MODULO 1 - Dati generali del programmaold.iss.it/binary/lgac/cont/PROGETTOIEO.1202736477.pdf ·...

Alleanza Contro il Cancro (ACC) – Istituto Superiore di Sanità (ISS) Art.3 DM 21 luglio 2006 - Programma Straordinario di Ricerca Oncologica 2006 Programma 3 “Rete solidale e collaborazioni internazionali” MODULO 1 MODULISTICA MODULO 1 - Dati generali TITOLO DEL PROGETTO: Identificazione di marcatori per la predizione della risposta a nuovi

farmaci antitumorali (inibitori di HDAC, tirosino chinasi e pompe ioniche).

COSTO COMPLESSIVO DEL PROGETTO € 5.295.816,00

FINANZIAMENTO RICHIESTO AD ACC/ISS € 2.700.000,00

RISORSE PROPRIE € 2.595.816,00

COFINANZIAMENTI : 0,00

(SPECIFICARE ENTE EROGATORE, DATA INIZIO DISPONIBILITÀ FONDI E RELATIVO IMPORTO)

___________________________________________________ /__/__/__/__/__/__/ /__/__/__/__/__/__/__/

ENTE EROGATORE GG MM AA IMPORTO

___________________________________________________ /__/__/__/__/__/__/ /__/__/__/__/__/__/__/


_______________________________________________ /__/__/__/__/__/__/ /__/__/__/__/__/__/__/


DURATA (in mesi, massimo 36) :36

I

Alleanza Contro il Cancro (ACC) – Istituto Superiore di Sanità (ISS) Art.3 DM 21 luglio 2006 - Programma Straordinario di Ricerca Oncologica 2006 Programma 3 “Rete solidale e collaborazioni internazionali” MODULO 1 COORDINATORE DEL PROGETTO:

nominativo: Prof. Pier Giuseppe Pelicci

struttura di appartenenza : Istituto Europeo di Oncologia funzione: Chairman – Dipartimento di Oncologia Sperimentale

indirizzo : Via Adamello, 16 – 20139 Milano

N. tel: 02/57489831 N. fax: 02/94375991

indirizzo E-mail : [email protected]

DESTINATARIO ISTITUZIONALE PROPONENTE

Destinatario Istituzionale Istituto Europeo di Oncologia Rappresentante legale Dott. Carlo Ciani Responsabile Scientifico UO 1 Prof. Pier Giuseppe Pelicci Gruppi di ricerca afferenti al DI (Dipartimento/Sezione e nominativo del Responsabile Scientifico)

1. Dipartimento di Oncologia Sperimentale – Prof. Pier Giuseppe Pelicci 2. Dipartimento di Oncologia Sperimentale – Prof. Saverio Minucci 3. Dipartimento di Oncologia Sperimentale – Dott.ssa Susanna Chiocca 4. Dipartimento di Oncologia Sperimentale – Prof. Salvatore Pece 5. Dipartimento di Oncologia Sperimentale – Dott.ssa Giuseppina Bonizzi 6. Dipartimento di Oncologia Sperimentale – Dott.ssa Luisa Lanfrancone

Gruppi di ricerca afferenti ad altre Istituzioni di Ricerca (Istituzione e nominativi del Responsabile Scientifico e del Rappresentante Legale)

7. IRCCS Istituto Clinico Humanitas – Dott.ssa Paola Allavena 8. Istituto Dermopatico dell’Immacolata – Dott. Alessandro Terrinoni

DESTINATARI ISTITUZIONALI PARTECIPANTI Destinatario Istituzionale FONDAZIONE IRCCS “ISTITUTO NAZIONALE DEI TUMORI” Rappresentante legale Dott. Stefano Zurrida Responsabile Scientifico UO 2 Dott.ssa Maria Grazia Daidone Gruppi di ricerca afferenti al DI (Dipartimento/Sezione e nominativo del Responsabile Scientifico)

1. Dipartimento di Oncologia Sperimentale – Dott.ssa Maria Grazia Daidone 2. Dipartimento di Oncologia Sperimentale – Dott.ssa Angela Greco 3. Dipartimento di Oncologia Sperimentale – Dott.ssa Sylvie Ménard 4. Dipartimento di Oncologia Sperimentale – Dott.ssa Gabriella Sozzi 5. Dipartimento di Oncologia Sperimentale – Dott.ssa Franco Zunino 6. Dipartimento di Anatomia Patologica – Dott.ssa Silvana Pilotti

Gruppi di ricerca afferenti ad altre Istituzioni di Ricerca (Istituzione e nominativi del Responsabile Scientifico e del Rappresentante Legale)

7. Istituto Superiore di Sanità – Dott. Stefano Fais

II

Alleanza Contro il Cancro (ACC) – Istituto Superiore di Sanità (ISS) Art.3 DM 21 luglio 2006 - Programma Straordinario di Ricerca Oncologica 2006 Programma 3 “Rete solidale e collaborazioni internazionali” Destinatario Istituzionale Fondazione IRCCS Istituto Neurologico Besta Rappresentante legale Dott. Alessandro Moneta Responsabile Scientifico UO 3 Dott. Gaetano Finocchiaro Gruppi di ricerca afferenti al DI (Dipartimento/Sezione e nominativo del Responsabile Scientifico)

1. Struttura di Neuro-Oncologia Sperimentale, Ist. Besta– Dott. Gaetano Finocchiaro 2. Struttura di Neurobiologia, Ist. Besta – Dr. Maurizio Gelati

Gruppi di ricerca afferenti al DI (Dipartimento/Sezione e nominativo del Responsabile Scientifico)

3. IEO – Dott.ssa Giuliana Pelicci Gruppi di ricerca afferenti ad altre Istituzioni di Ricerca (Istituzione e nominativi del Responsabile Scientifico e del Rappresentante Legale)

III

Alleanza Contro il Cancro (ACC) – Istituto Superiore di Sanità (ISS) Art.3 DM 21 luglio 2006 - Programma Straordinario di Ricerca Oncologica 2006 Programma 3 “Rete solidale e collaborazioni internazionali” MODULO 2

MODULO 2 - DESCRIZIONE DEL PROGETTO (SINTESI DELLE ATTIVITÀ DI TUTTE LE UNITÀ

OPERATIVE)

BASE DI PARTENZA E RAZIONALE (max 4000 caratteri) L’obiettivo della nuova Medicina Molecolare è la definizione degli specifici difetti genetico-molecolari di un determinato tumore per il disegno di farmaci appropriati ed esempi sono già ampiamente disponibili nella pratica clinica così come l’identificazione di profili di espressione genica capaci di costituire signatures di sensibilità/resistenza ai diversi trattamenti. La risposta agli attuali quesiti della Medicina Molecolare sarà generata dalla sovrapposizione virtuale di farmacogenomica e farmacogenetica, ovvero del genoma della cellula tumorale con quello del singolo paziente con l’obbiettivo finale di sviluppare modalità di trattamento con un razionale meccanicistico, in base al quale somministrare al momento opportuno il trattamento ottimale (singolo ma più verosimilmente in combinazione per agire su meccanismi di progressione primari, secondari o multipli e ridondanti) a pazienti individuali in base ad un razionale definito dalle alterazioni molecolari del singolo tumore, con una concreta possibilità di ottenere una risposta clinica duratura (anche in termini di cronicizzazione della malattia oncologica) e avendo a disposizione una diagnostica molecolare che ci consenta di identificare i pazienti potenzialmente responsivi allo specifico trattamento, così come quelli ad esso refrattari, e ad effettuare la validazione del bersaglio cellulare, ovvero verificare l’avvenuta interferenza su pathway/s molecolare/i alterato/i. Tale atteggiamento implica una transizione dall’atteggiamento conservativo/difensivo di una chemioterapia di combinazione, nella quale i farmaci vengono associati allo scopo di contrastare la resistenza, intrinseca e/o acquisita, ad un approccio innovativo e interventistico, con il quale si associano molecole contro differenti bersagli molecolari, quali ad esempio inibitori delle tirosino-chinasi o delle istone-deacetilasi, per sfruttare la suscettibilità della cellula e aumentare la possibilità di eradicare la malattia a livello molecolare. Inibitori delle tirosino-chinasi. In base alla considerazione che enzimi tirosin chinasici sono coinvolti in pathways di proliferazione e sopravvivenza cellulare e che varie protein chinasi hanno un ruolo regolatorio in tali processi, l’inibizione di queste attività enzimatiche, attivate in modo aberrante in diversi tipi di tumore, rappresenta un nuovo ed estremamente promettente approccio con differenti opportunità terapeutiche con il quali interferire a diversi livelli sulla patofisiologia della cellula tumorale. Tra i recettori ad attività tirosin-chinasica quelli più studiati, definibili come upstream targets, appartengono alla famiglia EGFR (EGFR, HER-2/neu, HER-3), VEGFR (VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3), PDGFR (KIT, PDGFRA, PDGFRB), mentre altri possibili bersagli terapeutici sono costituiti dalle molecole effettrici di tali recettori (downstream targets perché a valle della cascata indotta dall’interazione tra fattore di crescita e recettore), tra cui Ras/Raf-MEK/Erk, BRAF, PI3K/Akt, PTEN, Ret. Proprio in relazione al loro ruolo fondamentale nella trasduzione del segnale mitogenico e quindi nei processi di proliferazione e differenziamento cellulare così come nell’attivazione dell’angiogenesi, i recettori ad attività tirosin-chinasica sono stati oggetto di un’intensa ricerca, finalizzata all’identificazione di molecole in grado di interferire sulla loro attività in modo specifico. A tutt’oggi diversi sono gli inibitori tirosin-chinasici, sia recettoriali che citoplasmatici, utilizzati in clinica nel trattamento di neoplasie solide e sistemiche. Generalmente si tratta di anticorpi monoclonali che legano la porzione extracellulare del recettore inibendone l’interazione col ligando (gefitinib nel caso di EGFR, trastuzumab nel caso di HER-2, IMC-1C11 nel caso di VEGFR) o impedendone la dimerizzazione (come nel caso di pertuzumab per HER-2) e di piccole molecole capaci di inibire l’attività enzimatica delle tirosin-chinasi (come nel caso dell’imatinib per la proteina di fusione ad attività tirosin-chinasica BCR/ABL nella leucemia mieloide cronica). Inibitori delle istone-deacetilasi. Le deacetilasi (HDAC) e le acetil-transferasi (HAT) istoniche influenzano la struttura della cromatina e modulano l’attività di diverse proteine non istoniche implicate nella regolazione di differenti funzioni cellulari. Ad oggi nell’uomo sono state identificate 18 HDAC, che sono state raggruppate in tre classi. La classe I, a cui appartengono HDAC1, HDAC2, HDAC3 e HDAC8, è ubiquitaria ed è implicata nella patogenesi di numerosi tumori. La sperimentazione clinica di inibitori delle HDAC ha condotto recentemente il primo inibitore di HDAC (il SAHA) alla registrazione per l’utilizzo nella terapia di alcuni linfomi a cellule T. Gli attuali inibitori delle deacetilasi istoniche in sperimentazione clinica (incluso il SAHA) mostrano tutti una certa tossicita’ e una bassa selettivita’ per i diversi isoenzimi HDAC. Uno di questi inibitori (l’acido valproico o VPA) è da diversi decenni in uso come farmaco antiepilettico, a dosi che nei pazienti neurologici non sono però sufficienti ad inibire HDAC. Il VPA è un inibitore specifico per la classe I di HDAC, e potrebbe quindi rappresentare un farmaco selettivo per la sottofamiglia di HDAC maggiormente coinvolta nella tumorigenesi. OBIETTIVO PRINCIPALE E OBIETTIVI SECONDARI DEL PROGETTO (max 4000 caratteri) La caratterizzazione sistematica delle alterazioni genetiche e funzionali dei tumori ha consentito di identificare numerosi bersagli molecolari per la generazione di nuovi farmaci (Farmaci Molecolari). I primi studi clinici eseguiti con tali farmaci hanno confermato le proprietà attese di efficacia e scarsa tossicità. In generale, però, i Farmaci Molecolari si sono dimostrati attivi in una frazione modesta dei pazienti trattati, verosimilmente in quei casi nei quali lo specifico bersaglio molecolare è

IV

Alleanza Contro il Cancro (ACC) – Istituto Superiore di Sanità (ISS) Art.3 DM 21 luglio 2006 - Programma Straordinario di Ricerca Oncologica 2006 Programma 3 “Rete solidale e collaborazioni internazionali” accessibile e/o biologicamente rilevante. L’obiettivo di questo programma di ricerca e’ la identificazione di marcatori biologici e molecolari di predizione della risposta clinica ad alcuni dei farmaci molecolari disponibili: inibitori di istone-deacetilasi, HDACi (VPA e SAHA); inibitori delle tirosino chinasi, TKi (herceptin e imatinib); inibitori delle pompe ioniche (PPI) in selezionati tipi di tumore (tumori della mammella, melanomi, leucemie mieloidi e glioblastomi). I tumori che verranno inseriti nello studio verranno caratterizzati per l’espressione del bersaglio e, ove appropriato, per il suo stato di attivazione o per la presenza di alterazioni genetiche. La sensibilita’ ai Farmaci Molecolari selezionati verra’ analizzata sia sul “bulk” delle cellule tumorali che su colture di cellule staminali dello stesso tumore. Lo studio verra’ eseguito utilizzando modelli pre-clinici di neoplasia: i) modelli animali, comprendenti topi transgenici (leucemie mieloidi acute ottenute mediante transgenizzazione delle proteine di fusione PML-RAR e AML1-ETO; leucemia mieloide cronica esprimente bcr-abl; tumore mammario esprimente erbB2; melanomi sovraesprimenti B-Raf) e xenotrapianti dei corrispondenti tumori umani in topi immunodeficienti. Ii) Campioni umani, comprendenti colture primarie di tumore (per esempio cellule epiteliali mammarie e di melanoma), colture di cellule tumorali staminali (mammosfere, neurosfere, melanosfere e LTC-IC) e campioni bioptici dagli stessi tumori. La attivita’ sperimentale sara’ articolata in tre fasi: Fase 1: Valutazione della attivita’ biologica (crescita cellulare, apoptosi, senescenza, ciclo cellulare), biochimica (effetto sulle vie di segnalazione downstream allo specifico bersaglio molecolare: HDAC, TK, pompe ioniche) e molecolare (profili di espressione) di ciascun farmaco nelle varie colture primarie di tumore e nei modelli murini transgenici disponibili. Tali studi condurranno alla identificazione di bersagli critici della risposta e/o potenziali marcatori. Fase 2: Valutazione dell’espressione dei marcatori di risposta nelle biopsie dei tumori, mediante ibridazione in situ e immunoistochimica. Fase 3: Validazione della efficacia predittiva dei marcatori selezionati mediante studi correlativi su xenotrapianti di tumori umani. Se questo programma di ricerca condurra’ alla identificazione di marcatori di risposta ai Farmaci Molecolari studiati, programmiamo la esecuzione di uno studio clinico pilota (carcinomi metastatici della mammella trattati con VPA). Infine, verranno condotti studi preliminari per la caratterizzazione del bersaglio molecolare di nuovi farmaci (ET-43) potenzialmente attivi nei confronti di liposarcomi esprimenti la proteina di fusione FUS-CHOP. METODOLOGIA (max 8000 caratteri) Studieremo la attivita’ anti-tumorale di HDACi (VPA e SAHA) nei tumori della mammella, melanomi, glioblastomi e leucemie acute mieloidi; herceptin nel tumore della mammella; imatinib nella leucemia mieloide cronica; PPI nel tumore della mammella; ET-43 nei liposarcomi. Task 1: Esperimenti in tumori umani. Testeremo l’attivita’ e il meccanismo di azione dei vari farmaci su colture primarie di tumore al fine di identificare marcatori di risposta che verranno poi validati su campioni bioptici degli stessi tumori. In particolare: Caratterizzazione del bersaglio. Ciascun tumore verra’ caratterizzata per l’espressione del bersaglio (le varie isoforme di HDAC, B-Raf, erbB2, bcr-abl, proteine di fusione) e, ove appropriato, per il suo stato di attivazione (erbB2, B-Raf e bcr-abl). Nei tumori mammari e nei melanomi, verra’ valutata la presenza di alterazioni genetiche di erbB2 e B-Raf. Colture primarie: i) cellule staminali di glioblastoma (neurosfere), di tumore mammario (mammosfere), melanoma (melanosfere) e di leucemie (LTC-IC); ii) cellule aderenti di tumore mammario (cellule epiteliali), melanoma e glioblastoma; iii) colture in mezzi liquidi di cellule da leucemia mieloide acuta e cronica. Test di sensibilita’. L’attivita’ biologica dei vari farmaci molecolari sara’ analizzata mediante test convenzionali per la valutazione della proliferazione cellulare, ciclo cellulare, apoptosi e senescenza. Valutazione biochimica. Valuteremo l’effetto biochimico atteso di ciascun farmaco (inibizione dell’acetilazione degli istoni e di altri bersagli; inibizione delle vie di segnalazione “downstream” a tirosino chinasi attivate; inibizione funzionale delle pompe protoniche vacuolari). Correlazioni molecolari. Ciascun trattamento sara’ valutato mediante analisi globale di espressione (eseguita prima e, serialmente, dopo l’aggiunta del farmaco) al fine di identificare eventuali marcatori molecolari di risposta. Correlazioni funzionali. Gli studi sopra descritti consentiranno di identificare bersagli critici della risposta ai farmaci, che verranno validati biologicamente mediante esperimenti di RNAi negli stessi modelli. Tale approccio potra’ consentire di identificare specifiche vie di segnalazione che saranno rivalutate nei saggi biologi sopra descritti. Analisi delle biopsie. Le molecole che saranno identificate mediante i saggi sopra descritti verranno valutate per la loro espressione nei tumori originali mediante ISH o ICH nei campioni bioptici corrispondenti. Task 2. Modelli animali. Lo studio su modelli animali e’ diviso in due parti: Analisi della sensibilita’ ai farmaci molecolari. L’efficacia in vivo dei vari farmaci sara’ valutata nei modelli animali di tumore gia’ disponibili nei nostri laboratori. Valuteremo in parallelo gli effetti biochimici e molecolari dei trattamenti, come descritto sopra. Valore predittivo dei marcatori di risposta. Gli studi descritti sopra consentiranno di identificare potenziali marcatori di risposta che verranno validati mediante trattamento e monitoraggio molecolare di xenotrapianti di tumore umano in topi immunodeficienti. Task 3. Studi clinici di fase1/2. I marcatori di risposta identificati verranno validati mediante studi clinici di fase 1/2. Prevediamo di eseguire uno studio su pazienti con carcinoma metastatico della mammella mediante l’HDACi VPA. Tale

V

Alleanza Contro il Cancro (ACC) – Istituto Superiore di Sanità (ISS) Art.3 DM 21 luglio 2006 - Programma Straordinario di Ricerca Oncologica 2006 Programma 3 “Rete solidale e collaborazioni internazionali” scelta e’ motivata dal fatto che la identificazione di marcatori di risposta per tumore mammario e’ gia’ in fase avanzata di sviluppo nei nostri laboratori e il VPA disponibile a basso costo sul mercato farmaceutico. RISULTATI ATTESI (max 4000 caratteri) L’obiettivo principale di questo programma di ricerca e’ la identificazione di marcatori biologici e molecolari di predizione della risposta clinica dei seguenti farmaci molecolari: HDACi (VPA e SAHA) nei tumori della mammella, melanomi, glioblastomi e leucemie acute mieloidi; herceptin, un anticorpo monoclonale contro erbB2, nel tumore della mammella; imatinib, un TKi per BCR/ABL, nella leucemia mieloide cronica; PPI, un inibitore delle pompe ioniche, nel tumore della mammella; ET-43 in una sottoclasse di liposarcomi. Per raggiungere tale scopo, ci aspettiamo i seguenti risultati:

1. Caratterizzazione molecolare del bersaglio di ciascun farmaco, in ciascuno dei tumori inclusi nello studio, in termini di livelli di espressione, presenza di mutazioni e stato funzionale;

2. Definizione della sensibilita’ a ciascun farmaco di tumori della mammella, glioblastomi e leucemie mieloidi mediante uso di modelli pre-clinici. A tale scopo, tratteremo con i vari farmaci colture primarie (comprese colture di cellule staminali tumorali) e modelli animali dei vari tumori (animali transgenici e xenotrpianti di tumori umani in topi immunodeficienti) e valuteremo i loro effetti biologici, biochmici (sul bersaglio e vie di segnalazione “down-stream”) e molecolari (mediante analisi globale di espressione);

3. Identificazione di bersagli critici della risposta a ciascun farmaco. I marcatori di risposta saranno valutati per il loro ruolo funzionale nella sensibilita’ del tumore ai vari farmaci nei medesimi modelli sperimentali;

4. Caratterizzazione dell’espressione dei marcatori identificati nelle biopsie tumorali; 5. Validazione della accuratezza dei marcatori di risposta identificati mediante studi correlativi in xenotrapianti di

tumori umani in topi immunodeficienti; 6. Esecuzione di studi clinici di fase 1/2 per la validazione clinica dei marcatori identificati (previsto uno studio clinico

su carcinoma metastatico della mammella e l’inibitor delle HDAC VPA).

VI

Alleanza Contro il Cancro (ACC) – Istituto Superiore di Sanità (ISS) Art.3 DM 21 luglio 2006 - Programma Straordinario di Ricerca Oncologica 2006 Programma 3 “Rete solidale e collaborazioni internazionali”

MODULO 2 COMPOSIZIONE DEL COSTO COMPLESSIVO DEL PROGETTO Voci di costo e breve descrizione Totale di cui a carico dei fondi ministeriali

1. Personale dipendente € 1.847.000,00 NULLA _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ 2. Personale a contratto/consulenza/borsa di studio € 1.012.916,00 € 931.400,00_____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ 3. Missioni € 44.500,00 € 27.600,00_____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ 4. Attrezzature (solo a noleggio o leasing): ________ ________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ 5. Materiale di consumo € 1.691.000,00 € 1.326.000,00____________________________________________ ____________________________________________ ____________________________________________ 6. Pubblicazioni / organizzazione convegni, ecc. € 38.000,00 € 24.500,00 ___________________________________________ ____________________________________________ ____________________________________________ 7. Elaborazione dati (specificare) € 5.000,00 ________ ___________________________________________ ___________________________________________ ___________________________________________ 8. Spese generali delle strutture coinvolte (specificare) € 657.400,00 € 390.500,00___________________________________________ ___________________________________________ ___________________________________________ TOTALE € 5.295.816,00 € 2.700.000,00

VII


MODULO 2 Curriculum Vitae del Coordinatore del progetto (max 2 pagine) ( INDICARE ANCHE LE 10 PUBBLICAZIONI SCIENTIFICHE RITENUTE PIÙ SIGNIFICATIVE, CON PARTICOLARE RIFERIMENTO A QUELLE DELL’AREA TEMATICA SCIENTIFICA SULLA QUALE INSISTE IL PROGETTO) Curriculum Vitae Prof. Pier Giuseppe Pelicci, M.D. - Ph.D. Data di nascita: 5 Settembre 1956 Luogo di nascita: Gubbio (Perugia), Italia 1975: Diploma di Maturità Scientifica (Perugia). Votazione: 60/60. 1975: Iscrizione alla facoltà di Medicina e Chirurgia dell'Università di Perugia. 1976: Allievo interno presso l'Istituto di Microbiologia dell’Università di Perugia diretto dal prof. M.

Pitzurra. 1977: Allievo interno presso l'Istituto di Fisiologia dell’Università di Perugia diretto dal prof. F. Magni.

1978-1981: Allievo interno presso l'Istituto di Clinica Medica dell'Università di Perugia diretto dal prof. P. Larizza. 1981: Laurea in Medicina e Chirurgia - Votazione: 110/110 e lode 1981: Medico interno con compiti assistenziali presso l'Istituto di Clinica Medica dell'Università di Perugia,

diretto dal prof. P. Larizza. 1982: Ricercatore presso "Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale, Unite de Recherches en

Genetique Moleculaire et Hematologie, I.N.S.E.R.M.-U.91", Creteil, France, diretto dal prof. H. Rochant.

1983: Medico interno con compiti assistenziali presso l'Istituto di Clinica Medica dell'Università di Perugia, diretto dal prof. P. Larizza.

1984-1986: Ricercatore presso il laboratorio di biologia molecolare della "New York University Medical Center, Department of Pathology, New York, U.S.A." diretto dal prof. Riccardo Dalla Favera.

1987-1990: Assistente medico con compiti assistenziali e responsabile del laboratorio di biologia molecolare e di diagnostica molecolare dei tumori dell'Istituto di Clinica Medica I dell'Università di Perugia, diretto dal prof. F. Grignani.

1987: Specialista in Medicina Interna, Università di Perugia, 50/50 e lode 1987: Dottore in Ricerca, Disciplina Biologia Molecolare 1990-1994: Aiuto Ospedaliero presso l'Istituto di Clinica Medica I dell'Università di Perugia, diretto dal prof. F.

Grignani 1994-2000 Professore Associato di Oncologia Medica, Università di Parma 2000-2003 Professore Ordinario di Patologia Generale, Università Vita e Salute San Raffaele, Milano. 1995- Chairman, Dipartimento di Oncologia Sperimentale, Istituto Europeo di Oncologia, Milano. 2001- Direttore Scientifico, Fondazione Scuola Superiore Europea di Medicina Molecolare (SEMM). 2003- Professore Ordinario di Patologia Generale, Università degli Studi di Milano, Milano. TITOLI DI STUDIO: 1981 Dottore in Medicina, Università di Perugia, 110/110 e lode 1987 Specialista in Medicina Interna, Università di Perugia, 50/50 e lode 1987 Dottore di Ricerca in Biologia Molecolare ATTIVITA' DIDATTICA: 1982: Incarico di insegnamento al "Terzo Corso Annuale di Specializzazione in Educazione Sanitaria".

Centro Sperimentale per l'Educazione Sanitaria, Università di Perugia. 1987-1994: Corsi integrativi e attivita' didattiche integrative, quale professore a contratto nella Scuola di

Specializzazione in Medicina Interna, Facoltà di Medicina, Università degli Studi di Perugia. 1988-1994: Attività didattica in forma di esercitazioni, seminari e partecipazione alla commissione di esame per

l'insegnamento di Genetica Umana per gli studenti della Facoltà di Medicina e Chirurgia dell'Università di Perugia.

1994-2000 Professore Associato, Corso di Oncologia Medica, Facoltà di Medicina, Università di Parma. 2000- Professore Ordinario, Corso di Patologia Generale, Facoltà di Medicina e Chirurgia, Università Vita

Salute S. Raffaele, Milano,

VIII


ATTIVITA' SCIENTIFICA L'attività di ricerca é documentata da 277 lavori originali e 41 rassegne pubblicati su riviste internazionali e 31 capitoli di libri. L'attività scientifica si é svolta sui seguenti temi: a) Meccanismi del riarrangiamento dei geni delle immunoglobuline e del recettore delle cellule T e loro impiego nella

diagnostica dei disordini linfoproliferativi. b) Analisi delle alterazioni genetiche delle cellule neoplastiche ed interpretazione delle stesse in termini di patogenesi della

trasformazione e marcatori tumorali specifici. In particolare sono stati studiati: alterazioni degli oncogeni c-myc e c-myb nei linfomi; alterazioni del gene RAR� nella leucemia acuta promielocitica

c) Studi clinici e biologici sulla terapia differenziativa con Acido Retinoico delle Leucemie Acute Mieloblastiche e di alcune neoplasie solide.

d) Clonaggio del gene Shc e definizione del ruolo della proteina SHC nella trasduzione del segnale da tirosin-chinasi attivate a Ras.

e) Meccanismi genetici dell’invecchiamento PUBBLICAZIONI

1. Alcalay M, Tiacci E, Bergomas R, Bigerna B, Venturini E, Minardi SP, Meani N, Diverio D, Bernard L, Tizzoni L, Volorio S, Luzi L, Colombo E, Lo Coco F, Mecucci C, Falini B, Pelicci P.G.. Acute myeloid leukemia bearing cytoplasmic nucleophosmin (NPMc+ AML) shows a distinct gene expression profile characterized by up-regulation of genes involved in stem-cell maintenance. Blood 106(3), 899-902, 2005.

2. Colombo E, Bonetti P, Lazzerini Denchi E, Martinelli P, Zamponi R, Marine JC, Helin K, Falini B, Pelicci P.G.. Nucleophosmin Is Required for DNA Integrity and p19Arf Protein Stability. Mol Cell Biol 25(20), 8874-86, 2005.

3. Falini B, Mecucci C, Tiacci E, Alcalay M, Rosati R, Pasqualucci L, La Starza R, Diverio D, Colombo E, Santucci A, Bigerna B, Pacini R, Pucciarini A, Liso A, Vignetti M, Fazi P, Meani N, Pettirossi V, Saglio G, Mandelli F, Lo-Coco F, Pelicci P.G., Martelli MF; GIMEMA Acute Leukemia Working Party. Cytoplasmic nucleophosmin in acute myelogenous leukemia with a normal karyotype. New Engl J Med 352(7), 740, 2005.

4. Giorgio M, Migliaccio E, Orsini F, Paolucci D, Moroni M, Contursi C, Pelliccia P, Luzi L, Minucci S, Marcaccio M, Pinton P, Rizzuto R, Bernardi P, Paolucci F, and Pelicci P.G.. Electron Transfer between Cytochrome c and p66Shc Generates Reactive Oxygen Species that Trigger Mitochondrial Apoptosis. Cell 122, 1-13, 2005.

5. Insinga A, Monestiroli S, Ronzoni S, Gelmetti V, Marchesi F, Viale A, Altucci L, Nervi C, Minucci S, Pelicci P.G.. Inhibitors of histone deacetylases induce tumor-selective apoptosis through activation of the death receptor pathway. Nat Med 11(2), 233, 2005.

6. Colombo E, Martinelli P, Zamponi R, Shing DC, Bonetti P, Luzi L, Volorio S, Bernard L, Pruneri G, Alcalay M, Pelicci P.G.. Delocalization and destabilization of the Arf tumor suppressor by the leukemia-associated NPM mutant. Cancer Res 66(6), 3044-50, 2006.

7. Mariano AR, Colombo E, Luzi L, Martinelli P, Volorio S, Bernard L, Meani N, Bergomas R, Alcalay M, Pelicci P.G.. Cytoplasmic localization of NPM in myeloid leukemias is dictated by gain-of-function mutations that create a functional nuclear export signal. Oncogene 25(31), 4376-80, 2006.

8. Villa R, Morey L, Raker VA, Buschbeck M, Gutierrez A, De Santis F, Corsaro M, Varas F, Bossi D, Minucci S, Pelicci P.G., Di Croce L. The methyl-CpG binding protein MBD1 is required for PML-RAR{alpha} function. Proc Natl Acad Sci U S A 103(5), 1400-5, 2006.

9. Di Micco R, Fumagalli M, Cicalese A, Piccinin S, Gasparini P, Luise C, Schurra C, Garre' M, Nuciforo PG, Bensimon A, Maestro R, Pelicci PG, d'Adda di Fagagna F. Oncogene-induced senescence is a DNA damage response triggered by DNA hyper-replication. Nature 444(7119), 638-42, 2006.

10. Fazi F, Zardo G, Gelmetti V, Travaglini L, Ciolfi A, Di Croce L, Rosa A, Bozzoni I, Grignani F, Lo-Coco F, Pelicci PG, Nervi C. Heterochromatic gene repression of the retinoic acid pathway in acute myeloid leukemia. Blood 2007

IX

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=pubmed&dopt=Abstract&list_uids=15831697&query_hl=1


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=pubmed&dopt=Abstract&list_uids=16540653&query_hl=1&itool=pubmed_docsum





MODULO 3 MODULO 3: DESCRIZIONE DEL CONTRIBUTO DI CIASCUNA UNITÀ OPERATIVA (Compilare un modulo per ciascuna UO) UNITÀ OPERATIVA N. 1: Istituto Europeo di Oncologia

RESPONSABILE SCIENTIFICO: nominativo: Prof. Pier Giuseppe Pelicci



N. tel: 02/57489831 N. fax: 02/94375991


RAPPRESENTANTE LEGALE: nominativo: Dott. Carlo Ciani

CONTRIBUTO SPECIFICO FORNITO AL PROGETTO (max 2000 caratteri) IEO. I gruppi di ricerca afferenti a IEO hanno messo a punto: i) protocolli per colture primarie di carcinomi mammari e melanomi (popolazioni “bulk” e staminali), glioblastoma (staminali; in collaborazione con Besta) e leucemie acute mieloidi (LTC-IC e colture in sospensione); ii) modelli animali di topi transgenici per leucemie (con PML-RAR; AML1-ETO e bcr-abl), melanomi (B-Raf) e tumori mammari (MMTV-erbB2) e modelli di xenotrapianto per glioblastoma, melanoma e tumore mammario. I gruppi IEO si dedicheranno allo studio degli HDACi. Ad oggi nell’uomo sono state identificate 18 HDAC, raggruppate in tre classi. Gli attuali inibitori delle deacetilasi istoniche in sperimentazione clinica (incluso il SAHA) mostrano tutti una bassa selettivita’ per i diversi isoenzimi HDAC. Uno di questi inibitori (VPA) è da diversi decenni in uso come farmaco antiepilettico ed è un inibitore specifico per HDAC di classe I. SAHA e VPA verranno utilizzati nei tumori mammari, melanomi, glioblastomi e leucemie mieloidi acute, come dettagliato nella “Descrizione della Proposta”. Contemporaneamente, mediante RNAi, saranno “spente” le varie HDAC di classe I per determinare quale HDAC e’ principalmente implicata nel mantenimento del fenotipo tumorale ed eventualmente nella sensibilita’ agli HDACi. IDI. Il gruppo IDI coinvolto in questo progetto partecipera’ agli studi degli effetti di HDACi in carcinomi mammary, melanomi e leucemie mieloidi studiando, in particolare la regolazione farmacologica della famiglia p53/p63/p73. ICH. Un sottotipo di liposarcomi umani e’ caratterizzato dalla presenza del fattore di trascrizione chimerico FUS-CHOP e dalla sensibilita’ all’effetto citotossico di un nuovo agente anti-tumorale: ET-743, un prodotto naturale in sperimentazione clinica. Il gruppo di ricerca di Humanitas testera’ l’ipotesi che il farmaco ET-743 agisca bloccando la capacita’ transattivante di FUS-CHOP.

X

Alleanza Contro il Cancro (ACC) – Istituto Superiore di Sanità (ISS) Art.3 DM 21 luglio 2006 - Programma Straordinario di Ricerca Oncologica 2006 Programma 3 “Rete solidale e collaborazioni internazionali” METODOLOGIA (max 4000 caratteri)

Dal punto di vista metodologico, la esecuzione di questo progetto di ricerca comporta i seguenti principali approcci tecnologici (tutti già disponibili nel laboratorio del proponente):

a) Propagazione in vitro di cellule staminali ematopoietiche, di melanoma, glioblastomas e mammarie umane e murine mediante colture a lungo termine di midollo osseo (LTC-IC) o mammosfere, melanosfere, neurosfere rispettivamente. b) Ingegnerizzazione dellecellule staminali. Le cellule staminali ematopoietiche e mammarie verranno modificate geneticamente mediante uso di retrovirus o lentivirus, al fine di esprimere proteine mutanti o di attenuare l’espressione di geni endogeni (RNAi). c) Trapianto di celle staminali nell’animale da esperimento. Le cellule staminali emopoietiche, neuroinali, melanocitiche e mammarie propagate (e manipolate) in vitro verranno poi trapiantate, rispettivamente, in topi letalmente irradiati, sottocute, intracerebralmente o nel grasso mammario (previamente svuotato di tessuto mammario endogeno). d) Esecuzione di profili di espressione. Vari campioni cellulari (comprese specifiche sottopopolazioni di staminali/progenitori) di origine ematopoietica o da tessuto mammario verranno analizzati per i loro profili di espressione genica, mediante tecnologia Affimetrix. e) Tecniche convenzionali di imaging, biologia molecolare e biochimica. Questo progetto prevede l’uso di tecnologie standard di imaging (in vitro e in vivo), biologia molecolare (produzione di virus ricombinanti), biologia cellulare (trasfezioni, infezioni etc.) e biochimica (proteomica, studi di interazioni proteiche etc).

XI


MODULO 3

COMPOSIZIONE DEL COSTO DELL’UNITÀ OPERATIVA Voci di costo e breve descrizione Totale di cui a carico dei fondi ministeriali

1. Personale dipendente € 554.000,00 NULLA _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ 2. Personale a contratto/consulenza/borsa di studio € 521.000,00 € 521.000,00 _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ 3. Missioni € 5.000,00 € 5.000,00 _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ 4. Attrezzature (solo a noleggio o leasing): ________ ________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ 5. Materiale di consumo € 1.128.000,00 € 1.008.500,00 ____________________________________________ ____________________________________________ ____________________________________________ 6. Pubblicazioni / organizzazione convegni, ecc. € 1.000,00 € 1.000,00 ___________________________________________ ____________________________________________ ____________________________________________ 7. Elaborazione dati (specificare) __________ ____________ ___________________________________________ ___________________________________________ ___________________________________________ 8. Spese generali delle strutture coinvolte (specificare) € 401.500,00 € 294.500,00 ___________________________________________ ___________________________________________ ___________________________________________ TOTALE € 2.610.500,00 € 1.830.000,00

XII


MODULO 3

Curriculum Vitae del Responsabile Scientifico dell’Unità Operativa (max 1 pagina) (PERIODO DI RIFERIMENTO: ULTIMI 5 ANNI; INDICARE ANCHE LE 10 PUBBLICAZIONI SCIENTIFICHE RITENUTE PIÙ SIGNIFICATIVE, CON PARTICOLARE RIFERIMENTO A QUELLE DELL’AREA TEMATICA SCIENTIFICA SULLA QUALE INSISTE IL PROGETTO) Curriculum Vitae Prof. Pier Giuseppe Pelicci, M.D. - Ph.D. Data di nascita: 5 Settembre 1956 Luogo di nascita: Gubbio (Perugia), Italia 1995- Chairman, Dipartimento di Oncologia Sperimentale, Istituto Europeo di Oncologia, Milano. 2001- Direttore Scientifico, Fondazione Scuola Superiore Europea di Medicina Molecolare (SEMM). 2003- Professore Ordinario di Patologia Generale, Università degli Studi di Milano, Milano. ATTIVITA' SCIENTIFICA L'attività di ricerca é documentata da 277 lavori originali e 41 rassegne pubblicati su riviste internazionali e 31 capitoli di libri. L'attività scientifica si é svolta sui seguenti temi: a) Meccanismi del riarrangiamento dei geni delle immunoglobuline e del recettore delle cellule T e loro impiego nella

diagnostica dei disordini linfoproliferativi. b) Analisi delle alterazioni genetiche delle cellule neoplastiche ed interpretazione delle stesse in termini di patogenesi della

trasformazione e marcatori tumorali specifici. In particolare sono stati studiati: alterazioni degli oncogeni c-myc e c-myb nei linfomi; alterazioni del gene RAR� nella leucemia acuta promielocitica

c) Studi clinici e biologici sulla terapia differenziativa con Acido Retinoico delle Leucemie Acute Mieloblastiche e di alcune neoplasie solide.

d) Clonaggio del gene Shc e definizione del ruolo della proteina SHC nella trasduzione del segnale da tirosin-chinasi attivate a Ras.

e) Meccanismi genetici dell’invecchiamento PUBBLICAZIONI

1. Alcalay M, Tiacci E, Bergomas R, Bigerna B, Venturini E, Minardi SP, Meani N, Diverio D, Bernard L, Tizzoni L, Volorio S, Luzi L, Colombo E, Lo Coco F, Mecucci C, Falini B, Pelicci P.G.. Acute myeloid leukemia bearing cytoplasmic nucleophosmin (NPMc+ AML) shows a distinct gene expression profile characterized by up-regulation of genes involved in stem-cell maintenance. Blood 106(3), 899-902, 2005.

2. Colombo E, Bonetti P, Lazzerini Denchi E, Martinelli P, Zamponi R, Marine JC, Helin K, Falini B, Pelicci P.G.. Nucleophosmin Is Required for DNA Integrity and p19Arf Protein Stability. Mol Cell Biol 25(20), 8874-86, 2005.

3. Falini B, Mecucci C, Tiacci E, Alcalay M, Rosati R, Pasqualucci L, La Starza R, Diverio D, Colombo E, Santucci A, Bigerna B, Pacini R, Pucciarini A, Liso A, Vignetti M, Fazi P, Meani N, Pettirossi V, Saglio G, Mandelli F, Lo-Coco F, Pelicci P.G., Martelli MF; GIMEMA Acute Leukemia Working Party. Cytoplasmic nucleophosmin in acute myelogenous leukemia with a normal karyotype. New Engl J Med 352(7), 740, 2005.

4. Giorgio M, Migliaccio E, Orsini F, Paolucci D, Moroni M, Contursi C, Pelliccia P, Luzi L, Minucci S, Marcaccio M, Pinton P, Rizzuto R, Bernardi P, Paolucci F, and Pelicci P.G.. Electron Transfer between Cytochrome c and p66Shc Generates Reactive Oxygen Species that Trigger Mitochondrial Apoptosis. Cell 122, 1-13, 2005.

5. Insinga A, Monestiroli S, Ronzoni S, Gelmetti V, Marchesi F, Viale A, Altucci L, Nervi C, Minucci S, Pelicci P.G.. Inhibitors of histone deacetylases induce tumor-selective apoptosis through activation of the death receptor pathway. Nat Med 11(2), 233, 2005.

6. Colombo E, Martinelli P, Zamponi R, Shing DC, Bonetti P, Luzi L, Volorio S, Bernard L, Pruneri G, Alcalay M, Pelicci P.G.. Delocalization and destabilization of the Arf tumor suppressor by the leukemia-associated NPM mutant. Cancer Res 66(6), 3044-50, 2006.

7. Mariano AR, Colombo E, Luzi L, Martinelli P, Volorio S, Bernard L, Meani N, Bergomas R, Alcalay M, Pelicci P.G.. Cytoplasmic localization of NPM in myeloid leukemias is dictated by gain-of-function mutations that create a functional nuclear export signal. Oncogene 25(31), 4376-80, 2006.

8. Villa R, Morey L, Raker VA, Buschbeck M, Gutierrez A, De Santis F, Corsaro M, Varas F, Bossi D, Minucci S, Pelicci P.G., Di Croce L. The methyl-CpG binding protein MBD1 is required for PML-RAR{alpha} function. Proc Natl Acad Sci U S A 103(5), 1400-5, 2006.

9. Di Micco R, Fumagalli M, Cicalese A, Piccinin S, Gasparini P, Luise C, Schurra C, Garre' M, Nuciforo PG, Bensimon A, Maestro R, Pelicci PG, d'Adda di Fagagna F. Oncogene-induced senescence is a DNA damage response triggered by DNA hyper-replication. Nature 444(7119), 638-42, 2006.

10. Fazi F, Zardo G, Gelmetti V, Travaglini L, Ciolfi A, Di Croce L, Rosa A, Bozzoni I, Grignani F, Lo-Coco F, Pelicci PG, Nervi C. Heterochromatic gene repression of the retinoic acid pathway in acute myeloid leukemia. Blood 2007

XIII








MODULO 3BIS MODULO 3BIS: DESCRIZIONE DEL CONTRIBUTO DI CIASCUN GRUPPO DI RICERCA (Si devono presentare tanti moduli 3bis quanti sono i gruppi di ricerca coinvolti) GRUPPO DI RICERCA: 1. Dipartimento di Oncologia Sperimentale - Istituto Europeo di Oncologia (Prof. Pier

Giuseppe Pelicci)

RESPONSABILE SCIENTIFICO: nominativo: Prof. Pier Giuseppe Pelicci



N. tel: 02/57489831 N. fax: 02/94375991



CONTRIBUTO SPECIFICO FORNITO AL PROGETTO (max 500 caratteri) Recentemente abbiamo perfezionato il protocollo di coltivazione delle cellule epiteliali della ghiandola mammaria (mammosfere) e dimostrato che le mammosfere murine sono in grado di differenziare in cellule duttali e mioepiteliali, quando vengono coltivate in presenza di siero in condizioni di aderenza su collagene e ricostituire la ghiandola mammaria svuotata. E’ nostra intenzione purificare cellule staminali normali e da mammelle dei topi MMTV-ErbB2/neu, che sviluppano tumori spontanei alla ghiandola mammaria. Utilizzeremo quindi popolazioni staminali purificate per testare la loro sensibilita’ a inibitori di istone-deacetilasi. METODOLOGIA (max 1000 caratteri) Le cellule mammarie verranno purificate mediante selezione negativa con quattro anticorpi (CD45, CD31, CD140a e TER119) e coltivate in condizione di non adesione (mammosfere). Allo scopo d’identificare la cellula o le cellule staminali presenti nella mammosfera, adotteremo una strategia alternativa sfruttando la capacita’ di tali cellule di rimanere quiescenti dopo la divisione asimmetrica. Per raggiungere tale obiettivo, le cellule epiteliali, purificate come descritto sopra, verranno colorate con il PKH, un colorante che s’inserisce nella membrana cellulare e e viene diluito durante le varie divisioni cellulari: in questo modo le cellule che replicano poco (cellule quiescenti) trattengono il colorante e sono localizzate nel centro della mammosfera, rispetto alla maggioranza delle cellule presenti nella periferia che non sono colorate e rappresentano le cellule progenitrici.

XIV


MODULO 3BIS

COMPOSIZIONE DEL COSTO DEL GRUPPO DI RICERCA Voci di costo e breve descrizione Totale di cui a carico dei fondi ministeriali

1. Personale dipendente € 90.000 ,00 NULLA _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ 2. Personale a contratto/consulenza/borsa di studio € 120.000,00 € 120.000,00 _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ 3. Missioni ________ ________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ 4. Attrezzature (solo a noleggio o leasing): ________ ________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ 5. Materiale di consumo €210.000,00 € 180.000,00 ____________________________________________ ____________________________________________ ____________________________________________ 6. Pubblicazioni / organizzazione convegni, ecc. _________ ___________ ___________________________________________ ____________________________________________ ____________________________________________ 7. Elaborazione dati (specificare) __________ ____________ ___________________________________________ ___________________________________________ ___________________________________________ 8. Spese generali delle strutture coinvolte (specificare) € 84.000,00 € 60.000,00 ___________________________________________ ___________________________________________ ___________________________________________ TOTALE € 504.000,00 € 360.000,00

XV


MODULO 3BIS MODULO 3BIS: DESCRIZIONE DEL CONTRIBUTO DI CIASCUN GRUPPO DI RICERCA (Si devono presentare tanti moduli 3bis quanti sono i gruppi di ricerca coinvolti) GRUPPO DI RICERCA: 2. Dipartimento di Oncologia Sperimentale - Istituto Europeo di Oncologia (Prof. Saverio

Minucci)

RESPONSABILE SCIENTIFICO: nominativo: Prof. Saverio Minucci

struttura di appartenenza : Istituto Europeo di Oncologia funzione: Group Leader


N. tel: 02/57489832 N. fax: 02/94375990



CONTRIBUTO SPECIFICO FORNITO AL PROGETTO (max 500 caratteri) Il nostro obiettivo e’ la identificazione di marcatori biologici e molecolari di predizione della risposta clinica agli inibitori di istone-deacetilasi. Lo studio si articolerà in tre fasi principali: Fase 1: Valutazione della attivita’ biologica, biochimica e molecolare di ciascun farmaco ed identificazione di potenziali marcatori. Fase 2: Valutazione dell’espressione dei marcatori di risposta. Fase 3: Validazione della efficacia predittiva dei marcatori selezionati. METODOLOGIA (max 1000 caratteri) In collaborazione con gli altri gruppi di ricerca afferenti a IEO, questo gruppo ha messo a punto: i) protocolli per colture primarie di carcinomi mammari (popolazioni “bulk” e staminali), glioblastoma (staminali; in collaborazione con Besta) e leucemie acute mieloidi (LTC-IC e colture in sospensione); ii) modelli animali di topi transgenici per leucemie (con PML-RAR; AML1-ETO e bcr-abl), e tumori mammari (MMTV-erbB2). Il nostro gruppo si dedicherà allo studio dell’effetto degli inibitori delle istone deacetilasi in questi modelli, mirando principalmente (mediante l’esecuzione sistematica di profili di espressione genica in tumore/normale, in correlazione con la risposta al trattamento con inibitori di HDAC in vitro/in vivo) alla identificazione e successiva validazione di marcatori predittivi di risposta a tali farmaci. Se validati, tali marcatori saranno usati successivamente in studi clinici.

XVI


MODULO 3BIS



XVII


MODULO 3BIS: DESCRIZIONE DEL CONTRIBUTO DI CIASCUN GRUPPO DI RICERCA (Si devono presentare tanti moduli 3bis quanti sono i gruppi di ricerca coinvolti) GRUPPO DI RICERCA: 3. Dipartimento di Oncologia Sperimentale - Istituto Europeo di Oncologia (Dott.ssa Susanna

Chiocca)

RESPONSABILE SCIENTIFICO: nominativo: Dott.ssa Susanna Chiocca



N. tel: 02/57489835 N. fax: 02/94375990



CONTRIBUTO SPECIFICO FORNITO AL PROGETTO (max 500 caratteri) Questo gruppo di ricerca si dedicherà alla messa a punto di protocolli per il silenziamento mediante RNAi delle HDAC di classe I (identificazione di sequenze oligonucleotidiche e clonaggio in vettori adeguati), e si dedicherà in collaborazione con gli altri gruppi di ricerca IEO allo studio mediante tali tecnologie del ruolo delle varie HDAC di classe I nel mantenimento del fenotipo tumorale e nella determinazione della sensibilità agli inibitori della istone deacetilasi. METODOLOGIA (max 1000 caratteri) Studieremo la attivita’ anti-tumorale di HDACi (VPA e SAHA) nei tumori della mammella, melanomi, glioblastomi e leucemie acute mieloidi. Questi modelli cellulari ed animali verranno usati per identificare (mediante knock-down sistematico delle HDAC di classe I) quali sono le specifiche HDAC coinvolte nel mantenimento del fenotipo tumorale, e nella determinazione della sensitività a VPA e SAHA. In particolare, valuteremo nei modelli ex vivo la capacità proliferativa e differenziativa delle culture primarie tumorali (bulk e staminali) prima/dopo silenziamento, e la capacità tumorigenica in vivo di cellule esprimenti vari oncogeni attivati, prima/dopo il silenziamento delle varie HDAC. Una volta identificate le HDAC chiave, profili di espressione genica mirati tenteranno di identificare marcatori “HDAC-specifici”, a complemento dei marcatori generali di risposta identificati negli studi effettuati dagli altri gruppi di ricerca.

XVIII


MODULO 3BIS



XIX


MODULO 3BIS MODULO 3BIS: DESCRIZIONE DEL CONTRIBUTO DI CIASCUN GRUPPO DI RICERCA (Si devono presentare tanti moduli 3bis quanti sono i gruppi di ricerca coinvolti) GRUPPO DI RICERCA: 4. Dipartimento di Oncologia Sperimentale - Istituto Europeo di Oncologia (Prof. Salvatore

Pece)

RESPONSABILE SCIENTIFICO: nominativo: Prof. Salvatore Pece

struttura di appartenenza : Istituto Europeo di Oncologia funzione: Ricercatore

indirizzo : Via Ripamonti, 435 – 20141 Milano

N. tel: 02/57489434 N. fax: 02/57489851



CONTRIBUTO SPECIFICO FORNITO AL PROGETTO (max 500 caratteri) Il contributo di questa U.O. consistera’ nell’utilizzo di colture primarie a lungo termine e di cellule staminali, isolate da tumori mammari umani, come sistemi-modello pre-clinici di malattia neoplastica per: i) validazione funzionale di specifici meccanismi molecolari, oggetto di studio di questo progetto, quali effettivi bersagli farmacologici anti-tumorali; ii) identificazione e validazione di ‘bio-marcatori’ per la stratificazione dei pazienti ed il monitoraggio delle terapie molecolari. METODOLOGIA (max 1000 caratteri) 1. Caratterizzazione di tumori mammari con sovversione funzionale di HDACs e ErbB2, e validazione di bio-marcatori per la stratificazione dei pazienti e il monitoraggio di terapie molecolari. Saranno usate tecniche di immunoistochimica (valutazione dello stato globale di acetilazione istonica; espressione di ErbB2) e ibridizzazione in situ (FISH per diverse HDACs e ErbB2) su tessuti tumorali inclusi in paraffina. 2. Utilizzo di colture primarie, da tumori previamente caratterizzati per gli specifici bersagli molecolari, per lo studio di fenotipi cellulari (proliferazione, differenziazione, apoptosi) e profili di espressione genica (Affymetrix) in risposta a: i) uso di farmaci con azione molecolare (HDACi, Herceptin); ii) ablazione di bersagli molecolari tramite RNAi. 3. Utilizzo di cellule staminali tumorali per valutare gli effetti dei suddetti farmaci sui programmi di morfogenesi tumorale (saggi di formazione di mammosfere in sospensione e organogenesi tumorale in 3D- matrigel).

XX


MODULO 3BIS



XXI


MODULO 3BIS MODULO 3BIS: DESCRIZIONE DEL CONTRIBUTO DI CIASCUN GRUPPO DI RICERCA (Si devono presentare tanti moduli 3bis quanti sono i gruppi di ricerca coinvolti) GRUPPO DI RICERCA: 5. Dipartimento di Oncologia Sperimentale - Istituto Europeo di Oncologia (Dott.ssa

Giuseppina Bonizzi)

RESPONSABILE SCIENTIFICO: nominativo: Dott.ssa Giuseppina Bonizzi

struttura di appartenenza : Istituto Europeo di Oncologia funzione: Ricercatore

indirizzo : Via Ripamonti, 435 – 20141 Milano

N. tel: 02/57489434 N. fax: 02/57489851



CONTRIBUTO SPECIFICO FORNITO AL PROGETTO (max 500 caratteri) Il nostro gruppo, negli ultimi anni, ha identificato e validato in vitro e in vivo culture primarie di cellule staminali provenienti da modelli murini di cancerogenesi mammaria. La stessa metodologia è stata applicata con successo a tessuto tumorale umano. La possibilità di discriminare cellule staminali da progenitrici, permetterà di identificare le cellule sensibili ai vari farmaci molecolari e di validare l’accuratezza predittiva in modelli di xenotrapianto di nuovi marcatori molecolari identificati. METODOLOGIA (max 1000 caratteri) 1. Identificazione delle cellule staminali tumorali provenienti da topi MMTV-ErbB2/neu che sviluppano tumori spontanei della mammella. Le cellule epiteliali tumorali verranno colorate con il PKH, seguendo il protocollo da noi validato che permette di discriminare le cellule staminali dai progenitori. Tali cellule verranno trattate con i farmaci molecolari a nostra disposizione descritti sopra in maniera da determinare la cellula sensibile al trattamento e i pathway coinvolti. In vitro tali cellule verranno testate per determinare la sopravvivenza durante trattamento e per identificare nuovi pathway responsabili della resistenza. In parallelo, queste stesse cellule verranno iniettate nel topo secondo le metodiche in uso per valutare la capacità di tali farmaci di inibire la crescita tumorale in vivo. 2. Cellule e pezzi operatori provenienti da tumori mammari umani, verranno xenotrapiantati sottocute in topi immunodeficienti per permettere di identificare l’efficacia in vivo di tali farmaci molecolari. L’identificazione in vivo dell’efficacia di un trattamento permetterà di ottenere la migliore terapia per quel determinato paziente.

XXII


MODULO 3BIS


1. Personale dipendente € 70.000 ,00 NULLA _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ 2. Personale a contratto/consulenza/borsa di studio € 90.000,00 € 90.000,00 _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ 3. Missioni ________ ________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ 4. Attrezzature (solo a noleggio o leasing): ________ ________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ 5. Materiale di consumo €150.000,00 € 131.000,00 ____________________________________________ ____________________________________________ ____________________________________________ 6. Pubblicazioni / organizzazione convegni, ecc. _________ ___________ ___________________________________________ ____________________________________________ ____________________________________________ 7. Elaborazione dati (specificare) __________ ____________ ___________________________________________ ___________________________________________ ___________________________________________ 8. Spese generali delle strutture coinvolte (specificare) € 61.000,00 € 44.000,00 ___________________________________________ ___________________________________________ ___________________________________________ TOTALE €371.000,00 € 265.000,00

XXIII


MODULO 3BIS MODULO 3BIS: DESCRIZIONE DEL CONTRIBUTO DI CIASCUN GRUPPO DI RICERCA (Si devono presentare tanti moduli 3bis quanti sono i gruppi di ricerca coinvolti) GRUPPO DI RICERCA: 6. Dipartimento di Oncologia Sperimentale - Istituto Europeo di Oncologia (Dott.ssa Luisa

Lanfrancone)

RESPONSABILE SCIENTIFICO: nominativo: Dott.ssa Luisa Lanfrancone



N. tel: 02/94375011 N. fax: 02/94375991

indirizzo E-mail :[email protected]


CONTRIBUTO SPECIFICO FORNITO AL PROGETTO (max 500 caratteri) Il contributo specifico fornito da questo gruppo di ricerca è quello di identificare e caratterizzare nuovi bersagli cellulari e molecolari per un potenziale intervento terapeutico nel melanoma metastatico. Recenti evidenze sperimentali indicherebbero infatti la presenza di una cellula staminale melanocitaria in linee cellulari di melanoma, non considerata quale bersaglio delle attuali terapie. Ulteriori studi sono richiesti per isolare e caratterizzare tale popolazione nel contesto di campioni bioptici di melanoma, oltre che per valutare le eventuali capacità tumorigeniche in vivo e per identificare le molecole coinvolte nei processi di divisione cellulare, proliferazione e differenziazione di queste cellule. Tale popolazione staminale verrà quindi utilizzata per verificare la sensibilità ai farmaci e il loro eventuale meccanismo di azione nel melanoma. METODOLOGIA (max 1000 caratteri) COLTURE PRIMARIE DI CELLULE DI MELANOMA Le biopsie di melanoma verranno suddivise per poter isolare cellule da crescere in aderenza (colture primarie di melanoma) e in sospensione. Una delle caratteristiche, infatti, delle cellule staminali isolate da altri tumori (gliomi, carcinomi della mammella e del polmone) è quella di crescere in assenza di aderenza al substrato, formando aggregati cellulari definiti sfere. Queste sfere (melano-sfere) verranno susseguentemente caratterizzate per l’espressione dei marcatori precedentemente identificati, quali il CD20, il CD133 e la nestina. I campioni bioptici di melanoma sono in grado di generare colture continue di cellule in aderenza nel laboratorio del proponente: queste colture verranno quindi caratterizzate per il loro livello di differenziazione e la sensibilità ai farmaci valutata in entrambe le popolazioni. CARATTERIZZAZIONE BIOLOGICA E BIOCHIMICA DELLE CELLULE DI MELANOMA TRATTATE CON I FARMACI I campioni bioptici di melanoma verranno caratterizzati per l’espressione, lo stato di attivazione e le alterazioni genetiche di B-Raf e N-Ras. Le vie molecolari implicate nell’attivazione di questi oncogeni verranno valutate durante l’azione dei farmaci sulle popolazioni cellulari cresciute in coltura. Livelli di attivazione dei recettori tirosin chinatici e integrinici, così come delle loro molecole bersaglio, verrà analizzato mediante studi biochimici e validato inibendo le molecole coinvolte mediante interferenza a RNA. Proliferazione ed apoptosi verranno valutate mediante citofluorimetria con marcatori specifici (Ki-67, caspasi 3 e Tunel assay). MODELLI ANIMALI DI MELANOMA Un modello di attivazione di B-Raf in vivo mediante mutazione V600E è attualmente in corso di preparazione nel laboratorio del proponente. Tale modello verrà utilizzato per generare melanomi murini in vivo ed validare l’efficacia dei farmaci usati in vitro.

XXIV


MODULO 3BIS


1. Personale dipendente € 60.000 ,00 NULLA _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ 2. Personale a contratto/consulenza/borsa di studio € 72.000,00 € 72.000,00 _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ 3. Missioni ________ ________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ 4. Attrezzature (solo a noleggio o leasing): ________ ________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ 5. Materiale di consumo €160.000,00 € 137.000,00 ____________________________________________ ____________________________________________ ____________________________________________ 6. Pubblicazioni / organizzazione convegni, ecc. _________ ___________ ___________________________________________ ____________________________________________ ____________________________________________ 7. Elaborazione dati (specificare) __________ ____________ ___________________________________________ ___________________________________________ ___________________________________________ 8. Spese generali delle strutture coinvolte (specificare) € 58.000,00 € 41.000,00 ___________________________________________ ___________________________________________ ___________________________________________ TOTALE €350.000,00 € 250.000,00

XXV


MODULO 3BIS: DESCRIZIONE DEL CONTRIBUTO DI CIASCUN GRUPPO DI RICERCA (Si devono presentare tanti moduli 3bis quanti sono i gruppi di ricerca coinvolti) GRUPPO DI RICERCA: 7. Laboratorio di Immunologia e infiammazione – IRCCS Istituto Clinico Humanitas -

(Dott.ssa Paola Allavena)

RESPONSABILE SCIENTIFICO: nominativo: Dott.ssa Paola Allavena

struttura di appartenenza : IRCCS Istituto Clinico Humanitas – Humanitas Mirasole SpA funzione: Medico

indirizzo : Via Manzoni, 56 – 20089 Rozzano (MI)

N. tel: 02/82245112 N. fax: 02/82245191


RAPPRESENTANTE LEGALE: nominativo: Dott. Ivan Michele Colombo

CONTRIBUTO SPECIFICO FORNITO AL PROGETTO (max 500 caratteri) Meccanismo d’azione del farmaco anti-tumorale Trabectedin in liposarcomi umani FUS-CHOP positivi 1. Validare l’ipotesi che il farmaco Trabectedin (ET-743) agisca bloccando la capacita’ transattivante della proteina di

fusione FUS-CHOP in liposarcomi umani. 2. Studiare l’effetto del farmaco su altri geni a valle del trascritto FUS-CHOP (citochine, chemochine, geni regolatori

dell’apoptosi). 3. Studiare gli effetti biologici dei geni attivati dal trascritto FUS-CHOP in liposarcomi umani in particolare la proteina

infiammatoria PTX3. METODOLOGIA (max 1000 caratteri) Un sottotipo di liposarcomi umani e’ caratterizzato dalla traslocazione t(12;16)(q13;p11) che risulta in un trascritto di fusione FUS-CHOP, patogenetico della malattia. Questo trascritto agisce come un fattore trascrizionale abnorme che attiva alcuni geni, tra questi Pentraxin-3 (PTX-3), un proteina infiammatoria originariamente descritta dal gruppo proponente. (Garlanda et al. Annual Rev. Immunol. 2005). Trabectedin e’ un nuovo farmaco anti-tumorale molto attivo sui liposarcomi. Il progetto si propone di studiare se il trascritto FUS-CHOP e’ il bersaglio del farmaco. Sono disponibili linee cellulari di liposarcoma aventi e non il trascritto FUS-CHOP. Il meccanismo di regolazione della trascrizione sara’ studiato con analisi Chromatin Immune-precipitation (CHIP) dopo trattamento con il farmaco. I liposarcomi producono elevati livelli di PTX3, che e’ fortemente ridotta in seguito a trattamento in vitro con Trabectedin. Gli effetti biologici di PTX3 nei liposarcomi umani saranno studiati in linee cellulari e in tumori primari stabilizzati come xenotrapianti. Esperimenti di gene silencing con siRNA per PTX3 verranno effettuati in vitro e in vivo.

XXVI

mailto:[email protected]


MODULO 3BIS


1. Personale dipendente € 50.000 ,00 NULLA _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ 2. Personale a contratto/consulenza/borsa di studio € 20.000,00 € 20.000,00 _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ 3. Missioni ________ ________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ 4. Attrezzature (solo a noleggio o leasing): ________ ________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ 5. Materiale di consumo € 88.000,00 € 88.000,00 ____________________________________________ ____________________________________________ ____________________________________________ 6. Pubblicazioni / organizzazione convegni, ecc. __________ ____________ ___________________________________________ ____________________________________________ ____________________________________________ 7. Elaborazione dati (specificare) __________ ____________ ___________________________________________ ___________________________________________ ___________________________________________ 8. Spese generali delle strutture coinvolte (specificare) € 12.000,00 € 12.000,00 ___________________________________________ ___________________________________________ ___________________________________________ TOTALE € 170.000,00 € 120.000,00

XXVII


MODULO 3BIS: DESCRIZIONE DEL CONTRIBUTO DI CIASCUN GRUPPO DI RICERCA (Si devono presentare tanti moduli 3bis quanti sono i gruppi di ricerca coinvolti) GRUPPO DI RICERCA: 8. Laboratorio di Biochimica - Istituto Dermopatico dell’Immacolata - (Dott. Alessandro

Terrinoni)

RESPONSABILE SCIENTIFICO: nominativo: Dott. Alessandro Terrinoni

struttura di appartenenza : Istituto Dermopatico dell’Immacolata funzione: Ricercatore

indirizzo : Via Monti di Creta, 104 – 00167 Roma

N. tel: 06/72596469 N. fax: 06/20427290

indirizzo E-mail :[email protected]

RAPPRESENTANTE LEGALE: nominativo: Dott. Eugenio Luchetti

CONTRIBUTO SPECIFICO FORNITO AL PROGETTO (max 500 caratteri) Valutazione dell’espressione di p53delle isoforme dei geni della sua famiglia, p63e p73 in tumori cutanei e linfomi. Questo studio sarà principalmente condotto su diverse linee cellulari tumorali primarie e successivamente su biopsie di pazienti. Inoltre verrà studiata la regolazione dell’espressione della E3 Ligasi Itch, che è importante nella regolazione della stabilità di queste proteine dopo danno genotossico. Su carcinomi mammari, melanomi e leucemie mieloidi verrà studiato l’effetto di HDACi in relazione alla modulazione farmacologica della famiglia di p53. Regolazione diretta od inibizione/induzione delle loro E3 ligasi. METODOLOGIA (max 1000 caratteri) Analizzeremo l’espressione di Itch endogeno in diverse linee di melanoma, con diverse caratteristiche istologiche. Inoltre l’analisi verrà effettuata in seguito a vari trattamenti chemioterapici. In particolare useremo chemioterapici come il cisplatino, etoposide, taxolo e UVB (tipicamente alle dosi di 5-20 µM, 10-25 µM, 25-100 nM, and 30J/m2 rispettivamente). Per lo studio in vivo abbiamo già disponibili topi p63-/-, p73-/- ed Itch-/-. Genereremo topi transgenici per p63 utilizzando la tecnologia precedentemente usata nel nostro laboratorio. In breve il gene p63 verrà clonato a valle del promotore della cheratina 14 per indurre l’espressione di p63 unicamente nello strato basale dell’ epidermide. Analizzeremo l’espressione di p63 esogeno sia per RT-PCR che per immunoistichimica utilizzando sezioni dell’epidermide.

XXVIII


MODULO 3BIS


1. Personale dipendente € 70.000 ,00 NULLA _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ 2. Personale a contratto/consulenza/borsa di studio € 3.000,00 € 3.000,00 _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ 3. Missioni € 5.000,00 € 5.000,00 _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ 4. Attrezzature (solo a noleggio o leasing): ________ ________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ 5. Materiale di consumo € 80.000,00 € 67.500,00 ____________________________________________ ____________________________________________ ____________________________________________ 6. Pubblicazioni / organizzazione convegni, ecc. € 1.000,00 € 1.000,00 ___________________________________________ ____________________________________________ ____________________________________________ 7. Elaborazione dati (specificare) __________ ____________ ___________________________________________ ___________________________________________ ___________________________________________ 8. Spese generali delle strutture coinvolte (specificare) € 13.500,00 € 13.500,00 ___________________________________________ ___________________________________________ ___________________________________________ TOTALE € 172.500,00 € 90.000,00

XXIX


MODULO 3 MODULO 3: DESCRIZIONE DEL CONTRIBUTO DI CIASCUNA UNITÀ OPERATIVA (Compilare un modulo per ciascuna UO) UNITA’ OPERATIVA N. 2: Fondazione IRCCS “Istituto Nazionale dei Tumori”

RESPONSABILE SCIENTIFICO: nominativo: Dott.ssa Maria Grazia Daidone

struttura di appartenenza : Ricerca Traslazionale funzione: Direttore

indirizzo : Via Venezian, 1. Milano

N. tel: 02/23902238 N. fax: 02/23903052

indirizzo E-mail: [email protected]

RAPPRESENTANTE LEGALE: nominativo: Dott. Stefano Zurrida

CONTRIBUTO SPECIFICO FORNITO AL PROGETTO (max 2000 caratteri) L’obiettivo della nuova Medicina Molecolare è la definizione degli specifici difetti genetico-molecolari di un determinato tumore per il disegno di trattamenti appropriati e già disponibili nella pratica clinica sono farmaci mirati contro bersagli molecolari così come già acquisite sono informazioni relative ai meccanismi che condizionano stabilmente il microambiente tumorale e, conseguentemente, influiscono significativamente sia nella progressione tumorale sia nei fenomeni di resistenza e di non risposta ai farmaci. In base alla considerazione che enzimi tirosin chinasici sono coinvolti in pathways di proliferazione e sopravvivenza cellulare e che alcuni di essi hanno un ruolo regolatorio in tali processi, l’inibizione di queste attività enzimatiche, attivate in modo aberrante in diversi tipi di tumore, rappresenta un promettente approccio con differenti opportunità terapeutiche con cui interferire a diversi livelli sulla patofisiologia della cellula tumorale. In relazione al loro ruolo fondamentale nella trasduzione del segnale mitogenico e quindi nei processi di proliferazione e differenziamento cellulare così come nell’attivazione dell’angiogenesi, i recettori ad attività tirosin-chinasica sono stati oggetto di una ricerca finalizzata all’identificazione di molecole in grado di interferire sulla loro attività in modo specifico. Attualmente diversi inibitori tirosin-chinasici, sia recettoriali che citoplasmatici, sono già utilizzati in clinica: generalmente si tratta di anticorpi monoclonali che legano la porzione extracellulare del recettore inibendone l’interazione col ligando (cetuximab con EGFR, trastuzumab con HER-2, IMC-1C11 con VEGFR) o impedendone la dimerizzazione (pertuzumab con HER-2) e di piccole molecole capaci di inibirne l’attività enzimatica (imatinib con la proteina di fusione BCR/ABL, gefitinib con EGFR). L’applicazione di una terapia personalizzata si basa sull’identificazione di target patologicamente deregolati. che svolgono un ruolo cruciale nella biologia della cellula tumorale e/o sulla progressione neoplastica, e studi clinici di Fase II-III, condotti su tumori di diversa origine, indicano che un’efficiente risposta al farmaco è strettamente dipendente dalla modalità di deregolazione del recettore stesso (amplificazione genica piuttosto che mutazioni attivanti o presenza di un loop autocrino/paracrino). Sulla base di queste considerazioni ci si propone di indagare attraverso diversi modelli, sperimentali e clinici, e su tumori di diversa origine: la possibile deregolazione di recettori ad attività tirosin-chinasica e dei relativi downstream targets per identificarne il meccanismo in un’estensiva caratterizzazione di base condotta su tumori clinici biomarcatori che, singolarmente o in combinazione, consentano di identificare pazienti responsivi a trattamenti che prevedono l’impiego di inibitori di tirosin chinasi il profilo di attività antitumorale e la caratterizzazione preclinica di nuovi composti in grado di inibire l’attività tirosin chinasica in un panel di linee di tumori umani e, laddove possibile, su stem-like tumor-initiating cells l’importanza del microambiente tumorale sulla risposta ai farmaci.

METODOLOGIA (max 4000 caratteri) Possibile deregolazione di recettori ad attività tirosin-chinasica e dei relativi downstream targets: lo studio – focalizzato alle famiglie EGFR e PDGFR - sarà effettuato analizzando: upstream targets

analisi dell’espressione (immunoistochimica) analisi dello stato di attivazione (biochimica) ricerca delle mutazioni attivanti nei rispettivi geni (sequenziamento)

XXX



ricerca dell’espressione dei rispettivi ligandi (RT-PCR) ricerca di possibili amplificazione genica (FISH)

downstream targets l’attivazione di K-Ras e BRAF sarà ricercata tramite analisi mutazionale (sequenziamento) l’attivazione di Akt sarà determinata tramite immunoistochimica e western blot il coinvolgimento di PTEN sarà determinata tramite immunoistochimica, FISH e ricerca di mutazioni.

Nel caso di nuove mutazioni saranno costruiti opportuni modelli cellulari in vitro per valutare l’effetto sull’attività del recettore e dei suoi downstream targets e sulla risposta ai farmaci. Lo studio sarà condotto su un gruppo di tumori già parzialmente esplorati (sarcomi epitelioidi, cordomi, sarcomi intimali, MPNST, adenocarcinomi polmonari) in funzione sia della disponibilità di materiale fissato o criopreservato sia delle conoscenze pregresse che indicano come recettori appartenenti ad entrambe le famiglie recettoriali siano spesso contemporaneamente deregolati (adenocarcinoma polmonare, cordomi, sarcomi intimali), suggerendo la possibilità di una terapia combinata. Studio di biomarcatori che, singolarmente o in combinazione, consentano di identificare pazienti responsivi a trattamenti che prevedono l’impiego di inibitori di tirosin chinasi: la valutazione verrà condotta su due patologie, il carcinoma mammario e le metastasi epatiche da carcinoma colorettale, per le quali sono già disponibili o saranno disponibili campioni di tessuto fissato e/o criopreservato da pazienti afferenti a protocolli clinici che prevedono il trattamento con trastuzumab, nel casco del carcinoma mammario, o cetuximab, nel caso dei tumori colonrettali. In particolare, nel tentativo di meglio identificare le pazienti responsive a trastuzumab ci si propone di analizzare le caratteristiche molecolari di una serie di 50 carcinomi della mammella con amplificazione di HER-2 valutando l’espressione dei geni implicati nei meccanismi che sembrano responsabili del funzionamento di questo anticorpo nei modelli sperimentali in vitro e in vivo (proliferazione, apoptosi, angiogenesi e infiltrazione linfocitaria). I geni che risulteranno differenzialmente espressi in questa serie di tumori (training set) verranno successivamente validati mediante real time-PCR e/o immunoistochimica su una serie indipendente (testing set) di 400 carcinomi metastatici positivi per HER-2 di cui è nota la risposta al trattamento con trastuzumab. Relativamente alle metastasi epatiche da carcinoma colonrettale, è stato recentemente attivato un protocollo di trattamento perioperatorio che prevede l’impego di diversi farmaci in combinazione con cetuximab. Saranno disponibili prelievi pre- e post-trattamento, rispettivamente alla biopsia e alla chirurgia, e su questo materiale verrà valutata l’espressione di EGFR, PTEN, fosfoAKT e fosfoS6 e la presenza di mutazioni nei geni EGFR, PTEN, RAS, PI3K e TP53, e i risultati delle analisi biomolecolari verranno correlati alla risposta clinica al trattamento neoadiuvante. Profilo di attività antitumorale e la caratterizzazione preclinica di nuovi composti in grado di inibire enzimi tirosin chinatici: la relazione causale tra proteina target e progressione neoplastica è ormai ben stabilita per le proteine tirosin chinasi della famiglia Ret, coinvolte nel carcinoma tiroideo. E’ stato identificato e caratterizzato un inibitore delle oncoproteine Ret a struttura indolinonica (denominato RPI-1) in grado di inibire l’attività enzimatica di Ret e la conseguente trasmissione del segnale, attivo in vivo su un modello di carcinoma midollare della tiroide. Sulla base di queste premesse, lo studio si pone come obiettivo l’approfondimento della caratterizzazione preclinica del composto RPI-1 (o analoghi) allo scopo di definirne il profilo di attività antitumorale in relazione al contesto biologico del tumore e di approfondirne il meccanismo d’azione utilizzando un panel di linee di carcinoma polmonare umano. Meccanismi che condizionano il microambiente tumorale, e vengono ad interferire sulla risposta ai farmaci, ci si propone di approfondire i meccanismi legati alle pompe protoniche vacuolari e quelli responsabili di morte apoptotica dopo trattamento con inibitori di pompe protoniche (PPI) in tumori solidi come melanomi e colon-carcinomi, analizzando anche l’effetto di tale trattamento sul traffico vescicolare e promuovere studi clinici di fase II basati sul trattamento dei tumori solidi con PPI.

XXXI


MODULO 3


1. Personale dipendente € 1.223.000,00 NULLA _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ 2. Personale a contratto/consulenza/borsa di studio € 379.916,00 € 298.400,00 _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ 3. Missioni € 28.500,00 € 14.600,00 _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ 4. Attrezzature (solo a noleggio o leasing): ________ ________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ 5. Materiale di consumo € 422.000,00 € 206.500,00 ____________________________________________ ____________________________________________ ____________________________________________ 6. Pubblicazioni / organizzazione convegni, ecc. € 32.000,00 € 20.500,00 ___________________________________________ ____________________________________________ ____________________________________________ 7. Elaborazione dati (specificare) € 5.000,00 ____________ ___________________________________________ ___________________________________________ ___________________________________________ 8. Spese generali delle strutture coinvolte (specificare) € 196.900,00 € 60.000,00 ___________________________________________ ___________________________________________ ___________________________________________ TOTALE € 2.287.316,00 € 600.000,00

XXXII


MODULO 3 Curriculum Vitae del Responsabile Scientifico dell’Unità Operativa (max 1 pagina) (PERIODO DI RIFERIMENTO: ULTIMI 5 ANNI; INDICARE ANCHE LE 10 PUBBLICAZIONI SCIENTIFICHE RITENUTE PIÙ SIGNIFICATIVE, CON PARTICOLARE RIFERIMENTO A QUELLE DELL’AREA TEMATICA SCIENTIFICA SULLA QUALE INSISTE IL PROGETTO)

Curriculum Vitae di Maria Grazia Daidone

Studi & Formazione: Laurea in Scienze Biologiche (summa cum laude), Università di Milano, 1976; Specialità in Statistica Medica, Università di Milano, 1996. Borsa di Studio del Consiglio Nazionale delle Ricerche di Roma, 1977-1980 Posizione attuale: Responsabile della Struttura Complessa Ricerca Traslazionale, Dipartimento di Oncologia Sperimentale, Istituto Nazionale Tumori di Milano (dal 1999). Attività didattica: docente ai corsi di formazione della SIS (Scuola Italiana di Senologia), dal 1985. Docente in Biologia dei Tumori, Master in Senologia Diagnostica e Terapeutica, Facoltà di Medicina, Università di Siena, dal 2001 Incarichi ufficiali: Componente del Governing Council dello European Study Group for Cell Proliferation, dal 1998. Vice-chairman, Receptor and Biomarkers Group, EORTC, dal 2003 al 2006; Chairman-elect. Patho-Biology Group, EORTC, dal 2007. Revisore di progetti di ricerca per: Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (study section), Consiglio Nazionale delle Ricerche (study section), Netherlands Cancer Society, Cancer Research UK, Oncosuisse Editorial Board: Cell Proliferation, dal 1998; Co-editor, International Journal of Biological Markers, dal 1998 Ad hoc reviewer per le seguenti riviste: Annals of Oncology, BMC Genomics, Breast Cancer Research and Treatment, British Journal of Cancer, Cancer, Cancer Research, Carcinogenesis, Cell Death and Differentiation, Clinical Cancer Research, European Journal of Cancer, International Journal of Cancer, Journal of Chemotherapy, International Journal of Pathology, Journal of Clinical Pathology, Journal of Pathology, Nature Oncology-Clinical Practice, Nature Reviews cancer Finanziamenti per le ricerche: Consiglio Nazionale delle Ricerche (Progetto Finalizzato Oncologia, Progetto Finalizzato ACRO, Comitato per le Scienze Biologiche e Mediche, Comitato per le Ricerche Tecnologiche e Innovazione); Ministero dell’Istruzione, dell’Università e della Ricerca – Consiglio Nazionale delle Ricerche (Progetto Strategico Bridge-Oncologia, Progetto Speciale Oncologia, Piano Nazionale di Ricerca); Ministero della Sanità; Ministero della Salute; Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro; Serono S.p.A.; Menarini S.p.A.;Polytech S.p.A.;Novuspharma s.r.l. Settori di interesse: ields of Interest: Caratterizzazione biomolecolare dei tumori umani e delle lesioni preneoplastiche; Identificazione e caratterizzazione di cellule staminali/progenitori tumorali; Studi traslazionali in tumori umani solidi (carcinoma mammario, ovarico e della cervice uterina, polmonare, colorettale); Studio di fattori citoprotettivi nella progressione tumorale; Identificazione e validazione di potenziali bersagli molecolari per approcci terapeutici innovativi; Studio dell'azione di farmaci antiblastici e ormoni sui tumori umani; Coordinamento di controlli di qualità per biomarcatori; Formulazione e proposizione di linee guida per l’utilizzo clinico di biomarcatori Pubblicazioni: 147 lavori su riviste con Impact Factor 1. N. Zaffaroni, C. Della Porta, R. Villa, C. Botti, S. Buglione, M. Mottolese, M.G. Daidone. Transcription and alternative

splicing of telomerase reverse transcriptase in benign and malignant breast tumors and in adjacent mammary glandular tissues: implications for telomerase activity. J. Pathol., 198: 37-46, 2002.

2. D. Coradini, S. Veneroni, C. Pellizzaro, L. Ventura, M.G. Daidone. Infiltrating ductal and lobular breast carcinomas are characterized by different interrelationships among markers related to angiogenesis and hormone dependence. Br. J. Cancer, 87:1105-11, 2002.

3. M.G. Daidone, D. Coradini, G. Martelli, S. Veneroni. Primary breast cancer in elderly women: biological profile and relation with clinical outcome. Critical Reviews in Oncology/Hematology, 45: 313-25, 2003.

4. V. Cappelletti, S. Veneroni, D. Coradini, S. Oriana, G. Tomasic, M. Younes, M.G. Daidone. Re: Tamoxifen May Be an Effective Treatment for BRCA1-Related Breast Cancer Irrespective of Estrogen Receptor Status. Journal of the National Cancer Institute, 95:629-630, 2003.

5. Coradini D, Pellizzaro C, Speranza A, Daidone MG. Hypoxia and estrogen receptor profile influence the responsiveness of human breast cancer cells to estradiol and antiestrogens. Cell Mol Life Sci. 2004; 61: 76-82.

6. V. Cappelletti, L. Celio, E. Bajetta, A. Allevi, R. Longarini, P. Miodini, R. Villa, A. Fabbri, L. Mariani, R. Giovanazzi, E. Galante, M. Greco, M.G. Daidone. Prospective Evaluation of ER-β in predicting response to neoadjuvant antiestrogen therapy in elderly breast cancer patients. Endocrine-Related Cancer, 11: 761-770, 2004.

7. MG Daidone, A Paradiso, N Harbeck, F Sweep, M Gion, and M Schmitt. Biomolecular features of clinical relevance for breast cancer. Eur J Nucl Med Mol Imaging 2004; Suppl 1:S3-14.

8. L. De Cecco, L. Marchionni, M. Gariboldi, J. Reid, S. Lagonigro, S. Caramuta, C. Ferrario, E.Bussani, D.Mezzanzanica, F.Turatti, D.Delia, M.G. Daidone, et al. Ovarian cancer gene classifier with elements of FGF2-signaling: functional analysis and clinical predictivity. Oncogene, 23:8171-8183, 2004.

9. J.F. Reid, L. Lusa, L. De Cecco, D. Coradini, S. Veneroni, M.G. Daidone, M. Gariboldi, M.A. Pierotti. Limits of predictive models using microarray data for breast cancer clinical treatment outcome. J. Natl. Cancer Inst. 97: 927-930, 2005.

10. Ponti D., Zaffaroni N., Capelli C., Daidone M.G. Breast cancer stem cells: An overview. Eur J Cancer 42: 1219-1224, 2006.

XXXIII


MODULO 3BIS

MODULO 3BIS: DESCRIZIONE DEL CONTRIBUTO DI CIASCUN GRUPPO DI RICERCA (Si devono presentare tanti moduli 3bis quanti sono i gruppi di ricerca coinvolti) GRUPPO DI RICERCA N. 1: Ricerca traslazionale

RESPONSABILE SCIENTIFICO: nominativo: Dott.ssa Maria Grazia Daidone

struttura di appartenenza : Fondazione IRCCS “Istituto Nazionale dei Tumori” funzione: Direttore indirizzo : via Venezian, 1 - Milano

N. tel: 02/23902238 N. fax: 02/2390/3052



CONTRIBUTO SPECIFICO FORNITO AL PROGETTO (max 500 caratteri) In virtù del ruolo fondamentale nella trasduzione del segnale mitogenico e quindi nei processi di proliferazione e differenziamento cellulare così come nell’attivazione dell’angiogenesi, i recettori ad attività tirosin-chinasica sono stati oggetto di un’intensa ricerca, finalizzata all’identificazione di molecole in grado di interferire sulla loro attività in modo specifico e attualmente sono già disponibili nella pratica clinica molecole contro ERBB2, EGFR, VEGFR, PDGFR e BCR-ABL. Una possibile strategia da mettere in atto per migliorare l’efficacia di tali farmaci prevede: 1) l’utilizzo di strumenti predittivi in grado di meglio identificare i pazienti potenzialmente responsivi al trattamento mirato; 2) l’identificazione e la standardizzazione di biomarcatori in grado di predire precocemente la risposta al trattamento (quali surrogati di risposta clinica); 3) un disegno adeguato di studi prospettici, in termini di dimensionamento del campione, analisi statistica e appropriati indicatori di risposta clinica. METODOLOGIA (max 1000 caratteri) Il Cetuximab è un anticorpo molecolare ad elevata affinità per EGFR dimostratosi attivo in associazione con irinotecan nel carcinoma colorettale. Prendendo vantaggio da uno studio prospettico recentemente attivato presso il nostro Istituto su tale neoplasia, ci proponiamo di identificare biomarcatori che, singolarmente o in associazione, consentano di identificare pazienti responsivi all’associazione di cetuximab con farmaci convenzionali (capecitabina, oxaliplatino e irinotecan). La valutazione verrà condotta su lesioni primitive e/o metastasi epatiche ottenute durante il normale iter chirurgico da pazienti sottoposti a trattamento perioperatorio e lo studio prevede il reclutamento di 40 casi. Saranno disponibili prelievi pre- e post-trattamento, rispettivamente alla biopsia e alla chirurgia, e su questo materiale verrà valutata l’espressione di EGFR, PTEN, fosfoAKT e fosfoS6 e la presenza di mutazioni nei geni EGFR, PTEN, RAS, PI3K e TP53, e i risultati delle analisi biomolecolari verranno correlati alla risposta clinica al trattamento neoadiuvante. In parallelo, il profilo di attività antitumorale della combinazione di farmaci verrà studiato anche su un pannello di linee cellulari di carcinoma colorettale, a diversa capacità tumorigenica.

XXXIV



MODULO 3BIS


1. Personale dipendente € 160.000,00 NULLA _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ 2. Personale a contratto/consulenza/borsa di studio € 76.500,00 € 50.000,00 _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ 3. Missioni € 5.000,00 € 2.500,00 _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ 4. Attrezzature (solo a noleggio o leasing): ________ ________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ 5. Materiale di consumo € 60.000,00 € 25.500,00 ____________________________________________ ____________________________________________ ____________________________________________ 6. Pubblicazioni / organizzazione convegni, ecc. € 10.000,00 € 7.500,00 ___________________________________________ ____________________________________________ ____________________________________________ 7. Elaborazione dati (specificare) __________ ____________ ___________________________________________ ___________________________________________ ___________________________________________ 8. Spese generali delle strutture coinvolte (specificare) € 31.000,00 € 9.500,00 ___________________________________________ ___________________________________________ ___________________________________________ TOTALE € 342.500,00 € 95.000,00

XXXV


MODULO 3BIS

MODULO 3BIS: DESCRIZIONE DEL CONTRIBUTO DI CIASCUN GRUPPO DI RICERCA (Si devono presentare tanti moduli 3bis quanti sono i gruppi di ricerca coinvolti) GRUPPO DI RICERCA N. 2: Meccanismi molecolari di crescita e progressione

RESPONSABILE SCIENTIFICO: nominativo: Dott.ssa Angela Greco

struttura di appartenenza : Fondazione IRCCS “Istituto Nazionale dei Tumori” funzione: Dirigente 1° liv indirizzo : via Venezian, 1 - Milano

N. tel: 02/23903222 N. Fax: 02/23902746



CONTRIBUTO SPECIFICO FORNITO AL PROGETTO (max 500 caratteri) Questo progetto è correlato al progetto N. 6 (responsabile Dott.ssa Pilotti, INT, Milano) che si propone di identificare alterazioni a carico di tirosino chinasi recettoriali e altre molecole downstream in tumori umani. I recettori tirosino chinasici (RTK) sono attivati frequentemente nei tumori attraverso modalità differenti quali amplificazione genica, rarrangiamento genico, loop autocrino/paracrino, mutazioni puntiformi. Numerosi studi evidenziano come la risposta ai farmaci dipenda strettamente dal meccanismo di attivazione del recettore. Inoltre, in caso di attivazione per mutazione puntiforme, il sito interessato da quest’ultima può influenzare la risposta a farmaci specifici. Queste evidenze suggeriscono la necessità di studi in vitro e in vivo finalizzati alla definizione del tipo di risposta di tirosino chinasi o altre proteine a loro specifici inibitori. Lo scopo di questo progetto è la costruzione di modelli in vitro e in vivo per valutare:

1) l’effetto di nuove mutazioni identificate in tumori nel progetto N. 6 (Responsabile Dott.ssa Pilotti, INT, Milano) sull’attività di recettori tirosino chinasi e molecole downstream;

2) l’analisi della trasduzione del segnale innescato da recettori e molecole downstream attivati da mutazioni puntiformi; 3) la capacità di composti noti e nuovi di inibire l’attivazione costitutiva delle molecole sudette.

METODOLOGIA (max 1000 caratteri)

Le mutazioni selezionate saranno inserite nei cDNA di interesse tramite mutagenesi sito-specifica, e i costrutti risultanti saranno espressi in cellule di mammifero. Tramite esperimenti di trasfezione transiente in cellule HeLa e/o HEK saranno valutati: i) l’effetto delle mutazioni (ciò permetterà di distinguere mutazioni attivanti da polimorfismi); ii) il livello di attivazione causato da mutazioni diverse; iii) la sensibilità a farmaci specifici; iiii) la trasduzione del segnale. I diversi costrutti saranno trasfettati stabilmente in cellule NIH3T3 per valutarne l’attività trasformante. Linee cellulari trasformate saranno isolate ed utilizzate per l’analisi della trasduzione del segnale e per la valutazione della risposta ai farmaci in vitro. Inoltre le stesse saranno utilizzate per la costruzione di modelli animali per lo studio in vivo della risposta ai farmaci. In particolare sarà valutata: i) la loro capacità di produrre tumori in topi nudi; ii) l’effetto di farmaci specifici sulla crescita di tali tumori.

XXXVI



MODULO 3BIS



XXXVII


MODULO 3BIS

MODULO 3BIS: DESCRIZIONE DEL CONTRIBUTO DI CIASCUN GRUPPO DI RICERCA (Si devono presentare tanti moduli 3bis quanti sono i gruppi di ricerca coinvolti) GRUPPO DI RICERCA N. 3: Biologia molecolare

RESPONSABILE SCIENTIFICO: nominativo: Dott.ssa Sylvie Ménard


N. tel: 02/23902571 N. fax: 02/23903073



CONTRIBUTO SPECIFICO FORNITO AL PROGETTO (max 500 caratteri) Studi recenti di terapia adiuvante condotti in pazienti affette da carcinoma della mammella con amplificazione dell’oncogene HER2, hanno mostrato circa 50% di risposta al nuovo farmaco Herceptin, un anticorpo monoclonale umanizzato diretto contro la proteina codificata da questo gene. L’attività svolta dal gruppo cercherà di definire dei marcatori biomolecolari di risposta a questo nuovo farmaco.

METODOLOGIA (max 1000 caratteri) Al fine di identificare dei marcatori di risposta ad Herceptin ci proponiamo di analizzare le caratteristiche molecolari di 50 tumori della mammella tutti con amplificazione di HER2 e quindi eleggibili al trattamento. In particolare verrà presa in considerazione l’espressione dei geni implicati nei meccanismi che sembrano responsabili del funzionamento di questo anticorpo nei modelli sperimentali in vitro ed in vivo (proliferazione, apoptosi, angiogenesi e infiltrazione linfocitaria). Le molecole che risulteranno più differenzialmente espresse all’interno di questa serie di tumori verranno in seguito saggiate tramite IHC e/o real-time PCR su una casistica di 400 carcinomi metastatici della mammella, positivi per HER2, tutti trattati con Herceptin e dei quali è nota la risposta al trattamento.

XXXVIII



MODULO 3BIS


1. Personale dipendente € 200.000,00 NULLA _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ 2. Personale a contratto/consulenza/borsa di studio € 45.000,00 € 45.000,00 _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ 3. Missioni ________ ________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ 4. Attrezzature (solo a noleggio o leasing): ________ ________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ 5. Materiale di consumo € 56.000,00 € 36.000,00 ____________________________________________ ____________________________________________ ____________________________________________ 6. Pubblicazioni / organizzazione convegni, ecc. ________ ________ ___________________________________________ ____________________________________________ ____________________________________________ 7. Elaborazione dati (specificare) __________ ____________ ___________________________________________ ___________________________________________ ___________________________________________ 8. Spese generali delle strutture coinvolte (specificare) € 31.000,00 € 9.000,00 ___________________________________________ ___________________________________________ ___________________________________________ TOTALE € 332.000,00 € 90.000,00

XXXIX


MODULO 3BIS

MODULO 3BIS: DESCRIZIONE DEL CONTRIBUTO DI CIASCUN GRUPPO DI RICERCA (Si devono presentare tanti moduli 3bis quanti sono i gruppi di ricerca coinvolti) GRUPPO DI RICERCA N. 4: Citogenetica e citogenetica molecolare

RESPONSABILE SCIENTIFICO: nominativo: Dott.ssa Gabriella Sozzi

struttura di appartenenza : Fondazione IRCCS “Istituto Nazionale dei Tumori” funzione: Responsabile

indirizzo : via Venezian, 1 - Milano

N. tel: 02/23902232 N. fax: 02/23902764



CONTRIBUTO SPECIFICO FORNITO AL PROGETTO (max 500 caratteri) Obiettivi specifici di questo progetto sono:1) l’ isolamento, la propagazione e la caratterizzazione biomolecolare di sottopopolazioni con caratteristiche di staminalita’ da linee cellulari e tumori primari polmonari non-a piccole cellule mediante approcci funzionali ( capacita’ di crescita “in sfera”, di multi-differenziazione, di sostenere la crescita tumorale “in vivo”) e fenotipici (co-espressione di specifici marcatori); 2) l’analisi della risposta ad agenti diretti a specifici bersagli molecolari e a farmaci convenzionali.

METODOLOGIA (max 1000 caratteri) Approcci biochimici e molecolari (Western Blotting, Real time) saranno impiegati per esaminare i meccanismi di farmacoresistenza in putative cellule tumorali staminali polmonari (LCSC). Analisi di amplificazione genica (SKY, FISH, array-CGH), di profili di espressione genica e proteomici e di specifiche proteine coinvolte nella resistenza ai farmaci inclusi trasportatori di membrana verranno condotte allo scopo di identificare i meccanismi molecolari di chemoresistenza/sensibilita’ in LCSC e in cellule tumorali polmonari differenziate. Saranno inoltre studiate le alterazioni genetiche/epigenetiche in LCSC e la loro stabilita’ durante la crescita in vitro/in vivo. La sensibilità cellulare ad agenti diretti a specifici bersagli molecolari con particolare riferimento a 1) inibitori dell’attività tirosin-chinasica di recettori per fattori di crescita alterati nel cancro polmonare quali EGF-R e MET, 2) agenti clinicamente rilevanti nel cancro polmonare tra cui composti del platino e inibitori delle DNA topoisomerasi, sarà esaminata mediante saggi di inibizione della crescita e della formazione di colonie e di induzione di apoptosi.

XL



MODULO 3BIS



XLI


MODULO 3BIS

MODULO 3BIS: DESCRIZIONE DEL CONTRIBUTO DI CIASCUN GRUPPO DI RICERCA (Si devono presentare tanti moduli 3bis quanti sono i gruppi di ricerca coinvolti) GRUPPO DI RICERCA N. 5: Chemioterapia e farmacologia antitumorale preclinica

RESPONSABILE SCIENTIFICO: nominativo: Dott. Franco Zunino

struttura di appartenenza : Fondazione IRCCS “Istituto Nazionale dei Tumori” funzione: Direttore

indirizzo : via Venezian, 1 - Milano

N. tel: 02/23902267 N. fax: 02/23902692



CONTRIBUTO SPECIFICO FORNITO AL PROGETTO (max 500 caratteri) Sulla base della considerazione che enzimi tirosin chinasici sono coinvolti in pathways di sopravvivenza e varie proteine chinasi hanno un ruolo regolatorio in tali processi, l’inibizione di queste attività enzimatiche, attivate in modo aberrante in diversi tipi di tumore, rappresenta un nuovo approccio terapeutico. Un requisito considerato importante, emerso dagli studi su questi nuovi farmaci mirati, è che la proteina “target” svolga un ruolo cruciale nella biologia della cellula tumorale e/o a progressione neoplastica. Questa relazione causale è ormai ben stabilita per le proteine tirosin chinasi della famiglia Ret che sono coinvolte nel carcinoma tiroideo. E’ stato identificato e caratterizzato un inibitore delle oncoproteine Ret a struttura indolinonica (denomonato RPI-1) capace di inibire l’attività enzimatica delle proteine Ret e la trasmissione del segnale da esse dipendente ed attivo in vivo su un modello di carcinoma midollare della tiroide.

METODOLOGIA (max 1000 caratteri) Sulla base di queste premesse, lo studio si pone come obiettivo l’approfondimento della caratterizzazione preclinica del composto RPI-1 (o analoghi) allo scopo di definirne il profilo di attività antitumorale in relazione al contesto biologico del tumore e approfondire il suo meccanismo d’azione. Caratteristica di molti inibitori di tirosin chinasi è la capacità di inibire varie tirosin chinasi. Questa proprietà potrebbe essere sfruttata per una applicazione terapeutica su diversi tipi tumorali. In particolare è stata documentata la capacità del composto indolinonico di inibire l’attività di tirosin chinasi di c-Met e di ridurre il potenziale metastatico del tumore polmonare NSCLC H460. Pertanto, saranno studiate le relazioni tra l’espressione di c-Met ed il potenziale antiinvasivo di inibitori di questa serie utilizzando un panel di linee di carcinoma polmonare umano.

XLII



MODULO 3BIS


1. Personale dipendente € 160.000,00 NULLA _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ 2. Personale a contratto/consulenza/borsa di studio € 37.000,00 € 37.000,00 _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ 3. Missioni ________ ________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ 4. Attrezzature (solo a noleggio o leasing): ________ ________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ 5. Materiale di consumo € 60.000,00 € 44.000,00 ____________________________________________ ____________________________________________ ____________________________________________ 6. Pubblicazioni / organizzazione convegni, ecc. € 5.000,00 ________ ___________________________________________ ____________________________________________ ____________________________________________ 7. Elaborazione dati (specificare) __________ ____________ ___________________________________________ ___________________________________________ ___________________________________________ 8. Spese generali delle strutture coinvolte (specificare) € 30.000,00 € 9.000,00 ___________________________________________ ___________________________________________ ___________________________________________ TOTALE € 292.000,00 € 90.000,00

XLIII


MODULO 3BIS

MODULO 3BIS: DESCRIZIONE DEL CONTRIBUTO DI CIASCUN GRUPPO DI RICERCA (Si devono presentare tanti moduli 3bis quanti sono i gruppi di ricerca coinvolti) GRUPPO DI RICERCA N. 6: Medicina di Laboratorio 4

RESPONSABILE SCIENTIFICO: nominativo: Dott.ssa Silvana Pilotti


N. tel: 02/23902293 N. fax: 02/23902877



CONTRIBUTO SPECIFICO FORNITO AL PROGETTO (max 500 caratteri) L’applicazione di una terapia personalizzata si basa sull’identificazione di target patologicamente deregolati. I recettori tirosinchinasici (TK) più studiati appartengono alla famiglia dell’EGFR (EGFR, HER-2/neu, HER-3) e del PDGFR (KIT; PDGFRA, PDGFRB) (qui definiti upstream targets). Parallelamente, altri targets terapeutici possono essere rappresentati da molecole effettrici dei recettori TK, quali K-Ras, BRAF, AKT, PTEN (downstream targets). Ad oggi diversi inibitori TK, sia recettoriali che citoplasmatici, sono utilizzati in clinica per il trattamento di tumori di diverso istotipo. Generalmente, gli inibitori disponibili sono costituiti o da anticorpi monoclonali che legano la porzione extracellulare del recettore o da piccole molecole capaci di inibire l’attivita’ enzimatica delle tirosino-chinasi. Diversi studi clinici sia di fase I che di fase II effettuati prendendo in considerazione differenti tumori indicano che una efficiente risposta al farmaco è strettamente dipendente dalla modalità di deregolazione del recettore stesso, ossia se il meccanismo responsabile dell’attivazione del recettore sia rappresentato da meccanismi quali l’amplificazione genica, piuttosto che da mutazioni attivanti o dalla presenza di un loop autocrino/paracrino. METODOLOGIA (MAX 1000 CARATTERI) Nell’ambito dei farmaci molecolari appartenenti alla classe dei recettori tirosin chinasici, ci si propone di mettere a punto un algoritmo per l’identificazione di possibili targets terapeutici applicabile ad un gruppo di tumori parzialmente già esplorati (sarcomi epitelioidi, cordomi, sarcomi intimali, MPNST, mesotelioma, adenocarcinomi del polmone). Sulla scorta delle considerazioni precedentemente esposte, ci si propone di indagare nei differenti istotipi tumorali in studio la possibile deregolazione di recettori TK e di molecole downstream e di identificarne il meccanismo. Upstream targets La deregolazione dei recettori TK sopra citati sarà analizzata tramite:

1) Analisi dell’espressione (immunoistochimica IHC) 2) Analisi dello stato di attivazione (Biochimica) 3) Ricerca di mutazioni attivanti nei rispettivi geni (sequenza) 4) Ricerca dell’espressione dei rispettivi ligandi (RT-PCR) 5) Ricerca di possibile amplificazione genica (FISH) Nel caso di nuove mutazioni saranno costruiti opportuni modelli cellulari in vitro per valutarne l’effetto sull’attivita’ del recettore e sulla risposta ai farmaci (In collaborazione con la Dr. Greco, INT Milano, Progetto n.2 ). Downstream targets 1) l’attivazione di K-Ras e BRAF sarà ricercata tramite analisi mutazionale (sequenza) 2) l’attivazione di AKT sarà determinata tramite IHC e Western blot 3) il coinvolgimento di PTEN sarà determinata tramite IHC, FISH e ricerca di mutazioni. Anche in questo caso l’effetto di nuove mutazioni sarà valutato utilizzando opportuni modelli cellulari in vitro.

La scelta dei tumori sopraelencati è stata determinata dalla disponibilità sia di materiale fissato che criopreservato e dal fatto che osservazioni iniziali, derivate sia dal nostro laboratorio che dalla letteratura, indicano come recettori appartenenti ad entrambe le famiglie siano spesso contemporaneamente deregolati (adenocarcinoama del polmone, cordomi, sarcomi intimali, mesoteliomi) suggerendo la possibilità di una terapia combinata.

XLIV



MODULO 3BIS


1. Personale dipendente € 180.000,00 NULLA _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ 2. Personale a contratto/consulenza/borsa di studio € 50.000,00 € 43.000,00 _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ 3. Missioni € 8.000,00 € 2.000,00 _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ 4. Attrezzature (solo a noleggio o leasing): ________ ________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ 5. Materiale di consumo € 80.000,00 € 26.000,00 ____________________________________________ ____________________________________________ ____________________________________________ 6. Pubblicazioni / organizzazione convegni, ecc. € 10.000,00 € 10.000,00 ___________________________________________ ____________________________________________ ____________________________________________ 7. Elaborazione dati (specificare) € 5.000,00 ____________ ___________________________________________ ___________________________________________ ___________________________________________ 8. Spese generali delle strutture coinvolte (specificare) € 36.400,00 € 9.000,00 ___________________________________________ ___________________________________________ ___________________________________________ TOTALE € 369.400,00 € 90.000,00

XLV


MODULO 3BIS

MODULO 3BIS: DESCRIZIONE DEL CONTRIBUTO DI CIASCUN GRUPPO DI RICERCA (Si devono presentare tanti moduli 3bis quanti sono i gruppi di ricerca coinvolti) GRUPPO DI RICERCA N. 7: Istituto Superiore di Sanità – Dipartimento del Farmaco

RESPONSABILE SCIENTIFICO: nominativo: Stefano Fais

struttura di appartenenza Istituto Superiore di Sanità’ funzione: Dirigente di Ricerca

indirizzo :Viale Regina Elena, 299 - Roma

N. tel: 06/49903195 N. fax: 06/49903691

indirizzo E-mail:[email protected]

RAPPRESENTANTE LEGALE: nominativo: Prof. Enrico Garaci

CONTRIBUTO SPECIFICO FORNITO AL PROGETTO (max 500 caratteri) Fra i meccanismi che condizionano stabilmente il microambiente tumorale vi sono l’alterazione dei gradienti di pH ed il continuo rilascio di microvescicole a contenuto acido. Entrambe i fenomeni sono di recente stati proposti come meccanismi chiave sia nella progressione tumorale sia nei fenomeni di resistenza e di non risposta ai farmaci citotossici. La cellula tumorale è caratterizzata da un pH citosolico alcalino e da un pH extracellulare acido che determina le condizioni selettive per la crescita di cellule particolarmente aggressive ed in grado di sopravvivere in condizioni fisiologicamente avverse. Infatti, i tumori umani sono provvisti di meccanismi di regolazione del pH assenti o poco espressi in cellule normali e che quindi rappresentano un possibile bersaglio terapeutico. Uno di tali meccanismi è costituito dalla aumentata e selettiva espressione delle pompe protoniche vacuolari (V-ATPasi), la cui funzione è inibita dagli inibitori di pompe protoniche (PPI). Nostri studi hanno dimostrato che il pretrattamento con PPI sia in vitro che in vivo di tumori umani resistenti ai chemioterapici induce sensibilità degli stessi ad una gran varietà di farmaci anti-tumorali, che è strettamente correlata alla normalizzazione dei gradienti di pH fuori/dentro la cellula (Luciani L et al JNCI 2004). Sulla base di questo studio sono attualmente in corso due studi clinici di fase II sulla combinazione pre-trattamento con PPI/chemioterapia in pazienti con melanoma ed osteosarcoma. Inoltre, più di recente abbiamo dimostrato che il trattamento in vitro ed in vivo con PPI di linfomi B umani induce apoptosi cellulare e rallenta la crescita tumorale (De Milito et al, Cancer Research 2007, in press). L’azione pro-apoptotica è in parte mediata da una massiva alterazione dei gradienti di pH nella cellula. L’apoptosi indotta dai PPI nei linfomi/leucemie B è di tipo caspasi-indipendente mentre studi preliminari su tumori solidi e linfomi T indicano che il processo è caspasi-indipendente. Questi risultati suggeriscono l’uso dei PPI come agenti antineoplastici. Risultati preliminari in modelli xenochimerici suggeriscono che l’effetto sulla crescita tumorale sia correlabile ad una marcata alterazione dei gradienti di pH fra l’ambiente interstiziale e l’esterno della cellula, sia somministrando i PPI oralmente che per via sistemica. Sembra infatti che la biodisponibilità di questi farmaci sia identica tra i vari tipi di somministrazione. Il presente progetto propone (i) un approfondimento dei meccanismi molecolari legati alle VATPasi H+ e cellulari responsabili della morte apoptotica in seguito a trattamento con PPI in tumori solidi come melanomi e colon-carcinomi, analizzando anche l’effetto di tale trattamento sul traffico vescicolare e (ii) la promozione di studi clinici di fase II basati sul trattamento dei tumori solidi con PPI. Il progetto propone anche la messa a punto un test fluorimetrico di trasporto protonico e di tecniche di spettroscopia di risonanza magnetica per la valutazione dell’attività inibitoria dei PPI sulle V-ATPasi tumorali e per l’ analisi della selettiva localizzazione cellulare delle V-ATPasi in relazione al grado di malignità. Inoltre, parte del progetto si occuperà di verificare quale fra le varie subunità delle V-ATPasi può rappresentare il miglior target per terapie più squisitamente molecolari.

XLVI

Alleanza Contro il Cancro (ACC) – Istituto Superiore di Sanità (ISS) Art.3 DM 21 luglio 2006 - Programma Straordinario di Ricerca Oncologica 2006 Programma 3 “Rete solidale e collaborazioni internazionali” METODOLOGIA (MAX 1000 CARATTERI) Linee cellulari Verrà utilizzato un ampio pannello di line cellulari derivanti da tumori umani, inclusi melanoma carcinoma, linfomi e sarcoma. SCID mice human tumor model Gli esperimenti in vitro saranno preliminari agli esperimenti in vivo che saranno eseguiti su modelli xenograft costitutiti da topi SCID trapiantati s.c. con linee tumorali umane, come già più volte descritto (Lozupone F et al Int J Cancer 2000; Eur J Immunol 2003; Cancer Res 2004), anche in test sull’efficacia di nuovi approcci farmacologici antitumorali (Luciani L et al, J Natl Cancer Inst 2004). Analisi dei meccanismi molecolari alla base dell’effetto antitumorale dei PPI Le varie line cellulari verranno coltivate in varie condizioni di pH ambientale (e.g. terreno tamponato, terreno non-tamponato, terreno a differenti pH fra 7.4 e 5.6). Questo fondamentalmente per il fatto che i PPI necessitano di un ambiente acido per essere protonati e trasformati nel farmaco attivo (De Milito A and Fais S, Future Oncology, 2005). Esperimenti preliminari suggeriscono che i PPI possono indurre apoptosi delle cellule tumorali ed una serie di esperimenti verranno eseguiti per verificare i pathway cellulari alla base dell’effetto citopatico dei PPI e la diversa sensibilità delle cellule tumorali a seconda sia dell’istotipo sia del grado di malignità. A tale scopo verrà valutata l’apoptosi al citofluorimetro, attraverso la misurazione del rapporto Annexin-V-FITC/ propidium iodide. Verrà valutato il livello di attivazione delle caspasi, la capacità di inibitori pan-caspasi (i.e. z-vad) di inibire tale apoptosi, verrà misurato il potenziale di membrane mitocondriale, la quantità di citocromo C presente nella cellula, i livelli di attivazione di ROS e l’eventuale presenza di alterazioni della permeabilità lisosomiale, attraverso l’uso di probes quali Lysosensor and lysotracker, adatti a misurare i livelli di pH nei vari compartimenti cellulari. Verranno inoltre valutati I livelli di alcuni enzimi litici particolarmente sensibili alle variazioni di pH quali le catepsine. Effetti dei PPI su alcune funzioni cellulari dipendenti dal pH quali cannibalismo, attività fagocitica e rilascio di microvescicole. I base a dati preliminary abbiamo potuto stabilire che cellule derivanti da tumori metastatici, come alcuni melanoma, hanno la tendenza ad usare meccanismi fagocitici molto peculiari per cibarsi in condizioni di basso livello di nutrienti. Queste cellule sono in grado di sopravvivere anche in condizioni estremamente ostili per cellule normali o più differenziate, come regimi di pH intorno a 5 (Lugini L et al, Lab Invest 2003; Cancer Res 2006). Dati preliminari suggeriscono inoltre che in queste condizioni le cellule di melanoma rilasciano un maggior numero di microvescicole, che abbiamo dimostrato essere di grande importanza per la omeostasi tumorale (Andreola G et al, J Exp Med 2002; Huber V et al, Gastroenterology 2005). Quindi, sarà valutata la capacità dei PPI di interferire sia sulle attività fagocitiche sia sul rilascio di microvescicole da parte dei melanomi. Attraverso tecniche di saggio della fagocitosi e di misura del rilascio delle microvescicole, messa a punto nei nostri laboratori. Misura in vivo sul pH tumorale e di analisi dei cambiamenti a livello gnomico e post-genomico indotti nel tumore in seguito a trattamento con PPI I topi SCID verranno inoculati sottocute con varie linee cellulari umane. Appena i tumori s.c. saranno misurabili i topi verranno trattati per gavage con dosi crescenti di PPI (da 2.5 a 62.5 mg). Oltre alla crescita tumorale, verrà misurato il pH della massa neoplastica e comparato a quello dei tessuti sani circostanti, attraverso magnetic resonance spectroscopy (MRS) in animali vivi ed anestetizzati, usando bobine magnetiche adatte a tumori di circa 1-2 cm di diametro e probes specifici. Negli stessi animali verranno fatti prelievi seriali di sangue, per purificare e misurare i livelli plasmatici di microvescicole e prelevati campioni di tumore per eseguire sia studi istologici che di genomica e proteomica. Studio del target cellulare dei PPI, le ATPasi vacuolari. Le V-ATPasi possono avere la doppia funzione di pompare protoni, per la maggior parte H+ sia dal citosol all’ambiente extracellulare, e questa sembra essere una caratteristica peculiare dei tumori, ma anche dal citosol all’interno di alcuni orfanelli cellulari che sembrano avere legami di vario tipo con la membrana plasmatica. Attraverso questa funzione queste pompe protoniche riescono a regolare i gradienti di pH nella cellula. E’ stato dimostrato di recente che la inibizione della attività V-ATPasica attraverso il knockdown della subunità ATP6L mediante l’uso di RNAi può sostanzialmente inibire la crescita tumorale e la capacità metastatica, insieme ad una chiara soppressione di alcune attività enzimatiche alla base dei processi litici a carico della matrice extracellulare (Lu X et al Cancer Res 2005). Noi abbiamo ottenuto gli RNAi in grado di interferire con la sintesi della subunità ATP6L delle V-ATPasi. Tramite l’uso di questi RNAi, vogliamo verificare la specificità dei PPI per le subunità attive delle V-ATPasi. Studio dei pathway metabolici delle cellule tumorali umane in varie condizioni di acidità ed effetto dei PPI su tale assetto metabolico. Da quando Warburg circa 80 anni fa formulò l’ipotesi che la maggiore differenza fra le cellule normali e quelle tumorali fosse che le prime usano l’ossigeno per vivere mentre le cellule tumorali fermentano zuccheri, non si sono fatti grandi passi avanti nella comprensione di tale fenomeno. Sta di fatto però che una tecnica di grande utilizzo nella pratica clinica, quale la PET, è basata sull’uso di un analogo del glucosio, per la identificazione di lesioni tumorali anche di piccole dimensioni, ed identifica di fatto zone del corpo in cui siano presenti alti livelli di glicolisi. Questa glicolisi porta alla produzione di acido lattico in presenza od in assenza di ossigeno, ed è dall’acido lattico che si creano inizialmente le condizioni di acidità. Parte di questo studio sarà dedicata a caratterizzare la tipologia dei metabolici presenti nelle cellule derivanti da vari tumori umani, in varie condizioni di pH, in presenza od in assenza di trattamento con PPI. A tale scopo sarà utilizzata la spettroscopia della risonanza magnetica nucleare protonica (H1-NMR) che permette di caratterizzare qualitativamente e quantitativamente il profilo metabolico cellulare (Piccioni et al. 2007).

XLVII


MODULO 3BIS


1. Personale dipendente € 230.000,00 NULLA _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ 2. Personale a contratto/consulenza/borsa di studio € 45.000,00 € 45.000,00 _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ 3. Missioni € 2.500,00 € 2.500,00 _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ 4. Attrezzature (solo a noleggio o leasing): ________ ________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ 5. Materiale di consumo € 20.000,00 € 20.000,00 ____________________________________________ ____________________________________________ ____________________________________________ 6. Pubblicazioni / organizzazione convegni, ecc. ________ ________ ___________________________________________ ____________________________________________ ____________________________________________ 7. Elaborazione dati (specificare) ________ ________ ___________________________________________ ___________________________________________ ___________________________________________ 8. Spese generali delle strutture coinvolte (specificare) € 7.500,00 € 7.500,00 ___________________________________________ ___________________________________________ ___________________________________________ TOTALE € 305.000,00 € 75.000,00

XLVIII


MODULO 3: DESCRIZIONE DEL CONTRIBUTO DI CIASCUNA UNITÀ OPERATIVA (Compilare un modulo per ciascuna UO) UNITA’ OPERATIVA N. 3: Fondazione IRCCS Istituto Neurologico Besta

RESPONSABILE SCIENTIFICO: nominativo: Dott. Gaetano Finocchiaro

struttura di appartenenza : Fondazione IRCCS Istituto Neurologico Besta funzione: Responsabile della Struttura

indirizzo : Via Celoria 11- 20133 Milano

N. tel: 02/23942454 N. fax: 02/26681688


RAPPRESENTANTE LEGALE: nominativo: Dr. Alessandro Moneta

CONTRIBUTO SPECIFICO FORNITO AL PROGETTO (max 2000 caratteri) Durante il primo anno di ricerca ci si propone di studiare i rapporti tra formazione di neurosfere (NS), caratterizzazione di gliomi maligni (HGG) e sopravvivenza dei pazienti. Dati preliminari del nostro gruppo indicano che solo una frazione di HGG forma neurosfere; inoltre i glioblastomi derivati da gliomi di grado inferiore sembrano non produrre NS (Beier et al., 2007). Prevediamo inoltre di valutare l’espressione in gliomi primitivi, nelle NS ed in medulloblastoma del gene polycomb EZH2. EZH2 ha un ruolo importante nel prevenire l’esaurimento di cellule staminali (Kamminga et al., 2006) ed appare overespresso in diversi tumori dove può fungere da marker anche preneoplastico (Ding and Kleer, 2006). Anche i rapporti tra EZH2 e sopravvivenza verranno studiati. Nel secondo anno contiamo di investigare in un modello murino di glioma il rapporto tra tumorigenicità ed espressione di EZH2. Vogliamo poi indagare in vitro, su NS, ed in vivo gli effetti del trattamento di HDAC inibitori come SAHA sull’espressione di EZH2 e sulla sopravvivenza. Infatti le istone deacetilasi sono mediatori importanti dell’azione di proteine del gruppo Polycomb (van der Vlag and Otte, 1999). Questi studi potranno fornire una base importante allo sviluppo di una sperimentazione di fase I/II nel terzo anno che verifichi la sicurezza e la possibile efficacia del trattamento con HDAC inibitori come SAHA in pazienti affetti da glioblastoma multiforme (GBM) o da medulloblastoma. METODOLOGIA (max 4000 caratteri) Formazione di neurosfere da gliomi maligni e sopravvivenza. Questo studio è già iniziato ma si ritiene necessario espanderlo fino a raggiungere un numero statisticamente rilevante di osservazioni (da 50 a 80 casi). I frammenti di tumore sono ottenuti dal dipartimento di neurochirurgia dell’Istituto Neurologico Besta. Dopo dissezione si utilizza un mezzo di coltura privo di siero fetale ma con presenza di EGF e FGF. In queste condizioni una parte delle cellule sopravvive e forma neurosfere. Si prevede anche di valutare la percentuale di attecchimento in queste condizioni (formazione di NS per più di 10 passaggi) ed il suo rapporto con l’andamento clinico considerando in particolare la progression free survival a 6 mesi dalla diagnosi (PFS6) e la sopravvivenza complessiva (OS). Espressione di EZH2 in tumori primitivi (gliomi e medulloblastoma) ed in NS da GBM. Questi studi prevedono l’uso della PCR quantitativa e dell’immunoistochimica usando reagenti disponibili in commercio: primer e sonde validate (ABI) e anticorpi (Abcam, Invitrogen). Si prevede lo studio di almeno 50 tumori primitivi. Si valuterà inoltre per PCR quantitativa l’espressione di EZH2 in NS da HGG come pure in cellule aderenti (AC) derivate dagli stessi tumori utilizzando un mezzo di coltura senza EGF-FGF e con siero. La popolazione NS, secondo diversi studi, è arricchita della componente simil-staminale presente nel tumore (Lee et al., 2006). Si vuole inoltre studiare il rapporto tra espressione di EZH2, caratteristiche del glioma o del medulloblastoma (sede, età, istologia) e sopravvivenza dei portatori. Valutazione in vivo della tumorigenicità di EZH2. Si propone di valutare in vivo l’espressione di EZH2 dopo inoculo di cellule di GBM murino (GL261) o umano (inoculi in topi nudi). Questi studi dovrebbero per mettere di capire se l’espressione di EZH2 è necessaria per la formazione di tumore in queste condizioni, verificando in particolare se cellule EZH2+ si selezionano/amplificano in vivo.

XLIX

Alleanza Contro il Cancro (ACC) – Istituto Superiore di Sanità (ISS) Art.3 DM 21 luglio 2006 - Programma Straordinario di Ricerca Oncologica 2006 Programma 3 “Rete solidale e collaborazioni internazionali” Effetto di HDAC inbitori su cellule di GBM e di medulloblastoma. Questi studi al momento prevedono l’uso dell’HDAC inibitore suberoylanilide hydroxamic acid (SAHA). Alcuni studi hanno proposto recentemente che SAHA abbia una spiccata azione antitumorale in vitro su GBM e medulloblastoma. Il nostro progetto vuole valutare se questa azione sia specificamente a carico della componente simil-staminale di questi tumori, identificata sia tarmite la crescita come NS che tramite immunoseparazione usando il marker CD133 o eventuali marker alternativi. Effetto di HDAC inibitori in vivo. In questi studi ci si propone di verificare l’efficacia di SAHA (o di altri HDAC inibitori) su gliomi derivati da cancer stem-like cells (neurosfere o cellule immunoselezionate per l’espressione di marker staminali). I modelli usati sono ottenute con cellule GL261 o con cellule umane in topi nudi. Nel modello GL261 si propone anche di studiare l’effetto della somministrazione di SAHA associata ad immunoterapia con cellule dendritiche. Studi clinici su HDAC inibitori. Uno studio di fase I usando Vorinostat (SAHA) associato al trattamento standard del GBM con temozolomide viene proposto negli USA presso l’MD Anderson Cancer Center (NABTC04-03). I risultati preliminari di questo trial potranno incoraggiare una sperimentazione di fase I/II nel nostro paese. In considerazione dei risultati uno studio di fase I può essere proponibile su pazienti portatori di medulloblastoma. Tre studenti recenti a livello pre-clinico incoraggiano questa prospettiva (Furchert et al., 2007, Spiller et al., 2006, Sonnemann et al., 2006).

L


MODULO 3



LI


MODULO 3

Curriculum Vitae del Responsabile Scientifico dell’Unità Operativa (max 1 pagina) (PERIODO DI RIFERIMENTO: ULTIMI 5 ANNI; INDICARE ANCHE LE 10 PUBBLICAZIONI SCIENTIFICHE RITENUTE PIÙ SIGNIFICATIVE, CON PARTICOLARE RIFERIMENTO A QUELLE DELL’AREA TEMATICA SCIENTIFICA SULLA QUALE INSISTE IL PROGETTO) Il dott. Gaetano Finocchiaro si è laureato in Medicina a Milano nel 1979. E’ specializzato in Neurologia e in Biochimica e Chimica Clinica. E’stato reserch yellow nel Dipartimento di genetica dell’Università di yale dal 1984 al 1987.Attualmente è responsabile dell’Unità Operativa di Biochimica e Genetica e della Struttura di Neuro-Oncologia Sperimentale presso l’Istituto Neurologico Besta. Il suo gruppo si occupa di biologia molecolare e terapie innovative dei tumori cerebrali ed in particolare di: rapporti tra cellule staminali, glioblastomi e medullostomi; immunoterapia dei glioblastomi con cellule dendritiche. E’ nell’editorial board di Neuro-Oncology e Journal of Neuro-Oncology; è reviewer delle principali riviste di oncologia o neuroscienze (Cancer Res, Int J cancer, Clin Cancer res, J Neurosci etc) come pure di grant italiani ed internazionali (AIRC, Wellcome Trust). Ha ricevuto grant nazionali ed internazionali E’autore di circa 100 lavori scientifici recensiti e presenti su PubMed. Pubblicazioni selezionate

1. Eoli M, Menghi F, Bruzzone MG, De Simone T, Valletta L, Pollo B, Bissola L, Silvani A, Bianchessi D, D'Incerti L, Filippini G, Broggi G, Boiardi A, Finocchiaro G. Methylation of O6-methylguanine DNA methyltransferase and loss of heterozygosity on 19q and/or 17p are overlapping features of secondary glioblastomas with prolonged survival. Clin Cancer Res. 2007 May 1;13(9):2606-13.

2. Serena Pellegatta, Pietro Luigi Poliani, Daniela Corno, Francesca Menghi, Francesco Ghielmetti, Blanca Suarez-Merino, Valentina Caldera, Sara Nava, Maria Ravanini, Fabio Facchetti, Maria Grazia Bruzzone and Gaetano Finocchiaro. Neurospheres enriched in cancer stem-like cells are highly effective in eliciting a dendritic cell mediated immune response against malignant gliomas. Cancer Res. 2006 Nov 1;66(21):10247-52..

3. Eoli M, Bissola L, Bruzzone MG, Pollo B, Maccagnano C, De Simone T, Valletta L, Silvani A, Bianchessi D, Broggi G, Boiardi A, Finocchiaro G. Reclassification of oligoastrocytomas by loss of heterozygosity studies. Int J Cancer. 2006 Jul 1;119(1):84-90.

4. Piepoli T, Jakupoglu C, Gu W, Lualdi E, Suarez-Merino B, Poliani PL, Cattaneo MG, Ortino B, Goplen D, Wang J, Mola R, Inverardi F, Frassoni C, Bjerkvig R, Steinlein O, Vicentini LM, Brustle O, Finocchiaro G. Expression studies in gliomas and glial cells do not support a tumor suppressor role for LGI1. Neuro-oncol. 2006 Apr;8(2):96-108.

5. Pellegatta S, Tunici P, Poliani PL, Dolcetta D, Cajola L, Colombelli C, Ciusani E, Di Donato S, Finocchiaro G. The therapeutic potential of neural stem/progenitor cells in murine globoid cell leukodystrophy is conditioned by macrophage/microglia activation. Neurobiol Dis. 2006 Feb;21(2):314-23.

6. Tunici P, Bulte JW, Bruzzone MG, Poliani PL, Cajola L, Grisoli M, Douglas T, Finocchiaro G. Brain engraftment and therapeutic potential of stem/progenitor cells derived from mouse skin. J Gene Med. 2006 Jan 3; [Epub ahead of print]

7. Tunici P, Bissola L, Lualdi E, Pollo B, Cajola L, Broggi G, Sozzi G, Finocchiaro G. Genetic alterations and in vivo tumorigenicity of neurospheres derived from an adult glioblastoma. Mol Cancer. 2004 Oct 6;3:25.

8. Beghini A, Magnani I, Roversi G, Piepoli T, Di Terlizzi S, Moroni RF, Pollo B, Fuhrman Conti AM, Cowell JK, Finocchiaro G, Larizza L. The neural progenitor-restricted isoform of the MARK4 gene in 19q13.2 is upregulated in human gliomas and overexpressed in a subset of glioblastoma cell lines. Oncogene. 2003 May 1;22(17):2581-91.

9. Bissola L, Eoli M, Pollo B, Merciai BM, Silvani A, Salsano E, Maccagnano C, Bruzzone MG, Fuhrman Conti AM, Solero CL, Giombini S, Broggi G, Boiardi A, Finocchiaro G. Association of chromosome 10 losses and negative prognosis in oligoastrocytomas. Ann Neurol. 2002 Dec;52(6):842-5.

10. Manni I, Tunici P, Cirenei N, Albarosa R, Colombo BM, Roz L, Sacchi A, Piaggio G, Finocchiaro G. Mxi1 inhibits the proliferation of U87 glioma cells through down-regulation of cyclin B1 gene expression. Br J Cancer. 2002 Feb 1;86(3):477-84.

LII


MODULO 3BIS MODULO 3BIS: DESCRIZIONE DEL CONTRIBUTO DI CIASCUN GRUPPO DI RICERCA (Si devono presentare tanti moduli 3bis quanti sono i gruppi di ricerca coinvolti) GRUPPO DI RICERCA: 1. Struttura di Neuro-Oncologia Sperimentale - Istituto Neurologico Besta

RESPONSABILE SCIENTIFICO: nominativo: Dott. Gaetano Finocchiaro

struttura di appartenenza : Fondazione IRCCS Istituto Neurologico Besta funzione: Responsabile della struttura

indirizzo : Via Celoria 11 - 20133 Milano

N. tel: 02/23942454 N. fax: 02/26681688



CONTRIBUTO SPECIFICO FORNITO AL PROGETTO (max 500 caratteri) Studio dei rapporti tra formazione di NS da gliomi maligni e sopravvivenza dei pazienti e di valutare l’espressione di EZH2 in gliomi, NS e medulloblastomidel. Studio in un modello murino di glioma del rapporto tra tumorigenicità ed espressione di EZH2. Sviluppo di una sperimentazione di fase I/II che verifichi la sicurezza e la possibile efficacia del trattamento con HDAC inibitori come SAHA in pazienti affetti da GBM o medulloblastoma. METODOLOGIA (max 1000 caratteri) Formazione di neurosfere da gliomi maligni e sopravvivenza: studio su 50-80 casi. Dopo dissezione si utilizza un mezzo di coltura privo di siero fetale ma con presenza di EGF e FGF. Si prevede anche di valutare la percentuale di formazione di NS ed il suo rapporto con PFS6 e OS. Espressione di EZH2 in gliomi, medulloblastomi ed NS tramite PCR quantitativa e immunoistochimica. Valutazione in vivo dell’espressione di EZH2 in GBM murino GL261 o umano (inoculi in topi nudi). Studi clinici di fase I o I/II con HDAC inibitori in pazienti affetti da GBM o medulloblastoma.

LIII


MODULO 3BIS


1. Personale dipendente € 30.000 ,00 NULLA _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ 2. Personale a contratto/consulenza/borsa di studio € 60.000 ,00 € 60.000,00 _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ 3. Missioni € 8.000,00 € 5.000,00 _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ 4. Attrezzature (solo a noleggio o leasing): ________ ________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ 5. Materiale di consumo € 80.000,00 € 50.000,00 ____________________________________________ ____________________________________________ ____________________________________________ 6. Pubblicazioni / organizzazione convegni, ecc. € 5.000,00 € 3.000,00 ___________________________________________ ____________________________________________ ____________________________________________ 7. Elaborazione dati (specificare) __________ ____________ ___________________________________________ ___________________________________________ ___________________________________________ 8. Spese generali delle strutture coinvolte (specificare) € 36.000,00 € 17.000,00 ___________________________________________ ___________________________________________ ___________________________________________ TOTALE € 219.000,00 € 135.000,00

LIV


MODULO 3BIS MODULO 3BIS: DESCRIZIONE DEL CONTRIBUTO DI CIASCUN GRUPPO DI RICERCA (Si devono presentare tanti moduli 3bis quanti sono i gruppi di ricerca coinvolti) GRUPPO DI RICERCA: 2. Struttura di Neuro-Biologia e UPTC - Istituto Neurologico Besta

RESPONSABILE SCIENTIFICO: nominativo: Dott. Maurizio Gelati

struttura di appartenenza : Fondazione IRCCS Istituto Neurologico Besta funzione: Contrattista

indirizzo : Via Celoria 11 - 20133 Milano

N. tel: 02/23941 N. fax: 02/26681688



CONTRIBUTO SPECIFICO FORNITO AL PROGETTO (max 500 caratteri) Il nostro gruppo contribuirà ad indagare in vitro, su NS, ed in vivo gli effetti del trattamento di HDAC inibitori come SAHA sull’espressione di EZH2 e sulla sopravvivenza. Infatti le istone deacetilasi sono mediatori importanti dell’azione di proteine del gruppo Polycomb (van der Vlag and Otte, 1999). Questi studi potranno fornire una base importante allo sviluppo di sperimentazione cliniche di fase I/II. METODOLOGIA (max 1000 caratteri) Questi studi al momento prevedono l’uso dell’HDAC inibitore suberoylanilide hydroxamic acid (SAHA). Alcuni studi hanno proposto recentemente che SAHA abbia una spiccata azione antitumorale in vitro su GBM e medulloblastoma. Il nostro progetto vuole valutare se questa azione sia specificamente a carico della componente simil-staminale di questi tumori, identificata sia tramite la crescita come NS che tramite immunoseparazione usando il marker CD133 o eventuali marker alternativi. Studiando l’effetto di HDAC inibitori in vivo ci si propone di verificare l’efficacia di SAHA (o di altri HDAC inibitori) su gliomi derivati da cancer stem-like cells (neurosfere o cellule immunoselezionate per l’espressione di marker staminali). I modelli usati sono ottenute con cellule GL261 o con cellule umane in topi nudi.

LV


MODULO 3BIS


1. Personale dipendente € 20.000 ,00 NULLA _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ 2. Personale a contratto/consulenza/borsa di studio € 32.000 ,00 € 32.000,00 _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ 3. Missioni € 3.000,00 € 3.000,00 _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ 4. Attrezzature (solo a noleggio o leasing): ________ ________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ 5. Materiale di consumo € 31.000,00 € 31.000,00 ____________________________________________ ____________________________________________ ____________________________________________ 6. Pubblicazioni / organizzazione convegni, ecc. _________ ___________ ___________________________________________ ____________________________________________ ____________________________________________ 7. Elaborazione dati (specificare) __________ ____________ ___________________________________________ ___________________________________________ ___________________________________________ 8. Spese generali delle strutture coinvolte (specificare) € 9.000,00 € 9.000,00 ___________________________________________ ___________________________________________ ___________________________________________ TOTALE € 95.000,00 € 75.000,00

LVI


MODULO 3BIS MODULO 3BIS: DESCRIZIONE DEL CONTRIBUTO DI CIASCUN GRUPPO DI RICERCA (Si devono presentare tanti moduli 3bis quanti sono i gruppi di ricerca coinvolti) GRUPPO DI RICERCA: 3. Dipartimento di Oncologia Sperimentale - Istituto Europeo di Oncologia

RESPONSABILE SCIENTIFICO: nominativo: Dott.ssa Giuliana Pelicci


indirizzo : Via Ripamonti, 435 - Milano

N. tel: 02/57489830 N. fax: 02/95375991



CONTRIBUTO SPECIFICO FORNITO AL PROGETTO (max 500 caratteri) Il gruppo collaborerà in particolare agli studi su cellule cancer stem-like da glioblastoma che crescono in vitro come neurosfere (NS). Verrà caratterizzato in queste cellule il ruolo di geni rilevanti per il fenotipo stem-like come Rai ShcC (Troglio et al., 2004) ed il suo eventuale rapporto con l’espressione di EZH2 sia in vitro che in vivo (tumori derivati in topi nudi da NS di GBM) in prenza di trattamenton inibitori HDAC. METODOLOGIA (max 1000 caratteri) Il gruppo collaborerà allo caratterizzazione di neurosfere da gliomi maligni e da medulloblastoma in presenza di EGF e FGF, valutando per real time PCR e western blotting l’espressione di Rai ShcC in parallelo a quella di EZH2. Gli studi verranno estesi in vivo dopo inoculo di NS da GBM umani o di cellule di medulloblastoma valutando l’espressione dei due geni per real time PCR o immunoistochimica. Verrà anche studiata la risposta al trattamento con HDAC inibitori come SAHA in modelli murini di GBM e medulloblastoma.

LVII


MODULO 3BIS


1. Personale dipendente € 20.000 ,00 NULLA _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ 2. Personale a contratto/consulenza/borsa di studio € 20.000 ,00 € 20.000,00 _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ 3. Missioni ________ ________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ 4. Attrezzature (solo a noleggio o leasing): ________ ________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ 5. Materiale di consumo € 30.000,00 € 30.000,00 ____________________________________________ ____________________________________________ ____________________________________________ 6. Pubblicazioni / organizzazione convegni, ecc. _________ ___________ ___________________________________________ ____________________________________________ ____________________________________________ 7. Elaborazione dati (specificare) __________ ____________ ___________________________________________ ___________________________________________ ___________________________________________ 8. Spese generali delle strutture coinvolte (specificare) € 14.000,00 € 10.000,00 ___________________________________________ ___________________________________________ ___________________________________________ TOTALE € 84.000,00 € 60.000,00

LVIII

MODULO 1 - Dati generali del programmaold.iss.it/binary/lgac/cont/PROGETTOIEO.1202736477.pdf ·...

Documents

Transcript of MODULO 1 - Dati generali del programmaold.iss.it/binary/lgac/cont/PROGETTOIEO.1202736477.pdf ·...