Molekuláris genetikai alkalmazások a klinikai laboratóriumi gyakorlatban

1. Humán klinikai molekuláris genetika.

2. Állatorvosi molekuláris genetika.

3. Személyazonosság vizsgálata - igazságügyi

orvostani alkalmazások.

4. Hisztokompatibilitási vizsgálatok.

Molekuláris genetikai diagnosztika

1. Monogénes betegségek analízise.

2. Kockázati tényezık meghatározása.

3. Prognosztika.

4. Terápiára adott válasz monitorozása.

5. Farmakogenetika.

6. Normál populáció tesztelés (szőrıprogramok).

Módszerek

1. Vizsgálati anyag: nukleinsav.2. Minta: alvadásgátolt vér (fehérvérsejt), szájüreg mosófolyadék, tenyésztett sejt, stb.3. Vizsgálati módszerek

Nukleinsav izolálás(DNS szintézis RNS-bıl)DNS szakasz(ok) amplifikációja (PCR)Mutáció keresés

- Mutáció szőrés (SSCP, HA, dHPLC, HRM)- Mutáció detektálás (restrikciós emésztés, allélspecifikus PCR, OLA)Gold standard: DNS szekvenálás

4. Interpretáció.

Mutációk

Founder

Különbözımutációk a génben ugyanazt (hasonló) fenotípust okoznak.

pl. haemophilia A

Ugyanaz a mutáció figyelhetımeg újra és újra

Mutációs forrópontok, instabil genomszakasz.

pl. achondroplasia, FGFR3 mutáció(nt.1138)

Mutációtípusok elıfordulási gyakorisága

Mutációk elıfordulási gyakorisága öröklıdés szerint

Súlyos, monogénes öröklött betegség genetikai hátterének kiderítése

A kaukázusi népcsoport egyik leggyakoribb, igen súlyos, autoszomális recesszív módon öröklıdı betegsége.

A szervezet exocrin mirigyeket tartalmazó szerveit érinti, a betegség következtében kórosan megváltozik a verejték elektrolit-tartalma (verejtékteszt: >60 mM Cl -), megváltozott ionösszetételő viszkózus secretumok jelennek meg és győlnek fel a pancreas, tüdı, máj állományában és az epeutakban.

Születéskor várható élettartam 37 év (50 évvel ezelıtt 10 év).

Cystás fibrosis (mucoviscidosis, CF)

- 12 transzmembrán domén (TM), amelyek a klorid csatornát alkotják - 2 NBD, 1 szabályozó doménMőködésének szabályozása az NBD-hez kötıdı ATP hidrolízisén és a szerinekfoszforilációján keresztül valósul meg- A leggyakoribb (50-70 %) CF mutáció az NBD1-ben található (∆∆∆∆F508)

A CFTR protein szerkezete

USA: újszülöttkori szőrés 40 államban kötelezı (IRT), az eredménye csökkenı incidencia

A CF genetikai háttereAutoszomális recesszív öröklıdésmenet

~ 1600 mutációt írtak le a CFTR génben (7q)

Gyakori (~30), ritka (>1000)

Incidencia: 1-2.000 (kaukázusi), 1-90.000 (ázsiai)

Minden 27. kaukázusi eredető ember heterozigóta valamelyik CFTR gén mutációra nézve

American College of Obstetricians and Gynecologists: minden American College of Obstetricians and Gynecologists: minden gyermeket vgyermeket váállalllal óó ppáárnak ajrnak aj áánlott CF genetikai hordoznlott CF genetikai hordozóószszőőrr éésen rsen réészt venni.szt venni.

Magyarországi adatok a CF mutációk megoszlásáról

2 nemzetközi közlés.

Nemeti M et al Nemeth K et al 1992 Hum Genet. 1996 J Inher Metab D

84 család. 458 CF beteg.

∆∆∆∆F508: 54(64,4%) 49,9%R553X: 2 1,3%G542X: 1 3,0%1717-1G>A: 1 NAW1282X: 1 NAN1303K: 1 1,5%G551D: 0 0,0%621+1G>T: 0 NA

A CFTRdele2,3(21kb) mutációHum Genet, 2000

- 29 országra kiterjedıkollaboráció-olyan betegekben találták, akiknél az e2 és e3 exonok amplifikálása sikertelen volt (homozigóta mutánsok a CFTRdele2,3(21kb) delécióra)- a 4. exonban korai terminációt eredményez- a mutáció súlyos CF fenotípussal jár- a mutáció elterjedése követi az elsımilleniumi szláv vándorlásokat

6 kb 0,1 kb 4,7 kb 10,3 kb0,1 kb

intron 1 e2 i2 e3 intron 3

A CFTRdele2,3(21kb) mutáció

CFTRdele2,3(21kb)

delécióa 2-es és 3-as exonokat, mint funkcionális egységeket érinti

~21000 bp kiesése

Betegek, anyagok és módszerek

1. Beteg kiválasztási kritériumok:

- klinikailag súlyos CF

- korábban multiplex mutáció detektálási módszerrel vizsgáltak

- n=43

2. Kontrollok:

- heterozigóta CFTRdele2,3(21kb) a Prágai Egyetemtıl

3. A deléció detektálása:

- a deléciós pontra tervezett PCR primerekkel

- DNS szekvenálás a deléciós pont kimutatására/ megerısítésére

EredményekA CFTRdele2,3(21kb) mutáció detektálása:

- 4/43 beteg

- mind heterozigóta formában

- minden esetben együtt a ∆∆∆∆F508 mutációval

- minden családban transz öröklıdést mutat a ∆∆∆∆F508 mutációval

- a családvizsgálatok minden esetben összetettheterozigótaságot bizonyítanak

- a DNS szekvenálás igazolja a deléciós pont azonosságát az irodalmi adatokkal

intron 1intron 3

CFTR mutációk elıfordulása kelet-magyarországi CF betegekben

45%

9%

5%2% 2% 2%

24%

2%

2%

7%

deltaF508 -/-

deltaF508 +/-, CFTRdele2,3(21kb)deltaF508 +/-, N1303K

deltaF508 +/-, 1717-1 G-A

G542X, N1303K

G542X, R347P

deltaF508 +/-

G542X +/-

N1303K +/-

no mutation

Konklúzió

A szláv etnikai hátterő népességre jellemzıCFTRdele2,3(21kb) mutáció elıfordul a magyar CF betegekben is.

A mutáció gyakorisága adataink szerint a ∆∆∆∆F508 mutáció után következik, minden korábban detektált CF mutációnál (~30) gyakoribb.

Fentiek alapján a CFTRdele2,3 mutáció részét kell hogy képezze a magyar CF molekuláris genetikai diagnosztikai vizsgálati panelnek.

Kockázati tényezık vizsgálata multifaktoriális betegségekben

- gyakori SNP-k -

Idıskori macula degeneráció (AMD) I.A fejlett országokban a 65 év feletti vakság vezetı oka.A betegség a szem éleslátásért felelıs területét támadja meg.Magyarország: 6000 beteg évente (2800 késıi, nedves típus).

Tünetek: - olvasás nehezítettsége, - színlátási képesség romlása,- centrális homályok, torzképek,- centrális vakság.

Pathogenezis: a retinális pigment epithelium (RPE) romló funkciója.

Kockázati tényezık:- UV expozíció, dohányzás,- hypertónia, oxidatív stressz,- kaukázusi rassz, - genetikai meghatározottság.

AMD II.Stádiumok:

1. Korai:- RPE egyenetlenségek, - soft drusenek

2. Késıi:- geographicus atrophia,- subretinális neovascularizációs membrán. - nedves

AMD

száraz

AMD

retina

RPEBruch-m.choroidea

Arroyo, JAMA 2006

1. A komplement faktor H (CFH) a komplement rendszer alternatív útvonalának szabályozó molekulája.CFH Y402H: a 7. SCR doménben, a molekula egyik heparin-és CRP kötıhelyén.Következménye: megváltozott sejtfelszíni affinitás.

2. LOC387715 rs 10490924 (vagy HTRA1 rs11200638). SNP-k. Erıs kapcsoltság, ismeretlen funkció.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Heparin kötıhelyek

CRP kötıhelyek

JEM 2007

AMD genetika

Eredmények1. Magyarországon a kockázati CFH allél homozigóta

elıfordulása 7-8%, míg a LOC387715 esetében ez 3-4%.

2. A polimorfizmusok inkább homozigóta formában jelentenek kockázatot, de az akár 10-11-szeres is lehet.

3. A genotípuskombinációktovábbi kockázat-növekedésseljárnak:

CFH -/-, LOC +/-OR (95%CI): 15,0 (3,2-71,0) a késıi stádiumúbetegekben.

Farmakogenetika

50 éve ismert a gyógyszerekre adott egyéni válasz.Farmakogenetika: hogy befolyásolja az öröklıdés a választ?

CYP2D6

Arch Pharmacol 2004

Enzimaktivitás

100%

0%

Thiopurine S-methyltransferase (TPMT)A tiopurin gyógyszerek fı metabolizálója. 6-mercaptopurine, 6-thioguanine használata: AML, ALL. Azathioprine (AZA, Imuran) : immunszuppresszáns. Gyulladásos bélbetegségek, RA, autoimmun hepatitis, szervtranszplantáltak. UK: 30-40,000 beteg évente.

Az aktív metabolit a 6-TGN. A TPMT enzim a tiopurin gyógyszerek inaktív metabolittá tör-ténı konverziójáért fele-lıs. A TPMT aktivitás nagy populáción belüli vari-ációt mutat.

EJHG 2009

PM: dózis-asszociált mellékhatások. 90% magas (normál aktivitás), 10% közepes, 1:300 PM.

TPMT*2: G238C,TPMT*3A: G460A és A719G,TPMT*3B: G460A,TPMT*3C: A719Gegyütt felelıs a PM és IM fenotípusért 80-95%-ban.Interetnikai variabilitás: TPMT*3A 4% -ban fordul elıkaukázusi populációban, hiányzik az orientálisban.

PM: két null allél (homozigóta vagy összetett heterozigóta).

TPMT

Clin Pharmacol Ther 1997

IM: egy mutáns allél, PM: két mutáns allél (homozigóta vagy összetett heterozigóta).

TPMT hiány esetén a standard dózisú 6-merkapto-purin vagy AZA életveszélyes myeloszuppresszív mellékhatásokkal járhat.

A TPMT PM betegekben a standard dózis 8-15-öd része elegendı lehet.

NEJM 2003

n=101. Fı diagnózis: gyulladásos bélbetegség (67). Eredmények:*1*1 (vad típus): 90 beteg.Heterozigóta genotípus: 11 beteg. Genotípusok megoszlása: *1*2: 1 beteg, *1*3A: 6 beteg, *1*3C: 2 beteg, ritka allélek (*1*9, *1*20): 2 beteg.

Közremőködık:

CF. Gönczi Ferenc, Nagy Béla, Újhelyi Rita, Milan Macek, Dzsudzsák Erika, Ajzner Éva, Gombos Éva, Madar László, Ivády Gergely.

AMD. Losonczy Gergely, Fekete Ágnes, Káldi Ildikó, VokóZoltán, Takács Lili, Ajzner Éva, Vajas Attila, Kasza Márta, Dzsudzsák Erika, Berta András.

Kappelmayer János.

Milyen vizsgálatok segítségével lehet új kockázati tényezıket találni?

- Teljes genom szőrés eset-kontroll keretek között

Pl. NEJM 2007, Wellcome Trust Case Control Consortium (1926 beteg, 2938 kontroll) + Német MI study (875+1644).

377857, ill. 272602 SNP analízis

WTCCC: 9 lókuszNémet vizsgálat: ezek közül kettıben van szignifikáns különbségMindkett ıben egyértelmő: 9p21.3 (SNP, rs1333049)Kombinált analízis: még 4 lókusz lehet felelıs.

Mekkora a kockázat?Kockázat növekedés (esélyhányados) 1.08 (95%CI: 0.90-1.31)-tól 1.37 (95%CI: 1.26-1.48) , azaz 8-37% (!).

"These estimates demonstrate the limited potential of the variants thus far identified (singly or in combination) to provide clinically useful prediction of disease."

Wellcome Trust Case Control Consortium. Genomwide association study of 14,000 cases of seven common diseases and 3,000 shared controls.Nature 2007;447:661-78.

Patogenetikai utak felderítése. Az esetleges additív (sokszorozódó) hatások felmérése.

Akkor mire jó?

Zheng et al NEJM 2008

Prosztata tumor kockázat becslés

- eset-kontroll, 2893 beteg, 1715 kontroll- 16 SNP-t teszteltek- 5 különbözıkromoszóma régió- a betegek 1,4%-a esett a legmagasabb kockázatú csoportba