Biosensor Niveau 1

Teori

1 09-01-18

Inden du starter... For at kunne forstå teorien som ligger til grund for en biosensor er det vigtigt at du har styr på nogle generelle

mikro/molekyler biologiske principper, begreber og metoder. Du behøver ikke forstå emnerne helt i dybden, men

blot have et kendskab til dem. Her er en liste over ting du bør have kendskab til inden du læser biosensor teorien:

• Det centrale dogme

• Kendskab til E. coli bakterier som modelorganisme

• Plasmider/ekspressionsvectorer

• Restrictionsenzymer, ligase og hvordan de anvendes til molekylærbiologisk arbejde

• Heat-shock transformation

• Genelementer: Promoter, ribosomalt bindingssted (RBS), kodende DNA sekvens (CDS – fra det engelske cod-

ing DNA sequence), terminator og origin of replication (ori)

• Genregulering

• Antibiotika og brugen af antibiotika som selektionsmarkør.

Hvis der er nogle af de ovenstående emner du ikke er bekendt med eller bare gene vil have opfrisket så kan du finde

emnet under Teori: Baggrund her på hjemmesiden.

Indledning Der findes flere forskellige typer af biosensorer. Med Biotech Academy’s Biosensor kit kan du lave såkaldte “helcelle

biosensorer”. En helcelle biosensor er en bakterie eller en anden organisme, som kan detektere et input og re-

spondere med et output. Man kan altså bruge en biosensor til at undersøge hvorvidt et bestemt molekyle eller atom

er til stede. Det kan bruges i mange sammenhænge f.eks. medicinske eller miljømæssige. Her kommer et eksempel

på en biosensor fra den virkelige verden.

Eksempel på en biosensor: Planter som detekterer sprængstof Forskere har genmodificeret tobaksplanten Nicotiana tabacum til at detektere TNT (et sprængstof som bruges i

mange bomber og miner). Plantens response på TNT er at miste sin grønne farve. Man kan altså bruge denne bio-

sensor til f.eks. at finde miner som ligger begravet under jorden. Forskerne mener at de er i stand til at få planten til

at detektere andre molekyler såsom forurening eller andre skadelige gasser. Således kunne planten vokse i f.eks.

storcentre el.lign. for at holde øje med skadelige stoffer i luften. Du kan finde den originale videnskabelig artikel her

[1].

2 09-01-18

Eksempel på en biosensor: Bakterier detektere forurenet vand Et nystartet Amerikansk firma (FREDsense) har udviklet et måleinstrument, som kan måle indholdet af grundstoffet

Arsen i en vandprøve. Arsen kan forårsage sygdomme i blodbanerne samt cancer. FREDsense’s måleinstrument in-

deholder en kapsel med genmodificerede bakterier, som kan detektere Arsen i vandprøven. Præcis hvordan det

virker vil virksomheden ikke afsløre, men den kunne fungere på samme måde som biosensorerne du kan lave med

Biotech Academy’s biosensor kit. Virksomheden er også ved at udvikle måleinstrumenter til at måle indholdet af jern

og mangan i vandprøver. Du kan læse mere på virksomhedens egen hjemmeside: www.fredsense.com [2].

Biotech Academy’s Biosensor Niveau 1 I Biosensor kittet findes to niveauer; niveau 1 og niveau 2. En niveau 1 biosensor kan ikke detektere noget, men blot

udtrykke et responsgen. Det kunne f.eks. være et rødt eller lilla farveprotein eller et grønt fluorescerende protein

(Figur 1). Fordi en niveau 1 biosensor ikke kan detektere noget er det ikke rigtigt en biosensor, men frem-

gangsmåden hvormed du laver en niveau 1 biosensor er den samme som en niveau 2 biosensor. En niveau 1 biosen-

sor nemmere at få til at fungere derfor er kan det være en fordel først at lave en niveau 1 biosensor før du går til

niveau 2.

FIGUR 1 VISER BILLEDER AF TRE NIVEAU 1 BIOSENSORER MED HVER SIT RESPONSGEN. DER ER BRUGT FØLGENDE RESPONSGENER (VENSTRE

TIL HØJRE); DSRFP (STÆRK RBS), AMILCP OG GFP.

For at lave en niveau 1 biosensor med Biosensor kittet skal du sammensætte to stykker DNA. Således at de tilsam-

men danner et såkaldt biosensor plasmid. Dette plasmid transformeres derefter ind i E. coli bakterier som dermed

bliver genmodificeret til f.eks. være røde eller lilla (Figur 2).

3 09-01-18

FIGUR 2. TO STYKKER DNA SAMMENSÆTTES TIL ET PLASMID SOM TRANSFORMERES IND I EN E. COLI BAKTERIE. BAKTERIEN VIL NU VÆRE

FORSKELLIG FARVET ALT EFTER HVILKET RESPONSGEN SOM BLIVER BRUGT. REKTANGLERNE ANGIVER DEN KODENDE DNA SEKVENS FOR ET

LILLA FARVEPROTEIN (ØVERST) ELLER ET RØDT FARVEPROTEIN (NEDERST) SOM ER EN DEL AF HVER DERES RESPONSGEN. ALTSÅ BESTEM-

MER RESPONSGENET HVILKEN FARVE BAKTERIEN BLIVER.

Lad os tage et nærmere kig på de to stykker DNA som skal sammensættes. Det ene indeholder fire genelementer: en

promoter, et origin of replication (ori), et chloramphenicol (Cam) resistensgen og en terminator. Dette DNA stykke

kaldes Detektionsgenet (Figur 3a). Det andet DNA stykke kaldes responsgenet og indeholder to genelementer: et

ribosomalt binding sted (RBS – også kendt som Shine-Delgarno sekvens) og en kodende DNA sekvens (CDS – fra det

engelske navn coding DNA sequence). Når detektionsgenet og responsgenet bliver korrekt sammensat danner de til

sammen et funktionelt biosensor plasmid (Figur 3a). Promotoren i detektionsdelen er en såkaldt konstitutiv promot-

er og vil dermed altid være aktiv, dvs. at den altid udtrykker det DNA som ligger efter (også kaldet ”nedstrøms for”)

promoteren. I det nyligt sammensatte plasmid ligger responsgenet nedstrøms for promoteren og bliver dermed ud-

trykt. Hvis den kodende DNA sekvens i responsgenet koder for et rødt farveprotein vil bakterien altså udtrykke dette

protein og bakterien vil være rød. Hvis responsgenet istedet indeholder sekvensen for et lilla farveprotein bliver bak-

terierne lilla. På den måde kan du med valget af responsgen bestemme hvilken farve din biosensor skal have (Figur

2). I biosensor kittet findes forskellige responsgener som alle giver din biosensor en egenskab, f. eks. at gøre biosen-

sor bakteriene en bestemt farve eller gøre dem i stand til at fluorescere. Du kan læse mere om de forskellige typer af

responsgener længere nede på siden eller udforske de enkelt responsgener som finde i biosensor kittet nederst på

forsidesiden af biosensor.dk.

4 09-01-18

FIGUR 3 ET PLASMIDKORT OVER ET BIOSENSOR PLASMID TIL EN NIVEAU 1 BIOSENSOR. PLASMIDET SEKS GENELEMENTER: KONSTITUTIV

PROMOTER (GRØN PIL), RIBOSOMALT BINDINGSSTED (PINK OVAL), KODENDE DNA SEKVENS FOR RESPONSEGEN (LILLA REKTANGEL), TERMINATOR (RØD SEKSKANT), ORIGIN OF REPLICATION (GUL CIRKEL) OG CHLORAMPHENICOL RESISTENSGEN (ORANGE REKTANGEL). DETEKTOR- OG RESPONSGENET ER MARKERET MED STIPLEDE RØDE LINJER.

Lad os udnytte lejligheden til at genopfriske det centrale dogme, for hvad menes der egentligt med at responsgenet

bliver udtrykt? Vi bruger et biosensor plasmid med et lilla responsgen som eksempel. Når biosensor plasmidet er

blevet transformeret ind i E. coli bakterierne, vil RNA polymeraser binde sig til promoteren, køre langs DNA strengen

og bruge den som skabelon til at syntetisere en mRNA streng. Når RNA polymerase kommer til terminatoren (den

røde sekskant) hopper RNA polymerasen af DNA strengen og frigiver mRNA strengen – denne proces kaldes som

bekendt transskription. mRNA strengen indeholder to genelementer: ribosomalt bindings sted og den kodende DNA

sekvens for det lilla farveprotein. Ribosomerne i bakterien kan nu binde sig til det ribosomale bindings sted og

begynde at translatere den kodende DNA sekvens på mRNA strengen til det lilla farveprotein (Figur 4). Når en til-

strækkelig stor mængde af lilla farveprotein er blevet produceret i bakterien, vil man med det blotte øje kunne se at

den er lilla.

5 09-01-18

FIGUR 4 VISER DEN PROCES SOM SKER INDE I EN E. COLI BAKTERIE, NÅR DEN INDEHOLDER ET BIOSENSOR PLASMID. PLASMID DNA’ET

BLIVER FØRST TRANSSKRIBERET TIL MRNA, DERNÆST TRANSLATERET TIL ET PROTEIN, DETTE PROTEIN GIVER BAKTERIERNE DEN SYNLIGT

LILLA FARVE. PROTEIN STRUKTUREN SOM ER VIST PÅ FIGUREN ER IKKE STRUKTUREN DEN RIGTIGE STRUKTUR AF AMILCP. BILLEDE REFER-

ENCE: [3].

Origin of replication og Chloramphenicol resistensgen Vi har undersøgt funktionen af fire ud de seks genelementer som findes i et biosensor plasmid. De to sidste Origin of

replication og chloramphenicol resistensgenet er også essentielle for biosensoren. Origin of replication sørger for at

bakterierne kan replicere biosensor plasmidet lige som at bakterierne replicere deres egen kromosom. Hvis ikke

origin of replication var i plasmidet ville plasmidet ikke bliver ført videre når en bakterie delte sig. Dermed ville kun

meget få bakterier have biosensor plasmid og udtrykke responsgenet (f.eks. det lilla farveprotein). Det ville derfor

være meget svært af se om din biosensor virker, da det ikke ville være muligt at se de få lilla bakterie blandt de

mange ufarvede. Chloramphenicol resistensgenet bruges som selekionsmarkør; når bakterierne transformeres er

det kun meget få som optager biosensor plasmidet. For at finde lige netop de bakterier som har optaget plasmidet

vokses bakterierne på et medium med antibiotikummet chloramphenicol i. Dermed er det kun de bakterier som er

resistente overfor chloramphenicol som kan overleve. Biosensor plasmidet indeholder et chloramphenicol re-

sistensgen og derfor er disse bakterier resistente.

Typer af responsgener Der findes mange forskellige måder hvor på biosensore kan give et respons – det vigtigste er at bakterierne giver et

respons som vi mennesker kan se eller måle med et instrument. I biosensor kittet findes forskellige typer af re-

6 09-01-18

sponsgener. Her følger en overordnet forklaring af de forskellige typer. Nederst på forsiden af biosensor.dk kan du

klikke dig ind på de enkelte responsgener hvis du vil læse mere specifikt om de enkelte gener.

Farveprotein eller Chromoproteiner Den mest oplagt form for respons er noget som vi kan se uden hjælp fra noget udstyr. Det kan vi med chromopro-

teiner. Chromoproteiner giver bakterierne en farve inden for det synlige lys-spektrum. Generelt fungere chromopro-

teiner ved at absorbere en af det synlige lys. Hvis protein f.eks. er i stand til at absorbere de røde, gul og grønne

bølgelængder (fra ca. 500 nm – 700 nm) vil der kun være det lilla og blå lys tilbage, hvilket vil blive reflekteret. Hvis

en bakterie indeholder sådan et protein vil den altså have en blå-lilla farve [4].

Fluorescerende proteiner Du kan måske huske begrebet fluorescens fra fysik timerne. Det foregår når et molekyle kan optage energien fra lys

af en bestemt bølgelængde for derefter af udsende lys ved en anden bølgelængde. Man siger at molekylet exciteres

af lys ved én bølgelængde, hvorefter at det emitterer lys ved en anden bølgelængde. Nogle proteiner har denne

egenskab, disse kaldes fluorescerende proteiner. De minder altså om chromoproteiner, da de giver bakterierne en

farve. Det er dog nødvendigt at excitere fluorescerende proteiner med lys af en bestemt bølgelængde for at de

udviser deres farve. Det bedste eksempel er nok grønt fluorescerende protein (GFP) som kræver excitation af UV-lys

for at den grønne farve kan ses.

For at se hvordan du kan lave din egen biosensor skal du læse biosensor forsøgsvejledningen som kan findes her:

Forsøgsvejledning.

7 09-01-18

Referencer [1] M. S. Antunes, K. J. Morey, J. Jeff Smith, K. D. Albrecht, T. A. Bowen, J. K. Zdunek, J. F. Troupe, M. J. Cuneo, C.

T. Webb, H. W. Hellinga, and J. I. Medford, “Programmable ligand detection system in plants through a synthetic signal transduction pathway,” PLoS One, vol. 6, no. 1, 2011.

[2] “FREDsense hjemmeside,” https://www.fredsense.com/. .

[3] “GFP struktur,” https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/e/e4/GFP_structure.png.

[4] N. O. Alieva, K. A. Konzen, S. F. Field, E. A. Meleshkevitch, M. E. Hunt, V. Beltran-Ramirez, D. J. Miller, J. Wiedenmann, A. Salih, and M. V. Matz, “Diversity and evolution of coral fluorescent proteins,” PLoS One, vol. 3, no. 7, 2008.