Nuove tecnologie perstudiare il cervello con laluceMassimo De Vittorio

Center for Biomolecular Nanotechnologies, Istituto Italiano di Tecnologia,Arnesano (Lecce), ItalyDipartimento di ingegneria dell’innovazione, Università Del Salento, Lecce, Italy

Ferruccio Pisanello Center for Biomolecular Nanotechnologies, Istituto Italiano di Tecnologia,Arnesano (Lecce), Italy

Nell’ultimo decennio l’optogenetica èdiventata una delle tecniche più uti-lizzate nelle neuroscience moderne.

Attraverso l’espressione di proteine fotosensi-bili in specifiche classi di neuroni, è possibi-le controllare otticamente l’attività neurona-le, attivando o inibendo la generazione di se-gnali cerebrali. Tuttavia, il cervello è un tessu-to intrinsecamente dispersivo, e per sfruttareal meglio le potenzialità dell’optogenetica lacomunità scientifica ha sviluppato una seriedi approcci in grado di portare efficientemen-te la radiazione luminosa nel cervello. Que-sto lavoro ha lo scopo di analizzare lo statodell’arte dei dispositivi impiantabili per espe-rimenti di optogenetica, concentrandosi sulruolo ricoperto dalle micro e nanotecnologie.

Introduzione

Il cervello umano è un organo straordinario, com-posto da decine di miliardi di neuroni, ciascu-

no dei quali interconnesso con migliaia di altrineuroni grazie un numero incredibile di sinapsi.Questa complessa rete di cellule memorizza edelabora le informazioni raccolte dai nostri sensi,producendo le nostre sensazioni e azioni. Le neu-roscienze studiano da molti decenni questa intri-cata rete cerebrale per comprenderne la struttura,i meccanismi e per studiare e controllare disordi-ni e patologie cerebrali. Già a partire dalla finedel 1800 si scoprì che l’attività cerebrale è di tipoelettrico: il flusso di ioni attraverso i cosiddetticanali ionici, proteine situate sulla membranacellulare, determina il potenziale di transmem-brana, ovvero la differenza di potenziale elettricotra il nucleo della cellula e il suo ambiente ester-no. Questo potenziale in un neurone a riposo ènegativo. Quando il potenziale sale al di sopradi una certa soglia, la cellula si attiva generandoil cosiddetto potenziale d’azione. Il metodo piùutilizzato per misurare questo potenziale e perinfluenzarlo è basato sull’uso di uno o più elet-trodi metallici. Questo approccio ha portato allafine del secolo scorso ai primi dispositivi mediciper il controllo di patologie cerebrali, ovvero sti-molatori elettrici in grado di modulare l’attività

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Figura 1: Principio di funziona-mento dell’optogenetica. Riprodot-ta da riferimento [32].

neuronale (deep brain stimulation - DBS) gra-zie ad impulsi elettrici ad alta frequenza in zonespecifiche e profonde del cervello, per trattare isintomi di gravi patologie neurologiche e neuro-psichiatriche quali il tremore essenziale, il morbodi Parkinson e la distonia. Pur avendo permessodi ottenere importanti risultati nel trattamento disintomi motori in pazienti affetti da queste pato-logie, l’uso di stimoli elettrici può produrre effetticollaterali importanti quali, depressione, sbalzid’umore e impulsività [1]. Inoltre, l’applicazio-ne di stimoli elettrici colpisce indistintamenteogni classe di cellule, producendo quindi effettinegativi anche su neuroni e zone cerebrali inte-gre. Il cervello è infatti ricco di differenti tipi dineuroni che lavorano assieme per implementaresensazioni, sentimenti, pensieri e movimenti e lacapacità di modulare l’attività di specifiche classidi neuroni è essenziale per la comprensione delfunzionamento del cervello e per correggernei malfunzionamenti. Questa specificità nel con-trollo di tipi distinti di neuroni è adesso possibilegrazie al lavoro di un gruppo di scienziati pres-so le università di Stanford e di Würzburg chehanno messo a punto una nuova combinazionedi genetica e fotonica, creando nel 2005 [2] unnuovo filone delle neuroscienze chiamato poi nel2006 optogenetica. Il termine optogenetica indi-ca un insieme di tecniche che rendono specifichecellule neuronali attivabili o disattivabili attra-verso stimoli luminosi. Definita nel 2010 come latecnica dell’anno dalla rivista “NatureMethods”,si basa sulla capacità di codificare geneticamen-te il DNA di alcune proteine fotosensibili dellafamiglia delle opsine, in specifiche classi di neu-

roni. Traendo spunto da alcuni microorganismialgali che si dirigono verso la luce, quali la Chla-mydomonas reinhardtii, Georg Nagel ed i suoicolleghi riuscirono a clonare nel 2003 il gene del-la canalrodopsina-2 (ChR2, ChannelRhodopsin-2), che di fatto è un canale ionico sensibile allaluce blu. Il DNA di queste proteine, una voltacodificato in alcuni tipi di neuroni produce l’e-spressione di questi canali ionici sulla membranacellulare e rende possibile attivare i neuroni conimpulsi luminosi (Fig.1) [3]. La ChR2 controlla ilflusso passivo di ioni Na+, K+, H+, Ca2+ versol’interno della cellula. Tale flusso depolarizza ilneurone e ne stimola quindi l’attività elettrica.Nel tempo sono state sviluppate altre opsine ingrado di controllare un flusso inverso di caricaper mantenere il neurone iperpolarizzato e quin-di “spento”. In Fig.2 sono illustrate alcune diqueste opsine. L’optogenetica è stata utilizzatacon successo in organismi e modelli animali spe-rimentali (C. elegans, zebrafish, topo, ratto) peranalizzare la relazione tra circuiti neurali e com-portamento ed è stata dimostrata con successoanche in primati [4], permettendo di intraveder-ne la futura applicazione sull’uomo. Oltre allanecessità della codifica genetica, l’optogeneticarichiede anche tecniche per l’illuminazione deineuroni transgenici e dato che il cervello è unmezzo dispersivo, e non trasparente, sono statenel tempo proposte modalità di illuminazione at-tive, con sorgenti ottiche miniaturizzate interneal cervello, e passive, dove invece le sorgenti otti-che quali LED e laser sono esterne al cervello e laluce è trasferita sui neuroni mediante guide d’on-da. Questi approcci possono essere divisi nelle

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Figura 2: Tre diverse proteine sensibili alla luce utilizza-te per optogenetica. a) la ChannelRhodopsinrisponde a stimoli che blu che producono unflusso netto di ioni positivi verso l’interno dellacellula, depolarizzandola. b) la Halorhodopsinpompa attivamente ioni Cl- verso l’interno dellacellula iperpolarizzandola. c) la archaerhodop-sins pompa attivamen ioni H+ fuori dalla cellu-la iperpolarizzandola Riprodotta da riferimento[3].

tre grandi macro-categorie illustrate in Fig.3, de-scritte nel dettaglio nel seguito di questo lavoro.

Figura 3: Classificazione in macro-categorie dei disposi-tivi per portare luce nel cervello. Modificata apartire da riferimento [5].

Fotonica integrata impiantabile

I sistemi impiantabili di fotonica integrata sonogeneralmente costituiti da vari stadi, rappresen-tati in Fig.4A [5]. Una sorgente luminosa (i), chetipicamente rimane fuori dal cervello, invia laradiazione luminosa ad un accoppiatore (ii) e adun selettore (iii, switcher), che dirigono la luceverso un certo numero di guide d’onda. Questeultime possono essere sia mono- che multi- mo-dali, e tipicamente terminano con un elementoriflettente o diffrattivo, che ha il compito di ri-dirigere i fotoni guidati nel tessuto. La prima

implementazione di questo approccio risale al2010 (Fig.4B) [6] e prevedeva di implementare iblocchi (i)-(iii) su un banco ottico, con le guided’onda impiantabili realizzate in ossinitruro di al-luminio (SiON) e con un rivestimento dielettricoin SiO2/Al per limitare le perdite di propaga-zione. Nella zona terminale delle guide d’ondafurono posizionati dei riflettori metallici, in gra-do di reindirizzare la radiazione a 90° rispettoall’asse ottico della guida d’onda e consentendola realizzazione di geometrie di fotostimolazionearbitrarie, anche in tre dimensioni [7]. Negli annisuccessivi sono poi stati integrati dispositivi foto-nici più complessi, inclusi reticoli di diffrazioneper aumentare l’efficienza di accoppiamento edisaccoppiamento della radiazione (Fig.4C) [8] oreticoli a matrice di guide d’onda in grado di ri-dirigere lunghezze d’onda diverse nei vari canali,permettendo un’attivazione dinamica dei puntidi emissione (Fig.4D) [9]. Di particolare rilevan-za ed eleganza è l’approccio di Mohanty et al[10], che permette di integrare il blocco (iii) diret-tamente nel dispositivo impiantabile. Attraver-so l’utilizzo di selettori interferometri attivabilielettricamente (electrically-driven interferome-tric switches, Fig.4E) è infatti possibile dirigerela radiazione in una guida d’onda piuttosto chein un’altra. I selettori sono realizzati integrandodei micro-riscaldatori che riscaldano localmenteuna delle due guide d’onda in una configurazio-ne a due porte d’uscita. Il calore generato cambial’indice di rifrazione locale e la modulazione difase che ne risulta permette di attivare una o l’al-tra uscita del dispositivo. La compatibilità dellafotonica integrata con tecnologie di micro e nanofabbricazione planari consente di integrare i si-stemi descritti con elettrodi per la registrazionedel segnale extracellulare, ma anche di ottene-re dispositivi con sorgenti luminose “on-chip”(Fig.4F,G) [11, 12]. Tuttavia, i limiti principali diquesto approccio sono il numero di guide d’ondache possono essere fabbricate sullo stesso dispo-sitivo e la dimensione minima delle guide stesse,che deve essere tale da consentire un efficientetrasferimento di potenza.

Micro diodi ad emissione di luce

Nel caso dei micro-diodi ad emissione di luce(µLED), le sorgenti luminose sono direttamen-

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Figura 4: Interfacce ottiche basate su fotonica integrata.Riprodotta da riferimento [5].

te impiantate nel tessuto. Nel 2013 Mc Allin-den et al. hanno realizzato una matrice di µLEDimpiantabili in nitruro di gallio (GaN) diretta-mente su substrato di zaffiro [13], ottenendo finoa quattro emettitori in linea che sono poi statiimpiegati per eccitare cellule nervose a diverseprofondità nella corteccia cerebrale [14]. La di-stanza minima tra gli emettitori, che definisce larisoluzione del sistema, è definita dal profilo diemissione Lambertiano dei µLED, che guida ladisposizione spaziale dei dispositivi sul sistemaimpiantabile. Inoltre, benché il substrato di zaffi-ro garantisca alta trasparenza nel blu e rigiditàd’impianto, non consente l’integrazione di elet-trodi per registrare l’attività nervosa. Tra il 2015e il 2016 due diversi lavori [15, 16] hanno supe-rato questo limite integrando µLED ed elettrodisu un substrato di silicio (Fig.5A-B). In alterna-tiva all’integrazione monolitica sul substrato difabbricazione, un approccio per ottenere µLEDimpiantabili è rappresentato dal metodo pick-and-place. Gli emettitori vengono staccati dalsubstrato di origine e posizionati su uno stratodi un altro materiale, permettendo la realizza-

zione di impianti polimerici flessibili contenentisistemi optoelettronici attivi. Questo metodo èstato proposto nel 2013 [17], ed ha consentito diintegrare oltre ai µLED anche sensori di tempera-tura, elettrodi, sistemi di rilascio farmacologico efotorilevatori [18, 19, 20] (Fig.5C-D). L’utilizzo disubstrati flessibili consente di avere dei sistemiimpiantabili con una rigidezza simile a quelladel cervello, riducendo l’accumularsi di glia edastrociti intorno al dispositivo. Tuttavia, il limiteprincipale dei µLED impiantabili rimane il caloregenerato dal dispositivo nel tessuto che compor-ta una serie di artefatti sperimentali soprattuttoquando sono necessari stimoli luminosi di lungadurata [13, 17].

Figura 5: Sistemi basati su µLED impiantabili. Riprodot-ta da riferimento [5]

Fibre ottiche ingegnerizzate

Le fibre ottiche sono state le prime guide d’on-da utilizzate in esperimenti di optogenetica invivo [21], e rappresentano ancora il metodo piùcomune per portare luce nel cervello. Tuttavia,l’utilizzo di una semplice fibra ottica ha una seriedi limiti rispetto ai sistemi descritti nei due para-grafi precedenti: ha una dimensione superiore(dimetro di circa 200µm), si può interfacciarecon un singolo volume di cervello relativamentepiccolo, e richiede l’impianto di un sistema ac-cessorio per il monitoraggio elettrico dell’attivitàcerebrale. Negli ultimi anni molti di questi limi-ti sono stati superati impiegando micro e nanotecnologie di fabbricazione per sfruttare le pro-prietà fotoniche di queste guide d’onda, aprendo

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la strada ad una nuova generazione di interfac-ce ottiche con il sistema nervoso centrale, chepossono essere catalogate come: (i) fibre ottichepolimerichemultifunzionali (FOPM) [22, 23], chepossono integrare canali per iniezione farmaco-logica ed elettrodi per monitoraggio dell’attivitànervosa, e, (ii) fibre ottiche rastremate, che sfrut-tano la multiplazione a divisione di modo perportare e raccogliere luce dal cervello con riso-luzione spaziale [24, 25, 26]. Le FOPM (Fig.6A)sono costituite da vari strati di polimeri soffici,disposti in una preforma cilindrica che viene poisottoposta ad un tiraggio ad alta temperaturaper ottenere il dispositivo finale. Progettandoopportunamente la geometria, la disposizione ela composizione degli strati che compongono lapreforma è possibile ingegnerizzare la sezioned’impianto, ottenendo così dispositivi multifun-zionali. Per esempio, nel 2017 Park e collabo-ratori hanno realizzato una FOPM in grado diintegrare un canale per il rilascio farmacologico,delle guide d’onda e degli elettrodi per monito-rare l’attività cerebrale [23]. Il dispositivo è statopoi impiantato cronicamente ed impiegato peruna procedura nota come “one-step optogene-tics” in cui l’inizione del virus adenoassociatoper l’espressione delle opsine, l’emissione di lucee il monitoraggio dell’attività avvengono esatta-mente nello stesso volume di tessuto. Un altrovantaggio importante delle FOPM è la loro natu-ra polimerica: la bassa rigidezza dell’impiantoben si confà alle proprietà meccaniche del cervel-lo, permettendo di ridurre al minimo le reazionitissutali avverse sul lungo termine. Tuttavia, lasezione delle FOPM risulta comparabile a quel-la delle fibre ottiche tradizionali, arrecando undanno da impianto cospicuo, in particolare separagonato agli approcci basati su fibre otticherastremate.

Le fibre ottiche rastremate sono invece dellefibre ottiche la cui parte terminale viene affuso-lata per una lunghezza di qualche millimetro,con una punta di diametro inferiore ad 1µm [27].La guida d’onda a sezione variabile conferisceal dispositivo una peculiarità importante per gliesperimenti optogenetica: man mano che il dia-metro si riduce, il numero di modi guidati dallastruttura diminuisce. Questo genera un’emis-sione graduale della luce iniettata in fibra, chepuò quindi essere utilizzata per portare luce lun-

go l’intera profondità di regioni funzionali delcervello di topo [25, 27]. Essendo questa emis-sione basata su una selezione modale, i modiguidati di ordine alto vengono emessi lontanodalla punta, mentre quelli di ordine basso piùvicino ad essa. Di conseguenza, selezionandol’ordine dei modi eccitati nella guida (cambian-do per esempio l’angolo di iniezione in fibra)è possibile selezionare la regione di emissionee di conseguenza il volume di cervello eccitato(Fig.6B). Quest’approccio è efficiente sia con fibrerastremate puramente dielettriche, ma anche confibre ricoperte dametallo, che guidano la luce perconfinamento metallico. In questo caso lo stratometallico viene rimosso selettivamente solo a se-zioni specifiche della rastremazione, generandodei punti di emissione luminosa che possono es-sere attivati selettivamente variando l’angolo diingresso in fibra [24, 28, 29]. Le fibre rastrematesono state utilizzate in vivo in animali liberi dimuoversi, possono essere accoppiate a sistemidi optogenetica wireless e hanno una sezione diimpianto estremamente ridotta [30, 31]. Tuttequeste caratteristiche le rendono un importantecomplemento alle tecnologie basate su fotonicaintegrata e ai µLED. In aggiunta, le fibre rastre-mate sono state recentemente proposte per rac-cogliere fluorescenza funzionale con risoluzionespaziale lungo l’asse dell’impianto, sfruttandoancora una volta le proprietà di multiplazionee demultiplazione modale della rastremazionestessa. Se quest’ultima caratteristica rappresentaun vantaggio rispetto alle FOPM, l’integrazionedi elettrodi e di canali di rilascio farmacologiconon è ancora stata dimostrata.

Conclusioni

Le micro e le nanotecnologie combinate all’op-togenetica stanno contribuendo alla nascita diuna nuova generazione di dispositivi ottici perstudiare il sistema nervoso centrale. Fotonicaintegrata, µLEDs e fibre ottiche sono approccicomplementari, e stanno permettendo di impo-stare esperimenti altrimenti impossibili con leclassiche tecniche di elettrofisiologia. Queste me-todologie stanno convergendo verso un’impor-tante sfida: integrare più funzionalità all’internodello stesso dispositivo, per ottenere una rap-

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Figura 6: Fibre ottiche ingegne-rizzata per il sistema nervoso cen-trale. Riprodotta da riferimento[5].

presentazione dinamica e ad alta risoluzione deisegnali convolti nei processi cerebrali.

Ringraziamenti

Gli autori ringraziano il finanziamento n. 828972nel contesto programma di ricerca e innovazioneHorizon 2020 della Comunità Europea. MDV rin-grazia il finanziamento n. 692643 del ConsiglioEuropeo delle Ricerche (ERC) nel contesto pro-gramma di ricerca e innovazione Horizon 2020della Comunità Europea. FP ringrazia il finan-ziamento n. 677683 del Consiglio Europeo delleRicerche (ERC) nel contesto programma di ricer-ca e innovazione Horizon 2020 della ComunitàEuropea

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Massimo De Vittorio: è professore ordinario dielettronica presso il Dipartimento di Ingegne-ria dell’Innovazione dell’Università del Salento edirettore del Center for Biomolecular Nanotech-nologies dell’Istituto Italiano di Tecnologia diLecce. Ha lavorato per molti anni allo sviluppodi micro e nanotecnologie per la fotonica per letelecomunicazioni; più di recente sviluppa mi-cro e nanotecnologie per il corpo umano e perl’ambiente.

Ferruccio Pisanello: ingegnere delle telecomu-nicazioni con un dottorato in fisica. Dopo unaformazione incentrata su fotonica e ottica quan-tistica, dal 2012 lavora allo sviluppo di sistemiimpiantatili per applicazioni di optogenetica eneuroscienze.

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