Obrazac varijabilnosti i diferencijacij prirodnih · Pinus mugo Turra (krivulj, planinski bor,...

UNIVERZITET U NIŠU

PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET

DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU

Obrazac varijabilnosti i diferencijacijа prirodnih

populacija Pinus mugo srednje Evrope i Balkanskog

poluostrva u odnosu na sastav epikutikularnih voskova

MASTER RAD

Kandidat: Mentor:

Jelena Nikolić 179 Dr Zorica S. Mitić

Niš, 2017.

UNIVERSITY OF NIŠ

FACULTY OF SCIENCE AND MATHEMATICS

DEPARTMENT OF BIOLOGY AND ECOLOGY

The variability pattern and differentiation of native

populations of Pinus mugo in Central Europe and Balkan

Peninsula regarding the composition of epicuticular waxes

MASTER THESIS

Candidate: Mentor:

Jelena Nikolić 179 Dr. Zorica S. Mitić

Niš, 2017.

BIOGRAFIJA KANDIDATA

Jelena Nikolić rođena je 13. septembra 1993. godine u Vranju, gde 2008. godine

završava osnovnu, a 2012. godine gimnaziju „Bora Stanković“ kao nosilac Vukove diplome.

Prirodno-matematički fakultet u Nišu upisuje 2012. godine na Departmanu za biologiju i

ekologiju. Osnovne akademske studije završava 2015. godine sa prosečnom ocenom 9.00 i

iste godine upisuje Master akademske studije, smer Biologija, koje u predviđenom roku

završava.

ZAHVALNICA

Zahvalnost na prvom mestu dugujem svom mentoru doc. dr Zorici Mitić na poverenju

koje mi je ukazala uključivši me u ovo interesantno istraživanje. Poštovanje za sve ono što je

učinila je neizmerno. Hvala joj na stručnim sugestijama i savetima, spremnosti za zajednički

rad, uloženom trudu, izdvojenom vremenu kao i nesebičnoj pomoći tokom celokupne izrade

ovog master rada.

Takođe, najlepše se zahvaljujem i članovima Komisije za ocenu master rada prof. dr

Petru Marinu i prof. dr Bojanu Zlatkoviću.

Posebnu zahvalnost dugujem prof. dr Bojanu Zlatkoviću i dr Časlavu Stefanoviću na

pomoći u sakupljanju biljnog materijala, kao i prof. dr Gordani Stojanović i doc. dr Snežani

Jovanović na pomoći u realizaciji hemijskih analiza i interpretaciji dobijenih rezultata.

Veliko hvala i prof. dr Vladimiru Ranđeloviću za izradu geografske karte distribucije koja

prati ovaj master rad.

Na kraju, volela bih da izrazim neizmernu zahvalnost svojim najbližima, majci

Svetlani, ocu Slađanu, bratu Dušanu i sestri Ani. Oni su bili i ostali moja bezrezervna

podrška i sigurna luka svih ovih godina. Hvala im što su me bodrili čak i onda kada izbor

nije bio lak, podsticali da razmišljam široko, gledam daleko, delujem pravovremeno i

koračam staloženo i smireno. Uvek uz mene i za mene, oni su ti koji svaki moj uspeh čine

kompletnim.

SAŽETAK

U radu je analizirana fitohemijska varijabilnost i diferencijacija populacija P. mugo

poreklom sa različitih planinskih masivа srednje Evrope i Balkanskog poluostrva: Julijski

Alpi (Triglav), Skardsko-Pindske (Šar-planina) i Balkansko-Rodopske planine (Pirin).

Kombinacijom GC/FID i GC/MS analize epikutikularnih voskova izolovanih sa dvogodišnjih

četina 45 jedinki P. mugo utvrđeno je prisustvo četiri diterpena (pimaradien,

sandarakopimaradien, 18-norabieta-8,11,13-trien i abietartrien), tri primarna alkohola (1-

heksadekanol, cis-9-oktadecen-1-ol i 1-oktadekanol) i 10 n-alkana u seriji od C20 do C29.

Multivarijantne statističke analize CDA i CA pokazale su jasno izdvajanje populacije sa

Julijskih Alpa u odnosu na populacije sa Balkanskog poluostrva. Dobijena korelacija

Mahalanobisovih distanci i geografske udaljenosti ispitivanih populacija ukazuje na njihovu

potencijalnu geografsku diferencijaciju, tj. „izolaciju putem distance“. Takođe, izdvajanje

populacije sa Julijskih Alpa u nezavistan klaster u odnosu na balkanske populacije, ide u

prilog hipotezi da u navedenim delovima areala P. mugo postoje dva različita vikarijantna

genska pool-a. Ipak, s obzirom da u ovom radu nisu analizirane populacije sa Južnih i

Istočnih Karpata, osobenost balkanskih populacija P. mugo na nivou epikutikularnih voskova

još uvek ne može biti u potpunosti potvrđena.

Ključne reči: Pinus mugo, epikutikularni voskovi, geografska diferencijacija, Julijski Alpi,

Balkan

ABSTRACT

This paper includes analysis of the phytochemical variability and differentiation of P.

mugo populations from various mountain systems of Central Europe and Balkan Peninsula:

Julian Alps (Triglav), Scardo-Pindic (Šara) and Balkan-Rhodope mountains (Pirin).

Combination of GC/FID and GC/MS analyses of epicuticular waxes isolated from two-year-

old needles from 45 individuals of P. mugo has shown presence of four diterpenes

(pimaradiene, sandaracopimaradiene, 18-norabieta-8,11,13-triene and abietatriene), three

primary alcohols (1-hexadecanol, cis-9-octadecen-1-ol and 1-octadecanol) and 10 n-alkanes

ranging from C20 to C29. The multivariate analyses CDA and CA have shown clear separation

of the population from Julian Alps and the populations in Balkan Peninsula. The correlation

of Mahalanobis distances and geographic distances of studied populations indicates their

potential geographic differentiation, i.e. isolation by distance (IBD). Separation of the Julian

Alps population into an independent cluster from the Balkan populations is supporting the

hypothesis that in the stated parts of range there are two different vicariant gene pools of P.

mugo. However, as this paper did not include analysis of populations from Southern and

Eastern Carpathians, the distinctiveness of Balkan populations of P. mugo at the level of

epicuticular waxes cannot be completely supported in the present day.

Keywords: Pinus mugo, epicuticular waxes, geographic differentiation, Julian Alps, the

Balkans

SADRŽAJ

1. UVOD ................................................................................................................................ 1

1.1. Opšte karakteristike vrste Pinus mugo ........................................................................ 1

1.1.1. Sistematski položaj .............................................................................................. 1

1.1.2. Habitus i anatomija .............................................................................................. 1

1.1.3. Stanište i distribucija ............................................................................................ 5

1.1.4. Privredni značaj ................................................................................................... 6

1.2. Opšte karakteristike biljne kutikule............................................................................. 7

1.2.1. Epikutikularni vosak kao hemotaksonomski kriterijum .................................... 10

1.2.2. Opšte karakteristike, distribucija i taksonomski značaj alkana ......................... 10

2. CILJEVI RADA ............................................................................................................. 13

3. MATERIJAL I METODE ............................................................................................. 14

3.1. Biljni materijal........................................................................................................... 14

3.2. Ekstrakcija epikutikularnih voskova ......................................................................... 15

3.3. GC-FID i GC-MS analiza epikutikularnih voskova .................................................. 15

3.4. Statistička analiza ...................................................................................................... 16

4. REZULTATI ................................................................................................................... 19

4.1. Hemijski sastav epikutikularnog voska četina P. mugo sa područja srednje Evrope i

Balkana ................................................................................................................................. 19

4.1.1. Promenjivost pojedinačnih komponenti epikutikularnih voskova ..................... 21

4.1.2. Analiza varijanse (ANOVA).............................................................................. 26

4.1.3. Analiza glavnih komponenti (PCA)................................................................... 28

4.1.4. Kanonijska diskriminantna analiza (CDA) ........................................................ 31

4.1.5. Klaster analiza (CA) .......................................................................................... 34

5. DISKUSIJA ..................................................................................................................... 35

5.1. Varijabilnost ispitivanih P. mugo populacija ............................................................ 35

5.2. Diferencijacija populacija ......................................................................................... 37

6. ZAKLJUČCI ................................................................................................................... 40

7. LITERATURA................................................................................................................ 42

Jelena Nikolić Master rad

1

1. UVOD

1.1.1. Opšte karakteristike vrste Pinus mugo

1.1.1. Sistematski položaj

Pinus mugo Turra (krivulj, planinski bor, klekovina) pripada najvećoj (više od 230

vrsta), ekonomski najznačajnijoj i filogenetski bazičnoj familiji četinara Pinaceae (Stefanović

et al., 1998). Prema filogenetskoj klasifikaciji kopnenih biljaka (Embryophyta), koju su

predložili Chase i Reveal 2009. godine, ova vrsta pripada potklasi Pinidae (=Pinophyta,

Pinopsida), redu Pinales i familiji Pinaceae (tabela 1.1).

Tabela 1.1. Položaj vrste P. mugo u filogenetskom sistemu kopnenih biljaka.

Klasa (classis): Equisetopsida

Potklasa (subclassis): Pinidae

Red (ordo): Pinales

Familija (familia): Pinaceae

Podfamilija (subfamilia): Pinoideae

Rod (genus): Pinus

Podrod (subgenus): Pinus (Diploxylon)

Sekcija (section) Pinus

Podsekcija (subsection) Pinus

1.1.2. Habitus i anatomija

Pinus mugo sensu stricto (subsp. mugo, var. mugo) je žbun retko viši od 3 (-4) m, sa

krivim, ukošenim deblom, jednim ili više (slike 1.1-1.3). Kora je sivosmeđa, sa nepravilnim

ljuspama. Mlade grančice gole, svetlozelene, kasnije smeđe do crnkastosive. Pupoljci su jako

smolasti, dugi do 6 mm, sa kratkim vrhom. Četine po dve, traju 3-6 godina, gusto stojeće,

povijene na grani, malo uvrnute, tamnozelene, duge 3-8 cm, široke 2 mm. Smoni kanali

subepidermalno, 2-6 na preseku. Epidermalne ćelije palisadnog oblika, dva puta više nego što

su široke. Muške resolike šišarke (mikrostrobilusi) duge do 15 mm, na prošlogodišnjem

izbojku. Ženske šišarke (makro-, megastrobilusi) su jajolike do jajoliko-konične, duge 2-6

cm, široke 1.5-2 cm. Apofize rombične do kvadratne, piramidalne ili ravne. Grbica (umbo)


2

izrazita, uokvirena tamnim prstenom. Zreli semeni zameci dugi do 5 mm, sa 2-3 puta dužim

krilastim dodatkom. Oprašivanje je anemofilno, muški i ženski strobilusi se pojavljuju VI-VII

meseca, semeni zameci sazrevaju krajem druge godine (Jovanović, 1992).

Slika 1.1. P. mugo sa Julijskih Alpa (Slovenija, Triglav; foto: Stefanović, 2016).


3

Slika 1.2. P. mugo sa Skardsko-Pindskih planina (Kosovo i Metohija, Šar-planina;

foto: Zlatković, 2016).


4

Slika 1.3. P. mugo sa Balkansko-Rodopskih planina (Bugarska, Pirin; foto: Zlatković, 2016).


5

1.1.3. Stanište i distribucija

Habitus krivulja odražava teške, u prvom redu klimatske, uslove pod kojima on živi;

to su granični uslovi za život šumskog drveća, sa kratkim vegetacionim periodom (3-4

meseca) (slike 1.1-1.3). Na Suvoj planini se javlja u fitocenozi Sorbo-Pinetum mugo B. Jov.,

1953. Na Prokletijama (Koprivnik, Streočke planine) krivulj raste u fitocenozi Wulfenio-

Pinetum mugo M. Jank. et Bog., 1967. na kiselom humusno-silikatnom zemljištu, Pinetum

mugo serpentinicum M. Jank., 1982. i nekim drugim (Jovanović, 1992).

Prema Flori Evope (Gaussen et al., 1993) i Atlasu Flore Evrope (Jalas i Suominen,

1972), P. mugo je endemičan za Evropski kontinent i može se naći na planinama srednje

Evrope, Balkanskog poluostrva, i centralnog dela Apeninskog poluostrva. Pripadnost flornom

elementu: Srednjo-južnoevropski planinski (temp-submerid) – subalp-alp (Jovanović, 1992).

Na slici 1.4 je prikazana distribucija žbunastih taksona P. mugo kompleksa prema

Hamerník i Musil (2007): P. mugo sensu stricto (=var. mugo) i P. x pseudopumilio (=var.

pumilio).

Za područje Srbije, Jovanović (1992) navodi sledeće lokalitete: istočna Srbija - Suva

planina (Trem), Stara planina (Tri čuke, Tri kladenca); Metohija – Prokletije (Koprivnik,

Lumbardska planina, Nedžinat, Derviš kom, Đaravica, Juničke planine), Žljeb, Hajla, Maja

Rusolija, Mokra planina, Paštrik, Koritnik, Ošljak, Kodža Balkan; Kosovo – Šar-planina

(ispod Jažinačkog jezera, Jelovarnik), Ostrovica.

Slika 1.4. Distribucija žbunastih taksona P. mugo kompleksa: mu (tamno zelena površina) –

P. mugo Turra (sensu stricto); pp (ljubičasta površina) – Pinus x pseudopumilio; svetlo

zelena površina predstavlja nesigurni deo areala (Hamerník i Musil, 2007).


6

Sandoz (1983) navodi da su trenutne fragmentisane populacije P. mugo samo mali

ostaci nekadašnjeg većeg areala krivulja koji je postojao u kasnom Tercijaru i tokom

intergalcijalnih perioda Kvartara. Smatra se da je ovakav biogeografski obrazac rezultat

zagrevanja Holocena i klimatskih fluktuacija tokom Pleistocena. Naime, trenutni areal P.

mugo je izrazito disjunktan, podeljen na nekoliko desetina delova koji su izolovani jedan od

drugog od trenutka kada je klima u Holocenu počela da se zagreva. Takođe, tokom

Pleistocenskih klimatskih fluktuacija areal P. mugo se više puta širio – tokom glacijacija kada

se krivulj spuštao na niže nadmorske visine i formirao velike i kontinuirane populacije i

skupljao - tokom interglacijalnih perioda kada su veće nadmorske visine postajale dostupne i

kolonizovane od strane P. mugo individua, dok su se sastojine na nižim nadmorskim

visinama skupljale pod pritiskom jačih kompetitora. Redukovani protok gena između

odsečenih regiona tokom toplijih perioda, genetički drift i/ili mogući efekat osnovača su

procesi koji su značajno uticali na prostornu genetičku i morfološku strukturu populacija P.

mugo. Takođe, uticaj pojedinih genetičkih i demografskih procesa je značajno modifikovan

hladnim vs. toplim periodima Pleistocena (Boratyńska et al., 2014).

1.1.4. Privredni značaj

S obzirom na to da raste i na staništima gde druge drvenaste vrste ne uspevaju, veoma

je značajan kao pionirska vrsta i čuvar zemljišta na starim, visokim planinskim terenima. Kao

"armatura" snežnih masa služi kao zaštita od lavina (zaštitne šume). Drvo sa

crvenkastosmeđom srčevinom i žućkastom beljikom, tvrdo i teško pogodno je za rezbarstvo i

gorivo (na planinskim pašnjacima). Iz četina se dobija etarsko ulje, koje se koristi u

kozmetičkoj industriji. Krivulj je korišćen u protiverozionim radovima i hortikulturi

(Jovanović, 1992).


7

1.2. Opšte karakteristike biljne kutikule

Različiti nepovoljni abiotički i biotički faktori uslovili su pojavu efikasnih

mehanizama zaštite kod biljaka kao sesilnih organizama. U odbrani od nepovoljnih uslova

spoljašnje sredine bitnu funkciju ima zaštitni lipidni sloj na površini nadzemnih zeljastih

delova koji se naziva kutikula.

Biljka ostvaruje kontakt sa svojom okolinom preko kutikule. Njome su najčešće

obavijeni listovi, plodovi, zeljasti delovi stabla, ređe cvetovi i drške, dok koren nije prekriven

kutikulom (Barthlott i Neinhuis, 1997). Iako je kutikula karakteristična za evolutivno

razvijenije grupe biljaka, ona se može javiti i kod jetrenjača, pravih mahovina i paprati.

Na osnovu rastvorljivosti u organskim rastvaračima razlikuju se dva osnovna tipa

komponenti biljne kutikule: lipofilna jedinjenja koje se oslobađaju ekstrakcijom u organskim

rastvaračima kolektivno su označena kao kutikularni vosak, dok je lipofilna komponenta

koja se ne može ekstrahovati zbog polimerne strukture označena kao kutin (Šarac et al.,

2014). Najčešća i najzastupljenija grupa jedinjenja u kutikularnim voskovima su alifatični,

acikični, negranati, zasićeni ugljovodonici, koji sadrže najmanje 20 ugljenikovih atoma.

Ovakva "dugolančana jedinjenja" nastaju elongacijom masnih kiselina sa više od 18

ugljenikovih atoma i daljom modifikacijom u odgovarajuće alkane, aldehide, ketone,

primarne i sekundarne alkohole, kao i estre koji se formiraju između masnih kiselina i

alkohola (Samuels et al., 2008). Manje zastupljena grupa jedinjenja u kutikularnim

voskovima mnogih biljnih vrsta su pentaciklični triterpenoidi. U kutikularnom vosku

pojedinih biljnih vrsta mogu se naći i aromatična jedinjenja, ali u manjim količinama (Jetter

et al., 2007).

Vosak prožima kutikulu celom debljinom, pri čemu je jedan deo voska ugrađen u

kutinski polimerni matriks (intrakutikularni vosak), a drugi nataložen na spoljašnjoj

površini kutina (epikutikularni vosak) (Jeffree, 1996). Naime, intrakutikularni vosak je

amorfna smeša lipida uronjenih u kutin, koja povezuje kutikulu sa ćelijskim zidom, dok se

epikutikularnim voskom smatraju površinski lipidi (u kontaktu sa atmosferom) nataloženi na

spoljašnjoj površini kutina. Kutikula je za epidermis vezana pomoću pektinskog sloja

(polisaharid). Strukturna razlika u hemijskom sastavu između dva voštana sloja se može

napraviti nakon selektivnog izolovanja i analize najpre epikutikularnog, a potom i

intrakutikularnog voska: mehanički, pomoću guma arabike ili krio-adhezinom tehnikom sa

vodom (Taylor, 2011, Riederer, 2006; Kunst i Samuels, 2003; Riedel, et al. 2003; van


8

Maarseeven i Jetter, 2009). Istraživanja pomoću skenirajuće elektronske mikroskopije (SEM)

otkrila su da epikutikularni vosak formira površinski voštani film sa posebnim

trodimenzionalnim strukturama (kristaloidima) koje štrče u atmosferu i čiji oblik, veličina, i

orjentacija u odnosu na površinu izuzetno variraju kod različitih biljnih vrsta (Barthlott et al.,

1998; Jeffree, 2006). Prema Koch i sar. (2008), najčešći mikromorfološki tipovi

epikutikularnih voštanih kristaloida koji se sreću u biljnom svetu su: korice, pločice, štapići,

tubule (cevčice), končaste strukture itd.

Kod golosemenica voštani kristaloidi uglavnom imaju izgled tubula i odlikuje ih

dominacija sekundarnog alkohola nonakozan-10-ola (tzv. nonakozanol-tubule, Barthlott et

al., 1998). Nonakozan-10-ol je dominantna komponenta kutikularnih voskova većine

golosemenica (Ginkgo, Pinus, Abies, Picea, Wollemia, Taxus itd.) kao i nekih

skrivenosemenica, i smatra se odgovoranim za tubularnu mikrostrukturu epikutikulanog

voštanog sloja kod ovih biljaka (Jeffree, 2006). Iako se hemijski sastav različitih tipova

kristaloida odnosi na dominantnu komponentu ukupnog ekstrahovanog voska, nekoliko

Slika 1.5. SEM mikrografija epikutikularnog voska na licu četine P. nigra (Mitić et al., 2017).


9

istraživanja potvrdilo je sposobnost nonakozan-10-ola da rekristališe in vitro u formi tubula

(Jetter i Riederer, 1994; Ensikat et al., 2006). Kod Pinus spp., voštane tubule su vrlo guste, sa

mrežastim izgledom, i koncentrisane uglavnom u stominim komorama, dok najveću površinu

četina prekriva glatki voštani sloj, tj. amorfni vosak, sa uočljivim granulama na pojedinim

mestima (slika 1.5).

Fizičke i hemijske osobine kutikularnih voskova određuju neke od vitalnih funkcija

biljaka (Šarac, 2014). Pre svega, vosak značajno redukuje nestomaternu transpiraciju, a veza

između kserofitnog karaktera pojedinih biljaka i količine lisnih kutikularnih voskova je

potvrđena u velikom broju radova. Vosak, takođe, štiti biljku od raznih spoljašnih uticaja:

vetra, snega, mraza i ultravioletnog zračenja (Reicosky i Hanover, 1978; Barnes et al., 1996);

redukuje zadržavanje vode na površini biljaka, smanjuje apsorpciju prašine, polena i ostalih

zagađujućih materija iz vazduha (Kerstiens, 1996; Barthlott i Neinhaus, 1997) pri čemu

pokazuje osobinu "samo-čišćenja" (lotus efekat – Barthlott i Neinhaus, 1997). Takođe,

pokazano je da kutikularni vosak ima značajnu ulogu u zaštiti biljaka od mnogih bakterijskih

i fungalnih infekcija (Jenks et al., 1994) i da učestvuje u različitim interakcijama između

biljaka i insekata (Eigenbrode i Espelie, 1995).

Štiteći biljku od štetnih uticaja sredine/staništa, njegova struktura i sastav se menjaju.

Među mnogobrojnim faktorima sredine koji mogu uticati na produkciju i strukturu voska,

najprimetnije promene izazivaju temperatura i intezitet svetlosti. Interesantno je da se

promene u strukturi voska pod uticajem faktora sredine češće dešavaju kod epikutikularnih

voskova sačinjenih od predstavnika različitih klasa jedinjenja u odnosu na voskove u kojima

dominira samo jedna klasa jedinjenja. Pojedine studije su pokazale da je veliki broj gena

uključen u produkciju voskova, kao i to da su epikutikularni voskovi uglavnom inertni u

pogledu biološke aktivnosti (Lemieux, 1996; Seigler, 1998; prema Jovanović, 2016).

Kutin kao gradivna komponenta čini između 40 i 80% mase kutikularne membrane.

Detaljnije, polimer čine C16 i C18 oksigenovane masne kiseline umrežene estarskim vezama

koje vode poreklo od oleinske i linoleinske kiseline, dobijene ω-hidroksilacijom ili

epoksidacijom dvostruke veze koja je praćena hidroksilacijom epoksida uz učešće enzima

kao katalizatora. U sastav polimernog matriksa takođe ulazi i glicerol. Sastav kutina se

utvrđuje nakon izolovanja i depolimerizacije, raskidanja estarskih veza i dobijanja

monomernih jedinica i njihovih derivata (Heredia, 2003; Heredia i Dominguez, 2009; Kunst i

Samuels, 2009; prema Jovanović, 2016).


10

1.2.1. Epikutikularni vosak kao hemotaksonomski kriterijum

Fina struktura voska predstavlja konstantnu ili relativno nepromenljivu karakteristiku

date biljne vrste, pa se stoga može koristiti kao veoma pouzdan parametar u taksonomiji

biljaka. Drugim rečima, jedinke iste vrste koje se razvijaju pod uticajem istih sredinskih

faktora karakterišu se sličnom mikromorfološkom strukturom i hemijskim sastavom voska.

Do odstupanja, odnosno varijabilnosti u mikromorfološkim i hemijskim karakteristikama

voska kod biljaka najčešće dolazi usled promene intenziteta različitih ekoloških faktora

(klimatski, edafski i orografski faktori; Jefree, et al. 1976). Takođe, hemijski sastav

epikutikularnog voska može i da varira u zavisnosti od biljne vrste, organa biljke, kao i u

zavisnosti od ontogenetske faze u kojoj se nalazi jedinka (Koch, et al. 2008).

Značaj epikutikularnih voskova ogleda se u praćenju i merenju mikromorfoloških i

hemijskih karaktera u okviru date taksonomske kategorije. Obzirom da voštani depoziti mogu

varirati u pogledu veličine, oblika i frekvenciji/brojnosti, mikromorfologija epikutikularnog

voska predstavlja izvor mnoštva, za taksonomiju korisnih, karaktera. Dodatno, razmatranje

karakteristika voska zajedno sa drugim karakteristikama biljaka omogućava razjašnjavanje i

razumevanje evolutivnih odnosa između taksona.

Veliki broj hemotaksonomskih istraživanja je ukazao na značaj metabolita iz

epikutikularnog voska u diferenciranju i sistematici taksona na nivou različitih taksonomskih

kategorija. Varijabilnost u sastavu i strukturni diverzitet komponenti epikutikularnog voska

predstavlja važnu osnovu u taksonomiji biljaka na osnovu koje se može razmatrati grupisanje

taksona u okviru različitih taksonomskih kategorija. Moguće je izvršiti diferenciranje

taksona, razlikovanje grupa u okviru sekcija, ili čak identifikaciju vrsta, čime se stiče uvid u

evolutivne i filogenetske odnose u biljnom svetu (Jovanović et al., 2015).

1.2.2. Opšte karakteristike, distribucija i taksonomski značaj alkana

Alkani su zasićeni ugljovodonici, poznati pod nazivom parafini. Sastoje se od dva

elementa: ugljenika (C) i vodonika (H), povezanih kovalentnim vezama. Veličinu alkana

određuje broj međusobno vezanih C atoma. Alkani sa više od tri C atoma mogu formirati

različite strukturne izomere. Na taj način možemo razlikovati linearne, normalne alkane (n-

alkane), sa ugljenikovim skeletom cik-cak strukture i opštom formulom: CnH2n+2 i račvaste

(iso-alkane) sa opštom formulom CnH2n+2, n>3 (Nikolić, 2008).


11

Dugolančani n-alkani sa neparnim brojem C atoma su jedna od najzastupljenijih

komponenti kutikularnih voskova. Zbog svoje velike nepolarnosti, oni znatno doprinose

hidrofobnim osobinama voskova, smanjujući nestomaterni gubitak vode sa površine listova i

drugih delova biljke. n-Alkani (C21-C37) iz epikutikularnog voska su najčešće korišćeni

biomarkeri. Kod većine terestričnih biljaka najzastupljeniji su n-alkani C27, C29 i C31, koji

ponekad čine i do 90% ukupnog sastava voska (Nikolić, 2008). Akvatične biljke karakteriše

dominacija n-alkana C23 i C25, dok je dominacija n-alkana relativno kratkih nizova

ugljenikovih atoma (C15, C17, i C19) utvrđena kod nekih algi i cijanobakterija (Chikaraishi i

Naraoka, 2003). U kutikularnim voskovima četinara najčešće dominira n-alkan C31, a zatim

C27, C29 i C25 (Maffei et al., 2004).

Kao jedna od najzastupljenijih komponenti kutikularnih voskova, čiji je biosinteza

pod strogom genetičkom kontrolom, n-alkani su najčešće korišćeni kao hetmotaskonomski

markeri različitih biljnih familija (Maffei et al., 1996; 2004). Obzirom da ne sadrže

funkcionalne grupe, karakteriše ih izuzetna stabilnost, pa ih je moguće detektovati u svežem

biljnom materijalu, ali i u fosilnom materijalu, zemljištu, sedimentima i slično. Pored

hemijske stabilnosti, n-alkani su favorizovani markeri jer se lako izoluju i identifikuju

(Marin, 2003; Bush i Mclnerney, 2013). Sadržaj n-alkana u voskovima varira u zavisnosti od

biljne vrste, roda, familije, pa se identifikovanje, kvantifikovanje i predstavljanje distribucije

alkana u voskovima vrlo često koristi u hemotaksonomskim studijama (Jovanović, 2016).

Međutim, i pored neosporne činjenice da su sastav i produkcija n-alkana u

kutikularnim voskovima genetički determinisani, kod n-alkana (kao i kod drugih sekundarnih

metabolita biljaka) uočava se određena varijabilnost, kao posledica uticaja različitih

ekoloških faktora. Zbog toga je pre analize taksonomskog značaja neophodno istražiti intra- i

interpopulacionu varijabilnost n-alkana određenog taksona. Takođe, pravilno uzorkovanje i

doslednost u postupcima branja, skladištenja i izolacije n-alkana su preduslovi validne

interpretacije dobijenih rezultata (Marin, 2003).

Generalno, n-alkani se mogu okarakterisati kao dobri markeri na nižim nivoima

klasifikacije (do nivoa roda), osim u slučajevima njihove velike varijabilnosti u uzorcima.

Kada se taksoni na nivou vrste morfološki teško razlikuju, karakterističan sadržaj pojedinih

n-alkanskih nizova može da bude od koristi u njihovom diferenciranju. Mnoge studije su

pokazale da se n-alkani mogu koristiti i kao veoma informativni markeri u proučavanjima

geografske varijabilnosti i/ili identifikaciji infraspecijskih taksona Pinus (Nikolić et al.,

2012a; 2012b; Bojović et al., 2012; Šarac et al., 2016), Picea (Nikolić et al., 2013) i


12

Juniperus (Rajčević et al., 2014) vrsta. Tokom protekle dve decenije, Massimo Maffei je u

seriji radova publikovao veliku količinu rezultata istraživanja koja se bave taksonomskim

značajem alkana iz kutikularnih voskova različitih biljnih familija. Prema Maffei et al.

(1996a; 1996b; 1996c; 1997; 2004) n-alkani mogu se koristiti kao pouzdani

hemotaksonomski markeri na višim nivoima klasifikacije, kao što su tribusi, potfamilije i

familije.


13

2. CILJEVI RADA

Osnovni naučni ciljevi ovog istraživanja mogu se predstaviti u nekoliko teza:

1. Određivanje hemijskog sastava epikutikularnog voska četina P. mugo sensu stricto

poreklom sa različitih planinskih masivа srednje Evrope i Balkanskog poluоstrva:

Julijski Alpi (Triglav), Skardsko-Pindske (Šar-planina) i Balkansko-Rodopske planine

(Pirin).

2. Uvrđivanje diverziteta i diferencijacije autohtonih populacija P. mugo sa područja

srednje Evrope i centralnog Balkana na nivou epikutikularnih voskova.

3. Definisanje potencijalnih hemotipova istraživanih populacija P. mugo.

4. Poređenje dobijenih rezultata sa morfološkim, biohemijskim i molekularnim

karakterima koji su korišćeni u dosadašnjim istraživanjima P. mugo.


14

3. MATERIJAL I METODE

3.1. Biljni materijal

Biljni materijal (dvogodišnje četine) P. mugo sensu stricto sakupljen je sa tri planinska

masiva srednje Evrope i Balkanskog poluostrva: Julijski Alpi (Triglav), Skardsko-Pindske

(Šar-planina) i Balkansko-Rodopske planine (Pirin). Prilikom odabira pojedinačnih stabala,

nije se rukovodio superiornim morfološkim karakteristikama (npr. visinski i debljinski

prirast, dužina četina i šišarki, oblik krune), već prostornom pokrivanju celokupne populacije,

odabirajući stabla na što većoj horizontalnoj i vertikalnoj razdaljini, u zavisnosti od veličine

odabrane populacije. U svakoj od odabranih populacija krivulja, tokom leta 2016. godine,

izvršeno je sakupljanje grančica sa dvogodišnjim četinama sa 15 odraslih stabala. Grančice su

brane po celokupnom obimu donje trećine krune. Uzorci svakog pojedinačnog stabla stavljani

su u zasebnu polietilensku kesu, zajedno sa oznakom lokaliteta, datumom sakupljanja i

rednim brojem stabla, kako ne bi došlo do mešanja uzoraka. Geografski položaj populacija je

određen uz pomoć GPS uređaja (GPS Garmin eTrex Vista® C). Orografske karakteristike

staništa, pre svega nadmorska visina i ekspozicija su preuzeti iz SRTM (Shuttle Radar

Topography Mission) (Reuter et al., 2007) digitalnog elevacionog modela rezolucije 90 x 90

m (Farr al., 2007) pomoću softvera ArcGIS 10 (ESRI, 2011) (tabela 3.1). Herbarski primerci

su deponovani u Herbarijumu Departama za biologiju i ekologiju, Prirodno-matematičkog

fakulteta u Nišu (“Herbarijum Moesiacum Niš” - HMN).

U ručnom frižideru uzorci su sa mesta sakupljanja prenošeni do zamrzivača (- 20°C) na

skladištenje do momenta upotrebe.


15

Tabela 3.1. Geografski položaj i stanišne karakteristike odabranih populacija P. mugo.

Takson P. mugo sensu stricto

Regija Evrope srednja Evropa južna Evropa (Balkansko poluostrvo)

Planinski masiv Alpi Skardsko-Pindske

planine

Balkansko-

Rodopske planine

Lokalitet

Slovenija,

Julijski Alpi,

Triglav

Kosovo i Metohija,

Šar-planina,

Ostrovica

Bugarska, Pirin,

Vihren

Broj analiziranih jedinki

(n) 15 15 15

Geografska širina (N) 46°21'56.7" 42°14'12.80" 41°45'31.95"

Geografska dužina (E) 13°52'27.8" 20°55'13.53" 23°25'0.13"

Nadmorska visina (m

a.s.l.) 1524 1734 1952

Geološka podloga Krečnjak Serpentinit Silikat

Datum sakupljanja 15.06.2016. 13.08.2016. 03.07.2016.

Vaučer broj 13097 HMN 12810 HMN 13098 HMN

3.2. Ekstrakcija epikutikularnih voskova

Epikutikularni voskovi ekstrahovani su potapanjem 5 g iglica u 10 ml n-heksana u

trajanju od 60 sekundi. Nakon toga ekstrakti su filtrirani, upareni do suvog stanja i rastvoreni

u 1 ml n-heksana. Koncentrovani ekstrakti su frakcionisani na mini koloni korišćenjem Paster

pipete napunjene florisilom (60–100 mesh). Voskovi su dobijeni eluiranjem sa 5 ml n-

heksana, nakon čega su upareni do suvog, ponovo rastvoreni u 1 ml n-heksana i čuvani na 4-

6°C do dalje analize. Ekstarkcija voskova izvršena je posebno za svaku jedinku (45 uzoraka).

3.3. GC-FID i GC-MS analiza epikutikularnih voskova

Hemijski sastav heksanskih ekstrakata je određen pomoću GC-FID (gasna

hromatografija sa plameno jonizacionim detektorom) i GC-MS (gasna hromatografija-

masena spektrometrija) tehnika analize. Svi uzorci su snimani u triplikatu, na 7890/7000B


16

GC/MS/MS tripl-kvadripol sistemu (Agilent Technologies, USA) sa Combi PAL auto-

semplerom i HP-5 MS kolonom (5% fenil metil siloksan, 30 m x 0.25 mm i.d. i 0.25 µm

debljina filma).

Temperaturni program: prvih 2.25 minuta izotermalno na 70 0C, zatim linearni

porast temperature, od 70 do 300 0C (5 °C min-1), potom izotermalno na 300 0C, zadnjih 10

minuta programa. Injektovana zapremina uzorka 5 µL (split 2:1). Bekfleš (nakon završetka

analize) 1.89 min, na 280 0C, sa helijumom pod pritiskom od 50 psi. MS uslovi: jonizacija -

70 eV, opseg masa 50-650 amu, vreme skenova 0.32 sekunde. GC-FID analiza je izvedena

pod istim eksperimentalnim uslovima kao što je već navedeno za GC-MS analizu. Procentni

sastav je preračunat na osnovu površine GC-FID pikova, bez korekcionih faktora.

Identifikacija komponenti. Komponente voskova su identifikovane pomoću

AMDIS softvera (Automated Mass Spectral Deconvolution and Identification System, Ver.

2.1, DTRA/NIST, 2011), na osnovu lineranih retencionih indeksa (RI), koji su određeni na

osnovu retencionih vremena standardne serije alkana (C8-C40), snimljene na istom aparatu i

pod istim uslovima kao i uzorci. RI su upoređivani sa literaturnim vrednostima (Van Den

Dool i Kratz, 1963; Stein, 1990; Adams, 2007; NIST Chemistry WebBook); identifikacija je

izvršena na osnovu upoređivanja masenih spektara komponenata voska sa

literaturnim/bibliotečkim masenim spektrima Wiley 6, NIST02, MassFinder 2.3 (Stein, 1990)

i MS bibliotekama dobijenih na osnovu snimanja čistih supstanci.

3.4. Statistička analiza

Sve identifikovane komponente epikutikularnih voskova P. mugo obrađene su

metodama univarijantne i multivarijantne statistike (Quinn i Keough, 2002) uz pomoć

programskog paketa Statistica, version 5.1 (StatSoft Inc., 1996, Tulsa, OK, USA).

Deskriptivna statistika. Za sve identifikovane komponente urađena je osnovna

deskriptivna statistika (srednja vrednost, maksimum, minimum, standardna devijacija i

koeficijent varijacije) na osnovu koje je urađena analiza varijabilnosti ispitivanih karaktera u

okviru istraživanih populacija. Ovi rezultati su grafički prikazani uz pomoć whisker box plota

gde je za svaki karakter prikazana njegova varijabilnost na nivou ispitivane populacije.

Koeficijent varijacije (CV%) je korišćen za opisivanje hemijske varijabilnosti karaktera i u

odnosu na njegove vrednosti karakteri su okarakterisani kao nisko varijabilni (CV% < 50),


17

umereno varijabilni (50 < CV% < 100), visoko varijabilni hemijski karakteri (100 < CV% <

150), oni karakteri kod kojih je CV% >150 su okarakterisani kao jako visoko varijabilni.

Jednofaktorska analiza varijanse (ANOVA) je urađena da bi se utvrdilo da li

postoji statistički značajna razlika u prosečnim vrednostima analiziranih karaktera između

ispitivanih populacija. Osnovni postupak na kome se zasniva ova tehnika jeste izvođenje dve

različite ocene varijanse populacija iz podataka, za koje se zatim računa količnik. Jedna od

ovih ocena (varijansa između grupa) predstavlja meru efekata nezavisne promenljive

udružene sa varijansom greške. Druga ocena (varijansa unutar grupa) je mera samo varijanse

greške. Količnik varijansi između i unutar grupa označava se kao F-vrednost ili F-količnik.

Statistički značajnan F-količnik ukazuje da su prosečne vrednosti posmatranog karaktera za

date populacije veoma različite. Da bi se utvrdilo između kojih konkretnih populacija su

ispoljene statistički značajne razlike, izvršena je i post-hoc provera rezultata dobijenih

ANOVA testom, korišćenjem Tukey HSD (honest significant difference) testa.

Analiza glavnih komponenti (PCA) je urađena na kompletnom uzorku, odnosno

korelacionoj matrici individualnih vrednosti svih hemijskih karaktera (45 individua, 17

karaktera). Ova tehnika je primenjena da bi se utvrdilo koliko koji hemijski karakter

doprinosi ukupnoj varijabilnosti uzorka kao i da bi se utvrdio odnos između pojedinih grupa

jedinki, odnosno populacija u multidimenzionalnom hemijskom prostoru. PCA ima za cilj da

smanji dimenzionalnost izvornih podataka prevodeći ih u skup novih promenljivih koje se

nazivaju glavne komponente. Glavne komponetne nisu korelisane među sobom i sukcesivno

opisuju najveći moguć procenat varijabilnosti. Rezultati su prikazani grafički

scatterplotovima u prostoru koji je definisan prvom i drugom glavnom komponentom koje

opisuju najveći procenat varijabilnosti uzorka.

Kanonijska diskriminantna analiza (CDA). Da bi se utvrdilo da li postoji

diferencijacija populacija na osnovu analiziranih karaktera urađena je kanonijska

diskriminantna analiza sa populacijama koje su uzete kao a priori grupna varijabla. Ova

analiza ima za cilj da utvrdi koliko se prethodno definisane grupe (populacije) međusobno

razlikuju i koji karakteri najviše doprinose diskriminaciji populacija.

Klaster analiza (CA). Klaster analiza omogućava grupisanje analiziranih varijabli u

grupe ili klastere tako se da slični uzorci nalaze u istog klasi (klasteru). Klaster analiza

bazirana na matrici Mahalanobisovih distanci koje su izračunate u CDA, a za koju je korišćen

Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean (UPGMA) metod hijerarhijskog


18

klasterovanja urađena je na osnovu svih identifikovanih komponenti voskova i rezultati su

prikazani grafički uz pomoć dendrograma. Ova analiza je korišćena da bi se utvrdila sličnost

između prvobitno neklasifikovanih objekata tj. populacijama u ovom slučaju.


19

4. REZULTATI

4.1. Hemijski sastav epikutikularnog voska četina P. mugo sa

područja srednje Evrope i Balkana

Dvogodišnje četine sa 45 odraslih stabala P. mugo sakupljene su sa tri planinska

masiva srednje Evrope i centralnog dela Balkanskog poluostrva: Julijski Alpi (Triglav),

Skardsko-Pindske planine (Šar-planina) i Balkansko-Rodopske planine (Pirin).

Kombinacijom GC/FID i GC/MS analize u epikutikularnom vosku četina identifikovano je

17 komponenti čije su relativne koncentracije date u tabeli 4.1, a nekoliko odabranih

hromatograma prikazano je na slikama 4.1 i 4.2. Utvrđeno je prisustvo četiri diterpena (dva

pimaranskog - pimaradien i sandarakopimaradien i dva abietanskog tipa - 18-norabieta-

8,11,13-trien i abietartrien), tri primarna alkohola (1-heksadekanol, cis-9-oktadecen-1-ol i 1-

oktadekanol) i 10 n-alkana u seriji od C20 do C29. U populaciji Triglav, diterpeni i n-alkani

predstavljaju dve dominantne grupe jedinjenja sa približno istom zastupljenošću (27.8 i

25.5%, resp.). U populaciji sa Šar-planine, n-alkani i diterpeni, takođe, imaju sličnu

zastupljenost (34.4 i 32.7%%, resp.), dok je u populaciji Pirin, sadržaj n-alkana dosta veći u

odnosu na diterpene (31.9 vs. 19.9%). U sve tri ispitivane populacije primarni alkoholi

predstavljaju najslabije zastupljenu grupu jedinjenja u epikutikularnim voskovima, pri čemu

njihov sadržaj varira od 8.1% u populaciji sa Šar-planine do 17.5% u populaciji sa Pirina

(tabela 4.1).

Najzastupljenije komponente voskova u populaciji Triglav su tri diterpena -

sandarakopimaradien, 18-norabieta-8,11,13-trien i abietartrien (10.0, 7.4 i 6.7%, resp.) i

primarni alkohol cis-9-oktadecen-1-ol (6.0%). U populacijama sa Balkanskog poluostrva

(Šar-planina i Pirin), dve najzastupljenije komponente su diterpen 18-norabieta-8,11,13-trien

(22.4% i 9.7%, resp.) i n-alkan C21 (10.1% i 8.2%, resp.). Pored njih u populaciji Šar-planina

visoko su zastupljeni diterpen abietartrien i n-alkan C25 (6.6 i 5.4%, resp.), a u populaciji

Pirin primarni alkohol cis-9-oktadecen-1-ol i n-alkan C20 (7.8 i 6.4%, resp.) (tabela 4.1).


20

Tabela 4.1. Rezultati deskriptivne statistike za 17 komponenti epikutikularnih voskova P. mugo populacija sa područja srednje Evrope i Balkanskog poluostrva

(četiri najzastupjenije komponente u svakoj od populacija su boldirane; Avg - srednja vrednost, Min - minimalna vrednost, Max maksimalna vrednost, SD -

standardna devijacija, CV – koeficijent varijacije).

Takson P. mugo sensu stricto

Populacija Triglav Šar-planina Pirin

Broj analiziranih jedinki (N) 15 15 15

R. br. Komponenta Avg Min Max SD CV% Avg Min Max SD CV% Avg Min Max SD CV%

1. 1-Heksadekanol 5.79 0.81 9.82 2.56 44.14 3.66 0.00 7.58 2.08 56.84 5.42 1.43 10.32 2.80 51.71

2. Pimaradien 3.81 0.00 24.47 6.01 157.55 0.85 0.00 2.00 0.61 71.13 1.50 0.00 3.49 1.12 74.66

3. C20 5.48 2.63 8.66 1.31 23.98 3.01 1.70 4.36 0.68 22.53 6.40 3.21 9.20 1.79 27.90

4. Sandarakopimaradien 9.97 0.70 39.50 9.87 98.93 2.82 0.60 5.85 1.48 52.27 3.14 0.00 6.82 2.49 79.36

5. 18-Norabieta-8,11,13-trien 7.35 1.52 17.66 4.89 66.46 22.39 6.70 40.07 9.58 42.80 9.71 2.81 29.66 6.91 71.16

6. cis-9-Oktadecen-1-ol 5.96 0.20 16.52 4.57 76.65 2.69 0.00 4.30 1.60 59.50 7.84 0.82 25.48 6.23 79.47

7. Abietatrien 6.70 2.81 14.97 3.66 54.67 6.61 3.53 10.27 2.08 31.51 5.55 0.00 9.25 2.44 43.93

8. 1-Oktadekanol 4.10 0.00 10.77 3.68 89.72 1.72 0.00 4.03 1.67 97.31 4.23 0.67 10.85 2.84 67.23

9. C21 5.27 2.60 10.24 2.54 48.17 10.12 3.06 41.73 9.63 95.21 8.16 3.96 12.67 3.12 38.22

10. C22 0.96 0.00 1.92 0.51 53.40 0.95 0.00 2.05 0.56 58.45 1.88 0.75 2.91 0.62 32.96

11. C23 2.57 0.77 8.35 1.99 77.60 5.03 1.05 9.95 2.77 55.12 4.82 1.25 9.22 2.31 47.91

12. C24 2.43 0.47 5.70 1.46 59.99 2.91 0.25 7.52 1.85 63.45 2.60 0.66 7.00 1.56 60.00

13. C25 5.54 0.77 33.72 8.27 149.26 5.42 0.76 10.57 3.05 56.23 3.92 0.41 9.60 2.48 63.16

14. C26 0.80 0.00 3.69 1.07 133.29 1.29 0.00 3.38 0.94 72.86 0.45 0.00 2.56 0.68 149.52

15. C27 2.12 0.00 14.16 3.69 174.23 2.94 0.34 6.81 2.19 74.47 1.63 0.19 4.22 1.33 81.67

16. C28 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.28 0.00 0.98 0.34 121.41 0.06 0.00 0.35 0.13 208.95

17. C29 0.27 0.00 1.60 0.45 163.52 2.39 0.61 5.68 1.68 70.41 2.00 0.00 7.05 2.24 111.68

Diterpeni 27.84 5.10 55.57 14.79 53.13 32.67 12.16 55.72 12.64 38.68 19.91 2.81 38.20 8.84 4439

Primarni alkoholi 15.85 1.01 36.63 10.42 65.77 8.06 0.42 15.65 4.55 56.48 17.49 3.49 46.65 11.52 65.90

n-Alkani 25.45 13.06 71.25 14.24 55.94 34.35 16.55 53.96 12.62 36.76 31.92 12.17 51.00 9.93 31.10


21

U literaturi postoji samo jedan rad u kome se navode podaci o n-alkanima iz

epikutikularnih voskova četina P. mugo i P. mugo var. pumilio (Maffei et al., 2004), prema

kome se n-alkani nalaze u seriji C18-C34, a dominira C31 (6.2 i 22.4%, resp.). Uzorkovanje

biljnog materijala je izvršeno tokom leta, izvan autohtonih populacija u rasadnicima

severozapadne Italije (Turinska regija), a hemijska analiza je sprovedena na jako malom

broju uzoraka (tri jedinke; Maffei et al., 2004).

4.1.1. Promenjivost pojedinačnih komponenti epikutikularnih voskova

Promenjivost pojedinačnih hemijskih karaktera analizirana je na osnovu rezultata

deskriptivne statistike koji su bazirani na statističkoj obradi podataka svih identifikovanih

komponenti voskova izolovanih sa četina 45 jedinki P. mugo.

Kao rezultat deskriptivne statistike, izračunate su srednja vrednost, standardna

devijacija i koeficijent varijacije (CV%). Srednja vrednost je pokazatelj prosečne vrednosti

ispitivanih karaktera i omogućava dalje korišćenje statističkih pokazatelja varijabilnosti –

standardne devijacije i koeficijenta varijacije. Standardna devijacija, kao mera apsolutne

varijabilnosti, ukazuje na prosečno odstupanje vrednosti ispitivanog karaktera od srednje

vrednosti. Varijabilnost ispitivanih karaktera se ocenjuje pomoću koeficijenta varijacije i

izražava u procentima (Bojović i Mitrović, 2010).

Koeficijent varijacije (CV%). Vrednosti koeficijenta varijacije za identifikovane

komponente epikutikularnih voskova P. mugo variraju u opsegu od 22.5 do 209.0% (tabela

4.1). Jako visok (CV%>150) i visok nivo koeficijenta varijacije (100<CV%<150) pokazuje

pet komponenti u populaciji Triglav (pimaradien i n-alkani C25, C26, C27 i C29), samo jedna u

populaciji sa Šar-planine (n-alkan C28) i tri u populaciji sa Pirina (n-alkani C26, C28 i C29). U

svakoj od ispitivanih populacija najveći broj komponenti pokazuje umeren nivo koeficijenta

varijacije (50<CV%<100). Nizak nivo koeficijenta varijacije (10<CV%<50) pokazuju po tri

komponente u populacijama Triglav (1-heksadekanol i n-alkani C20 i C21) i Šar-planina

(abietatrien, 18-norabieta-8,11,13-trien i n-alkani C20), dok u populaciji Pirin pet komponenti

(abietartrien i n-alkani C20-C23) odlikuje nizak nivo koeficijenta varijacije.


22

18-Norabieta-8,11,13-trien

Abietatrien

C23 C25 C21

Slika 4.1. Hromatogram epikutikularnog voska četina P. mugo: A) populacija Triglav (uzoark T3) B) populacija Šar-planina (uzorak S4).

B

A

Pimaradien

Sandarakopimaradien

C20


23

Slika 4.2. Hromatogram epikutikularnog voska četina P. mugo: A) populacija Šar-planina (uzoark S15) B) populacija Pirin (uzorak P13).

B 18-Norabieta-8,11,13-trien

C21

Abietatrien

C23

A

18-Norabieta-8,11,13-trien

Abietatrien

C21


24

A

Slika 4.3. Whisker plot za 17 komponenti epikutikularnih voskova P. mugo: A)

populacija Triglav B) populacija Šar-planina.

B


25

Sadržaj n-alkana C20 varira od 3.0% u populaciji Šar-planina do 6.4% u populaciji

Pirin. U svim ispitivanim populacijama spada u karaktere sa niskom varijabilnošću (tabela

4.1 i slike 4.3-4.5).

Sadržaj sandarakopimaradiena varira od 2.8% u populaciji Šar-planina do 10.0% u

populaciji Triglav. U svim ispitivanim populacijama pokazuje umeren nivo koeficijenta

varijacije.

Sadržaj 18-norabieta-8,11,13-triena varira od 7.4% u populaciji Triglav do 22.4% u

populaciji Šar-planina u kojoj spada u karaktere sa niskom varijabilnošću. U preostale dve

populacije 18-norabieta-8,11,13-triena pokazuje umeren nivo varijacije.

Sadržaj najzastupljenijeg primarnog alkohola, cis-9-oktadecen-1-ola, varira od 2.7%

u populaciji Šar-planina do 7.8% u populaciji Pirin. U svim ispitivanim populacijama spada u

karaktere sa umerenom varijabilnošću.

Slika 4.4. Whisker plot za 17 komponenti epikutikularnih voskova P. mugo - populacija Pirin.


26

Sadržaj abietartriena varira od 5.6% u populaciji Pirin do 6.7% u populaciji Triglav

u kojoj pokazuje umeren nivo varijacije. U preostale dve populacije spada u karaktere sa

niskom varijabilnošću.

Sadržaj n-alkana C21 varira od 5.3% u populaciji Triglav, u kojoj pokazuje nizak nivo

varijacije, do 10.1% u populaciji Šar-planina, gde spada u karaktere sa umerenom

varijabilnošću.

Sadržaj n-alkana C25 varira od 3.9% u populaciji Pirin, gde spada u karaktere sa

umerenom varijabilnošću, do 5.5% u populaciji Triglav, u kojoj pokazuje visok nivo

koeficijenta varijacije.

4.1.2. Analiza varijanse (ANOVA)

U cilju utvrđivanja da li postoji statistički značajna razlika u prosečnim vrednostima

hemijskih karaktera (komponenti epikutikularnog voska) između analiziranih populacija

(Triglav, Šar-planina i Pirin) urađena je analiza varijnse (ANOVA). ANOVA ili disperziona

analiza, predstavlja analitički model za testiranje značajnosti razlika između srednjih

vrednosti ispitivanih grupa, koji omogućava izdvajanje karaktera koji su statistički značajni

za diferencijaciju ispitivanih grupa (Bojović i Mitrović, 2010).

Slika 4.5. Varijabilnost dominantnih komponenti epikutikularnih voskova P. mugo

u ispitivanim populacijama.


27

Tabela 4.2. Rezultati analize varijanse – ANOVA (sa Tukey HSD post-hoc testom) za 17

komponenti epikutikularnih voskova u istraživanim populacijama P. mugo.

R. br. Karakter F1) P2) Prosečni sadržaj (%)3)

Triglav Šar-planina Pirin

N=154) N=15 N=15

1. 1-Heksadekanol 3.14 ns 5.79 3.66 5.42

2. Pimaradien 2.81 ns 3.81 0.85 1.50

3. C20 25.68 *** 5.48b 3.01a 6.40b

4. Sandarakopimaradien 6.74 ** 9.97b 2.82a 3.14a

5. 18-Norabieta-8,11,13-

trien 17.83 *** 7.35a 22.39b 9.71a

6. cis-9-Oktadecen-1-ol 4.88 * 5.96ab 2.69a 7.84b

7. Abietatrien 0.74 ns 6.70 6.61 5.55

8. 1-Oktadekanol 3.64 * 4.10a 1.72a 4.23a

9. C21 2.41 ns 5.27 10.12 8.16

10. C22 12.80 *** 0.96a 0.95a 1.88b

11. C23 4.87 * 2.57a 5.03b 4.82b

12. C24 0.34 ns 2.43 2.91 2.60

13. C25 0.41 ns 5.54 5.42 3.92

14. C26 3.08 ns 0.80 1.29 0.45

15. C27 0.94 ns 2.12 2.94 1.63

16. C28 7.28 ** 0.00a 0.28b 0.06a

17. C29 7.22 ** 0.27a 2.39b 2.00b

1) F: ANOVA F-test. 2) P: nivoi statističke značajnosti (*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001,

ns: nema značajnosti). 3) Prosečni sadržaji sa različitim superskript slovima u istom redu

(a, b) se značajno razlikuju (Tukey HSD post-hoc test). 4) Broj analiziranih jedinki za

datu populaciju.

ANOVA je ukazala na postojanje značajnih razlika između ispitivanih populacija P.

mugo za 9 komponenti epikutikularnih voskova (sandarakopimaradien, 18-norabieta-8,11,13-

trien, cis-9-oktadecen-1-ol, 1-oktadekanol i n-alkane C20, C22, C23, C28 i C29) (tabela 4.2).

Post-hoc provera rezultata dobijenih ANOVA testom, korišćenjem Tukey HSD testa,

potvrdila je značajnost svih karaktera, osim za n-alkan C22. Tri komponente epikutikularnih

voskova (sandarakopimaradien i n-alkani C23 i C29) ukazale su na izdvajanje populacije

Triglav u odnosu na preostale dve ispitivane populacije. Populacija Šar-planina se, takođe,


28

značajno razlikuje od preostale dve ispitivane populacije na osnovu sadržaja tri komponente

(18-norabieta-8,11,13-triena i n-alkana C20 i C28), dok je na izdvajanje populacije Pirin

ukazao samo jedan karakter (n-alkan C22). Sadržaj cis-9-oktadecen-1-ola se značajno

razlikuje samo između populacija Šar-planina i Pirin, a nijedan od testiranih karaktera nije

pokazao statistički značajne razlike između sve tri ispitivane populacije P. mugo.

4.1.3. Analiza glavnih komponenti (PCA)

Analiza glavnih komponenti (PCA) 17 komponenti epikutikularnih voskova, koja je

bazirana na korelacionoj matrici individualnih vrednosti, pokazala je da prve tri glavne

komponente opisuju 65.4% ukupne varijabilnosti uzorka (tabela 4.3). Prva glavna

komponenta (PC1) opisuje 33.2% ukupne varijabilnosti, druga (PC2) 21.5%, a treća (PC3)

10.7%. Karakteri koji najviše doprinose ukupnoj varijabilnosti na prvoj glavnoj komponenti

su n-alkani C22-C29. Na drugoj glavnoj komponenti varijabilnosti najviše doprinose tri

primarna alkohola (1-heksadekanol, cis-9-oktadecen-1-ol i 1-oktadekanol), diterpen 18-

norabieta-8,11,13-trien i n-alkan C20.

Rezultati ove analize pokazuju totalno preklapanje ispitivanih populacija što ukazuje

da je varijabilnost epikutikularnih voskova P. mugo složena (slika 4.5A). Naime, na osnovu

disperzije jedinki u koordinantnom sistemu definisanom osama PC1 i PC2, može se uočiti

tendencija formiranja tri grupe jedinki. Prva grupa, koja pokazuje negativne vrednosti za

PC1, uključuje jedinke iz sve tri ispitivane populacije, iako najmanje jedinki iz populacije

Triglav. Ovu grupu odlikuju epikutikularni voskovi sa većim sadržajem n-alkana C22-C29 u

poređenju sa ostalim grupama (slika 4.5B). Pretežno u pozitivnom delu PC1 nalaze se druga i

treća grupa jedinki, međusobno odvojene po PC2. Druga grupa, koja se nalazi u pozitivnom

delu PC2, uključuje samo jedinke iz populacija Triglav i Pirin čiji voskovi sadrže veći

primarnih alkohola (1-heksadekanola, cis-9-Oktadecen-1-ola i 1-oktadekanola) i najkraćeg n-

alkana C20, Treća grupa, koja se nalazi u negativnom delu PC2, uključuje jedinke iz sve tri

populacije čiji voskovi sadrže veći procenat diterpena (pimaradiena, sandarakopimaradiena,

18-norabieta-8,11,13-triena i abietatriena) i n-alkana C21.


29

A

B

Slika 4.5. A) Analiza glavnih komponenti (PCA) 45 P. mugo individua iz tri autohtone

populacije sa područja srednje Evrope i Balkanskog poluostrva (Triglav, Šar-planina i

Pirin) B) Prikaz 17 komponenti epikutikularnih voskova u projekciji prve dve PC ose.


30

Tabela 4.3. Opterećenje hemijskih karaktera na prve tri ose analize glavnih komponenti

(PCA). Boldirane vrednosti su statistički značajne >0.5.

R. br. Karakter Faktor

1

Faktor

2

Faktor

3

1. 1-Heksadekanol 0.096 0.855 0.290

2. Pimaradien 0.384 -0.064 -0.732

3. C20 0.387 0.615 -0.252

4. Sandarakopimaradien 0.474 -0.142 -0.711

5. 18-Norabieta-8,11,13-

trien 0.164 -0.702 0.466

6. cis-9-Oktadecen-1-ol -0.004 0.906 0.198

7. Abietatrien 0.448 -0.264 0.408

8. 1-Oktadekanol -0.038 0.890 0.160

9. C21 0.132 -0.344 0.347

10. C22 -0.560 0.343 -0.012

11. C23 -0.896 -0.025 -0.018

12. C24 -0.881 0.114 -0.154

13. C25 -0.770 0.052 -0.140

14. C26 -0.774 -0.144 -0.093

15. C27 -0.832 -0.018 -0.066

16. C28 -0.722 -0.248 -0.053

17. C29 -0.748 -0.124 0.054

Prp.Totl 0.332 0.215 0.107

U populaciji Pirin utvrđeno je prisutvo sva tri tipa epikutikularnih voskova sa

pribižnom istom zastupljenoću, što nam ukazuje da se ova populacija odlikuje i najvećim

nivoom varijabilnosti komponenti epikutikularnih voskova. U populaciji Triglav je, takođe,

utvrđeno prisustvo sva tri hemotipa, iako su jedinke čiji voskovi sadrže veći procenat n-

alkana C22-C29 najslabije zastupljene. Na kraju, populacija Šar-planina se odlikuje najnižim

nivoom varijabilnosti voskova, s obzirom na prisustvo samo dva hemotipa.


31

4.1.4. Kanonijska diskriminantna analiza (CDA)

Kanonijska diskriminantna analiza (CDA) na osnovu 45 jedinki iz tri a priori grupe

(ispitivane populacije P. mugo) pokazala je da prve dve diskriminantne ose (CA1 i CA2)

učestvuju u 100% ukupne diskriminacije, od čega CA1 sa 65.7% (tabela 4.4). CA1 je najviše

određena sadržajem diterpena 18-norabieta-8,11,13-triena i n-alkana C23, C24, C25, C27 i C28

dok je CA2 najviše određena sadržajem n-alkana C22, C24 i C27.

Scatterplot, dobijen na osnovu CDA (slika 4.6A), pokazao je da se populacija Triglav

po CA1, koja opisuje najveći procenat diskriminacije, jasno radvaja od populacija sa

Balkanskog poloustrva (Pirin i Šar-planina). Naime, sve jedinke iz ove populacije nalaze se u

negativnom delu CA1, dok su se individue iz populacija sa Balkana koncentrisale kao dve

susedne grupe pretežno na pozitnom delu CA1. Međutim, populacija Šar-planina je dodatno

odvojena i po CA2, s obzirom da se jedino individue iz ove populacije nalaze u njenom

pozitivnom delu. CDA sa 3 a priori grupe u proseku je korektno klasifikovala čak 95.5%

ispitivanih individua (tabela 4.5): 100% u populacijama Triglav i Šar-planina i 85.7% u

populaciji Pirin.

Na opisanu diferencijaciju populacija P. mugo utiče nekoliko komponenti

epikutikularnih voskova (tabela 4.4). Populacija Triglav može biti opisana kao hemotip 1 čiji

voskovi sadrže najmanji procenat diterpena 18-norabieta-8,11,13-triena i n-alkana C23 i C24

(7.4, 2.6 i 2.4%, resp.). Populacija Pirin pripada hemotipu 2 čiji voskovi sadrže najmanji

procenat n-alkana C25 i C27 (3.9 i 1.6%, resp.), a najveći procenat C22 (1.9%). Na kraju,

populacija Šar-planina može biti okarakterisana kao hemotip 3 čiji voskovi sadrže najveći

procenat diterpena 18-norabieta-8,11,13-triena i n-alkana C23, C24, C27 i C28 (22.4, 5.0, 2.9,

2.9 i 0.3%, resp.) u poređenju sa ostalim grupama.


32

Tabela 4.4. Standardizovani koeficijenti za prve dve kanonijske ose (CA) 17 komponenti

voskova na osnovu kanonijske diskriminantne analize sa 3 a priori grupe. Boldirane

vrednosti su statistički značajne >1.0.

R. br. Karakter CA1 CA2

1. 1-Heksadekanol 0.72 -0.91

2. Pimaradien 0.18 -0.35

3. C20 0.50 0.64

4. Sandarakopimaradien -0.47 -0.68

5. 18-Norabieta-8,11,13-trien 1.90 -0.10

6. cis-9-Oktadecen-1-ol 0.02 0.60

7. Abietatrien -0.87 -0.73

8. 1-Oktadekanol -0.13 -0.14

9. C21 0.77 -0.31

10. C22 -0.42 1.10

11. C23 1.78 -0.02

12. C24 -1.74 -1.50

13. C25 1.31 0.78

14. C26 0.78 -0.03

15. C27 -1.89 -1.46

16. C28 1.01 0.14

17. C29 0.69 0.59

Cum. Prop. 0.657 1.000

Tabela 4.5. Procenat korektne klasifikacije u a priori definisanim grupama.

Populacija Procenat korektne

klasifikacije

Triglav 100.00

Šar-planina 100.00

Pirin 85.71

Total 95.45


33

Slika 4.6. A) Kanonijska diskriminantna analiza (CDA) na osnovu sadržaja 17

komponenti voskova izolovanih sa četina 45 jedinki P. mugo sa 3 a priori grupe B)

Klaster analiza 3 populacije P. mugo bazirana na 17 komponenti epikutikularnih

voskova.

A

B


34

4.1.5. Klaster analiza (CA)

Klaster analiza omogućava grupisanje analiziranih varijabli u grupe ili klastere tako se

da slični uzorci nalaze u istoj klasi (klasteru). U ovoj analizi je korišćen algomerativni

hijerarhijski metod (UPGMA) koji kao krajnji rezultat produkuje dendogram koji u suštini,

može da se shavati kao grafički prikaz sličnosti upoređivanih grupa. Ova analiza je korišćena

da bi se utvrdila sličnost između prvobitno neklasifikovanih objekata tj. populacija P. mugo u

ovom slučaju.

Na dendogramu, koji je dobijen pomoću CA (slika 4.6B), možemo primetiti

grupisanje analiziranih populacija krivulja na sličan način, kao i na scatterplotu koji je

dobijen na osnovu CDA (slika 4.6AB). Najveći pocenat sličnosti dele dve populacije sa

Balkanskog poluostrva (Pirin i Šar-planina), dok se populacija Triglav izdvaja u poseban

klaster.


35

5. DISKUSIJA

5.1. Varijabilnost ispitivanih P. mugo populacija

Na osnovu varijabilnosti komponenti epikutikularnih voskova, PCA je ukazala na

prisustvo tri različita hemotipa kod 45 jedinki P. mugo sa tri planinska masiva srednje Evrope

i centralnog Balkana: hemotip 1 odlikuju epikutikularni voskovi sa većim sadržajem n-alkana

C22-C29; hemotip 2 voskovi sa većim sadržajem primarnih alkohola (1-heksadekanola, cis-9-

Oktadecen-1-ola i 1-oktadekanola) i najkraćeg n-alkana C20; i hemotip 3 voskovi sa većim

procenatom diterpena (pimaradiena, sandarakopimaradiena, 18-norabieta-8,11,13-triena i

abietatriena) i n-alkana C21. U populaciji Pirin utvrđeno je prisutvo sva tri tipa epikutikularnih

voskova sa pribižnom istom zastupljenoću, što nam ukazuje da se ova populacija odlikuje i

najvećim nivoom varijabilnosti komponenti epikutikularnih voskova. U populaciji Triglav je,

takođe, utvrđeno prisustvo sva tri hemotipa, iako su jedinke čiji voskovi sadrže veći procenat

n-alkana C22-C29 najslabije zastupljene. Na kraju, populacija Šar-planina se odlikuje najnižim

nivoom fitohemijskog diverziteta, s obzirom na prisustvo samo dva hemotipa.

Na osnovu dobijenih rezultata možemo zaključiti da P. mugo odlikuje relativno visok

nivo varijabilnosti voskova (tri hemotipa – „alkanski“, „alkoholski“ i „diterpenski“ kod svega

45 ispitivanih jedinki), što je donekle i očekivan rezultat. Naime, poznato je da se četinari kao

višegodišnje, stranooplodne vrste koje se oprašuju i rasejavaju putem vetra, sa velikim

fekunditetom, brojem hromozama, arealom i karakteristične za kasne stadijume sukcesije

fitocenoza, odlikuju izuzetno visokim stepenom genetičkog diverziteta u populacijama i

vrstama u celini (Hamrick et al., 1979). Takođe, Balkansko poluostrvo zajedno sa

Apeninskim i Pirinejskim predstavlja tzv. vruće tačke diverziteta četinara u Evropi,

prvenstveno zbog uloge refugijuma tokom poslednje Pleistocenske glacijacije (Last Glacial

Maximum, LGM). Kao rezultat neprekidnog prisustva, borovi imaju veći genetički diverzitet

na ovim poluostrvima nego u ostalim delovima Evrope koje su rekolonizovani posle LGM

(Naydenov, 2006, prema Šarac, 2014). Ipak, na osnovu pregleda objavljenih rezultata

genetičkog diverziteta evroazijskih borova na osnovu cpSSRs (hloroplastnih mikrosatelita),

očigledno je da postoji ogromna varijabilnost: termofilni mediteranski borovi kao što su P.

pinaster, P. brutia, P. halepensis i P. pinea pokazuju izuzetno niske nivoe ili čak odsustvo

genetičkog diverziteta dok se frigorifilni borovi, P. sylvestris, P. mugo, P. uncinata i P. nigra

odlikuju najvećim stepenom genetičkog diverziteta (Šarac, 2014). Smatra se da su tokom


36

klimatskih fluktuacija u periodu Kvartara kserotermni borovi preživeli izuzetno snažan efekat

"uskog grla" (bottleneck effect) odnosno rapidno smanjenje brojnosti, s obzirom da su tokom

poslednje glacijacije mogli da opstanu isključivo u najjužnijim tačkama refugijuma u kojima

su postojali povoljni ekološki uslovi za njihov opstanak. Ovo je za posledicu imalo drastično

smanjenje brojnosti i efektivne veličine populacija kao i gubitak genetičkog diverziteta. Na

žalost, fitohemijski diverzitet populacija termofilnih mediteranskih borova još uvek nije

istraživan na nivou epikutikularnih voskova, tako da za sada ne posotoje podaci o razlici

između varijabilnosti epikutikularnih voskova frigorifilnih vs. termofilnih borova.

Sa druge strane, frigorifilni borovi su, s obzirom na bolju adaptiranost na hladnije

uslove, mogli da održe veće efektivne veličine populacija i genetičku varijabilnost tokom

klimatskih fluktuacija Kvartara. Na primer, za P. sylvestris je objavljeno da je preživeo sve

glacijalne faze u kontinentalnim visoravnima severne Španije (Franco-Múgica et al., 2001,

prema Šarac, 2014), gde je utvrđen i veoma visok nivo diverziteta cpSSRs, na osnovu koga

su Robledo-Arnuncio et al. (2005) ukazali na mogućnost da je P. sylvestris uspeo da održi

demografsku stabilnost tokom uzastopnih klimatskih ciklusa u najsevernijim delovima

Iberijskog poluostrva i da je ovo verovatno slučaj i sa P. nigra i P. mugo sensu lato. Sa druge

strane, Dzialuk et al. (2012) i Heuertz et al. (2010), na osnovu varijabilnosti cpSSRs,

pretpostavljaju da je P. mugo s.l. preživeo LGM in situ na području srednje Evrope: u

različitim prostorno izolovanim refugijumima Sudeta, Alpa i Zapadnih Karpata (Dzialuk et

al., 2012) odnosno Alpa i Pirineja (Heuertz et al., 2010) na kojima je imao više refugijalnih

staništa gde je uspešno preživeo nepovoljne klimatske prilike. Sa druge strane, Dzialuk et al.

(2016), koji su po prvi put analizirali populacije P. mugo s.l. iz celog areala, navode da su

glacijalni refugijumi P. mugo s.l. postojali samo na Alpima i Istočnim i Južnim Karpatima,

dok se u populacijama sa Sudeta, Zapadnih Karpata, planina Balkanskog poluostrva i Pirineja

nalaze tragovi dekolonizacionih procesa koji su sledili nakon LGM.

U svakom slučaju, visok nivo varijabilnosti epikutikularnih voskova P. mugo

populacija sa Julijskih Alpa i dva planinska masiva centralnog Balkana u saglasnosti je sa

dosadašnjim populaciono-genetičkim istraživanjima ove frigorifilne Pinus vrste. Ipak, nešto

manji nivo varijabilnosti koji je utvrđen u populaciji Šar-planina može se objasniti sledećim

činjenicama: 1) područje Šar-planine pretrpelo je nekoliko većih požara tokom prošlosti kada

su sastojine P. mugo značajno redukovane; 2) ovo područje je donedavno (<30 pre godina)

bilo pod snažnim antropogenim pritiskom (spaljivanje populacija u cilju stvaranja alpskih

pašnjaka, korišćenje drva za ogrev u domaćinstvima itd.), i tek nakon što je 1986. godine


37

proglašeno za Nacionalni park, sastojine P. mugo su postale zakonom zaštićene od seče. Sa

druge strane, populacije P. mugo na Pirinu i Triglavu nalaze se u okviru nacinalnih parkova

koji su osnovani 30-ak godina ranije; 3) ova populacija je jedina istraživana populacija

krivulja koja preživljava na negostoljubivoj serpentinskoj podlozi. Kao mogući rezultat svih

navedenih faktota, na Pirinu i Triglavu P. mugo formira veoma guste sastojine iznad gornje

šumske granice, dok se na Šar-planina ova vrsta javlja u vidu malih rasutih grupa ili

pojedinačnih jedinki.

5.2. Diferencijacija populacija

Obe multivarijantne analize (CDA i CA), koje se korišćene u cilju utvrđivanje

fitohemijske diferencijacije analiziranih populacija P. mugo, pokazale su jasno izdvajanje

populacije sa Julijskih Alpa u odnosu na populacije sa Balkanskog poluostrva. Dobijena

korelacija Mahalanobisovih distanci i geografske udaljenosti ispitivanih populacija ukazuje

na njihovu potencijalnu geografsku diferencijaciju, tj. „izolaciju putem distance“ (isolation by

distance – IBD). Područje Alpskog planinskog sistema je već predloženo za poseban

vikarijantni genski pool P. mugo na osnovu cpSSR diverziteta u dve nezavisne studije

(Heuertz et al., 2010; Dzialuk et al., 2016). Distinktni genski pool-ovi na glavnim planinskim

masivima Evrope su, takođe, identifikovani i za neke druge četinarske vrste iz regiona kao što

su Abies alba (Vendramin et al., 1999), P. nigra (Afzal-Rafii i Dodd, 2007) i P. cembra

(Höhn et al., 2009). Jasno izdvajanje populacije Julijski Alpi u nezavistan klaster u odnosu na

populacije sa Balkana, ide u prilog hipotezi da se u navedenim delovima areala zapravo

nalaze dva različita vikarijantna genska pool-a P. mugo. Međutim, prema Dzialuk et al.

(2016), balkanske populacije P. mugo su genetički heterogene, tj. pod uticajem genskog pool-

a sa Istočnih i Južnih Karpata sa jedne i genskog pool-a Alpa sa druge strane. Ovakav tip

genetičkog diverziteta ukazuje na kolonizaciju Balkanskog poluostrva iz dva različita

glacijalna refugijuma: sa Alpa preko Dinarida i sa Južnih Karpata. Slične rezultate

publikovali su i Boratyńska et al. (2015) na osnovu morfo-anatomskih karakteristika četina P.

mugo: dve balkanske populacije pripale su grupi Alpi, jedna se spojila sa grupom Istočni i

Južni Karpati, a jedna je imala intermedijaran položaj. Ipak, na osnovu cpSSR diverziteta,

veći broj balkanskih populacija pripada karpatskom genskom pool-u u odnosu na Alpe

(Dzialuk et al., 2016). S obzirom da u ovom radu nisu analizirane populacije sa Južnih i


38

Istočnih Karpata, osobenost balkanskih populacija P. mugo na nivou epikutikularnih voskova

još uvek ne može biti u potpunosti potvrđena.

Ukoliko pogledamo scatterplot dobijen na osnovu CDA, očigledno je da postoji i

određen stepen fitohemijske diferencijacije između dve ispitivane balkanske populacije P.

mugo. Naime, jedinke iz obe populacije nalaze se pretežno u pozitivnom delu CA1, ali

međusobno su radvojene po CA2. Sa druge strane, Slavov i Zhelev (2004) su pokazali

odsustvo diferencijacije između 15 populacija P. mugo sa četiri planine na teritorije Bugarske

(Rila, Pirin, Stara planina i Vitoša) na osnovu alozima, a sličan rezultat su publikovali

Hajadari et al. (2015) za 6 populacija sa Šar-planine i Prokletija na osnovu terpenskih

markera. Ovakvo odsustvo diferencijacije između populacija P. mugo sa planinskih masiva

Bugarske ili Kosova i Metohije može se objasniti činjenicom da su ispitivane fragmentisane

populacije samo mali ostaci nekadašnjeg većeg arela krivulja koji je postojao na ovim

prostorima pre nego što je klima u Holocenu počela da se zagreva. Naime, sa porastom

temperature, veće nadmorske visine su postajale dostupne i kolonizovane od strane P. mugo

individua, dok su se sastojine na nižim nadmorskim visinama postepeno smanjivale pod

pritiskom jačih kompetitora. S obzirom da je životni vek P. mugo često oko 200 godina,

poslednjih 4000-6000 godina verovatno nije dovoljan vremenski period za diferencijaciju

malih fragmentisanih populacija na velikim nadmorskim visinama planinskih masiva

Bugarske ili Kosova i Metohija, čak i u odsustvu protoka gena između njih. Dakle, s obzirom

da je do razdvajanja ispitivanih populacija došlo u skorijoj prošlosti (pre 4000-6000 godina),

odsustvo njihove sadašnje diferencijacije (na osnovu alozima i terpenskih markera) donekle

je i očekivano. Pored toga, poznato je da se četinarske vrste, generalno, odlikuju izuzetno

niskim stepenom genetičke diferencijacije populacija usled efektivnog protoka gena putem

rasejavanja polena i semena (Hamrick et al., 1979).

Sa druge strane, dobijena blaga diferencijacija balkanskih populacija P. mugo u ovom

radu, može se, donekle, objasniti činjenicom da se ove populacije nalaze i na oko tri puta

većoj geografskoj udaljenosti (ca. 300 km) u odnosu na populacije koje su ispitivali Slavov i

Zhelev (2004) i Hajadari et al. (2015). Ipak, ne možemo zanemariti činjenicu da P. mugo

produkuje ogromne količine polena koji se može preneti na izuzetno velike geografske

distance, tako da je protok gena preko polena moguć i između mnogo udaljenijih populacija

kao što su npr. populacije sa Sudeta, Alpa i Tatra, udaljene i više od 1000 km (iako sa malom

verovatnoćom efektivne polinacije; Sjögren et al., 2008). Na kraju, možemo napomenuti i da

se ispitivane balkanske populacije P. mugo u ovom radu nalaze na različitim planinskim


39

sistemima, tj. Skardsko-Pindskom i Balkansko-Rodopskom. Fitohemijska diferencijacija

između populacija sa različitih planinskih sistema Balkanskog poluostrva je, takođe utvrđena

i kod P. heldreichii na osnovu terpenskih markera (Dinarski Alpi vs. Skardsko-Pindski

planinski masiv; Nikolić et al., 2015).


40

6. ZAKLJUČCI

1. U epikutikularnim voskovima dvogodišnjih četina P. mugo iz tri prirodne populacije

sa područja srednje Evrope i Balkanskog poluostrva (Triglav, Šar-planina i Pirin)

utvrđeno je prisustvo četiri diterpena (pimaradien, sandarakopimaradien, 18-

norabieta-8,11,13-trien i abietartrien), tri primarna alkohola (1-heksadekanol, cis-9-

oktadecen-1-ol i 1-oktadekanol) i 10 n-alkana u seriji od C20 do C29.

2. U populaciji Triglav, diterpeni i n-alkani predstavljaju dve dominantne grupe

jedinjenja sa približno istom zastupljenošću (27.8 i 25.5%, resp.). U populaciji sa

Šar-planine, n-alkani i diterpeni, takođe, imaju sličnu zastupljenost (34.4 i 32.7%%,

resp.), dok je u populaciji Pirin, sadržaj n-alkana dosta veći u odnosu na diterpene

(31.9 vs. 19.9%). U sve tri ispitivane populacije primarni alkoholi predstavljaju

najslabije zastupljenu grupu jedinjenja u epikutikularnim voskovima, pri čemu njihov

sadržaj varira od 8.1% u populaciji Šar-planina do 17.5% u populaciji Pirin.

3. Najzastupljenije komponente voskova u populaciji Triglav su tri diterpena -

sandarakopimaradien, 18-norabieta-8,11,13-trien i abietartrien (10.0, 7.4 i 6.7%, resp.)

i primarni alkohol cis-9-oktadecen-1-ol (6.0%). U populacijama sa Balkanskog

poluostrva (Šar-planina i Pirin), dve najzastupljenije komponente su diterpen 18-

norabieta-8,11,13-trien (22.4% i 9.7%, resp.) i n-alkan C21 (10.1% i 8.2%, resp.).

Pored njih u populaciji Šar-planina visoko su zastupljeni diterpen abietartrien i n-

alkan C25 (6.6 i 5.4%, resp.), a u populaciji Pirin primarni alkohol cis-9-oktadecen-1-

ol i n-alkan C20 (7.8 i 6.4%, resp.).

4. ANOVA je ukazala na postojanje značajnih razlika između ispitivanih populacija P.

mugo za 9 komponenti epikutikularnih voskova (sandarakopimaradien, 18-norabieta-

8,11,13-trien, cis-9-oktadecen-1-ol, 1-oktadekanol i n-alkane C20, C22, C23, C28 i C29),

što ukazuje na to da postoji statistički značajna razlika između ispitivanih populacija

na nivou pojedinih karaktera. Takođe, post-hoc provera rezultata dobijenih ANOVA

testom, korišćenjem Tukey HSD testa, potvrdila je značajnost svih karaktera, osim za

n-alkan C22.


41

5. Na osnovu varijabilnosti komponenti epikutikularnih voskova, PCA je ukazala na

prisustvo tri različita hemotipa kod 45 jedinki P. mugo: hemotip 1 odlikuju

epikutikularni voskovi sa većim sadržajem n-alkana C22-C29; hemotip 2 voskovi sa

većim sadržajem primarnih alkohola i najkraćeg n-alkana C20; i hemotip 3 voskovi sa

većim procenatom diterpena i n-alkana C21. U populaciji Pirin utvrđeno je prisutvo sva

tri tipa epikutikularnih voskova sa pribižnom istom zastupljenoću, što nam ukazuje da

se ova populacija odlikuje i najvećim nivoom varijabilnosti komponenti

epikutikularnih voskova. U populaciji Triglav je, takođe, utvrđeno prisustvo sva tri

hemotipa, iako su jedinke čiji voskovi sadrže veći procenat n-alkana C22-C29

najslabije zastupljene. Na kraju, populacija Šar-planina se odlikuje najnižim nivoom

fitohemijskog diverziteta, s obzirom na prisustvo samo dva hemotipa. Za ovako visok

nivo varijabilnosti epikutikularnih voskova P. mugo (tri hemotipa – „alkanski“,

„alkoholski“ i „diterpenski“ kod svega 45 ispitivanih jedinki), možemo reći da je i

očekivan, s obzirom da se četinari se, generalno, odlikuju izuzetno visokim stepenom

genetičkog diverziteta u populacijama i vrstama u celini, kao i da su na to ukazala sva

dosadašnja populaciono-genetička istraživanja ove frigorifilne Pinus vrste.

6. CDA i CA, koje se korišćene u cilju utvrđivanje fitohemijske diferencijacije

populacija P. mugo, pokazale su jasno izdvajanje populacije sa Julijskih Alpa u

odnosu na populacije sa Balkanskog poluostrva. Dobijena korelacija Mahalanobisovih

distanci i geografske udaljenosti ispitivanih populacija krivulja ukazuje na njihovu

potencijalnu geografsku diferencijaciju, tj. „izolaciju putem distance“. Izdvajanje

populacije sa Julijskih Alpa u nezavistan klaster u odnosu na populacije sa Balkana,

ide u prilog hipotezi da se u navedenim delovima areala P. mugo nalaze dva različita

vikarijantna genska pool-a. Ipak, s obzirom da u ovom radu nisu analizirane

populacije sa Južnih i Istočnih Karpata, osobenost balkanskih populacija P. mugo na

nivou epikutikularnih voskova još uvek ne može biti u potpunosti potvrđena.

7. CDA i CA su ukazale i na određen stepen fitohemijske diferencijacije između

ispitivanih balkanskih populacija P. mugo koje se nalaze na različitim planinskim

sistemima: Skardsko-Pindskom i Balkansko-Rodopskom.

8. Za sticanje boljeg uvida u fitohemijski diverzitet i diferencijaciju populacija P. mugo

potrebno je uključiti u analizu populacije iz celog areala rasprostranjenja, kao i veći

broj fitohemijskih markera (npr. terpene, fenole, flavnoide, masne kiseline itd.).


42

7. LITERATURA

Adams R. P. (2007). Identification of Essential Oil Component by Gas

Chromatography/Quadrupole Mass Spectrometry, Allured Publishing Corporation,

Carol Stream, IL.

Afzal-Rafii Z., Dodd R. S. (2007). Chloroplast DNA supports a hypothesis of glacial refugia

over postglacial recolonization in disjunct populations of black pine (Pinus nigra) in

western Europe. Molecular Ecology, 16(4), 723-736.

Barnes J. D., Percy K. E., Paul N. D., Jones P., McLaughlin C. K., Mullineaux P. M.,

Wellburn A. R. (1996). The influence of UV-B radiation on the physicochemical

nature of tobacco (Nicotiana tabacum L.) leaf surfaces. Journal of Experimental

Botany, 47(1), 99-109.

Barthlott W., Neinhuis C. (1997). Purity of the sacred lotus, or escape from contamination in

biological surfaces. Planta, 202(1), 1-8.

Barthlott W., Neinhuis C., Cutler D., Ditsch F., Meusel I., Theisen I., Wilhelmi H. (1998).

Classification and terminology of plant epicuticular waxes. Botanical Journal of the

Linnean Society, 126(3), 237-260.

Bojović S., Mitrović S. (2010). Biostatistika. – Institut za šumarstvo, Beograd.

Bojović S., Šarac Z., Nikolić B., Tešević V., Todosijević M., Veljić M., Marin P. D. (2012).

Composition of n-alkanes in natural populations of Pinus nigra from Serbia–

chemotaxonomic implications. Chemistry & Biodiversity, 9(12), 2761-2774.

Boratyńska K., Dzialuk A., Lewandowski A., Marcysiak K., Jasiñska K.A., Sobierajska K.,

Tomaszewski D., Burczyk J., Boratyński A. (2014). Geographic distribution of

quantitative traits variation and genetic variability in natural populations of Pinus

mugo in Central Europe. Dendrobiology, 72, 65-84.

Boratyńska K., Jasińska A. K., Boratyński A. (2015). Taxonomic and geographic

differentiation of Pinus mugo complex on the needle characteristics. Systematics and

Biodiversity, 13(6), 581-595.


43

Bush R. T., Mclnerney F. A. (2013). Leaf wax n-alkane distributions in and across modern

plants: implications for paleoecology and chemotaxonomy. Geochimica et

Cosmohimica Acta, 117, 161-179.

Chase M. W., Reveal J. L. (2009). A phylogenetic classification of the land plants to

accompany APG III. Botanical Journal of the Linnean Society, 161(2), 122-127.

Chikaraishi Y., Naraoka H. (2003). Compound-specific δD–δ 13 C analyses of n-alkanes

extracted from terrestrial and aquatic plants. Phytochemistry, 63(3), 361-371.

Dzialuk A., BoratyŃska K., Romo, A., BoratyŃski A. (2016). Taxonomic and geographic

variation of the Pinus mugo complex on chloroplast microsatellite

markers. Systematics and Biodiversity, 15, 1-16.

Dzialuk A., Boratyński A., Boratyńska K., Burczyk J. (2012). Geographic patterns of genetic

diversity of Pinus mugo (Pinaceae) in Central European mountains. Dendrobiology,

68, 31-41.

Eigenbrode S. D., Espelie K. E. (1995). Effects of plant epicuticular lipids on insect

herbivores. Annual Review of Entomology, 40(1), 171-194.

Ensikat H. J., Boese M., Mader W., Barthlott W., Koch K. (2006). Crystallinity of plant

epicuticular waxes: electron and X-ray diffraction studies. Chemistry and Physics of

Lipids, 144(1), 45-59.

Farr T. G., Rosen P. A., Caro E., Crippen R., Duren R., Hensley S., Kobrick M., Paller M.,

Rodriguez E., Roth L., Seal D., Shaffer S., Shimada J., Umland J., Werner M.,Oskin

M., Burbank D., Alsdorf D. (2007). The shuttle radar topography mission. Reviews of

Geophysics, 45, RG2004. 10.1029/2005RG000183.

Gaussen H., Heywood V. H., Charter A. O. 1993. Pinus L.. In: Tutin T. G., Heywood V. H.,

Burges N. A., Valentine D. H., Walters S. M., Webb B. A., editors. Flora Europea.

Vol. 1, 2nd edn. Cambridge University Press, Cambridge, pp. 40-44.

Hajdari A., Mustafa B., Ahmeti G., Pulaj B., Lukas B., Ibraliu A., Novak J. (2015).

Essential oil composition variability among natural populations of Pinus mugo Turra

in Kosovo. SpringerPlus, 4(1), 828-828.

Hamerník J., Musil I. (2007). The Pinus mugo complex–its structuring and general overview

of the used nomenclature. Journal of Forest Science, 53(6), 253-266.

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0016703713002317

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0016703713002317


44

Hamrick J. L., Mitton J. B., Linhart Y.B. (1979). Levels of Genetic Variation in Trees:

Influence of life history characteristics. Presented at the Symposium on Isozymes of

North American Forest Trees and Forest Insects, Berkeley, Calif.

Heuertz M., Teufel J., González‐Martínez S. C., Soto A., Fady B., Alía R., Vendramin G.

G. (2010). Geography determines genetic relationships between species of mountain

pine (Pinus mugo complex) in western Europe. Journal of Biogeography, 37(3), 541-

556.

Höhn M., Ábrán P., Vendramin G.G. (2005). Genetic analysis of Swiss stone pine

populations (Pinus cembra L. subsp. cembra) from the Carpathians using chloroplast

microsatellites. Acta Silvatica and Lignaria Hungarica, 1, 39-47.

Jalas J., Suominen J. (1973). Atlas Florae Europaeae. 2 Gymnospermae (Pinaceae to

Ephedraceae). Helsinki.

Jeffree C. E. (2006). The fine structure of the plant cuticle. Biology of the Plant Cuticle, 23,

11-125.

Jeffree C. E. 1996. Structure and ontogeny of plant cuticles. In: Kerstiens G., editor. Plant

cuticles. An integrated approach. BIOS Scientific, Oxford, pp. 33–82.

Jeffree C.E., Baker E.A., Holloway P.J. (1976). Microbiology of Aerial Plant Surfaces. Ed.

Dickinson C.H., Elsevier Inc., 1976.

Jenks M. A., Joly R. J., Peters P. J., Rich P. J., Axtell J. D., Ashworth E. N. (1994).

Chemically induced cuticle mutation affecting epidermal conductance to water vapor

and disease susceptibility in Sorghum bicolor (L.) Moench. Plant Physiology, 105(4),

1239-1245.

Jetter R., Kunst L., Samuels A. L. (2008). Composition of plant cuticular waxes. Biology of

the plant cuticle, 23, 145-181.

Jetter R., Riederer M. (1994). Epicuticular crystals of nonacosan-10-ol: in-vitro reconstitution

and factors influencing crystal habits. Planta, 195(2), 257-270.

Jovanović B. (1992). P. nigra Arn. In: Sarić M, editor. Flora Srbije 1. Srpska akademija

nauka i umetnosti, Beograd, pp. 200-202.


45

Jovanović S. (2016). Sekundarni metaboliti predstavnika roda Sedum L. (Crassulaceae)

centralnog Balkanskog poluostrva i njihov hemotaksonomski značaj. Doktorska

disertacija, Prirodno- matematički fakultet, Univerzitet u Nišu.

Jovanović S., Zlatković B., Stojanović G. (2015). Distribution and variability of n‐alkanes in

epicuticular waxes of Sedum species from the Central Balkan Peninsula:

chemotaxonomic importance. Chemistry & Biodiversity, 12(5):767-780.

Kerstiens G. (1996). Signalling across the divide: a wider perspective of cuticular structure—

function relationships. Trends in Plant Science, 1(4), 125-129.

Koch K., Bhushan B., Barthlott W. (2008). Diversity of structure, morphology and wetting of

plant surfaces. Soft Matter, 4(10), 1943-1963.

Kunst L., Samuels A. L. (2003). Biosynthesis and secretion of plant cuticular wax. Progress

in Lipid Research, 42(1), 51-80.

Maffei M. (1996a). Chemotaxonomic significance of leaf wax alkanes in the Compositae. In:

Hind D. J. N., Beentje H. J., editors. Compositae: Systematics. Proceedings of the

International Compositae Conference. Vol. 1. Royal Botanic Gardens, Kew, pp. 141-

158.

Maffei M. (1996b). Chemotaxonomic significance of leaf wax n-alkanes in the Umbelliferae,

Cruciferae and Leguminosae (Subf. Papilionoideae). Biochemical Systematics and

Ecology 24(6), 531-545.

Maffei M. (1996c). Chemotaxonomic significance of leaf wax alkanes in the Gramineae.

Biochemical Systematics and Ecology 24(1), 53-64.

Maffei M., Badino S., Rossi S. (2004). Chemotaxonomic significance of leaf wax n-alkanes

in the Pinales (Coniferales). Journal of Biological Research, 1(1), 3-19.

Maffei M., Meregalli M., Scannerini S. (1997). Chemotaxonomic significance of surface wax

n-alkanes in the Cactaceae. Biochemical Systematics and Ecology, 25(3), 241-253.

Marin P. D. (2003). Biohemijska i molekularna sistematika biljaka. NNK international,

Beograd.

Mitić Z. S., Zlatković B. K., Miljković M., Jovanović S. Č., Marin P. D., Stojanović G. S.

(2017). First insights into micromorphology of needle epicuticular waxes of south-

eastern european Pinus nigra populations. Iheringia. Série Botânica, (in press).


46

Nikolić B. (2008). Varijabilnost sastava terpena i alkana u četinama omorike (Picea

omorica/Panč./Purkynĕ), munike (Pinus heldreichii Christ.) i molike (Pinus peuce

Griseb.). Doktorska disertacija. Biološki fakultet, Beograd.

Nikolić B., Ristić M., Bojović S., Krivošej Z., Matevski V., Marin P. D. (2015). Population

variability of essential oils of Pinus heldreichii from the Scardo‐Pindic mountains,

Ošljak and Galičica. Chemistry & Biodiversity, 12(2), 295-308.

Nikolić B., Tešević V., Đordđević I., Todosijević M., Jadranin M., Bojović S., Marin P. D.

(2012a). Chemodiversity of nonacosan‐10‐ol and n‐alkanes in the needle wax of

Pinus heldreichii. Chemistry & Biodiversity, 9(1), 80-90.

Nikolić B., Tešević V., Đorđević I., Todosijević M., Jadranin M., Bojović S., Marin, P. D.

(2012b). Population variability of nonacosan‐10‐ol and n‐alkanes in needle cuticular

waxes of Macedonian pine (Pinus peuce Griseb.). Chemistry & Biodiversity, 9(6),

1155-1165.

Nikolić B., Tešević V., Đorđević I., Todosijević M., Jadranin M., Bojović S., Marin P. D.

(2013a). Variability of n‐alkanes and nonacosan‐10‐ol in natural populations of Picea

omorika. Chemistry & Biodiversity, 10(3), 473-483.

Quinn G. P., Keough M. J. (2002). Experimental design and data analysis for biologists.

Cambridge Univ. Press., Cambridge.

Rajčević N., Janaćković P., Dodoš T., Tešević V., Marin P. D. (2014). Biogeographic

variation of foliar n‐alkanes of Juniperus communis var. saxatilis Pallas from the

Balkans. Chemistry & Biodiversity, 11(12), 1923-1938.

Reicosky D. A., Hanover J. W. (1978). Physiological effects of surface waxes I. Light

reflectance for glaucous and nonglaucous Picea pungens. Plant Physiology, 62(1),

101-104.

Reuter H. I., Nelson A., Jarvis A. (2007). An evaluation of void‐filling interpolation methods

for SRTM data. International Journal of Geographical Information Science, 21(9),

983-1008.

Riedel M., Eichner A., Jetter R. (2003). Slippery surfaces of carnivorous plants: composition

of epicuticular wax crystals in Nepenthes alata Blanco pitchers. Planta, 218(1), 87-

97.


47

Rieder M. (2006) in „Biology of the Plant Cuticle“, Ed. Riederer M., Muller C., Annual Plant

Reviews, Wiley-Blackwell.

Robledo‐Arnuncio J. J., Collada C., Alia R., Gil L. (2005). Genetic structure of montane

isolates of Pinus sylvestris L. in a Mediterranean refugial area. Journal of

Biogeography, 32(4), 595-605.

Samuels L., Kunst L., Jetter, R. (2008). Sealing plant surfaces: cuticular wax formation by

epidermal cells. Annual Review of Plant Biology, 59, 683-707.

Sandoz H. (1983). Considérations sur la genèse du Pin mugho (Pinus mughus Scopoli), son

berceau probable, sa répartition ancienne et actuelle. Revue Générale de

Botanique, 90, 131-151.

Slavov G. T., Zhelev P. (2004). Allozyme variation, differentiation, and inbreeding in

populations of Pinus mugo in Bulgaria. Canadian Journal of Forest Research, 34(12),

2611-2617.

Stefanović S., Jager M., Deutsch J., Broutin J., Masselot M. (1998). Phylogenetic

relationships of conifers inferred from partial 28S rRNA gene sequences. American

Journal of Botany, 85(5), 688-697.

Stein S.E. (1990). National institute of Standards and Technology (NIST) Mass spectral

Database and Software, Version 3.02, USA.

Šarac Z. (2014). Utvrđivanje varijabilnosti i diferencijacije prirodnih populacija Pinus nigra

Arnold u Srbiji korišćenjem fitohemijskih i molekularnih markera. Doktorska

disertacija. Biološki fakultet, Univerzitet u Beogradu.

Šarac Z., Zlatković B., Jovanović S., Stojanović G., Marin P. D. (2016). Geographically-

related variation in epicuticular wax traits of Pinus nigra populations from Southern

Carpathians and Central Balkans – taxonomic considerations. Chemistry &

Biodiversity, 13(7), 931-942.

Taylor P. (2011). The wetting of leaf surfaces. Current Opinion in Colloid & Interface

Science, 16(4), 326-334.

Van den Dool H., Kratz P. D. (1963). A generalization of the retention index system

including linear temperature programmed gas- liquid partition chromatography.

Journal of Chromatography A, 11, 463-471.


48

Van Maarseveen C., Jetter R. (2009). Composition of the epicuticular and intracuticular wax

layers on Kalanchoe daigremontiana (Hamet et Perr. de la Bathie) leaves.

Phytochemistry, 70(7), 899-906.

Vendramin G. G., Anzidei M., Madaghiele A., Sperisen C., Bucci G. (2000). Chloroplast

microsatellite analysis reveals the presence of population subdivision in Norway

spruce (Picea abies K.). Genome, 43(1), 68-78.

Прилог5/1

ПРИРОДНO-MАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ

НИШ

КЉУЧНА ДОКУМЕНТАЦИЈСКА ИНФОРМАЦИЈА

Редни број, РБР:

Идентификациони број, ИБР:

Тип документације, ТД: Монографска

Тип записа, ТЗ: текстуални / графички

Врста рада, ВР: мастер рад

Аутор, АУ: Јелена Николић

Ментор, МН: Зорица С. Митић

Наслов рада, НР: Образац варијабилности и диференцијација природних популација

Pinus mugo средње Европе и Балканског полуострва у односу на састав

епикутикуларних воскова Језик публикације, ЈП: Српски

Језик извода, ЈИ: Енглески

Земља публиковања, ЗП: Р. Србија

Уже географско подручје, УГП: Р. Србија

Година, ГО: 2017.

Издавач, ИЗ: ауторски репринт

Место и адреса, МА: Ниш, Вишеградска 33.

Физички опис рада, ФО: (поглавља/страна/

цитата/табела/слика/графика/прилога)

48 страна; 12 слика; 6 табела

Научна област, НО: Биологија

Научна дисциплина, НД: Ботаника

Предметна одредница/Кључне речи,

ПО: Pinus mugo, епикутикуларни воскови, географска диференцијација,

Јулијски Алпи, Балкан

УДК 581.526:582.475+547.916(1-191.2)(497)

Чува се, ЧУ: Библиотека Важна напомена, ВН:

Извод, ИЗ: У раду је анализирана фитохемијска варијабилност и диференцијација

популација P. mugo пореклом са различитих планинских масива средње Европе

и Балканског полуострва: Јулијски Алпи (Триглав), Скардско-Пиндске (Шар-

планина) и Балканско-Родопске планине (Пирин). Комбинацијом GC/FID и

GC/MS анализе епикутикуларних воскова изолованих са двогодишњих четина

45 јединки P. mugo утврђено је присуство четири дитерпена, три примарна

алкохола и 10 n-алкана у серији од C20 до C29. Мултиваријантне статистичке

анализе CDA и CA показале су јасно издвајање популације са Јулијских Алпа у

односу на популације са Балканског полуострва. Добијена корелација

Махаланобисових дистанци и географске удаљености испитиваних популација

указује на њихову потенцијалну географску диференцијацију, тј. „изолацију

путем дистанце“. Такође, издвајање популације са Јулијских Алпа у независтан

кластер у односу на балканске популације, иде у прилог хипотези да се у

наведеним деловима ареала P. mugo постоје два викаријантна генска pool-а.

Ипак, с обзиром да у раду нису анализиране популације са Јужних и Источних

Карпата, особеност балканских популација P. mugo на нивоу епикутикуларних

воскова још увек не може бити у потпуности потврђена. Датум прихватања теме, ДП: 17.05.2017.

Датум одбране, ДО:

Чланови комисије, КО: Председник: Др Петар Марин

Члан: Др Бојан Златковић

Члан,

ментор: Др Зорица Митић

Прилог 5/2

ПРИРОДНО - МАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ

НИШ

KEY WORDS DOCUMENTATION

Accession number, ANO:

Identification number, INO:

Document type, DT: Monograph

Type of record, TR: textual / graphic

Contents code, CC: master thesis

Author, AU: Jelena Nikolić

Mentor, MN: Zorica S. Mitić

Title, TI: The variability pattern and differentiation of native populations of Pinus mugo in Central Europe and Balkan Peninsula regarding the composition of epicuticular waxes

Language of text, LT: Serbian

Language of abstract, LA: English

Country of publication, CP: Republic of Serbia

Locality of publication, LP: Serbia

Publication year, PY: 2017

Publisher, PB: author’s reprint

Publication place, PP: Niš, Višegradska 33. Physical description, PD: (chapters/pages/ref./tables/pictures/graphs/appendixes)

48 p.; 12 pictures; 6 tables

Scientific field, SF: Biology

Scientific discipline, SD: Botany

Subject/Key words, S/KW: Pinus mugo, epicuticular waxes, geographic differentiation, Julian Alps,

the Balkans UC 581.526:582.475+547.916(1-191.2)(497)

Holding data, HD: Library

Note, N: Abstract, AB: This paper includes analysis of the phytochemical variability and differentiation

of native P. mugo populations from various mountain systems of Central Europe and Balkan Peninsula: Julian Alps (Triglav), Scardo-Pindic (Šara) and Balkan-Rhodope mountains (Pirin). Combination of GC/FID and GC/MS analyses of epicuticular waxes isolated from two-year-old needles from 45 individuals of P. mugo has shown presence of four diterpenes, three primary alcohols, and 10 n-alkanes ranging from C20 to C29. The multivariate analyses CDA and CA have shown clear separation of the population from Julian Alps and the populations in Balkan Peninsula. The correlation of Mahalanobis distances and geographic distances of studied populations indicates their potential geographic differentiation, i.e. isolation by distance. Also, separation of the Julian Alps population into an independent cluster from the Balkan populations is supporting the hypothesis that in the stated parts of range there are two different vicariant gene pools of P. mugo. However, as this paper did not include analysis of populations from Southern and Eastern Carpathians, the distinctiveness of Balkan populations of P. mugo at the level of epicuticular waxes cannot be completely supported in the present day.

Accepted by the Scientific Board on, ASB:

Defended on, DE:

Defended

Board,

DB:

President: Dr. Petar Marin

Member: Dr. Bojan Zlatković

Member, Mentor: Dr. Zorica Mitić

Obrazac varijabilnosti i diferencijacij prirodnih · Pinus mugo Turra (krivulj, planinski bor,...

Documents

Transcript of Obrazac varijabilnosti i diferencijacij prirodnih · Pinus mugo Turra (krivulj, planinski bor,...