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Alleanza Contro il Cancro (ACC) – Istituto Superiore di Sanità (ISS) Art.3 DM 21 luglio 2006 - Programma Straordinario di Ricerca Oncologica 2006Programma 3 “Rete solidale e collaborazioni internazionali”

MODULO 1

MODULISTICA

MODULO 1 - Dati generali

TITOLO DEL PROGETTO (max 100 caratteri)

NUOVE MOLECOLE REGOLATRICI DI ITCH SU P73/P63 NEL CICLO CELLULARE E CHEMIOTERAPIA DEI TUMORI EPITELIALI

COSTO COMPLESSIVO DEL PROGETTO /_1_/_5_/2_/_6_/_0_/_0_/0_/

FINANZIAMENTO RICHIESTOAD ACC/ISS /__/_9_/_0_/_0_/_0_/_0_/_0_/

RISORSE PROPRIE /__/_6_/_2_/_6_/_0_/_0_/_0_/

COFINANZIAMENTI : /__/_2_/_7_/_0_/_0_/_0_/_0_/

(SPECIFICARE ENTE EROGATORE, DATA INIZIO DISPONIBILITÀ FONDI E RELATIVO IMPORTO)

__PHILIPH MORRIS TO GERRY MELINO______________________________/_01_/_09_/_2007_ _120000 /__/

ENTE EROGATORE GG MM AA

IMPORTO

__AIRC GERRY MELINO________ /__01/03/2006_/

/__/__/__50000__/


IMPORTO

__MIUR FIRB RUSSO/D’ATRI______________________________ /__01/06/2007__/ /__/__100000__/


IMPORTO

DURATA (in mesi, massimo 36) : /_3_/_6_/

I

Alleanza Contro il Cancro (ACC) – Istituto Superiore di Sanità (ISS) Art.3 DM 21 luglio 2006 - Programma Straordinario di Ricerca Oncologica 2006Programma 3 “Rete solidale e collaborazioni internazionali” MODULO 1

COORDINATORE DEL PROGETTO:

nominativo:__Gerry Melino_________

struttura di appartenenza : :__IDI-IRCCS___ funzione: :__Direttore Laboratorio di Biochimica_______________

indirizzo : __Via Monti d Creta 104______________________________________________________

N. tel:__0672596976___ N. fax:______0620427290_______

indirizzo E-mail : [email protected]_________

DESTINATARIO ISTITUZIONALE PROPONENTE

Destinatario Istituzionale IDI - IRCCS

Rappresentante legale Dott. Eugenio Luchetti

Responsabile Scientifico UO 1 Prof Gerry Melino

Gruppi di ricerca afferenti al DI (Dipartimento/Sezione e nominativo del Responsabile Scientifico)

Gruppi di ricerca afferenti ad altre Istituzioni di Ricerca (Istituzione e nominativi del Responsabile Scientifico e del Rappresentante Legale):Università Tor Vergata, Dip Medicina Sperimentale, Dott.sa Eleonora Candi, Prof Alessandro Finazzi Agrò

DESTINATARI ISTITUZIONALI PARTECIPANTI

Destinatario Istituzionale Istituto Nazionale Tumori Regina Elena

Rappresentante legale Dr Marino Nonis (Direttore Generale)

Responsabile Scientifico UO 2 Giovanni Blandino

Gruppi di ricerca afferenti al DI (Dipartimento/Sezione e nominativo del Responsabile Scientifico)Gruppi di ricerca afferenti ad altre Istituzioni di Ricerca (Istituzione e nominativi del Responsabile Scientifico e del Rappresentante Legale)Università Tor Vergata, Dip di Biologia, Prof.sa Maria Grazia Santoro, Alessandro Finazzi AgròIstituto Europeo di Oncologia, Dipartimento di Oncologia Sperimentale, Dott.sa Luisa lanfrancone, Dr. Carlo Ciani.

Destinatario Istituzionale IDI-IRCCS

Rappresentante legale Dott. Eugenio Luchetti

Responsabile Scientifico UO 3 Dott.sa Stefania D’Atri

Gruppi di ricerca afferenti al DI (Dipartimento/Sezione e nominativo del Responsabile Scientifico)

Gruppi di ricerca afferenti ad altre Istituzioni di Ricerca (Istituzione e nominativi del Responsabile Scientifico e del Rappresentante Legale)CNR, Istituto di Neurobiologia e Medicina Molecolare, Dott.Sa Ester Alvino, Prof. Pietro Calissano – Istituto Nazionale per la Ricerca sul Cancro, Genova, Ulrich Pfeffer, Dr. Gianfranco Ciappina

II

Alleanza Contro il Cancro (ACC) – Istituto Superiore di Sanità (ISS) Art.3 DM 21 luglio 2006 - Programma Straordinario di Ricerca Oncologica 2006Programma 3 “Rete solidale e collaborazioni internazionali” MODULO 2

MODULO 2 - DESCRIZIONE DEL PROGETTO (SINTESI DELLE ATTIVITÀ DI TUTTE LE

UNITÀ OPERATIVE)

BASE DI PARTENZA E RAZIONALE (max 4000 caratteri) (3400/4000)

La famiglia di p53 comprende tre membri: p53, p63 e p73. p53 è il gene mutato più frequentemente nei tumori umani. È un fattore trascrizionale, che è attivato rapidamente come risposta a danni genotossici od ad attivazione d’oncogeni, regolando l’espressione di geni coinvolti nel controllo del ciclo cellulare e dell’apoptosi. Analogamente a p53, p73 e p63 contengono un dominio di transattivazione (TA), un dominio di legame al DNA (DBD) ed un dominio d’oligomerizzazione (OD). La struttura genica di p63 e p73 è molto complessa in quanto entrambi i geni codificano per diverse isoforme e per diverse varianti che derivano da splicing alternativi e da inizi di trascrizione diversi. In particolare, le varianti N mancano del dominio TA e quindi agiscono da dominanti negativi. Dal momento che p53, p63 e p73 sono altamente omologhi (la loro identità di sequenza raggiunge il 63% nel DBD), questi geni dovrebbero avere funzioni ridondanti. Infatti, sia p53 che p73 sono in grado di bloccare la crescita cellulare e indurre apoptosi. Conseguentemente, sia p63 [1] che p73 [2, 3] sono coinvolti nella tumorigenesi, in particolare nei tumori epiteliali. Le proteine p53/p63/p73 cooperano nella tumorigenesi regolando l’apoptosi [4], funzione indispensabile per l’azione dei farmaci anti-tumorali genotossici [5-8]. Quindi lo "status" dei geni della famiglia di p53 è un fattore importante nella prognosi e chemiosensibilità tumorale: l’azione di p63/p73 diventa quindi essenziale nei frequenti casi di inattivazione di p53. Infatti, deregolazioni di p63/p73 inducono resistenza alla citotossicità da chemioterapici [7, 8]. Similmente a p53, l’espressione di p63 e p73 è mantenuta a bassi livelli nelle cellule di mammiferi, e la loro induzione e attivazione cellulare è principalmente controllata a livello post-traduzionale. Sia p63 che p73 sono ubiquitinati in vivo e degradati attraverso la via proteolitica proteasoma-dipendente. Mentre p53 è degradato da mdm2, noi abbiamo scoperto che la degradazione di p63/p73 è regolata da Itch, una ubiqitina E3 ligasi contenente HECT ed appartenente alla famiglia Nedd4 [9]. Itch ha come bersaglio sia le varianti TAp73 che Np73, tenendo i loro livelli proteici bassi in condizioni normali. Oltre a p63/p73, Itch reprime la via di Hedgehog e dei suoi trasduttori (proteine Gli) [10], la cui attivazione è frequentemente responsabile dell’insorgenza di tumori neuroectodermici. Oltre ai farmaci anti-Itch per regolare i livelli di p63/p73, genereremo inibitori delle interazioni molecolari di p73. Sono stati identificati peptidi sintetici (che rappresentano la sequenza del dominio di legame specifico al DNA della proteina p73) che interagendo con la proteina p53 mutata ripristinano la funzione apoptotica della proteina p73. Il bersaglio molecolare individuato è rappresentato dal complesso proteico mutp53/p73, la cui attività oncogenica ed il diretto coinvolgimento nella chemioresistenza di tumori a p53 mutata è stato documentato da vari studi in vitro ed in vivo. Oltre ad usare Itch come target farmacologico diretto, è possibile ipotizzare un’azione sinergica con altre molecole che regolano punti diversi della stessa via: cicline-chinasi dipendenti (CDK) e regolatori di IKK/NF-kB. Nelle cellule tumorali si riscontra quasi costantemente un’aumentata attività delle CDKs e una modulazione negativa della loro attività/espressione può determinare inibizione della crescita tumorale in vitro ed in modelli animali [11, 12]. Analogamente, la protein-chinasi RaLP regola proliferazione e sopravvivenza cellulare, promuovendo la tumorigenesi [13], e IKK/NF-kB é costitutivamente attivata nei tumori, dove NF-kB causa resistenza all'apoptosi da farmaci antitumorali [14]. Inoltre, p63 e p73 regolano il ciclo cellulare, interagiscono con NF-kB e transattivano IKK.La regolazione farmacologia di Itch su p63/p73/Hedgehog/Gli ed eventuali sinergie con CDK/IKK/NF-kB/RaLP è un’area totalmente inesplorata nel cancro ed in particolare nei tumori epiteliali.

OBIETTIVO PRINCIPALE E OBIETTIVI SECONDARI DEL PROGETTO (max 4000 caratteri) (4092/4000)

L’obiettivo principale di questo progetto é quello di sviluppare nuove molecole (da noi identificate) inibitori della E3-ubiquitina-ligasi Itch e di validare tali molecole nella via p63/p73 e nella via Hedgehog/Gli. Inoltre, valuteremo il potenziale terapeutico di peptidi capaci di disassemblare complessi proteici (mp53/p73) ad attività oncogenica, e studieremo il potenziale terapeutico di inibitori selettivi di NF-B/IKK e di CDKs, come singoli agenti ed in associazione con gli inibitori di Itch e chemioterapici convenzionali. Analizzeremo l’espressione della proteina chinasica RaLP nei melanomi e caratterizzeremo la

III


trasduzione del segnale da essa attivata. Il progetto é suddiviso nei seguenti obiettivi specifici.

1) Valutazione dell’espressione di p63/p73/Itch in tumori cutanei/linfomi. . Questo studio sarà principalmente condotto dapprima su diverse linee cellulari tumorali e successivamente su biopsie di pazienti. Questo approccio permetterà una correlazione clinica tra l’espressione di questi marcatori ed il decorso clinico della malattia.

2) Studio delle proprietà biochimiche delle proteine leganti/regolanti ITCH. Tali proteine includono YAP, Wwox e N4BP1. Si studierà l’espressione di tali proteine in cellule tumorali e in biopsie di pazienti in correlazione con l’espressione di Itch, p63 e p73.

3) Generazione topi transgenici. che esprimono alti livelli di p63 nei tessuti epiteliali. I topi verranno utilizzati allo scopo di studiare l’insorgenza di tumori.

4) Identificazione di inibitori della E3 Ligasi Itch. L’ “hightroughput screening” su 35000 molecole sintetiche, ha identificato 48 molecole capaci di inibire 70% dell’auto-ubiquitinazione di Itch. Abbiamo selezionato 6 molecole sottoposte a test in vitro per la specificità di substrato, utilizzando controlli negativi -Nedd4 e Mdm2. Verrà effettuata la validazione degli inibitori di Itch a livello biochimico,cellulare e murino. Studieremo citotossicità degli inibitori-Itch su linee Tet-On esprimenti p63/p73. Valuteremo la degradazione di p63/p73, ± inibitore, durante l’azione di chemioterapici, misurando apoptosi e ciclo cellulare. Inoltre, genereremo nuovi modelli animali over-esprimenti isoforme cutanee induribili di p63 per studiare tumorigenesi in vivo e l’efficacia degli inibitori. Topi p63-/-, p73-/- ed Itch-/- sono già presenti nel nostro laboratorio.

5) Caratterizzazione del complesso proteico mutp53/p73 come bersaglio molecolare di peptidi sintetici; sintesi dei peptidi. Oltre ai farmaci anti-Itch per regolare i livelli di p63/p73, genereremo inibitori delle interazioni molecolari di p73. Analizzeremo la risposta tumorale alle combinazione farmacologiche dei peptidi con Transumab, Iressa, Avastin. Valuteremo l’indice apoptotico dopo trattamento con peptidi anti-p73 e bio-farmaci in cellule epiteliali. Verificheremo se l’eventuale aumento dell’apoptosi da cisplatino e etoposide dopo pretrattamento con peptidi, sia dovuto alla capacità di p73 di attivare più efficientemente i geni bersaglio. Creeremo nuovi modelli sperimentali (incluso topi nude/scid sottoposti a xenotrapianto di cellule di tumori umani) in vivo per la valutazione dell’efficacia terapeutica dei peptidi e delle associazioni con bio-farmaci.

6) Studio dell’effetto di piccole molecole ciclopentenoniche inibitrici della via IKK/NF-kB e caratterizzazione del sistema IKK/NF-kB e del pathway di HSF1 nei modelli prescelti. Gli effetti cellulari di piccole molecole ciclopentenoniche inibitrici di NF-kB saranno studiati in diversi tipi di melanoma umano, resistenti alla chemio-, radio-terapia. Valuteremo la sinergia con gli inibitori di Itch.

7) Identificazione delle molecole con proprietà agoniste di Numb, caratterizzarne l’interazione con Itch, Numb e le proteine Gli (Gli1, Gli2 e Gli3), e identificare i domini funzionali. Valutaremo l’efficacia delle molecole agoniste di Numb in vitro/vivo. I trattamenti combinati che risulteranno maggiormente efficaci in vitro verranno testati in topi nude/scid (xenotrapianto di melanoma umano).

8) Definizione degli effetti antitumorali di inibitori di CDKs, come singoli agenti e in combinazione con chemioterapici convenzionali, su linee cellulari di melanoma umano ed in modelli animali. Valuteremo antiproliferazione e citotossicità di inibitori di CDKs sviluppati da Nerviano Medical Sciences in melanoma. Attualmente, i due inibitori di CDKs sono in sperimentazione clinica fase-I. Identificheremo marcatori tumorali correlati con la sensibilità/resistenza cellulare agli inibitori e sinergie con gli inibitori di Itch e IKK/NF-kB.

9) Identificazione delle molecole coinvolte nella trasduzione del segnale migratorio mediato da RaLP, identificazione di inibitori della funzione di RaLP,

METODOLOGIA (max 8000 caratteri) (6390/8000)

Obiettivo 1. Analizzeremo l’espressione di Itch endogeno in seguito a vari trattamenti chemioterapici, In particolare useremo chemioterapici come il cisplatino, etoposide, taxolo e UVB (tipicamente alle dosi di 5-20 M, 10-25 M, 25-100 nM, and 30J/m2 rispettivamente) per 24 ore. Abbiamo a disposizione diverse linee di cellule di melanomi di diverse caratteristiche istologiche. In parallelo, analizzeremo i livelli di p63 e p73 per Western Blot. Per escludere che p63 e p73 possono essere regolati a livello trascrizionale, analizzeremo l’espressione di p63 e p73 per “real time PCR” in seguito a trattamento chemioterapico.Obiettivo 2. Analizzeremo l’espressione di YAP, Wwox e N4BP1. in seguito a vari trattamenti chemioterapici come il cisplatino, etoposide, taxolo e UVB (tipicamente alle dosi di 5-20 M, 10-25 M, 25-100 nM, and 30J/m2 rispettivamente) per 24 ore. Valuteremo l’ipotesi che tali proteine leganti ITCH possano regolare, o positivamente o negativamente, la funzione di ITCH. Si eseguiranno saggi di in vivo ubiquitinazione trasfettando HEK293 con vettori di espressione per ITCH, per p63/p73 in combinazione con YAP, Wwox e N4BP1. Utilizzeremo saggi di “RNA interference” per analizzare l’effetto dell’ inibizione di YAP, Wwox e N4BP1 su p63/p73/ e proteine Gli.Obiettivo 3. Nel nostro laboratorio sono giá presenti topi p63-/-, p73-/- ed Itch-/-. Genereremo topi transgenici per p63 utilizzando la tecnologia precedentemente usata nel nostro laboratorio. In breve il gene p63 verrá clonato a valle del

IV


promotore della cheratina 14 per indurre l’espressione di p63 unicamente nello strato basale dell’ epidermine. Analizzeremo l’espressione di p63 esogeno sia per RT-PCR che per immunoistochimica utilizzando sezioni dell’epidermide.Obiettivo 4. Una libreria di circa 35000 molecole sintetiche é stata analizzata tramite un saggio immunologico di chemioluminescienza per identificare molecole inibitrici di ITCH. In breve, la proteina di fusione GST-ITCH é stata immobilizzata su delle piastre rivestite con glutatione e poi incubata con un buffer di reazione (50mM Tris-HCl ph 8.0, 100mM NaCl, 5mM MgCl2, 1mM ATP, 2mM DTT) che contiene l’enzima purificato E1, E2 e Flag-ubiquitina. Infine é stato effettuato un saggio ELISA utilizzando un anticorpo monoclonale anti-FLAG coniugato con la perossidasi.Obiettivo 5. L’indice apoptotico di cellule SKBR3 e T47D dopo trattamento con peptidi e bio-farmaci verrà valutato mediante analisi citofluorimetriche, TUNEL, Annessina V, e la comparsa della forma frammentata di PARP. Esperimenti di immunoprecipitazione della cromatina verificheranno se l’eventuale aumento della morte cellulare indotta dal cisplatino e dall’etoposide dopo pretrattamento con la miscela dei peptici, sia dovuto alla capacità di p73 di attivare più efficientemente i geni bersaglio. I gruppi di animali previsti in questo obiettivo sono:1) animali trattati con soluzione fisiologica, 2) animali trattati con peptidi di uguale chimica ma sequenza casuale non specifica, 3) animali trattati con le molecole di interesse.Gli end-points di questa fase da valutare sono; i)variazioni di peso corporeo ii) variazioni di attività normali (aggressività, capacità riproduttiva, ecc.). Gli end-points nella fase successiva saranno considerati: farmacocinetica, inibizione del target sia in modo diretto o indiretto; massima dose tollerata in base alla tossicità classica e minima dose effettiva.Obiettivo 6. Verranno utilizzate tecniche di silencing di HSF1 o della subunità p65 di NF-kB attraverso shRNA interference, e verrà determinato l’effetto del silenziamento sull’espressione di un pannello di geni pro-infiammatori, pro- e anti-apoptotici, e di proteine con funzione di chaperones. Verra’ studiato l’effetto del silencing sul controllo dell’inizio della traduzione attarverso l’analisi dello stato funzionale di fattori quali eIF2a, eIF4E e eIF4E-BPs. Inoltre verrà analizzata in dettaglio la cascata di attivazione di NF-kB e di HSF nelle varie condizioni sperimentali, con lo scopo di individuare nuovi possibili bersagli per farmaci pro-apoptotici. Data la mancanza di informazioni su un'eventuale attivazione costitutiva del pathway di HSF in cellule tumorali, verrà studiato il livello di fosforilazione e DNA-binding di HSF1 in differenti linee chemio-resistenti di CM e melanoma, caratterizzate o meno da regolazione aberrante di NF-kB.Obiettivo 7. Ci proponiamo anche di caratterizzare il meccanismo di inbizione di Gli da parte della proteina REN a dominio BTB, antagonista di Gli precedentememnte identificato nel nostro laboratorio (Di Marcotullio et al., 2004) L’identificazione di proteine che interagiscono con i fattori di trascrizione Gli, mediante approccio proteomico, ci consentirà anche di caratterizzare molecole con proprietà antagoniste. Ci proponiamo anche di valutare l’efficacia di tali molecole in saggi cellulari in vitro ed in vivo in modelli di medulloblastoma murino (topi difettivi del gene Patched1) ed in topi condizionali doppi mutanti Engrailed2-Cre/Numb-loxP knockout per il gene Numb a livello cerebellare.Obiettivo 8. Gli effetti antiproliferativi dei CDK-Is, da soli od in associazione con chemioterapici convenzionali od inibitori di Itch, verranno valutati in linee cellulari di melanoma utilizzando un test di chemiosensibilità in vitro basato sulla riduzione di sali di tetrazolio e saggi di clonogenicità. Tecniche di Western blotting, Northern blotting e/o real-time RT-PCR saranno utilizzate per valutare l’espressione di molecole effettrici potenzialmente correlate con la sensibilità/resistenza cellulare ai CDK-Is (es. MITF, CDKs, inibitori di CDKs, cicline, Rb). A tal fine saranno anche determinati, mediante microarrays oligonucleotidici Affimetrix, i profili d’espressione genica delle line in studio. Tecniche di Western blotting e saggi chinasici saranno impiegati per valutare eventuali cambiamenti indotti dal trattamento con CDK-Is nello stato di fosforilazione e attività di molecole coinvolte nella regolazione del ciclo cellulare. Inoltre, in cellule di controllo e in cellule esposte ai CDK-Is saranno determinati i profili d’espressione genica per identificare geni modulati dal trattamento farmacologico e quindi potenzialmente coinvolti negli effetti antitumorali osservati.Obiettivo 9. I melanociti normali saranno ottenuti separando le popolazioni cellulari dell’epidermide mediante tripsina e crescendole in terreno a ridotta concentrazione di siero, ma con l’aggiunta di fattori specifici. Per quanto riguarda le cellule neoplastiche, linee primarie di melanoma metastatico sono gia’ state stabilizzate e caratterizzate nel gruppo del proponente. Queste colture primarie verranno utilizzate per studiare la risposta migratoria e proliferativa a segnali extracellulari, sia mitogenici, sia motogenici, sia di stress, quali UV. La coltura in vitro di queste popolazioni cellulari consentirà la manipolazione genetica una volta identificati i partners molecolari della risposta cellulare. L’RNA e i lisati proteici estratti dalle cellule in coltura, ma anche dai campioni bioptici verranno utilizzati per effettuare l’analisi dell’espressione di RaLP durante le varie fasi della progressione neoplastica. In particolare, verrà condotto uno studio sui campioni di nevi e melanomi conservati in paraffina, analizzando anche i linfonodi sentinella utilizzati per verificare la metastatizzazione di alcuni casi di melanoma.

RISULTATI ATTESI (max 4000 caratteri) (3847/4000)

Proponiamo farmaci agenti su meccanismi nuovi ed inesplorati. L’identificazione di nuovi bersagli molecolari (Itch) su nuove vie (p63/p73/Hedgehog/Gli) con nuove specifiche molecole (da noi identificate) ad attività anti-tumorale rappresenta il principale obiettivo della ricerca oncologica. La valutazione anche in modelli animali del sinergismo (CDK2/IKK/NF-kB/RaLP) di queste nuove molecole contribuirà al miglioramento delle terapie chemioterapiche classiche nei tumori epiteliali oggi resistenti ai farmaci. Ci proponiamo di caratterizzare sia a livello biochimico, che cellulare e murino un inibitore specifico di Itch (U01), l’E3 ubiquitina ligasi responsabile della degradazione di p63, p73 e proteine della famiglia Gli. P63 e p73 sono membri della famiglia di p53. Analogamente a p53 , p73 e p63 sono in grado di indurre blocco del ciclo cellulare e apoptosi. Poiché p53 é mutato nel 50% dei tumori umani, la regolazione dell’espressione di p73 e p63 potrebbe

V

Alleanza Contro il Cancro (ACC) – Istituto Superiore di Sanità (ISS) Art.3 DM 21 luglio 2006 - Programma Straordinario di Ricerca Oncologica 2006Programma 3 “Rete solidale e collaborazioni internazionali”essere determinante per un efficente risposta apoptotica in seguito a trattamento con agenti chemioterapici. L’uso di tale inibitore,

aumentando i livelli endogeni di p63 e p73 dovrebbe sensibilizzare le cellule tumorali a diversi trattamenti chemioterapici inducendo la risposta apoptotica. Oltre a p63/p73, Itch reprime la via di Hedgehog e dei suoi trasduttori la cui attivazione è frequentemente responsabile dell’insorgenza di tumori neuroectodermici. Itch è quindi un candidato ideale per la terapia oncologica, finora totalmente inesplorato in questi tipo di tumori (U03)Oltre ai farmaci anti-Itch per regolare i livelli di p63/p73, genereremo inibitori delle interazioni molecolari di p73. Sono stati identificati peptidi sintetici (U02) (che rappresentano la sequenza del dominio di legame specifico al DNA della proteina p73) che interagendo con la proteina p53 mutata ripristinano la funzione apoptotica della proteina p73. Il bersaglio molecolare individuato è rappresentato dal complesso proteico mutp53/p73, la cui attività oncogenica ed il diretto coinvolgimento nella chemioresistenza di tumori a p53 mutata è stato documentato da vari studi in vitro ed in vivo. Analizzeremo la risposta tumorale alle combinazione farmacologiche dei peptidi con Transumab, Iressa, Avastin. Valuteremo l’indice apoptotico dopo trattamento con peptidi anti-p73 e bio-farmaci in cellule epiteliali. Creeremo nuovi modelli sperimentali (incluso topi nude/scid sottoposti a xenotrapianto di cellule di tumori umani) in vivo per la valutazione dell’efficacia terapeutica dei peptidi e delle associazioni con bio-farmaci. Ci proponiamo di caratterizzare Oltre ad usare Itch come target farmacologico diretto, è possibile ipotizzare un’azione sinergica con altre molecole che regolano punti diversi della stessa via: cicline-chinasi dipendenti (CDK) e regolatori di IKK/NF-kB. Nelle cellule tumorali si riscontra quasi costantemente un’aumentata attività delle CDKs ela loro attivitá chinasica é necessaria per una corretta progressione del ciclo cellulare. Infatti i complessi cicline-chinasi dipendenti regolano le diverse fasi del ciclo cellulare e una modulazione negativa della loro attività/espressione può determinare blocco del ciclo cellulare e inibizione della crescita tumorale in vitro ed in modelli animali. Analogamente, la via di IKK/NF-kB è costitutivamente attivata nei tumori, dove NF-kB causa resistenza all'apoptosi indotta da farmaci antitumorali. I circuiti intracellualri delle chinasi cicline- dipendenti e di NF-kB sono connessi con p63 e p73. Infatti, p63 e p73 sono in grado di regolare il ciclo cellulare inducendo arresto della proliferazione, interagiscono con NF-kB e transattivano IKK. Ci proponiamo di utilizzare l’inibitore di Itch insieme ad inibitori delle chinasi cicline- dipendenti (U03) e/o inibitori di IKK/NF-kB (U02) in diversi tumori. L’uso sinergico di tali inibitori dovrebbe sensibilizzare ancor di piú l’apoptosi indotta da trattamenti chemioterapici. La regolazione farmacologia di Itch su p63/p73/Hedgehog/Gli ed eventuali sinergie con CDK/IKK/NF-kB è un’area totalmente inesplorata nel cancro ed in particolare nei tumori epiteliali. Inoltre, l’identificazione delle molecole coinvolte nella trasduzione del segnale migratorio mediato da RaLP (U02) consentirebbe potenzialmente di bloccare la migrazione e l’invasione delle cellule del melanoma attraverso l’uso di inibitori della funzione di RaLP, ma anche di quella delle molecole ad esso connesse.

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MODULO 2

COMPOSIZIONE DEL COSTO COMPLESSIVO DEL PROGETTO

Voci di costo e breve descrizione Totale di cui a carico dei fondi ministeriali

1. Personale dipendente _485000,00 NULLA

2. Personale a contratto/consulenza/borsa di studio _282000,00 _270000,00

3. Missioni 45700,00 _45700,00

4. Materiale di Consumo 550500,00_ __361500,00

5. Pubblicazioni/ organizzazione convegni, ecc. _400000___ __40000,00

6. Elaborazione dati (specificare) ___________ ___

7. Spese generali delle strutture coinvolte (specificare) _122800,00__ __104800,00

TOTALE 1526000,00__ 900000,00__

VII


MODULO 2

Curriculum Vitae del Coordinatore del progetto (max 2 pagine)( INDICARE ANCHE LE 10 PUBBLICAZIONI SCIENTIFICHE RITENUTE PIÙ SIGNIFICATIVE, CON PARTICOLARE RIFERIMENTO A QUELLE DELL’AREA TEMATICA SCIENTIFICA SULLA QUALE INSISTE IL PROGETTO) ADDRESS [email protected] (vox +39-06-20427299; fax +39-06-20427290)

Dept. Medicina Sperimentale, Universita' Tor Vergata, 00133 Roma, Italy.

PRESENT POSITION Professor of Molecular Biology, Faculty of Medicine, University of Rome-Tor Vergata, Italy.

EDITORIAL ACTIVITY (1). Editor-in-Chief, "Cell Death & Differentiation", Nature Publishing Group (Impact Factor 7.463) (www.nature.com/cdd). (2). Editorial Board of journals “Cell Cycle”, “Cancer Biology & Therapy”, “Molecular Neurobiology”.

BIOTECH/AGENCY ACTIVITY Consultant/Scientific Advisor for “Promark” (London, UK), “EiRx Therapeutics”, (Cork, Ireland), VIB - Belgium Molecular Biology Institute (Ghent, Belgium). Scientific Advisor for the Government of Italy (C.N.R.), Ireland (Science Foundation of Ireland) and Finland (Finish Academy).

EDUCATION 1978 M.D. (Rome). 1981 Spec Paediatrics (Rome). 1984 Ph.D. (London) 1985 Spec Oncology (Rome).

PREVIOUS POSITIONS 1979-1987. Chemical Pathology Dept., Charing Cross & Westminster Medical School., University of London. Research Fellow and later Senior Lecurer. 1988-1994 Research Fellow, University of Rome Tor Vergata.

SCIENTIFIC INTERESTS Programmed cell death (apoptosis) in neural and epidermal models: (1) role of p73 and p63, homolog of p53, (2) role of transglutaminases and their substrates.

(1) The p53/p63/p73 family. DNA damage elicit repair mechanisms involving the tumour suppressor gene p53. More recently, two additional members of the same family have been identified: p63 and p73. The molecular events driven by DNA damage to elicit the function of p63/p73 is investigated in vitro. In parallel, the transcriptional activity of p63/p73 is under scrutiny. The molecular mechanisms of apoptosis involving these two genes is also under investigation. Transgenic mice and knock for p63 or p73 is in progress.

(2) Molecular mechanisms of cell death in the skin. The death of keartinocytes is also known as, corneification, or formation of the cornified envelope. The molecular events are investigated in vitro and in animal models as well as in human pathologies. The role of transglutaminases (type 1, 2, 3, and 5) is investigated at biochemical level; their substrates (SPRs, loricrin, keratins) are also characterized. These proteins are also evaluated in the skin diseases including lamellar ichthyosis, palmoplantar kerathosis, pachionikya congenita, Vowinkel syndrome, Sjoegren-Larsson syndrome. Knock-out mice for the transglutaminases (1, 2) are completed, new ones (3, 5) are in progress.

SCIENTIFIC PUBLICATIONS GM has published 256 refereed papers. The cumulative impact factor is 1,359. The citations (5912 cites, ISI 2006) are an average of 23.09 citations per paper. The H-factor is 40 (40 papers with more than 40 citations). Most cited papers: Nature 1999. 399: 806 (461 cites), Nature 1997. 388: 432 (230 cites),J Exp Med 1998. 188: 1763 (217 cites), Mol Cell Biol 1994. 14: 6584 (206 cites), J Cell Sci 2000. 113: 1661 (192 cites).

RELEVANT PAPERS1. Melino G , Bernassola F, Corasaniti MT, Knight RA, Nistico G, Finazzi-Agro A. S-nitrosylation regulates apoptosis. Nature. 1997. 388: 432-

433.2. Gong JG, Costanzo A, Yang HQ, Melino G, Kaelin WG, Levrero M, Wang JYJ. Regulation of the p53 homolog p73 by c-Abl tyrosine kinase

in cell death response to cisplatin. Nature. 1999. 399: 806-809.3. De Laurenzi V, Melino G. The little devil of death. Nature. 2000. 406: 135-136.4. Melino G. The Syren’s song (Concept: apoptosis). Nature. 2001. 412:23.5. Melino G. A thirst for knowledge: Gerry Melino. (lifelines). Nature. 2003. 421: 697. 6. Melino G, De Laurenzi V, Vousden KH. p73 and cancer. Nature Review Cancer. 2002. 2: 605-6157. Candi E, Schmidt R, Melino G.. The cornified envelope: a model of cell death in the skin. Nature Reviews Molecular Cellular Biology.

2005. 6: 328-340.8. Melino G, Lu X, Gasco M, Crook T, Knight RA. Functional regulation of p63 and p73: development and cancer. Trends in Biochemical

Sciences. 2003. 28 (12): 663-670. 9. De Laurenzi V, Costanzo A, Barcaroli D, Terrinoni A, Falco M, Annicchiarico-Petruzzelli M, Levrero M, Melino G. Two new p73 splice

variants, gamma and delta, with different transcriptional activity. Journal Experimental Medicine. 1998. 188: 1763-1768. 10. Bernassola F, Salomoni P, Oberst A, Di Como CJ, Pagano M, Melino G, Pandolfi PP. Ubiquitin-dependent degradation of p73 is inhibited

by PML. Journal Experimental Medicine. 2004. 199 (11): 1545-57. 11. Nicotera P, Melino G. Neurodevelopment on route p63 Neuron. 2005. 48 (5): 707-709.12. Cassidy AJ, van Steensel MAM, Steijlen PM, van Geel M, van der Velden J, Morley SM, Terrinoni A, Melino G, Candi E, McLean WHI. A

homozygous missense mutation in TGM5 abolishes epidermal transglutaminase 5 activity and causes acral peeling skin sindrome. Am J Hum Genet. 2005. 77: 909-917.

13. Rossi M, De Laurenzi V, Munarriz E, Green DR, Liu Y-C, Vousden KH, Cesareni G, Melino G. The ubiquitin-protein ligase Itch regulates p73 stability. EMBO Journal. 2005. 24 (4): 836-848.

VIII

Alleanza Contro il Cancro (ACC) – Istituto Superiore di Sanità (ISS) Art.3 DM 21 luglio 2006 - Programma Straordinario di Ricerca Oncologica 2006Programma 3 “Rete solidale e collaborazioni internazionali”14. Gressner O, Schilling T, Lorenz K, Schleithoff ES, Koch A, Schultze-Bergkamen H, Lena AM, Candi E, Terrinoni A, Catani MV, Oren M,

Melino G, Krammer PH, Stremmel W, Mueller M Tap63a induces apoptosis by activating signaling via death receptors and mitochondria. EMBO Journal. 2005. 24 (13): 2458-71.

15. Viganó M, Lamartine J, Testoni B, Merico D, Alotto D, Castagnola C, Robert A, Candi E, Melino G, Gidrol X, Mantovani R. New p63 targets in keratinocytes identified by genome-wide approach. EMBO J. 2006. 25: 5105-16.

16. Melino G . , Annicchiarico M., Piredda L., Candi E., Gentile V., Davies P.J.A., Piacentini M. tissue-Transglutaminase and apoptosis: sense and antisense transfection studies in human neuroblastoma cells. Molecular Cellular Biology. 1994. 14,10: 6584-96.

17. DeLaurenzi V, Melino G. Gene disruption of transglutaminase2. Molecular Cellular Biology. 2001. 21:148-55.18. Munarriz E, Barcaroli D, Stephanou A, Townsend PA, Maisse C, Terrinoni A, Neale MH, Martin SJ, Latchman DS, Knight RA, Melino G, De

Laurenzi V. PIAS-1 is a checkpoint regulator which affects exit from G1 and G2 by sumoylation of p73. Molecular Cellular Biology. 2004. 24(24):10593-610.

19. Szondy Z, Sarang Z, Molnar P, Németh T, Piacentini M, Mastroberardino PG, Falasca L, Aeschlimann D, Kovacs J, Kiss I, Szegezdi E, Birckbichler PJ, Melino G and Fésüs L. TGase2 -/- mice reveal a phagocytosis-associated crosstalck between macrophages and apoptotic cells. PNAS -USA. 2003. 100 (13): 7812-7817.

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22. Barcaroli D, Dinsdale D, Neale MH, Buongiorno-Borbone L, Ranalli M, Munarriz E, Sayan AE, McWilliam J, Smith TM, Fava E, Knight RA, Melino G, De Laurenzi V. FLASH is an essential component of the Cajal bodies. PNAS-USA. 2006. 103, 40: 14802-14807.

23. Barcaroli D, Buongiorno L, Terrinoni A, Rossi M, Knight RA, Matera AG, Melino G, De Laurenzi V. FLASH is required for histone transcription and S-phase progression. PNAS -USA. 2006. 103, 40: 14808-14812.

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26. Oberst A, Malatesta M, Aqueilan RI, Rossi M, Salomoni P, Murillas R, Sharma P, Kuehn MR, Oren M, Croce CM, Bernassola F, Melino G. The Nedd4 Binding Partner 1 (N4BP1) protein is an inhibitor of the E3 ligase Itch. PNAS -USA. 2007. 104, 27: 11280-11285.

27. Candi E., Melino G., GP. Mei, Tarcsa E., Chung SI, Marekov LN., Steinert PM. Biochemical, structural and transglutaminase substrate properties of human loricrin, the major epidermal cornified cell envelope protein. JBC. 1995. 270,44: 26382-26390.

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29. Candi E, Melino G, Lahm A, Ceci R, Rossi A, Ciani B, Steinert PM. Transglutaminase 1 mutations in Lamellar Ichthyosis: loss of activity due to failure of activation by proteolytic processing. JBC. 1998. 273: 13693-13702.

30. De Laurenzi V, Raschella' G, Barcaroli D, Annicchiarico-Petruzzelli M, Ranalli M, Catani MV, Tanno B, Costanzo A, Levrero M, Melino G . Induction of neuronal differentiation by p73, in a neuroblastoma cell line. JBC. 2000. 275 (20): 15226-15231.

31. Maccarrone M, Lorenzon T, Bari M, Melino G, Finazzi-Agro A. Anandamide induces apoptosis in human cells via vanilloid receptors. Evidence for a protective role of cannabinoid receptors. JBC. 2000. 275 (41): 31938-45.

32. Candi E, Oddi S, Terrinoni A, Paradisi A, Ranalli M, Finazzi-Agro' A, Melino G. Transglutaminase 5 cross-links loricirn, involucrin and SPRs during epidermal differentiation. JBC. 2001. 276 (37): 35014-35023.

33. Verderio EA, Telci D, Okoye A, Melino G, Griffin M. A novel RGD-independent cell adhesion pathway mediated by fibronectin-bound tissue transglutaminase rescues cells from anoikis. JBC. 2003. 278 (43): 42604-14

34. Melino G, Bernassola F, Ranalli M, Yee K, Zong WX, Corazzari M, Knight RA, Green DR, Thompson C, Vousden KH. p73 induces apoptosis via PUMA transactivation and Bax mitochondrial translocation. JBC. 2004. 279 (9): 8076-83.

35. Flinterman M, Guelen L, Ezzati-Nik S, Killick R, Melino G, Tominaga K, Gäken J, Tavassoli M. E1A mediates p53 independent transcriptional activation of the p73 and p53 apoptotic target Noxa.. JBC. 2005. 280: 5945-59.

36. Sayan BS, Sayan AE, Knight RA, Melino G, GM Cohen. p53 is cleaved by caspases generating fragments localizing to mitochondria. JBC. 2006. March 10. In Press (PMID: 16531411)

37. Bellodi C, Kindle K, Bernassola F, Dinsdale D, Cossarizza A, Melino G, Heery D, Salomoni P. Cytoplasmic function of mutant PML and PML-RARa. JBC. 2006. March 10. In Press (PMID: 16540467)

PATENTS FOR INVENTION1. Rosato N., Melino G., Mei G.P., Finazzi-Agro' A. Metodo utilizzabile nella misurazione della fluidita' delle membrane cellulari mediante

l'intensita' di fluorescenza della sonda Laurdan. Italy , C.N.R. FC.37845/267D. 1992.2. Melino G , Catani V, Bernassola F, Avigliano L, Finazzi-Agro' A, Cotter T, Hayes I. Modulation of cutaneous growth.

US 8654/1140. 2000.3. Melino G , De Laurenzi V, Bernassola F, Tobler A, Grob T, Hayes I. Human Delta-N p73 molecules and uses thereof.

US 16599/003. 2001.Melino G, Salomoni P, Rossi M. Regulation of ubiquitinin degradation of transcvription factors p73 & p6

IX


MODULO 3

MODULO 3: DESCRIZIONE DEL CONTRIBUTO DI CIASCUNA UNITÀ OPERATIVA(Compilare un modulo per ciascuna UO)

UNITÀ OPERATIVA: __________UO1 __________________________________________________________

RESPONSABILE SCIENTIFICO: Prof. Gerry Melino _____________________________________________________

struttura di appartenenza : ___IDI-IRCCS_____ funzione: ____Direttore Laboratorio di Biochimica_

indirizzo : ______Via Monti di Creta 104_______________________________________________

N. tel:__0672596469__ N. fax:_____0620427290________

indirizzo E-mail: [email protected]___________

RAPPRESENTANTE LEGALE: nominativo:____Dott. Eugenio Luchetti______________

CONTRIBUTO SPECIFICO FORNITO AL PROGETTO (max 2000 caratteri) (1770)L’obiettivo principale di questo progetto é quello di sviluppare nuove molecole inibitorie della E3-ubiquitina-ligasi Itch e di validare tali molecole nella via p63/p73. Il progetto é suddiviso nei seguenti obiettivi specifici.

1) Valutazione dell’espressione di p63/p73/Itch in tumori cutanei/linfomi. . Questo studio sarà principalmente condotto dapprima su diverse linee cellulari tumorali e successivamente su biopsie di pazienti. Questo approccio permetterà una correlazione clinica tra l’espressione di questi marcatori ed il decorso clinico della malattia.

2) Studio delle proprietà biochimiche delle proteine leganti/regolanti ITCH. Tali proteine includono YAP, Wwox e N4BP1. Si studierá l’espressione di tali proteine in cellule tumorali e in biopsie di pazienti in correalazione con l’espressione di Itch, p63 e p73. L’espressione di YAP, Wwox e N4BP1 sará analizzata anche in seguito a trattamento con diversi farmaci chemioterapici.

3) Generazione topi transgenici. che esprimono alti livelli di p63 nei tessuti epiteliali. I topi verranno utilizzati allo scopo di studiare l’insorgenza di tumori. Sono giá presenti nel nostro laboratorio topi p63-/-, p73-/- ed Itch-/- .

4) Identificazione di inibitori della E3 Ligasi Itch. L’ “hightroughput screening” su 35000 molecole sintetiche, ha identificato 48 molecole capaci di inibire 70% dell’auto-ubiquitinazione di Itch. Abbiamo selezionato 6 molecole sottoposte a test in vitro per la specificità di substrato, utilizzando controlli negativi -Nedd4 e Mdm2. Verrà effettuata la validazione degli inibitori di Itch a livello biochimico,cellulare e murino.Studieremo citotossicità degli inibitori-Itch su linee Tet-On esprimenti p63/p73. Valuteremo la degradazione di p63/p73, ± inibitore, durante l’azione di chemioterapici, misurando apoptosi e ciclo cellulare. Inoltre, genereremo nuovi modelli animali over-esprimenti isoforme cutanee inducibili di p63 per studiare tumorigenesi in vivo e l’efficacia degli inibitori. Topi p63-/-, p73-/- ed Itch-/- sono già presenti nel nostro laboratorio.

METODOLOGIA (max 4000 caratteri) (3300)Obiettivo 1. Analizzeremo l’espressione di Itch endogeno in seguito a vari trattamenti chemioterapici, In particolare useremo chemioterapici come il cisplatino, etoposide, taxolo e UVB (tipicamente alle dosi di 5-20 M, 10-25 M, 25-100 nM, and 30J/m2 rispettivamente) per 24 ore. Abbiamo a disposizione diverse linee di cellule di melanomi di diverse caratteristiche istologiche. In parallelo, analizzeremo i livelli di p63 e p73 per Western Blot. Per escludere che p63 e p73 possono essere regolati a livello trascrizionale, analizzeremo l’espressione di p63 e p73 per “real time PCR” in seguito a trattamento chemioterapico.Obiettivo 2. Analizzeremo l’espressione di YAP, Wwox e N4BP1. in seguito a vari trattamenti chemioterapici come il cisplatino, etoposide, taxolo e UVB (tipicamente alle dosi di 5-20 M, 10-25 M, 25-100 nM, and 30J/m2 rispettivamente) per 24 ore. Valuteremo l’ipotesi che tali proteine leganti ITCH possano regolare, o positivamente o negativamente, la funzione di ITCH. Si eseguiranno saggi di in vivo ubiquitinazione trasfettando HEK293 con vettori di espressione per ITCH, per p63/p73 in combinazione con YAP, Wwox e N4BP1. Utilizzeremo saggi di “RNA interference” per analizzare l’effetto dell’ inibizione di YAP, Wwox e N4BP1 su p63/p73/ e proteine Gli.

X


Obiettivo 3. Nel nostro laboratorio sono giá presenti topi p63-/-, p73-/- ed Itch-/-. Genereremo topi transgenici per p63 utilizzando la tecnologia precedentemente usata nel nostro laboratorio. In breve il gene p63 verrá clonato a valle del promotore della cheratina 14 per indurre l’espressione di p63 unicamente nello strato basale dell’ epidermine. Analizzeremo l’espressione di p63 esogeno sia per RT-PCR che per immunoistochimica utilizzando sezioni dell’epidermide. Obiettivo 4. Una libreria di circa 35000 molecole sintetiche é stata analizzata in duplicato per identificare molecole inibitrici dell’E3 ligasi ITCH. Per questa analisi abbiamo utilizzato un saggio immunologico di chemioluminescienza per quantificare gli effetti inibitori delle varie molecole. In breve, la proteina di fusione GST-ITCH é stata purificata da batteri e poi immobilizzata su delle piastre rivestite con glutatione. Successivamente, la proteina GST-ITCH immobilizzata é stata incubata con un buffer di reazione (50mM Tris-HCl ph 8.0, 100mM NaCl, 5mM MgCl2, 1mM ATP, 2mM DTT) che contiene l’enzima purificato E1, E2 e una versione Flag tag dell ubiquitina. Infine é stato effettuato un saggio ELISA utilizzando un anticorpo monoclonale anti-FLAG (M2 Sigma) coniugato con la perossidasi. Da questo “hightroughput screening” sono state identificate 48 molecole capaci di inibire 70% dell’auto-ubiquitinazione di Itch ad una concentrazione di 10 M. Abbiamo selezionato 6 molecole sottoposte a test in vitro per la specificità di substrato, utilizzando come controlli negativi le E3 ligasi Nedd4 e Mdm2. Tali molecole sono state poi utilizzate per l’analisi in vitro sui substrati di ITCH. Abbiamo utilizzato delle linee di osteosarcoma SAOS inducibili per le isoforme TA e N di p63 e p73. Tali cellule sono state indotte con con doxiciclina (2,5 m/ml), raccolte dopo 24 ore e il loro estratto proteico é stato incubato per 2 ore a 4 con GST-ITCH. Il complesso é stato poi purificato tramite “GST pulldown” e sottoposto ad una reazione di in vitro ubiquitinazione in presenza o assenza delle molecole identificate. .Infine, si studieranno gli eventuali effetti citotossici degli inibitori-Itch su diverse linne cellulari. Valuteremo la degradazione di p63/p73, ± inibitore, durante l’azione di chemioterapici, misurando apoptosi e ciclo cellulare tramite analisi al Facs. Contemporaneamente, si analizzeranno nelle cellule trattate con le diverse molecole i livelli dell’espressione endogena di p73 e p63. Si utilizeranno linee cellulari come le Cos-1, SH-SY5Y, HEP3B e HaCat che esprimono livelli endogeni di p73 e p63.

XI


MODULO 3

COMPOSIZIONE DEL COSTO DELL’UNITÀ OPERATIVA Voci di costo e breve descrizione Totale di cui a carico dei fondi ministeriali

1. Personale dipendente _150000,00 NULLA_______________________________________________________________________________________________________________________________________

2. Personale a contratto/consulenza/borsa di studio __87000,00 _75000,00_1 borsista 1addetto al coordinamento progetto per 3 anni_______________________________________________________________________________________________________________________________________ 3. Missioni 20000,00 _20000,00________________________________________________________________________________________________________________________________________

4. Attrezzature (solo a noleggio o leasing): 30000,00 _30000,00____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

5. Materiale di consumo _260000,00__ _208000,00____________________________________________________________________________________________________________________________________

6. Pubblicazioni / organizzazione convegni, ecc. _32000,00_ __32000,00 ___________________________________________________________________________________________________________________________________

7. Elaborazione dati (specificare) __________ _______0______________________________________________________________________________________________________________________________________

8. Spese generali delle strutture coinvolte (specificare) _64000,00__ ___55000,00__________________________________________________________________________________________________________________________________

TOTALE __643000,00____ _420000,00__

XII


MODULO 3

Curriculum Vitae del Responsabile Scientifico dell’Unità Operativa (max 1 pagina)(PERIODO DI RIFERIMENTO: ULTIMI 5 ANNI; INDICARE ANCHE LE 10 PUBBLICAZIONI SCIENTIFICHE RITENUTE PIÙ SIGNIFICATIVE, CON PARTICOLARE RIFERIMENTO A QUELLE DELL’AREA TEMATICA SCIENTIFICA SULLA QUALE INSISTE IL PROGETTO)

Vedi Curriculum responsabile del Progetto

XIII


MODULO 3BIS

MODULO 3BIS: DESCRIZIONE DEL CONTRIBUTO DI CIASCUN GRUPPO DI RICERCA(Si devono presentare tanti moduli 3bis quanti sono i gruppi di ricerca coinvolti)

GRUPPO DI RICERCA: __UO01- Laboratorio di Biochimica_________________________________________________

RESPONSABILE SCIENTIFICO: Prof. Gerry Melino

struttura di appartenenza : ___IDI-IRCCS ____ funzione: ___Direttore__

indirizzo : _Via Monti di Creta 104____________________________________________

N. tel:__0672596976___ N. fax:___0620427290______

indirizzo E-mail: [email protected]________

RAPPRESENTANTE LEGALE: nominativo:___Eugenio Luchetti______

CONTRIBUTO SPECIFICO FORNITO AL PROGETTO (max 500 caratteri) (547)

Questo gruppo di ricerca si occuperá dei seguenti obiettivi:

1) Valutazione dell’espressione di p63/p73/Itch in tumori cutanei/linfomi. Questo studio sarà principalmente condotto dapprima su diverse linee cellulari tumorali e successivamente su biopsie di pazienti. Questo approccio permetterà una correlazione clinica tra l’espressione di questi marcatori ed il decorso clinico della malattia.

2) Studio delle proprietà biochimiche delle proteine leganti/regolanti ITCH. Tali proteine includono YAP, Wwox e N4BP1.

3) Identificazione di inibitori della E3 Ligasi Itch.

4) Validazione degli inibitori di Itch a livello biochimico.

METODOLOGIA (max 1000 caratteri) (1030)

Obiettivo 1. Analizzeremo l’espressione di Itch endogeno in diverse linee di cellule di melanomi di diverse caratteristiche istologiche in seguito a vari trattamenti chemioterapici, In particolare useremo chemioterapici come il cisplatino, etoposide, taxolo e UVB (tipicamente alle dosi di 5-20 M, 10-25 M, 25-100 nM, and 30J/m2 rispettivamente). Obiettivo 2. Analizzeremo l’espressione di YAP, Wwox e N4BP1. in seguito a vari trattamenti chemioterapici (vedi Obiettivo 1). Si eseguiranno saggi di in vivo ubiquitinazione trasfettando HEK293 con vettori di espressione per ITCH, per p63/p73 in combinazione con YAP, Wwox e N4BP1. Obiettivo 3. Una libreria di circa 35000 molecole sintetiche é stata analizzata tramite un saggio immunologico di chemioluminescienza per identificare molecole inibitrici di ITCH. In breve, la proteina di fusione GST-ITCH é stata immobilizzata su delle piastre rivestite con glutatione e poi incubata con un buffer di reazione (50mM Tris-HCl ph 8.0, 100mM NaCl, 5mM MgCl2, 1mM ATP, 2mM DTT) che contiene l’enzima purificato E1, E2 e Flag-ubiquitina. Infine é stato effettuato un saggio ELISA utilizzando un anticorpo monoclonale anti-FLAG coniugato con la perossidasi.

XIV


MODULO 3BIS


COMPOSIZIONE DEL COSTO DEL GRUPPO DI RICERCAVoci di costo e breve descrizione Totale di cui a carico dei fondi ministeriali

1. Personale dipendente 120000,00_ NULLA_______________________________________________________________________________________________________________________________________

2. Personale a contratto/consulenza/borsa di studio _75000,00__ _75000,00_1 Borsista ricercatore 1 contratto per coordizazione progettto_________________________________________________________________________________________________________________________________________ 3. Missioni __15000,00 15000,00_______________________________________________________________________________________________________________________________________

4. Attrezzature (solo a noleggio o leasing): _30000,00 30000,00__Imager per Immufluorescenza____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

5. Materiale di consumo _180000,00 _139000,00_____________________________________________________________________________________________________________________________________

6. Pubblicazioni / organizzazione convegni, ecc. _30000,00__ _30000,00_ ___________________________________________________________________________________________________________________________________

7. Elaborazione dati (specificare) ___0_______ _0_________________________________________________________________________________________________________________________________

8. Spese generali delle strutture coinvolte (specificare) _60000,00__ _51000,00___________________________________________________________________________________________________________________________________

TOTALE _510000,00__ ___340000,00__

XV



GRUPPO DI RICERCA: ____UO01-UTV_____________________________

RESPONSABILE SCIENTIFICO: Dr. Eleonora Candi______________________________________________________

struttura di appartenenza : ___Univ Tor Vergata Dip Med Sperim_____ funzione: __Ricercatore___

indirizzo : ____Via Montpellier 1__________________________________________________

N. tel:__0672596487 N. fax:_____0620427290_____

indirizzo E-mail: __________________________________________

RAPPRESENTANTE LEGALE: nominativo:_____Prof Alessandro Finazzi Agrò___________

CONTRIBUTO SPECIFICO FORNITO AL PROGETTO (max 500 caratteri)

Questo gruppo di ricerca si occuperá dei seguenti obiettivi:1) Generazione topi transgenici. che esprimono alti livelli di p63 nei tessuti epiteliali. I topi verranno utilizzati allo

scopo di studiare l’insorgenza di tumori. Sono giá presenti nel nostro laboratorio topi p63-/-, p73-/- ed Itch-/- . 2) Studio degli effetti citotossici degli inibitori-Itch su linee Tet-On esprimenti p63/p73. Valuteremo la degradazione di

p63/p73, ± inibitore, durante l’azione di chemioterapici, misurando apoptosi e ciclo cellulare. Tali studi verranno condotti anche utilizzando topi transgenici sopradescritti.

METODOLOGIA (max 1000 caratteri)

Obiettivo 1. Nel nostro laboratorio sono giá presenti topi p63-/-, p73-/- ed Itch-/-. Genereremo topi transgenici per p63 utilizzando la tecnologia precedentemente usata nel nostro laboratorio. In breve il gene p63 verrá clonato a valle del promotore della cheratina 14 per indurre l’espressione di p63 unicamente nello strato basale dell’ epidermine. Analizzertemo l’espressione del 63 esogeno sia per RT-PCR che per immunoistichimica utilizzando sezioni dell’epidermide. Obiettivo 2. SI anlizzeranno gli effetti citotossici e/o anti proliferativi delle molecole inibitorie di ITCH identificate nell’Obiettivo 2 del gruppo di Ricerca del Prof. Gerry Melino utilizzando diverse linne cellulari. Valuteremo la degradazione di p63/p73, ± inibitori, durante l’azione di chemioterapici, misurando apoptosi e ciclo cellulare tramite analisi al FACS. Contemporaneamente, si analizzeranno nelle cellule trattate con le diverse molecole i livelli dell’espressione endogena di p73 e p63. Si utilizeranno linee cellulari come le Cos-1, SH-SY5Y, HEP3B e HaCat che esprimono livelli endogeni di p73 e p63.

XVI


MODULO 3BIS



2. Personale a contratto/consulenza/borsa di studio 12000,00_ __0__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 3. Missioni _5000,00 _5000,00________________________________________________________________________________________________________________________________________

4. Attrezzature (solo a noleggio o leasing): ___0_____ ___0_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

5. Materiale di consumo __80000,00_ 69000,00____________________________________________________________________________________________________________________________________

6. Pubblicazioni / organizzazione convegni, ecc. _2000,00_ __2000,00____ ___________________________________________________________________________________________________________________________________

7. Elaborazione dati (specificare) __0________ _______0______________________________________________________________________________________________________________________________________

8. Spese generali delle strutture coinvolte (specificare) _4000,00___ __4000,00___________________________________________________________________________________________________________________________________

TOTALE _133000,00_ __80000,00_

XVII



UNITÀ OPERATIVA: UO02

RESPONSABILE SCIENTIFICO: BLANDINO GIOVANNI______________________

struttura di appartenenza : Istituto Nazionale Tumori Regina Elena funzione: Dirigente Medico di I Livello

indirizzo : via delle messi d’oro 156 00158 Roma________________________________________________________

N. tel:+39 06 52662522_____________ N. fax: +39 0652662505__________________________

indirizzo E-mail: [email protected] __________________________________________

RAPPRESENTANTE LEGALE: nominativo: Dr Marino Nonis (Direttore Generale)

CONTRIBUTO SPECIFICO FORNITO AL PROGETTO (max 2000 caratteri) L'efficacia terapeutica dei farmaci anti-tumorali é strettamente legata alla loro capacita' di indurre l'apoptosi delle cellule tumorali. Diversi farmaci usati comunemente nella terapia dei tumori sono capaci di attivare la proteina p53, un potente attivatore del processo apoptotico. Sono stati identificati peptidi sintetici (che rappresentano la sequenza del dominio di legame specifico al DNA della proteina p73) che interagendo con la proteina p53 mutata ripristinano la funzione apoptotica della proteina p73. Il bersaglio molecolare individuato è rappresentato dal complesso proteico mutp53/p73, la cui attività oncogenica ed il diretto coinvolgimento nella chemioresistenza di tumori a p53 mutata è stato documentato da vari studi in vitro ed in vivo. La possibile combinazione dei peptidi con bio-farmaci (Trastuzumab, Iressa, Avastin) offre la possibilità di colpire specificamente e contemporaneamente diversi bersagli molecolari la cui alterata regolazione contribuisce al mantenimento del fenotipo trasformato della cellula tumorale. Ci proponiamo inoltre di caratterizzare il ruolo del sistema IKK/NF-B nel meccanismo molecolare alla base della disregolazione della sopravvivenza in cellule tumorali, con il duplice obiettivo di caratterizzare nuovi bersagli molecolari per la terapia del cancro, e di identificare piccole molecole ciclopentenoniche con attività pro-apoptotica in neoplasie resistenti alla chemio- e radio-terapia. Come modello verranno utilizzati diversi tipi di melanoma e di carcinoma mammario (CM) umani. Nello studio proposto da questa unità inoltre verranno studiati altri bersagli rappresentati 1) dalla valutazione del pattern di espressione di RaLP all’interno dei diversi tipi di melanoma e delle sue varianti cliniche in funzione della capacità migratoria delle cellule che compongono il tumore; 2) dall’identificazione delle molecole coinvolte nella trasduzione del segnale migratorio mediato da RaLP. L’inibizione della funzione di RaLP, ma anche di quella delle molecole ad esso connesse, consentirebbe potenzialmente di bloccare la migrazione e l’invasione delle cellule del melanoma.


Analisi della risposta di cellule tumorali alle combinazione farmacologiche dei peptidi con Transumab, Iressa, Avastin.L’indice apoptotico di cellule SKBR3 e T47D dopo trattamento con peptidi e bio-farmaci verrà valutato mediante analisi citofluorimetriche, TUNEL, Annessina V, e la comparsa della forma frammentata di PARP. Esperimenti di immunoprecipitazione della cromatina verificheranno se l’eventuale aumento della morte cellulare indotta dal cisplatino e dall’etoposide dopo pretrattamento con la miscela dei peptici, sia dovuto alla capacità di p73 di attivare più efficientemente i geni bersaglio.

Modelli sperimentali in vivo per la valutazione dell’efficacia terapeutica dei peptici e delle associazioni con bio-farmaci

XVIII

Alleanza Contro il Cancro (ACC) – Istituto Superiore di Sanità (ISS) Art.3 DM 21 luglio 2006 - Programma Straordinario di Ricerca Oncologica 2006Programma 3 “Rete solidale e collaborazioni internazionali”I gruppi di animali previsti in questa fase sono:1) animali trattati con soluzione fisiologica, 2) animali trattati con peptidi di uguale chimica ma sequenza casuale non specifica, 3) animali trattati con le molecole di interesse.Gli end-points di questa fase da valutare sono; i)variazioni di peso corporeo ii) variazioni di attività normali (aggressività, capacità riproduttiva, ecc.)E’ importante, in questo contesto, tener presente che queste molecole, a differenza dei classici chemioterapici, possono anche non presentare tossicità alle dosi efficaci in quanto target specifici di molecole ben identificate di processi cellulari peculiari delle cellule tumorali. Infatti, come indicato dal “commentary” del NCI (1999) per questi composti è da rivedere e valutare quali devono essere gli end-points più idonei per la valutazione dell’efficacia terapeutica in “vivo”.Gli end-points nella fase successiva saranno considerati: farmacocinetica, inibizione del target sia in modo diretto o indiretto; massima dose tollerata in base alla tossicità classica e minima dose effettiva.Su animali portatori della neoplasia umana “target” dei peptidi, sia trattati che nei gruppi di controllo non trattati, saranno effettuati studi di farmacocinetica e farmacodistribuzione mediante analisi dei peptidi con HPLC. In questo contesto i più significativi end-points potrebbero essere rappresentati dalla capacità induttiva a varie dosi degli effetti molecolari desiderati valutabili, macroscopicamente, come inibizione della crescita neoplastica, e dal punto di vista molecolare su biopsie da tessuti neoplastici trattati e non, mediante studi di genomica e proteomica riferiti alle molecole coinvolte nei processi biologici in cui i peptidi sintetici interferiscono.Per caratterizzare il meccanismo di "cross-talk" tra HSF e NF-kB, e definire l'importanza dell'interazione dei 2 pathways nel controllo dell’apoptosi indotta da chemioterapici e ciclopentenoni antitumorali, verranno utilizzate tecniche di silencing di HSF1 o della subunità p65 di NF-kB attraverso shRNA interference, e verrà determinato l’effetto del silenziamento sull’espressione di un pannello di geni pro-infiammatori, pro- e anti-apoptotici, e di proteine con funzione di chaperones. Verra’ studiato l’effetto del silencing sul controllo dell’inizio della traduzione attarverso l’analisi dello stato funzionale di fattori quali eIF2a, eIF4E e eIF4E-BPs.Colture primarie di melanociti verranno utilizzate per studiare la risposta migratoria e proliferativa a segnali extracellulari, sia mitogenici, sia motogenici, sia di stress, quali UV. La coltura in vitro di queste popolazioni cellulari consentirà la manipolazione genetica una volta identificati i partners molecolari della risposta cellulare.Analisi dell’espressione genica. L’RNA e i lisati proteici estratti dalle cellule in coltura, ma anche dai campioni bioptici verranno utilizzati per effettuare l’analisi dell’espressione di RaLP durante le varie fasi della progressione neoplastica. In particolare, verrà condotto uno studio sui campioni di nevi e melanomi conservati in paraffina, analizzando anche i linfonodi sentinella utilizzati per verificare la metastatizzazione di alcuni casi di melanoma.

XIX


MODULO 3


1. Personale dipendente _215000,00 NULLA_______________________________________________________________________________________________________________________________________

2. Personale a contratto/consulenza/borsa di studio _105000,00 105000,00____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 3. Missioni _9000,00 _9000,00_______________________________________________________________________________________________________________________________________

4. Attrezzature (solo a noleggio o leasing): ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

5. Materiale di consumo _160000,00_ 124000,00____________________________________________________________________________________________________________________________________

6. Pubblicazioni / organizzazione convegni, ecc. _8000,00_ _8000,00__ ___________________________________________________________________________________________________________________________________

7. Elaborazione dati (specificare) __________ _____________________________________________________________________________________________________________________________________________

8. Spese generali delle strutture coinvolte (specificare) __33000,00________ _24000,00____________________________________________________________________________________________________________________________________

TOTALE __530000,00___ _____270000,00

XX


MODULO 3


Nascita: Nato a Scicli il 02.07.1965Indirizzo: Dipartimento di Oncologia Sperimentale Istituto Nazionale Tumori Regina Elena IRCCS – Roma.Posizioni: 1990 Laurea in Medicina e Chirurgia1994 Diploma di Specializzazione in Oncologia1995 – 1999 Post-dottorato presso l’Istituto Weizmann 1999 - ad oggi group leader presso l'Istituto Regina Elena, Dipartimento di Oncologia Sperimentale, Roma.Posizione attuale: 2002 - ad oggi Dirigente di I° livello presso l'Istituto Regina Elena, Dipartimento di Oncologia Sperimentale, Roma.

Coordinatore di un progetto del IV programma quadro (1.1.1.ii.b “Combating Cancer”). Responsabile programmi di ricerca finanziati da CNR, AIRC, Telethon, Ministero della Sanità, FIRB.

Pubblicazioni di rilievo[1-25]

1. Strano, S., S. Dell'Orso, S. Di Agostino, G. Fontemaggi, A. Sacchi, and G. Blandino, Mutant p53: an oncogenic transcription factor. Oncogene, 2007. 26(15): p. 2212-9.

2. Bossi, G., E. Lapi, S. Strano, C. Rinaldo, G. Blandino, and A. Sacchi, Mutant p53 gain of function: reduction of tumor malignancy of human cancer cell lines through abrogation of mutant p53 expression. Oncogene, 2006. 25(2): p. 304-9.

3. 5. Di Agostino, S., S. Strano, V. Emiliozzi, V. Zerbini, M. Mottolese, A. Sacchi, G. Blandino, and G. Piaggio, Gain of function of mutant p53: the mutant p53/NF-Y protein complex reveals an aberrant transcriptional mechanism of cell cycle regulation. Cancer Cell, 2006. 10(3): p. 191-202.

4. Strano, S., O. Monti, N. Pediconi, A. Baccarini, G. Fontemaggi, E. Lapi, F. Mantovani, A. Damalas, G. Citro, A. Sacchi, G. Del Sal, M. Levrero, and G. Blandino, The transcriptional coactivator Yes-associated protein drives p73 gene-target specificity in response to DNA Damage. Mol Cell, 2005. 18(4): p. 447-59.

5. Fontemaggi, G., A. Gurtner, A. Damalas, A. Costanzo, Y. Higashi, A. Sacchi, S. Strano, G. Piaggio, and G. Blandino, deltaEF1 repressor controls selectively p53 family members during differentiation. Oncogene, 2005. 24(49): p. 7273-80.

6 Di Stefano, V., G. Blandino, A. Sacchi, S. Soddu, and G. D'Orazi, HIPK2 neutralizes MDM2 inhibition rescuing p53 transcriptional activity and apoptotic function. Oncogene, 2004. 23(30): p. 5185-92.

7. Rizzo, M.G., E. Giombini, D. Diverio, M. Vignetti, A. Sacchi, U. Testa, F. Lo-Coco, and G. Blandino, Analysis of p73 expression pattern in acute myeloid leukemias: lack of DeltaN-p73 expression is a frequent feature of acute promyelocytic leukemia. Leukemia, 2004. 18(11): p. 1804-9.

8. Strano, S., G. Fontemaggi, A. Costanzo, M.G. Rizzo, O. Monti, A. Baccarini, G. Del Sal, M. Levrero, A. Sacchi, M. Oren, and G. Blandino, Physical interaction with human tumor-derived p53 mutants inhibits p63 activities. J Biol Chem, 2002. 277(21): p. 18817-26.

9. Morena, A., S. Riccioni, A. Marchetti, A.T. Polcini, A.M. Mercurio, G. Blandino, A. Sacchi, and R. Falcioni, Expression of the beta 4 integrin subunit induces monocytic differentiation of 32D/v-Abl cells. Blood, 2002. 100(1): p. 96-106.

10. Fontemaggi, G., I. Kela, N. Amariglio, G. Rechavi, J. Krishnamurthy, S. Strano, A. Sacchi, D. Givol, and G. Blandino, Identification of direct p73 target genes combining DNA microarray and chromatin immunoprecipitation analyses. J Biol Chem, 2002. 277(45): p. 43359-68.

XXI



GRUPPO DI RICERCA: DIPARTIMENTO SPERIMENTALE ISTITUTO REGINA ELENA

RESPONSABILE SCIENTIFICO: BLANDINO GIOVANNI______________________

struttura di appartenenza : Istituto Nazionale Tumori Regina Elena funzione: Dirigente Medico di I Livello

indirizzo : via delle messi d’oro 156 00158 Roma________________________________________________________

N. tel:+39 06 52662522_____________ N. fax: +39 0652662505__________________________

indirizzo E-mail: [email protected] __________________________________________

RAPPRESENTANTE LEGALE: nominativo: Dr Marino Nonis (Direttore Generale)

CONTRIBUTO SPECIFICO FORNITO AL PROGETTO (max 500 caratteri) In precedenti studi abbiamo dimostrato che specifiche proteine p53 mutate trasdotte in cellule di adenocarcinoma polmonare umano ne provocano un aumento netto della chemioresistenza dopo trattamento con etoposide e cisplatino (3). Il nostro gruppo di ricerca si é specificamente focalizzato sull'identificazione di peptidi sintetici (che rappresentano la sequenza del dominio di legame specifico al DNA della proteina p73) che interagendo con la proteina p53 mutata ripristinano la funzione apoptotica della proteina p73. Studi in vitro hanno dimostrato che 2 peptidi (10aa) sono in grado di disassemblare il complesso proteico mutp53/p73 e di potenziare l’attività apoptotica del cisplatino e della adriamicina in linee cellulari derivate da carcinoma mammario umano.

METODOLOGIA (max 1000 caratteri)Analisi della risposta di cellule tumorali alle combinazione farmacologiche dei peptidi con Transumab, Iressa, Avastin.L’indice apoptotico di cellule SKBR3 e T47D dopo trattamento con peptidi e bio-farmaci verrà valutato mediante analisi citofluorimetriche, TUNEL, Annessina V, e la comparsa della forma frammentata di PARP. Esperimenti di immunoprecipitazione della cromatina verificheranno se l’eventuale aumento della morte cellulare indotta dal cisplatino e dall’etoposide dopo pretrattamento con la miscela dei peptici, sia dovuto alla capacità di p73 di attivare più efficientemente i geni bersaglio.Modelli sperimentali in vivo per la valutazione dell’efficacia terapeutica dei peptici e delle associazioni con bio-farmaciI gruppi di animali previsti in questa fase sono:1) animali trattati con soluzione fisiologica, 2) animali trattati con peptidi di uguale chimica ma sequenza casuale non specifica, 3) animali trattati con le molecole di interesse.Gli end-points di questa fase da valutare sono; i)variazioni di peso corporeo ii) variazioni di attività normali (aggressività, capacità riproduttiva, ecc.)Gli end-points nella fase successiva saranno considerati: farmacocinetica, inibizione del target sia in modo diretto o indiretto; massima dose tollerata in base alla tossicità classica e minima dose effettiva.

XXII


MODULO 3bis


1. Personale dipendente 100.000,00 NULLADirigente Medico I LivelloDirigente Biologo I LivelloTecnico di laboratorio

2. Personale a contratto/consulenza/borsa di studio _50000,00 50000,00____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 3. Missioni __5000,00 5000,00_______________________________________________________________________________________________________________________________________

4. Attrezzature (solo a noleggio o leasing): ________ 0,00____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

5. Materiale di consumo _38000,00_ 30000,00____________________________________________________________________________________________________________________________________

6. Pubblicazioni / organizzazione convegni, ecc. _5000,00 5000,00 ___________________________________________________________________________________________________________________________________

7. Elaborazione dati (specificare) __________ 0,00_________________________________________________________________________________________________________________________________

8. Spese generali delle strutture coinvolte (specificare) _ _ 0,00_________________________________________________________________________________________________________________________________

TOTALE _218000,00_ 90000,00


XXIII


GRUPPO DI RICERCA: _UO02-Santoro__________

RESPONSABILE SCIENTIFICO: Prof.ssa Gabriella Santoro_______________________________

struttura di appartenenza : _ Università di Roma Tor Vergata, Dipartimento di Biologia funzione: _Prof. Ordinario_

indirizzo : ____Via Della Ricerca Scientifica, 1______________________________________________

N. tel:___06.72594822_______ N. fax:_____06-72594821_____________________

indirizzo E-mail: [email protected]__________

RAPPRESENTANTE LEGALE: nominativo: Prof. Alessandro Finazzi Agrò, Rettore dell’Università degli Studi di Roma

“Tor Vergata”____________________________________________________________


Il presente progetto si propone di caratterizzare il ruolo del sistema IKK/NF-B nel meccanismo molecolare alla base della disregolazione della sopravvivenza in cellule tumorali, con il duplice obiettivo di caratterizzare nuovi bersagli molecolari per la terapia del cancro, e di identificare piccole molecole ciclopentenoniche con attività pro-apoptotica in neoplasie resistenti alla chemio- e radio-terapia. Come modello verranno utilizzati diversi tipi di melanoma e di carcinoma mammario (CM) umani. Gli obiettivi specifici includono: 1) la caratterizzazione del sistema IKK/NF-B e del pathway di HSF1 nei modelli prescelti; 2) l’identificazione dei segnali responsabili del “cross-talk” tra i fattori trascrizionali HSF1 e NF-B in questi tipi di tumori; 3) la caratterizzazione dell’attivita’ pro-apoptotica di ciclopentenoni naturali e di sintesi in modelli di melanoma e CM chemio- e radio-resistenti in vitro ed in vivo.


Per caratterizzare il meccanismo di "cross-talk" tra HSF e NF-kB, e definire l'importanza dell'interazione dei 2 pathways nel controllo dell’apoptosi indotta da chemioterapici e ciclopentenoni antitumorali, verranno utilizzate tecniche di silencing di HSF1 o della subunità p65 di NF-kB attraverso shRNA interference, e verrà determinato l’effetto del silenziamento sull’espressione di un pannello di geni pro-infiammatori, pro- e anti-apoptotici, e di proteine con funzione di chaperones. Verra’ studiato l’effetto del silencing sul controllo dell’inizio della traduzione attarverso l’analisi dello stato funzionale di fattori quali eIF2a, eIF4E e eIF4E-BPs. Inoltre verrà analizzata in dettaglio la cascata di attivazione di NF-kB e di HSF nelle varie condizioni sperimentali, con lo scopo di individuare nuovi possibili bersagli per farmaci pro-apoptotici. Data la mancanza di informazioni su un'eventuale attivazione costitutiva del pathway di HSF in cellule tumorali, verrà studiato il livello di fosforilazione e DNA-binding di HSF1 in differenti linee chemio-resistenti di CM e melanoma, caratterizzate o meno da regolazione aberrante di NF-kB.

XXIV



1. Personale dipendente 90.000 NULLA

Stipendi personale di ruolo_________________________________________________________________________________________________________________

2. Personale a contratto/consulenza/borsa di studio 35.000 35.000

1 Borsa di studio_______________________________1 Contratto ________________________________________________________________________________

3. Missioni 8.000 4.000

Iscrizione a Convegni e/o Congressi________________Spese di viaggio e soggiorno per riunioni scientifiche e/oPartecipazione a Convegni________________________

4. Attrezzature (solo a noleggio o leasing): __ _0___ ___0__________________________________________________________________________________________________________________________________________

5. Materiale di consumo 62.000 39.000

Materiali in plastica monouso, terreni per colture cellulari,reagenti per biochimica e biologia molecolare, anticorpi,materiale radioattivo_____________________________

6. Pubblicazioni / organizzazione convegni, ecc. 6.000 3.000

Estratti e spese di pubblicazione__________________________________________________________________________________________________________

7. Elaborazione dati (specificare) ___0___ ___0____________________________________________________________________________________________________________________________________

8. Spese generali delle strutture coinvolte (specificare) 12.000 9.000

Spese Dipartimentali (10%)________________________________________________________________________________________________________

TOTALE 213.000 90.000

XXV



GRUPPO DI RICERCA: Dipartimento di Oncologia Sperimentale - Istituto Europeo di Oncologia

RESPONSABILE SCIENTIFICO: nominativo: Dott.ssa Luisa Lanfrancone

struttura di appartenenza : Istituto Europeo di Oncologia funzione: Group Leader

indirizzo : Via Adamello, 16 - 20139 Milano

N. tel: 02/94375100 N. fax: 02/94375990

indirizzo E-mail: [email protected]

RAPPRESENTANTE LEGALE: nominativo: Dr. Carlo Ciani


Il contributo specifico fornito alla ricerca è quello di identificare nuovi bersagli molecolari che consentano la creazione di farmaci molecolari mirati. Nello studio proposto da questa unità gli obiettivi sono rappresentati 1) dalla valutazione del pattern di espressione di RaLP all’interno dei diversi tipi di melanoma e delle sue varianti cliniche in funzione della capacità migratoria delle cellule che compongono il tumore; 2) dall’identificazione delle molecole coinvolte nella trasduzione del segnale migratorio mediato da RaLP. L’inibizione della funzione di RaLP, ma anche di quella delle molecole ad esso connesse, consentirebbe potenzialmente di bloccare la migrazione e l’invasione delle cellule del melanoma.


Colture primarie di melanociti e cellule tumorali di melanoma. Un ruolo centrale nello svolgimento del programma di ricerca e’ costituito dalla disponibilita’ nell’IEO di campioni di cute normale e patologica. I melanociti normali saranno ottenuti separando le popolazioni cellulari dell’epidermide mediante tripsina e crescendole in terreno a ridotta concentrazione di siero, ma con l’aggiunta di fattori specifici. Per quanto riguarda le cellule neoplastiche, linee primarie di melanoma metastatico sono gia’ state stabilizzate e caratterizzate nel gruppo del proponente. Queste colture primarie verranno utilizzate per studiare la risposta migratoria e proliferativa a segnali extracellulari, sia mitogenici, sia motogenici, sia di stress, quali UV. La coltura in vitro di queste popolazioni cellulari consentirà la manipolazione genetica una volta identificati i partners molecolari della risposta cellulare.Analisi dell’espressione genica. L’RNA e i lisati proteici estratti dalle cellule in coltura, ma anche dai campioni bioptici verranno utilizzati per effettuare l’analisi dell’espressione di RaLP durante le varie fasi della progressione neoplastica. In particolare, verrà condotto uno studio sui campioni di nevi e melanomi conservati in paraffina, analizzando anche i linfonodi sentinella utilizzati per verificare la metastatizzazione di alcuni casi di melanoma.

XXVI


MODULO 3BIS


1. Personale dipendente € 25.000 ,00 NULLA_______________________________________________________________________________________________________________________________________

2. Personale a contratto/consulenza/borsa di studio € 20.000 ,00 € 20.000,00____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 3. Missioni ________ _______________________________________________________________________________________________________________________________________________

4. Attrezzature (solo a noleggio o leasing): ________ ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

5. Materiale di consumo € 60.000,00 € 55.000,00____________________________________________________________________________________________________________________________________

6. Pubblicazioni / organizzazione convegni, ecc. _________ ___________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________


8. Spese generali delle strutture coinvolte (specificare) € 21.000,00 € 15.000,00_________________________________________________________________________________________________________________________________

TOTALE € 126.000,00 € 90.000,00

XXVII


MODULO 3


UNITÀ OPERATIVA: U03

RESPONSABILE SCIENTIFICO:

nominativo: Stefania D’Atri

struttura di appartenenza: Istituto Dermopatico dell’Immacolata-IRCCS. funzione: Dirigente Struttura Semplice

indirizzo: Via dei Monti di Creta 104, 00167Roma

N. tel: +39/06/66464735 N. fax: +39/06/66464705


RAPPRESENTANTE LEGALE:

nominativo: Dr. Eugenio Luchetti


Le chinasi ciclica-dipendenti (CDKs) sono dei regolatori chiave del ciclo cellulare e sono inoltre coinvolte nel controllo della trascrizione genica. Nelle cellule tumorali, si riscontra quasi costantemente una aumentata attività delle CDKs ed è stato dimostrato che una modulazione negativa della loro funzione può determinare arresto del ciclo cellulare ed apoptosi in vitro, nonchè inibire la crescita tumorale in modelli animali. Al riguardo, di particolare rilevanza clinica appaiono recenti studi in vitro che dimostrano che l’abrogazione dell’espressione di CDK2 determina una marcata inibizione della proliferazione e della clonogenicità di cellule di melanoma umano. Infatti, poiché il melanoma è una neoplasia altamente resistente ai chemioterapici convenzionali, lo sviluppo di più efficaci protocolli terapeutici è strettamente dipendente dall’individuazione di nuovi farmaci a bersaglio molecolare attivi in tale forma neoplastica.L’attivazione della pathway di Hedgehog e dei suoi trasduttori (proteine Gli) è frequentemente responsabile di tumori cerebrali (ad es. tumore cerebellare medulloblastoma). Processi di ubiquitinazione basati su complessi contenenti Cullin1 and Cullin3/proteine con dominio BTB, controllano le proteine Gli (Di Marcotullio et al., 2007). Il nostro laboratorio ha identificato un nuovo meccanismo di soppressione della pathway attraverso la ubiquitinazione e conseguente proteolisi indotta dalla E3 ligasi Itch, meccanismo che è attivato dalla proteina Numb e soppresso nel medulloblastoma umano (Di Marcotullio et al., 2006). La ricerca si propone di caratterizzare l’interazione di Itch, Numb e le proteine Gli (Gli1, Gli2 e Gli3), di identificarne i domini funzionali ed i segnali di attivazione del processo di ubiquitinazione allo scopo di disegnare molecole con proprietà agoniste.Su tali basi, l’UO3 contribuirà al presente progetto di ricerca con studi finalizzati:(a) alla definizione del potenziale terapeutico di inibitori di CDKs (CDK-Is), come singoli agenti ed in associazione con chemioterapici convenzionali o inbitori di Itch, nel melanoma. (b), Identificazione di inibitorii della pathway oncogenica di Hedgehog/Gli e loro uso nella soppressione della tumorigenesi cerebrale: ruolo dei meccanismi di ubiquitinazione e di interattori dei fattori di trascrizione della famiglia Gli.


Gli studi finalizzati alla definizione del potenziale terapeutico di CDK-Is nel melanoma saranno condotti utilizzando due nuove molecole sviluppate da Nerviano Medical Sciences, un pan-CDK-I, attivo su differenti classi di CDKs, e un CDK-I maggiormente selettivo per CDK2. Attualmente, tali CDK-Is sono in fase I di sperimentazione clinica in pazienti con neoplasie solide.Utilizzando un ampio pannello si linee cellulari di melanoma umano, saranno inizialmente valutati gli effetti antiproliferativi e apoptotici dei due CDK-Is. Se, come è ipotizzabile, questi risulteranno attivi su una consistente percentuale di linee di melanoma, verranno condotti studi per identificare possibili marcatori tumorali correlati con la sensibilità o resistenza ai CDK-Is. A tal fine, linee di melanoma opportunamente selezionate sulla base della sensibilità/resistenza ai CDK-Is saranno caratterizzate per espressione e/o attività di MITF (fattore trascrizionale che regola l’espressione di CDK2), CDKs, inibitori cellulari di CDKs, cicline, Rb ed altre molecole coinvolte nella regolazione del ciclo cellulare e dell’apoptosi. Nelle stesse

XXVIII

Alleanza Contro il Cancro (ACC) – Istituto Superiore di Sanità (ISS) Art.3 DM 21 luglio 2006 - Programma Straordinario di Ricerca Oncologica 2006Programma 3 “Rete solidale e collaborazioni internazionali”linee saranno determinati, mediante microarrays oligonucleotidici, i profili d’espressione genica e questi correlati con la risposta al trattamento. Ulteriori studi in vitro saranno condotti per identificare i principali meccanismi molecolari che, a valle dell’inibizione delle CDKs, sono coinvolti negli effetti antiproliferativi e/o apoptotici dei CDK-Is. Cellule di controllo e cellule trattate con i due inibitori saranno comparativamente analizzate per distribuzione nelle diverse fasi del ciclo cellulare, proteolisi o cambiamenti nell’espressione/fosforilazione di molecole pro- e anti-apoptotiche, attivazione di specifiche caspasi. Verranno inoltre valutati eventuali alterazioni indotte dal trattamento con CDK-Is nell’espressione, e/o fosforilazione, e/o attività di molecole coinvolte nella regolazione del ciclo cellulare. Infine, verrà comparato il profilo d’espressione genica di cellule di controllo e di cellule esposte a CDK-Is per identificare geni modulati dal trattamento farmacologico e quindi potenzialmente coinvolti negli effetti antitumorali osservati.Su alcune linee di melanoma opportunamente selezionate nell’ambito del pannello disponibile, verranno infine condotti studi per valutare gli effetti antiproliferativi/apoptotici dei composti in esame in associazione con chemioterapici convenzionali (es. alchilanti, taxani, antibiotici antitumorali, inibitori delle topoisomerasi) ed inibitori di Itch sviluppati dall’UO1. Ci proponiamo anche di caratterizzare il meccanismo di inbizione di Gli da parte della proteina REN a dominio BTB, antagonista di Gli precedentememnte identificato nel nostro laboratorio (Di Marcotullio et al., 2004) L’identificazione di proteine che interagiscono con i fattori di trascrizione Gli, mediante approccio proteomico, ci consentirà anche di caratterizzare molecole con proprietà antagoniste. Ci proponiamo anche di valutare l’efficacia di tali molecole in saggi cellulari in vitro ed in vivo in modelli di medulloblastoma murino (topi difettivi del gene Patched1) ed in topi condizionali doppi mutanti Engrailed2-Cre/Numb-loxP knockout per il gene Numb a livello cerebellare.

XXIX


MODULO 3


1. Personale dipendente _120000,00_____ NULLA_______________________________________________________________________________________________________________________________________

2. Personale a contratto/consulenza/borsa di studio 90000,00 _90000,00______________________________________________________________________________________________________________________________________

3. Missioni 16700,00 _16700,00_______________________________________________________________________________________________________________________________________

4. Attrezzature (solo a noleggio o leasing): ________ _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

5. Materiale di consumo _100500,00_ ___77500,00_____________________________________________________________________________________________________________________________________



8. Spese generali delle strutture coinvolte (specificare) _25800,00__ ___25800,00___________________________________________________________________________________________________________________________________

TOTALE _353000,00_ _210000,00_

XXX


MODULO 3


CURRICULUM VITAEDott.ssa Stefania D'Atri

Luogo e data di nascita: Roma, 01/02/1958

TITOLI DI STUDIO1981 Laurea in Scienze Biologiche, Università degli Studi di Roma "La Sapienza".1985 Specializzazione in "Patologia Generale con Indirizzo Tecnico", Università degli Studi di Roma "La Sapienza".

ATTIVITA' PROFESSIONALEOttobre '79 - Febbraio '84: Allieva interna, Istituto Regina Elena per lo Studio e la Cura dei Tumori (Roma)Marzo '84 - Febbraio '89 Agosto '90 - Gennaio '93:

Ricercatore (art. 36, Legge 20/3/1975 n. 70), Istituto di Medicina Sperimentale, C.N.R. (Roma).

Febbraio ’93 - Giugno ’94: Assistente Biologo, Laboratorio di Farmacologia, Istituto Dermopatico dell'Immacolata-IRCCS (Roma)

Luglio ‘94 - Dicembre ‘05: Coadiutore Biologo, Laboratorio di Farmacologia (1994-2004) e Laboratorio di Oncologia Molecolare (2005), Istituto Dermopatico dell'Immacolata-IRCCS (Roma).

Gennaio ‘06 - presente: Dirigente Struttura Semplice, Laboratorio di Oncologia Molecolare, Istituto Dermopatico dell'Immacolata-IRCCS (Roma).

DIECI PUBBLICAZIONI DEGLI ULTIMI 5 ANNI (2003-2007)1. C. Schietroma, F. Cianfarani, P.M. Lacal, T. Odorisio, A. Orecchia, J. Kanitakis, S. D’Atri, M.C. Failla, and G. Zambruno. Vascular endothelial growth factor-C expression correlates with lymph node localization of human melanoma metastases. Cancer 98:789-797, 2003.2. R. Pepponi, G. Marra, M.P. Fuggetta, S. Falcinelli, E. Pagani, E. Bonmassar, J. Jiricny, and S. D’Atri . The effect of O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase and mismatch repair activities on the sensitivity of human melanoma cells to temozolomide, 1,3-bis(2-chloroethyl)1-nitrosourea and cisplatin. J. Pharmacol. Exp. Ther. 304:661-668, 2003.3. D. Castiglia, E. Pagani, E. Alvino, P. Vernole, G. Marra, E. Cannavò, J. Jiricny, G. Zambruno, and S. D’Atri. Biallelic somatic inactivation of the mismatch repair gene MLH1 in a primary skin melanoma. Gene Chromosome Canc.37:165-175, 2003.4. P. Vernole, R. Pepponi and S. D’Atri. Role of mismatch repair in the induction of chromosomal aberrations and sister chromatid exchanges in cells treated with different chemotherapeutic agents. Cancer Chemother. Pharmacol. 52:185-192, 2003.5. S. Caporali, S. Falcinelli, G. Starace, M.T. Russo, E. Bonmassar, J. Jiricny, and S. D’Atri. DNA damage induced by temozolomide signals to both ATM and ATR: role of the mismatch repair system. Mol Pharmacol. 66:478-491, 20046. P.M. Lacal, F. Ruffini, E. Pagani, and S. D’Atri. An autocrine loop directed by the vascular endothelial growth factor promotes invasiveness of human melanoma cells. Int. J. Oncol. 27:1625-1632, 20057. P. Vernole, B. Tedeschi, L. Tentori, L. Levati, G. Argentin, R. Cicchetti, O. Forini, G. Graziani, and S. D'Atri. Role of the mismatch repair system and p53 in the clastogenicity and cytotoxicity induced by bleomycin. Mutat. Res. 594:63-77, 20068. E. Alvino, D. Castiglia, S. Caporali, R. Pepponi, P. Caporaso, P.M. Lacal, G. Marra, F. Fischer, G. Zambruno, E. Bonmassar, J. Jiricny, and S. D’Atri. A single cycle of treatment with temozolomide, alone or combined with O6-benzylguanine, induces strong chemoresistance in melanoma cell clones in vitro: role of O 6-methylguanine-DNA methyltransferase and the mismatch repair system. Int. J. Oncol 29: 785-797, 2006.9. T. Di Pucchio, L Pilla, I. Capone, M. Ferrantini ,E. Montefiore, F. Urbani, R. Patuzzo, E. Pennacchioli, M. Santinami, A. Cova, G. Sovena, F. Arienti, C. Lombardo, A. Lombardi, P. Caporaso, S. D’Atri, et al. Immunization of Stage IV melanoma patients with Melan-A/Mart-1 and gp100 peptides plus IFN- results in the activation of specific CD8+ T cells and monocytic/dendritic cell precursors. Cancer Res. 66: 4943-4951, 2006.10. E. Pagani, S. Falcinelli, R. Pepponi, M. Turriziani, P. Caporaso, S. Caporali, E. Bonmassar, and S. D’Atri. Combined effect of temozolomide and hyperthermia on human melanoma cell growth and O6-methylguanine-DNA methyltransferase activity. Int. J. Oncol 30:443-451, 2007

XXXI


MODULO 3BIS


GRUPPO DI RICERCA: Istituto Dermopatico dell’Immacola-IRCCS


nominativo: Stefania D’Atri

struttura di appartenenza: Istituto Dermopatico dell’Immacolata-IRCCS. funzione: Dirigente Struttura Semplice

indirizzo: Via dei Monti di Creta 104, 00167Roma

N. tel: +39/06/66464735 N. fax: +39/06/66464705



nominativo: Dr. Eugenio Luchetti


Nell’ambito dell’UO3, il gruppo di ricerca svolgerà gli studi relativi alla:(a) valutazione degli effetti antiproliferativi dei CDK-Is, da soli od in associazione con chemioterapici convenzionali od inibitori di Itch, in linee cellulari di melanoma(b) identificazione di marcatori tumorali correlati con la sensibilità/resistenza cellulare ai CDK-Is(c) identificazione delle principali alterazioni molecolari conseguenti alla inibizione di CDKs e coinvolte negli effetti antitumorali dei CDK-Is


Gli effetti antiproliferativi dei CDK-Is, da soli od in associazione con chemioterapici convenzionali od inibitori di Itch, verranno valutati in linee cellulari di melanoma utilizzando un test di chemiosensibilità in vitro basato sulla riduzione di sali di tetrazolio e saggi di clonogenicità. Tecniche di Western blotting, Northern blotting e/o real-time RT-PCR saranno utilizzate per valutare l’espressione di molecole effettrici potenzialmente correlate con la sensibilità/resistenza cellulare ai CDK-Is (es. MITF, CDKs, inibitori di CDKs, cicline, Rb). A tal fine saranno anche determinati, mediante microarrays oligonucleotidici Affimetrix, i profili d’espressione genica delle line in studio. Tecniche di Western blotting e saggi chinasici saranno impiegati per valutare eventuali cambiamenti indotti dal trattamento con CDK-Is nello stato di fosforilazione e attività di molecole coinvolte nella regolazione del ciclo cellulare. Inoltre, in cellule di controllo e in cellule esposte ai CDK-Is saranno determinati i profili d’espressione genica per identificare geni modulati dal trattamento farmacologico e quindi potenzialmente coinvolti negli effetti antitumorali osservati.

XXXII


MODULO 3BIS


1. Personale dipendente _50000,00____ NULLA_______________________________________________________________________________________________________________________________________

2. Personale a contratto/consulenza/borsa di studio __78000,00 78000,00Un contratto per 3 anni__________________________________________________________________________________________ 3. Missioni ___9500,00 9500,00Partecipazione a congressi nazionali ed internazionali__________________________________________________________________________________________

4. Attrezzature (solo a noleggio o leasing): ________ 0____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

5. Materiale di consumo _48000,00_ 400000,00Reagenti per colture cellulari, biochimica, e biologia molecolare. Anticorpi, microarrays Affimetrix, farmaci____________________________________________

6. Pubblicazioni / organizzazione convegni, ecc. _________ 0 ___________________________________________________________________________________________________________________________________

7. Elaborazione dati (specificare) __________ 0_________________________________________________________________________________________________________________________________

8. Spese generali delle strutture coinvolte (specificare) _22500,00_ 22500,00_________________________________________________________________________________________________________________________________

TOTALE _208000,00__ 150.000

XXXIII


MODULO 3BIS


GRUPPO DI RICERCA: Istituto di Neurobiologia e Medicina Molecolare – Consiglio Nazionale delle Ricerche


nominativo: Ester Alvino

struttura di appartenenza: Istituto di Neurobiologia e Medicina Molecolare – Consiglio Nazionale delle Ricerche funzione:

Tecnologo X Livello

indirizzo: Via del Fosso del Cavaliere 100, 00133 Roma

N. tel: +39/06/49934255 N. fax: +39/06/49934257



nominativo: Prof. Pietro Calissano


Nell’ambito dell’UO3, il gruppo di ricerca contribuirà agli studi finalizzati alla identificazione dei principali meccanismi molecolari che, a valle dell’inibizione delle CDKs, sono coinvolti negli effetti antitumorali dei CDK-Is in esame. In particolare, il gruppo di ricerca valuterà gli effetti apoptotici dei CDK-Is, da soli od in associazione con chemioterapici convenzionali od inibitori di Itch, in linee cellulari di melanoma


I livelli di apoptosi in cellule di melanoma di controllo o trattate con i CDK-Is, da soli od in associazione con chemioterapici convenzionali od inibitori di Itch, saranno determinati mediante citofluorimetria a flusso, utilizzando il saggio dell’annessina V e la colorazione con ioduro di propidio. Nelle stesse cellule saranno valutati degradazione di PARP ed attivazione di specifiche caspasi, mediante tecniche di Western blotting e/o kits commercialmente disponibili. Saggi di Western blotting saranno impiegati per valutare proteolisi e/o cambiamenti nell’espressione e/o foforilazione di molecole pro- o anti-apoptotiche (es, molecole appartenenti alla famiglia di bcl-2, survivina, X-IAP, etc.).

XXXIV


MODULO 3BIS


1. Personale dipendente _20000,00_ NULLA_______________________________________________________________________________________________________________________________________

2. Personale a contratto/consulenza/borsa di studio ________ 0____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 3. Missioni __6000,00_ 6.000Partecipazione a congressi nazionali ed internazionali__________________________________________________________________________________________


5. Materiale di consumo __10800__ 9.000Reagenti per colture cellulari ed saggi di Western blotting, anticorpi________________________________________________________________________________________



8. Spese generali delle strutture coinvolte (specificare) __________ 0_________________________________________________________________________________________________________________________________

TOTALE __36800,00_ 15.000

XXXV


MODULO 3BIS


GRUPPO DI RICERCA: Istituto Nazionale per la Ricerca sul Cancro, Genova


nominativo: Ulrich Pfeffer

struttura di appartenenza:. Istituto Nazionale per la Ricerca sul Cancro, Genova

funzione: Responsabile S.S. Genomica Funzionale

indirizzo: Largo Rosanna Benzi 10, 16132 Genova

N. tel: +39/010/5737303 N. fax: +39/010/8630734



nominativo: Dr. Gianfranco Ciappina


Nell’ambito dell’UO3, il gruppo di ricerca svolgerà l’analisi bioinformatica dei profili d’espressione genica di:(a) linee cellulari di melanoma resistenti o sensibili ai CDK-Is oggetto di studio, al fine di identificare possibili marcatori tumorali correlati con la sensibilità/resistenza cellulare ai CDK-Is(b) linee cellulari di melanoma sensibili ai CDK-Is, di controllo o esposte acutamente ai CDK-Is, al fine di identificare geni modulati dal trattamento farmacologico e quindi potenzialmente coinvolti negli effetti antitumorali osservati.


Gli screening di microarrays verranno eseguiti su piattaforma GeneChipTM Affymetrix. Per la generazione del dato di intensità a partire dai pixels verrà usato il software Expression Console dell’Affymetrix, mentre per la normalizzazione verrà usato il programma GCRMA nell’ambiente di Bioconductor. La qualità delle ibridazioni verrà monitorata usando il pacchetto AffyQC di Bioconductor.Per l’analisi statistica dei dati verrà utilizzato il programma SAM. I parametri saranno impostati in modo da escludere falsi positivi. Saranno considerati solo geni la cui espressione sia variata di almeno due volte. Il valore di significatività (q-value) delle liste create dovrà essere inferiore a 0.01. I sets di geni ottenuti verranno paragonati tra di loro con lo scopo di identificare sets sovrapponibili. La sovrapponibilità verrà valutata mediante correlazione di Spearman dei valori di espressione ottenuti.La valutazione delle funzioni molecolari e dei pathway di appartenenza dei geni identificati verrà realizzata sulla base delle annotazioni della Gene Ontology e utilizzando programma EASE. I pathway molecolari identificati potranno successivamente essere analizzati usando GenMapp, che permette la visualizzazione della regolazione di singoli geni appartenenti ad un dato pathway nelle varie condizioni analizzate.

XXXVI


MODULO 3BIS


1. Personale dipendente 20000,00 NULLA_______________________________________________________________________________________________________________________________________

2. Personale a contratto/consulenza/borsa di studio 12000,00 12000,00Un contratto__________________________________________________________________________________________ 3. Missioni _1200,00 1200,00Partecipazioni a congressi nazionali ed internazionali__________________________________________________________________________________________


5. Materiale di consumo _________ 0____________________________________________________________________________________________________________________________________



8. Spese generali delle strutture coinvolte (specificare) __1800,00 1800,00_________________________________________________________________________________________________________________________________

TOTALE ___35000,00__ 15.000

XXXVII


MODULO 3BIS


GRUPPO DI RICERCA: __Università di Roma, Dipartimento Medicina Sperimentale_________________________

RESPONSABILE SCIENTIFICO: nominativo:__Alberto Gulino__________________________________________

struttura di appartenenza : Università di Roma, Dipartimento Medicina Sperimentale funzione: Professore Ordinario,

Dirigente II livello______

indirizzo : _Viale Regina Elena, 324 - ROMA____________________________________________________

N. tel:_064464021________________________ N. fax:064461974__________________________

indirizzo E-mail: [email protected]________________________________________

RAPPRESENTANTE LEGALE: nominativo:__Prof. Mario Piccoli__________________________________________

CONTRIBUTO SPECIFICO FORNITO AL PROGETTO (max 500 caratteri) L’attivazione della pathway di Hedgehog e dei suoi trasduttori (proteine Gli) è frequentemente responsabile di tumori cerebrali (ad es. tumore cerebellare medulloblastoma). lo scopo del gruppo di ricerca sarà l’identificazione di inibitorii della pathway oncogenica di Hedgehog/Gli e loro uso nella soppressione della tumorigenesi cerebrale: ruolo dei meccanismi di ubiquitinazione e di interattori dei fattori di trascrizione della famiglia Gli.La ricerca si propone inoltre di caratterizzare l’interazione di Itch, Numb e le proteine Gli (Gli1, Gli2 e Gli3) ed identificare molecole agoniste.


Ci proponiamo anche di caratterizzare il meccanismo di inbizione di Gli da parte della proteina REN a dominio BTB, antagonista di Gli precedentememnte identificato nel nostro laboratorio (Di Marcotullio et al., 2004) L’identificazione di proteine che interagiscono con i fattori di trascrizione Gli, mediante approccio proteomico, ci consentirà anche di caratterizzare molecole con proprietà antagoniste. Ci proponiamo anche di valutare l’efficacia di tali molecole in saggi cellulari in vitro ed in vivo in modelli di medulloblastoma murino (topi difettivi del gene Patched1) ed in topi condizionali doppi mutanti Engrailed2-Cre/Numb-loxP knockout per il gene Numb a livello cerebellare.

XXXVIII


MODULO 3BIS



2. Personale a contratto/consulenza/borsa di studio ________ ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 3. Missioni ________ _______________________________________________________________________________________________________________________________________________

4. Attrezzature (solo a noleggio o leasing): ________ ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

5. Materiale di consumo __28500,00_______ 28500,00______________________________________________________________________________________________________________________________________



8. Spese generali delle strutture coinvolte (specificare) _1500,00__ ____1500,00_____________________________________________________________________________________________________________________________________

TOTALE ___60.000________ 30.000___

XXXIX

Alleanza Contro il Cancro (ACC) – Istituto Superiore di Sanità (ISS) Art.3 DM 21 luglio 2006 - Programma Straordinario di Ricerca Oncologica 2006Programma 3 “Rete solidale e collaborazioni internazionali”Bibliografia

1. Candi, E., D. Dinsdale, A. Rufini, P. Salomoni, R.A. Knight, M. Mueller, P.H. Krammer, and G. Melino, TAp63 and DeltaNp63 in cancer and epidermal development. Cell Cycle, 2007. 6(3): p. 274-85.

2. Melino, G., X. Lu, M. Gasco, T. Crook, and R.A. Knight, Functional regulation of p73 and p63: development and cancer. Trends Biochem Sci, 2003. 28(12): p. 663-70.

3. Melino, G., V. De Laurenzi, and K.H. Vousden, p73: Friend or foe in tumorigenesis. Nat Rev Cancer, 2002. 2(8): p. 605-15.

4. Flores, E.R., S. Sengupta, J.B. Miller, J.J. Newman, R. Bronson, D. Crowley, A. Yang, F. McKeon, and T. Jacks, Tumor predisposition in mice mutant for p63 and p73: evidence for broader tumor suppressor functions for the p53 family. Cancer Cell, 2005. 7(4): p. 363-73.

5. Yuan, Z.M., H. Shioya, T. Ishiko, X. Sun, J. Gu, Y.Y. Huang, H. Lu, S. Kharbanda, R. Weichselbaum, and D. Kufe, p73 is regulated by tyrosine kinase c-Abl in the apoptotic response to DNA damage. Nature, 1999. 399(6738): p. 814-7.

6. Gong, J.G., A. Costanzo, H.Q. Yang, G. Melino, W.G. Kaelin, Jr., M. Levrero, and J.Y. Wang, The tyrosine kinase c-Abl regulates p73 in apoptotic response to cisplatin-induced DNA damage. Nature, 1999. 399(6738): p. 806-9.

7. Irwin, M.S., K. Kondo, M.C. Marin, L.S. Cheng, W.C. Hahn, and W.G. Kaelin, Jr., Chemosensitivity linked to p73 function. Cancer Cell, 2003. 3(4): p. 403-10.

8. O'Nions, J., L.A. Brooks, A. Sullivan, A. Bell, B. Dunne, M. Rozycka, A. Reddy, J.A. Tidy, D. Evans, P.J. Farrell, A. Evans, M. Gasco, B. Gusterson, and T. Crook, p73 is over-expressed in vulval cancer principally as the Delta 2 isoform. Br J Cancer, 2001. 85(10): p. 1551-6.

9. Rossi, M., R.I. Aqeilan, M. Neale, E. Candi, P. Salomoni, R.A. Knight, C.M. Croce, and G. Melino, The E3 ubiquitin ligase Itch controls the protein stability of p63. Proc Natl Acad Sci U S A, 2006. 103(34): p. 12753-8.

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11. Shapiro, G.I., Cyclin-dependent kinase pathways as targets for cancer treatment. J Clin Oncol, 2006. 24(11): p. 1770-83.

12. Deshpande, A., P. Sicinski, and P.W. Hinds, Cyclins and cdks in development and cancer: a perspective. Oncogene, 2005. 24(17): p. 2909-15.

13. Chong, H., H.G. Vikis, and K.L. Guan, Mechanisms of regulating the Raf kinase family. Cell Signal, 2003. 15(5): p. 463-9.

14. Rossi, A., P. Kapahi, G. Natoli, T. Takahashi, Y. Chen, M. Karin, and M.G. Santoro, Anti-inflammatory cyclopentenone prostaglandins are direct inhibitors of IkappaB kinase. Nature, 2000. 403(6765): p. 103-8.

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