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MONITORIZAÇÃO EM TEMPO REAL DO PROCESSO DE DIFERENCIAÇÃO NEURAL IN VITRO A PARTIR DE

CÉLULAS ESTAMINAIS EMBRIONÁRIAS

Margarida Isabel Martins da Silva

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em

Engenharia Biomédica

Júri

Presidente: Prof. Pedro Miguel Felix Brogueira

Orientador: Prof. Domingos Manuel Pinto Henrique

Co-orientador: Prof. António Alfredo Coelho Jacinto

Vogal: Rita Leonor Álvares Cabral de Figueiredo Fior

Setembro de 2007

3

AGRADECIMENTOS

Antes de qualquer dissertação sobre tema algum, gostaria de agradecer ao Professor

Domingos Henrique a oportunidade possibilitada de fazer parte, durante estes seis meses, da

Unidade de Biologia do Desenvolvimento (UBD) no Instituto de Medicina Molecular.

Agradeço ao Professor António Jacinto, cujos conselhos de microscopia foram preciosos e

revisão da tese extremamente enriquecedora, assim como a todas as pessoas da Unidade da

Morfogénese, companheira de laboratório da UBD.

Dentro da UBD, agradeço especialmente à Evguenia Bekman (Geni) e Elsa Abranches

grande parte do que sei de cultura de células. Após muitas correcções da parte delas na sala

escura da cultura as primeiras células estaminais e precursoras neurais apareceram como

queríamos.

Obrigada a todos os membros da UBD, sem no entanto esquecer quem passou pelo

laboratório, o Carlos Rodrigues, companheiro de Mestrado desde o primeiro dia.

Por ter conduzido a minha entrada no mundo da microscopia e me ter ajudado muito em

todos os aspectos de processamento das imagens, obrigada Ricardo Henriques. As tuas dicas e

tempo foram a ajuda de que necessitava em momentos onde nada ocorre à mente.

À Carina Santos o meu obrigada pelos conselhos preciosos para utilização dos

microscópios. A tua experiência em aquisições de imagens em tempo real foi essencial para a

optimização que desenvolvi.

Ao Nuno Moreno do Instituto Gulbenkian de Ciência agradeço a disponibilidade em partilhar

comigo o que sabia sobre detecção de cálcio em células animais.

À Ana Nery que acompanhou todos os meses do meu trabalho de laboratório e me apoiou

nos dias em que as células teimavam em morrer, o meu obrigada do fundo do coração.

Ao André Augusto, sempre presente, pelas tuas boleias a horas tardias ao laboratório

apenas para eu focar o microscópio.

Aos amigos de casa no mês de escrita intensa de tese: Alexandre Domingues, Maria João

Leitão e Pedro Monteiro, obrigada por terem compreendido que durante este tempo precisava de

espaço para pensar, e adorava um copo de leite com “Cheerios” no final da noite na vossa

companhia.

Ao Luís Santos agradeço as inúmeras correcções científicas, discussões relativas ao

trabalho que desenvolvi, e apoio na recta final de trabalho.

Aos meus pais e irmã que confiam incondicionalmente nas minhas capacidades e que,

mesmo à ingrata distância que separa Lisboa e o Fundão, têm sempre uma palavra amiga e um

beijo para enviar.

4

RESUMO

Apesar do conhecimento de mecanismos moleculares envolvidos na especificação dos

diferentes tipos celulares do tubo neural durante a embriogénese, a dinâmica celular da

diferenciação na linhagem neural e propagação estável deste tipo de células in vitro é ainda um

aspecto de forte investigação. A estratégia promissora de terapia celular no sistema nervoso para

tratamento de doenças degenerativas como a doença de Parkinson é um dos objectivos finais do

investimento neste campo.

O protocolo de diferenciação de precursores neurais em monocamada proposto por Austin

Smith e colaboradores (Ying et al., 2003) partindo de células estaminais embrionárias da linhagem

46C foi usado neste estudo, tendo sido definido como objectivo a monitorização em tempo real da

dinâmica dos precursores neurais em roseta, e confirmação da presença de movimento

intercinético nuclear característico de células neuroepiteliais, com consequente relação com os

estadios do ciclo celular das células envolvidas.

Abordagens iniciais de microscopia de fluorescência de campo claro e confocal não se

mostraram eficazes na obtenção de imagens para análise na medida em que comprometiam a

viabilidade e morfologia precursores.

Monitorização de microscopia em campo claro com luz visível revelou-se menos lesiva para

as culturas em questão, tendo sidas obtidas imagens de 16h do processo de diferenciação neural

mostrando que os precursores neurais apresentam movimentos intercinéticos nucleares,

decorrendo as mitoses na região apical da roseta.

Estratégias de microscopia apresentam-se assim promissoras na monitorização da

dinâmica celular deste tipo de células, podendo no futuro ser optimizadas condições para

observação de variados comportamentos celulares ou mesmo até ao nível molecular com recurso

a marcadores fluorescentes.

Conceitos-chave: neurogénese, precursores neurais, roseta, movimento intercinético nuclear,

microscopia em tempo real.

5

ABSTRACT

Despite the broad insight into the molecular mechanisms that specify neuronal cell type in

the neural tube during embryogenesis in vertebrates, cell behaviour underlying neuron production

and stable propagation in culture of neuronal progenitors is still largely unknown. Cell therapy in the

nervous system is a promising strategy to cure diseases like Parkinson’s or for nerve regeneration

in spinal cord lesions.

The protocol for conversion of 46C embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in

adherent monoculture, proposed by Austin Smith and collaborators (Ying et al., 2003), has been

used in this study. Our main goals were to follow the process of in vitro neuronal differentiation,

establishing whether Sox1-GFP positive neural progenitors reveal the classical interkinetic nuclear

movement (INM) of embryonic neuroepithelial cells, and, in addition, to correlate this movement

with the cell cycle stages of neural progenitors.

Using brightfield and confocal microscopes we have tested screening approaches based on

fluorescence. However, these techniques compromise progenitor morphology in rosettes and

cellular viability.

Alternatively, we have optimized visible light microscopy conditions that enable maintenance

of cell viability during long period observations. Films with sixteen hours of duration show that

neural precursors exhibit INM, with mitosis images located in the rosette apical region. Moreover,

our results indicate that the somal position of cells varies with the cell cycle progression.

Strategies of microscopy might prove to be extremely useful in monitoring the cellular

dynamics in these in vitro conditions, with the possibility of optimizing specific conditions for the

observation of several cellular behaviours, even at the molecular level, by the use of fluorescent

reporters.

Key words: neurogenesis, neuronal precursors, rosette, interkinetic nuclear movement, live

imaging.

6

ÍNDICE

Agradecimentos.................................................................................................................................. 3

Resumo .............................................................................................................................................. 4

Abstract .............................................................................................................................................. 5

Lista de Figuras.................................................................................................................................. 9

Lista de Tabelas ............................................................................................................................... 12

1. Motivação ............................................................................................................................ 13

2. Introdução............................................................................................................................ 14

2.1. Desenvolvimento............................................................................................................. 14

2.1.1. Ferramentas conceptuais ........................................................................................... 14

Estadios de diferenciação......................................................................................................... 14

Expressão diferencial de genes................................................................................................ 15

2.1.2. Modelo animal usado: murganho ............................................................................... 16

2.1.3. Desenvolvimento do sistema nervoso........................................................................ 17

Origem embrionária do tecido neural........................................................................................ 18

Indução neural versus epidermal.............................................................................................. 18

Formação do tubo neural .......................................................................................................... 18

Polaridade dorso-ventral ........................................................................................................... 19

Movimento intercinético nuclear................................................................................................ 21

2.1.4. Células estaminais...................................................................................................... 24

Definição ................................................................................................................................... 24

Células estaminais em cultura .................................................................................................. 24

Vias envolvidas na auto-renovação .......................................................................................... 25

Sinalização Notch na aquisição de identidade neural .............................................................. 26

2.1.5. Diferenciação neural in vitro ....................................................................................... 27

2.1.6. Cálcio.......................................................................................................................... 30

Cálcio e o ciclo celular .............................................................................................................. 31

Cálcio e a Indução neural ......................................................................................................... 32

Indicadores de cálcio ................................................................................................................ 34

Exemplo de aplicação ............................................................................................................... 35

7

2.2. Microscopia ..................................................................................................................... 36

Princípios físicos ....................................................................................................................... 36

Câmaras CCD........................................................................................................................... 38

Fotomultiplicadores ................................................................................................................... 39

Electron Multiplying CCD (EMCCD) ......................................................................................... 39

2.2.1. Microscopia de luz transmitida ................................................................................... 40

Modelo de Abbe ........................................................................................................................ 40

Campo claro.............................................................................................................................. 41

2.2.2. Fluorescência ............................................................................................................. 41

Mecanismos de absorção/excitação......................................................................................... 42

Fontes de luz............................................................................................................................. 43

Filtros usados............................................................................................................................ 44

Construção da imagem............................................................................................................. 45

2.2.3. Microscopia confocal .................................................................................................. 45

Enquadramento histórico .......................................................................................................... 46

Implementação.......................................................................................................................... 46

2.3. Microscopia em tempo real de células ........................................................................... 47

2.3.1. Viabilidade celular....................................................................................................... 47

2.3.2. Fototoxicidade ............................................................................................................ 48

2.3.3. Setup de aquisição: maximização do signal to noise ratio (SNR).............................. 49

Fontes de ruído ......................................................................................................................... 49

Objectivas de imersão............................................................................................................... 50

3. Objectivos............................................................................................................................ 51

4. Materiais e Métodos ............................................................................................................ 52

4.1. Células estaminais.......................................................................................................... 52

4.2. Expansão de células estaminais embrionárias não diferenciadas ................................. 52

4.3. Diferenciação em monocamada ..................................................................................... 53

4.4. Replaqueamentos dia 4 e 8 de monocamada................................................................ 53

4.5. Substrato de diferenciação: PDL-Laminina .................................................................... 53

4.6. Quantificação por FACS de aquisição de destino neural ............................................... 54

4.7. Teste de micoplasma...................................................................................................... 54

8

4.8. Microscopia ..................................................................................................................... 55

4.9. Incorporação do indicador de cálcio ............................................................................... 58

4.10. Detecção de cálcio.......................................................................................................... 58

5. Resultados........................................................................................................................... 59

5.1. Fluorescência: widefield Axiovert 200M ......................................................................... 59

5.2. Fluorescência: Confocal LSM510................................................................................... 64

5.3. Campo claro: Axiovert 200M........................................................................................... 68

5.3.1. Análise de distâncias.................................................................................................. 72

5.3.2. Velocidades e ângulos ............................................................................................... 76

5.3.3. Tipo de divisão............................................................................................................ 77


6. Discussão............................................................................................................................ 84

6.1. Optimização das condições de observação de progenitores neurais ............................ 84

6.2. Movimento intercinético nuclear ..................................................................................... 85

6.2.1. Mitose ......................................................................................................................... 86

6.2.2. Velocidades de migração ........................................................................................... 87

6.2.3. Tipo de divisão dos progenitores neurais................................................................... 87


7. Conclusão............................................................................................................................ 90

8. Referências Bibliográficas................................................................................................... 92

9

LISTA DE FIGURAS

Figura 1.1. Sumário dos transplantes possíveis específicos com base em células estaminais...... 13 Figura 2.1. Representação esquemática da localização dos folhetos embrionários e respectivos

órgão aos quais darão origem...................................................................................... 15 Figura 2.2. Gastrulação no embrião de rato .................................................................................... 17 Figura 2.3. Células da crista neural (preto) estão situadas entre a ectoderme neural (tracejado) e a

ectoderme epidermal (branco). .................................................................................... 19 Figura 2.4. Fotografia e representação esquemática da constituição do tubo neural. .................... 20 Figura 2.5. A transplantação de um notocórdio extra (vermelho) numa posição mais dorsal resulta

na proliferação adicional de neuroblastos (verde) ....................................................... 21 Figura 2.6. Divisão do tubo neural em região ependimal, marginal, e zona do manto.................... 21 Figura 2.7. A progressão temporal de crescimento do tubo neural e córtex cerebral depende de

padrões de divisões celulares especificos. .................................................................. 22 Figura 2.8. Movimento intercinético nuclear de progenitores neurais no tubo neural. .................... 23 Figura 2.9. Tipos de divisão simétrica e assimétrica em cortes de tubo neural de galinha............. 23 Figura 2.10. Vias de sinalização principais (LIF e BMP) envolvidas na auto-renovação de células

estaminais embrionárias. ............................................................................................. 26 Figura 2.11. Via de sinalização Notch.............................................................................................. 27 Figura 2.12. Expressão dos genes hes em secções transversais do tubo neural de galinha......... 27 Figura 2.13. Clusters de células estaminais embrionárias não diferenciadas observadas com luz

visível em campo claro................................................................................................. 28 Figura 2.14. Cultura de progenitores neurais no terceiro dia de monocamada em PDL-Laminina,

observadas com luz visível em campo claro................................................................ 29 Figura 2.15. Repórter Sox1-GFP para monitorização de diferenciação neural em monocamada.. 29 Figura 2.16. Hipótese de indução-sinalização por cálcio................................................................. 30 Figura 2.17. Dinâmica da sinalização por cálcio.............................................................................. 31 Figura 2.18. Imagens bidimensionais adquiridas em microscópio confocal de células estaminais

embrionárias de rato, incubadas com Fluo-4 AM. ....................................................... 32 Figura 2.19. Modelo de indução neural e epidermal em embrião de Xenopus laevis. .................... 33 Figura 2.20. Novo modelo de indução neural em Xenopus laevis................................................... 33 Figura 2.21. Obtenção de Fluo-4, fluorescente e impermeável na membrana celular (direita) a

partir da esterificação de um outro composto (esquerda), não fluorescente e

permeável celular. ........................................................................................................ 34 Figura 2.22. Modificações estruturais da molécula de BAPTA para formação dos compostos Fluo

...................................................................................................................................... 35 Figura 2.23. Movimento celular é acompanhado de flutuações de cálcio. A. Representação em

função do tempo das alterações de fluorescência devido a níveis de cálcio de uma

célula em migração; B. Direcção e distância percorrida pela mesma célula durante

10

cada minuto do ensaio de medição de níveis de cálcio. Imagens da migração foram

adquiridas a cada 30s durante 45min, após incubação das células com 1mM de Fluo-

3 (Adaptado de Komuro et al., 1996). .......................................................................... 35 Figura 2.24. Representação do processo de formação de uma imagem com uma lente convexa. 36 Figura 2.25. Representação de uma onda electromagnética, com as suas componentes eléctrica e

magnética ..................................................................................................................... 37 Figura 2.26. Princípio de funcionamento de uma câmara CCD ...................................................... 38 Figura 2.27. Princípio de funcionamento de um fotomultiplicador ................................................... 39 Figura 2.28. Estrutura da GFP, com a localização da parte fluorescente evidenciada no seu

interior........................................................................................................................... 42 Figura 2.29. Diagrama de Jablonski. ............................................................................................... 43 Figura 2.30. Espectros de emissão das lâmpadas de Mercúrio e Xénon ....................................... 43 Figura 2.31. Representação esquemática de um espectro de excitação e emissão de um fluoróforo

genérico........................................................................................................................ 44 Figura 2.32. Representação esquemática da disposição de todos os constituintes de um sistema

de aquisição de microscopia de fluorescência............................................................. 44 Figura 2.33. Discos de Airy como uma medida do poder de resolução. ......................................... 45 Figura 2.34. Representação esquemática da disposição espacial dos componentes principais num

microscópio confocal. ................................................................................................... 47 Figura 2.35. Efeito de binning na aquisição de uma imagem. ......................................................... 50 Figura 2.36. Influência da utilização de objectivas de ar ou de imersão no percurso óptico da luz.50 Figura 4.1. Microscópio de fluorescência invertido Zeiss Axiovert 200M ........................................ 56 Figura 4.2. Microscópio confocal de varrimento Zeiss LSM 510 ..................................................... 56 Figura 4.3. Espectro de excitação (centrado em 488 nm) e emissão (centrado em 510 nm) do

indicador de cálcio Fluo-4 ............................................................................................ 58 Figura 5.1. Imagens de instantes de tempo de aquisição de células 46C Sox1-GFP em

monocamada (dia 5/4/07) num microscópio de fluorescência invertido Zeiss Axiovert

200M............................................................................................................................. 60 Figura 5.2. Imagens de instantes de tempo de aquisição de células 46C Sox1-GFP em


200M............................................................................................................................. 61 Figura 5.3. Imagem de rosetas de células 46C Sox1-GFP em monocamada (dia 23/4/07) num

microscópio de fluorescência invertido Zeiss Axiovert 200M. ..................................... 62 Figura 5.4. Imagens de instantes de tempo de aquisição de células 46C Sox1-GFP em


200M............................................................................................................................. 62 Figura 5.5. Imagens de instantes de tempo de aquisição de células 46C Sox1-GFP em


200M............................................................................................................................. 62 Figura 5.6. Imagem de cultura de células 46C Sox1-GFP em monocamada (dia 28/4/07) num

11

microscópio confocal da varrimento Zeiss LSM510..................................................... 65 Figura 5.7. Imagem de cultura de células 46C Sox1-GFP em monocamada (dia 21/5/07) num

microscópio confocal da varrimento Zeiss LSM510..................................................... 65 Figura 5.8. Dados de velocidades, ângulo com a horizontal e distâncias percorridas pela célula

indicada a azul na Figura 5.7. A célula, que se afasta do centro da roseta, mantém um

movimento aproximadamente radial (desvio padrão de 2º85’), com velocidade média

de 0,135�m/min. .......................................................................................................... 66 Figura 5.9. Imagem de cultura de células 46C Sox1-GFP em monocamada (dia 6/6/07) num

microscópio confocal da varrimento Zeiss LSM510..................................................... 66 Figura 5.10. Dados de velocidades, ângulo com a horizontal e distâncias percorridas pela célula

indicada a azul na Figura 5.9. ...................................................................................... 67 Figura 5.11. Imagem de cultura de células 46C Sox1-GFP em monocamada (dia 26/6/07) num

microscópio confocal de varrimento Zeiss LSM510..................................................... 68 Figura 5.12. Imagem de cultura de células 46C Sox1-GFP em monocamada (dia 27/6/07) num

microscópio de fluorescência invertido Axiovert 200M. ............................................... 69 Figura 5.13. Imagem de cultura de células 46C Sox1-GFP em monocamada (dia 27/6/07) num

microscópio de fluorescência invertido Axiovert 200M. ............................................... 69 Figura 5.14. Imagens de cultura de células 46C Sox1-GFP em monocamada (dia 28/7/07) num

microscópio de fluorescência invertido Axiovert 200M. ............................................... 70 Figura 5.15. Imagem de cultura de células 46C Sox1-GFP em monocamada (dia 28/7/07) num

microscópio de fluorescência invertido Axiovert 200M. ............................................... 71 Figura 5.16. Distância ao centro da roseta, em função do tempo, de células 46C Sox1-GFP em

monocamada (dia 28/7/07) nunca ligadas ao centro da roseta durante a aquisição. . 72 Figura 5.17. Distância ao centro da roseta, em função do tempo, de células 46C Sox1-GFP em

monocamada (dia 28/7/07) sempre ligadas ao centro da roseta e que nunca dividem.

...................................................................................................................................... 72 Figura 5.18. Distância ao centro da roseta, em função do tempo, de células 46C Sox1-GFP em

monocamada (dia 28/7/07) que se dividem no centro da roseta com retracção do

corpo celular aproximadamente uma hora antes da divisão........................................ 74 Figura 5.19. Análise de distâncias relativamente ao centro da roseta, ângulos com a horizontal, e

velocidade de células 46C Sox1-GFP em monocamada (dia 28/7/07). ...................... 76 Figura 5.20. Imagens de cultura de células 46C Sox1-GFP em monocamada (dia 27/7/07) num

microscópio de fluorescência invertido Axiovert 200M. ............................................... 78 Figura 5.21. Imagem de anafase de uma célula 46C Sox1-GFP em monocamada (dia 27/7/07)

num microscópio de fluorescência invertido Axiovert 200M. ....................................... 79 Figura 5.22. Imagens de cultura de células 46C Sox1-GFP em monocamada (dia 27/7/07) num

microscópio de fluorescência invertido Axiovert 200M. ............................................... 80 Figura 5.23. Imagens de cultura de células S25 em monocamada (dia 5/8/07) num microscópio

confocal de varrimento Zeiss LSM 510 após incubação com Fluo-4. ......................... 82

12

LISTA DE TABELAS

Tabela 2.1. Índices de refracção de alguns meios usados em cultura de células........................... 38 Tabela 5.1. Dados referentes às aquisições obtidas no microscópio de fluorescência invertido

Zeiss Axiovert 200M de imagens de culturas em monocamda de células 46C Sox1-

GFP. ............................................................................................................................. 59 Tabela 5.2. Dados referentes às aquisições obtidas no microscópio confocal de varrimento Zeiss

LSM510 de imagens culturas em monocamada de células 46C Sox1-GFP............... 64 Tabela 5.3. Dados relativos a células 46C Sox1-GFP em monocamada (dia 28/7/07) que se

dividem no centro da roseta com movimento de retracção. ........................................ 75 Tabela 5.4. Valores de velocidades média e máxima, e valor médio de ângulo com a horizontal

das células-mãe em divisão e filhas 46C Sox1-GFP em monocamada (dia 28/7/07). 77 Tabela 5.5. Dados do tipo de divisão referentes à cultura de células 46C Sox1-GFP em

monocamada................................................................................................................ 81

13

1. MOTIVAÇÃO

Um elevado número de terapias com células estaminais estão já estabelecidas, embora

grande parte delas envolva apenas intervenções a nível experimental ou de elevado custo. Num

futuro próximo será possível o uso de tecnologias derivadas da investigação de células estaminais

humanas embrionárias e de adulto no sentido da cura de doenças como o cancro, Parkinson,

diabetes mellitus tipo 1 ou doenças degenerativas musculares e nervosas. Contudo, a

investigação neste campo terá de evoluir bastante de modo a esclarecer todos os mecanismos

subjacentes à maquinaria de funcionamento dos processos de diferenciação das linhagens de

interesse a partir de células estaminais. Estão aqui incluídas a escolha da fonte mais adequada de

células estaminais, o modo de obtenção de culturas puras no tipo desejado de células

diferenciadas, bem como o nível de organização das últimas de modo a reterem o seu potencial

proliferativo, que permita a obtenção de enxertos efectivos (Figura 1.1).

Figura 1.1. Sumário dos transplantes possíveis específicos com base em células estaminais.

Purificação de células estaminais hematopoiéticas a partir da medula óssea e subsequente transplantação poderão

reconstituir o sistema sanguíneo para tratamento de cancro, doenças imunológicas ou metabólicas são possíveis

exemplos. Neurónios dopaminérgicos derivados de células embrionárias estaminais poderão também ser transplantadas

para tratamento da doença de Parkinson (Adaptado de Mayhall et al., 2004).

É neste contexto que vários grupos tentam desenvolver metodologias de controlo de

diferenciação neural in vitro. No laboratório da Unidade de Biologia do Desenvolvimento no

Instituto de Medicina Molecular foi estabelecido um protocolo de diferenciação neural in vitro em

culturas aderentes em monocamada partindo de células estaminais embrionárias. Esta ferramenta

constitui a base de trabalho para o estudo detalhado da cinética dos progenitores neurais nestas

condições experimentais. Nos estudos efectuados até ao momento não há referência à

monitorização do comportamento in vitro dos progenitores neurais, nem aos passos intermédios

que levam à aquisição de polaridade e migração de células, como descrito in vivo no tubo neural.

Todos estes aspectos constituíram uma forte motivação para a realização deste estudo.

14

2. INTRODUÇÃO

2.1. DESENVOLVIMENTO

O desenvolvimento de um organismo multicelular a partir de uma célula única, o ovo, com a

criação de estruturas morfológica e fisiologicamente tão distintas é uma conquista importante na

evolução que levanta ainda muitas questões à comunidade científica. Vários organismos modelo

são usados como objecto de estudo dos princípios da embriogénese e desenvolvimento. Dos

organismos para os quais existe maior variedade de metodologias disponíveis e conhecimentos

estabelecidos destacam-se entre os invertebrados a mosca da fruta Drosophila melanogaster e o

nemátodo Caenorhabditis elegans, e entre os vertebrados a rã (Xenopus sp.), o peixe-zebra

(Danio rerio), galinha (Gallus gallus) e murganho (Mus musculus).

2.1.1. FERRAMENTAS CONCEPTUAIS

ESTADIOS DE DIFERENCIAÇÃO

O desenvolvimento de um organismo multicelular pode ser separado conceptualmente em

cinco processos: divisão celular inicial, formação de padrões, morfogénese, diferenciação celular e

crescimento. A fertilização é seguida de um período de rápidas divisões celulares, ou clivagens,

onde o ovo se divide num número finito de células mais pequenas.

A fase de formação de uma estrutura embrionária organizada começa com a definição do

mapa corporal, por definição dos dois eixos fundamentais que separam regiões anteriores e

posteriores, ventrais e dorsais. Em animais, o eixo antero-posterior é aquele que passa desde a

cabeça até à cauda. Estruturas dorsais são aquelas atrás do plano frontal, sendo ventrais as

estruturas à frente deste.

Após definição do mapa corporal, ocorre a alocação das células em diferentes regiões do

organismo, dando origem aos diferentes folhetos embrionários: ectoderme (no pólo animal),

endoderme (no pólo vegetal) e mesoderme, espacialmente entre os anteriores (Figura 2.1). Em

cada uma destas zonas, as células adquirem uma identidade própria, resultante de uma

expressão diferencial, e neste ponto mensurável, de um determinado conjunto de genes. Ao

movimento de migração celular que permite esta divisão de folhetos com formação de uma

cavidade interna é chamado de gastrulação.

15

Figura 2.1. Representação esquemática da localização dos folhetos embrionários e respectivos órgão aos quais darão

origem

(Adaptado de Wolpert et al., 2002).

A diferenciação celular ocorre apenas a partir deste momento. Sendo um processo gradual,

inicialmente as células dividem-se algumas vezes antes de se começarem a diferenciar estrutural

e funcionalmente.

A última etapa consiste no crescimento da estrutura delineada até aqui, passível de

acontecer por vários processos: aumento do tamanho celular, multiplicação, ou deposição de

material extra celular.

EXPRESSÃO DIFERENCIAL DE GENES

Todas as células somáticas de um organismo são derivadas do ovo fertilizado por

sucessivas séries de divisões mitóticas, como tal, salvo raras excepções, todas contêm o mesmo

património genético. Deste modo, os diferentes tipos celulares são gerados por alterações na

actividade de transcrição ou tradução de determinados genes, que conduzem à síntese de várias

proteínas.

O ponto fulcral do desenvolvimento é a activação e inibição da transcrição de determinados

genes nas células correctas e no momento certo. Na medida em que a actividade de um gene é

determinada em grande parte por factores de transcrição que se ligam a regiões reguladoras, são

estas peças que controlam este processo complexo. Neste aspecto há que ter cuidado em não

considerar o desenvolvimento como um mero mecanismo de controlo da regulação genética, dado

que a expressão genética é apenas um dos primeiros passos de cascatas de sinalização e

influência celulares.

16

2.1.2. MODELO ANIMAL USADO: MURGANHO

Todos os embriões de vertebrados passam por um conjunto muito semelhante de estadios

de desenvolvimento. Durante a gastrulação movimentos celulares resultam na formação dos três

folhetos embrionários. Uma das primeiras estruturas reconhecíveis nesta fase é o notocórdio, que

pertence à mesoderme e é formado ao longo do eixo anterio-posterior do embrião. A partir dos

sómitos, que ladeiam o notocórdio, originam-se a coluna vertebral, músculos do tronco e

membros. O cérebro e a espinal-medula são derivados do tubo neural, uma estrutura na

neuroectoderme localizada imediatamente acima do notocórdio. Os aspectos que mais diferem no

desenvolvimento dos embriões dos diferentes vertebrados até ao estado de gastrulação referem-

se ao modo de nutrição do mesmo. A forma do embrião está directamente relacionada com a

quantidade de vitelo presente no ovo e, no caso dos mamíferos, com as estruturas adjacentes

formadas, nomeadamente a placenta. No entanto, após a fase de gastrulação, todos os embriões

de vertebrados passam por um estadio filotípico, onde em traços gerais, todos se assemelham

(Haeckel, 1875).

O murganho tem um ciclo de vida de 9 semanas, período relativamente pequeno para um

mamífero e que o torna, em parte, o modelo preferencial de estudo para o desenvolvimento de

vertebrados. Um outro ponto importante é o facto de ser facilmente manipulável com as

ferramentas genéticas clássicas, permitindo a criação de mutantes específicos. Contudo, o seu

desenvolvimento é intra-uterino, não sendo facilmente acessível para manipulação experimental

ou observação contínua, apesar de poder ser cultivado fora do ambiente materno por curtos

períodos de tempo.

O óvulo é fertilizado no oviducto, onde as clivagens ocorrem, levando à formação de uma

estrutura, mórula, de células altamente compactadas. Uma característica particular do

desenvolvimento de mamíferos é o aparecimento de dois grupos de células após as primeiras

clivagens: trofoectoderme, no exterior da estrutura e que originará a placenta e estruturas extra-

embrionárias, e massa celular interna numa localização mais interna. Neste estadio, a 3 dias e

meio de gestação, a trofoectoderme expande devido à internalização de fluido para o interior do

blastocisto agora formado, criando-se uma cavidade interna contendo a massa celular interna

numa extremidade. Nas 24 horas seguintes, a massa celular interna divide-se em endoderme e

ectoderme primitivas (podendo a última ser designada também de epiblasto), enquanto ocorre a

implantação do embrião na parede uterina. Aqui, a trofoectoderme parietal, em contacto com o

epiblasto, forma os tecidos extra-embrionários na forma primitiva de cone ectoplacental. No dia 6

após fertilização, ocorre um alongamento do epiblasto e o desenvolvimento da cavidade

proamniótica. Meio-dia depois começa a gastrulação e a definição de uma estrutura espacialmente

organizada. Num ponto não específico da endoderme visceral ocorre o espessamento da parede,

definindo um sulco que migra para a futura região anterior do embrião. As células em proliferação

do epiblasto deslocam-se lateral e anteriormente a partir dele, entre a ectoderme e a endoderme

visceral, formando o folheto da mesoderme (Figura 2.2). Na região anterior desta estrutura forma-

17

se então uma região com maior condensação de células denominada de nódulo de Hensen

(revisto em Wolpert et al. 2002).

Figura 2.2. Gastrulação no embrião de rato

(Adaptado de Wolpert et al., 2002).

Neste ponto, a 8 dias e meio após fertilização, ocorre o enrolamento da estrutura,

formando-se assim as estruturas definitivas do embrião, tal como o tracto gastrointestinal, o

coração e o fígado. Aproximadamente no nono dia é terminada a gastrulação, apresentando já o

embrião cabeça e membros definidos. A organogénese continua a partir deste ponto.

2.1.3. DESENVOLVIMENTO DO SISTEMA NERVOSO

Apesar da grande diversidade de organismos que possuem sistema nervoso, os princípios

subjacentes ao seu desenvolvimento foram conservados ao longo da evolução.

O sistema nervoso central de um mamífero adulto é composto por quatro tipos celulares

distintos: neurónios, oligodendrócitos, astrócitos e microglia (Kitner, 2002), sendo os três últimos

tipos considerados células da glia. O modo como estas linhagens celulares são formadas durante

o desenvolvimento é uma das questões fundamentais da neurobiologia, na medida em que todos

estes tipos celulares têm uma origem embrionária comum: as células neuroepiteliais. Estas células

estão dispostas numa estrutura tubular denominada tubo neural, formando um epitélio colunar

pseudo-estratificado. A expressão diferencial no tempo e no espaço de moléculas ao longo do

tubo neural é um factor importante na determinação do destino das células neuroepiteliais. Por

outro lado, e nalguns casos, a produção de neurónios ou células da glia parece ser regulada pela

existência de limites intrínsecos do número de divisões celulares dos progenitores, funcionando

este aspecto como um “relógio celular” (Sanes et al., 2006). Em última instância, o nível de

proliferação e o número de células produzidas poderão ser controladas pela libertação de sinais

extracelulares mitogénicos, ou de sinais inibidores de divisão, levando a que os progenitores

saiam do ciclo celular (Sanes et al. 2006). Contudo, o número total de células dum determinado

tipo é também influenciado pelo nível de morte celular, havendo casos em que uma super-

18

produção neuronal leva a uma reprogramação dos mecanismos de apoptose por parte das

células.

ORIGEM EMBRIONÁRIA DO TECIDO NEURAL

Enquanto a maior parte dos órgãos internos do corpo são originados a partir da mesoderme

(são disso exemplo rins, tecido sanguíneo e coração), é a partir da ectoderme que se diferenciam

tecidos neural e epitelial. Nos vertebrados, através de processos altamente conservados, células

da ectoderme embrionária originam progenitores epidermais na região ventral e progenitores

neurais na zona dorsal, onde as células se distinguem das restantes pela aquisição de uma

morfologia colunar, originando uma região denominada de placa neural. Neste ponto, o embrião

atinge o estado de neurula. Segue-se a formação do tubo neural a partir do tecido da placa neural

por invaginação do mesmo para o interior do embrião. O tubo neural permitirá o desenvolvimento

da espinal-medula e do cérebro na sua porção anterior.

INDUÇÃO NEURAL VERSUS EPIDERMAL

Experiências em anfíbios (Spemann et al., 1924) revelaram que a indução neural é iniciada

após libertação de determinados factores a partir da mesoderme dorsal, sendo neste ponto que se

dá a separação entre destino neural e epidermal. Como consequência, uma gama de moléculas

foram catalogadas como indutores neurais, os quais: i) são expressos num local preciso

(mesoderme dorsal) e numa janela temporal bem definida (no estado de gástrula inicial); ii) actuam

apenas na ectoderme dorsal apesar de serem secretados na mesoderme dorsal, e iii) o têm um

efeito directo, induzindo diferenciação de estruturas neurais sem características de mesoderme

(revisto em Moreau et al., 2004). Por exemplo, Noggin, Chordin, Follistatin, XnR3 e Cerberus estão

já descritos como obedecendo a todos estes requisitos (Sasai et al., 1997). No entanto, a acção

destes factores potenciadores de neuralização é acompanhada pela inactivação de mecanismos

com acção ventralizante relacionados com a presença de Bone Morphogenetic Proteins (BMPs)

no meio de cultura, apesar de estes serem factores necessários mas não suficientes para o

processo de neuralização em detrimento do destino epidermal (ver Secção 2.1.6).

FORMAÇÃO DO TUBO NEURAL

A formação do tubo neural acontece por dois processos de neurulação: primária e

secundária, sendo o primeiro bastante semelhante em anfíbios, pássaros e mamíferos. Durante a

neurulação primária, a ectoderme é dividida em três conjuntos de células: (1) o tubo neural

posicionado centralmente, (2) a epiderme localizada externamente e (3) células da crista neural

localizada entre as anteriores, originando no futuro neurónios periféricos, células da glia e células

pigmentadas da pele.

19

Figura 2.3. Células da crista neural (preto) estão situadas entre a ectoderme neural (tracejado) e a ectoderme epidermal

(branco).

a. placa neural; b. formação dos enrolamentos neurais (em murganho); c. estadio intermédio de fecho do tubo neural; d.

tubo neural já fechado (Adaptado de Hall et al., 1991).

Logo após formação da placa neural, as suas extremidades tornam-se mais espessas e

movem-se para cima, formando as pregas neurais, enquanto um sulco se forma no centro,

dividindo o embrião nas suas futuras regiões direita e esquerda. Contrariamente ao que acontece

em galinha, cujo tubo neural começa por fechar inicialmente ao nível do futuro mesencéfalo e

prossegue a partir daí por um mecanismo semelhante a um fecho éclair em ambas as direcções, a

ligação de células do tubo neural em mamíferos é iniciada em vários locais ao longo do eixo

antero-posterior. A contribuição dos dois tipos de neurulação para a formação do tubo neural

definitivo é variável nos diferentes vertebrados, sendo sabido que, em peixes a neurulação é

exclusivamente secundária, enquanto que em galinha as porções anteriores do tubo neural são

formadas por neurulação primária, sendo a parte caudal formada por neurulação secundária. No

que toca a mamíferos, em rato, e provavelmente em humano também, a neurulação secundária

começa ao nível do sómito 35, equivalente à região mais caudal.

Na neurulação secundária, o tubo neural é criado a partir de um cilindro sólido de células, o

denominado cordão medular, que posteriormente cavita no centro (Gilbert, 2000).

POLARIDADE DORSO‐VENTRAL

Mesmo sem técnicas de marcadores moleculares muito desenvolvidas, por mera

observação de morfologia, é evidente a polarização dorso-ventral do tubo neural em duas regiões

espacialmente distintas (Figura 2.4). Estudos iniciais de neurogénese baseados em contagens de

mitoses em cortes histológicos levados a cabo por Viktor Hamburguer em 1948, revelaram dados

preliminares de que a proliferação celular no tubo neural de embriões de galinha era controlada

pela polaridade dorso-ventral adquirida. Por mera contagem de núcleos em mitose por unidade de

área nas regiões basal (ventral) e alar (dorsal) foi reportado que o número de mitoses na região

basal em estados iniciais de desenvolvimento era superior ao da região alar, situação invertida em

estados de desenvolvimento mais tardios. Relacionado com esta dinâmica, está o aparecimento

mais precoce de neurónios motores na região ventral, seguindo-se, temporalmente, a

20

diferenciação em interneurónios e neurónios sensoriais das células da região dorsal. Uma possível

explicação é a que diferenças na densidade mitótica são reflexo de diferenças na duração do ciclo

celular nessas regiões. Por outro lado, pode também especular-se quanto à diferente proporção

de células proliferativas nas regiões basal e alar (Hollyday, 2001).

Esta característica é reflectida na estrutura madura que é a espinal-medula, na medida em

que na região dorsal se situam as conexões entre neurónios espinhais e sensoriais, e na região

ventral estão alojados os neurónios motores.

A parte mais dorsal do tubo neural (roof plate) apresenta-se como uma região bastante

estreita de uma monocamada de células cujos núcleos estão localizados na periferia. Na medida

em que estas células são precursoras de células radiais da glia, não está referenciada a presença

de neuroblastos nesta zona. No pólo ventral, o soalho do tubo neural (floor plate) tem uma

estrutura semelhante mas é mais largo em extensão.

a. b.

Figura 2.4. Fotografia e representação esquemática da constituição do tubo neural.

a. Secção transversal (2μm) de tubo neural de embrião de uma ave. As células em divisão da zona ventricular (vz) e as da

zona do manto (mz) são claramente distintas. Células do floor plate (localizadas entre as linhas a tracejado) são também

facilmente distinguíveis de todas as outras em seu redor. Escala = 50μm (Adaptado de Wilson et al., 2003);

b. Representação esquemática da constituição do tubo neural.

A região intermédia é constituída por elevada densidade de neuroblastos, havendo a

formação de duas protuberâncias menos densas em cada lado do tubo neural perto da

extremidade ventral.

A polaridade do tubo neural é induzida por sinais provenientes de todos os tecidos

envolventes: o padrão dorsal maioritariamente imposto pela epiderme, enquanto que o ventral

induzido pela presença do notocórdio. Foi baseado neste último que, no início do século XX, as

primeiras experiências e deduções neste campo foram obtidas. Extracção do notocórdio em

embriões teve como resultado a não diferenciação do tubo neural. Contudo, uma transplantação

de um outro para uma localização mais dorsal levou à indução de um segundo floor plate (Figura

2.5) e aparecimento de motorneurónios nessa mesma região. Assim, esta estrutura não neuronal

é necessária e suficiente para a determinação do eixo dorso-ventral da espinal-medula.

21

Figura 2.5. A transplantação de um notocórdio extra (vermelho) numa posição mais dorsal resulta na proliferação adicional

de neuroblastos (verde)

(Adaptado de revisão de Wilson et al., 2005).

MOVIMENTO INTERCINÉTICO NUCLEAR

A divisão do tubo neural em camadas radiais foi proposta inicialmente pelo alemão Wilhelm

His: região ependimal (perto dos ventrículos), zona do manto e região marginal (zona de

concentração de neurónios pós-mitóticos) (Figura 2.6). Figuras mitóticas foram descritas na região

ependimal – a mais interior no tubo neural. Terminologia mais recente concatena as duas regiões

mais internas no conceito de região ventricular.

Figura 2.6. Divisão do tubo neural em região ependimal, marginal, e zona do manto.

As figuras de mitose foram identificadas na região ependimal da estrutura, estando a posição dos núcleos dos progenitores

neurais correlacionada com a fase do ciclo celular dos mesmos (Adaptado de Sanes et al, 2006).

Nos estadios iniciais do desenvolvimento, o tubo neural apresenta-se apenas como

neuroepitélio simples com simetria bilateral, ocupando cada célula um raio da estrutura (Wilcock et

al., 2007). Cada célula tem contacto com ambas as regiões basal e apical e apresenta ao longo do

seu ciclo de vida, movimentos radiais entre estas duas zonas, inicialmente identificados em

secções de tubo neural incubadas com timidina tritiada e posteriormente fixadas (Sauer et al.,

1959). Durante a transição da fase S para mitose, o núcleo das células neuroepiteliais movimenta-

se da zona basal para a apical e a célula adquire uma forma mais redonda nos instantes

precedentes à citocinese. Após divisão, as células-filhas retomam a morfologia fusiforme inicial do

progenitor.

A distinção entre divisão simétrica e assimétrica está relacionada com o destino que as

22

células-filhas adquirem depois da divisão. Divisões simétricas são aquelas onde ambas as células-

filhas seguem o mesmo destino: ou ambas continuam como progenitores neurais ou se tornam

neurónios pós-mitóticos. Neste último caso, chama-se divisão simétrica terminal. Nas divisões

assimétricas, são originados um progenitor neural e uma célula neuronal pós-mitótica.

Esta população de células mitoticamente activas e assíncronas está unida fisicamente por

junções aderentes na superfície apical. Esta ligação é bastante forte quando estão envolvidos

progenitores sendo, contudo, atenuada durante a diferenciação terminal (Pearson et al., 2005).

Dependendo do estado de progressão da neurogénese no embrião, existe uma maior ou menor

percentagem de divisões terminais. No início do desenvolvimento do tubo neural, a maior parte

das divisões são proliferativas e originam dois novos progenitores, enquanto que nos estadios

finais da neurogénese se verifica uma predominância de divisões simétricas terminais com a

formação de duas células diferenciadas.

Figura 2.7. A progressão temporal de crescimento do tubo neural e córtex cerebral depende de padrões de divisões

celulares especificos.

Antes da neurogénese, divisões simétricas têm como objectivo único o aumento do número de precursores neurais

(Adaptado de Fishell et al., 2003).

Por outro lado, uma característica relevante das divisões na região apical das células

neuroepiteliais é a orientação do plano de clivagem na citocinese relativamente à superfície apical

do neuroepitélio. Planos de clivagem orientados aproximadamente entre 45-90º relativamente à

superfície luminal são referidos como verticais, sendo as divisões com planos de clivagem entre 0-

45º denominadas de horizontais (Figura 2.9).

Trabalhos efectuados por Chenn e McConnel em 1995 (revisto em Chenn et al., 1998)

indicam que a existência de divisões simétricas ou assimétricas depende da orientação do plano

de clivagem da célula-mãe. Uma divisão horizontal coloca uma célula numa região mais apical e a

outra numa posição mais basal levando a que a segunda entre em G0, constituindo assim uma

divisão assimétrica. Pelo contrário, uma separação vertical estabelece uma herança igual de

porções de membrana basal e apical das células-filhas (Figura 2.8), constituindo uma divisão

simétrica que dá origem a duas células-filhas com o mesmo destino: dois progenitores ou dois

neurónios em diferenciação terminal.

23

Figura 2.8. Movimento intercinético nuclear de progenitores neurais no tubo neural.

Durante a fase inicial de desenvolvimento do tubo neural os progenitores dividem por divisões simétricas. A posição dos

núcleos difere de acordo com as fases do ciclo celular. A síntese de DNA (S) ocorre com os núcleos na região mais basal

do tubo neural. Via fase G2 as células procedem à mitose (M) na região ventricular (V), originando duas células filhas que

re-entram no ciclo celular. Durante a neurogénese, divisões assimétricas geram duas células filhas, uma das quais pode re-

entrar no ciclo celular em G1, podendo seguir a outra para diferenciação por migração da zona ventricular (VZ) para a zona

marginal (MZ), onde os neurónios pós-mitóticos se acumulam (Adaptado de Yoshikawa, 2000).

Estudos posteriores (Wilcock et al., 2007) em tubo neural de galinha revelam que a

orientação do plano de clivagem aquando da divisão não tem relação directa com a aquisição de

um determinado destino neural, podendo ocorrer divisões horizontais simétricas e verticais

assimétricas (Figura 2.9). No entanto, é referido que as divisões verticais originam

maioritariamente duas células com o mesmo destino neural.

Figura 2.9. Tipos de divisão simétrica e assimétrica em cortes de tubo neural de galinha.

Uma célula (a tracejado branco) divide segundo um plano vertical (tracejado a rosa) com formação de um neurónio

(tracejado a vermelho) e um progenitor (tracejado a verde). Ambos os núcleos das células formadas migram em direcção à

superfície basal (a tracejado azul). O núcleo de uma célula (tracejada a vermelho) retrai a sua membrana apical, enquanto

a outra (a tracejado verde) continua em direcção à superfície apical e divide de novo numa divisão horizontal

(Adaptado de Wilcock et al., 2007).

Para o estudo in vitro de diferenciação celular, células estaminais têm sido amplamente

usadas na medida em que a sua capacidade de diferenciação terminal em determinadas linhagens

celulares permite um estudo detalhado de todos os processos envolvidos.

24

2.1.4. CÉLULAS ESTAMINAIS

Nas últimas três décadas assistiu-se a um grande avanço no conhecimento dos

mecanismos subjacentes a este tipo celular e nas potenciais aplicações que terapias celulares

poderiam ter. É neste ponto que a perspectiva de restabelecimento da função normal de tecidos

humanos danificados por doenças se apresenta como finalidade de todo o esforço dispendido

nesta área. No entanto, muitos aspectos estão ainda por esclarecer, nomeadamente o modo como

obter populações puras das células diferenciadas desejadas em equilíbrio com a manutenção do

potencial mitótico no sentido de obter enxertos efectivos.

DEFINIÇÃO

Para definição do conceito de células estaminais são comummente usados dois

parâmetros: a sua origem e o seu potencial. Quanto à origem, as células estaminais podem ser

embrionárias, adultas, ou do cordão umbilical. Duas características necessárias para a definição

do seu potencial são: a capacidade ilimitada de auto-renovação sem senescência; e o potencial de

diferenciação terminal em um ou mais tipos celulares, in vitro e in vivo como resposta a estímulos

fisiológicos.

Uma avaliação dos tipos celulares que existem tendo como parâmetro o potencial de

diferenciação levam-nos a definições de totipotência, pluripotência, multipotência e unipotência.

Células totipotentes resultam das divisões iniciais a partir do ovo em estado de mórula, e

possuem a capacidade de originar todas as células diferenciadas do organismo, incluindo tecidos

extra-embrionários da linhagem da trofoectoderme.

Como descendentes directos das células totipotentes encontram-se as células

pluripotentes, com capacidade de originar linhagens celulares presentes nos três folhetos

embrionários. Podendo já existir no ser adulto, as células multipotentes possuem a capacidade de

auto-renovação e formação de múltiplos tipos celulares diferenciados, mas restritos a um

determinado tecido, órgão ou sistema fisiológico. Em organismos adultos, a localização deste tipo

celular é variada, e a sua função é a manutenção do nível de células maduras, sendo as peças

fundamentais na regeneração de tecidos danificados ou doentes. A fronteira da definição de

células estaminais é ocupada por células unipotentes que originam apenas um tipo celular mas

que mantêm a propriedade de auto-renovação, característica que as distingue das não-estaminais.

CÉLULAS ESTAMINAIS EM CULTURA

Para obtenção de células estaminais embrionárias em cultura, embriões no estado de

blastocisto são plaqueados intactos ou, após isolamento da massa celular interna, em camadas de

células de suporte mitoticamente inactivadas (revisto em Friel et al., 2005). A expansão de culturas

homogéneas de células estaminais de qualquer outro tipo ex vivo não é trivial, devido à elevada

percentagem de diferenciação presente nas culturas. O motivo deste facto não está ainda

25

esclarecido, mas pensa-se ser devido à elevada dependência das células relativamente ao nicho

de onde são provenientes, ou à incapacidade de criação de condições de cultura que mimetizem

completamente o meio natural que sustente a auto-renovação (Conti et al., 2005). Por outro lado

não está ainda excluída a possiblidade da existência de um nível mínimo de divisão assimétrica,

mesmo in vivo, por parte das células estaminais embrionárias que levará sempre à presença de

uma certa percentagem de diferenciação.

O factor responsável pela manutenção da capacidade de auto-renovação em culturas com

células de suporte foi identificado no final dos anos 80. Inicialmente denominado Differentiation

Inhibiting Activity (DIA), é hoje mais conhecido como Leukemia Inhibitory Factor (LIF). Com a

descoberta deste membro da família das citocinas, foi possível a cultura de células estaminais

embrionárias em placas cobertas com gelatina, na presença adicional de soro.

VIAS ENVOLVIDAS NA AUTO‐RENOVAÇÃO

No que diz respeito ao LIF, a sua ligação aos receptores específicos (LIFR-β e gp130)

despoleta a activação de duas importantes cascatas de sinalização intracelulares, nomeadamente

a JAK-Stat e SHP2-Erk (Figura 2.10). A activação do receptor de membrana β (LIFR-β), resulta na

formação de complexos STAT3 que, quando translocados para o núcleo, controlam a transcrição

de genes importantes na auto-renovação (Friel et tal, 2005). Caso a ligação seja feita via gp130,

inicia-se uma cascata de transfosforilações envolvendo as cinases Raf e MAPK (MEK)

constituindo um sinal de pró-diferenciação em células estaminais embrionárias. Deste modo, a

eficiência com que as células em cultura mantêm o potencial de auto-renovação é em parte

consequência de um balanço de sinais destas duas vias.

Por outro lado, a expressão do gene oct4 contribui também para a auto-renovação das

células estaminais embrionárias. No entanto, a sua expressão não é suficiente para a manutenção

deste estado de pluripotência, estando dependente da acção dos complexos STAT3.

O gene nanog está também envolvido neste processo, sendo a sua expressão controlada

por Oct4.

Experiências levadas a cabo por Ying e colaboradores (Ying et al., 2003) referem a proteína

BMP4, como participante adicional no processo de manutenção do potencial de auto-renovação

das células estaminais embrionárias, induzindo a transcrição de genes Id, inibidores de

diferenciação. A ligação das BMPs ao seu receptor podem também activar vias inibidoras de auto-

renovação, como a via MAPK. Deste modo, é necessário definir-se um balanço entre a activação

do complexo STAT3, expressão dos genes Id, e actividade da via MAPK (Figura 2.10) para manter

o potencial de auto-renovação nas células estaminais.

26

Figura 2.10. Vias de sinalização principais (LIF e BMP) envolvidas na auto-renovação de células estaminais embrionárias.

O LIF activa tanto a via JAK-Stat como a via de pró-diferenciação MAPK. A acção do BMP é inibidora de neurogénese no

entanto, a sua capacidade de induzir diferenciação noutras linhas celulares é bloqueada pela via LIF/Stat3

(Adaptado de Friel et al., 2005).

A principal diferença entre auto-renovação de células embrionária estaminais humanas e de

murganho é a de que a presença de LIF não é necessária para manter a capacidade de auto-

renovação de células estaminais humanas, como acontece com as de murganho. Pelo contrário, é

imprescindível a presença de basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) para a manutenção desse

potencial (revisto em Friel et al. 2005).

Em ensaios in vitro, após propagação de células estaminais, o objectivo é a diferenciação

das mesmas num tipo celular predefinido. No entanto, para se ter controlo sobre o processo de

diferenciação é necessário ter conhecimento detalhado das vias envolvidas. Uma das vias

conservadas entre organismos para determinação na linhagem neural é a via de sinalização

Notch.

SINALIZAÇÃO NOTCH NA AQUISIÇÃO DE IDENTIDADE NEURAL

O gene Notch codifica para uma proteína transmembranar de 300kD. É a interacção desta

proteína com um dos seus ligandos que direcciona o destino das células portadoras do receptor

para um estado não diferenciado por inibição da diferenciação neural. Este processo é

responsável pela inibição lateral, essencial para o normal desenvolvimento embrionário de

mamíferos (revisto em Chiba, 2006).

Em Drosophila, Delta e Serrate são as duas proteínas transmembranares identificadas

como ligandos de Notch; em vertebrados, Delta e Jagged e em C.elegans, LAG-2 e APX-1.

As proteínas ajusante das interações Delta-Notch são os factores de transcrição Supressor

of Hairless [Su(H)], CBF1/RJBk em mamíferos, e LAG-1 em C.elegans. Por outro lado os genes do

locus Enhancer of split [E(spl)] que codificam para proteínas nucleares basic helix-loop-helix

(bHLH) têm também um papel importante (Figura 2.11). Em conjunto com Groucho, estas inibem a

expressão de genes proneurais Achaete-Scute.

27

Figura 2.11. Via de sinalização Notch.

Ligação do ligando Delta (verde) a um dos receptores Notch (roxo) da célula adjacente origina duas clivagens proteolíticas,

mediando a libertação do domínio intracelular do Notch (Nicd). Este entra no núcleo com a proteína de ligação ao DNA

CSL (CBF1, Su(H) e LAG-1) (laranja). O co-activador Mastermind (verde) e outros factores de transcrição são recrutados

pelo complexo CSL, enquando co-repressores (azul e cinzento) são libertados (Adaptado de Bray, 2006).

Em vertebrados, aos primeiros genes homólogos dos inibidores neurais E(spl) foram

atribuídas as designações de hes1 e hes3 (Baek et al., 2006). Posteriormente outros foram

caracterizados, sendo quatro os descritos como existentes no tubo neural em rato: hes1, hes3,

hes5 e hes6, com padrões distintos, mas sobreponíveis (Revisto em Kageyama et al., 2007).

Figura 2.12. Expressão dos genes hes em secções transversais do tubo neural de galinha.

Os quatro genes hes são expressos na região ventricular do tubo (A), onde Notch-1 é expresso (B). Imagens sobrepostas

(C) demonstram sobreposição em expressão (DAPI a azul. Vermelho e verde são originados de hibridações in situ).

Expressão de genes hes não está presente em neurónios diferenciados, como mostrado pelo marcador neuronal

complementar TUJ-1 (D) Escala = 50μm (Adaptado de Fior et al., 2005).

Mesmo após conhecimento exaustivo das vias envolvidas na diferenciação na via neural in

vivo, é necessário o estabelecimento in vitro de ensaios sólidos e reprodutíveis de todos os passos

em questão.

2.1.5. DIFERENCIAÇÃO NEURAL IN VITRO

Partindo de células estaminais embrionárias várias metodologias foram desenvolvidas com

o intuito de reproduzir in vitro a neurogénese, envolvendo a produção de precursores neurais e de

células neuronais diferenciadas. Destacam-se a formação de corpos embrióides na presença de

ácido retinóico (Bain et al., 1996), co-cultura com células de suporte de estroma (Kawasaki et al.,

28

2000) ou diferenciação em monocamada (Ying et al., 2003).

A formação de corpos embrióides resulta da agregação das células estaminais em

suspensão em conjuntos multicelulares e multidiferenciados. Concentrações elevadas de ácido

retinóico induzem primariamente diferenciação neural, induzindo no entanto também mesoderme.

Consequentemente, as culturas finais obtidas são sempre uma mistura muito heterogénea de

vários tipos celulares.

Os ensaios de co-cultura de células estaminais embrionárias com células PA6 de estroma

foram estabelecidos por Kawasaki e colaboradores (Kawasaki et al., 2000). Este tipo de co-cultura

induz diferenciação neural em meio sem soro e sem uso de ácido retinóico.

No Instituto de Medicina Molecular, Lisboa, foi desenvolvido um protocolo de diferenciação

neural em monocamada a partir de células estaminais embrionárias, com base no trabalho de

Austin Smith e os seus colaboradores, do Institute for Stem Cell Research (University of

Edimburgh, UK) (Ying et al., 2003) com células embrionárias estaminais 46C. Estas células

contêm a sequência codificante de GFP regulada pelo promotor do gene sox1. Este gene é o

marcador de neuroectoderme de embrião de rato presente temporalmente mais cedo no

desenvolvimento.

É assim possível monitorizar a diferenciação neural através de observações de

fluorescência dado que a expressão de GFP ocorre apenas aquando da transcrição de sox1. Em

embriões gerados a partir de células desta linhagem a fluorescência proveniente de GFP

encontra-se exclusivamente em células neuroepiteliais (Ying et al., 2003).

Segundo este protocolo, as células estaminais embrionárias são inicialmente mantidas no

estado de pluripotência em meio de cultura suplementado com LIF (Figura 2.13). Três a quatro

dias após a remoção deste factor de inibição de diferenciação já há expressão de marcadores

claros da linhagem neural. Só neste ponto a percentagem de células Sox1-GFP positivas sobe

para valores entre 70-90%, confirmando que os estímulos fornecidos ao meio têm como

consequência a diferenciação das células estaminais em precursores neurais (Figura 2.15).

Figura 2.13. Clusters de células estaminais embrionárias não diferenciadas observadas com luz visível em campo claro

(Escala = 50μm).

Os progenitores neurais (Figura 2.14), após replaqueamento num substrato de Poli-D-

Lisina-Laminina, que aumenta a sobrevivência e potencia a adesão celular, são morfologicamente

distintos das células estaminais suas precedentes: os corpos celulares são opacos, com núcleos

difíceis de distinguir, e as células organizam-se em estruturas em forma de roseta (Figura 2.14).

29

Figura 2.14. Cultura de progenitores neurais no terceiro dia de monocamada em PDL-Laminina, observadas com luz visível

em campo claro.

As células tendem a formar estruturas organizadas em forma de rosetas. Uma roseta encontra-se destacada dentro do

círculo a vermelho (Escala = 30μm).

a. b.

Figura 2.15. Repórter Sox1-GFP para monitorização de diferenciação neural em monocamada.

a. Cinética da população positiva Sox1-GFP. O decréscimo de células GFP+ após o dia 8 de cultura ocorre devido ao facto

de a diferenciação em células da glia e neurónios é acompanhada por uma diminuição da expressão de sox1; b. Número

de células em cultura durante a diferenciação. Dados recolhidos da mesma amostra de a. Deste modo, fica claro que ao

decréscimo do número de células Sox1-GFP positivas se deve a uma diminuição da expressão deste gene e não a uma

diminuição real do número de células em cultura (Adaptado de Ying et al., 2003).

O traçado do gráfico da Figura 2.15a reflecte a capacidade de manutenção do estado de

precursor neural durante 12 dias, após início da diferenciação. Bekman e colaboradores (Bekman

et al.. 2006) revelam que a partir deste ponto a percentagem de células Sox1-positivas decresce

devido a um aumento da diferenciação dos precursores em células da glia e neurónios. Os autores

referem que a percentagem de neurónios no 12º dia de replaqueamento atinge os 30% do número

total de células em cultura.

Para culturas em monocamada de células 46C, estudos de imuno-histoquímica (Bekman et

al., 2006) com marcadores da região apical, como ZO-1 ou o complexo de polaridade PAR,

indicam que os conjuntos de progenitores neurais organizados em rosetas são semelhantes a

pequenos tubos neurais, com domínios apicais bem definidos, à volta dos quais os progenitores

GFP positivos estão distribuídos. Do mesmo modo, componentes presentes nas junções apicais

30

como N-caderina e β-catenina parecem localizar-se apenas na mesma região luminal.

Detecção de neurónios diferenciados pelos anticorpos Tuj1 e HU revelam a presença dos

mesmos na região exterior à roseta, mimetizando a consequência da sua normal migração do tubo

neural para a região ventricular.

Um dos mecanismos ainda pouco estudados mas com importância na determinação da

linhagem neural prende-se com a dinâmica do cálcio nos precursores neurais.

Conhecendo a importância do cálcio em processos de movimento celular e dado que está

reportada a existência de movimento de precursores neurais no tubo neural in vivo, seria do

máximo interesse aliar o estudo do movimento de precursores neurais em cultura de monocamada

com a monitorização da concentração de cálcio nas células em questão.

2.1.6. CÁLCIO

Cada tipo celular exprime um conjunto de componentes do Ca2+-signalling toolkit (Figura

2.16) tendo consequentemente sistemas de sinalização com propriedades espaciais e temporais

distintas.

Figura 2.16. Hipótese de indução-sinalização por cálcio.

Para além da activação de respostas celulares, o cálcio constitui também uma parte de um mecanismo de feedback que

regula transcrição de vários genes e é responsável por manter o conjunto de bombas, canais, buffers e efectores do Ca2+-

signalling toolkit (Adaptado de Berridge et al., 2003).

Pode ocorrer entrada de cálcio para a célula a partir do meio externo devido a uma grande

variedade de estímulos, nomeadamente despolarização, presença de agonistas extracelulares ou

mensageiros intracelulares, ou deplecção dos locais de armazenamento internos. Para o meio

intracelular, a libertação de moléculas de cálcio provenientes do retículo endoplasmático (RE) ou

sarcoplasmático (RS) é controlada pelas diferenças de concentração existentes, ou por

mensageiros como o inositol-1,4,5-trifosofato [Ins(1,4,5)P3], ADP ribose cíclica (cADPr) ou

esfingosina-1-fosfato (S1P). Para remoção do cálcio do citoplasma são activadas a bomba

Na+/Ca2+, Ca2+-ATPase de membrana ou Ca2+-ATPase do retículo sarco(endo)plasmático (Figura

2.17).

31

Figura 2.17. Dinâmica da sinalização por cálcio.

Durante as reacções on, a maioria de cálcio, encontra-se ligado a buffers, enquanto uma pequena proporção se liga a

efectores que activam uma grande variedade de processos. Nas reacções off, o cálcio é libertado e removido da célula por

várias bombas e transportadores: bomba Na+/Ca2+ (NCX), Ca2+-ATPase de membrana (PMCA) ou Ca2+-ATPase do retículo

sarco(endo)plasmático (SERCA). A mitocôndria tem também uma função activa na medida em que incorpora cálcio através

de um transportador uniporta e o liberta para o citoplasma lentamente

(Adaptado de Berridge et al., 2003).

CÁLCIO E O CICLO CELULAR

O ciclo celular das células eucarióticas é dividido em quatro fases distintas: G1, S, G2 e M.

Pode considerar-se que o ciclo começa com Mitose (M), mecanismo a quatro tempos: profase,

metafase, anafase e telofase, seguidos de citocinese, através do qual as células se dividem. Após

divisão celular, ocorre a entrada na interfase, período no qual as células aumentam de volume

continuamente. Dela fazem parte as fases S, G1 e G2. É na fase S que ocorre duplicação de

património genético, constituindo G1 e G2 fases de transição antes e após este período. O tempo

dispendido pelas células em G1 é variável. No entanto, o momento preciso em a célula inicia a

duplicação de DNA está bem determinado. É neste ponto que ocorre a síntese de muitas

proteínas, enzimas e RNA, verificando-se também a formação de organitos celulares. Como

consequência, em G1, e ainda em maior escala em G2, ocorre aumento de volume celular.

Quando as células são privadas de factores de crescimento, saem do ciclo celular e permanecem

num estado de quiescência denominado de fase G0. Moléculas com papel crucial em todo este

processo são as cinases de ciclo celular, que adquirem a sua forma activa por associação com

ciclinas, através de mecanismos ainda pouco conhecidos (Santella, 1998). A existência de

segundos mensageiros que despoletam a iniciação de cascatas de sinalização para activação das

cinases é considerada uma forte hipótese. O Cálcio constitui uma das moléculas mais importantes

como segundo mensageiro possível.

32

Em células somáticas de mamíferos, oscilações espontâneas de cálcio podem ser

observadas durante a transição entre fase G0 e G1, correlacionadas com a activação de genes

que permitem a reentrada no ciclo celular. Antes da fase S, oscilações promovem síntese de DNA,

enquanto um aumento da concentração de cálcio intracelular ocorre na transição de G2 para a

mitose.

Em células estaminais embrionárias de murganho, foi já demonstrada a existência de picos

de cálcio não sincronizados entre as células vizinhas, confinados a transições de G1 para a fase S

(Kapur et al., 2007).

Figura 2.18. Imagens bidimensionais adquiridas em microscópio confocal de células estaminais embrionárias de rato,

incubadas com Fluo-4 AM.

A. Oscilações espontâneas dos níveis de cálcio intracelular; B. A fluorescência normalizada de células individuais é

representada em função do tempo. Os números dos traçados correspondem às células individuais marcadas em A, e os

asteriscos aos instantes de tempo da aquisição das imagens (Adaptado de Kapur et al., 2007).

Conhecendo a existência de sinalização por cálcio em células estaminais em cultura, é

assim relevante determinar o papel deste elemento na indução neural

CÁLCIO E A INDUÇÃO NEURAL

O modelo de indução neural previa a existência de sinais inibitórios, como as BMPs,

membros da família de TGF-β, que bloqueiam a via neural, em detrimento da epidermal. Este facto

sugere que os indutores neurais como Noggin e Chordin actuavam bloqueando directamente a

interacção entre as BMP e os seus receptores, inibindo a transdução da via de sinalização (Figura

2.19).

33

Figura 2.19. Modelo de indução neural e epidermal em embrião de Xenopus laevis.

A. No caso de indução epidermal, a transdução do sinal a partir da ligação de BMP leva à formação de complexos entre

proteínas Smad que, quando translocadas para o núcleo, activam a expressão de genes epidermais, reprimindo os a

transcrição dos neurais; B. No caso de indução neural, indutores neurais como Noggin inibem a ligação das BMP com os

seus receptores de membrana, resultando na expressão de genes neurais (Adaptado de Moreau et al., 2004).

Contudo, experiências em Xenopus laevis mostraram que uma estimulação dos canais de

cálcio tipo-L, que permite um aumento transiente do cálcio intracelular, provoca também indução

neural mesmo na presença de BMP. Dados adicionais de alteração do destino epidermal para

neural após aumento da concentração de cálcio intracelular levaram à formulação de um novo

modelo (Figura 2.20): do mesmo modo que Noggin e Chordin impedem a ligação das BMPs aos

seus receptores no modelo anterior, esta via de inibição está também presente. Como dado

adicional, foi descrito o bloqueio da cascata de Smads através da calcineurina, uma fosfatase

dependente de cálcio, e a activação de uma cinase (CaMkinaseII) pelo cálcio que conduz à

transcrição imediata de genes envolvidos na aquisição do destino neural.

Figura 2.20. Novo modelo de indução neural em Xenopus laevis.

O cálcio desempenha o papel principal, através da activação da calcineurina que previne a fosforilação das Smads. Por

outro lado, o cálcio é também responsável pelo controlo da transcrição de genes, tanto directamente, como via activação

da calcium calmodulin kinase type II (CaMKII). Os canais de tipo L são activados após ligação do BMP a indutores neurais

(Adaptado de Moreau et al., 2004).

34

INDICADORES DE CÁLCIO

Dada a importância dos fluxos de cálcio entre os meios extra e intra-celulares em vários

processos, nomeadamente a aquisição de identidade neural, foram desenvolvidos diferentes

fluoróforos passíveis de incorporação nas células em estudo com o objectivo da monitorização da

concentração de cálcio intracelular. Os fluoróforos do grupo Indo, Fluo, Fura e Oregon constituem

alguns exemplos.

Todos os indicadores de cálcio são baseados em BAPTA (ácido 1,2-bis-(2-

aminofenoxi)etano-N,N,N’,N’-tetraacético), um homólogo de EGTA insensível a pH. Tal como o

último, BAPTA retém uma elevada sensibilidade para o Ca2+ (Kd ~ 100 nM a pH 7.0) na presença

de concentrações potencialmente competidoras de Mg2+ para este composto químico. Como

resultado da aromatização dos Azotos alifáticos do EGTA, o BAPTA tem elevadas taxas de

criação e rompimento da ligação com Ca2+.

Indicadores baseados em BAPTA são incorporados nas células por uma transformação

temporária dos carboxilatos em acetometil ésteres (AM). Estas moléculas hidrofóbicas não

carregadas difundem-se passivamente através das membranas celulares libertando o indicador de

policarboxilato após clivagem da parte éster por esterases intracelulares (Yuste et al, 2005),

podendo aumentar assim a sua fluorescência após ligação ao cálcio.

Figura 2.21. Obtenção de Fluo-4, fluorescente e impermeável na membrana celular (direita) a partir da esterificação de um

outro composto (esquerda), não fluorescente e permeável celular.

O local de ligação do Ca2+ dos indicadores derivados de BAPTA pode também ser

modificado de modo a alterar a afinidade do composto para o metal numa elevada gama de

concentrações, desde nanomolar até milimolar (Figura 2.22).

35

Figura 2.22. Modificações estruturais da molécula de BAPTA para formação dos compostos Fluo

(Adaptado de ‘Invitogen.com’).

Para incorporação do fluoróforo nas células de interesse, vários protocolos sugerem a

incubação a 37ºC com uma solução do fluoróforo e observação imediata da fluorescência

adquirida.

EXEMPLO DE APLICAÇÃO

No córtex cerebral, os neurónios pós-mitóticos têm movimentos de migração da região

onde são produzidos para a sua posição final da camada granular interna. Durante a migração, o

movimento das células é caracterizado por uma alternância entre fases estacionárias e

movimentos na mesma direcção, mas em sentidos opostos, sendo a taxa de migração

aparentemente controlada pela concentração externa de cálcio e o seu influxo através dos canais

de tipo L (Komuro et al., 1996). Experiências com indicadores de cálcio (Fluo-3 e Fura-Red) em

culturas de cerebelo revelam que cada fase do movimento “saltatório” das células está

correlacionada, temporalmente, com a frequência e amplitude de flutuações espontâneas de cálcio

intracelular (Figura 2.23).

Figura 2.23. Movimento celular é acompanhado de flutuações de cálcio. A. Representação em função do tempo das

alterações de fluorescência devido a níveis de cálcio de uma célula em migração; B. Direcção e distância percorrida pela

mesma célula durante cada minuto do ensaio de medição de níveis de cálcio. Imagens da migração foram adquiridas a

cada 30s durante 45min, após incubação das células com 1mM de Fluo-3 (Adaptado de Komuro et al., 1996).

36

2.2. MICROSCOPIA

Datam de 1660 as primeiras observações de vasos capilares por Marcello Malpighi (1628-

1694) com recurso a um microscópio. No entanto, é ao nome de Robert Hooke (1635-1703) que

comummente se associam os primeiros passos dados na evolução desta área. Seu

contemporâneo, foi Antoni van Leeuwenhoek (1632-1723) o responsável pelas primeiras

observações de seres vivos a elevadas ampliações.

Em 1830 Joseph Lister resolveu matematicamente o problema da aberração esférica,

facultando a prova necessária para que Ernst Abbe (1840-1905) e Carl Zeiss (1816-1888)

publicassem um artigo científico em 1877 definindo o conceito de distância de resolução,

formalmente tida como Lei de Abbe. Foi da responsabilidade desta dupla a invenção das

objectivas de imersão a óleo, fixando o limite máximo de resolução de 0,2μm para microscopia de

luz visível, situado actualmente em 0,1620μm. No entanto, técnicas recentes permitem atingir

resoluções de poucos Å, recorrendo à obtenção de padrões de interferência com luz visível.

PRINCÍPIOS FÍSICOS

A maior parte das propriedades dos instrumentos de formação de uma imagem

(telescópios, câmaras ou microscópios) podem ser interpretados a partir dos fundamentos da

Óptica. Qualquer superfície esférica pode ser considerada uma lente, na medida em que altera o

sentido de um feixe de raios paralelos se colocada na sua linha de propagação. Neste sentido,

todas as lentes têm distâncias focais definidas, nos dois sentidos a partir dela, definidas no eixo

comum a partir do seu centro. A distância focal determina o local do ponto focal, situado na

intersecção dos raios refractados pela lente (Figura 2.24).

Figura 2.24. Representação do processo de formação de uma imagem com uma lente convexa

(Adaptado de ‘OLYMPUS’).

Para discussão da maior parte dos princípios subjacentes aos fenómenos de microscopia é

suficiente considerar a luz como um campo escalar. Contudo, uma onda luminosa tem natureza

electromagnética e por isso, pode ser representada por uma função periódica (1),

A(x,t) = A0 sin(k(x-vt)) (1)

onde A0 representa a amplitude da onda. O argumento da função seno é linear tanto na

posição (x) como no tempo (t), de modo a representar a sua propagação no espaço a uma

37

determinada velocidade (v). A direcção de propagação será +x para valores positivos de v, e no

sentido contrário para valores negativos de v. A(x,t) pode ser representado tanto no eixo espacial,

dado um instante de tempo, como no eixo temporal, fixada uma coordenada x. No caso de uma

representação tridimensional, a função de onda terá de ser definida como

A(r,t) = A0 sin(k.r-ωt+ϕ) (2)

A equação (2) representa uma onda monocromática normal ao vector k que se propaga na

direcção definida no espaço tridimensional por r (Figura 2.25).

Figura 2.25. Representação de uma onda electromagnética, com as suas componentes eléctrica e magnética

(Adaptado de ‘OLYMPUS’).

Devido ao facto de a função seno ter uma frequência natural de 2π, é a constante k que

estipula o comprimento de onda λ. Em (1), k não é mais que o equivalente à norma de k em (2).

k = ||k|| = 2π/λ (3)

A frequência da onda, ν, pode ser vista como o número de ciclos que ocorrem por unidade

de tempo, tal que o produto da frequência pelo comprimento de onda originará a velocidade v de

propagação da onda (4).

νλ = v (4)

ω/k = v (5)

Em (5) a frequência angular ω virá então expressa em rad/seg.

Para a luz no vácuo, vem que v = c.

Quando uma onda passa por uma fronteira onde o índice de refracção é diferente, a

velocidade da onda é alterada pelo custo de alteração do comprimento de onda e não da

frequência (4), característica intrínseca e constante. Por outro lado, pode explicar-se o desvio de

trajectória de um raio ao atravessar dois meios com propriedades diferentes através da lei da

refracção de Snell-Descartes (6).

n1 sin(θ1)= n2 sin(θ2) (6)

O índice de refracção, n, (7) apresenta-se como o rácio entre a velocidade da luz e a

velocidade da onda em cada material (vi).

ni = c/vi (7)

38

Tabela 2.1. Índices de refracção de alguns meios usados em cultura de células

(adaptado de Yuste et al., 2005).

Tipo de material Índice de refracção

Ar 1,00028

Água 1,333

Meio de cultura ou salino 1,335

Células animais 1,36

Óleo de imersão 1,51

Vidro 1,52

Numa abordagem quântica, a energia transportada pela onda é proporcional à densidade

de fotões e energia transportada por cada um (8).

e = hν = hc/λ (8)

onde h representa a constante de Planck.

CÂMARAS CCD

Dado às suas características de desempenho quando incorporadas em equipamentos de

imagiologia, as câmaras CCD são comummente em microscopia como transdutor dos sinais

luminosos provenientes da amostra. Como aspectos importantes tem-se o seu ecrã plano,

linearidade de resposta em diferentes janelas de operação, possibilidade de variação do tamanho

e tipo de pixel e baixo ruído associado (Yuste et al., 2005).

Figura 2.26. Princípio de funcionamento de uma câmara CCD

(Adaptado de “Basics of Light & Imaging”, OLYMPUS).

A resolução de um detector CCD é apenas determinado pelo tamanho de cada pixel. Deste

modo, imagens com a maior resolução possível terão de ser adquiridas com o sensor utilizando o

menor tamanho de pixel disponível. Duas estruturas adjacentes são resolvidas pela câmara CCD

se os seus máximos forem aquiridos por pixeis diferentes com, pelo menos um pixel com sinal de

menor intensidade entre os anteriores. Isto significa que um objecto necessita de, no mínimo, dois

39

pixeis para ser adquirido sem perda de informação, levando a que a mínima separação entre

objectos que a CCD consegue verdadeiramente distinguir equivalente ao tamanho de dois pixeis

unitários. Assim,

Resolução da CCD = 2 x Xp (9)

sendo Xp o tamanho de um pixel (µm).

Por outro lado, a resolução da imagem é dependente da magnificação da objectiva e

qualquer outro sistema de lentes anterior à câmara de transdução. No caso de uma CCD,

Xim = Xobj x Mobj x Mtl (10)

onde Xim é o tamanho da imagem, Xobj o tamanho do objecto, Mobj a ampliação da objectiva,

e Mtl a ampliação de qualquer outro conjunto de lentes (se não existir, Mtl = 1), se usadas.

FOTOMULTIPLICADORES

Um fotomultiplicador é um tubo de vidro, sob vácuo, constituído por um fotocátodo que

recebe os impulsos luminosos e liberta electrões por efeito fotoeléctrico. Estes electrões são

multiplicados por um sistema formado por um conjunto de eléctrodos (10 a 14), os dínodos, que

termina num ânodo onde se recolhe o sinal (Figura 2.27). O sinal de saída é assim uma corrente

proporcional ao número de fotões incidentes no fotocátodo, e à voltagem aplicada aos terminais

do fotomultiplicador.

Figura 2.27. Princípio de funcionamento de um fotomultiplicador

(Adaptado de “Basics of Light & Imaging”, OLYMPUS).

ELECTRON MULTIPLYING CCD (EMCCD)

As câmaras EMCCD são consideradas soluções híbridas entre as câmaras CCD e os

fotomultiplicadores. Os fotões provenientes da amostra são recebidos inicialmente por uma CCD

e, como ao ecrã da câmara está acoplado um sistema de aumento de ganho, existe uma

multiplicação considerável do sinal recebido. Esta amplificação é feita por um mecanismo de

ionizações sucessivas, semelhante ao presente num fotomultiplicador.

A principal vantagem deste sistema é a redução do ruído de leitura que, mesmo em

condições de baixo ganho, é aproximadamente de um electrão. Consequentemente tem-se um

aumento de sensibilidade para este tipo de detector.

40

2.2.1. MICROSCOPIA DE LUZ TRANSMITIDA

MODELO DE ABBE

A relação entre abertura e resolução num microscópio foi primeiramente reportada por

Abbe a partir de um modelo que considerava a amostra como sendo uma grelha de difracção

imersa num meio com índice de refracção n (com comprimento de onda igual a λ0/n, sendo λ0 o

comprimento da onda no vácuo). Este modelo retrata exactamente o que acontece em

microscopia de luz transmitida, na qual existe coerência espacial entre os raios que penetram na

amostra numa direcção particular. Se a grelha for iluminada por um conjunto de ondas

monocromáticas planas provenientes do condensador, a luz transmitida forma um conjunto de

padrões de difracção que se deslocam em ângulos perfeitamente definidos relativamente ao

ângulo de incidência da luz.

Para uma grelha composta por fendas de período p, iluminada por uma luz de comprimento

de onda λ0/n, máximos de difracção ocorrerão a ângulos θN, nos quais o incremento do percurso

do feixe é um múltiplo exacto do comprimento de onda em questão. Este requisito garante

interferência construtiva (11).

p sin(θN) = N λ0/n , com N = 0, ±1, ±2, ±3, …, ±Nmáx (11)

onde Nmáx é definido pelo requisito de |sin(θN)| ≤ 1.

Quando as ondas planas incidentes são oblíquas à amostra, com ângulo de incidência de

θi, a condição para interferência construtiva resulta de uma pequena modificação de (11).

p (sin(θN)-sin(θi)) = N λ0/n (12)

Caso particular surge quando θi = -θmáx, que conduz a que a ordem zero de interferência

saia e entre na objectiva com um ângulo de -θmáx, e o primeiro máximo ocorra a +θmáx. Está assim

estipulado o limite de resolução do microscópio

pmin (sin(θmáx)-sin(-θmáx)) = pmin (2sin(θmáx)) = λ0/n

equivalente a

pmin = λ0/(2n.sin(θmáx)) (13)

A quantidade n.sin(θmáx) refere-se à abertura numérica, NA, do sistema óptico.

Em casos onde a abertura numérica do condensador, NAcond, difere da da objectiva, NAobj,

(13) passa a

pmin = λ0/(NAcond+NAobj) (14)

É neste ponto que se torna clara a importância do condensador em sistemas de aquisição

de imagem de luz transmitida. Esta parte do sistema não tem como objectivo apenas a

concentração de luz no campo de visão, mas também controla os ângulos de incidência da luz na

amostra, garantindo que a abertura numérica da objectiva está a ser maximamente utilizada na

captação de todas as possíveis ordens de difracção de todos os elementos constitutivos da

amostra passíveis comparação com a rede de difracção de Abbe.

De maior importância é o limite de resolução intrínseco do microscópio, determinado pela

41

difracção da luz em toda a óptica usada, com a mínima distância detectável entre dois pontos

luminosos dada pelo critério de Rayleigh (15). Esta igualdade refere que para dois pontos serem

detectáveis é necessário que os seus máximos se situem a uma distância angular tal que à

posição do máximo de um ponto corresponda, pelo menos, ao mínimo do outro (Deus et al.,

2000).

d = 0.61 x λ/NA (15)

sendo d a distância mínima detectável entre dois pontos, λ o comprimento de onda da luz, e

NA a abertura numérica da objectiva em uso.

CAMPO CLARO

Na sua forma mais básica, sem necessidade de recorrer a qualquer tipo de filtros, a

microscopia de campo claro pode ser útil na visualização de estruturas onde o contaste da

amostra, intrínseco ou após colorações, é por si suficiente para uma descrição do objecto em

estudo. As imagens são formadas por alterações da absorvância dos elementos constituintes da

amostra, originando diferentes intensidades colectadas pelo detector.

2.2.2. FLUORESCÊNCIA

Até ao momento, a microscopia de fluorescência tem sido o método mais largamente usado

para estudo de estruturas fixadas ou vivas, muito devido à elevada especificidade dos marcadores

fluorescentes para vários componentes celulares e moleculares. A elevada especificidade na

detecção das mesmas também contribui em muito para esta primazia.

Neste sentido, foi a introdução da GFP (Green Fluorescent Protein) em 1998 que permitiu

uma revolução no conceito de fluorescência na biologia celular moderna. Tratando-se de uma

proteína proveniente da medusa Aequorea victoria a sua fluorescência é devida a p-

hidroxibenzildeneimidazoliona formada numa reacção auto-catalítica dos aminoácidos 65 a 67

(Ser-Tyr-Gly) na proteína nativa. Devido ao facto de a parte fluorescente estar confinada ao

interior da molécula (Figura 2.28), a GFP tem elevada estabilidade e resistência a desnaturação

por proteases e quenching por Oxigénio e alterações de pH. O pico de excitação situa-se a

488nm, com máximo de emissão a 507nm.

42

Figura 2.28. Estrutura da GFP, com a localização da parte fluorescente evidenciada no seu interior.

Fusões GFP podem ser facilmente obtidas por técnicas de recombinação standard no seu

terminal amino ou carboxil, no entanto, é necessária a verificação de que a introdução dessa

sequência codificante não interfere com a viabilidade celular.

MECANISMOS DE ABSORÇÃO/EXCITAÇÃO

O processo de fluorescência foi primeiramente descrito por Stokes em 1852 e consiste na

emissão de luz por moléculas excitadas após absorção de fotões de determinado comprimento de

onda. A diferença entre os comprimentos de onda dos fotões emitidos e os que provocaram a

excitação depende apenas das orbitais mais externas do fluoróforo específico.

O estado fundamental onde se encontram a maior parte dos electrões do fluoróforo antes

da absorção de luz é designado por S0. A energia transferida para estes é convertida em cinética

vibracional e rotacional, provocando alteração do estado energético dos electrões na molécula.

Ocorre transição para um estado excitado se os fotões incidentes ultrapassarem um determinado

limiar de valor de energia, apenas dependente do seu comprimento de onda, segundo (8). As

orbitais para as quais a transição ocorre são denominadas de Si (i=1,2,…,n), aumentando i com o

aumento da distância ao núcleo e, como tal, da energia necessária para a transição. Como em

cada estado electrónico existem vários estados vibracionais e rotacionais, para excitação de um

fluoróforo para um determinado estado excitado, são possíveis fotões com energias

correspondentes a um intervalo de comprimentos de onda. Deste modo, o espectro de excitação

dos fluoróforos consiste em picos com desvio padrão diferente de zero e não somente por deltas

de Dirac.

Vários processos de perda de energia podem ocorrer a partir daqui. Dentro do mesmo

estado excitado, os electrões podem perder alguma da sua energia vibracional, dando origem à

denominada relaxação vibracional. Caso essa transição ocorra entre estados vibracionais de

níveis energéticos diferentes, trata-se de conversão interna. Ambos estes mecanismos ocorrem

sem emissão de radiação, colocando o electrão no estado vibracional e rotacional de menor

energia dessa orbital. Libertação de fotões de fluorescência ocorre a partir deste ponto, quando os

electrões perdem toda a sua energia no retorno ao estado fundamental.

Fluorescência não é o único processo pelo qual os electrões voltam ao estado fundamental.

43

Pode também formação de tripletos energéticos, com libertação de luz de fosforescência,

responsáveis em parte pelo processo de fototoxicidade deste tipo de iluminação.

Figura 2.29. Diagrama de Jablonski.

A luz absorvida excita electrões do fluoróforo para um nível energético superior. Vários mecanismos intermédios podem

ocorrer, havendo emissão de luz de fluorescência pelo regresso do electrão ao seu estado fundamental após um intervalo

de tempo de 10ns (Adaptado de “Basics of Light & Imaging”, OLYMPUS).

FONTES DE LUZ

As fontes de luz mais comuns para microscopia de fluorescência são lâmpadas de mercúrio

a alta pressão, arcos de Xénon ou lâmpadas de metal halide, um híbrido entre as anteriores.

Como output, ambas apresentam uma luz concentrada branca, mas possuem características

diferentes a nível de componentes espectrais (Figura 2.30). Os arcos de Mercúrio têm a maior

parte da luz com comprimentos de onda em torno de picos centrados nas linhas de emissão do

átomo em fase gasosa, nomeadamente a: 254nm (UV), 265nm (UV), 365nm (UV), 405nm

(violeta), 436nm (azul), 546nm (verde), e 578nm (amarelo). Esta fonte é ideal se existir uma

grande coincidência entre a banda de excitação de um determinado fluoróforo e estes picos. Fora

destes valores, a potência da lâmpada é aproximadamente nula. Pelo contrário, os arcos de

Xénon emitem um contínuo de frequências entre 250 e 800nm, mas menos intensas.

Figura 2.30. Espectros de emissão das lâmpadas de Mercúrio e Xénon

(Adaptado de “Basics of Light Microscopy & Imaging”, OLYMPUS).

44

FILTROS USADOS

O primeiro elemento de filtragem num microscópio de epifluorescência é um conjunto de

três filtros alojados num cubo: filtro de excitação, de emissão e um dicróico.

I. O filtro de excitação, um passa-banda ou passa-baixo, transmite apenas os comprimentos

de onda específicos que excitam o fluoróforo em questão. Usualmente a sua nomenclatura está

relacionada com o tipo de fluoróforo com que podem ser usados.

II. O filtro de emissão tem como função a selecção dentro de uma janela de comprimento

de onda específico toda a luz de emissão proveniente da excitação específica do fluoróforo

pretendido. O valor do pico máximo desta luz é sempre de maior comprimento de onda que a luz

de emissão (Figura 2.31), devido à libertação de uma parte da energia de excitação no processo

de relaxamento.

Este tipo de filtros tanto pode ser passa-alto como passa banda.

Figura 2.31. Representação esquemática de um espectro de excitação e emissão de um fluoróforo genérico

(Adaptado de “Basics of Light Microscopy & Imaging”, OLYMPUS)

III. O espelho dicróico é uma pequena peça com uma superfície plana interna disposta num

ângulo de 45º relativamente ao caminho óptico. A cobertura desta área torna-o altamente

característico, por reflectir apenas uma cor, correspondente à luz de excitação, e transmitir outra

cor, a luz de emissão.

Figura 2.32. Representação esquemática da disposição de todos os constituintes de um sistema de aquisição de

microscopia de fluorescência

(Adaptado de Haragushi et al., 1999).

45

CONSTRUÇÃO DA IMAGEM

A formação da imagem num sistema óptico de fluorescência difere bastante de

microscópios de luz transmitida. Os estados moleculares que dão origem à fluorescência têm um

tempo finito de vida de alguns nanosegundos e, normalmente, cada molécula de fluoróforo emite

fluorescência de modo independente. Para substituição do modelo de Abbe (Secção 2.2.1), tem-

se agora um conjunto de pontos emissores de frentes de onda esféricas, representando a emissão

espontânea de luz por moléculas individuais, tendo sido este modelo inicialmente desenvolvido por

Rayleigh (1842-1919) na análise de imagens de estrelas, consideradas elementos pontuais para

os telescópios. Como consequência, a imagem de fluorescência é apenas a sobreposição ou

soma do padrão de intensidade formado por cada fluoróforo pontual da amostra.

Essencialmente o que a objectiva faz é a colecção de uma secção circular da frente de

onda, transformando-a numa onda convergente no plano da imagem. Devido a esta limitação

espacial, a onda deixou de ser completamente esférica, passando a ter modificada a sua

amplitude e fase. Deste modo, em vez de a transformação ser um delta de Dirac, são formados

círculos concêntricos progressivamente atenuados com a distância ao centro, chamados de discos

de Airy (1801-1892), em sua honra.

Figura 2.33. Discos de Airy como uma medida do poder de resolução.

Exemplo de objectivas de diferentes aberturas numéricas: baixa à esquerda, e de mais elevada à direita (Adaptado de

“Basics & Light Microcopy”, OLYMPUS).

2.2.3. MICROSCOPIA CONFOCAL

Muito do crescente interesse pelo uso de microscópios confocais prende-se com o aumento

do número de fluoróforos à disposição dos grupos de investigação molecular e celular.

Infelizmente, imagens de fluorescência são altamente degradadas pela luz refractada ou emitida

pelas estruturas fora do plano de foco. Este problema torna-se particularmente nefasto na

observação de amostras espessas (como cortes de cérebro ou embriões inteiros) e é aumentado

devido à baixa resolução no eixo dos z dos microscópios widefield convencionais.

Grande advento nesta área foi a introdução de microscópios confocais na medida permitem

rejeitar a luz fora do plano de foco, aumentando assim a resolução em z logo na aquisição.

46

ENQUADRAMENTO HISTÓRICO

O princípio subjacente à microscopia confocal foi primeiramente descrito por Marvin Minsky

em 1961: a luz proveniente de um ponto na amostra, após passar pela objectiva, atravessa uma

abertura (pinhole), cujo tamanho, controlável pelo utilizador, define a espessura do plano referente

à luz que se está a colectar. Luz fora do foco pretendido será bloqueada pela abertura. Assim,

apesar de a intensidade de luz recolhida pelo detector ser reduzida, apenas é colectada luz do

plano de foco pretendido. Esta característica, usualmente chamada de seccionamento óptico, é útil

para reconstrução 3-D de estruturas vivas sem o uso de cortes no sentido literal da palavra.

Sendo a iluminação da amostra pontual, por varrimento do campo de observação segundo

eixos ortogonais é formada uma imagem do objecto em estudo.

IMPLEMENTAÇÃO

Segundo Minsky, o modo mais simples de implementação desta tecnologia é a fixação de

todo o percurso da luz, movimentando a amostra debaixo do feixe incidente. Esta opção permite

varrimento de maiores áreas no entanto, torna-se impraticável quando a amostra está ligada

fisicamente a outros sistemas.

Melhoria posterior foi a conjugação de aberturas concêntricas num disco, de Nipkow, tanto

na luz incidente como na transmitida. Este dispositivo permite a iluminação e obtenção de

informação de vários pontos da estrutura ao mesmo tempo, poupando a quantidade de luz a que a

amostra está sujeita.

Varrimento por laser é também uma opção de implementação desta descoberta. No caso

de sistemas baseados em espelhos, a linha de interesse do espectro do laser é seleccionada

através de um modulador óptico-acústico [acousto-optical modulator (AOM)]. O varrimento no

plano da amostra é feito com o recurso a espelhos controlados por galvanómetros que

direccionam o feixe de laser na direcção pretendida. Luz de fluorescência amostra retorna em

sentido contrário e, após passar pelo dicróico, transparente, para o comprimento de onda em

questão, é focado na abertura situada em frente ao detector. O sinal de saída do detector é

correlacionado com a posição computacionalmente controlada dos espelhos, permitindo a

reconstrução de uma imagem a duas dimensões (Yuste et al., 2005).

47

Figura 2.34. Representação esquemática da disposição espacial dos componentes principais num microscópio confocal.

Raios de luz provenientes de regiões fora do plano de foco (laranja) são bloqueados pelo pinhole, não contribuindo para a

formação da imagem (Adaptado de “Confocal Laser Scanning Microscopy – Principles”).

Dado que em biologia há eventos que ocorrem a uma escala muito reduzida de tempo, e

que o uso de galvanómetros, pesados, leva a que o varrimento da amostra seja demasiado lento,

foi tentado o uso de fibra óptica para obtenção de velocidades de varrimento superiores. Através

de uma excitação acústica são formadas ondas de refracção que levam à vibração de um cabo de

fibra óptica, que funciona como pinhole, transmissor e receptor da luz de laser.

Sistemas mais avançados foram desenvolvidos pela Leica e Zeiss recorrendo ao uso de

vários detectores para uma aquisição simultânea de diferentes comprimentos de onda. Dispersão

espectral da luz de fluorescência de emissão por um prisma ou uma rede de difracção são

exemplos usados.

2.3. MICROSCOPIA EM TEMPO REAL DE CÉLULAS

2.3.1. VIABILIDADE CELULAR

Controlo das condições externas à cultura são factor fundamental a ter em conta quando se

pretende fazer aquisições de imagens em tempo real. Para tal existem algumas estratégias de

manutenção da viabilidade celular durante a aquisição de imagens que incluem selecção da

câmara de incubação, temperatura, condições de crescimento, natureza do meio ou osmolaridade

do mesmo. Em geral, as câmaras usadas possuem uma janela de vidro, usualmente da espessura

de uma coverslip, através da qual as imagens são adquiridas, com possíveis entradas para adição

48

de meio de cultura ou seringas de adição de drogas ou microinjecção.

Dado que a função celular é intimamente regulada pela temperatura do meio, uma grande

variedade de métodos estão disponíveis para controlo da temperatura das culturas no

microscópio. Algumas câmaras comerciais de incubação incluem já a possibilidade de

aquecimento. Contudo, há que ter em conta a possibilidade de não estabilidade de temperatura

quando se aquece apenas a câmara de incubação e não todo o sistema de objectivas e platina do

microscópio, dado que estes podem funcionar como escape de calor durante a aquisição. Para tal,

existem sistemas onde a objectiva é aquecida ou todo o microscópio está dentro de uma câmara

aquecida a ar. Esta última solução minimiza movimentos da amostra, para fora do plano focal

pretendido, devidos a expansão térmica dos elementos do microscópio. Dependendo da situação

em causa e dos meios disponíveis, uma ponderação tem de ser feita antes da iniciação de

qualquer experiência com estas exigências.

Células de mamífero são mantidas em condições específicas, usualmente em meio

definido, suplementado com factores de crescimento, e/ou soro animal, contendo um sistema de

tampão com o objectivo de manter um pH constante. A maior parte dos meios usados no

crescimento celular depende de uma atmosfera de 5% CO2 para manutenção de pH fisiológico, o

que pode ser atingido por selamento da câmara após purgar a câmara com CO2 ou mantendo a

câmara numa atmosfera controlada. Em alternativa, existe a opção do uso de meios não

dependentes de CO2.

Independentemente da estratégia adoptada, o seu efeito na viabilidade celular deve ser

testado.

2.3.2. FOTOTOXICIDADE

Uma das causas, ou talvez a principal, da fototoxicidade causada pela exposição de células

a luz de fluorescência é a libertação de radicais livres. De acordo com a Figura 2.29, após

absorção de um fotão, o fluoróforo permanece no estado excitado durante alguns nanosegundos.

Um “bom” fluoróforo decairá de novo para o estado fundamental por libertação de um fotão de

emissão. No entanto, existe a possibilidade de conversão da estrutura energética na de um

tripleto, altamente reactiva, podendo levar à formação de radicais livres, nomeadamente de

Oxigénio. Apesar de a célula ter mecanismos enzimáticos intrínsecos de conversão destes

radicais livres em compostos menos nocivos, esta via tem resultados efectivos se não estiver

saturada, o que acontece se se ultrapassar o limite de fluorescência de cada tipo celular. De modo

a minimizar as possíveis consequências deste efeito pode suplementar-se o meio com scavengers

de elevada especificidade para esses radicais tais como o ascorbato (vitamina C) ou TroloX (um

derivado de vitamina E). Caso não se pretenda fazer muitas alterações ao meio ideal de cultura,

uma outra solução será reduzir o tempo de exposição à fonte de luz.

Um aspecto importante em aquisições de imagens de culturas células de longa duração é a

possibilidade de evaporação do meio de cultura, alterando a osmolaridade do mesmo que resta

sobre as células. Deste modo é necessário ter atenção ao volume de meio usado e às condições

49

de selagem da câmara da incubação, de modo a evitar perdas de meio por evaporação.

2.3.3. SETUP DE AQUISIÇÃO: MAXIMIZAÇÃO DO SIGNAL TO NOISE RATIO (SNR)

FONTES DE RUÍDO

Em imagiologia, as duas fontes principais de ruído existentes são: o ruído do detector e de

iluminação. Em geral, uma escolha cuidada do tipo e condições de funcionamento dos detectores

Cada sistema de transdução reage por emissão de ruído de modo distinto. No caso de

microscópios de varrimento (microscópios confocais de varrimento: Laser Scanning Confocal

Microscopes [LSCMs] e microscópios multifotónicos), a presença do fotomultiplicador pode levar à

libertação de electrões sem que um fotão tenha sido recolhido pelo detector. Esta corrente criada

é chamada de ruído negro, e aumenta com o aumento da voltagem nos terminais do

fotomultiplicador, normalmente controlada na opção de ganho do detector. Caso seja usado um

microscópio widefield, a câmara CCD acoplada introduz ruído associado a cada pixel. A

manutenção de uma temperatura baixa em torno da câmara CCD leva a uma melhoria da

quantidade de ruído presente nas imagens adquiridas. Contudo, a conversão do valor analógico

de cada pixel para um valor digital introduz, por sua vez, também ruído, identificado de forma

exacta, e passível de conhecimento para cada tipo de câmara.

Qualquer sistema de aquisição de imagens assume que a iluminação é constante ao longo

de todo o campo do microscópio e entre os diferentes instantes da experiência. No entanto, existe

uma variância espacial no que toca a intensidade de iluminação não desprezável, em parte devida

a variações de potência da fonte de alimentação da lâmpada. Este aspecto assume maior

importância aquando do uso de luz visível ou de fluorescência. Em microscópios de varrimento,

este problema é minimizado, podendo ser negligenciada a participação desta fonte de ruído no

processamento das imagens obtidas.

Tal como em todos os processos estatísticos, o aumento do N, número de eventos

recolhidos, leva a uma melhoria do sinal de saída pretendido. Assim, sendo uma estatística

Poisson a modelação matemática correspondente à captação de fotões por parte das câmaras, a

incerteza associada a este evento será de N1/2, igual ao valor do rácio entre o sinal e o ruído

(Signal to Noise Ratio: SNR) dado que SNR=N/(N1/2). Deste modo, aumentando o número de

fotões recolhidos, aumentar-se-à a relação SNR. Em experiências com fluorescência, esta

melhoria da relação sinal-ruído pode não ser possível pois poderá conduzir a um aumento do dano

celular. Em montagens onde exista uma câmara CCD existe a possibilidade de fazer binning na

captação, onde um grupo de n x n pixeis adquiridos, é transformado num único na representação

da imagem obtida. Apesar da perda de resolução de um factor de n, existe aumento da

intensidade do sinal de uma potência de n, podendo assim ser reduzida a intensidade da luz de

exposição nesse mesmo factor, com consequente aumento do SNR de n vezes.

50

Figura 2.35. Efeito de binning na aquisição de uma imagem.

(Adaptado de “Basic Light Microscopy & Imaging”, OLYMPUS).

OBJECTIVAS DE IMERSÃO

Dado que existem múltiplas conjugações de componentes ópticos que permitem a obtenção

de uma imagem do objecto em estudo, há que considerar a que fornece maior quantidade de

informação sem introdução de ruído.

A luz que sai da amostra para a objectiva é desviada da sua direcção em interfaces existe

uma grande diferença de índices de refracção. Com a maior parte das observações em

microscópio, isto acontece na fronteira entre o vidro em contacto com a amostra e o ar. Para além

da reflexão total na interface aumentar para raios abaixo do ângulo crítico de 41.8º para este tipo

de fronteira, existe perda de uma grande quantidade de raios provenientes de elevados ângulos.

Esta limitação pode ser suplantada pelo preenchimento do espaço entre objectiva e o vidro com

um fluido de imersão com maior índice de refracção. Deste modo, em sistemas de imersão em

óleo, o vidro da amostra, óleo, e objectiva têm aproximadamente o mesmo índice de

refractividade, tal que os raios se propaguem com o menor desvio em relação à direcção inicial,

reduzindo o número de aberrações esféricas.

Figura 2.36. Influência da utilização de objectivas de ar ou de imersão no percurso óptico da luz.

Notar que a resolução de uma imagem obtida com uma determinada objectiva é função do

parâmetro NA. Contudo, em fluorescência, a intensidade de sinal recolhida é proporcional a NA4.

Assim, um pequeno aumento do valor de NA poderá conduzir a uma melhoria significativa no sinal

colectado.

É esta razão que leva muitas vezes em experiências de fluorescência ao uso de objectivas

de elevada abertura numérica e meios de imersão como água (n = 1,33) ou óleo (n = 1,51).

51

3. OBJECTIVOS

Após percepção dos mecanismos moleculares e celulares inerentes à diferenciação neural

in vivo, e identificação das condições essenciais para o estabelecimento de culturas em

monocamada de células cujo comportamento mimetize o dos precursores neurais no

desenvolvimento de um vertebrado, foi estabelecido como objectivo principal a monitorização e

caracterização da diferenciação neural a partir de culturas de células estaminais embrionárias

usando o protocolo de diferenciação em monocamada estabelecido por Ying e colaboradores

(2003) e modificado por Bekman e colaboradores (Bekman et al., 2006).

Para tal, e definindo objectivos intermédios, foi necessário:

- estabelecer em que medida os progenitores neurais Sox1-GFP positivos revelam o

movimento característico de migração denominado de movimento intercinético nuclear das

células embrionárias neuroepiteliais;

- correlacionar o movimento dos progenitores com as diferentes fases do ciclo celular;

- analisar e processar imagens obtidas de culturas obtidas em tempo real, recorrendo

incialmente ao software ImageJ.

Por outro lado, tendo identificado o papel do cálcio na aquisição de identidade neural por

parte das células da ectoderme e em células do cerebelo, a posteriori fixou-se como objectivo o

desenvolvimento de um protocolo que permitisse monitorizar fluxos de cálcio nas células em

cultura em monocamada.

52

4. MATERIAIS E MÉTODOS

4.1. CÉLULAS ESTAMINAIS

A linhagem celular utilizada neste trabalho foi a 46C, cedida pelo Dr. Austin Smith (Institute

for Stem Cell Research, Edinburgh University, Scotland, UK), que contém a sequência codificante

da GFP na ORF (open reading frame) do gene sox1, expresso selectivamente nas células

neuroepiteliais de precursores neurais. Dado que a fidelidade da expressão de Sox1-GFP é

mantida in vivo, esta linha celular é uma ferramenta importante na monitorização e quantificação

da aquisição de identidade neural pelas células embrionárias estaminais.

Para monitorização da quantidade de cálcio intracelular foram usadas células S25, que

contêm apenas uma cassete βgeo inserida no locus de sox2. Não foram usadas células 46 C para

estes ensaios porque os marcadores de cálcio utilizados têm picos de excitação sobrepostos com

o espectro de excitação de GFP.

Ambas as linhas são mantidas em cultura a 37ºC, num ambiente húmido com 5%CO2.

Todos os passos de manuseamento das células decorreram em ambiente estéril numa câmara de

fluxo laminar classe II tipo A/B3.

4.2. EXPANSÃO DE CÉLULAS ESTAMINAIS EMBRIONÁRIAS NÃO DIFERENCIADAS

Células estaminais de ambas as linhagens são propagadas sem células de suporte em

placas de plástico cobertas de gelatina [0,1% (v/v) em PBS] em meio de cultura GMEM (Glasgow

modified Eagle’s medium, 1x GIBCO, ref. 21710-025) suplementado com 1% (v/v) de Glutamina

(200mM, 100x, GIBCO ref. 25030-123), 1% (v/v) de solução de Penicilina-Estreptomicina (100x,

GIBCO), 1% (v/v) de Piruvato de Sódio (100mM, 100x, GIBCO ref. 11360-039), 1% (v/v) de

Aminoácidos não essenciais (100x, GIBCO ref. 11140-035), 10% (v/v) de Soro fetal bovino

inactivado (GIBCO, FBS ES-qualified), e 0,001% (v/v) de 2-mercaptoetanol (0,1M Sigma M-7522),

e posteriormente filtrado com poro de 0,2µm.

Cerca de 3x106 células congeladas em Azoto líquido ou a -80ºC são rapidamente

descongeladas e plaqueadas em GMEM suplementado com LIF (produzido no laboratório para

concentração final de 60pg/µL) em placas de 60mm cobertas com gelatina. Após um dia,

efectuam-se passagens de dois em dois dias, caso a cultura mantenha baixa percentagem de

morte celular, com boa confluência e morfologia correcta. Para cada passagem, lavar as células

aderentes duas vezes com PBS e tripsinizar com 0,1% (v/v) de solução de tripsina em PBS para

cobrir toda a placa (a partir de solução de tripsina 1x: PBS com 0,0025% (v/v) Tripsina GIBCO

25090-028, 0,01% (v/v) de soro de galinha inactivado, e 0,002% (v/v) de 0.5M EDTA) durante 2 a

3 min a 37ºC. Após ressuspensão das células em GMEM suplementado para neutralizar a tripsina,

fazer um spin down ao tubo por centrifugação durante 2 min a 1000rpm. Ressuspender

53

imediatamente as células em GMEM e passá-las para novas placas cobertas de gelatina a 3x104

células/cm2 no caso de expansão.

A última passagem antes de lançamento de High Density a ressuspensão é feita em Esgro

medium (Chemicon) suplementado com LIF (para concentração final de 60pg/µL).

4.3. DIFERENCIAÇÃO EM MONOCAMADA

24 horas antes do início de diferenciação em monocamada passar as células estaminais de

modo similar ao referido na secção 4.2 mas a uma densidade mais elevada: 1x105 células/cm2

(High Density), em Esgro medium suplementado com LIF (para concentração final de 60pg/µL).

Após garantia de boa confluência da cultura por observação ao microscópio de luz visível,

com verificação da existência de clusters bem formados de células estaminais, fazer uma

tripsinização com ressuspensão das células em meio RHB (Stem Cell Sciences). O plaqueamento

seguinte é feito a 1x104 células/cm2 (Ying et al., 2003 refere que o valor que maximiza a

viabilidade celular neste passo de replaqueamento situa-se em 0,5-1,5x104 células/cm2) em placas

cobertas de gelatina, com meio RHB, sem adição de LIF. Sob estas condições, e na ausência de

LIF, as células estaminais embrionárias perdem o seu potencial de pluripotência, direccionando-se

predominantemente para um destino neural.

Após 2 dias de início de diferenciação em monocamada mudar o meio, replaqueando as

células no dia 4 (de modo similar às passagens referidas na secção 4.2).

A percentagem de GFP (ver secção 4.6) na cultura deve ser medida no dia zero e em todos

os replaqueamentos subsequentes. Deve também ser retirada uma amostra da suspensão celular

nestes dias para teste da presença de micoplasma (ver secção 4.7).

4.4. REPLAQUEAMENTOS DIA 4 E 8 DE MONOCAMADA

Para os replaqueamentos de dia 4 e 8 após início de monocamada a tripsinização deve ser

feita como acima mencionado, sendo a ressuspensão em meio RHB. As células são inoculadas

em placas cobertas de PDL-Laminina (ver secção 4.5), a 2-5x104 células/cm2 em meio RHB

suplementado com bFGF (concentração final de 5ng/µL). O meio é mudado a cada dois dias

(entre replaqueamentos).

4.5. SUBSTRATO DE DIFERENCIAÇÃO: PDL‐LAMININA

Para potenciar a adesão dos precursores neurais às placas de cultura, são cobertos os

fundos dos poços de 6-well, e um círculo de vidro de 14 mm ou 20 mm na base de caixas

‘MatTek’, com Poli-D-Lisina Laminina. Para filmagens, o uso de placas com fundo de vidro

justifica-se devido ao facto de o plástico afectar a polaridade da luz incidente na amostra,

introduzindo artefactos na aquisição da imagem.

As soluções usadas são de 10µg/mL de PDL (Sigma P-7280) em PBS, e 2,5 µg/mL de

54

Laminina (Sigma L-2020) em PBS.

Cobrir placas estéreis com a solução de PDL e deixar repousar à temperatura ambiente

durante 1h. Lavar as placas com PBS duas vezes para retirar o excesso de PDL e cobrir com a

solução de Laminina. Deixar as placas a 37ºC e 5% CO2 durante a noite e colocá-las a -20ºC

depois desse tempo, e durante um período máximo de 6 meses.

20min antes de cada utilização as placas devem ser transferidas para a incubadora de

modo a permitir o descongelamento da Laminina e o equilíbrio das soluções. Aspirar a Laminina

em todas as placas imediatamente antes do replaqueamento das células.

4.6. QUANTIFICAÇÃO POR FACS DE AQUISIÇÃO DE DESTINO NEURAL

O uso de células 46C permite a quantificação da percentagem de precursores neurais nas

culturas através de citometria de fluxo devido à inserção da sequência codificante de GFP na

região regulada pelo promotor de sox1, gene expresso exclusivamente em precursores neurais.

Após tripsinização das células (ver secção 4.2), retirar aproximadamente 5x105 células para um

tubo de FACS e ressuspender as células em FACS buffer (4% (v/v) FBS em PBS).

Após adição de 1:200 de Iodeto de Propídio a análise de fluorescência foi feita recorrendo

ao citómetro ‘FACS Calibur’, e com software ‘CellQuest’. A adição de Iodeto de Propídio prende-se

com a necessidade de quantificar o número de células viáveis na cultura. Por existir perda de

integridade da membrana celular quando as células morrem, o Iodeto de Propídio é somente

incorporado nas células mortas, não sendo possível atravessar a membrana das células vivas.

Como resultados, 10000 eventos gated são representados, por exclusão de restos celulares e

células mortas. Eventos gated são todas as células cujas características de tamanho e

complexidade se incluem em intervalos estabelecidos por experiências de calibração do software

para este tipo de aquisições. O controlo negativo, fixado aquando calibração do aparelho é feito

com células S25, não fluorescentes a priori.

Para as culturas de S25, não é possível contabilizar a percentagem de progenitores neurais

em cada passo experimental, na medida em que as células não expressam GFP. No entanto,

estudos anteriores (Bekman et al. 2006) reflectem a eficiência do protocolo para este tipo de

células.

4.7. TESTE DE MICOPLASMA

Antes do início de uma diferenciação em monocamada ou congelamento de células deve

ser testada a ausência de micoplasma nas amostras celulares por um protocolo de amplificação

por PCR de um fragmento conservado de micoplasma. Recolher aproximadamente 1x106 células

e centrifugar a solução celular a 15000 rpm durante 30s à temperatura ambiente. Ressuspender

as células em wash buffer (10mM Tris-HCL, pH 8,3; KCl 50mM; MgCl2 1,5mM) e centrifugar de

novo nas mesmas condições com remoção do sobrenadante no final. Ressuspender as células

55

obtidas numa solução 1:1 de solução A (10mM Tris-HCl, pH 8,3; KCl 100mM; MgCl2 2,5mM) e

solução B [10mM Tris-HCl, pH 8,3; MgCl2 2.5mM; Tween20 1% (v/v); TritonX100 1% (v/v);

proteinase K 120µg/ml (de uma solução stock 20mg/ml em 5mM Tris-HCl pH 7,8 e 50% (v/v)

glicerol)] e incubar a 60ºC durante 1h. A desnaturação da suspensão deve ser feita seguidamente

durante 10min a 90ºC.

O teste de amplificação por PCR de todo o conteúdo desta solução deve ser feito

recorrendo aos primers Pr27: 5’-TGCACCATCTGTCACTCTGTTAACCTC-3’ e Pr22: 5’-

ACTCCTACGGGAGGCAGCAGTA-3’, construídos de modo a amplificar um gene de micoplasma

correspondente a 16rRNA de aproximadamente 717bp. As condições de amplificação são: 95ºC

5min; seguidos de 30 ciclos de 95ºC 30s, com uma etapa de 58ºC 1,5min e 72ºC durante 1,5min;

com passo final de 72ºC 10min. Como controlo positivo é usado um plasmídeo com uma inserção

correspondente ao gene de micoplasma a amplificar. De modo a confirmar a acessibilidade do

conteúdo genético na preparação efectuada, deve ser usado GAPDH como housekeeping gene

(Fwd: ATTCAACGGCACAGTCAAGG; Rev: TGGATGCAGGGATGATGTTC). A verificação dos

produtos de amplificação é feita em gel de 1% (p/v) agarose.

4.8. MICROSCOPIA

Para manutenção das condições ideais de cultura, é colocada em cima da platina do

microscópio uma caixa incubadora com as culturas de células em caixas ‘MatTek’ no seu interior.

A temperatura interna da câmara deve ser mantida a 38ºC (tendo em conta a dissipação de calor

existente) por recurso a um controlador de temperatura, sendo as células mantidas a pH constante

pela injecção na caixa de um fluxo humidificado de 5% CO2 misturado com ar. Devem ser

somente analisadas culturas livres de contaminação por micoplasma, e nos dias 2, 3 e 4 de

replaqueamento.

Para a detecção das células GFP positivas, dois microscópios foram usados.

Numa primeira abordagem, a aquisição foi feita num microscópio de fluorescência invertido

Zeiss Axiovert 200M (Figura 4.1), com recurso a uma lâmpada de Mercúrio e um conjunto de

filtros, de modo a ter um passa-banda de excitação entre 450nm e 490nm, e um filtro de emissão

entre 515nm e 565nm.

Neste microscópio, a conversão dos fotões emitidos para imagem digital é feita através de

uma BW CCD na base do microscópio. Lentes com ampliações de 20x (Zeiss Plan-Neofluar

NA=0,5 seca) e 40x (Zeiss EC Plan-Neofluar NA=0,75 seca) foram testadas. Imagens das células

a diferentes planos focais foram adquiridas em cada instante de tempo, com intervalos que

variaram entre os 5 a 30min entre diferentes aquisições. Parâmetros como tempo de exposição e

binning foram controlados no software Metamorph (Molecular Devices) de modo a optimizar as

condições de observação sem influência na viabilidade celular e condições de morfologia da

cultura. Foi também manualmente controlada a intensidade da lâmpada por regulação da abertura

do diafragma de campo.

56

Figura 4.1. Microscópio de fluorescência invertido Zeiss Axiovert 200M

(imagem gentilmente cedida por Ricardo Henriques).

Numa segunda abordagem foram usadas a objectiva sem imersão Plan-Neofluar 20x (NA =

0,5), e a objectiva de imersão de óleo Plan-Neofluar 40x (NA = 1,3) do microscópio confocal de

varrimento Zeiss LSM 510 (Figura 4.2), recorrendo à linha de 488nm do laser de Árgon para

excitação da GFP. Como filtro de emissão foi escolhido um passa-banda entre 505nm e 550nm.

Percentagens de transmissão de laser entre 8% e 16% foram testadas, mantendo a potência do

laser a 25%, menor valor possível antes do início da região de instabilidade do mesmo. Neste

microscópio é também possível, simultaneamente com a excitação a 488nm, obter uma imagem

semelhante ao visível, calculada pelo software com base nas diferenças de percentagem de luz

antes de penetrar na amostra e depois de ser absorvida por esta. A imagem é assim formada

devido às diferentes impedâncias ópticas entre as células, estruturas sub-celulares e meio

envolvente.

Figura 4.2. Microscópio confocal de varrimento Zeiss LSM 510

(imagem gentilmente cedida por Ricardo Henriques).

Imagens do comportamento das células em cultura foram adquiridas, recorrendo ao

software LSM Image Browser (Carl Zeiss AIM), em intervalos que variaram entre 20 e 30min

durante períodos de tempo até a um máximo de 10h. Foram adoptadas estratégias de aquisição

de até 7 planos de focagem em cada instante de tempo com distâncias que variaram entre 0,3µm

57

e os 2µm. Parâmetros como o número de linhas e colunas de pontos varridos em cada imagem,

velocidade de varrimento, e tempo de exposição de cada ponto foram também sucessivamente

alterados de modo a manter a viabilidade celular. Por outro lado, numa tentativa de redução de

ruído nas imagens e aumento da resolução espacial, o valor de pinhole sofreu alterações nos

diferentes ensaios, de 72µm a 704µm, bem como os valores de ganho do amplificador e detector,

e valor de offset a subtrair à imagem equivalente a potencial ruído de fundo. Aumento do ganho do

detector significa aumento da tensão aos terminais do fotomultiplicador, pelo que conduz,

claramente, a um aumento do ruído negro no sistema.

De modo a reduzir a energia a que as células estavam sujeitas, foi tentada uma abordagem

recorrendo ao pico de 633nm do laser de HeNe do microscópio de varrimento confocal LSM 510.

Dado que este comprimento de onda não excita GFP, as imagens obtidas equivalem a

transmissão. A percentagem de transmissão de laser usada foi muito inferior, 2%,

comparativamente com os ensaios GFP. Dado que não existe fluorescência da cultura quando

excitada com este comprimento de onda, a escolha do filtro de emissão não é importante para

este estudo. Foi usada a objectiva de imersão Plan-Neofluar 40x (NA = 1,3), tendo sido adquiridas

imagens com intervalos de 10min, e 7 planos de focagem por instante de tempo.

Numa terceira abordagem, foram usadas as capacidades de filmagem autónoma e

programável do microscópio de fluorescência invertido Zeiss Axiovert 200M para obtenção de

imagens de campo claro com luz visível. O único parâmetro de interesse nesta optimização é a

intensidade da lâmpada na medida em que a amostra está sempre iluminada durante as

filmagens. Para a obtenção de boas imagens, foram modificados o binning e tempo de exposição

em cada aquisição. Em cada instante de tempo foram gravadas várias imagens, acima e abaixo

do plano de foco com o objectivo de ser possível uma visualização 3D das rosetas. Foi utilizada a

objectiva com ampliação de 40x.

Em qualquer uma das abordagens com o microscópio de fluorescência invertido Zeiss

Axiovert 200M, antes do início da aquisição foi feita iluminação de Köhler, no sentido de se ter o

máximo aproveitamento da abertura numérica da lente usada. Nestas condições, o condensador e

amostra ficam colocados na posição mais centrada em relação à objectiva, estando a luz de

iluminação focada sobre a amostra. Este tipo de iluminação pode ser feita a uma ampliação baixa,

no nosso caso a 20x.

No final de todas as aquisições dos diferentes modos de aquisição usados, foi testada a

viabilidade celular da cultura por remoção do meio de cultura e adição de solução de Azul Tripano

em PBS (1:10).

Todas as imagens de aquisição foram posteriormente tratadas com o software ImageJ.

58

4.9. INCORPORAÇÃO DO INDICADOR DE CÁLCIO

A concentração intracelular de cálcio nas células em diferenciação em monocamada, a

partir do dia 2 de cada replaqueamento foi monitorizada através da incorporação do indicador de

cálcio Fluo-4, AM (Invitrogen). Para tal foi desenvolvido um protocolo de incorporação do Fluo-4

nas culturas em estudo.

À solução stock de Fluo-4 [1mM em DMSO (SIGMA)] adicionar igual proporção de solução

Pluronic F127 [20% (p/v) stock (SIGMA-P2443) em água]. Agitar e adicionar o tampão [20mM

HEPES pH 7,4 (SIGMA) em HBSS (Gibco - Invitrogen 1417-0088)] para concentrações finais de

Fluo-4 de 4 µM e Pluronic a 0,08% (p/v).

Aspirar o meio de cultura das placas para observação, adicionar a solução preparada e

incubar as células durante 30 min a 37ºC.

Efectuar observações de fluorescência sem realizar qualquer lavagem da solução

adicionada.

4.10. DETECÇÃO DE CÁLCIO

Logo após o período de incubação, a caixa ‘MatTek’ foi transferida para o dispositivo

instalado na platina do microscópio confocal de varrimento Zeiss LSM510. As condições de

observação foram optimizadas para a fluorescência presente nas amostras. Foi usada a objectiva

de imersão de óleo Plan-Neofluar 40x (NA = 1,3), e o pico de 488nm do laser de Árgon para

excitação do Fluo-4. Como filtro de emissão foi escolhido um passa-banda entre 505nm e 550nm.

Exceptuando a percentagens de transmissão de laser, aqui de 7%, e o intervalo de tempo entre

aquisições, que foi alterado para 1min, todas as condições de observação tinham sido já testadas

anteriormente (512 pixeis de varrimento em x e y, e tempo de exposição de cada pixel de 1,60 µs).

Figura 4.3. Espectro de excitação (centrado em 488 nm) e emissão (centrado em 510 nm) do indicador de cálcio Fluo-4

(Adaptado de ‘Invitrogen’).

59

5. RESULTADOS

5.1. FLUORESCÊNCIA: WIDEFIELD AXIOVERT 200M

Numa primeira abordagem foram adquiridas imagens num microscópio de fluorescência

invertido Zeiss Axiovert 200M.

Sendo o objectivo primordial a descrição do comportamento dos progenitores neurais em

cultura, nas estruturas típicas de roseta formadas nestas condições de monocamada, todas as

aquisições de microscopia foram centradas em regiões onde a densidade e constituição de

rosetas (número de células no plano principal, e maior ou menor sobreposição de células)

permitisse uma boa obtenção de imagens.

Foi usada a objectiva de 40x nas experiências iniciais. Nestes ensaios, apesar da

fluorescência da GFP ser significativa para a distinção de grupos de células, observou-se que o

sinal emitido não era suficientemente intenso para se poder usar binning de 1 sem fazer bleaching

nas culturas, com generalizada morte celular. Deste modo, por aumento do binning para o valor 2,

foi possível a redução do tempo de exposição da amostra à luz de excitação, com aumento da

intensidade de sinal. Como consequência houve uma perda de resolução, apesar de não

significativa para o ensaio.

Os dados das aquisições no microscópio de fluorescência invertido Zeiss Axiovert 200M

encontram-se sumariadas na Tabela 5.1.

Tabela 5.1. Dados referentes às aquisições obtidas no microscópio de fluorescência invertido Zeiss Axiovert 200M de

imagens de culturas em monocamda de células 46C Sox1-GFP.

Dia Passagem Objectiva Binning

Tempo de

exposição

(ms)

Intervalo

de tempo (min)

Número

de planos

adquiridos

Informações

3/4/07 p21_d4+4+1 40x 2 250 10 11 Morte celular

após 20min

4/4/07 p21_d4+4+2 40x 2 500 20 9 Morte celular

após 20min

5/4/07 p21_d4+4+3 40x 2 250 30 3 4h30 de aquisição

23/4/07 p18_d4+3 20x 3 80 30 1 5h30 de aquisição

24/4/07 p18_d4+4 20x 2 60* 30 1 12h de aquisição

26/4/07 p18_d4+4+2 40x 2 80* 30 1 11h de aquisição

30/4/07 40x 2 80 30 1 4h de aquisição

*intensidade da lâmpada reduzida ao mínimo de modo a permitir a obtenção de uma imagem na ocular.

60

Para optimização das condições de observação com manutenção da viabilidade celular, o

primeiro parâmetro a ser modificado foi o tempo de exposição; inicialmente a 250ms, nas últimas

experiências foi fixado a 80ms.

O tempo de intervalo entre aquisições foi também aumentado, permitindo a recuperação,

mesmo que parcial, das perturbações possivelmente causadas pela exposição à luz de

fluorescência.

Nas duas primeiras tentativas de aquisição de imagens de fluorescência foi observada uma

extensa morte celular poucos minutos após o instante inicial. A primeira série de imagens onde é

clara a distinção das estruturas de rosetas com todas as células Sox1-GFP positivas, indicativo da

identidade de progenitores neurais, teve como duração 4h (Figura 5.1).

Figura 5.1. Imagens de instantes de tempo de aquisição de células 46C Sox1-GFP em monocamada (dia 5/4/07) num

microscópio de fluorescência invertido Zeiss Axiovert 200M.

As setas indicam a localização do mesmo progenitor neural em diferentes instantes de aquisição. Condições de

observação: GFP std; Tempo de exposição = 250ms; Binning = 2; Objectiva 40x (Escala = 30μm).

61

t = 0 t = 4h



A vermelho estão circundadas duas rosetas. Condições de observação: visível; Objectiva = 40x (Escala = 30μm).

Na Figura 5.2 (t = 0), é possível distinguir duas rosetas, circundadas a vermelho. Por

exposição a luz de 488nm, foram identificadas todas as células constituintes da roseta como

progenitores neurais (Sox1-GFP positivas). Após 1h30 de aquisição, equivalente a 4 instantes de

tempo de aquisição durante esse período, é possível notar movimentos celulares na roseta em

posição mais inferior. No entanto, ao analisar a roseta mais à esquerda uma hora depois (t =

2h30) nota-se que alguns progenitores se desprenderam da região apical. Esta pequena perda da

morfologia característica da roseta pode ser sinal de diminuição de viabilidade celular, facto

confirmado em t = 4h, onde toda a estrutura organizada da placa foi perdida (Figura 5.2).

Possíveis factores não ajustados, como temperatura e quantidade de CO2 efectivo dentro da caixa

poderiam ter causado esta morte celular. No entanto, na restante placa não sujeita a exposição

luminosa as células mantinham a disposição típica em rosetas, sem aumento do número de

células mortas em suspensão. A perda de viabilidade celular é pois apenas devida à fototoxicidade

da luz usada.

Como consequência, deixaram de ser adquiridos vários planos de focagem em cada

instante de tempo, tendo-nos restringido à aquisição de apenas um, o mais central possível no

plano das células. Por outro lado, foi reduzida a intensidade da lâmpada de Mercúrio.

Experiências intermédias de aumento do valor de binning e/ou redução da ampliação para a

objectiva de 20x foram testadas (Figura 5.3 e Figura 5.4). A perda de resolução nestes ensaios

não compensa o aumento do tempo em que a cultura foi mantida em boas condições. Nenhuma

conclusão pode ser retirada de casos em que, mesmo após várias horas de aquisição, existe

morte celular. Não há qualquer garantia que os movimentos dos precursores neurais são

característicos deste tipo de células, ou condicionados já pela morte celular que irá ocorrer. Não

nos foi possível identificar um intervalo de tempo a partir do qual os movimentos da cultura

deixaram de ser característicos para possivelmente serem afectados pelo estado da cultura.

62

Figura 5.3. Imagem de rosetas de células 46C Sox1-GFP em monocamada (dia 23/4/07) num microscópio de fluorescência

invertido Zeiss Axiovert 200M.

Condições de observação: GFP std; Tempo de exposição = 80ms; Binning = 3; Objectiva = 20x (Escala = 50μm).

t = 0 t = 12h



Condições de observação: GFP std; Tempo de exposição = 80 ms; Binning = 2; Objectiva 20x (Escala = 20μm).

t = 0 t = 4h00



Condições de observação: GFP std; Tempo de exposição = 80ms; Binning = 2 (Escala = 20μm).

63

As condições mais minimalistas que permitiram um registo de sinal com resolução

suficiente para dedução das características de comportamento celular pretendidas originaram a

obtenção de uma série de imagens durante 4h, cujos instantes de tempo inicial e final estão

representados na Figura 5.5.

Com esta ampliação (40x), valor de binning (igual a 2) e tempo de exposição (80ms com

redução da intensidade da lâmpada de Mercúrio) obtém-se uma resolução suficiente que permite

observar movimentos celulares. Nota-se que todas as células da cultura se movimentam, sendo

impossível seguir núcleos individualmente. Mesmo sob estas condições, a morfologia da cultura

no final da experiência não parece característica deste tipo de células, com alguma

desorganização na região onde estava anteriormente a roseta.

Por conseguinte, uma outra abordagem de microscopia foi tentada.

64

5.2. FLUORESCÊNCIA: CONFOCAL LSM510

Dado que o princípio de funcionamento de um microscópio confocal de varrimento é

bastante diferente de um microscópio de campo claro, os parâmetros a optimizar para redução do

dano na cultura são diferentes dos anteriormente referidos.

As condições usadas em todos os ensaios encontram-se na Tabela 5.2.

Tabela 5.2. Dados referentes às aquisições obtidas no microscópio confocal de varrimento Zeiss LSM510 de imagens

culturas em monocamada de células 46C Sox1-GFP.

O intervalo de tempo entre aquisições foi de 20min em todos os ensaios.

Dia

Número de

pixeis

em x e y

Objectiva

Tempo de

exposição de

cada pixel

(μs)

Intensidade de

laser (%)

Secção

óptica

(μm)

Número de

fatias

adquiridas

Intervalo em z

entre fatias

(μm)

27/04/07 512x512 20x 1,6 8 348 1 *

28/04/07 512x512x4 20x 1,6 15 704 4 3,0

21/05/07 256x256 40x 6,4 16 158 1 *

22/05/07 256x256x3 40x 6,4 16 136 3 0,3

24/05/07 512x512 40x 1,6 16 139 3 1,0

25/05/07 512x512x3 40x 1,6 16 72 3 0,5

26/05/07 512x512x5 40x 1,6 16 158 5 0,5

* não aplicável

Nas duas primeiras tentativas efectuadas no microscópio confocal de varrimento Zeiss LSM

510, dado que tanto a percentagem de transmissão de laser como a ampliação são reduzidas, as

imagens obtidas apresentam demasiado ruído e baixa resolução (Figura 5.6).

Na tentativa de reduzir a quantidade de laser incidente na amostra, o número de pontos

iluminados por imagem e o tempo de exposição de cada pixel foram alterados de forma síncrona,

mas em sentidos opostos.

Na Figura 5.7 (t = 0) é evidente a organização dos progenitores neurais em roseta, sendo

possível diferenciar os contornos de algumas células GFP positivas. Identificada com setas está

uma célula com movimento radial para o exterior da roseta.

65

a.

b.

Figura 5.6. Imagem de cultura de células 46C Sox1-GFP em monocamada (dia 28/4/07) num microscópio confocal da

varrimento Zeiss LSM510.

a. Luz transmitida; b. GFP. Condições de observação: Laser = 488nm; Intensidade = 15%; Tamanho = 512x512; Tempo

por pixel = 1,6μs; Secção óptica = 704μm; Objectiva=20x (Escala = 30μm).

t = 0

t = 4h20

t = 6h40

t = 11h20



Com as setas estão indicadas as posições da mesma célula nos diferentes instantes de tempo. Condições de observação:

Laser = 488nm; Intensidade = 16%; Tamanho = 256x256; Tempo por pixel = 6,4μs; Secção óptica = 158μm; Objectiva =

40x (Escala = 30μm).

66

0 10 20 30 40 50 60 7030

40

50

60

70

80

Tempo (min)Dis

tânc

ia a

o ce

ntro

da

rose

ta (u

m)

0 10 20 30 40 50 60 7055

60

65

70

75

Tempo (min)

Âng

ulo

com

linh

a ho

rizon

tal (

º)

0 10 20 30 40 50 60 700

0.2

0.4

0.6

0.8

Tempo (min)

Vel

ocid

ade

(um

/min

)

Figura 5.8. Dados de velocidades, ângulo com a horizontal e distâncias percorridas pela célula indicada a azul na Figura

5.7. A célula, que se afasta do centro da roseta, mantém um movimento aproximadamente radial (desvio padrão de 2º85’),

com velocidade média de 0,135μm/min.

Adicionalmente ao aumento da resolução (através do aumento do número de pixeis

varridos em ambas as direcções na amostra), foi aumentada em z a fatia óptica adquirida. Por

abertura do pinhole, apesar de o número de aberrações aumentar, a fluorescência colectada

equivale a um maior número de fluoróforos. Reduz-se assim o ruído de Poisson consequência da

aquisição de fluorescência de baixo número de moléculas fluorescentes.

t = 0

t = 3h40



Com setas estão indicadas as posições da mesma célula nos instantes de tempo inicial e final. Condições de observação:

Laser = 488nm; Intensidade = 16%; Tamanho = 512x512; Tempo por pixel = 1,6μs; Secção óptica = 322μm; Objectiva =

40x (Escala = 30μm).

67

0 5 10 15 2030

40

50

60

70

80

Tempo (min)Dis

tânc

ia a

o ce

ntro

da

rose

ta (u

m)

0 5 10 15 2040

45

50

55

60

Tempo (min)

Âng

ulo

com

linh

a ho

rizon

tal (

º)

0 5 10 15 200

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

Tempo (min)

Vel

ocid

ade

(um

/min

)

Figura 5.10. Dados de velocidades, ângulo com a horizontal e distâncias percorridas pela célula indicada a azul na Figura

5.9.

A célula, que se afasta do centro da roseta, mantém um movimento aproximadamente radial (desvio padrão de 5º48’), com

velocidade média de 0,190μm/min.

Na Figura 5.9, indicada por setas, está a posição nos dois instantes de tempo de uma

mesma célula. Esta move-se com movimento radial, provado pela representação gráfica do ângulo

que o vector direcção instantânea do progenitor forma com uma horizontal arbitrária.

Os valores de velocidades médias dos dois ensaios das Figura 5.7e Figura 5.9 são da

mesma ordem de grandeza: 0,135 e 0,190μm/min, respectivamente.

Como nos ensaios no microscópio confocal de varrimento LSM510 não foram observadas

imagens de mitose, e dado que a duração as filmagens implicaria a existência de divisões em

algumas células das rosetas, foi pensada a hipótese de fototoxicidade na cultura pela exposição à

luz de laser com a energia escolhida.

Foi iniciada uma abordagem de aquisição de imagens de transmissão com laser de menor

energia (633nm).

68

t = -1h50

t = -10min

t = 0

Figura 5.11. Imagem de cultura de células 46C Sox1-GFP em monocamada (dia 26/6/07) num microscópio confocal de


As células de interesse encontram-se no centro dos círculos. Condições de observação: Laser = 633nm; Intensidade = 2%;

Tamanho = 512x512; Tempo por pixel = 1,6μs; Objectiva = 40x (Escala = 20μm).

Na Figura 5.11 pode observar-se a divisão de uma célula, mesmo que não pertencente a

uma roseta bem definida. Uma das características das células em divisão neste tipo de culturas é

a perda de aderência à placa, adquirindo como consequência uma morfologia esférica (t = -1h50)

nos momentos antes da citocinese. Em t = -10min a célula encontra-se já muito alongada, sendo

na imagem seguinte (t = 0) as duas células-filhas claramente visíveis.

Apesar de obtenção de imagens de mitose de células da cultura, esta aproximação

experimental foi abandonada. Foi pensado que para obter imagens equivalentes a visível, uma

abordagem mais interessante poderia ser uma aquisição em campo claro com luz visível pois o

dano ao nível celular poderia ser menor do que uma exposição a laser, mesmo que de baixa

energia.

5.3. CAMPO CLARO: AXIOVERT 200M

Tendo como base todos os ensaios de fluorescência descritos nos pontos 5.1 e 5.2, foi

tentada uma abordagem de microscopia em campo claro com luz visível.

Estudos anteriores (Bekman et al., 2006) indicam que apenas progenitores neurais (Sox1-

GFP positivos) se organizam em estruturas de roseta, pelo que a confirmação da identidade

neural por exposição a luz de fluorescência nos instantes iniciais da aquisição das séries de

imagens foi abandonada nestes ensaios.

Na optimização, foram alterados parâmetros como binning e tempo de exposição da

câmara. A intensidade da lâmpada foi mantida a menor possível para visualização das imagens

com contraste suficiente para posterior tratamento.

69

t = 0

t = 1h30

t = 1h35

t = 1h50

t = 1h55

t = 2h10

t = 2h20

t = 5h

Figura 5.12. Imagem de cultura de células 46C Sox1-GFP em monocamada (dia 27/6/07) num microscópio de

fluorescência invertido Axiovert 200M.

Com setas estão indicadas duas células distintas antes do momento de citocinese.

Condições de observação: Luz visível; Objectiva = 40 (Escala = 30μm).



Condições de observação: GFP std; Tempo de exposição = 80 ms; Binning = 2; Objectiva = 40x (Escala = 20μm).

Apesar de as imagens da Figura 5.12 terem pouca qualidade devido às manchas no campo

do microscópio decorrentes da presença de lixo sobre a câmara CCD, estes são os primeiros

resultados da aquisição de imagens de rosetas com luz visível. Durante as cinco horas de

aquisição, podem ser observadas duas mitoses (t = 1h35 e t = 1h50). As células-mãe retraem o

corpo celular em direcção ao lúmen da roseta e adquirem uma forma mais arredondada, perdendo

a adesão quase total à placa imediatamente antes da citocinese. Após a divisão, as células-filhas

aderem à PDL-Laminina. O comportamento após este ponto não tem interesse para o estudo na

medida em que existe destruição da estrutura da roseta. Uma célula desloca-se para o canto

inferior direito (t = 2h20), levando a que todas as células às quais está ligada se movimentem

também nesse sentido. Este comportamento pode ser devido ao pequeno tamanho da roseta ou

pouca densidade de células à sua volta, sem no entanto ter significado biológico relevante.

Partindo de uma primeira abordagem que indicia a possibilidade de obtenção de bons

resultados com esta metodologia, foram desenvolvidos vários ensaios com as mesmas condições

70

experimentais.

Para todas as imagens representadas com uma divisão a ser monitorizada, foi considerado

como tempo zero o instante da citocinese, tendo o tempo valor negativo para instantes anteriores

à divisão, e positivo no sentido contrário.

t = -5h08 t = -3h46 t = -24min t = -22min

t = -4min

t = -2min

t = 0

t = 16min

t = 44min

t = 2h48

t = 3h14

t = 11h30

Figura 5.14. Imagens de cultura de células 46C Sox1-GFP em monocamada (dia 28/7/07) num microscópio de


A rosa encontra-se contornada uma célula em divisão em t = 0; a vermelho, as células-filhas.

Condições de observação: Luz visível; Objectiva = 40x (Escala = 20μm).

A cultura cujas imagens estão representadas na Figura 5.14 foi mantida sob observação na

platina do microscópio durante 16h38m. No final desse tempo, não existiam quaisquer sinais de

menor viabilidade celular. A morfologia celular manteve-se como descrita em estudos anteriores

(Ying et al., 2003) sem destruição da estrutura da roseta. Durante todo o tempo de aquisição, a

roseta manteve-se com movimentos dinâmicos por parte das células ligadas ao seu domínio apical

com existência de 20 divisões nas 49 células iniciais pertencentes à roseta.

71

Dado que o centro da roseta se move no plano durante o tempo de aquisição, foram

registadas as suas coordenadas ao longo do tempo. Os cálculos posteriores de tratamento de

resultados utilizam estes valores como centro de referência para qualquer movimento. Este

procedimento foi adoptado para todos os tratamentos de imagens adquiridas.



As células seguidas ao longo de todo o filme para cálculo de distância ao centro da roseta e observação de padrões

comportamentais encontram-se numeradas. Condições de observação: Luz visível; Objectiva = 40x (Escala = 20μm).

Para a roseta da Figura 5.15, após terem sido manualmente seguidas todas as células

observadas no instante inicial como pertencentes à estrutura, foi calculada a distância, em cada

instante de tempo, da célula ao centro da roseta. Nos casos em que a célula a ser seguida sai do

campo de observação ou que se divide, a marcação foi interrompida e registado o evento.

Num total de 49 células, cinco grupos com comportamentos comuns podem ser formados:

(i) 9 células nunca ligadas ao centro da roseta; (ii) 12 células com constante conexão ao centro

mas sem divisão durante a aquisição, (iii) 13 células que se dividem no centro da roseta com

retracção do corpo celular imediatamente antes da mitose, (iv) 3 células que se dividem no centro

da roseta sem o padrão de retracção de corpo celular, e (v) 4 células cuja divisão se dá fora do

lúmen da roseta.

72

5.3.1. ANÁLISE DE DISTÂNCIAS

0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 10000

20

40

60

80

100

120

140

Tempo (min)

Dis

tânc

ia a

o ce

ntro

da

rose

ta (u

m)

Figura 5.16. Distância ao centro da roseta, em função do tempo, de células 46C Sox1-GFP em monocamada (dia 28/7/07)

nunca ligadas ao centro da roseta durante a aquisição.

Valores colocados a zero quando a célula sai do campo do microscópio. Célula com menor valor médio de distância

representado a azul tracejado (média de 56,62±8,69 μm). Média das médias de distâncias igual a 75.00±18,25μm.

0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 10000

10

20

30

40

50

60

70

Tempo (min)

Dis

tânc

ia a

o ce

ntro

da

rose

ta (u

m)

0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 100010

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Tempo (min)

Dis

tânc

ia a

o ce

ntro

da

rose

ta (u

m)

a. b.


sempre ligadas ao centro da roseta e que nunca dividem.

Valor médio das médias das distâncias calculados conjuntamente nos dois gráficos de 30,47±9,52 μm.

Por análise dos valores de média de médias entre as células que nunca estão ligadas ao

centro da roseta (Figura 5.16) e as que permanecem sempre ligadas sem divisão (Figura 5.17)

nota-se que a distância média das nunca ligadas é em 53,8% maior do que a referente às que

mantêm ligação com o centro durante toda a aquisição. Dado que todas as células, à excepção da

representada a vermelho em Figura 5.17a. se encontram abaixo dos 55µm, este pode ser um valor

limite a partir do qual esta estrutura celular não consegue manter filamentos de conexão ao centro.

Este valor pode ser considerado como raio máximo suportável da roseta em questão nas

condições de cultura usadas.

De modo a obter um valor de distância mínima ao centro das células que nunca se

dividiram mas que oscilaram dentro da roseta, será necessário excluir as células correspondentes

73

aos traçados azul ciano do gráfico b., e verde do gráfico a. da Figura 5.17. O comportamento

destas células parece ser de afastamento ao centro, provavelmente devido ao facto de estas

terem sido originadas de uma divisão alguns minutos antes do início da aquisição. Pode assim

calcular-se o menor valor de distância ao centro das restantes células, igual a 8,35μm (referente

ao traçado a ciano do gráfico a. da Figura 5.17), com média de valores mínimos igual a

14,4±4,61μm.

Relativamente ao número inicial de 49 células seguidas, é possível registar a divisão de 20

células durante as 16h42 de aquisição. Destas, 80% aproximam-se do centro da roseta antes da

divisão e aí se dividem. Os restantes 20% correspondem a células que se dividem, em média, a

uma distância de 50µm do centro da roseta.

Noutras rosetas foram observadas células em aproximação à região apical e que, devido à

existência de muitas células com o corpo celular no lúmen, não se aproximaram para além de um

determinado raio e dividiram nesse local. Nos 20% de células que dividiram fora da roseta, em

nenhuma foi registado impedimento espacial para aproximação ao lúmen.

Tanto visual como graficamente, é possível distinguir dois modos de divisão das células que

se aproximam do lúmen da roseta para divisão. 82,4% das células em questão, após uma primeira

aproximação, na maior parte das vezes rápida como é visível pelo declive dos traçados dos

gráficos da Figura 5.18, têm um movimento de retracção do corpo celular durante,

aproximadamente, uma hora antes da divisão. A restante percentagem, apesar de a aproximação

ser semelhante, não tem esse movimento explícito.

74

0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 10000

10

20

30

40

50

60

70

Tempo (min)

Dis

tânc

ia a

o ce

ntro

da

rose

ta (u

m)

a.

0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 10000

10

20

30

40

50

60

70

80

Tempo (min)

Dis

tânc

ia a

o ce

ntro

da

rose

ta (u

m)

b.


que se dividem no centro da roseta com retracção do corpo celular aproximadamente uma hora antes da divisão

(movimento indicado por setas no gráfico).

Para as células estudadas cuja divisão no centro da roseta é acompanhada de retracção do

corpo celular, a distância média de divisão ao centro é de 8,64±1,10μm (Tabela 5.3).

.

75

Tabela 5.3. Dados relativos a células 46C Sox1-GFP em monocamada (dia 28/7/07) que se dividem no centro da roseta

com movimento de retracção.

Localização

(quadrante)

Número

da célula

(Fig.V3)

Gráfico

(Fig.V6) Cor

Menor distância antes

de retracção (μm)

Distância de

divisão (μm)

1º 2 a. Azul 11,0 9,61

4º 2 a. Verde 6,3 9,18

4º 4 a. Vermelho 10,7 8,65

4º 6 a. Ciano 14,2 9,50

4º 10 a. Magenta 13,1 9,29

4º 13 a. Amarelo 8,05 8,97

2º 5 a. Preto 17,8 7,32

2º 7 b. Azul 14,0 9,87

2º 11 b. Verde 7,58 735

2º 12 b. Vermelho 9,93 7,51

2º 13 b. Ciano 10,9 7,53

3º 1 b. Magenta 14,6 7,38

3º 6 b. Amarelo 11,0 10,19

* não representado graficamente

Com o objectivo de verificar se existe algum limite de aproximação a partir do qual as

células ficam determinadas a divisão, foi calculado o valor mínimo de distância antes do pico de

retracção, igual a 11,5±3,20μm. Confrontando este intervalo com o intervalo [14,4-

4,61;14,4+4,61]μm equivalente aos valores mínimos de distância das células pertencentes à

roseta mas que nunca se dividem, tem-se que, abaixo de 9,79µm de distância, as células

obrigatoriamente dividir-se-ão dentro de aproximadamente 1h. Caso a sua distância mínima

pertença ao intervalo [9,79;14,7]μm, apenas a distância não é parâmetro suficiente para retirar

qualquer conclusão quanto ao destino da célula. Aqui será necessário ter em consideração a

velocidade da célula antes desse ponto. Todas as células que se dividem com retracção do corpo

celular apresentam um decréscimo brusco de distância ao centro da roseta nos instantes

precedentes a atingirem o valor mínimo ao centro antes da retracção. A aceleração média dos

progenitores em aproximação ao centro da roseta, calculada até o instante em que a célula atingiu

a menor distância ao centro antes da retracção, e desde o primeiro máximo local entre [instante

com distância mínima ± (instante da retracção - instante com distância mínima)] é de

0,27±0,14μm/min2 (valor encontrado sem utilizar os dados referentes ao traçado a ciano na Figura

5.18a por se ter acesso apenas ao comportamento do progenitor meia hora antes da divisão). Nos

progenitores que nunca dividem, no intervalo de tempo anterior ao instante em que as células

entram na região delimitada pelo valor crítico de raio não são registadas acelerações com estes

valores.

Para células com distâncias ao centro da roseta entre 9,79µm e 14,7µm, por análise da sua

aceleração pode assim deduzir-se se se irão dividir ou não nos instantes seguintes.

Qualquer célula que se situe num raio superior a 14,48µm não está determinada a divisão

(excepção para os três casos reportados de células que dividem fora do centro da roseta).

76

5.3.2. VELOCIDADES E ÂNGULOS

Da análise de cinco divisões do conjunto das 13 que dividem com retracção do corpo

celular antes do momento de divisão, podem retirar-se parâmetros de dinâmica importantes como

a velocidade de aproximação ao centro da roseta da célula-mãe, velocidade de afastamento do

centro da roseta por parte das células filhas, e ângulos formados entre a direcção de movimento

das células e uma linha horizontal definida arbitrariamente. A Figura 5.19 é o exemplo de um

tratamento de dados para uma célula-mãe (a.) e uma das filhas (b.).

a. b.

Figura 5.19. Análise de distâncias relativamente ao centro da roseta, ângulos com a horizontal, e velocidade de células

46C Sox1-GFP em monocamada (dia 28/7/07).

a. Célula-mãe até ao instante de divisão; b. Uma das células-filhas da roseta.

Contrariamente à célula-mãe que se aproxima da roseta, a célula-filha, apesar de oscilar

muito em redor de determinadas posições, afasta-se da região apical da roseta, identificado pelo

declive positivo do gráfico.

O ângulo relativamente à horizontal de ambas as células é semelhante, em média perto de

55º, o que indica que a entrada da célula-mãe para o lúmen da roseta se dá segundo um raio da

mesma, e a saída dessa região por parte da célula-filha é feita segundo a mesma direcção.

77

Tabela 5.4. Valores de velocidades média e máxima, e valor médio de ângulo com a horizontal das células-mãe em divisão

e filhas 46C Sox1-GFP em monocamada (dia 28/7/07).

Velocidade média

(μm/min)

Velocidade máxima

(μm/min)

Valor médio de

ângulo com horizontal (º)

1 Célula-mãe 0,36±0,31 1,59±0,32 60,3±6,59

Célula-filha#1 0,67±0,53 7,34±0,64 37,8±6,62

Célula-filha#2 0,41±0,30 1,90±0,31 53,8±11,1

2 Célula-mãe 0,49±0,46 1,81±0,53 44,2±4,91

Célula-filha#1 0,44±0,41 5,14±0,46 49,5±8,75

Célula-filha#2 0,36±0,34 2,21±0,35 39,0±7,31

3 Célula-mãe 0,40±0,36 1,64±0,39 53,0±6,4

Célula-filha#1 0,42±0,41 10,2±0,64 49,1±9,93

Célula-filha#2 0,35±0,34 2,73±0,36 44,9±11,7

4 Célula-mãe 0,29±0,24 1,24±0,26 4,25±3,35

Célula-filha#1 0,25±0,24 1,83±0,25 22,0±13,2

Célula-filha#2 0,46±0,39 2,78±0,40 5,70±5,81

5 Célula-mãe 0,55±0,41 1,83±0,39 52,1±12,6

Célula-filha#1 0,47±0,35 3,81±0,61 34,7±5,25

Célula-filha#2 0,59±0,46 4,28±0,45 27,8±11,8

Por avaliação da Tabela 5.4, o valor médio das médias de velocidades dos progenitores em

aproximação ao centro da roseta é de 0,42±0,35µm/min, tendo estas células como média das

velocidades máximas 1,62±0,38µm/min. O valor médio de velocidades das células-filhas é de

0,44±0,12µm/min. Contudo, é nas velocidades máximas que as diferenças são mais notórias: a

média de velocidades máximas dos progenitores neurais durante o movimento para a região

apical da roseta é significativamente inferior à média do valor máximo de velocidades das células-

filhas, 4,21±2,69µm/min.

Os valores médios de ângulos que as células, tanto células-mãe como filhas, fazem com a

horizontal apresentam desvio padrão compreendido no intervalo [4,03;12,5]º, confirmando-se o

movimento preferencialmente radial deste tipo de células em roseta.

5.3.3. TIPO DE DIVISÃO

Um ponto a considerar na avaliação das divisões dos progenitores neurais na região apical

da roseta é o modo como a separação da célula-mãe é feita: divisão vertical ou horizontal.

Analisando o tipo de divisão que as células dos grupos (iii) e (iv) possuem, 12 das 16

(75,0%) dividem-se de modo vertical, enquanto as restantes 4 (25,0%) têm claramente um padrão

de divisão horizontal.

Por outro lado, é do maior interesse correlacionar o tipo de divisão com o destino das

células-filhas. Quando se observa que as células formadas perdem ligação à região apical da

roseta, assume-se que entraram em diferenciação terminal, sendo denominadas por N.

Adicionalmente algumas destas células rodam 90º relativamente à orientação anteriormente tida.

Células onde não é observado nenhum destes comportamentos são consideradas, neste estudo,

78

como progenitores (P).

Imagens exemplificativas de alguns casos referidos são representadas na Figura 5.20.

t = -4min

t = -4min

t = 0

t = 0

t = 8h40

t = 12h32

a. b.



As células de interesse no centro dos círculos encontram-se assinaladas com pontos: a. Divisão vertical simétrica; b.

Divisão vertical assimétrica. Condições de observação: Luz visível; Objectiva = 40x (Escala = 20µm).

Em ambos os instantes representados antes da citocinese (a t = 0) na Figura 5.20 é visível

a disposição dos cromossomas em posições diametralmente opostas, figura característica de

anafase (Figura 5.21).

79

Figura 5.21. Imagem de anafase de uma célula 46C Sox1-GFP em monocamada (dia 27/7/07) num microscópio de


A célula de interesse encontra-se assinalada com um ponto. Condições de observação: Luz visível; Objectiva = 40x

(Escala = 10µm).

Na Figura 5.20a., t = 8h40, as células-filhas encontram-se lado a lado e ligadas ao centro

da roseta, indicando que são progenitores neurais. Deste modo, considera-se a divisão como

vertical simétrica. Pelo contrário, na Figura 5.20b. t = 12h32, a célula-filha com ponto vermelho

não possui já nenhuma conexão com a região apical da roseta, tendo extensões da membrana

localizadas perpendicularmente ao raio da roseta. Este facto denota que a célula em questão

entrou em diferenciação terminal, estando em G0, sendo por isso a divisão denotada como vertical

assimétrica. A outra célula-filha, marcada com ponto azul, encontra-se ainda ligada ao centro da

roseta, prosseguindo em fase G1.

80

t = -4min

t = -2min

t = 0

t = 0

t = 10h38

t = 6h02

a. b.



As células de interesse no centro dos círculos encontram-se assinaladas com pontos: a. Divisão horizontal simétrica; b.

Divisão horizontal assimétrica. Condições de observação: Luz visível; Objectiva = 40x (Escala = 20µm).

No que toca a divisões horizontais, as figuras de mitose visíveis nas células em divisão

simétrica não são tão claras. O plano de clivagem da célula-mãe é perpendicular a um raio da

roseta, sobre o qual as células-filhas ficam após divisão. A adesão à placa dá-se imediatamente

após a citocinese na região luminal. Por observação da Figura 5.22a., até ao momento de término

das aquisições, a divisão indica que foram originados dois progenitores, na medida em que ambas

as células-filhas continuam ligadas ao centro da roseta através dos seus prolongamentos de

membrana. No entanto, qualquer conclusão a este respeito é influenciada pela janela temporal

limitada do tempo total de aquisição da série de imagens. Este aspecto está relacionado com a

classificação da divisão da Figura 5.22b. como assimétrica, originando um progenitor e uma célula

em diferenciação terminal. A célula-filha que recebe a porção de membrana basal, em t = 6h02

encontra-se muito afastada do lúmen da roseta, fora da estrutura organizada da mesma. A célula

que, aquando da divisão ficou na região mais apical, permanece no mesmo local, indicando que a

herança da identidade de progenitor poderá estar em relação com a parte de membrana da célula-

81

mãe recebida.

Na roseta representada na Figura 5.20 e Figura 5.22, durante as 15h de aquisição

ocorreram 13 divisões, tendo a roseta inicialmente 33 células ligadas ao lúmen.

Para cálculo do destino das células originadas foram utilizados apenas dados referentes a

aproximadamente 2/3 do tempo total, dado que, para divisões a partir deste instante, a dedução

do destino das células originadas é ainda mais erróneo. A cultura não está monitorizada tempo

suficiente depois da divisão das células no último terço de aquisições para que as conclusões

retiradas sejam pouco afectadas por erros (Tabela 5.5).

Tabela 5.5. Dados do tipo de divisão referentes à cultura de células 46C Sox1-GFP em monocamada.

Depois de cada valor de percentagem e entre parêntesis encontram-se os valores absolutos do número de divisões. P:

progenitor; N: célula em diferenciação terminal.

Simétrica P-P Assimétrica P-N Simétrica N-N Totais

Vertical:

- 27/07/07

- 28/07/07

- 23/08/07

66,7% (6)

60,0% (6)

*

11,1% (1)

10,0% (1)

*

0,00% (0)

0,00% (0)

*

77,8% (7)

70,0% (7)

78,6% (11)

Horizontal:

- 27/07/07

- 28/07/07

- 23/08/07

11,1% (1)

30,0% (3)

*

11,1% (1)

0,00% (0)

*

0,00% (0)

0,00% (0)

*

22,2% (2)

30,0% (3)

21,4% (3)

Totais:

- 27/07/07

- 28/07/07

- 23/08/07

79,8% (7)

90,0% (9)

*

22,2% (2)

10,0% (1)

*

0,00% (0)

0,00% (0)

*

* não aplicável devido a impossibilidade de identificação

Ainda nesta roseta, os acontecimentos: divisão horizontal com geração de dois

progenitores, divisão horizontal com geração de um progenitor e uma célula em diferenciação

terminal, e divisão vertical com geração de um progenitor e uma célula em diferenciação terminal

são equiprováveis, ocorrendo 1 evento deste tipo por cada 6 eventos de divisões verticais com

geração de dois progenitores.

Comparando os valores de percentagens totais obtidos por cálculo do número de divisões

verticais e horizontais pode referir-se que as divisões verticais são, nas três rosetas estudadas, as

mais frequentes, com média de 76,1±5,4% sobre o número de divisões totais. Nos dois casos

estudados de divisão do tipo de célula-filha originada, 1 em cada 6 divisões verticais origina um

par célula em diferenciação terminal-progenitor, sendo as restantes divisões com formação de um

par progenitor-progenitor. Em média 84,9±7,2% do número de divisões numa roseta originam um

par progenitor-progenitor onde, em média, 25,0% são devido a divisões horizontais.

Em nenhuma das rosetas analisadas há observações de divisões simétricas terminais.

Notar que, nos filmes analisados, com uma média de 16h05 de duração, a média do

número de divisões ocorridas é de 14,3±1,5.

82

Tendo identificado algumas características do comportamento dos progenitores neurais nas

culturas em monocamada desenvolvidas, foi iniciado o estabelecimento de condições para

incorporação da solução do fluoróforo Fluo-4 AM nas células e detecção dos níveis de

fluorescência das culturas.


Após estabelecimento de um protocolo de incorporação de Fluo-4 nas células e incubação

das culturas com a solução do fluoróforo, registaram-se imagens de microscopia confocal com

intervalos de tempo de 1min entre aquisições.

t = 0

t = 2min

t = 4min

t = 6min

Figura 5.23. Imagens de cultura de células S25 em monocamada (dia 5/8/07) num microscópio confocal de varrimento

Zeiss LSM 510 após incubação com Fluo-4.

Condições de observação: Laser = 488nm; Intensidade = 7%; Tamanho = 512x512; Tempo por pixel = 1,6μs; Secção

óptica = 830μm; Objectiva = 40x (Escala = 30μm).

No sentido de uma mais clara representação dos níveis de cálcio intracelulares procedeu-

se à conversão da intensidade registada nos pixeis das imagens de aquisição de microscópio

confocal das culturas incubadas com Fluo-4 para uma escala de cor, cuja gradação está indicada

na Figura 5.23. Nestas imagens são evidentes oscilações de cor, ocorrendo máximos de

intensidade no espaço intracelular. A eficiência do protocolo na incorporação do fluoróforo nas

células pretendidas está assim confirmada, sem existência de fluorescência de fundo,

correspondente ao nível inferior da escala de cor usada.

83

Deste modo, é possível identificar picos instantâneos dos níveis de cálcio, equivalentes a

um aumento da intensidade de detecção de sinal no interior das células. Os níveis registados têm

oscilações entre máximos e mínimos em intervalos de 1min, o menor intervalo detectado pela

aquisição desenvolvida. Neste sentido, pode deduzir-se a presença de diferentes concentrações

de cálcio no espaço intracelular com oscilações nesta escala de tempo.

Durante todo o tempo de aquisição desta série de imagens, 1h30, não são detectáveis

movimentos significativos das células sob observação. Apesar de ocorrerem picos de cálcio

durante esse tempo, não sincronizados nas células em monocamada, a mobilidade celular parece

estar afectada, com redução da velocidade dos progenitores comparativamente com os ensaios

de luz visível.

84

6. DISCUSSÃO

A utilização da linhagem 46C de células estaminais para diferenciação em precursores

neurais é da maior utilidade numa abordagem de microscopia em tempo real na medida em que

se torna assim possível confirmar a presença de precursores no campo do microscópio no

momento da aquisição das imagens, pela garantia da expressão de sox1 nas células

fluorescentes. No entanto, os ensaios de fluorescência revelaram alguns problemas de

optimização de parâmetros para manutenção da viabilidade celular das culturas de monocamada,

bem como para obtenção de imagens com qualidade para análise.

Importante notar que experiências de microscopia em tempo real com células estaminais

em diferenciação em monocamada, não foram reportadas até ao momento.

6.1. OPTIMIZAÇÃO DAS CONDIÇÕES DE OBSERVAÇÃO DE PROGENITORES NEURAIS

No que respeita às imagens obtidas no microscópio de fluorescência invertido Zeiss

Axiovert 200M, as células em monocamada apresentam um nível de fluorescência significativo

relativamente ao fundo não fluorescente, mesmo em casos onde a presença de ruído é elevada

(Figura 5.1). O valor de SNR neste tipo de microscópio para as condições experimentais é assim

suficiente para as observações em questão. No entanto, mesmo após minimização da quantidade

de luz incidente na amostra durante todo o tempo de aquisição, as imagens obtidas (Figura 5.5)

não correspondem às idealmente pretendidas. Os dados disponíveis indicam que a luz e modo de

iluminação do microscópio Axiovert 200M são lesivos para os progenitores neurais, em tão inicial

estado de diferenciação, dado que apenas na região da amostra focada pela luz de fluorescência

as células apresentam sinais visíveis de morte celular (Figura 5.1).

Um aspecto a ter em atenção diz respeito ao shutter de iluminação e ao tempo que ele

demora a abrir e a fechar completamente. O shutter do microscópio usado não é ultra rápido,

demorando algum tempo a abrir e a fechar. Durante esse tempo, a amostra está a ser iluminada

sem que haja aquisição de fotões para formação de uma imagem. Dispositivos altamente

sofisticados como o usado pelo sistema DeltaVisionRT (Applied Precision LLC) podem ser

pensados como alternativa pois minimizam o tempo em que a amostra está iluminada, usando

toda a luz emitida para construção da imagem de fluorescência. Idealmente, à abertura do shutter

corresponderia uma imediata aquisição de fotões e conversão pela CCD.

Por outro lado, a baixa eficiência quântica da CCD pode ser um dos motivos que obrigue a

que a iluminação da amostra seja feita durante mais tempo para se obter uma imagem no ecrã.

Para intensidades de sinal baixas (i.e. pequeno número de fotões colectados), os

fotomultiplicadores apresentam-se como soluções mais eficazes na transdução do sinal. Outra

hipótese seria o uso de detectores baseado em EMCCDs, por apresentarem uma sensibilidade

maior e menor ruído de leitura.

Uma nova abordagem foi testada num microscópio confocal, por possuir um princípio de

85

iluminação completamente diferente do anteriormente utilizado, e por ter fotomultiplicadores como

detectores, que permitem um aumento da sensibilidade da detecção de fluorescência.

Nas imagens obtidas foi complicada a identificação do movimento de células individuais. O

grande intervalo de tempo entre aquisições (20min) pode ter sido factor fundamental nesta

dificuldade. Na medida em que nas culturas sob estas condições nunca foi observada uma figura

de mitose, foi colocada de novo a hipótese de toxicidade pela luz laser desta energia.

Quando as culturas foram expostas a um laser de maior comprimento de onda, 633nm, e

por isso, de menor energia, foram pela primeira vez observados quatro eventos de mitose, num

intervalo total de 2h40 de tempo de aquisição (Figura 5.11). Como consequência, deve ser

ponderada no futuro uma abordagem de microscopia confocal com lasers de baixa energia para

este tipo de culturas em monocamada.

Sabe-se que as energias muito elevadas dos fotões incidentes provocam disrupção de

ligações químicas e produção de radicais livres por criação de tripletos energéticos. No entanto, a

redução da energia do laser para valores abaixo de 600nm coloca a iluminação no infra-vermelho

que, apesar de não provocar alterações estruturais nas moléculas constituintes da amostra,

conduz a alteração do seu estado vibracional, com aquecimento implicado. Consequentemente,

com o aumento do comprimento de onda do laser de iluminação têm de ser considerados novos

mecanismos de dano celular, indicando os resultados obtidos para a possível existência de um

intervalo óptimo que inclui os 633nm em que a formação de radicais livres e aquecimento não

ocorrem de modo significativo para a viabilidade da amostra. Especula-se quanto ao potencial uso

de fluoróforos nesta gama de comprimentos de onda para monitorização da dinâmica de

determinadas proteínas em culturas de precursores neurais. Actualmente são já usadas proteínas

fluorescentes (FPs) com comprimento de onda de excitação de 590nm, passíveis de uso em

células vivas.

Com os dados de que dispomos, a observação das culturas em monocamada num

microscópio de campo claro com luz visível é a mais prometedora para os objectivos

estabelecidos.

A luz do espectro do visível mantém a viabilidade de progenitores neurais em

monocamada, nas condições de diferenciação, temperatura e CO2 usadas.

6.2. MOVIMENTO INTERCINÉTICO NUCLEAR

A análise efectuada do comportamento celular de culturas de monocamada de progenitores

neurais revela a presença de uma população dinâmica de células, exibindo mudanças sequenciais

na sua forma e organização estrutural no decorrer do ciclo celular, e em relação com o processo

de diferenciação.

Como representado na Figura 5.14, os progenitores neurais com movimento intercinético

nuclear apresentam uma morfologia bipolar, com um corpo celular alongado, e membrana celular

nas direcções apical e basal da roseta. A posição do núcleo de cada célula varia com o estado do

ciclo celular em que se encontra, ocorrendo as mitoses na região apical. Consequentemente,

86

antes da divisão, estas células neuroepiteliais têm um movimento radial de aproximação ao lúmen

da roseta. Não se observaram nenhuns casos de aproximações tangenciais de progenitores à

região apical da roseta. Em 82,4% das células que se aproximam à região apical existe um

pequeno afastamento, claramente observável mas de difícil quantificação, do corpo celular 1h

antes da citocinese no sentido oposto ao centro da roseta (Figura 5.18). Após este momento, o

padrão de divisão de todas os progenitores é semelhante. A célula desprende quase totalmente da

placa adquirindo uma forma esférica. Desde este instante até à citocinese e distinção clara de

duas células decorrem aproximadamente 15min. As células filhas aderem imediatamente à placa,

ainda na região apical, e saem desta região aproximadamente com o mesmo ângulo de entrada

da célula mãe na roseta (Figura 5.19). Nos minutos iniciais, as células-filhas apresentam-se

fisicamente muito próximas uma da outra com movimentos muitas vezes síncronos.

Não foi possível estabelecer uma distância mínima ao centro da roseta que comprometesse

as células que passassem esse limitar de se dividir. Aparentemente, abaixo de 9,79μm de

distância ao centro da estrutura, as células ficam determinadas à divisão. No entanto, para células

localizadas num arco de círculo com raio interno maior ou igual a este valor e raio externo de

14,7μm, a avaliação da aceleração nos instantes anteriores a esse ponto indicará o destino que

elas adoptarão. As células que irão dividir, em média cerca de 2h05±32min antes do instante em

que têm distância mínima ao centro da roseta antes da retracção, estão situadas a 34μm do

centro. Estes dados indicam que a decisão de divisão por parte de um progenitor é tomada

aproximadamente 2h antes da maior aproximação à região apical da roseta. A este momento

corresponderá um instante durante a fase G2, que determina se a célula pode ou não entrar em

fase M. Estudos anteriores (Miyama et al., 2001) referem 2 a 5 horas como tempo de duração

conjunto das fases G2 e M.

6.2.1. MITOSE

Devido à impossibilidade de determinação exacta do momento de entrada dos progenitores

em fase M, torna-se artificial qualquer comparação com tempos de mitose deste tipo de células em

cultura. No entanto, estudos em cortes de tubo neural de embriões de galinha no dia 1,5 (Wilcock

et al., 2007) indicam como tempo de mitose 28±9min. Os valores de referência in vivo situam-se

nos 32min (Wilcock et al., 2007). Estes valores são maiores que o calculado neste estudo mas da

mesma ordem de grandeza, apontando para um comportamento normal das células das culturas

observadas no que diz respeito à fase M.

A análise das células com movimento intercinético nuclear e com divisão na região apical

da roseta indica uma frequência média de divisão de 0,92±0,20 divisões/h nas culturas. Este valor

corresponde a rosetas com, em média, 41±11 células. Para que a esta frequência média uma

população de 41 células sincronizadas duplicasse seriam necessárias 44h33. Durante este tempo

todas as células dividiriam pelo menos uma vez. Como as células em observação não estão

sincronizadas, este tempo pode ser apenas considerado um estimador máximo de tempo de ciclo

celular. O tempo médio de ciclo celular deste tipo de progenitores é assim igual ou inferior a

87

44h33. Este valor é muito semelhante ao obtido por Bekman e colaboradores (Bekman et al.,

2006) para este tipo de culturas: aproximadamente 2 dias. Um cálculo mais correcto da duração

do ciclo celular dos progenitores em estudo poderia ser deduzido caso as filmagens tivessem sido

prolongadas por mais tempo.

6.2.2. VELOCIDADES DE MIGRAÇÃO

Através da análise do padrão de velocidades das células dispostas em roseta, pode

constatar-se que o movimento intercinético nuclear não é linear nas condições de cultura

utilizadas. Tanto os progenitores em migração para o centro da roseta como as células-filhas após

divisão apresentam intervalos de velocidade constante, intercalados com movimentos “saltatórios”,

onde a velocidade aumenta de valor momentaneamente. Apesar do ruído presente nos gráficos de

velocidades da Figura 5.19 devido a pequenas oscilações de posição das células entre os

diferentes instantes de tempo, é clara a presença de picos de velocidade em ambos os casos.

Aspecto importante é a diferença de valores de velocidade (centrífuga) da célula-mãe no

sentido apical e das células-filhas no sentido basal (centrípeta). Representado como exemplo na

Figura 5.19, em todos os casos de divisões em que foram seguidas células, e apesar de os

valores de velocidades médias serem muito semelhantes, numa análise das velocidades máximas

atingidas, é notória a menor velocidade das células-mãe, progenitores, comparativamente com as

células originadas após divisão. Os valores máximos de velocidades de células-filhas atingem os

10,2µm/min, sendo a média de velocidades máximas dos progenitores neurais em aproximação ao

centro da roseta (1,62±0,38µm/min) 61,5% inferior à média das velocidades máximas das células-

filhas (4,21±0,12µm/min).

Conclusões sobre a duração das fases G2, S e G1 do ciclo celular só poderiam ser

tomadas com recurso a marcadores nucleares como 5-bromo-2’-desoxiuridina (BrdU).

Comparando os valores de velocidades das células, tanto células-mãe em aproximação à

região apical, como células-filhas, estes são, em média, 62,5 % superiores aos valores

encontrados nos ensaios de microscopia confocal: 0,135 e 0,190µm/min. Estes valores de

velocidades confirmam a hipótese de diminuição de mobilidade das células quando iluminadas

com laser ou luz de Mercúrio.

6.2.3. TIPO DE DIVISÃO DOS PROGENITORES NEURAIS

Do número total de divisões (n = 33) registadas em cada roseta analisada, em média 76,1%

das divisões são verticais, i.e. com o plano de clivagem da membrana celular sobre um raio da

roseta. Em 19 divisões foi possível distinguir o tipo células originadas, a partir das quais, e acordo

com a classificação estabelecida na Secção 5.3.3, em 15,8% são criados um par de células com

características diferentes (um progenitor e uma célula em diferenciação terminal). As restantes

divisões (84,2%) são responsáveis pelo aparecimento de dois progenitores.

Deste modo, a população de células que se afastam do lúmen da roseta é constituída por

88

progenitores em fase G1 e células pós-mitóticas em fase G0. Este valor de 84,2% encontrado está

um pouco acima do reportado por Wilcock e colaboradores (Wilcock et al., 2007) em cortes de

tubo neural de embrião de galinha, 66,7%. Contudo, confirma-se a predominância da produção de

progenitores em detrimento de células em diferenciação terminal. Tendo em consideração que

esta comparação é feita entre modelos de vertebrados diferentes, um dos motivos que pode estar

na origem do valor por nós encontrado pode ser a nossa incapacidade de inferência do destino

das células-filhas formadas. Até ao momento final do tempo total de aquisição de imagens, as

células consideradas para a estatística de formação de uma par de progenitores não tinham ainda

perdido a ligação à região apical da roseta. Contudo, não se exclui a hipótese deste processo ter

ocorrido nalguns casos, após ter sido terminada a aquisição das imagens.

Inferência quanto à produção de uma célula em diferenciação terminal foi feita nos casos

em que a célula em questão perde a ligação à região apical da roseta, obtendo uma orientação

rodada de 90º à anteriormente tida. Em analogia com o tubo neural, a célula em diferenciação

terminal tem assim agora as extensões da sua membrana ao longo do eixo dorso-ventral do tubo,

em detrimento do eixo médio-lateral. Um comportamento semelhante foi registado em células de

cortes de tubo neural de galinha (Wilcock et al., 2007) e cortes de retina de embriões de rato no

estado E14-17 (Saito et al., 2003). Importante sublinhar que, para além de modelos animais

diferentes, o ensaio por nós desenvolvido é unicamente in vitro, por comparação com as

experiências de Wilcok e colaboradores e Saito e colaboradores, que desenvolveram toda a parte

experimental em cortes de tecido provenientes de animais. Nos estudos referidos, a confirmação

de aquisição de identidade neural foi obtida posteriormente por ensaios imunohistoquímicos de

fixação com marcadores neuronais, tais como HuC, uma proteína característica de neurónios

diferenciados. Uma abordagem semelhante pode ser pensada no sentido da confirmação da

identidade pretendida. No entanto, uma alternativa a ensaios desta natureza consiste na

confirmação da perda da identidade de progenitor por diminuição e efectivo desaparecimento da

fluorescência dessas células. Apesar da GFP poder ainda encontrar-se no citoplasma nos

instantes imediatamente após a divisão, como a transcrição do gene sox1 termina com a perda de

identidade de progenitor neural, rapidamente as moléculas fluorescentes presentes no citoplasma

sofrem bleaching e as células em divisão terminal podem assim ser facilmente identificadas. Este

é um dos motivos da importância fulcral da optimização de técnicas de observação de

fluorescência neste tipo de culturas, não completamente atingida em tempo útil para a conclusão

deste estudo.

Do número total de divisões simétricas não terminais, 25% são devido a divisões

horizontais. Neste sentido, os dados referentes às divisões analisadas apontam para que exista

uma boa correlação entre a produção de um par de progenitores e o tipo de divisão vertical.

Apesar de haver tendência para divisão nesta orientação as divisões simétricas não são

exclusivamente verticais. Em oposição, as divisões assimétricas têm os dois tipos de orientação

do plano de clivagem. Estes dados estão em concordância com os obtidos por Wilcock e

colaboradores para cortes de tubo neural de galinha. Nada se pode deduzir quanto à existência de

divisões simétricas terminais, por não haver contagens de pares de células em divisão terminal

89

originadas a partir da mesma divisão. Mais uma vez, será necessário aumentar a janela de tempo

total de aquisição das séries de imagens. Caso a monitorização das culturas fosse feita por mais

tempo poderia ser confirmada a identidade de progenitor das células-filhas através da observação

do final do ciclo celular dessas células com existência de nova divisão.


Os ensaios efectuados para monitorização dos níveis de cálcio intracelular nas células de

roseta (Figura 5.23) apontam para elevada eficiência na incorporação do fluoróforo nas células em

causa. As evidências indicam que o protocolo desenvolvido funciona de modo reprodutível nas

células em monocamada das culturas de progenitores neurais de S25. Para a validação do

método contribuem também os valores nulos de fluorescência de fundo nas imagens. Para além

da eficaz incorporação do fluoróforo, detectado ao nível citoplasmático, são evidentes oscilações

na fluorescência interna dos progenitores, indicando assim a ligação de uma maior ou menor

quantidade de cálcio ao Fluo-4. Notar que a fluorescência desta molécula apenas aumenta

significativamente quando ligada a cálcio, sendo por isso um bom medidor de precisão da

concentração deste ião ao nível intracelular.

A análise dos resultados obtidos revela que ocorrem picos de cálcio no interior das células

em roseta, havendo oscilações de intensidade em intervalos de 1min, o menor intervalo de tempo

registado. De modo a obter um valor exacto de frequência das oscilações seria necessário

aumentar a frequência de aquisição do microscópio por diminuição do intervalo de tempo entre

amostragens. Como não foram detectados movimentos intercinéticos nucleares nas células

usadas neste ensaio não foi possível a partir destes resultados preliminares corroborar a relação

entre a existência de picos de cálcio intracelular e os movimentos dos progenitores. Mais uma vez,

os resultados sugerem a influência nociva da iluminação laser para excitação de moléculas

fluorescentes nos movimentos de migração das células de progenitores neurais em monocamada.

90

7. CONCLUSÃO

O presente estudo apresenta evidência in vitro da presença de movimento intercinético

nuclear de progenitores neurais e do processo de divisão deste tipo de células na região apical de

rosetas, estruturas miméticas do tubo neural formadas em cultura em monocamada.

Os progenitores neurais em vias de divisão migram para o lúmen da roseta, retraem toda a

membrana celular e adquirem uma forma completamente esférica imediatamente antes do

aparecimento dos primeiros sinais de constrição da membrana celular num plano médio da célula-

mãe. Nas culturas em monocamada monitorizadas, 76,1% das divisões ocorrem com o plano de

clivagem sobre um raio da roseta, constituindo as denominadas divisões verticais. Na restante

percentagem, a divisão horizontal origina uma célula na região apical e uma outra mais perto da

região basal. Em qualquer dos casos, a adesão à base da placa de cultura é feita na região apical,

imediatamente após divisão, recuperando as células-filhas a morfologia fusiforme característica

das células neste tipo de condições de cultura. Adicionalmente, as células para as quais se tenha

assumido uma divisão terminal entram em G0, libertando a ligação à região apical da roseta e

migrando para regiões fora dos limites da roseta. Estas células reorientam-se segundo um novo

eixo, análogo ao eixo dorso-ventral no tubo neural.

A abordagem de microscopia de campo claro com luz visível mostrou-se menos nociva no

que respeita à manutenção da viabilidade celular das culturas nas condições de iluminação

usadas. Além disso, proporciona uma aquisição de imagens com boa resolução para análise

manual. A monitorização do movimento de células individuais de modo automático, recorrendo a

técnicas de segmentação, foi muito exigente e morosa dadas as características de contraste das

imagens obtidas. A presença de vestígios celulares em suspensão no meio de cultura, bem como

a dificuldade técnica de remoção de poerias da câmara CCD, contribuíram em grande parte para

esta limitação da metodologia seguida neste estudo. Neste sentido, é da maior utilidade a

optimização das condições de observação em fluorescência das culturas de progenitores neurais.

Tendo o meio de cultura e material em suspensão baixa auto-fluorescência, e dado que é possível

com recurso a técnicas simples de manipulação genética endereçar marcadores fluorescentes a

uma grande quantidade de genes de interesse, o estabelecimento de condições de iluminação e

aquisição de imagens de amostras iluminadas com luz de fluorescência, tanto lâmpadas de

Mercúrio, Xénon ou laser será da maior utilidade. Sendo conhecido o papel de moléculas como

Notch e seus ligandos na diferenciação neural in vivo, a monitorização em tempo real da sua

expressão em culturas poderia abrir caminho para o estudo detalhado destes mecanismos em

culturas em placa e possível extrapolação para in vivo sem necessidade de outros ensaios. Neste

sentido, o desenvolvimento de modelos in vitro que mimetizem exactamente os comportamentos

in vivo das estruturas associadas são da maior utilidade para a comunidade científica. É neste

ponto que a contribuição deste estudo se torna importante.

O estabelecimento de ensaios em microscópios confocais com maior sensibilidade ao nível

de detectores, tais como o Zeiss LSM 510 META, seria uma hipótese para trabalhos futuros.

91

A existência de movimentos intercinéticos nucleares de progenitores neurais foi

tentativamente relacionada os fluxos de Cálcio nessas células (Komuro et al., 1996), o que nos

levou a desenvolver um protocolo para incorporação de repórteres de cálcio nas células

estudadas. Resultados preliminares revelam a eficiência da incorporação do fluoróforo e

consequente ligação a moléculas de cálcio do meio intracelular. Dado que a distribuição do cálcio

é citoplasmática, os níveis de intensidade de sinal detectados corresponderão a variações reais de

concentração. Neste sentido pode concluir-se a existência de variações de concentração de cálcio

intracelular nas células das culturas filmadas, não sendo os picos máximos coordenados entre as

células de uma mesma roseta. Contudo, há em certos casos indícios de pequenos aumentos em

células adjacentes, podendo o fluxo existir devido às gap junctions entre células. Apesar de não

estar esclarecido o papel deste tipo de junções no movimento intercinético nuclear de progenitores

neurais in vivo (Pearson et al., 2005), é conhecido que o posicionamento lado a lado dos

progenitores permite a passagem de moléculas de sinalização, nomeadamente cálcio. No sistema

nervoso central, está bastante bem descrita a participação das gap junctions cuja actividade é

dependente de cálcio na regulação do movimento de células e proliferação, sendo disso um

exemplo os movimento migratórios de neurónios onde existe correlação entre a velocidade e a

frequência e amplitude das alterações de cálcio (Komuro et al., 1996).

Em suma, a importância deste estudo no contexto de células estaminais e processos de

diferenciação centra-se no conhecimento mais detalhado do comportamento dos progenitores

neurais em placa, em culturas de monocamada, como miméticas do comportamento dos

progenitores neurais no ser humano. A relevância deste tipo de avanços torna mais viável a

possibilidade de diferenciação controlada de células estaminais em qualquer tipo de linhagem

celular estável para potenciais aplicações médicas de regeneração de tecidos lesados.

92

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