ки, например, у дрожжевых и дрожжеподобных грибов (рис. 10, а);

б) хламидоспоры – гифальные клетки увеличиваются, у них обра-

зуется толстая оболочка; эти структуры высокоустойчивы к действию

неблагоприятных факторов внешней среды и прорастают, когда условия

становятся более благоприятными (рис. 10, б);

в) артроспоры – структуры, которые образуются в результате фраг-

ментации гиф на отдельные клетки (рис. 10, в); встречаются у дрожжепо-

добных грибов, возбудителя кокцидиоидоза, тканевых форм дерматофи-

тов в волосе, кожных чешуйках и в ногте;

11

г) конидиоспоры – зрелые наружные споры – образуются на мице-лии и не являются следствием превращения каких-либо других клеток грибницы; они или возникают на дифференцированных конидиофорах, отличающихся от других нитей грибницы по размерам и форме (аспер-гилл, пеницилл, рис. 10, г, д), или располагаются по бокам и на концах любой ветви мицелия, прикрепляясь к ней непосредственно либо тонкой ножкой (рис. 10, е).

Алейрии (рис. 10, ж) отличаются от обычных конидий тем, что при их образовании протоплазма соответствующих нитей целиком идет на формирование спор, от мицелия остаются нежизнеспособные фрагменты. С обилием алейрий связан мучнистый характер культур дерматофитов на плотных средах.

К эндоспорам совершенных грибов относятся спорангиоспоры му-коровых грибов; они развиваются в специальных органах, располагаю-щихся на вершине спорангиеносца. Споры освобождаются при разрыве стенки спорангия и, попадая в благоприятные условия, прорастают и дают грибницы с соответствующими органами спороношения (рис. 10, з). Эн-доспоры обнаруживаются также у тканевых форм возбудителей кокци-диоидоза и риноспоридиоза. Они развиваются в круглых образованиях – сферулах. В процессе созревания последних в них развиваются многочис-ленные округлые или яйцевидные тонкостенные эндоспоры (рис. 10, и). При разрыве стенки зрелой сферулы эндоспоры освобождаются и, попадая в благоприятные условия, повторяют жизненный цикл, постепенно пре-вращаясь в зрелые сферулы.

Рис. 10. Неполовое размножение

грибов, морфология спор:

а – бластоспоры;

б – интеркаларные (промежуточ-

ные) и термиальные (концевые)

хламидоспоры;

в – артроспоры;

г – конидии аспергилла;

д – конидии пеницилла;

е – конидии споротрихума;

ж – алейрии;

з – спорангии с эндоспорами

у мукора;

и – сферулы кокцидиоидного гриба

Наличие или отсутствие конидий, их размер, форма и расположение

используются для идентификации видов грибов в клиническом материале

(рис. 11).

а б в

г д е

ж з и

12

Рис. 11. Дифференциация видов грибов в клиническом материале:

A – Aspergillus; B – Penicillium; C – Trichophyton; D К Microsporum;

E – Epidermophyton, F – Rhizopus

Ни один из описанных выше морфологических элементов не явля-

ется абсолютно характерным для того или иного вида гриба, так как

в культурах разных грибов можно встретить одинаковые клеточные формы,

различающиеся в деталях на разных этапах их созревания. Комплексом

разнообразных клеточных элементов определяется большой полиморфизм

грибов в культурах на различных питательных средах. В паразитарном

состоянии тканевые формы многих грибов очень резко отличаются от

культуральных. Морфологические черты тканевых форм более однооб-

разны и более характерны для возбудителей соответствующих заболеваний.

ФИЗИОЛОГИЯ ПАТОГЕННЫХ ГРИБОВ

Почти все патогенные грибы – аэробы: широкий приток кислорода

способствует развитию грибницы и накоплению продуктов жизнедея-

тельности. Для питания грибов необходимы азотистые и углеродсодер-

жащие вещества (а также минеральные соединения), причем эти вещества

могут быть довольно простыми: аминокислоты, соли азота, ди- и моноса-

хара и т. д. Этим объясняется свойство многих патогенных грибов легко

развиваться в организме человека и животных, где возбудитель находит

среду, богатую источниками питательных веществ. Патогенные грибы

способны размножаться в диапазоне pH от 3,0 до 10,0; оптимальное зна-

чение pH 6,0–6,5. Оптимальная температура для развития мицелиальных

13

форм 25–33 °С, для дрожжевых и дрожжеподобных форм – 36–37 °С.

Споруляции грибов способствует понижение влажности питательной среды

и уменьшенное содержание в среде белков и углеводов.

Ферментативная активность патогенных грибов очень разнообразна,

интенсивность ее широко варьирует как у различных грибов, так и у од-

ного и того же гриба в разных условиях существования. У одних грибов

более выражена протеолитическая активность, у других – сахаролитиче-

ская, а у некоторых – липолитическая. Одни грибы обладают обширным

рядом ферментов и усваивают самые разнообразные углеводы, другие,

наоборот, способны потреблять лишь очень ограниченный ряд азотистых

веществ и углеводов. Различна и глубина разложения питательных суб-

стратов грибами: одни из них разлагают белки лишь до аминокислот, дру-

гие – до аммиака и сероводорода. Потребление углеводов одними гриба-

ми сопровождается только образованием органических кислот, тогда как

другие окисляют их до воды и углекислоты.

Витамины, некоторые аминокислоты и микроэлементы для различ-

ных грибов являются важными факторами роста.

На жидких питательных средах многие грибы растут в виде войло-

ковидного осадка, вначале на дне, а затем в виде пристеночного кольца

или сплошной пленки. По характеру роста на плотных питательных средах

колонии грибов подразделяются на несколько типов (рис. 12):

1) кожистые, гладкие, плотной консистенции, с трудом отделяемые

от поверхности среды;

2) пушистые, рыхлые, ватообразной консистенции, легко пригиба-

емые к субстрату при прикосновении, с большим трудом снимаются петлей;

3) бархатисто-ворсистые колонии, покрытые очень коротким

густым мицелием, напоминающим бархат;

4) хрупкие, пленчатые, по консистенции напоминающие ломкий

картон, с очень коротким газоном воздушного мицелия, густомучнистые

при спорообразовании;

5) гипсовидно-мучнистые поверхностные колонии порошковидной

консистенции; мучнистость сплошь или звездчатыми очагами покрывает

колонию и легко отделяется от поверхности культуры;

6) мелкозернистые или бугристые, кожистой консистенции, тесно

спаянные со средой, нередко с глубокими отпрысками в среду;

7) крупнобугристые, строчковидные, очень хрупкой консистенции,

легко отделяемые от субстрата;

8) блестящие, сальные или матовые, сливкообразной консистенции,

иногда слизисто-тягучие, довольно легко эмульгируются в физиологи-

ческом растворе.

14

Candida albicans Microsporum gypseum

Trichophyton rubrum Epidermophyton floccosum

Aspergillus flavus

Рис. 12. Колонии грибов

Многим патогенным грибам свойственны различные оттенки в ок-

раске воздушного мицелия, более ярко выраженные на высоте споруляции.

Большое разнообразие оттенков имеется у аспергиллов, пенициллов (рис. 13)

и некоторых дерматофитов. Наряду с яркими белыми, желтыми, коричне-

выми, черными, синими, зелеными, красными и малиновыми культурами

встречаются беловато-желтые, розовато-оранжевые, золотисто-желтые,

охряно-ржавые культуры грибов.

Химическая природа и растворимость пигментов различны. Одни

из них растворимы в воде, другие – в спирте, ацетоне, дихлорэтане, четы-

реххлористом углероде. Водорастворимые пигменты довольно быстро

окрашивают питательные субстраты в соответствующие оттенки.

15

Более четко цвет пигмента выявляется на кислых питательных сре-дах с углеводами; стимулируют пигментообразование интенсивная аэра-ция и добавление в среду солей магния, железа, а для некоторых грибов и солей лития. Тканевые формы грибов в патологическом материале окра-шены только у возбудителей хромомикоза и различных мицетом. Суб-стратный мицелий и обратная сторона колоний остаются бесцветными или серовато-желтыми, иногда наблюдаются более темные оттенки.

Среди продуктов жизнедеятельности и экстрактов из клеток неко-торых грибов выявлены вещества, обладающие токсическими свойствами. С ними связано растворение эритроцитов, повреждение эпителия кожи и ее придатков и слизистых, клеток различных органов. Многие грибы обладают гиалуронидазной активностью. Важную патогенетическую роль играют полисахариды некоторых дерматофитов в развитии васкулитов, доказана токсичность некоторых липидов из культур дрожжеподобных грибов.

Рис. 13. Колонии пенициллов:

1 – пеницилл отмеченный

(Penicillium notatum);

2 – пеницилл с золотистым

пигментом (P. chrysogenum);

3 – пеницилл Тома (P. thomii);

4 – пеницилл алеющий

(P. purpurogenum)

Устойчивость грибов к воздействию факторов внешней среды за-

висит от вида гриба, причем различные клеточные элементы его по-

разному противостоят неблагоприятным воздействиям. Молодые клетки

грибов, заключенные в специальных органах плодоношения, более устой-

чивы, чем свободно лежащие споры. Слизистые капсулы, окружающие

грибы (криптококки, дрожжеподобные грибы) в патологическом материале

и в культурах, также обеспечивают относительно большую устойчивость

их к внешним факторам. Кипячение в течение нескольких минут приводит

к гибели грибов в тканевой и культуральной форме. Прямые солнечные

лучи и ультрафиолетовый свет действуют на грибы губительно лишь при

длительной экспозиции и во влажной среде.

1 2

3 4

16

Выраженным фунгицидным действием обладает 3–7 %-ная уксусная

кислота, салициловая и бензойная кислоты (1–2 %-ные), 1–10 %-ный

формалин, 0,1 %-ная сулема, 5 %-ная хлорная известь.

Заболевания, вызываемые патогенными грибами, условно можно

разделить на две группы: системные, или глубокие, микозы и поверхност-

ные микозы. Микозы, вызываемые условно-патогенными грибами, могут

иметь смешанное клиническое течение.

Патогенные грибы обычно не продуцируют экзотоксины. В орга-

низме хозяина они, как правило, вызывают развитие гиперсенсибилизации

к их различным антигенам. При системных микозах типичной тканевой

реакцией является развитие хронической гранулемы с различной степенью

некроза и образованием абсцесса. Кроме того, существует группа заболе-

ваний, называемых микотоксикозами, которые обусловлены попаданием в

организм микотоксинов, образующихся в процессе жизнедеятельности

ряда микроскопических плесневых грибов. Выделено более 300 видов

микотоксинов, продуцируемых представителями 350 видов грибов, одна-

ко практическое значение как загрязнители пищевых продуктов имеют

лишь около 20. Среди них наиболее распространены и опасны для здоро-

вья человека афлатоксины Bl, В2, Gl, G2, Ml (продуценты – грибы рода

Aspergillus), трихотеценовые микотоксины (в том числе дезоксиниваленол

и зеараленон, продуценты – грибы рода Fusarium), охратоксины, цитри-

нин, цитреовиридин (продуценты – грибы родов Aspergillus и Pénicillium),

алкалоиды спорыньи (Claviceps purpurea), в том числе лизергиновая кис-

лота и агроклавин.

Микотоксикозы являются разновидностью пищевых отравлений –

пищевых интоксикаций, и причиной их являются, как правило, зерно

и зерновые продукты. Зерно поражается грибами в период созревания

и уборки урожая при неблагоприятных метеорологических условиях и

неправильном хранении.

МИКРОСКОПИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

Для диагностики микозов применяются микроскопические (в том

числе гистологические), микологические (культуральные), аллергические,

серологические, экспериментальные, молекулярно-биологические и другие

методы исследования.

Ввиду морфологического многообразия грибов, а также их медлен-

ного роста ведущее значение в диагностике микозов имеют морфологиче-

ские методы обнаружения и идентификации возбудителя. В зависимости

от клинических проявлений болезни исследуемым материалом служат:

пораженные волосы, чешуйки кожи, кусочки ногтей, кожные и ногтевые

скарификаты, гной, мокрота, пунктаты лимфатических узлов, костного

17

мозга, внутренних органов, кровь, спинномозговая жидкость, желудочный

сок, желчь, испражнения, кусочки тканей, полученные при биопсии или

аутопсии, и др. Материал берут по возможности из очага инфекции с со-

блюдением правил асептики эпиляционным пинцетом, скальпелем, пре-

паровальной иглой, лезвием бритвы, ножницами, ложечкой Фолькмана,

пастеровской пипеткой и др. Тампонами материал стараются не брать.

Чтобы лучше рассмотреть пораженный участок, можно пользоваться лупой,

у больных микроспорией – люминесцентной лампой, в лучах которой по-

раненные волосы имеют изумрудно-зеленое свечение. При подозрении на

поражение дерматофитами ногти обрабатывают 70 %-ным этанолом для

инактивации и удаления наружной (сопутствующей) микрофлоры, со-

стригают и в сухом контейнере доставляют в лабораторию. Патологический

материал следует брать в количестве, достаточном для микроскопического

изучения в неокрашенном и окрашенном виде, для посева на питательные

среды или заражения экспериментальных животных, а также для прове-

дения других исследований. Как правило, параллельно с микологическим

проводится бактериологическое исследование патологического материала.

При необходимости транспортировки материала в лабораторию его

помещают в стерильные пробирки, контейнеры, между предметными

стеклами и др., указав в направлении паспортные данные больного, лока-

лизацию поражения, дату взятия материала, диагноз. Несмотря на то, что

многие возбудители микозов устойчивы во внешней среде, материал ре-

комендуется держать во влажной атмосфере в присутствии кислорода

и доставлять в лабораторию в течение 2 ч, особенно в случае контаминации

материала бактериями. С возбудителями гистоплазмоза, кокцидиоидоза

и других особо опасных микозов работают в специально оборудованных

лабораториях с соблюдением специальных правил, позволяющих предот-

вратить лабораторное заражение и распространение инфекции.

Микроскопию следует проводить с того дня, когда на питательной

среде появляются первые колонии. Перед микроскопическим исследова-

нием необходимо определить, является гриб дрожжевым или плесневым. Это

осуществляют по внешнему виду колоний, результатам проростковой пробы.

При микроскопии плесневых грибов учитывают структуру мицелия

(т. е. особенности строения гиф, их цвет, септированность; особенности

строения конидиев и спор, включая размер, форму, цвет конидиев; строение

их клеточной стенки, септированность и т. д.).

Для проведения микроскопии готовят нативные и окрашенные пре-

параты (рис. 14).

18

Рис. 14. Aspergillus flavus: нативный и окрашенный препараты

Нативные препараты готовят из волос, соскобов с ногтей, чешуек

кожи и других тканей, предварительно обработанных 10–30 %-ным раст-

вором КОН для растворения кератина и просветления препарата.

Можно использовать также хлораллактофен по Аману (хлоралгид-

рат + фенол + молочная кислота), лактофенол (20 % фенола, 20 % молоч-

ной кислоты, 40 % глицерина, 0,5 % метиленового синего) или другой

раствор. Материал помещают на предметное стекло в каплю КОН, пере-

мешивают, накрывают покровным стеклом и выдерживают 5–15 мин при

комнатной температуре, затем придавливают покровным стеклом. Для

более выраженного просветления препарат слегка подогревают или при-

меняют для просветления раствор КОН с диметилсульфоксидом (ДМСО):

20 г КОН + 100 мл 60 %-ного ДМСО. После обработки препарат изучают

в обычном световом микроскопе (при увеличении ×40, часто с опущенным

конденсором) или в фазово-контрастном микроскопе.

Если исследуемый материал жидкий, его предварительно центри-

фугируют и делают мазки из осадка.

При микроскопии нативных препаратов можно определить харак-

терное расположение спор гриба в пораженных волосах, мицелия в чешуй-

ках кожи и соскобах с ногтей, что позволяет лаборатории дать предвари-

тельное заключение. Окончательное заключение о видовой принадлежности

гриба дают только после микологического исследования материала.

Окрашенные препараты готовят, как правило, из материала, имею-

щего вязкую или жидкую консистенцию. В окрашенном материале легче

выявить элементы гриба, чем в нативных препаратах. Чаще всего исполь-

зуют следующие методы окраски: по Граму, Романовскому–Гимзе, по Го-

мори (метенаминовым серебром), по Мак–Манусу (периодной кислотой

и реактивом Шиффа), Цилю–Нильсену, Граму–Вельшу, Райту, Лейшману,

лактофенолом, лактофуксином, по Аравийскому. Для окраски дерматофитов

применяют методы Сабуро, Адамсона, Хоммершмидта, Берка и др.

19

Для экспресс-диагностики используют специальные методы окраски,

так как окраска по Романовскому–Гимзе или по Граму не всегда позволяет

выявить в материале клетки грибов. При необходимости применяют лю-

минесцирующие иммунные сыворотки (РИФ).

Клетки грибов, как правило, грамположительны (рис. 15, 16). Окраска

по Граму помогает выявить сопутствующие бактериальные клетки и об-

наружить капсулу у криптококков. Тушевая (негативная) окраска по Бурри

позволяет выявить инкапсулированные клетки Cryptococcus neoformans

в препаратах ликвора при криптококковом менингите. Окраска по Рома-

новскому–Гимзе используется для обнаружения в мокроте трофозоитов

Pneumocystis carinii, в крови или костном мозге (как и окраска по Райту) –

дрожжевую форму возбудителя гистоплазмоза. Для выявления нокардий

и других кислотоустойчивых грибов применяют метод окраски по Цилю–

Нильсену или модифицированный метод Хенкса.

Рис. 15. Epidermophyton floccosum Рис. 16. Candida albicans

Для приготовления окрашенных препаратов материал обрабатывают

различными способами. Если исследуемый материал жидкий, то из него

готовят неокрашенный мазок для микроскопии в просветляющих жидкостях:

смесь спирта с глицерином. Плотный исследуемый материал – кожные,

ногтевые чешуйки – помещают в каплю 10–20 %-ного раствора КОН,

немного подогревают до появления кристалликов щелочи по периферии

капли. Затем каплю накрывают покровным стеклом и микроскопируют.

Для выявления капсульных грибов используют окраску альциано-

вым синим (по методу Моури), которая позволяет выявить кислые гетеро-

полисахариды, являющиеся капсульным материалом.

Наиболее приемлемым методом окраски гистологических препаратов

является метод Гомори, позволяющий выявлять в тканях элементы гриба.

Высокой чувствительностью обладает метод прямой люминесцентной

микроскопии (вносимый при обработке препарата флюорохром связыва-

ется с полисахаридами клеточной стенки гриба, обеспечивая затем яркое

20

свечение клетки при ультрафиолетовом облучении). Высокоспецифичным

методом выявления грибов в тканях является применение прямой РИФ

на основе моноклональных антител, меченных флюорохромом.

Микроскопию проводят сначала под малым увеличением (объектив

до ×20), затем под большим без иммерсии (объектив до ×40). При микро-

скопии выявляют типичные для грибов элементы: нити мицелия, споры

или клетки дрожжей, гифы, спорангии, почкующиеся клетки.

Следующий этап – микологическое исследование – выделение

и идентификация грибов. Рассмотрим особенности этого этапа в зави-

симости от исследуемого материала.

МИКОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

Микологическое (культуральное) исследование направлено на вы-

деление чистой культуры гриба и ее идентификацию.

Посевы производят на плотные и жидкие, неселективные и селек-

тивные питательные среды: Сабуро, сусло-агар, Чапека, кукурузный, ри-

совый, картофельный агар, Френсиса, Полаччи и др. Грибы хорошо рас-

тут также на некоторых средах для бактерий – кровяном, шоколадном,

сердечно-мозговом агаре, угольно-дрожжевой среде. Их, как и картофель-

ный агар с глюкозой, используют для выделения грибов из «стерильных»

материалов (крови, ликвора, биоптатов и т.п.), инкубирование ведут более

длительное время. Для приготовления селективных сред к неселективным

добавляют антибиотики (левомицетин – 20–50, стрептомицин – 40, пени-

циллин – 20 мкг/мл и др.), а также красители (бенгальский розовый и др.)

или дезинфектанты. Так, для выделения грибов из контаминированных

бактериями материалов используют агар Сабуро с глюкозой, в который

добавляют пенициллин и гентамицин или гентамицин и хлорамфеникол.

Для первичной дифференциации грибов за рубежом широко используют

хромогенный агар CHROM. В его составе имеются хромогенные субстраты,

которые при действии на них того или иного фермента грибов расщепля-

ются с образованием окрашенных соединений. В результате этого коло-

нии различных грибов на агаре CHROM отличаются по цвету: белые,

кремовые, желтые, коричневые, черные, розовые, красные и т. д.

Сроки культивирования различны для разных видов грибов (от 2–4 дней

до 4 нед), при подозрении на диморфные грибы культуру выделяют до 8 нед.

Оптимальный режим культивирования для большинства пато-

генных грибов – 30 °С, 20–25 °С, реже 37 °С – при подозрении на ди-

морфные грибы.

Длительность инкубации для большинства грибов составляет не

более 4 нед; если по прошествии этого времени роста не наблюдается,

дают отрицательный ответ. В случае подозрения на диморфный микоз при

21

отсутствии роста в течение 4 нед культуру выдерживают 8 нед и только

после этого дают отрицательный результат.

Если грибы оказываются в смешанных культурах, их чистые куль-

туры получают после рассевов до изолированных колоний на кровяном

агаре или после обработки соляной кислотой (для уничтожения бактерий).

В последнем случае культуру гриба засевают в 3 пробирки с 5 мл бульона

Сабуро с глюкозой, в которые добавляют 4, 2 и 1 каплю 1 N раствора НС1

соответственно. Через 24–48 ч инкубирования при 25 °С по 0,1 мл бульона

рассевают на агаре Сабуро с глюкозой.

Выделенные культуры гриба идентифицируют по внешнему виду

и форме колоний, их консистенции, цвету, способности к росту при 37 °С,

микроскопическому строению – характеру ветвления мицелия и наличию

в нем септ, расположению конидиеносцев, спор, а также биохимическим

и другим признакам (рис. 17). Размеры грибов определяют с помощью

окуляра-микрометра. У некоторых грибов изучают способность фермен-

тировать и ассимилировать органические вещества. Для изучения развития

мицелия в динамике используют метод микрокультур.

Рис. 17. Клетки и колонии C. albicans

При культуральном исследовании диагностически значимо:

выделение любого плесневого гриба, если это гриб был обнаружен

микроскопически;

выделение плесневого или дрожжевого гриба при исследовании

стерильного в норме материала;

выделение диморфного гриба;

выделение грибов рода Cryptococcus;

выделение дерматофитов из кожи, волос, ногтей.

Алгоритм микологического исследования:

1. Определение грибковой этиологии возбудителя (микроскопия).

2. Определение дрожжевой гриб или плесневый:

– микроскопия клинического материала (наличие мицелия);

– характер колоний на питательной среде, скорость роста (дрожжевые

грибы – 48 ч, плесневые грибы растут медленно).

22

3. Окончательную идентификацию гриба до уровня вида (внутри-

видовая) проводят с использованием биохимических тестов и иммуноло-

гических методов.

При исследовании биохимических свойств изучают способность

выделенной культуры к ассимиляции (ауксанограмма) и ферментации

(зигограмма). Возможно использование автоматизированных систем

идентификации (тест-системы для идентификации грибов).

КЛАССИФИКАЦИЯ МИКОЗОВ

Поверхностные микозы (кератомикозы) – поражение поверх-

ностных слоев кожи, волос:

Malassezia furfur – возбудитель разноцветного лишая.

Exophiala werneckii – возбудитель черного лишая.

Piedraia hortae – возбудитель черной пьедры (пьедриоз).

Trichosporon beigelii – возбудитель белой пьедры (трихоспороз).

Эпидермофитии (эпидермомикозы, дерматофитии, дерматоми-

козы) – поражение эпидермиса, кожи, волос.

Род Microsporum

Microsporum audouinii – возбудитель микроспории.

Microsporum ferrugineum – возбудитель микроспории.

Род Trichophyton

Trichophyton tonsurans – возбудитель трихофитии.

Trichophyton violaceum – возбудитель трихофитии.

Trichophyton rubrum – возбудитель рубромикоза.

Род Epidermophyton

Epidermophyton floccosum – возбудитель эпидермофитии.

Epidermophyton interdigitale – возбудитель эпидермофитии.

Подкожные, или субкутайные, микозы – поражение дермы, под-

кожной клетчатки, мышц.

Sporothrix schenckii – возбудитель споротрихозa.

Fonseca compacta – возбудитель хромомикоза.

Fonseca pedrosoi – возбудитель хромобластомикоза.

Phialophora verrucosa – возбудитель хромомикоза.

Phoma spp., Alternaria spp., Bipolaris spp., Curvularia spp., Exophiala spp. –

возбудители феогифомикова.

Возбудители мицетомы (хронический гнойно-воспалительный

процесс подкожной клетчатки и смежных тканей) – Actinomyces spp.,

Nocardia spp., Madurella spp., Exophiala spp.

Системные, или глубокие, микозы – поражение внутренних ор-

ганов и тканей.

Histoplasma capsulatum, Н. duboisii – возбудитель гистоплазмоза.

23

Blastomyces dermatidis – возбудитель бластомикоза.

Coccidioides immitis – возбудитель кокцициоидоза.

ParaCoccidioides brasiliensis – возбудитель паракокцидиоидоза.

Cryptococcus neoformans – возбудитель криптококкоза. Оппортунистические микозы

Aspergillus spp. – аспергиллез.

Mucor spp. – зигомикоз.

Penicillium spp. – пенициллез.

Fusarium spp. – фузариоз.

Candida spp. – кандидоз.

Pneumocystis carinii – пневмоцистоз.

Практические навыки по теме.

1. Проведение микроскопии мазков-препаратов с грибами.

2. Определение морфотинкториальных свойств патогенных грибов.

3. Определение культуральных свойств патогенных грибов.

Алгоритмы лабораторной работы

Алгоритм: «Методы окрашивания».

Окраска по Мак-Манусу (Шик-реакция). Фиксированный в абсо-

лютном спирте препарат обрабатывают 5 мин 5 %-ным раствором йодной

кислоты, промывают в течение 2 мин водой, помещают на 2 мин в раствор

основного фуксина (0,1 г основного фуксина растирают в 5 мл этилового

спирта и 95 мл воды), а затем, быстро промыв водой, опускают на 10 мин

в раствор гидросульфита цинка (1 г цинка гидросульфита, 0,5 г виннока-

менной кислоты, 100 мл дистиллированной воды). Промывают 5 мин водой,

обезвоживают по 2 мин в возрастающих концентрациях этанола (70–80–

95–100%) и в течение 2 мин просветляют в ксилоле. Грибы окрашиваются

в малиновый цвет, фон мазка – бледно-розовый.

Окраска по Граму–Вельшу. Препарат обезжиривают смесью Ники-

форова в течение 24 ч, окрашивают 1 мин генциановым фиолетовым (1 часть

генцианового фиолетового + 2 части анилинового масла), а затем 1 мин

обрабатывают смесью 5%-го раствора иодида калия и 3%-го раствора пе-

рекиси водорода 1:1). Под контролем микроскопа препарат обесцвечивают

1%-ным раствором анилина и обезвоживают абсолютным алкоголем.

Окраска лактофенолом. Мазок на стекле заливают на 30–60 мин

смесью, содержащей 2 части глицерина и по 1 части карболовой, молочной

кислот и дистиллированной воды. При добавлении 5%-го раствора мети-

ленового синего грибы окрашиваются в светло-голубой цвет.

Окраска лактофуксином. Мазок заливают на 4–5 мин смесью, со-

держащей 0,1 г кислого фуксина на 100 мл молочной кислоты. На розовом

фоне отчетливо видны элементы гриба голубого цвета.

24

Окраска по Аравийскому. Фиксированный над пламенем мазок за-

ливают в чашке Петри гематеином Майера (1 г гематеина, 50 мл этилово-

го спирта (95 %), 5 % калийных квасцов, 100 мл дистиллированной воды)

и помещают на 15 мин в термостат при 37 °С. Затем краску сливают и 3 мин

окрашивают препарат эозином (на 1 мл воды добавляют 5 капель насы-

щенного спиртового раствора эозина), после чего мазок промывают водой

и обрабатывают 1–2 мин 1 %-ным раствором перманганата калия. Промытый

водой препарат просушивают и микроскопируют. Сферулы возбудителя

кокцидиоидоза окрашиваются в желтовато-розовый цвет, оболочка –

в бледно-розовый цвет в центре и розово-фиолетовый по краям.

Метод Сабуро. Чешуйки и волосы вначале обезжиривают в хлоро-

форме, затем помещают на часовое стекло с муравьиной кислотой и на-

гревают до кипения. Хорошо промывают в воде и в течение 1мин окраши-

вают насыщенным водным раствором метиленового синего (24 части ме-

тиленового синего, 16 частей 5%-го раствора бората натрия, 40 частей дис-

тиллированной воды). Промытый в воде препарат обезвоживают в абсо-

лютном спирте, просветляют ксилолом и заливают канадским бальзамом.

Метод Адамсона. Просветленные в течение 15–30 мин в 10 %-ным

растворе КОН волосы и чешуйки кожи промывают в 1%-ным растворе

этилового спирта, высушивают и окрашивают в течение 15–60 мин генци-

ановым фиолетовым. На 3–5 мин их погружают в раствор Грама, а потом

на 2–3 ч – в анилиновое масло, после чего высушивают фильтровальной

бумагой и заливают канадским бальзамом.

Метод Хаммершмидта. Патологический материал, фиксированный

в смеси Карнуа (10 г ледяной уксусной кислоты, 60 мл абсолютного спирта,

30 мл хлороформа), в течение 1 мин обрабатывают на стекле 70 %-ным

этанолом. Затем препарат промывают водой и погружают на 10 мин в све-

жеотфильтрованный насыщенный водный раствор коричневого бисмарка.

Осторожно промывают водой, высушивают в спирте восходящей концен-

трации или на воздухе, просветляют ксилолом и заливают канадским

бальзамом.

Метод Берна. После обезжиривания в смеси Никифорова волосы

и чешуйки кожи в течение 1 мин окрашивают раствором Берка (16 частей

5%-го раствора бората натрия, 20 частей насыщенного водного раствора

метиленового синего и 24 части дистиллированной воды). Затем препарат

помещают в свежеприготовленный жидкий раствор резорцина, промывают

этанолом (чешуйки кожи для обесцвечивания обрабатывают перекисью

водорода), обезвоживают спиртом возрастающей концентрации (70–95%),

просветляют ксилолом и заливают канадским бальзамом.

Метод Бессоне. После обезжиривания кожи эфиром на участок по-

ражения накладывают полоску липкого целлофана (скотча) и прижимают

25

его пальцем. Затем полоску снимают, прополаскивают в бензоле и липкой

стороной накладывают на тщательно обезжиренное предметное стекло.

Для получения окрашенного препарата полоску целлофана после снятия

с кожи погружают на 15–20 с в раствор Берка, быстро промывают водой

и дважды в абсолютном спирте, затем – в бензоле и наклеивают на пред-

метное стекло. Иногда перед нанесением полоски липкого целлофана кожу

окрашивают в течение 15–20 с несколькими каплями красителя (избыток

его удаляют фильтровальной бумагой).

Модифицированный метод Хенкса. После приготовления мазка

и фиксации его в пламени горелки на него в избытке наливают раствор

карболового фуксина и выдерживают 5 мин. Затем краску сливают, зали-

вают мазок 50 %-ным этанолом и сразу промывают мазок водой. Для

обесцвечивания фона на мазок наносят 1 %-ную серную кислоту, после

чего тщательно промывают водой. Для контрастирования фона мазок до-

крашивают 2,5%-ным метиленовым синим (в 95%-ным этаноле) в течение

1 мин. Nocardia spp. и другие кислотоустойчивые грибы окрашиваются

в бордово-красный цвет, фон – голубой.

Алгоритм: «Среды для культивирования грибов».

Среды для культивирования дерматофитов и других грибов Агар

Сабуро (г/л): мальтозы (глюкозы) – 40, пептона – 10, агар-агара – 15–18.

Стерилизация при 110–112 °С при 0,5 атм в течение 15 мин, рН после сте-

рилизации – 5,6–6,8. Для придания селективных свойств в среду вводят

хлорамфеникол (50 мкг/мл) или другие антимикробные средства. Приме-

няют для первичного посева исследуемого материала.

Бульон Сабуро (не содержит агар-агара). Применяется для выращи-

вания грибов при изготовлении антигенных препаратов.

Сусло-агар. К 100 мл пивного сусла (с 7–8 % углеводов по Баллингу)

добавляют 15–18 г агар-агара. Стерилизация при 110–112 °С в течение

10 мин, рН после стерилизации – 6,5–7,0. Применяют, как и агар Сабуро,

для первичного посева исследуемого материала.

Агар для дерматофитов, DTM agar (г/л): глюкозы – 10, пептона – 10,

фенолового красного – 0,2, агар-агара – 20. Стерилизация при 121 °С

(1 атм) в течение 15 мин, рН после стерилизации – 5,3–5,7. Для придания

селективных свойств в среду вводят: циклогексимид (0,05 %) для подав-

ления роста большинства сапрофитных грибов, хлортетрациклин и гента-

мицин (по 50 мкг/мл) для подавления роста грамположительных и грамот-

рицательных бактерий, включая синегнойную палочку. Применяют для

первичного посева исследуемого материала.

Среды для выращивания плесневых и дрожжевых грибов. Агар

Чапека-Докса (г/л): сахарозы – 30, натрия нитрата – 3, калия гидрофосфа-

та – 1, магния сульфата – 0,5, калия хлорида – 0,5, железа сульфата – 0,01,

26

агар-агара – 15. Стерилизация при 112–120 °С в течение 15 мин, рН после

стерилизации – 7,1–7,4. Эта синтетическая среда применяется для культи-

вирования грибов, изучения хламидоспор у грибов Candida и морфологии

аспергилл.

Дифференциальные среды. Кукурузный агар (г/л): кукурузной му-

ки – 43, глюкозы – 20, агар-агара – 15. Стерилизация при температуре

110–112 °С в течение 15 мин. Применяется для выявления красного пиг-

мента у Trichophyton rubrutn и хламидоспор у Candida albicans.

Среда Городковой (г/л): мясной воды – 10 мл, пептона – 10, натрия

хлорида – 5, глюкозы – 2,5, агар-агара – 15. Стерилизация при 110–112 °С

в течение 30 мин. Применяют для выявления аскоспор у дрожжей.

Рисовая среда (г/л): риса очищенного – 20, маннита – 20, L-серина – 10,

натрия сульфата – 5, агар-агара – 20. Стерилизация при 110–112 °С

в течение 20 мин, рН после стерилизации – 6,8. Используется для выявле-

ния хламидоспор у дрожжеподобных организмов.

Рисовый отвар по Елинову. 20 г очищенного риса кипятят в 1 л

дистиллированной воды в течение 30 мин, пропускают через бумажный

фильтр и доводят фильтрат до 1 000 мл дистиллированной водой, добав-

ляют 20 г маннита, 10 г серина, 5 г натрия сульфата, 20 г агар-агара. Гото-

вую среду осветляют лошадиной сывороткой (70 мл на 1000 мл среды).

Стерилизуют при 110–112 °С в течение 20 мин.

Картофельный агар. 20 г тертого картофеля настаивают в 1 л во-

допроводной воды в течение 4 ч при комнатной температуре, добавляют

20 г агар-агара, кипятят 10–15 мин, фильтруют, разливают в пробирки по

4-5 мл и стерилизуют при 120°С в течение 30 мин.

Картофельный агар с глюкозой отличается тем, что берут 100 г

протертого картофеля и после фильтрования среды добавляют 10 г глюко-

зы. Стерилизуют, как среду Сабуро.

Солодово-дрожжевой агар с глюкозой (г/л): пептона – 5, дрожже-

вого экстракта – 3, экстракта солода – 3, глюкозы – 10, агар-агара – 20.

Стерилизуют при 120 °С 15 мин, рН после стерилизации 6,2. Для прида-

ния селективных свойств после стерилизации среды доводят рН до 4 или

добавляют антибиотики.

Терминология. Candida spp., Cryptococcus neoformans, Blastoschizomyces

capitatus, Geotrichum candidum, Rhodotorula spp., Trichosporon spp.,

Pneumocystis carinii, Blastomyces dermatitidis, Coccidioides immitis,

Coccidioides posadasii, Bistoplasma capsulatum, ParaCoccidioides brasiliensis,

Penicillium marneffei, Sporothrix schenckii, Epidermophyton floccosum,

Microsporum audouinii, Microsporum canis, Microsporum gypseum, Exophiala

werneckii, Pedraria hortае, Trichophyton concentricum, Trichophyton

Omentagrophytes, Trichophyton rubrum, Trichophyton schoenleinii,

27

Trichophyton verrucosum, Trichophyton violaceum, Absidia corymbifera,

Basidiobolus ranarum, Conidiobolus coronatus, Cunninghamella bertholletiae,

Mucor spp., Rhizomucor spp., Rhizopus spp., Saksenaea vasiformis,

Acremonium spp., Curvularia spp., Madurella grisea, Pseudallescheria boydii,

Aspergillus spp., Fusarium spp., Penicillium spp., Scopulariopsis spp.,

Alternaria spp., Bipolaris spp., Cladosporium spp., Curvularia spp., Fonseсaea

spp., Phialophora spp., Phoma spp., Exophiala dermatitidis.

Вопросы для контроля знаний

1. Общая характеристика грибов. Классификация патогенных грибов,

их значение в патологии человека.

2. Морфология и биологические свойства грибов. Устойчивость

к факторам внешней среды.

Тестовые задания

1. У ребенка на слизистой оболочке щек и на языке обнаружены белесова-

тые пятна, напоминающие свернувшееся молоко. В приготовленных маз-

ках-препаратах найдены грамположительные овальные дрожжеподобные

клетки. Возбудитель какого заболевания был выявлен?

A. Стафилококки. D. Дифтерийная палочка.

B. Фузобактерии. E. Актиномицеты.

C. Грибы рода Кандида.

2. При микроскопии соскоба с языка, окрашенного по Граму, обнаружены

овальные, круглые, удлиненные цепочки почкующихся клеток темно-

фиолетового цвета. О возбудителе какого заболевания может идти речь?

A. Дифтерия. D. Стрептококковая инфекция.

B. Стафилококковая инфекция. E. Кандидоз.

C. Актиномикоз.

3. В лабораторию направлен материал из белесоватых наслоений слизи-

стой оболочки ротовой полости. При посеве материала на среде Сабуро

отмечен рост сметаноподобных колоний. При бактериоскопии выявлены

короткие почкующиеся нити. К возбудителям какой инфекции относят

выделенные микроорганизмы?

A. Риккетсиоз. D. Хламидиоз.

B. Микоплазмоз. E. Спирохетоз.

C. Микоз.

ЛИТЕРАТУРА

Основная

1. Донецкая Э. Г.-А. Клиническая микробиология : рук-во для спе-

циалистов клинической лабораторной диагностики / Э. Г.-А. Донецкая. –

М. : ГЭОТАР-Медиа, 2011. – 480 с.

28

2. Коротяев А. И. Медицинская микробиология, иммунология

и вирусология: учебник для мед. вузов / А. И. Коротяев, С. А. Бабичев. –

4-е изд., испр. и доп. – СПб. : СпецЛит, 2008. – 767 с.

3. Борисов Л. Б. Медицинская микробиология, вирусология, им-

мунология / Л. Б. Борисов. – М.: Медицина, 2001. – 721 с.

4. Медицинская и санитарная микробиология : учеб. пособие для

студ. высш. мед. учеб. заведений / А. А. Воробьев, Ю. С. Кривошеин,

В. П. Широбоков. – М. : Издательский центр «Академия», 2003. – 464 с.

5. Микробиология / И. Л. Дикий, И. Ю. Холупяк, Н. Е. Шевелева,

М. Ю. Стегний. – Харьков : Прапор, изд. УкрФА, 1999. – 413 с.

6. П’яткін К. Д. Мікробіологія з вірусологією та імунологією /

К. Д. П’яткін, Ю. С. Кривошеїн. – К. : Вища шк., 1992. – 431 с.

7. Ситнік І. О. Мікробіологія, вірусологія, імунологія / І. О. Ситнік,

С. І. Климнюк, М. С. Творко. – Тернопіль : Укрмедкнига, 1998. – 392 с.

8. Медицинская микология с основами микотоксикологии : учебник

для высших учебных заведений / Д. В. Леонтьев, А. Г. Сербин, В. В. Росихин

и др. ; под ред. Д. В. Леонтьева, А. Г. Сербина. – Харьков, 2010. – 142 с.

Дополнительная

1. Медична мікробіологія, вірусологія та імунологія : підручник

для студ. вищ. мед. навч. заклад / за ред. В. П. Широбокова. – 2-е вид. –

Вінниця : Нова книга, 2011. – 952 с.

2. Коротяев А. И. Медицинская микробиология, иммунология и

вирусология : учебник для мед. вузов / А. И. Коротяев, С. А. Бабычев. –

СПб. : СпецЛит, 2008. – 767 с.

3. Медицинская микробиология / под ред. В. И. Покровского. – М.

: ГЭОТАР-МЕД, 2001. – 768 с.

4. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология :

учебник по дисциплине «Микробиология, вирусология и иммунология»

для студентов учреждений высш. проф. образования / под ред. В. В. Зве-

рева, М. Н. Бойченко. – М. : ГЭОТАР-Медиа, 2010. – 480 с.

5. Руководство к практическим занятиям по медицинской микро-

биологии, вирусологии и иммунологии / под ред. В. В. Теца. – 2-е изд.,

перераб. и доп. – М. : Медицина, 2002. – 352 с.

6. Медицинская микробиология / под ред. А. М. Королюка

и В. Б. Сбойчакова. – СПб., 2002. – 267 с.

7. Частная медицинская микробиология с техникой микробиоло-

гических исследований : учеб. пособие / под ред. А. С. Лабинской,

Л. П. Блинковой, А. С. Ещиной. – М. : ОАО «Издательство медицина»,

2005. – 600 с.

8. Конспект лекций.

29

Учебное издание

ОБЩАЯ МИКОЛОГИЯ

Методические указания по дисциплине

«Микробиология, вирусология и иммунология» для студентов ІІ–III курсов специальности

«Лечебное дело», «Педиатрия», «Медико-профилактическое дело»,

«Стоматология»

Составители Минухин Валерий Владимирович

Замазий Татьяна Николаевна

Коваленко Наталия Ильинична

Кочнева Елена Владимировна

Ответственный за выпуск В. В. Минухин

Редактор М. В. Тарасенко

Корректор Е. В. Рубцова

Компьютерный набор Т. Н. Замазий

Компьютерная верстка Е. Ю. Лавриненко

Формат А5. Усл. печ. л. 1,8.

Зак. № 16-3356.

________________________________________________________________

Редакционно-издательский отдел

ХНМУ, пр. Ленина, 4, г. Харьков, 61022

izdatknmu@mail.ru, izdat@knmu.kharkov.ua

Свидетельство о внесении субъекта издательского дела в Государственный реестр издателей,

изготовителей и распространителей издательской продукции серии ДК № 3242 от 18.07.2008 г.

30

ОБЩАЯ МИКОЛОГИЯ Методические указания

по дисциплине «Микробиология,

вирусология и иммунология»

для студентов ІІ–III курсов специальности

«Лечебное дело», «Педиатрия»,

«Медико-профилактическое дело»,

«Стоматология»