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Modulatoren epigenetischer Regulationsmechanismen:

Medizinische Chemie neuer KDM4-Inhibitoren und Methodenentwicklung zur

SFC-MS-Analytik von Ketaminmetaboliten

I n a u g u r a l d i s s e r t a t i o n

zur

Erlangung des akademischen Grades eines

Doktors der Naturwissenschaften

(Dr. rer. Nat.)

der

Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät

der

Universität Greifswald

vorgelegt von

Georg Michael Fassauer

Greifswald, Juli 2018

Dekan: Prof. Dr. Werner Weitschies

1. Gutachter: Prof. Dr. Andreas Link

2. Gutachter: Prof. Dr. Gerhard Scriba

Tag der Promotion: 19. Oktober 2018

„Der Wille öffnet die Türen zum Erfolg.“

Louis Pasteur (1822-1895)

Inhaltsverzeichnis

II

Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis V

1 Synthese und Evaluation neuer möglicher Inhibitoren von Histon-Demethylasen 1

1.1 Einleitung 1

1.1.1 Aufbau des Chromatins und epigenetische Modifikationen 1

1.1.1.1 Lysin-spezifische Histon-Demethylasen 7

1.1.1.2 JumonjiC-Domäne enthaltende Histon-Demethylasen 8

1.1.2 Literaturübersicht über bisher publizierte Histon-Demethylase-Inhibitoren 12

1.1.2.1 Inhibitoren der Lysin-spezifischen Histon-Demethylase 12

1.1.2.2 Inhibitoren der JumonjiC-Domäne enthaltenden Histon-Demethylasen 14

1.1.3 Konzept der Bioisosterie 19

1.2 Untersuchungen, Ergebnisse und Diskussion 22

1.2.1 Synthese von Tetrazol- und Carbonsäurehydrazid-beinhaltenden

KDM4-Inhibitoren 22

1.2.1.1 Anthranilsäurederivate 22

1.2.1.2 Essigsäurederivate 32

1.2.2 Synthese von Tetrazol- und Pyridin-beinhaltenden KDM4-Inhibitoren 38

1.2.2.1 4-(1H-Tetrazol-5-yl)pyridin-2-amine/thiole/thioether/ether 38

1.2.2.2 4-(1H-Tetrazol-5-yl)picolinamide 48

1.2.2.3 4-(1H-Tetrazol-5-yl)pyridin-2-hydroxamsäure 51

1.2.2.4 [4-(1H-Tetrazol-5-yl)pyridin-2-yl]methanamine 52

1.2.2.5 4-(1H-Tetrazol-5-yl)picolinsäure/2,4-Di(1H-tetrazol-5-yl)pyridin 65

1.2.3 Synthese von Carbonsäure- und Pyridin-beinhaltenden KDM4-Inhibitoren 67

1.2.4 Biologische Testung/Analyse der Kristallstrukturen 69

1.3 Zusammenfassung und Ausblick Kapitel 1 81

2 Auswirkungen von epigenetischer (Fehl-)Regulation auf psychische Erkrankungen 83

3 Analytische Untersuchungen von Ketamin und dessen Metaboliten 86

3.1 Vorbetrachtungen 86

3.1.1 Depressive Erkrankungen und leitliniengerechte Therapie 86

Inhaltsverzeichnis

III

3.1.2 Ketamin als neue Therapiestrategie zur Behandlung (therapieresistenter)

depressiver Erkrankungen 89

3.1.3 Allgemeines zur Superkritischen Fluidchromatographie und ihre Vorteile 94

3.1.4 Besonderheiten der Analyten bei der Detektion mit einem

Single-Quadrupol-Massenspektrometer 97

3.1.5 Parameter der Validierung von chromatographischen Methoden 98

3.1.5.1 Selektivität 99

3.1.5.2 Kalibrierfunktion 99

3.1.5.3 Unterstes Quantifizierungslevel 100

3.1.5.4 Richtigkeit 100

3.1.5.5 Präzision 100

3.1.5.6 Wiederfindung, Matrix-Effekte und Stabilität 101

3.2 Methodenentwicklung und Validierung 101

3.2.1 Entwicklung und Optimierung einer SFC-MS-Methode 101

3.2.2 Validierung der SFC-MS-Methode 108

3.2.2.1 Selektivität 108

3.2.2.2 Kalibrierfunktion 110

3.2.2.3 Unterstes Quantifizierungslevel 114

3.2.2.4 Präzision und Richtigkeit 114

3.2.2.5 Wiederfindung, Matrix-Effekte und Stabilität 116

3.3 Anwendung der SFC-MS-Methode auf Proben einer klinischen Studie als

Proof-of-Concept 117

3.4 Gegenüberstellung der SFC-MS-Methode mit literaturbekannten

LC-Methoden 120

3.5 Zusammenfassung und Ausblick Kapitel 3 122

4 Experimenteller Teil 123

4.1 Geräteparameter 123

4.1.1 NMR-Spektroskopie 123

4.1.2 Schmelzverhalten 123

4.1.3 Dünnschichtchromatographie/Schwerkraftsäulenchromatographie 124

4.1.4 MIR-Spektroskopie 124

Inhaltsverzeichnis

IV

4.1.5 Mikrowellenreaktor 124

4.1.6 MPLC 125

4.1.7 Präparative HPLC 125

4.1.8 Hochauflösende Massenspektrometrie (HRMS) 125

4.1.9 SFC-MS 126

4.1.10 Visualisierung der Kristallstrukturen 126

4.1.11 Kristallographie (Institut für Biochemie, Greifswald) 126

4.1.12 Kristallographie (BESSY II, Berlin) und isothermer Titrationskalorimetrie 127

4.1.13 LANCE-Assay (Institut für Pharmazeutische Wissenschaften, Freiburg) 128

4.2 Chemikalien 128

4.3 Beschreibung der Synthesen 130

4.3.1 Synthese von Tetrazol- und Carbonsäurehydrazid-beinhaltenden

Substanzen 130

4.3.2 Synthese von Tetrazolylpyridinen und Isonicotinsäure-beinhaltenden

Substanzen 143

4.4 Beschreibung der validierten SFC-MS-Methode 195

4.4.1 Probenvorbereitung 195

4.4.2 Säulenauswahl 195

4.4.3 Chromatographische Parameter 196

4.4.4 MS-Parameter 196

4.4.5 Mathematische Prüfung auf Linearität 196

4.4.6 Sonstige experimentelle Daten 198

5 Literaturverzeichnis 202

Eigenständigkeitserklärung 225

Tabellarischer Lebenslauf 226

Eigene Publikationen, Poster und Vorträge 227

Danksagung 229

Abkürzungsverzeichnis

V


±I-Effekt Induktiver Substituenteneffekt

±M-Effekt Mesomerer Substituenteneffekt

2OG 2-Oxoglutarat

AcOH Konzentrierte Essigsäure

ACN Acetonitril

Äq. Molare Äquivalente

AMPA α-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolpropionsäure

API Active Pharmaceutical Ingredient

BfArM Bundesinstitut für Arzneimittel und Medizinprodukte

Bn Benzyl-Schutzgruppe

BnCl Benzylchlorid

BPR Back Pressure Regulator (Rückdruckregulator)

CRS Chemische Referenzsubstanz

δ Chemische Verschiebung in der NMR-Spektroskopie

d Dublett

DC, dc Dünnschichtchromatographie, dünnschichtchromatographisch

DCM Dichlormethan

DEPT135 Distortionless Enhancement of Polarization Transfer

DIBAL Diisobutylaluminiumhydrid

DIPEA N,N-Diisopropylethylamin

DMF N,N-Dimethylformamid

DMSO Dimethylsulfoxid

DNA Deoxyribonucleic acid

DNK Dehydronorketamin

DNMT DNA-Methyltransferase

ELISA Enzyme-linked Immunosorbent Assay

EMA European Medicines Agency

ESI Elektronenspray-Ionisation

EtOAc Ethylacetat

EtOH Ethanol

FAD Flavin-Adenin-Dinukleotid (oxidiert)

FADH2 Flavin-Adenin-Dinukleotid (reduziert)

FDA Food and Drug Administration

FDH Formaldehyd-Dehydrogenase

FTIR Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie

GC Gas Chromatographie


VI

HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation

HNK Hydroxynorketamin

HPLC High Performance Liquid Chromatography

HSQC Heteronuclear Single Quantum Correlation

IPA Propan-2-ol

IS Interner Standard

IT Ion Trap

ITC isotherme Titrationskalorimetrie

IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry

i. v. intravenös

J Kopplungskonstante

Jmj Jumonji-(Domäne)

KDM Histon-Lysin-Demethylase

KET Ketamin

LANCE-Assay Lanthanide-Chelate-Excite-Assay

LLOD Lower Limit of Detection

LLOQ Lower Limit of Quantification

LM Laufmittel

LSD Lysin-spezifische Histon-Demethylase

m Multiplett (NMR-Spektroskopie), medium (MIR-Spektroskopie)

MAO Monoaminoxidase

MeOH Methanol

MPLC Medium Pressure Liquid Chromatography

MS Massenspektrometrie

MTBE Methyl-tert-butylether (IUPAC: 2-Methoxy-2-methylpropan)

MW Mittelwert

NIH National Institutes of Health

NK Norketamin

NMDA N-Methyl-D-aspartat

NMP N-Methyl-2-pyrrolidon

NMR Nuclear Magnetic Resonance �� Wellenzahl

PDA Photo Diode Array Detector

PDCA Pyridin-2,4-dicarbonsäure

PHD Plant-Homöo-Domäne

p. o. peroral

ppm parts per million

q Quartett


VII

QC Quality Control

SQMS Single-Quadrupol-Massenspektrometer

RSD Relative Standardabweichung (Relative Standard Deviation)

s Singulett (NMR-Spektroskopie), strong (MIR-Spektroskopie)

SC Säulenchromatographie

sCO2 Überkritisches CO2

SD Standardabweichung (Standard Deviation)

SFC Supercritical Fluid Chromatography

SIM Selected Ion Monitoring

SPE Solid Phase Extraction

SSRI Selective Serotonine Reuptake Inhibitor

TEA Triethylamin

TEA∙HCl Triethylammoniumchlorid

THF Tetrahydrofuran

TOF Time of Flight

TZA Tri- und tetrazyklische Antidepressiva

ULOQ Upper Limit of Quantification

UV/Vis Ultraviolet/Visible

w weak (MIR-Spektroskopie)

WHO World Health Organization

Synthese und Evaluation neuer möglicher Inhibitoren von Histon-Demethylasen

Einleitung | 1

1 Synthese und Evaluation neuer möglicher Inhibitoren von Histon-Demethylasen

1.1 Einleitung

Bereits im Jahr 1940 wurde der Begriff Epigenetik geprägt, um die Bedeutung der

Entwicklung von verschiedenartigen Zelltypen aus ein und demselben Genom zu

adressieren und die Entstehung des Phänotyps in Korrelation von Genen und Umwelt zu

begründen1. Im modernen Kontext wird Epigenetik als potentiell vererbbare, aber durch

Umwelteinflüsse veränderbare Regulation der genetischen Funktion und Expression,

welche auf nicht DNA-codierten Mechanismen beruht, verstanden2. Heute lassen sich viele

Beispiele von epigenetischen Modifikationen aufführen, so werden unter anderem kausale

Zusammenhänge mit zahlreichen Krankheitsgeschehen angenommen. Besonders

eingängig war die Entdeckung, dass Bienenlarven sich auf Grund von differenzierter

Nutrition entweder zur Arbeiterbiene oder zur Bienenkönigin entwickeln konnten. Das

Genom war jeweils identisch, die unterschiedliche Ernährung führte jedoch zu

andersartigen Methylierungsmustern der DNA und damit zu heterogenen Phänotypen3.

Obwohl schon einige Arzneistoffe, welche in epigenetische Regulationsvorgänge

eingreifen, zur Verfügung stehen, ist das Forschungsfeld nach wie vor attraktiv. Im

Folgenden sollen die verschieden Arten von bekannten Modifikationen aufgezählt und

teilweise erörtert werden. Da oftmals chromatinische Strukturen Angriffspunkt von

epigenetischen Veränderungen sind, sollen auch diese kurz erläutert werden.

1.1.1 Aufbau des Chromatins und epigenetische Modifikationen

Auf Grund der Fülle an Informationen, welche im Erbgut gespeichert ist, müssen die

entsprechend langen, linearen molekularen Informationsträger, die DNA-Helices, „gepackt“

(kondensiert) werden. Dieses geschieht in Form von Chromatin, einer Assoziation von

DNA, Histonen, Nicht-Histon-Proteinen und RNA. Strukturell besteht eine Chromatin-

Einheit (Nucleosom) aus einem Histon-Oktamer, zusammengesetzt aus einem Tetramer

von jeweils zwei Histonen H3/H4, zwei Dimeren bestehend aus Histon H2A/H2B und etwa

147 Basenpaaren DNA in helikaler Form, die um das Oktamer gewunden sind4 (Abb. 1

oben). Mit dem fünften Histon H1 wird ein Linker zu Verfügung gestellt, welcher die weitere

Komprimierung zu Chromatinstrukturen höherer Ordnung ermöglicht. Die Packungsdichte

des Chromatins wird unter anderem durch epigenetische Modulatoren beeinflusst und

damit auch eine Möglichkeit zur Regulation der Transkription eröffnet. Das für die Mitose

essentielle, dichter gepackte Heterochromatin ist für Ableseprozesse weniger gut geeignet,

während das aufgelockerte Euchromatin für Transkriptionsabläufe besser zugänglich ist.


2 | Einleitung

Ein ausgeglichenes Verhältnis beider Chromatinarten ist für die störungsfreie

Genexpression von großer Bedeutung5.

Abb. 1: Oben: Aufbau eines Chromosomen-Kern-Komplexes mit umwindender DNA (PDB: 1KX5) (Farben der Histone entsprechen der unteren Abbildung). Unten: Organisation des Chromatins und N-terminale Histonstränge (modifiziert nach Sun et al.6): Grundlage von eukaryotischen Genomen ist die DNA, welche gewunden um Histone vorliegt. Diese Anordnungen können weiter komprimiert werden und formen so höhere Ordnungen wie Solenoide oder Chromosomen aus. Die vom Histon-Oktamer (bestehend aus jeweils zwei Kopien von H2A, H2B, H3, H4) hinausstehenden N-terminalen Enden können Ziel von posttranslationalen Modifikationen wie Acylierungen und Methylierungen sein (Alterationsmöglichkeiten von Lysinen graphisch markiert, die gezeigten Längen der Histone entsprechen nur einem Ausschnitt).

Posttranslationale Modifikationen sind reversible Vorgänge, so steht in der Regel jedem

„Writer“ (Einfügen einer Modifikation) ein „Eraser“ (Entfernen einer Modifikation)

gegenüber. Mit Hilfe von „Readern“ werden die Modifikationen erkannt und

nachgeschaltete Kaskaden gestartet7. Da der Fokus dieser Arbeit auf den Histon-

Demethylasen liegt, sollen andere epigenetische Modifikationen an dieser Stelle nur

umrissen werden.


Einleitung | 3

Ein nicht direkt Histon-modifizierender epigenetischer Eingriff ist die Methylierung von DNA.

Diese findet hauptsächlich an Position C5 von Cytosin statt und wird von dem Enzym DNA-

Methyltransferase (DNMT), unter Verwendung von S-Adenosylmethionin (SAM) als

Methylgruppendonor, katalysiert. Es sind verschiedene Varianten des Enzyms bekannt

(DNMT1, DNMT3a und DNMT3b8), welche jeweils eigene Erkennungsmuster besitzen9. Die

Entwicklung von Modulatoren der DNA-Methyltransferasen ist fortgeschritten, so dass

bereits Arzneistoffe eine Zulassung erhielten. Mit Decitabin (E1, Abb. 2), einem Cytidin-

Desoxynucleosidanalogon, werden DNMTs gehemmt und so eine Gen-Promoter-

Hypomethylierung provoziert, die in einer Reaktivierung der Tumorsuppressor-Gene und

einer Induktion der Zelldifferenzierung oder der Zellseneszenz, gefolgt von programmiertem

Zelltod, resultieren kann10. Azacitidin (E2) wirkt über einen aktuell weniger gut geklärten

Mechanismus, greift aber ebenfalls mit hemmender Wirkung in die Funktion von DNMT ein,

was eine Hypomethylierung der inadäquat methylierten Gene zu Folge hat und somit in

Krebszellen zur Re-Expression und zur Aktivierung Krebs-unterdrückender Funktionen

führen könnte11. Beide Inhibitoren besitzen eine Zulassung für die Indikation akute

myeloische Leukämie (AML), Azacitidin wird zusätzlich noch angewendet bei

myelodysplastischen Syndromen (MDS) und chronischer myelomonozytärer Leukämie

(CMML). Als „Eraser“ der DNMT können Ten-Eleven-Translocation (TET) Methylcytosin-

Dioxygenasen angesehen werden, welche die neu eingefügte Methylgruppe des

5-Methylcytosins zwar nicht entfernen, 5-Methylcytosin durch Hydroxylierung aber in

5-Hydroxymethylcytosin überführen können12. Interessanterweise ist dieses Enzym

abhängig von 2-Oxoglutarat (2OG) und Fe(II)13. Damit weist es eine gewisse Ähnlichkeit zu

den JmjC-Domänen enthaltenden Histon-Demethylasen auf. Da auch Mutationen der TETs

in Tumoren nachgewiesen werden konnten14, erscheint der Nutzen einer Hemmung oder

Aktivierung von DNMTs beziehungsweise der TETs in hohem Maße individuell zu sein.

Abb. 2: DNA-Methylase-Inhibitoren Decitabin und Azacitidin, Histon-Desacylase-Inhibitoren Vorinostat, Belinostat und Panobinostat.


4 | Einleitung

Ein weiteres „Writer-Eraser-Paar“ modifiziert freie Aminogruppen der Aminosäure Lysin von

N-terminalen Enden der Histonproteine mit Acylresten (einige Substrate in Abb. 1 unten).

Histon-Acetyltransferasen (HATs) fügen unter Zuhilfenahme von Acetyl-Coenzym A eine

Acetyl-Gruppe ein. Die basisch reagierende, leicht protonierbare Aminofunktion wird

dadurch in ein nicht mehr basisches Carbonsäureamid umgewandelt, was theoretisch zu

einer Verminderung der elektrostatischen Wechselwirkung zwischen positiv geladenem

Protein und negativ geladener DNA führt. Daraus resultieren eine Auflockerung des

Chromatins und eine erhöhte Transkriptionsbereitschaft. Die Rückreaktion, also das

Entfernen von Acetyl- und auch anderen kleinen Acylgruppen, wird durch Histon-

Desacylasen (HDACs) katalysiert. Diese arbeiten entweder Zink-abhängig (Klasse I, II und

IV) oder mittels NAD+ (Klasse III oder Sirtuine)15,16. Für die Zink-abhängigen HDACs

konnten ebenfalls Inhibitoren für die Arzneimitteltherapie zugelassen werden. So zielen die

drei Hydroxamsäurederivate Vorinostat (E3), Belinostat (E4) und Panobinostat (E5, Abb. 2)

auf eine Komplexierung des zentralen Zn2+-Kations ab17. Bei dem cyclischen Peptid

Romidepsin (nicht abgebildet) können nach reduktiver Spaltung einer Disulfidbrücke in vivo

entstandene Thiolgruppen an das metallische Zentrum koordiniert werden18. Auch hier sind

die Indikationen in der Therapie von Tumorerkrankungen angesiedelt (u. a. T-Zell-

Lymphome und Multiples Myelom). Interessanterweise sind darüber hinaus Nicht-Histon-

Proteine wie das Tumorsuppressor-Gen p53 oder der Transkriptionsfaktor NF-κB mögliche

Substrate der HATs/HDACs19. Weitere Modulationen von den vor allem aus dem

Chromosomeninneren herausragenden Histon-Enden können ferner Phosphorylierungen

(„Writer“: Histon-Kinasen, „Eraser“: Histon-Phosphatasen)20 und ADP-Ribosylierungen

(„Writer“: Poly(ADP-Ribose)-Polymerase, „Eraser“: Poly(ADP-Ribose)-Glycohydrolase)21

sein. Modifikationen mit anderen Proteinen wie Ubiquitin („Writer“: E1 (Aktivierendes

Enzym), E2 (Konjugierendes Enzym) und E3 (Ligase), „Eraser“: Ubiquitin-Hydrolasen)22

oder „Small Ubiquitin-related Modifier“ (SUMO) („Writer“: E1, E2 und E3, „Eraser“: Sentrin-

spezifische Proteasen)23 wurden ebenfalls beschrieben.

Die namensgebende posttranslationale Modifikation im Rahmen dieser Arbeit ist jedoch die

Demethylierung von Lysinen an N-terminalen Enden der Histone. Die dazu

entgegengesetzten „Writer“, die Lysin- und Arginin-Methyltransferasen (HMTs), fügen

Methylgruppen an die entsprechenden Aminosäuren an24. Als Cofaktor dient in der Regel

S-Adenosylmethionin, die Unterteilung der Methyltransferase erfolgt nach Aufbau (u. a.

Suv39, G9a oder EZH1) und nach Substrat, wobei hauptsächlich die Histone H3K9, H3K27

und H3K79 das Methylierungsziel darstellen25. Die Auswirkungen auf die Transkription

fallen jedoch weniger einheitlich als bei der Acylierung von Histonen oder Methylierung von

DNA aus. Das liegt auch daran, dass die basischen Eigenschaften der Aminofunktionen

durch das Anfügen einer oder mehrerer Methylgruppen nur geringfügig verändert werden.

So kommt es durch Einfach-Methylierung von H3K9 zu einer Aktivierung, bei einer Zwei-


Einleitung | 5

oder Dreifach-Methylierung aber zur Drosselung der transkriptionellen Regulation26,27.

Ähnlich verhält es sich mit H3K79, wobei prinzipiell alle drei Methylierungsmuster

aktivierend wirken können, für H3K79me3 aber auch eine Unterdrückung der

Genexpression festgestellt wurde28.

Die Entfernung der Methylgruppen wird durch Histon-Demethylasen katalysiert. Diese

können in Lysin-spezifische und JumonjiC-Domäne (JmjC) enthaltende Demethylasen

unterteilt werden. Letztere erhielt ihre Bezeichnung aus dem Japanischen und bedeutet

wörtlich übersetzt „Kruzifix“, weil bei der Erstentdeckung anormale, Kreuz-ähnliche Gebilde

der Neuralrinnen in Jumonji-mutierten Mäusen gefunden wurden29,30. Erst durch die

Entdeckung von KDM1 (LSD1, Lysin-spezifische Histon-Demethylase) konnte bewiesen

werden, dass die Methylierung von Histonproteinen keinen irreversiblen Prozess darstellt31.

Weitere Forschungsarbeiten förderten Informationen über Vertreter der deutlich größeren

Gruppe der JmjC-Domäne enthaltenden Histon-Lysin-Demethylasen zu Tage. Beide

Klassen unterschieden sich primär in ihrem Mechanismus, mit welchem sie Methylgruppen

von Lysinen entfernen können. Die Substrate hingegen überschneiden sich zum Teil und

sind hauptsächlich am Histon 3 (H3K4, K9, K27, K36 und K79) und geringfügig am Histon

4 (H4K20) lokalisiert32. Der allgemeine Aufbau der verschiedenen Enzyme wurde bereits in

Übersichtsarbeiten zusammengefasst33,34 (Tab. 1). Neben der für die katalytische Funktion

essentiellen Aminoxidase- und JmjC-Domäne sind zahlreiche weitere Motive zu finden,

welche Substrat- oder Protein-bindende und zum Teil namensgebende Eigenschaften

besitzen (z. B. JARID durch Jmj-At-rich-interactive-Domäne).

Über die Auswirkungen von (fehlgeleiteten) repressiven oder aktivierenden Effekten auf die

Transkription von verschiedenen Vertretern unter- oder überregulierter Histon-

Demethylasen wurden ebenfalls mehrere Übersichtsarbeiten publiziert32,35,36. Indirekt

lassen sich daraus auch mögliche Indikationen für Inhibitoren oder Aktivatoren

interpretieren. Diese gehen in eine ähnliche Richtung wie die bereits zugelassenen DNMT-

und HDAC-Inhibitoren, so konnten beispielsweise Überexpressionen von KDM1 in Brust-,

Prostata-, und Blasenkarzinomen festgestellt werden37,38. Auch für die KDM4-Enzymreihe

wurden Hinweise gefunden, dass es unter anderem zu einer Überregulierung in

Prostatatumoren gekommen war39-41.

Im Folgenden soll genauer auf die katalytischen Mechanismen der KDM1- und KDM4-

Enzymreihe eingegangen werden. Erstere ist ebenfalls für den zweiten Teil dieser Arbeit

von Interesse. Im Falle der KDM4 soll der Fokus für diesen Abschnitt besonders auf die

Varianten A und D gelegt werden.


6 | Einleitung

Tab. 1: Übersicht, struktureller Aufbau und Substrate der KDM-Familie (modifiziert nach33,34).

Bezeichnung Domänen Substrat(e) KDM1A (LSD1) H3K4me1/me2, H3K9me1/me2 KDM1B (LSD2) H3K4me1/me2 KDM2A (JHDM1A) H3K36me1/me2 KDM2B (JHDM1B) H3K4me3, H3K36me1/me2 KDM3A (JMJD1A) H3K9me1/me2 KDM3B (JMJD1B) H3K9me1/me2 KDM3C (JMJD1C) H3K9me1/me2 KDM4A (JMJD2A) H3K9me2/me3, H3K36me2/me3,

H1.4K26me2/me3 KDM4B (JMJD2B) H3K9me2/me3, H3K36me2/me3,

H1.4K26me2/me3 KDM4C (JMJD2C) H3K9me2/me3, H3K36me2/me3,

H1.4K26me2/me3 KDM4D (JMJD2D) H3K9me2/me3,

H1.4K26me2/me3 KDM4E (JMJD2E) H3K9me2/me3,

H3K56me3 KDM5A (JARID1A) H3K4me2/me3 KDM5B (JARID1B) H3K4me2/me3 KDM5C (JARID1C) H3K4me2/me3 KDM5D (JARID1D) H3K4me2/me3 KDM6A (UTX) H3K27me2/me3 KDM6B (JMJD3) H3K27me2/me3 KDM7A (JHDM1D) H3K9me1/me2, H3K27me1/me2 KDM7B (PHF8) H3K9me1/me2, H4K20me1 KDM7C (PHF2) H3K9me2 KDM8 (JMJD5) H3K36me2

Aminoxidase-Domäne

JmjC-Domäne Plant-Homöo-DomäneJmjN-Domäne

Tudor-Domäne

CXXC Zinkfinger-Domäne Leucin-rich-repeat-Domäne

At-rich-interactive-Domäne C5HC2 Zinkfinger-Domäne

Tetratricopeptid-Domäne

SWIRM-Domäne CW-Typ Zinkfinger-Domäne

F-Box-Domäne


Einleitung | 7

1.1.1.1 Lysin-spezifische Histon-Demethylasen

Der Mechanismus, mit welchem LSD1 Methylgruppen von Lysinresten an N-terminalen

Enden vom Histon H3 entfernt, ist abhängig von Flavin-Adenin-Dinukleotid (FAD) und läuft

wie folgt ab (Abb. 3): Die Oxidation eines mono- oder dimethylierten Lysins wird dadurch

katalysiert, dass FAD ein Hydridion aufnehmen kann. Das unter der Hydridabgabe

gebildete Iminiumion wird im weiteren Verlauf unter nichtkatalytischen Bedingungen mit

Wasser zum niedersubstituierten Amin, einem Proton und einem Molekül Formaldehyd

gespalten. Entstandenes FADH2 kann dann unter Einwirkung von molekularem Sauerstoff

über eine radikalische Spezies unter Abgabe von Wasserstoffperoxid wieder regeneriert

werden. Zur Oxidation des methylierten Lysinrestes wird ein freies Elektronenpaar benötigt,

weshalb nur mono- oder dimethylierte, aber keine trimethylierten Lysinreste als Substrat in

Frage kommen42. Es konnte jedoch nachgewiesen werden, dass auch Nicht-Histone, wie

Protein p5343 oder DNMT144, als Ziel adressiert werden.

Abb. 3: FAD-abhängiger Mechanismus der LSD1 (Erklärungen siehe Text).

LSD1 und 2 sind Monoaminoxidasen und stehen daher in enger Verwandtschaft zu anderen

Enzymen, die dieses katalytische Zentrum aufweisen45. Die Monoaminoxidasen (MAO) A

und B stellen beispielsweise schon seit längerer Zeit ein Target für Arzneistoffdesign dar.

Mit der Inhibition dieser Enzyme können sowohl depressive Erkrankungen als auch Morbus

Parkinson behandelt werden. Dass die Entwicklung von Inhibitoren der LSD1 davon stark

beeinflusst wurde, wird in Abschnitt 1.1.2.1 herausgearbeitet.

Strukturell enthält LSD1 neben der für die katalytische Aktivität notwendigen FAD- und

Substrat-bindenden Subdomäne noch eine SWIRM- (in den Proteinen Swi3p, Rsc8p und

Moira als erstes entdeckt) und eine Tower-Domäne (Abb. 4). Letztere ermöglicht die

Bindung anderer Proteine, wie zum Beispiel von CoREST (Repressor element-1 silencing


8 | Einleitung

transcription factor corepressor)46. LSD2 weist diese Tower-Domäne nicht auf, verfügt dafür

aber über eine Zinkfinger-Domäne47.

Abb. 4: Bändermodell der humanen LSD1 mit Cofaktor FAD (rot), ohne N-flexible Region und Abschnitte des C-Terminus (PDB: 2HKO).

1.1.1.2 JumonjiC-Domäne enthaltende Histon-Demethylasen

Die Klasse der JmjC-Domänen enthaltenden Enzyme ist in ihrer Funktion abhängig von

den Cofaktoren Fe(II) und 2OG. Wie der Name bereits suggeriert, besitzen alle Enzyme

dieser Reihe mindestens die katalytisch aktive JmjC-Domäne48. Sie sind im Gegensatz zur

LSD1/2 in der Lage auch trimethylierte Lysinreste zu demethylieren. Der Mechanismus läuft

dabei wie folgt ab (Abb. 5): Die durch zwei Histidinreste, einen Glutamat- oder Aspartatrest

und drei Wassermoleküle komplexierte Eisen(II)-Spezies wird im ersten Schritt durch ein

2OG-Molekül chelatisiert. Mit der Annäherung eines Substrates kann molekularer

Sauerstoff über Fe2+ gebunden werden. Es erfolgt eine Decarboxylierung des 2OG unter

Oxidation des Eisens zu einer reaktiven Fe(IV)-oxo-Spezies (vgl. auch49,50). Mit Abgabe des

Sauerstoffatoms auf die Methylgruppe des Substrates und der Bildung eines Halbaminals,

wird das Eisen wieder auf Stufe II reduziert. Im letzten Schritt wird durch Wassermoleküle

der Ausgangszustand der Komplexierung wiederhergestellt und das um eine Methylgruppe

verringerte Substrat unter Abgabe von Formaldehyd und dem Decarboxylierungsprodukt

des 2OG, Bernsteinsäure, freigegeben.


Einleitung | 9

Abb. 5: Katalytischer Mechanismus der JmjC-Domäne enthaltenden Histon-Demethylasen (Erklärungen siehe Text).

Die JmjC-Domäne enthaltenden Enzyme werden der Cupin-Superfamilie der

Dioxygenasen zugeordnet51. Eine Übersicht über den verschiedenen Aufbau von Vertretern

dieser Klasse wurde bereits weiter oben gegeben (Tab. 1). Neben der JmjC-Domäne

besitzen alle Enzyme der KDM4-Reihe, wie auch die Vertreter der KDM5-Reihe, die für die

strukturelle Integrität wichtige N-terminale Jumonji-Domäne (JmjN). Zusätzlich können

Plant-Homöo- und Tudor-Domänen vorhanden sein, welche für die Bindung von

methylierten Lysinresten und damit für die Substratselektivität zuständig sind33. KDM4D

und E fehlen diese beiden Domänen, sie sind daher bedeutend kürzer als KDM4A, B und C.

Mittlerweile konnten einige röntgenkristallographische Untersuchungen von verschiedenen

KDM4-Enzymen mit und ohne 2OG oder mit Inhibitoren vorgenommen und Strukturdaten

generiert werden (u. a.52-54). Häufig wird wegen der Praktikabilität nicht unter Luftausschluss

gearbeitet und deshalb aus Stabilitätsgründen bei der Kristallisation Ni2+- anstelle von Fe2+-

Kationen eingesetzt, da diese nicht von Luftsauerstoff oxidiert werden. Im eigentlichen

Zentrum der KDM4-Enzymreihe befinden sich die Motive der JmjN- und JmjC-Domäne,


10 | Einleitung

eine β-Haarnadel und ein kurzes C-terminales Ende. Letzteres formt mit zwei Cysteinresten

der JmjC-Domäne ein Zinkfinger-Motiv, es ist also neben dem Fe2+- auch ein Zn2+-Ion

vorhanden53 (Abb. 6, PDB: 2GP5).

Abb. 6: Katalytisches Zentrum der humanen KDM4A (PDB: 2GP5): Cofaktor 2OG (rot) komplexiert das zentrale Fe2+-Ion.

Für den weiteren Verlauf dieser Arbeit sind die Enzyme KDM4A und KDM4D von speziellem

Interesse, weshalb der genaue Aufbau der katalytischen Zentren an dieser Stelle verglichen

werden soll. Wie bereits erwähnt, fehlen KDM4D (UniProt: Q6B0I6) die beiden PHD- und

Tudor-Domänen, weshalb dieses Protein mit insgesamt 523 Aminosäuren deutlich kürzer

ausfällt als KDM4A (UniProt: O75164) mit 1064 Aminosäuren. Da KDM4A in dem

verwendeten biologischen Assay nicht in nativer Form zum Einsatz kam, sondern ein

katalytisch aktives, auf die Aminosäuren 1-359 gekürztes Fragment eingesetzt wurde, kann

dieses gut mit KDM4D verglichen werden (Abb. 7). Es wird deutlich, dass die drei zur

Komplexierung des Fe2+-Ions notwendigen Aminosäuren in beiden Strukturen identisch

sind. Ferner decken sich die Bestandteile, welche für relevante Interaktionen wichtig und

im weiteren Verlauf dieser Arbeit von Bedeutung sind. Lediglich das Aminosäurepaar

Histidin/Asparagin 90 unterscheidet sich dabei. Das heißt, dass Ergebnisse, welche mit

einem der beiden Enzyme erhalten werden, prinzipiell auch auf das andere übertragbar

sein sollten.


Einleitung | 11

Physiologisch werden KDM4A, B und C weitreichend in humanen Geweben, wie

beispielsweise in der Milz, in Ovarien oder im Darm, exprimiert. Hingegen findet sich eine

ausgeprägte Expression von KDM4D und E vor allen im Hoden wieder, wobei die Funktion

dort nach wie vor noch nicht genauer geklärt ist33. In Experimenten mit Knockout-Mäusen

konnte durch Eingriff in die Regulation von KDM4A entdeckt werden, dass die Bildung von

hypertrophem Herzmuskelgewebe beeinflussbar war55. Durch einen Knockout von KDM4A

in Brusttumorzelllinien konnte deren Proliferationsbereitschaft gestoppt werden56. Ähnliche

Beobachtungen wurden auch mit Colontumorzelllinien gemacht57. Des Weiteren spielen die

Vertreter der KDM4-Enzymreihe bei der Entwicklung von embryonalen Stammzellen eine

wichtige Rolle58.

Auf Grundlage der bisherigen Befunde scheint die Klasse der KDM4-Enzyme ein attraktives

Ziel für aktuelle Forschungen darzustellen. Trotz der mittlerweile mehr als eine Dekade

zurückliegenden Erstbeschreibung sind bisher noch keine regulierend eingreifenden

Moleküle über den experimentellen Status hinaus gelangt. Bei der LSD1 hingegen konnten

1 10 20 30 40 50 60 70

---MASES-E TLNPSARIMT FYPTMEEFRN FSRYIAYIES QGAHRAGLAK VVPPKEWKPR ASYDDIDDLV

METMKSKANC AQNPNCNIMI FHPTKEEFND FDKYIAYMES QGAHRAGLAK IIPPKEWKAR ETYDNISEIL

# # ## ## # ## ### # #### ## ########## ###### # ## #

71 80 90 100 110 120 130 140

IPAPIQQLVT GQSGLFTQYN IQKKAMTVRE FRKIANSDKY CTPRYSEFEE LERKYWKNLT FNPPIYGADV

IATPLQQVAS GRAGVFTQYH KKKKAMTVGE YRHLANSKKY QTPPHQNFED LERKYWKNRI YNSPIYGADI

# # ## # # #### ###### # # ### ## ## ## ######## # ######

141 150 160 170 180 190 200 210

NGTLYEKHVD EWNIGRLRTI LDLVEKESGI TIEGVNTPYL YFGMWKTSFA WHTEDMDLYS INYLHFGEPK

SGSLFDENTK QWNLGHLGTI QDLLEKECGV VIEGVNTPYL YFGMWKTTFA WHTEDMDLYS INYLHLGEPK

# # ## # # ## ## ### # ######### ####### ## ########## ##### ####

211 220 230 240 250 260 270 280

SWYSVPPEHG KRLERLAKGF FPGSAQSCEA FLRHKMTLIS PLMLKKYGIP FDKVTQEAGE FMITFPYGYH

TWYVVPPEHG QRLERLAREL FPGSSRGCGA FLRHKVALIS PTVLKENGIP FNRITQEAGE FMVTFPYGYH

## ###### ###### #### # # ##### ### # ## ### # ###### ## #######

281 290 300 310 320 330 340 350

AGFNHGFNCA ESTNFATRRW IEYGKQAVLC SCRKDMVKIS MDVFVRKFQP ERYKLWKAGK DNTVIDHTLP

AGFNHGFNCA EAINFATPRW IDYGKMASQC SCGEARVTFS MDAFVRILQP ERYDLWKRGQ DRAVVDHMEP

########## # #### ## # ### # # ## # # ## ### ## ### ### # # # ## #

Abb. 7: Vergleich der Aminosäuresequenzen von KDM4A und KDM4D: erste Reihe: Position; zweite Reihe: KDM4A; dritte Reihe: KDM4D; vierte Reihe: bei Übereinstimmung Markierung mit #, usw. Die grün hervorgehobenen Aminosäuren werden zum Komplexieren des Fe2+-Ions benötigt, die rot markierten Stellen repräsentieren relevante Wechselwirkungspartner für die in dieser Arbeit synthetisierten Inhibitoren. Die Zählweise der jeweiligen Positionen der Aminosäuren ist an KDM4D angepasst.


12 | Einleitung

bereits erste klinische Studien mit Inhibitoren durchgeführt werden. Das nächste Kapitel soll

eine Übersicht über die aktuelle Entwicklung von KDM- und LSD-Inhibitoren geben.

1.1.2 Literaturübersicht über bisher publizierte Histon-Demethylase-Inhibitoren

Die Aktualität des hier behandelten Themas wird auch dadurch unterstrichen, dass in den

letzten Jahren zahlreiche Übersichtsarbeiten publiziert worden sind. So lassen sich

allgemeine59,60, spezifische61 und drei hochaktuelle Arbeiten, welche im Jahr 2018

erschienen sind62-64, finden.

1.1.2.1 Inhibitoren der Lysin-spezifischen Histon-Demethylase

Da nach der Entdeckung und Aufklärung von LSD1 relativ schnell klar wurde, dass eine

Homologie zur MAO-A und -B bestand, war es nur folgerichtig, bekannte MAO-Inhibitoren

auch auf ihre biologische Aktivität gegen LSD1/2 zu testen. Der irreversible MAO-Hemmer

Tranylcypromin (E5) zeigte in einem orientierenden Versuch einen IC50-Wert von 2 µM und

diente damit als Leitstruktur für weitere Derivatisierungen65 (Abb. 8). Ein durch nucleophilen

Angriff an den Cyclopropylrest erhaltenes FAD-Addukt sorgte bei LSD1/2 ebenfalls für

einen irreversiblen Bindungsmodus. Da E5 bereits ein zugelassener und somit gut

untersuchter Arzneistoff war, konnten mehrere klinische Studien zur Behandlung von akuter

myeloischer Leukämie (AML) vergleichsweise schnell initiiert werden66,67. Auch die Derivate

GSK2879552 (E8) und ORY-1001 (E9) sind beziehungsweise waren ebenfalls Gegenstand

von Phase-I-Studien68,69. Damit stellen die Substanzen auf Tranylcypromin-Basis bisher die

am weitesten fortgeschrittenen Inhibitoren aller Histon-Lysin-Demethylasen in der Klinik

dar. Ferner wurden auch die MAO-Hemmer Phenelzin und Pargylin weiter modifiziert, um

beispielsweise die Potenz oder die Selektivität gegen LSD1 zu steigern. Mit Bizine (E10)

und dem Propargyl-Lysin-derivatisierten Peptid E11 (basierend auf einer modifizierten

H3-Substratpeptidsequenz) wurden zwei Analoga veröffentlicht70,71. Beide Inhibitoren

weisen ebenfalls irreversibles Bindungsverhalten auf, da der „Warhead“ (ein Hydrazin- oder

Propargyl-Rest) eine kovalente Bindung mit dem Enzym ausbildet.


Einleitung | 13

Abb. 8: Auswahl einiger auf Tranylcypromin, Phenelzin oder Pargylin basierender LSD-Inhibitoren.

Gleichermaßen wurden reversible Inhibitoren der LSD1/2 synthetisiert und publiziert, wobei

die Heterogenität der Substanzen höher ist als bei den irreversiblen Inhibitoren (Abb. 9). So

wies das relativ große und unselektive (Bis)thioharnstoff-Derivat E14 einen IC50-Wert von

4,8 µM gegen LSD1 auf. Das mit einem Benzoesäurehydrazid ausgestatte Molekül E12 war

mit einem IC50-Wert von 0,013 µM deutlich potenter72 und konnte in einer Folgearbeit durch

Modifikationen noch verbessert werden73. Substanz E13 mit 3-(Piperidin-4-yl-

methoxy)pyridin-Struktur besaß wiederum völlig andere Bindungsmotive, konnte die LSD1

aber mit einem IC50-Wert von 0,029 µM potent und reversibel hemmen74.

Abb. 9: Auswahl von reversiblen LSD1-Inhibitoren.

Cl

OH

NNH

O

SN

O

O

O

E12

IC50 = 0,013 µM

N

N

O

E13

IC50 = 0,029 µM

HN

HN

S

HN

HN

HN

S

HN

E14

IC50 = 4,8 µM

NH


14 | Einleitung

1.1.2.2 Inhibitoren der JumonjiC-Domäne enthaltenden Histon-Demethylasen

Mittlerweile ist die Anzahl an Inhibitoren der Fe(II)- und 2OG-abhängigen KDMs nicht nur

durch Originalarbeiten, sondern vor allem durch Patentliteratur merklich angestiegen.

Herausfordernd bei der Entwicklung ist zum einen die Selektivität, da die Enzyme mit der

katalytisch wirksamen JmjC-Domäne einen sehr ähnlichen Aufbau besitzen. Zum anderen

kam oftmals hinzu, dass sehr polare oder amphotere Grundkörper als Leitstrukturen genutzt

wurden und deren schlecht zellmembrangängigen Eigenschaften nur mit Mühe beseitigt

werden konnten.

Der theoretische Ansatz für viele Inhibitoren war die physiologische Komplexierung von

Eisen durch 2OG. Durch Verdrängung dieses Cofaktors durch ein ebenfalls Metall-

chelatisierendes Molekül wird die Bindung von 2OG unterbunden, weshalb für die

Demethylierung dann weniger 2OG zur Verfügung steht. Da dieser Vorgang prinzipiell bei

allen Vertretern der Enzymklasse möglich ist, wird diese Gruppe (zumindest die nicht weiter

derivatisierten Vertreter) zu den pan-Inhibitoren gezählt (Abb. 10).

Abb. 10: Auswahl an pan-Inhibitoren der JmjC-Domäne enthaltenden KDMs.

Einen der ersten Inhibitoren stellte N-Oxalylglycin (NOG), das Aza-Analogon von 2OG, dar.

Neben der mangelnden Selektivität innerhalb der KDM-Enzymreihe, wurden auch andere

2OG-abhängige Proteine wie die humane HIF Prolyl-Hydroxylase PHD2 oder die

Asparaginyl-Hydroxylase FIH gehemmt54. In derselben Publikation wurden ebenfalls

Pyridin-2,4-dicarbonsäure (2,4-PDCA) und das Bipyridin E15 vorgestellt. Für 2,4-PDCA

konnte sogar eine Röntgenkristallstruktur gelöst werden, welche zeigte, dass das zentrale

Fe2+-Ion von dem Pyridinstickstoffatom und der Carboxygruppe in Position 2 chelatisiert

wurde. E15 komplexierte das katalytische Metall über seine beiden Pyridinstickstoffatome.

In einer Folgearbeit wurden dann verschiedene Monoamide von E15 hergestellt, wodurch

HO

O

O

OH

O

2-Oxoglutarat (2OG)

HO

O

NH

O

OH

O

N-Oxalylglycin (NOG)

IC50(KDM4E) = 24 µM

N

O

O

OH

OH

Pyridin-2,4-dicarbonsäure (2,4-PDCA)

IC50(KDM4A) = 0,7 µM

IC50(KDM4E) = 1,4 µM

N

O O

N

OH

O

E15


N

OH

O OH

N

N

HN

N

Cl

JIB-04, E17

IC50(KDM4A) = 0,445 µM

IC50(KDM4E) = 0,34 µM

IC50(KDM5A) = 0,23 µM

IOX1, E16




Einleitung | 15

eine Inhibition im nanomolaren Bereich erreicht werden konnte75. Ein weiterer unselektiver

Inhibitor und Chelator von Eisen, basierend auf dem Zusammenwirken einer

Hydroxyfunktion und einem Chinolinstickstoffatom, wurde als IOX1 (5-Carboxy-8-

hydroxychinolin, E16) veröffentlicht. Die IC50-Werte lagen hierbei im einstelligen

mikromolaren Bereich76. Auch dieses Molekül sollte später, wie fast alle der hier genannten,

als Ausgangsstruktur für weitere Modifikationen genutzt werden. Das Pyridin-Hydrazon-

enthaltende Molekül JIB-04 (E17) kann ebenfalls zu den pan-Inhibitoren gezählt werden.

Die IC50-Werte lagen im submikromolaren Bereich77, erreicht wahrscheinlich durch die

Komplexierung des Eisens durch jeweils ein Stickstoffatom vom Pyridinring und

Hydrazonelement.

Als Weiterentwicklungen mit 8-Hydroxychinolin-Grundkörper (8HQ) wurden unter anderem

die nano/mikromolaren Inhibitoren E18 und E19 publiziert. Durch Derivatisierungen mit

lipophilen Resten an Position 6 oder 7 konnten Selektivität und Potenz gesteigert

werden78,79.

Abb. 11: Leitstrukturanaloga mit 4-Hydroxychinolin und 2,4-PDCA-Grundstuktur (Auswahl).

Die wohl am häufigsten aufgegriffene Struktur stellte die Isonicotinsäure dar. Zwei Beispiele

für direkte Arylverknüpfungen waren die Substanzen E20 und E21 (Abb. 11). Die

Derivatisierung fand jeweils an Position 2 des Pyridinrings statt und resultierte in

N

OH

HN

O

N

OH

Cl

SO

E18

IC50(KDM4B) = 0,01 µM

E19

IC50(KDM4C/E) = 5 µM

N

O OH

HN

O

N

O OH

N

NHN

O

N

O OH

HN

HOO

OH

E22

IC50(KDM4A-E) < 0,1 µM

IC50(KDM5C) = 0,1 µM

E20

IC50(KDM4A) = 0,37 µM

E21

IC50(KDM4C) = 12 µM

N

N

HNO O

N

N

E23

IC50(KDM4C) = 0,5 µM

IC50(KDM5C) = 0,06 µM


16 | Einleitung

unterschiedlichen Komplexierungsmustern des Fe2+-Ions. E20 konnte ein zusätzliches

Stickstoffatom des Pyrimidinrings dafür nutzen80, während bei E21 eine phenolische

Gruppe verwendet wurde81. Auch hier lagen die IC50-Werte im nanomolaren Bereich. Eine

Kopplung an Position 3 der Isonicotinsäure mit einem Amin führte gleichermaßen zu einem

potenten Inhibitor (E22) mit nanomolaren IC50-Werten82. Die zwei Stickstoffatome waren

hierbei räumlich nicht mehr in der Lage, eine Komplexierung des Eisens vorzunehmen.

Kristallstrukturanalysen zeigten, dass offenbar eine alleinige Koordinierung des

Pyridinstickstoffatoms ausreichte, um eine potente Inhibition zu garantieren. Der gleichen

Arbeitsgruppe um Westaway gelang es im Anschluss, die für die Zellpermeation hinderliche

Säure-Base-Amphoterie zu unterdrücken, indem sie die Carbonsäure in einen Heterozyklus

(E23) überführten83. Damit wurde gleichzeitig auch klar, dass eine saure Gruppe in

Position 4 des Pyridins nicht unverzichtbar ist.

Daminozid (E23), ein Pflanzenwachstumsregulator, zeigte eine verhältnismäßig hohe

Selektivität und hemmte insbesondere KDM2A und 7A84. Die Struktur ähnelt dem 2OG,

anstatt der Carbonsäurefunktion ist ein dimethyliertes Hydrazid vorhanden. Darauf

aufbauend, konnten Rüger et al. durch einen bioisosteren Austausch der zweiten

Carboxyfunktion mit einem Tetrazol fragmentartige Leitstrukturen entwickeln. E25 zeigte

die stärkste inhibitorische Wirkung gegen KDM4A auf, war gleichzeitig aber deutlich

schwächer wirksam gegen KDM5A und 6B und konnte daher im gewissem Maße als

tendenziell selektiv bezeichnet werden85.

Abb. 12: 2-Oxoglutaratmimetika mit bioisosterem Austausch als Grundlage.

Dem Prinzip der Chelatisierung ließ sich nicht nur mit Pyridinen, Hydraziden und Phenolen

nachgehen, sondern auch mit den von HDAC-Inhibitoren häufig verwendeten

Hydroxamsäuren. E26 war ein Beispiel dafür, dass mit so einem Strukturelement JmjC-

Domäne enthaltende Enzyme ebenfalls gehemmt werden konnten. Als Grundlage diente

wieder 2OG, welches über Seitenketten verschiedener Länge derivatisiert wurde86 (Abb.

13).

Weniger homogen ging es bei der Entdeckung von Motiven natürlichen Ursprungs zu.

Nachdem diskutiert wurde, ob Curcuminioide als Inhibitoren von Histon-Demethylasen

verwendet werden könnten87, ergab ein virtuelles Screening mit anschließender Testung

eines Nitro-Curcumin-Derivats (E27), dass auch diese Substanz inhibitorische

Eigenschaften gegen die KDM4-Enzymreihe aufweist88. Das in zahlreichen Pflanzen als


Einleitung | 17

Sekundärmetabolit vorkommende Epigallocatechingallat (EGCG, nicht gezeigt) konnte in

biologischen Testungen ebenfalls inhibitorische Eigenschaften (IC50(KDM4E) = 3 µM)

aufzeigen89. Kritisch muss dazu jedoch angemerkt werden, dass beide Stoffklassen

Merkmale von Pan-Assay Interference Compounds (PAINS) in sich tragen (u. a.

Polyphenole und Michael-Systeme).

E28 führte ein neues Strukturmotiv ein: Ein mit einem Styrenrest modifiziertes Pyridinium

konnte trotz fehlender Komplexierung potente Inhibitionen gegen KDM2A und 4A ergeben

und könnte daher noch interessant für zukünftige Untersuchungen werden90. Der Habitus

eines Iridium(III)-Komplexes (E29) unterschied sich von den bisher vorgestellten Inhibitoren

grundsätzlich, daher war es überraschend, dass auch E29 inhibitorische Aktivität

gegenüber verschiedenen Histon-Demethylasen zeigte. Der Wirkungsmechanismus

konnte jedoch noch nicht geklärt werden, ein Austausch des Fe(II) gegen Ir(III) sollte aber

nicht der Grund für dessen biologische Aktivität sein91. Einen nicht Eisen-involvierenden

Mechanismus besaß das in der Alkoholabusus-Therapie eingesetzte Disulfiram (E30). Hier

wurde das Entfernen des Zinkkations aus dem Zinkfinger-Motiv der KDM4 als

Mechanismus postuliert92. Die damit erreichte Inhibition im mikromolaren Bereich ist

beachtlich, wie jedoch die Selektivität gegen andere Zinkfinger-enthaltenden Proteine

aussieht, ist fraglich. Auch zyklische Peptide (nicht gezeigt) konnten bereits mit einer

Hemmung von KDM4 (IC50 = 0,6 µM) in Verbindung gebracht werden93.

Abb. 13: Auswahl an strukturell heterogenen KDM-Inhibitoren.

Die bisher vorgestellten Inhibitoren entstammen der wissenschaftlichen Fachliteratur. Da

aber vor allem in der Patentliteratur in verhältnismäßig kurzer Zeit zahlreiche Modulatoren

NN OH

O

OH

O

E26, n = 8


IC50(KDM4C) = 1,0 µM Ir

N

N

N

N

O

O

O2N NO2

Cl

Cl

Cl

Cl

N

S

SS

S

N

F

N+

N

I-

E27


IC50(KDM4B) = 9,3 µM

E28

IC50(KDM4A) = 2,58 µM

E29

IC50(KDM4D) = 15 µM

Disulfiram, E30


n

+ PF6-


18 | Einleitung

von JmjC-Domäne enthaltenden Enzymen vorgestellt wurden, sollen auch diese kurz

präsentiert werden (Abb. 14). Es wurden zwei Übersichtsarbeiten dazu ausgewertet, eine

aus dem Jahr 201394 und eine etwas aktuellere von 201595.

Schofield et al. publizierten ihre zahlreichen Inhibitoren nicht nur in der Fachliteratur,

sondern patentierten auch viele Derivate. So wurde unter anderem der Grundkörper der

2,4-PDCA wieder aufgenommen und mit verschiedenen Aminen in Position 3 modifiziert.

In der Regel erreichten diese Inhibitoren IC50-Werte im dreistelligen nanomolaren Bereich

(E31)96. Labellé et al. von der Firma Epitherapeutics nahmen sich der Struktur der

Isonicotinsäure an und alternierten sie an Position 2 mit einer Methylenbrücke und

verschiedenen Aminen97,98. E32 stellte ein hochpotentes Molekül dar, welches gegen

nahezu alle JmjC-Domäne enthaltenden Enzyme inhibitorisch aktiv war (u. a. KDM2B,

KDM4A/B/C, KDM5A). Die Veresterung der Carboxyfunktion führte in der Regel zu einem

Abfall der Potenz, durch die Seitenketten konnten Selektivitäten gegenüber verschiedenen

Enzym-Klassen erreicht werden.

Abb. 14: Auswahl an Inhibitoren von JmjC-Domäne enthaltenden Enzymen aus der Patentliteratur.

Quanticel Pharmaceuticals war das zweite größere Pharmaunternehmen, welches

reihenweise Derivate von Isonicotinsäure patentierte. Diese trugen in Position 2 einen

Pyrazol- bzw. Imidazolrest, welcher mannigfaltig substituiert wurde99. Auch diese Reihe von

Inhibitoren war hochpotent, wobei sich unter ihnen wenige Tetrazol-Derivate mit geringerer,

aber immer noch beachtlicher Aktivität befanden (E33). Die im Pharmabereich gängigen

Übernahmen betrafen dann wenig später die beiden genannten Unternehmen, so wurde

Quanticel Pharmaceuticals von Celgene und Epitherapeutics von Gilead Sciences für

Millionenbeträge übernommen100,101. Celgene und Gilead beabsichtigten dadurch ihr

Portfolio und Knowhow im Bereich epigenetische Regulationsmechanismen-


Einleitung | 19

beeinflussender Wirkstoffe zu erweitern und unterstrichen damit zusätzlich, welches

Potential den Inhibitoren der Histon-Demethylasen zugeschrieben wurde.

Eine Variation der bisher genannten Moleküle stellten die Pyrido[3,4-d]pyrimidine dar (E34).

Die IC50-Werte befanden sich hier ebenfalls im nanomolaren Bereich. Durch die nicht mehr

vorhandene Amphoterie konnte Zellgängigkeit erwirkt werden, was durch Angabe von

zellulären IC50-Werten ausgedrückt wurde102. Ferner fand eine massenhafte Patentierung

von an Position 3 derivatisierten Isonicotinsäuren von Chen et al. im Namen der nun

vereinigten Firma Celgene Quanticel Research statt103 (E35). Viele dieser Inhibitoren

zeigten wiederum nanomolare IC50-Werte. Zwar war auch eine Synthesevorschrift für

Tetrazolderivate vorhanden, Ergebnisse aus biologischen Testungen fehlten jedoch. Hier

bieten sich Anhaltspunkte für mögliche Ziele dieser Arbeit, inwiefern Tetrazolderivate von

Isonicotinsäuren auf der Suche nach neuen, innovativen Inhibitoren der KDM4-Enzymreihe

nutzbar sein können.

1.1.3 Konzept der Bioisosterie

Ein häufig genutztes Tool in der Entwicklung und im Design von neuartigen Arzneistoffen

ist die Verwendung von bioisosteren funktionellen Gruppen. Darunter wird häufig

verstanden, dass zwei ähnliche Moleküle eine vergleichbare biologische Wirkung entfalten,

wenn sie jeweils mit einer unterschiedlichen Gruppe analoger räumliche Ausdehnung und

zumeist auch ähnlicher chemischer und physikalischer Eigenschaften verknüpft sind.

Dieses Konzept wird unter vielen Gesichtspunkten eingesetzt, so können Moleküle mit

einem bioisosteren Austausch in Hinsicht auf ihr pharmakologisches Profil verändert und

Einfluss auf physikochemische Eigenschaften wie Acidität/Basizität, Lipophilie,

metabolische Stabilität und nicht zuletzt auch auf den Bindungsmodus am Zielprotein

genommen werden.

Abb. 15: Beispiele für bioiosteren Ersatz von Carbonsäuren (modifiziert nach104,105).


20 | Einleitung

Bei der Leitstruktur 2,4-PDCA bot es sich auf Grund der ausgeprägten Hydrophilie an, die

Carboxygruppe an Position 4 des Pyridinrings zu ersetzen. Für Carboxygruppen sind

etliche funktionelle Gruppen publiziert worden, mit denen vergleichbare Eigenschaften

erzeugt werden konnten104,106,107 (Abb. 15). Neben den bekannteren Vertretern wie

beispielsweise Sulfonamide (u. a. in Sulfamethoxazol, Sulfasalazin, Dorzolamid,

Hydrochlorothiazid, etc.), Acylsulfonamide (u. a. in Paritaprevir, Denoprevir),

Sulfonylharnstoffe (u. a. in Glimepirid) und Oxazolidindione (u. a. in Ethadion,

Paramethadion) wurden auch nicht mehr acide Oxetane oder Thietane beziehungsweise

deren Derivate als Substitutionsmöglichkeit vorgestellt105.

Im Arbeitskreis Link konnten bereits zahlreiche Erfahrungen mit der Synthese und den

biologischen Aktivitäten von Tetrazolen gesammelt werden. Die cyclischen Systeme mit

vier Stickstoffatomen besitzen einige Vorteile gegenüber Carbonsäuren. So verfügen sie

bei gesteigerter Lipophilie über eine etwas geringere Acidität, was zumindest theoretisch

zu einer besseren Membranpermeabilität führen könnte107. Daneben spielen metabolische

Parameter eine Rolle, denn Carbonsäuren können über zahlreiche Wege im Organismus

im Rahmen von Phase-II-Reaktionen erst mit Coenzym-A aktiviert und dann zum Beispiel

mit Glycin konjugiert werden. Weiterhin bestehen die Möglichkeiten der Decarboxylierung

und der β-Oxidation108. Tetrazole gehen hauptsächlich N1- oder N2-Glucuronidierungen

(letzteres bevorzugt) ein109, welche durch das Enzym UDP-Glucuronosyltransferase

katalysiert werden, und sind daher als metabolisch stabiler anzusehen.

Ein weiterer Unterschied zwischen den beiden sauren Gruppen liegt in der effektiven

Länge. Bei röntgenkristallographischen Untersuchungen von Propellan-haltigen

Glutaminsäureanaloga (E37/E38) konnte gezeigt werden, dass Tetrazole etwas

raumeinnehmender waren110 (Abb. 16).

Abb. 16: Pharmazeutisch chemische Entwicklungsstufen von Losartan und Glutaminanaloga als Vermessungsstruktur für Tetrazole (1 am Angiotensin-II-Rezeptor-Subtyp-1).

Ferner existieren rechnerische Modelle für elektrostatische Umgebungspotentiale, welche

vor allem offenbarten, dass die im deprotonierten Zustand generierte Aromatizität für eine

gleichmäßigere Ladungsverteilung sorgte111. Dieser Punkt war letztendlich auch der Grund

für die Erfolgsgeschichte der Entwicklung des Biaryltetrazols und AT1-


Einleitung | 21

Rezeptorantagonisten Losartan: Im deprotonierten Zustand besaß das Tetrazol gegenüber

der Carbonsäure eine größere Fähigkeit der Ladungsverteilung, die dann zu einer besseren

Wechselwirkung mit positiven Ladungen in der Bindetasche führten112. Daher zeigte das

Tetrazolderivat Losartan eine etwa zehnfach höhere inhibitorische Potenz als das

ursprüngliche Carbonsäure-haltige Molekül E35.

Auf Grund der zahlreichen Heteroatome besitzen Tetrazole mehr

Wasserstoffbrückenakzeptoren und zahlreiche Koordinierungsmöglichkeiten vor allem als

Tetrazolatanion. Im aromatischen Zustand sind zusätzlich noch π-π-Interaktionen mit

arylischen Aminosäuren möglich und können zu „π-π-Sandwich“-Komplexen führen113. Da

Tetrazole nach wie vor zu den unterrepräsentierten Motiven im Arzneistoffdesign gezählt

werden114, ist die Erstellung von Bibliotheken mit diesen Heterozyklen besonders reizvoll.

Eine gesonderte Formulierung der Zielstellung findet an dieser Stelle nicht statt, es wird

daher auf die Eingangsbemerkung bei den jeweiligen Synthesekapiteln verwiesen.


22 | Untersuchungen, Ergebnisse und Diskussion

1.2 Untersuchungen, Ergebnisse und Diskussion

1.2.1 Synthese von Tetrazol- und Carbonsäurehydrazid-beinhaltenden KDM4-Inhibitoren

Die in Abschnitt 1.1.2.2 beschriebenen, fragmentartigen KDM4-Inhibitoren mit

carbonsäuremimetischem Tetrazol- und chelatisierendem Carbonsäurehydrazid-Anteil

stellten wegen der zwar nur moderaten, im Verhältnis zur Molekülmasse aber beachtlichen

biologischen Aktivität, geeignete Leitstrukturen für weitere Untersuchungen dar85,113.

Aufgrund der flachen Struktur-Aktivitätsbeziehungen bei bisher von Rüger et al.

dargestellten Derivaten, die es nicht ermöglicht hatten, eng verwandte Analoga mit

gesteigerter Aktivität zu erhalten, wurde eine Erhöhung der Diversität im verbindenden

Molekülteil angestrebt. Erhaltene Verbindungen mit Variation der Kettenlänge des

aliphatischen Molekülrückgrats führten zunächst zu Hinweisen, die eine kürzere

Kettenlänge als im Substrat 2OG als optimal suggerierten. Spätere Re-Evaluation erwies

diesen Befund als vorläufig und eine um eine Methylengruppe längere Rückgratstruktur

lieferte bessere Hemmstoffe der KDM4A. Da eine weitere Verlängerung oder Kürzung

dieser 2-Oxoglutarsäureanaloga sich als ungünstig erwiesen hatte, wurde Anstelle des

flexiblen aliphatischen Linkers ein aromatischer Ring als Rückgrat ausgewählt, um weitere

Testsubstanzen bereitzustellen. Hierfür sollte ein Syntheseweg basierend auf

Anthranilsäure im Rahmen der vorliegenden Arbeit neu etabliert werden.

1.2.1.1 Anthranilsäurederivate

Die Zielstruktur der neuen Syntheseroute stellte 5-(1H-Tetrazol-5-yl)anthranilsäurehydrazid

(IX) dar (Abb. 17). Die Aminogruppe der Anthranilsäure verfügt theoretisch über zwei

Neuerungen gegenüber unsubstituierten (1H-Tetrazol-5-yl)benzoesäurehydraziden: Das

freie Elektronenpaar am Stickstoffatom könnte ebenfalls dafür genutzt werden, um an das

katalytisch wirkende Metallion zu koordinieren. Zusammen mit dem Carbonsäurehydrazid

wäre somit ein dreizähniger Chelator möglich. Außerdem sind Aminogruppen wertvolle

Bestandteile einer divergenten Synthesestrategie, d. h. dass erst im letzten oder vorletzten

Schritt der Syntheseroute eine Verzweigung stattfindet und somit der Weg zur zügigen

Erstellung einer Substanzbibliothek geebnet ist. Weiterhin war der Ausgangsstoff

Anthranilsäure preisgünstig kommerziell erhältlich. Die einzelnen Syntheseschritte werden

nachfolgend ausgeführt und erörtert (Abb. 17).

Der wohl wichtigste Schritt der geplanten Synthese war die Einführung einer Cyanogruppe

an Position 5 des aromatischen Systems. Aliphatische Nitrile sind häufig relativ einfach über

eine Kolbe-Nitril-Synthese zugänglich, aromatische Nitrile können unter anderem durch

eine Sandmeyer-Reaktion oder nucleophile aromatische Substitution (SNAr) dargestellt


Untersuchungen, Ergebnisse und Diskussion | 23

werden. Erstere würde sich schwierig gestalten, da dann zwei Aminofunktionen vorhanden

sein müssten und eine selektive Diazotierung nur einer Aminogruppe hohen

experimentellen Aufwand erfordern würde. Für Reaktionen vom Typ der SNAr sollten

Aromaten deaktiviert, also mit stark elektronenziehenden Gruppen substituiert, sein, was

bei der Anthranilsäure nicht zutrifft. Durch die Rosenmund-von-Braun-Reaktion sollte es

allerdings möglich werden, ein Arylbromid in ein Arylnitril zu überführen. Basierend auf

Annahme, dass ein Bromatom relativ einfach an Position 5 der Anthranilsäure einzuführen

war, wurde daher dieser Weg eingeschlagen.

Abb. 17: Geplante Syntheseroute zur Darstellung von 5-(1H-Tetrazol-5-yl)anthranilsäurehydrazid (IX): i) Acetanhydrid, Rückfluss, 60 min; ii) Br2, H2O, Raumtemperatur, 18 h; iii) NaOH, H2O, Rückfluss, 4 h; iv) CuCN, NMP, Rückfluss, 2 h; v) MeOH, SOCl2, Rückfluss, 15 h; vi) NaN3, TEA∙HCl, Toluen, 105 °C, 24 h; vii) EtOH, N2H4∙H2O, Rückfluss, 8 h.

Die direkte Bromierung von Anthranilsäure konnte aufgrund der Substituenteneinflüsse zu

zwei an den Positionen 3 beziehungsweise 5 monobromierten Produkten oder auch zu

einer dibromierten Anthranilsäure führen115. Um dies zu vermeiden, wäre eine Kühlung der

Reaktionslösung sinnvoll116,117. Sollten bereits mono- und disubstituierte Produkte

nebeneinander vorliegen, scheint eine Trennung mit Hilfe eines Auszugs mit kochendem

Wasser möglich118. Durch vorherige Acetylierung der Aminofunktion zum entsprechenden

Amid, konnte jedoch eine Regioselektivität für Position 5 erreicht werden119-121. Da dieser

Schritt zügig und quantitativ durch Umsetzung mit Acetanhydrid im Überschuss verlief,

wurde dieser Weg gewählt. Das acetylierte Intermediat II wurde anschließend mit

Bromwasser behandelt. Dabei zeigte eine bleibende Rotbraunfärbung das Ende der

NH2

OH

O NH

OH

O

O

NH

OH

O

O

Br

NH2

OH

O NH2

O

O

Br

NH2

O

O

N

NH2

O

O

N

N N

NHNH2

NH

NH2

NN

NNH

O

i ii

iii

iv v

iv

vivii

N

I II III

IVV VI

VIIVIIIIX

NH2

OH

O

Br



Notwendigkeit der Bromzugabe an. Nach weiterem Rühren und Abdampfen des

überschüssigen Broms im Laborabzug, konnte ein leicht rosafarbener Feststoff abfiltriert

werden. Dieser enthielt wie angenommen ausschließlich das an Position 5 monobromierte

Produkt III. Da die Aminofunktion als erstes ohne Derivatisierung auf Interaktionen mit

KDM4-Enzymen untersucht werden sollte, musste die Acetylgruppe jedoch wieder entfernt

werden. Dies geschah im Sinne einer klassischen Amidspaltung mit einem Überschuss an

Natriumhydroxid in wässriger Lösung unter Rückfluss122.

Es lag nahe, die erhaltene 5-Bromanthranilsäure (IV) direkt zum entsprechenden Nitril

umzusetzen. In der Patentliteratur wurde das Zielmolekül aus eben diesem Edukt mit Hilfe

von Kupfer(I)-cyanid und dem hochsiedenden polaren Lösungsmittel N-Methyl-2-pyrrolidon

(NMP) erhalten123. Diese Bedingungen entsprachen der klassischen Rosenmund-von-

Braun-Reaktion. Der allgemeine Mechanismus ist dabei noch nicht abschließend geklärt.

Es werden eine Bildung von Cu(III)-Spezies und ein Additions-Eliminations-Mechanismus

diskutiert. Die Reaktionskinetik wurde bereits genauer untersucht124. Hohe Temperaturen

sind notwendig für das Gelingen der Synthese, obgleich dadurch ein erhöhtes Maß an

Nebenreaktionen in Kauf genommen werden muss. Lösungsmittelfreie Varianten der

Synthese, welche mit einem Zusammenschmelzen der Edukte arbeiteten, wurden ebenso

beschrieben wie Abwandlungen mit ionischen Flüssigkeiten als Reaktionsmedium125,126.

Die Umsetzung von temperaturempfindlichen Stoffen ist mit dieser Methode limitiert,

weshalb verschiedene Cyanidquellen, Katalysatoren und Liganden untersucht worden sind.

Kaliumhexacyanidoferrat(II) als CN–-Donor hatte den großen Vorteil, dass die Toxizität im

Gegensatz zu Natrium-, Kalium- oder Kupfer(I)-cyanid minimal war. Zur erfolgreichen

Darstellung wurden aber in der Regel Katalysatoren auf Palladium-Basis benötigt127,128.

Spuren von CN– können jedoch durch die freie Carbonsäure protoniert werden, was zur

Bildung von HCN führt. Neben sicherheitsrelevanten Aspekten kann Cyanwasserstoff den

Palladium-Katalysator deaktivieren, da HCN eine besonders hohe Affinität zu Pd(0)-

Spezies aufweist129,130. Als weitere Cyanidquellen kamen Cyanhydrine zum Einsatz,

gegebenenfalls in Kombination mit Kaliumiodid, welches zu einem katalytischen

Halidaustausch führen sollte131. Zinkcyanid und Liganden auf Ethylendiamin-Basis konnten

ebenfalls dazu beitragen, dass die benötigten Reaktionstemperaturen abgesenkt werden

können132,133. Eine im Jahr 2014 erschienene Übersichtsarbeit fasst die zahlreichen

Möglichkeiten der vor allem Kupfer-katalysierten Cyanierungsreaktionen zusammen134.

Von den vorgestellten Möglichkeiten wurden unter anderem die klassische Rosenmund-

von-Braun-Reaktion, im Arbeitskreis auch auf Kaliumhexacyanidoferrat(II)-basierende

Methoden und die Ethylendiamin-gestützte Synthese ausprobiert. In keinem Falle konnte

die gewünschte 5-Cyananthranilsäure (V) erhalten werden. Da sehr wahrscheinlich die freie

Carboxygruppe den Grund für diese Fehlschläge darstellte, musste diese als Ester

geschützt werden, welcher zugleich für die Hydrazinolyse im finalen Schritt eine Aktivierung



der Carboxygruppe bewirkte. Für die Veresterung wurden zwei Wege untersucht: Die

klassische Fischer-Veresterung mit Methanol und Schwefelsäure als Katalysator und eine

Umsetzung mit Methanol und Thionylchlorid135,136. Die moderate Umsetzung von bis zu

65 % konnte mit sterischer Hinderung der Carbonsäure durch die Aminofunktion (bzw. das

entsprechende Ammoniumsalz mit Gegenion bei saurem Katalysator) begründet werden,

weshalb es in den Experimenten mit Hinblick auf die Ausbeuten auch keine Rolle spielte,

welche der beiden Veresterungsmöglichkeiten genutzt wurde. Der Thionylchlorid-Weg

besaß aber zusätzlich den Vorteil, dass etwas weniger harzige Rückstände entstanden.

Carbonsäure und Ester ließen sich zweckdienlich durch Flüssig-Flüssig-Extraktion mit

Ethylacetat und Natriumhydrogencarbonat-Lösung trennen.

Der so erhaltene 5-Bromanthranilsäuremethylester (VI) konnte dann einer Substitution mit

Cyanid unterzogen werden, wofür ebenfalls die Rosenmund-von-Braun-Reaktion genutzt

wurde137-139. Durch die hohen Temperaturen von über 200 °C kam es zu einer

Schwarzfärbung des Reaktionsansatzes, welche sich auch im weiteren

Aufarbeitungsverlauf als störend erwies. Neben dem eigentlichen Produkt entstanden

relativ große Mengen an Nebenprodukten, die weder in Wasser noch in Ethylacetat löslich

waren. Bei der DC-Verlaufskontrolle zeigten diese Stoffe keinerlei Elution mit

verschiedenen Laufmitteln und verblieben an der Startlinie. Das könnte darauf hinweisen,

dass es zu einer Polymerisation gekommen sein könnte, zumindest wäre es denkbar, dass

aus Ester und Amin eines zweiten Moleküls Polyamid-Strukturen entstanden sind. Diese

konnten zwar einfach durch Filtration aus dem Gemisch entfernt werden, sind aber

wahrscheinlich der Grund, warum die Ausbeuten weder sehr hoch, noch reproduzierbar

waren (19-54 %). Zusätzlich war die Massendifferenz von Bromid und Cyanid

verhältnismäßig hoch, sodass große Einwaagen an Edukt eingesetzt werden mussten, um

anschließend über genügend 5-Cyananthranilsäuremethylester (VII) für weitere Schritte zu

verfügen. Der Anfall von erheblichen Mengen an cyanidhaltigen Schwermetallabfällen war

ein weiterer Nachteil dieser Reaktion.

Auf die Diskussion des Tetrazolringschlusses soll in diesem Kapitel verzichtet werden, da

diese noch ausführlich im Abschnitt 1.2.2.1 durchgeführt wird. Lediglich auf die

Besonderheit, dass die im Arbeitskreis etablierte Methode mit Natriumazid,

Ammoniumchlorid und Dimethylformamid (vgl.85) für die hier gegeben Syntheseroute nicht

übertragbar war, soll an dieser Stelle hingewiesen werden. Diese führte zu einem

Hauptprodukt, dessen 1H-NMR-Spektrum nicht mehr das für einen Methylester typische

3H-Integral bei einer chemischen Verschiebung δ von etwa 3,8 ppm zeigte. Weil dazu noch

ein zusätzliches 1H-Integral bei etwa δ = 13,0 ppm vorhanden war und alle anderen Signale

denen des Edukts ähnelten, ist davon auszugehen, dass eine Esterhydrolyse eintrat. Bevor

die Gründe dafür gefunden wurden, konnte erfolgreich ein Tetrazolringschluss mit

Natriumazid, Triethylammoniumchlorid (TEA∙HCl) und Toluen etabliert werden140. Durch



das Einführen der sauren Tetrazolgruppe änderten sich jedoch auch die

physikochemischen Eigenschaften des Stoffes. So besaß 5-(1H-Tetrazol-5-

yl)anthranilsäuremethylester (VIII) einen zwitterionischen Charakter und ließ sich nicht

mehr ohne weiteres in Ethylacetat lösen. Dafür konnte die Protonierung zum Tetrazol

genutzt werden, um Tetrazolat-beinhaltende Stoffe aus einer basischen Lösung zu fällen,

ein Prozess, der im Laufe dieser Arbeit häufiger genutzt wurde.

Die Hydrazinolyse barg wie die Cyanierung Gefahren, welche hier durch ein mögliches

karzinogenes Potential des Hydrazins begründet war. Es galt daher, alle

arbeitssicherheitstechnischen Gegebenheiten zu beachten und die Belastung für das

Laborpersonal auf dem niedrigsten Level zu halten. In einer alkoholischen Hydrazinlösung

(Methanol oder Ethanol sind unter anderem möglich141,142) konnte der Methylester durch

längeres Erhitzen unter Rückfluss zu dem gewünschten 5-(1H-Tetrazol-5-

yl)anthranilsäurehydrazid (IX) umgesetzt werden. Die Ausbeute des Syntheseschrittes

(15 %) spiegelte jedoch nicht die vollständige Umsetzung wider, sondern war vielmehr ein

Ausdruck der anspruchsvollen Aufarbeitung des Rohproduktes. Durch eine weitere

basische Gruppe im Molekül wurde der amphotere Charakter gestärkt, wodurch auch die

Polarität anstieg. Es war damit nicht mehr ohne weiteres möglich, eine

säulenchromatographische Aufreinigung an unmodifiziertem Kieselgel durchzuführen, da

das Laufmittel hohe Anteile an Methanol benötigte. Es hat sich daher als zweckmäßig

erwiesen, das Endprodukt aus wässriger Methanol-Lösung umzukristallisieren und Verluste

in der Ausbeute dafür in Kauf zu nehmen. Es ist aber dennoch gelungen, den

siebenstufigen Syntheseentwurf umzusetzen und das gewünschte Molekül zu erhalten.

Mit Blick auf die mäßigen Ausbeuten und mangelnde Reproduzierbarkeit der Cyanierung

wurde versucht, diese mit Modifikationen der Syntheseroute zu verbessern. Ein Kellerfund

brachte 5-Iodanthranilsäure (X) hervor. Diese besaß zwar nur eine mäßige Reinheit

(schwarzer Feststoff statt farblose Prismen143), da das 1H-NMR-Spektrum aber eine

saubere Grundlinie zeigte, war wahrscheinlich lediglich überschüssiges Iod der Grund für

die Verfärbung. Es sollte untersucht werden, ob der Iodsubstituent besser gegen Cyanid

austauschbar war als ein Bromsubstituent. Der Ablauf ähnelte dem bisherigen Weg und

verlief über eine Veresterung und die Rosenmund-von-Braun-Reaktion (Abb. 18). Für die

Veresterung wurde diesmal die schwefelsäurekatalysierte Variante verwendet (modifiziert

nach Takalo et al.144), welche vergleichbare Ausbeuten wie bei 5-Bromanthranilsäure (IV)

aufwies. Die anschließende Cyanierung führte dann zu einer Ausbeute von 58 %, was

einen minimal besseren Wert darstellte als beim Bromderivat. Da die Bromierung eines

Aromaten aufgrund der höheren Reaktivität von Br2 in der Regel besser gelingt als die

Iodierung, war es aber fraglich, ob sich die minimal besseren Ausbeuten der Cyanierung

auch im Endergebnis niederschlagen würden.



Abb. 18: Cyanierung ausgehend von 5-Iodanthranilsäure (X): i) MeOH, H2SO4, Rückfluss, 24 h; ii) CuCN, NMP, Rückfluss, 2 h.

Aufgrund einer Anmerkung von Škoch et al.145, dass freie Amine bei einer

palladiumkatalysierten Cyanierung störende Einflüsse ausüben können, lag es nahe, dass

auch kupferkatalysierte Reaktionen davon negativ beeinflusst werden. Folgerichtig sollte

untersucht werden, ob die Rosenmund-von-Braun-Reaktion mit einer Acetamido-Gruppe

effizienter durchgeführt werden kann (Abb. 19). Hierfür wurde der bereits vorhandene

5-Bromanthranilsäuremethylester (VI) quantitativ mit Acetanhydrid acetyliert. Wider

Erwarten führte die anschließende Umsetzung mit Kupfer(I)-cyanid zu einer

unterdurchschnittlichen Ausbeute von nur 15 %. Auch hierbei sind große Mengen an

Wasser- und Ethylacetat-unlöslichen Feststoffen angefallen. Es gilt also zu resümieren,

dass die Einführung von Cyano-Gruppen in die gegebenen Moleküle prinzipiell möglich war,

die Erwartungen an Effizienz und Umweltverträglichkeit aber nicht vollständig erfüllt werden

konnten.

Abb. 19: Die Syntheseroute für N-Acetyl-5-(1H-tetrazol-5-yl)anthranilsäurehydrazid (XV) führte zu 3-Amino-2-methyl-6-(1H-tetrazol-5-yl)chinazolin-4(3H)-on (XVI): i) Acetanhydrid, Rückfluss, 30 min; ii) CuCN, NMP, Rückfluss, 1 h; iii) NaN3, TEA∙HCl, Toluen/DMF, 105 °C, 24 h; iv) N2H4∙H2O, MeOH, Rückfluss, 8 h.

Als weiterer negativer Punkt stellte sich die Tetrazolbildung aus N-Acetyl-5-

cyananthranilsäuremethylester (XIII) heraus. Das gewünschte Tetrazol XIV konnte nur in

Spuren erhalten werden. Die dafür genutzte Variante mit Toluen als Lösungsmittel hatte

wahrscheinlich dazu geführt, dass die Löslichkeit des Eduktes nicht ausreichte. Es erschien

NH2

O

O

I

i

X XI

NH2

OH

O

I

NH2

O

O

N

ii

VII

NH

O

O

BrVI XII

NH2

O

O

Br

O NH

O

O

XIII

O

N

NH

O

O

XIV

O

N

N N

NH

NH

NH

NH2

NN

NNH

O

O

N

NNH2

NN

NNH

O

XVI

i ii iii

iv iv

XV



daher sinnvoller, die Derivatisierung der Aminofunktion erst nach dem Tetrazolringschluss

vorzunehmen (Abb. 20). Würde die Acylierung im Anschluss an die Hydrazinolyse

stattfinden, bestünde die Gefahr, dass das Carbonsäurehydrazidstrukturelement ebenfalls

modifiziert würde.

Die Hydrazinolyse von N-Acetyl-5-(1H-tetrazol-5-yl)anthranilsäuremethylester (XIV)

brachte ein unvermutetes Molekül hervor: Statt des korrespondierenden

Carbonsäurehydrazids bildete sich der Heterozyklus 3-Amino-2-methyl-6-(1H-tetrazol-5-

yl)chinazolin-4(3H)-on (XVI) aus. Dieser Sachverhalt konnte mit Hilfe der hochauflösenden

Massenspektrometrie (HRMS), 2D-NMR-Spektren und Literaturhinweisen aufgeklärt

werden146. Auffällig war vor allem, dass ein 2H-Integral bei δ = 5,9 ppm im 1H-NMR-

Spektrum sichtbar wurde. Die terminale Aminogruppe von Carbonsäurehydraziden wurde

aber aufgrund ihres protonenaustauschenden Charakters bisher im 1H-NMR-Spektrum

nicht beobachtet. Dennoch stellte das derivatisierte Chinazolin ebenfalls ein interessantes

Molekül dar, das theoretisch im Besitz der notwendigen Eigenschaften zur Bindung an das

katalytische Zentrum der KDM4A war und daher unbedingt einer biologischen Testung

unterzogen werden sollte.

Abb. 20: Acylierungen von Tetrazolen können zu 1,3,4-Oxadiazolen (Umlagerungen nach Huisgen) (XVII) führen: ia) Acetanhydrid, Rückfluss, 1 h; ib) Acetylchlorid, Pyridin, 0 °C bis 40 °C, 2 h.

Da der Tetrazolringschluss des N-Acetyl-5-cyananthranilsäuremethylesters (XIII) fast

ausschließlich zu einem anderen als dem gewünschten Produkt führte, lag es nahe, die

Acetylierung erst nach der Tetrazolbildung durchzuführen. Aber auch bei dieser Route

(Abb. 20) galt es, Fallstricke zu beachten. Huisgen et al. untersuchten im Jahr 1960 unter

anderem die Stabilität von Tetrazolen147. Dabei wurde die Erkenntnis gewonnen, dass sich

Tetrazole mit Carbonsäurechloriden oder -anhydriden an Position 2 acylieren lassen. Diese

Gebilde sind thermolabil und lagern sich verhältnismäßig einfach bei Temperaturen von 60-

130 °C unter Abgabe von molekularem Stickstoff zu 1,3,4-Oxadiazolen um. So ließen sich

mit diesem Syntheseweg z. B. Methyl- oder Phenyl-substituierte 1,3,4-Oxadiazole in guten

Ausbeuten herstellen148,149. Selbiges ließ sich bei der Umsetzung von 5-(1H-Tetrazol-5-



yl)anthranilsäuremethylester (VIII) mit Acetanhydrid unter Rückfluss beobachten: Das

resultierende Molekül war ein 5-Methyl-1,3,4-oxadiazol (XVII), welches aufgrund des

Überschusses an Acetanhydrid aber wie gewünscht auch an dem primären aromatischen

Amin acetyliert wurde. Diese sauerstoffhaltigen Heterozyklen besitzen zwar nicht die

Acidität eines Tetrazols, könnten aber aufgrund der freien Elektronenpaare von Sauerstoff-

und Stickstoffatomen interessante Wechselwirkungen eingehen und sollten daher auch für

biologische Testungen gegen KDM4A in Betracht gezogen werden. Um synthetisch das

eigentlich gewollte Acetamido-Derivat des Tetrazoles (XIV) zugänglich zu machen, wurde

eine Methode herangezogen, die gewissermaßen für die Herstellung von

Carbonsäureestern gedacht ist. Bei der Einhorn-Variante (auf Grundlage der Schotten-

Baumann-Methode150) zur Herstellung von Estern aus Säurechloriden wurde Pyridin als

Lösungsmittel und Katalysator gleichzeitig genutzt. Weiterhin war es wichtig, dass der

Reaktionsansatz bei Zugabe des Säurechlorides gekühlt und danach nur gelinde erwärmt

wurde. Durch anschließende Zugabe von verdünnter HCl-Lösung wurde das Tetrazolat

wieder protoniert und ausgefällt, während das Pyridin als wasserlösliches Hydrochlorid

ausgewaschen werden konnte. Aufgrund der milden Reaktionsbedingungen blieb das

Tetrazol unverändert, jedoch mussten dafür auch mäßige Ausbeuten von 30-60 % in Kauf

genommen werden. Dennoch zeigte dieses Beispiel, wie wichtig die richtige Auswahl der

Bedingungen für die Selektivität einer Synthese von Tetrazolderivaten sein konnte. Ein

anderes Kriterium stellte die Auswahl des Lösungsmittels dar und soll im Folgenden kurz

erklärt werden.

Die Idee der Benutzung von Anthranilsäure als Grundkörper ging auch darauf zurück, dass

die freie primäre aromatische Aminogruppe genutzt werden sollte, um verschiedenste

Derivate darzustellen. Die Substituenten sollten möglichst universell gewählt werden

können, neben aliphatischen kamen daher ebenfalls aromatische Reste zum Einsatz.

Fluorsubstitutionen sind sinnvoll, um metabolische Stabilität zu gewähren und

physikochemische Eigenschaften aufgrund der starken Elektronegativität des Fluors zu

modifizieren151. Die Umsetzung von 5-(1H-Tetrazol-5-yl)anthranilsäuremethylester (VIII) mit

4-Fluorbenzoylchlorid wird nachfolgend gezeigt (Abb. 21). Neben der bereits

beschriebenen Einhorn-Variante, welche hier zum gewünschten Produkt N-4-Fluorbenzoyl-

5-(1H-tetrazol-5-yl)anthranilsäuremethylester (XIX) führte (modifiziert nach152,153), sollten

zudem die Auswirkungen eines aprotischen Lösungsmittels untersucht werden.

Literaturhinweise gaben Aufschluss über die Durchführbarkeit der Acylierung in

Dichlormethan154, allerdings konnte schon gezeigt werden, dass Benzoyltetrazole durchaus

isolierbar waren, wenn sie im aprotischen Lösungsmittel und unter Eiskühlung hergestellt

wurden155.



Abb. 21: Die Wahl des Lösungsmittels beeinflusst die Selektivität der Acylierungen von Tetrazolen: ia) 4-Fluorbenzoylchlorid, CH2Cl2, TEA, 0 °C bis Raumtemperatur, 18 h; ib) 4-Fluorbenzoylchlorid, Pyridin, 0 °C bis 50 °C, 3 h; ii) N2H4∙H2O, MeOH, Rückfluss, 5 h.

Ein Grundproblem bei der Nutzung von aprotischen Lösungsmitteln war die schlechte

Löslichkeit von (1H-Tetrazol-5-yl)anthranilsäuremethylester (VIII) in diesen Solvenzien.

Durch Zusatz einer Hilfsbase (welche ohnehin zugesetzt werden musste, um beim

Reaktionsverlauf mit einem Carbonsäurechlorid entstehendes HCl abzufangen) wurde die

Löslichkeit nur minimal verbessert. Trotz des Vorliegens einer Suspension aus Edukt in

Dichlormethan war nach Zugabe des 4-Fluorbenzoylchlorids eine Umsetzung detektierbar.

Nach Aufarbeitung des Reaktionsansatzes zeigte das 1H-NMR-Spektrum des Produktes

eine Überraschung: Das Fehlen eines Amid-NH-Signals und das Vorhandensein eines

2H-Integrals der NH2-Gruppe indizierten eine Acylierung des Tetrazols (Abb. 23). Der

zusätzliche Test mit Ehrlich-Sprühreagenz (Dimethylaminobenzaldehyd) war positiv, das

heißt, es hatte sich ein orangebraunes Iminoderivat gebildet. Die primäre aromatische

Aminofunktion wurde also nachweislich zunächst nicht umgesetzt und dann mit dem

Farbreagenz derivatisiert. Dies ist deshalb nicht unbedingt zu erwarten gewesen, weil ein

Tetrazolat über eine Mesomeriestabilisierung verfügt (Abb. 22). In der Regel sind solche

Moleküle dadurch reaktionsträger, weshalb angenommen wurde, dass die NH2-Gruppe als

erstes eine Acylierung unterlaufen würde. Auch dieses Beispiel zeigte, wie wichtig und

zeitaufwendig die Optimierungen der Reaktionsbedingungen in diesem Arbeitsfeld sind,

und dass mit nur wenigen Änderungen bereits völlig andere Moleküle erhalten werden

können.

Abb. 22: Mesomeriestabilisierung des Tetrazolats.

Mit dem Lösungsmittel Pyridin konnte Intermediat XIX zwar erhalten werden, der

anschließende Schritt der Hydrazinolyse gestaltete sich aber erneut schwierig (Abb. 21).



Die Untersuchungen der Produkte wurden auch von den vorherigen Befunden geleitet, dass

eventuell ein Chinazolin-Grundgerüst entstanden sein könnte. Die Umsetzung war jedoch

marginal und ein sauberer Stoff konnte auch nach intensiver Aufarbeitung nicht erhalten

werden. Gegebenenfalls war der aromatische Rest sterisch zu anspruchsvoll, weshalb ein

Ringschluss nicht gut gelang.

Abb. 23: In Bezug auf NH-Protonen deutlich unterschiedliche 1H-NMR-Spektren aus der Acylierung von (1H-Tetrazol-5-yl)anthranilsäuremethylester (VIII).

Weiterhin wurde versucht, die freie Aminofunktion für eine Alkylierung zu nutzen. Dafür

wurde nach einer Literaturangabe vorgegangen, welche Chloressigsäure im Wässrigen und

Natriumcarbonat als Hilfsbase (Abb. 24) vorschlug156. Die zusätzlich eingeführte



Carbonsäurefunktion sollte internen computergestützten Berechnungen zufolge ein

erhöhtes Interaktionspotential mit KDM4A ermöglichen.

Abb. 24: Fehlgeschlagene Alkylierung des primären aromatischen Amins (XXI): i) Chloressigsäure, Na2CO3, H2O, 90 °C, 3 h.

Die zitierte Literatur setzte aber nicht wie hier vorgestellt den Anthranilsäureester um,

sondern die freie Säure. Aufgrund der hohen Temperaturen und dem basischen pH-Wert

durch das eingesetzte Carbonat-Salz, kam es jedoch fast ausschließlich zur

Esterhydrolyse. Eine Alkylierung konnte nicht nachgewiesen werden. Zukünftige

Alkylierungsversuche sollten also wässrige Systeme meiden. Wegen Bedenken, dass eine

zweite saure Gruppe am Molekül zu einer erheblichen Steigerung der ohnehin schon hohen

Polarität des Moleküls geführt hätte, wurden Alternativen für die misslungene Umsetzung

nicht untersucht.

Für den vorgestellten Anthranilsäureweg ist festzuhalten, dass dieser erfolgreich verfolgt

werden konnte. Es wurden unterschiedliche Aspekte der kritischen Syntheseschritte (unter

anderem Cyanierung und Acylierung) untersucht und von verschiedenen Seiten beleuchtet.

Insgesamt standen mit 5-(1H-Tetrazol-5-yl)anthranilsäurehydrazid (IX) und 3-Amino-2-

methyl-6-(1H-tetrazol-5-yl)chinazolin-4(3H)-on (XVI) zwei vollständig charakterisierte und

aufgereinigte Verbindungen zur Verfügung, welche auf inhibitorische Eigenschaften gegen

KDM4A getestet werden sollen.

1.2.1.2 Essigsäurederivate

In Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe Makromolekulare Kristallographie um Dr.

Manfred Weiss von der Photonenquelle BESSY II des Helmholtz-Zentrum Berlin für

Materialien und Energie konnten im Rahmen von Diplomarbeiten und Dissertationen im

Arbeitskreis bereits mehrere Kristallstrukturen aufgelöst werden113,157. Die Kristallisation

erfolgte im katalytischen Zentrum der KDM4D, wobei aus Stabilitätsgründen das zentrale

Fe(II)-Kation gegen ein Ni(II)-Kation ausgetauscht wurde. KDM4D besitzt zwar einen sehr

ähnlichen Aufbau wie KDM4A, es konnte allerdings mit der Struktur AA040 gezeigt werden,

dass ein Phenylrest, welcher mit fünf Kohlenstoffkettengliedern aus dem Zentrum

herausragt, eine weitere Interaktion mit dem Aminosäurerest Histidin 90 eingeht (Abb. 25).

Dieses π-π-Stacking könnte einen zusätzlichen Energiegewinn bei der Bindung einbringen

und, noch wichtiger, eine gewisse Selektivität für die sonst sehr homogen aufgebaute

NH2

O

NN

NNH

O

VIII

i

NH

O

NN

NNH

O

XXI

O

OH



KDM4-Enzymreihe bedeuten, da KDM4A an dieser Position eine andere

Aminosäure(sequenz) aufweist. Daher ließ sich schlussfolgern, dass unbedingt noch ein

Derivat vom 2-Amino-2-(1H-tetrazol-5-yl)essigsäurehydrazid-Typ (vgl.113) mit

π-Elektronenüberschussaromaten bei gleicher Kettenlänge synthetisiert werden sollte.

Einen zweiten Punkt stellte die Untersuchung der Notwendigkeit der Carbonsäurehydrazid-

Gruppe von AA040 dar. Die chelatisierende Wirkung auf das zentrale Eisen-Kation wird

ohne Zweifel eine der gewinnbringendsten Molekül-Liganden-Interaktion repräsentieren.

Da aber bei AA040 offensichtlich noch weitere Interaktionspartner außerhalb des

katalytischen Zentrums der KDM4D vorhanden sind, wird die Frage aufgeworfen, ob ein

Verzicht auf die promiskuitiv bindende Hydrazid-Partialstruktur möglich wäre. Die

Synthesewege für beide Moleküle sollen im Folgenden besprochen werden.

Abb. 25: Kristallstruktur von AA040 (2-(4-Phenylbutylamido)-2-(1H-tetrazol-5-yl)essigsäurehydrazid) in KDM4D: Der Phenylrest zeigt ein zusätzliches π-π-Stacking mit His90.

Die zentrale Frage bei der Synthese von AA040-Analoga ohne Hydrazidfunktion war, ob

der Elektronenzug auf das Nitril ausreichen würde, um eine zufriedenstellende

Tetrazolbildung zu gewährleisten. Auf den genauen Mechanismus dieser Reaktion wird in

Abschnitt 1.2.2.1 eingegangen, es soll aber vorweggenommen werden, dass der

Tetrazolringschluss ohne ausreichende –I- oder –M-Effekte der benachbarten Gruppen

erschwert ist. Im Falle der Synthesestrategie von AA040 wurde der Elektronenzug von

einem angrenzenden Oxim generiert, welcher eine gute Ausbeute ermöglichte. Entfällt

dieser, müssen die Einflüsse des Amids den notwendigen Elektronenzug zu Verfügung

stellen (Abb. 26).



Im ersten Schritt wurde 5-Phenylvaleriansäure (XXII) mit Hilfe von Thionylchlorid in sein

korrespondierendes Carbonsäurechlorid (XXIII) übergeführt157. Ohne Aufarbeitung dieses

Intermediats erfolgte die Umsetzung mit 2-Aminoacetonitril-Hydrochlorid (XXIV) zum

entsprechenden Amid (XXV) (modifiziert nach Palumbo et al.158) mit guten Ausbeuten. Bei

der anschließenden Tetrazolbildung wurde zuerst eine drastischere Variante mit der Lewis-

Säure Aluminiumchlorid untersucht159. Dadurch sollte die Bildung von Aluminiumazid

realisiert werden, welches höhere Ausbeuten bei niedrigerer Reaktionstemperatur in

Aussicht stellte. Angewendet auf die gegebene Struktur fand jedoch keine Umsetzung statt

und das Edukt konnte nahezu verlustfrei wiedergewonnen werden. In der Literatur werden

strukturell verwandte Produkte erzielt, wenn die Umsetzung des Nitrils mit

metallorganischen Aziden wie Trimethylsilylazid oder Tributylzinnazid erfolgte160,161. Diese

Reagenzien besitzen in der Regel eine hohe Toxizität und sollten deshalb nur als Ultima

Ratio zum Einsatz kommen. Eine ältere Publikation zeigte jedoch, dass es eventuell

möglich sein könnte, das Amidonitril mit den „klassischen“ Reaktionsbedingungen

(Natriumazid, Ammoniumchlorid und Dimethylformamid) umzusetzen162.

Überraschenderweise führte dies zu verhältnismäßig guten Ausbeuten von über 50 %,

wobei das nicht abreagierte Edukt ebenfalls wiedergewonnen werden konnte. Der

ausgeübte Elektronenzug des Amids war offenbar ausreichend, um eine erfolgreiche

Tetrazolsynthese zu initiieren.

Abb. 26: Synthesestrategie für N-(1H-Tetrazol-5-yl)methyl-5-phenylvalerianamid (XXVI): i) SOCl2, Raumtemperatur, 24 h; ii) Pyridin, CH2Cl2, Raumtemperatur, 20 h; iii) NaN3, NH4Cl, DMF, 105 °C, 24 h.

Bezüglich der Wahl des π-Elektronenüberschussaromaten gab es Hinweise darauf, dass

die π-π-Wechselwirkung eines Imidazolrings (Histidin) mit einem Indolrest (Tryptophan)

etwa vier Mal größer sein konnte als die Interaktion eines Imidazolrings mit einem

Benzenrest (Phenylalanin)163. Es sollte daher mit hoher Priorität versucht werden, einen

Indolring an Stelle des Phenylrestes zu integrieren. Die Kettenlänge sollte dabei

unverändert bleiben, dies entsprach einer an Position 4 modifizierten Buttersäure, welche

ein Indol-3-yl-Rest trägt (Abb. 27).



Die Synthese des Grundkörpers 2-Amino-2-(1H-tetrazol-5-yl)essigsäureethylester-

Hydrochlorid (XXIX) erfolgte nach einem zweistufigen Schema und wurde bereits

ausführlich in der Dissertation von N. Rüger besprochen, weshalb hierauf verzichtet werden

soll113. Die Umsetzung mit (1H-Indol-3-yl)buttersäure (XXVII), beziehungsweise seinem

korrespondierenden Säurechlorid (XXVIII), sollte zum gewünschten Amid (XXX) führen. Die

lösungsmittelfreie Reaktion mit SOCl2 führte dabei ebenso wenig zum Erfolg wie die

Variante, in welcher Tetrahydrofuran als Lösungsmittel verwendet wurde164. In beiden

Fällen kam es zur Schwarzfärbung des Edukts, ohne dass das gewollte Säurechlorid

entstand.

Abb. 27: Syntheseschema für 2-[4-(1H-Indol-3-yl)butylamido]-2-(1H-tetrazol-5-yl)essigsäure-hydrazid (XXXI): i) SOCl2, DMF, Raumtemperatur, 24 h; ii) XXVII, DIC, DIPEA, CH2Cl2, 0 °C bis Raumtemperatur, 20 h; iii) N2H4∙H2O, MeOH, Rückfluss, 6 h.

Die Überführung von Carbonsäuren in Säurechloride zur Amidsynthese stellte einen

verhältnismäßig simplen Ansatz dar. Mittlerweile ist die Auswahl an leistungsfähigen

Kupplungsreagenzien zur Knüpfung von Peptidbindungen derart groß, dass hier alternative

Syntheseoptionen zur Verfügung standen. So wurden ähnliche Amide bereits unter der

Verwendung von 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid-Hydrochlorid (EDCI∙HCl)

(Abb. 28), welches eine Variante des bewährten Dicyclohexylcarbodiimids (DCC) darstellt,

synthetisiert165,166. Unter Zusatz von 1-Hydroxybenzotriazol (HOBt) können sich Aktivester

mit Carbodiimiden formen, welche für bessere Ausbeuten und weniger Nebenreaktionen

sorgen sollen167. Die Kupplung mit EDCI konnte auf das genannte Molekül erfolgreich

übertragen werden, jedoch nur in geringen Ausbeuten (15 %). Wichtig bei diesem

Reaktionstyp ist der konsequente Ausschluss von Wasser. Für die Experimente wurde

EDCI∙HCl verwendet, welches als farbloser Feststoff vorliegen sollte. Das verwendete

Reagenz war aber von wachsartige Konsistenz. Eine partielle Hydrolyse des EDCI∙HCl

konnte deshalb nicht ausgeschlossen werden und war sehr wahrscheinlich der Grund für

die niedrigen Ausbeuten. Unter Zuhilfenahme von Diisopropylcarbodiimid (DIC) und

4-(Dimethylamino)pyridin (4-DMAP) (Abb. 28) gelang es schließlich, 2-[4-(1H-Indol-3-

yl)butylamido]-2-(1H-tetrazol-5-yl)essigsäureethylester (XXX) in guten Ausbeuten (etwa



80 %) zu erhalten. Diese Kombination ist eigentlich für die Veresterung von Alkoholen und

Carbonsäuren entwickelt worden und auch unter der Bezeichnung Steglich-Veresterung

bekannt168. Allen Carbodiimid-gestützten Synthesen sind sehr milde

Reaktionsbedingungen eigen. Größter Nachteil ist in der Regel die zum Teil schwierige

Abtrennung der entstehenden Harnstoffderivate. Der bei der Reaktion mit DIC entstandene

Diisopropylharnstoff konnte aber über eine Flüssig-Flüssig-Extraktion und Fällung des

Produktes mit Salzsäure entfernt werden. Ein weiterer interessanter Ansatz war die

Verwendung von Cyanurchlorid, welches Carbonsäuren ebenfalls in Carbonsäurechloride

überführen kann. Für Indolessigsäure wurde bereits eine Kupplung mit einem Amin unter

Verwendung dieses Reagenzes beschrieben169. Diese Reaktionsbedingungen konnten

ebenfalls auf die hier vorgestellten Edukte übertragen werden, führten aber nur zu mäßigen

Ausbeuten von etwa 20 %. Damit gilt es zusammenzufassen, dass die Kupplung von 2-

Amino-2-(1H-tetrazol-5-yl)essigsäureethylester-Hydrochlorid (XXIX) mit (1H-Indol-

3-yl)buttersäure (XXVII) am besten mit DIC und 4-DMAP gelang und der Syntheseroute

über das in situ erzeugte Carbonsäurechlorid hinsichtlich Ausbeuten und

Reaktionsbedingungen klar überlegen war.

Abb. 28: Hilfsreagenzien für die Amidsynthese (v. l. n. r.): Thionylchlorid und Cyanurchlorid (Trichlortriazin, TCT) dienen der Herstellung von Carbonsäurechloriden; 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid-Hydrochlorid (EDCI∙HCl) und Diisopropylcarbodiimid (DIC) vermögen Carbonsäuren direkt an Amine zu kuppeln; 4-(Dimethylamino)pyridin (4-DMAP) dient als Katalysator dieser Reaktion.

Die nachfolgende Hydrazinolyse von Estern wie XXX wurde mit N2H4∙H2O in

methanolischer Lösung unter Rückfluss für mehrere Stunden durchgeführt. Die Umsetzung

konnte mit dünnschichtchromatographischer Unterstützung verfolgt werden und gelang in

der Regel quantitativ. Die Aufreinigung des Tetrazolylhydrazids stellte die größte

Herausforderung dar. Aufgrund des amphoteren Charakters war die Polarität von 2-[4-(1H-

Indol-3-yl)butylamido]-2-(1H-tetrazol-5-yl)essigsäurehydrazid (XXXI) trotz lipophiler

Seitenkette relativ hoch, weshalb sich eine säulenchromatographische Aufarbeitung

schwierig gestaltete. Unter Normalphasen-Bedingungen waren die Wechselwirkungen mit

dem Kieselgel stark ausgeprägt, wodurch große Anteile an Methanol im Laufmittel benötigt

wurden. Auf der anderen Seite wurde mit einer RP18-Phase kaum Retention erzielt. In

vorherigen Arbeiten konnte das Aufarbeitungsproblem mit einem zusätzlichen

Derivatisierungsschritt mit Methylethylketon zum Hydrazon und anschließender Spaltung

(mit zum Teil nur mäßigen Ausbeuten) gelöst werden113,157. Im Rahmen dieser Synthese

wurde erst eine Schwerkraftsäulenchromatographie mit 30 % Methanol im Laufmittel

S

O

Cl Cl

N

N

N

Cl

ClClN

N N HClN

N

N

N



durchgeführt. Die erzielte Reinheit reichte hierbei jedoch noch nicht aus. Erst der Vergleich

mit bisher beschriebenen HPLC-Methoden für das verhältnismäßig ähnlich aufgebaute

Tryptophan (amphoterer Charakter, Indolrest) brachte eine Möglichkeit zu Tage, mit

welcher das synthetisierte Molekül auch auf einer RP18-Phase reterniert werden konnte170.

Die Einstellung des pH-Wertes der wässrigen mobilen Phase auf 2,7 mit Phosphorsäure

führte offensichtlich zu einem günstigen Protonierungsgrad. Dennoch zeigte dieses

Beispiel, wie wichtig ein universelles Portfolio an verschiedenartigen Packmaterialien für

HPLC-Säulen sein kann. Ein HILIC-Trennmaterial wäre bei dieser Fragestellung mit

Sicherheit geeigneter gewesen, die hohen Anschaffungspreise deckeln aber den

weitreichenden Einsatz in der präparativen Anwendung.

In zukünftigen Synthesen sollte darüber nachgedacht werden, die für die Aufreinigung

problematische Amphoterie zumindest partiell einzuschränken, zum Beispiel durch

Umsetzung des Hydrazids mit Phosgen171-173 oder dem weniger toxischen

Carbonyldiimidazol174 (CDI) (Abb. 29). Dadurch verliert das Molekül seinen basischen

Charakter, denn das entstehende 1,3,4-Oxadiazol-2-ol ist eher saurer Natur. Es ist dann

zwar fraglich, in wie weit die komplexierenden Eigenschaften noch gegeben sind, sollte es

aber zu erheblichen Vorteilen in der Produktaufarbeitung kommen, wäre diese Variante in

Erwägung zu ziehen. In Modellreaktionen wurde versucht, 2-(1H-Tetrazol-5-

yl)essigsäurehydrazid (XXXII) sowohl mit Phosgen als auch mit CDI in verschiedenen

Lösungsmitteln umzusetzen. Eine erfolgreiche Isolierung des Oxadiazols gelang jedoch

nicht. Aufgrund der Fokussierung auf eine andere Grundstruktur ohne Hydrazidfunktion

bleibt die Zyklisierung zu Oxadiazolen zukünftigen Arbeiten vorbehalten.

Abb. 29: Nicht gelungene Überführung des Carbonsäurehydrazids in das entsprechende 1,3,4-Oxadiazol-2-ol bzw. das tautomere 1,3,4-Oxadiazol-2(3H)-on: i) CDI, THF/DMF, Rückfluss, 20 h oder Phosgen, Chlorbenzen, Rückfluss, 2 h.

Es konnten somit die beiden vielversprechenden Abwandlungen von AA040 ohne

Carbonsäurehydrazid (N-(1H-Tetrazol-5-yl)methyl-5-phenylvalerianamid (XXVI)) und mit

π-Elektronenüberschussaromaten (2-[4-(1H-Indol-3-yl)butylamido]-2-(1H-tetrazol-5-

yl)essigsäurehydrazid (XXXI)) synthetisiert und für die Cokristallisation zur Verfügung

gestellt werden. Diese Moleküle könnten als Tools für die Investigation neuer Bindungsmodi

ohne Chelator und für erweiterte π-π-Interaktionen in KDM4D dienen.



1.2.2 Synthese von Tetrazol- und Pyridin-beinhaltenden KDM4-Inhibitoren

Wie bereits in Abschnitt 1.1.2.2 aufgezeigt, stand mit Pyridin-2,4-dicarbonsäure ein

hochpotenter experimenteller pan-Inhibitor für die KDM4-Enzymreihe als Ausgangspunkt

zur Verfügung. Auch verschiedenste Derivate davon, die vor allem aus der Patentliteratur

stammten, konnten bereits synthetisiert und auf ihre Aktivität getestet werden. In der Regel

trugen diese Inhibitoren eine Carboxygruppe in Position 4 des Pyridinrings. Der Austausch

dieser Carboxygruppe durch einen aromatischen Tetrazolring war bisher nur vereinzelt

durchgeführt worden, und wenn, dann meistens als hintenangestellte Einzelmonographie

einer reihenweisen Patentierung von Pyridin-4-carbonsäuren99,103. Systematische

Untersuchungen der 4-(1H-Tetrazol-5-yl)pyridine auf inhibitorische Eigenschaften gegen

KDM4-Enzyme fehlten und stellten somit ein Ziel dieses Abschnitts dar. Des Weiteren sollte

auch die Untersuchung eines zweckmäßigen Aufbaus der Seitenkette in Position 2 des

Pyridins adressiert werden. Neben der direkten Verknüpfung über ein Heteroatom

(Stickstoff-, Schwefel- oder Sauerstoffatom), waren Stoffe mit Carbonylgruppe als

verknüpfendem Element oder deren reduzierte Varianten mit Methylenbrücke eine Option

(Tab. 2). Ein direkter Austausch der Carboxygruppe durch einen Tetrazolring in Position 2

oder 4 sollte auch erfolgen, um direkte Vergleiche der Aktivitäten erhalten zu können. Die

zum Teil nur geringfügigen Änderungen im Molekül machten zahlreiche neue

Synthesewege notwendig, welche im Folgenden besprochen werden sollen.

Tab. 2: Geplante Substitutionsmuster der (1H-Tetrazol-5-yl)pyridine.

Grundkörper Reste Strukturen

R1

R2

1.2.2.1 4-(1H-Tetrazol-5-yl)pyridin-2-amine/thiole/thioether/ether

Als Ausgangstoff für die 4-(1H-Tetrazol-5-yl)pyridin-2-amine diente 2-Chlorisonicotinnitril

(XXXIV), welches im ersten Schritt zum korrespondierenden Tetrazol XXXV (Abb. 30) und

anschließend mit verschiedenen Nucleophilen im Sinne einer SNAr umgesetzt werden

sollte. Eine vorangestellte Reaktion des Nitrils war wichtig, da dieses ebenfalls mit

Nucleophilen reagieren kann, wie beispielsweise die Synthese des Biguanids Metformin



und die Pinner-Reaktion zeigten175,176. Allerdings wurde dadurch ein amphoterer Charakter

generiert, welcher im Folgenden vor allem die Auswahl des Lösungsmittels stark

einschränkte.

Abb. 30: Tetrazolringschluss zum 2-Chlor-4-(1H-tetrazol-5-yl)pyridin (XXXV): i) NaN3, TEA∙HCl, Toluen, 110 °C, 18 h.

Die Formation des Tetrazols XXXV erfolgte bei der Umsetzung des aromatischen Nitrils

XXXIV mit Natriumazid in nahezu quantitativen Ausbeuten. Ein genauerer Blick auf den

Mechanismus gab Erklärungsansätze, warum dieser Syntheseschritt mit aromatischen

Systemen deutlich besser realisierbar war als mit aliphatischen Grundkörpern. Himo et al.

berechneten dafür Energiebarrieren für konzertierte 1,3-dipolare Cycloadditionen (Huisgen-

Cycloaddition177) und Tetrazolbildungen, welche über eine Imido-Azid-Zwischenstufe

abliefen178 (Abb. 31). Letztere wurde dann bevorzugt durchlaufen, wenn die Reaktion

protonenkatalysiert ablief. Das erforderliche Proton wurde unter den hier genannten

Reaktionsbedingungen vom Triethylammoniumchlorid zur Verfügung gestellt. Dabei greift

ein Azid-Stickstoffatom das Kohlenstoffatom des Nitrils nucleophil an. Je positiver das

Kohlenstoffatom polarisiert war, desto besser konnte die Tetrazolformung also gelingen.

Abb. 31: Wahrscheinlicher Mechanismus des Tetrazolringschlusses unter der Verwendung von Brønsted-Säuren (modifiziert nach Himo et al.178): Es wird ein achtgliedriger Übergangszustand und eine Imido-Azid-Zwischenstufe durchlaufen.

Bei aliphatischen Nitrilen erbrachten die benachbarten Alkylreste schwache +I- und

Hyperkonjugations-Effekte, weshalb die Reaktion hier in der Regel träge ablief.

Aromatische Reste können jedoch Elektronen über Mesomerieeffekte delokalisieren, das

heißt, dass das Kohlenstoffatom von aromatischen Nitrilen deutlich stärker positiv polarisiert

sein sollte. Pyridin als Substituent hatte zusätzlich eine elektronenziehende Wirkung, da ein



ausgeprägter –I-Effekt vorhanden war. Dies führte schlussendlich dazu, dass die

Umsetzung zum Tetrazol nahezu quantitativ gelang.

Die in dieser Arbeit hauptsächlich verwendete Kombination aus Toluen, Natriumazid und

Triethylammoniumchlorid (vgl. auch179) hatte aber laut der Originalarbeit von Koguro et al.

einen leicht abweichenden Ablauf140. So bildet sich aus dem Triethylammoniumchlorid ein

Triethylammoniumazid, welches in Toluen eine relevante Löslichkeit zeigte. Dieses wurde

in der Reaktion mit dem Nitril verbraucht, es entsteht das entsprechende

Triethylammoniumtetrazolat. Damit würde die Brønsted-Säure einen äquimolaren

Reaktionspartner darstellen und nicht nur katalytischer Natur sein.

Neben der sehr häufigen Behandlung von Nitrilen mit Natriumazid, Ammoniumchlorid und

Dimethylformamid für den Tetrazolringschluss180, kamen auch Zusätze von Lewis-Säuren

und organometallische Azide zum Einsatz (siehe auch Abschnitt 1.2.1.2). Auf der anderen

Seite muss das Edukt nicht immer ein Nitril sein, beispielsweise sind Tetrazole auch

ausgehend von Carbonsäureamiden zugänglich181, was wegen der großen Vielfalt an

verfügbaren Vertretern ein Vorteil wäre. Andererseits stünde anders als bei den Nitrilen bei

Carbonsäureamiden das Repertoire der Click-Chemie als besonders effizientes Verfahren

nicht zur Verfügung182. Aufgrund der Vielseitigkeit und Möglichkeiten des

Themenkomplexes wird an dieser Stelle auf drei Übersichtsarbeiten verwiesen108,183,184.

Das synthetisierte 2-Chlor-4-(1H-tetrazol-5-yl)pyridin (XXXV) sollte dann mit zahlreichen

Aminen unterschiedlichster Diversität umgesetzt werden (Abb. 32 und Tab. 3). Neben

aliphatischen Resten, kamen auch aromatische Substituenten zum Einsatz. Eine zweite

funktionelle Gruppe konnte durch die Verwendung von Diaminen oder Aminoalkoholen

eingeführt werden. Diese sollten im weiteren Verlauf der Kettenverlängerung dienen.

Erfreulicherweise kam es bei der SNAr mit Diaminen nicht in nennenswertem Umfang zu

befürchteten Dimerisierungen. Wahrscheinlich wurde diese mögliche Folgereaktion durch

einen ausreichend großen Überschuss an Diamin während der Reaktion verhindert. Wäre

eine Dimerisierung so nicht vermeidbar gewesen, hätten Schutzgruppenstrategien für die

Darstellung von Substanzen dieses Typs entwickelt werden müssen.

Abb. 32: Darstellung der 4-(1H-Tetrazol-5-yl)pyridin-2-amine: i) Amin, bis zu 220 °C, bis zu 48 h, Mikrowellenreaktor oder Rundkolben.

Die Synthesen der verschiedenen 4-(1H-Tetrazol-5-yl)pyridin-2-amine wurden in der Regel

umweltfreundlich ohne Verwendung von Lösungsmitteln im Mikrowellenreaktor und im Falle



der längeren Diamine/Aminoalkohole im Rundkolben durchgeführt. Durch Fällung aus

zumeist wässriger Lösung mit Salzsäure konnten zahlreiche Produkte isoliert werden. Die

Löslichkeit dieser Produkte war jedoch zum Teil noch schlechter als die des betreffenden

Eduktes. So mussten viele NMR-Spektren von den entsprechenden Natrium-Salzen der

4-(1H-Tetrazol-5-yl)pyridin-2-amine in D2O aufgenommen werden, da eine ausreichende

Löslichkeit in DMSO-d6 nicht gegeben war.

Tab. 3: Übersicht der dargestellten 4-(1H-Tetrazol-5-yl)pyridin-2-amine mit jeweiligem Rest R.

Alkylamine

XXXVI XXXVII XXXVIII

Benzylamine

XXXIX XL XLI XLII

Diamine185-187 XLIII XLIV XLV

Aminoalkohole188 XLVI XLVII

Piperazine189/ Morpholine

XLVIII XLIX L

Einen Hinweis auf die molekularen und supramolekularen Ursachen für die schlechte

Löslichkeit der 4-(1H-Tetrazol-5-yl)pyridin-2-amine lieferte die röntgenkristallographische

Untersuchung von N-[4-(1H-Tetrazol-5-yl)pyridin-2-yl]ethan-1,2-diamin-Hydrochlorid (XLIII)

(Abb. 33). Neben der kompletten Planarität und den zwitterionischen Eigenschaften des

Tetrazolylpyridins wurden zahlreiche intra- und intermolekulare

Wasserstoffbrückenbindungen beobachtet, welche zu starken Wechselwirkungen im

Kristallgitter führten und damit wohl ursächlich für Löslichkeitsprobleme waren. Dennoch

konnte mit der Kristallstruktur bewiesen werden, dass der entworfene Syntheseweg mit den

zum Teil harschen Bedingungen (u. a. Mikrowellenreaktor bei Temperaturen bis 220 °C)

bis hierhin umsetzbar war. Zusätzlich zeigten die Derivate XLVIII, XLIX und L mit Piperazin-

oder Morpholin-Partialstrukturen auf Grund des räumlichen und sp³-reichen Charakters der

Heterozyklen an der Seitenkette, dass auch mit dem coplanaren Tetrazolylpyridin-

Grundgerüst eine gute Wasserlöslichkeit erreicht werden konnte.

N

O



Abb. 33: Röntgenkristallographische Untersuchungen von N-[4-(1H-Tetrazol-5-yl)pyridin-2-yl]ethan-1,2-diamin-Hydrochlorid (XLIII).

Bei der Einführung eines Schwefelatoms an Position 2 des Pyridinrings wurde ein anderer

Weg eingeschlagen als bei den oben genannten Aminsubstituenten. Da sich Thiole

(beziehungsweise Thiolate) als relativ weiche und gute Nucleophile bequem alkylieren

lassen und im Gegensatz zu Aminen allgemein keine Mehrfachalkylierung befürchtet

werden muss, gestaltete es sich zweckdienlicher, das entsprechende Mercaptoderivat des

2-Chlor-4-(1H-tetrazol-5-yl)pyridins (LI) herzustellen (Abb. 34).

Abb. 34: Die Substitution durch ein Schwefelatom an Position 2 des 2-Chlor-4-(1H-tetrazol-5-yl)pyridins (XXXV) schlug fehl, war aber mit 2-Chlorisonicotinnitril (XXXIV) möglich: i) Thioharnstoff, EtOH, 135 °C, 60 min, Mikrowellenreaktor; ii) Benzylbromid, TEA, ACN, Raumtemperatur, 4 h; iii) NaN3, TEA∙HCl, Toluen, 100 °C, 17 h.

Es gelang jedoch nicht, die Substitution mit bereits vorhandenem Tetrazolring

durchzuführen, obwohl die prinzipielle Machbarkeit ähnlicher Umsetzungen mit freier

Carbonsäurefunktion bereits gezeigt wurde190. Daher sollte das Nitrilderivat XXXIV zuerst

mit einem Schwefelatom modifiziert und dann erst nach Alkylierung in das Tetrazolderivat

übergeführt werden. Dies funktionierte mit Hilfe des Mikrowellenreaktors passabel



(modifiziert nach191,192), die anschließende Alkylierung war ebenfalls gut umsetzbar193.

Damit konnte der Einsatz von oftmals sehr unangenehm riechenden Thiolen umgangen

werden194.

Mit diesem Syntheseweg war es möglich, das schwefelhaltige Benzylderivat LIV mit

Tetrazolylpyridin-Grundkörper darzustellen. Allerdings nahm die hohe Divergenz der

Synthesestrategie, wie es bei den Aminen noch der Fall war, mit einer späten Ausbildung

des Tetrazolrings ab. Es wurde nur eine Thioether-enthaltende Substanz synthetisiert, da

zuerst die biologischen Testungen abgewartet werden sollten, um zu entscheiden, ob

weitere Untersuchungen gerechtfertigt erscheinen.

Als Fehlschlag erwies sich die versuchte Substitution von 2-Chlor-4-(1H-tetrazol-5-

yl)pyridin (XXXV) mit Alkoholen bzw. Alkoholaten (Abb. 35). Es sollte versucht werden,

sowohl eine Umsetzung mit Methanolat als auch mit Phenolat zu erzielen. Für letzteres

wurde eine Vorschrift mit Phenol und tert-Butanolat in DMSO verwendet195. Hierbei konnten

außer unangenehm riechenden Abbauprodukten des DMSO keine weiteren

Umsetzungsprodukte detektiert werden. Bei der Reaktion mit Methanolat in Methanol

konnte ebenfalls keine Bildung des Zielprodukts beobachtet werden. Literaturhinweisen zu

Folge wäre es effektiver gewesen, bereits das Nitril XXXIV mit Methanolat reagieren zu

lassen196.

Abb. 35: Fehlgeschlagene Substitution von 2-Chlor-4-(1H-tetrazol-5-yl)pyridin (XXXV) mit Alkoholaten/Phenolaten: i) Natriummethanolat in Methanol/Phenol mit Kalium-tert-Butanolat, DMSO, bis zu 150 °C, bis zu 2 h, Mikrowellenreaktor.

Die zum Teil sehr niedrigen Ausbeuten bei der Substitution mit einigen Aminen (3-75 %)

deuteten bereits an, dass das 2-Chlorpyridin durch den Tetrazolring für die SNAr offenbar

deaktiviert wurde. Ein Grund dafür könnte sein, dass unter den stets basischen

Reaktionsbedingungen das acide Tetrazol-Proton entfernt wurde. Das resultierende

Tetrazolat erhöhte mit einem +I-Effekt die Elektronendichte im Pyridinring, was für die SNAr

als negativ einzuschätzen war. Dieser Gedankengang ließ folgende Schlüsse zu: Entweder

wird als Edukt das Nitril eingesetzt (siehe 2-(Benzylthio)-4-(1H-tetrazol-5-yl)pyridin (LIV)),



mit Katalysatoren wie Palladium gearbeitet197-199 (Experimente, bei denen BrettPhos-

Katalysatoren verwendet wurden, schlugen aber ebenfalls fehl) oder das acide Tetrazol-

Proton durch eine Schutzgruppe ausgetauscht. Letzteres spielte im weiteren Verlauf dieser

Arbeit eine erhebliche Rolle und soll an späterer Stelle diskutiert werden.

Um die chemische Diversität der Testsubstanzsammlung zu erweitern, sollten die durch

Substitution mit Diaminen und Aminoalkoholen erfolgreich dargestellten Derivate über

deren neu eingeführte Amino- oder Hydroxyfunktionen weiter funktionalisiert werden. Dafür

wurden Carbon-, Sulfon- oder verschiedene Kohlensäurechloride eingesetzt, welche zu

den entsprechenden Amiden beziehungsweise Carbamaten führten (Abb. 36 und Tab. 4).

Abb. 36: Umsetzung von N-[4-(1H-Tetrazol-5-yl)pyridin-2-yl]ethan-1,2-diamin-Hydrochlorid (XLIII) zu den entsprechenden Derivaten: i) Carbon-, Sulfon- oder Kohlensäurechlorid, NaOH, Wasser/ACN, 0 °C bis Raumtemperatur, bis zu 24 h.

Tab. 4: Übersicht der auf N-[4-(1H-Tetrazol-5-yl)pyridin-2-yl]ethan-1,2-diamin-Hydrochlorid (XLIII) basierenden dargestellten Derivate mit jeweiligem Rest R.

Carbonsäureamide

LVII LVIII

Sulfonsäureamide

LIX

Carbamate

LX

Auf Grund der sehr geringen Löslichkeit des Edukts XLIII gestaltete sich eine Acylierung

schwierig. Der Ausgangstoff war grundsätzlich nur dann in Wasser oder Methanol

solvatisierbar, wenn zusätzlich ein basisches Agens wie Natriumhydroxid oder Ammoniak

dazugegeben wurde. Die protischen Lösungsmittel stellen ebenfalls Reaktionspartner für

Säurechloride dar, selbiges gilt für die basischen Zusätze, die entweder die

Hydrolyse/Alkoholyse unterstützten oder zur Bildung des entsprechenden primären Amids

O



führten. Trotz Eiskühlung und mehrfacher Nachdosierung der Säurechloridäquivalente

waren deshalb die Ausbeuten sehr gering (ab 6 %).

Bei Substanz LX wurde deshalb eine Weiterentwicklung des präparativen Vorgehens

vorgenommen: Das Edukt XLIII wurde dafür erst in Acetonitril suspendiert und

anschließend mit verdünnter Natronlauge versetzt. Diese löste den Feststoff unter

Ausbildung eines Zweiphasen-Systems. Acetonitril und Wasser sind eigentlich vollständig

miteinander mischbar, da aber durch das hochkonzentrierte Natriumtetrazolat eine hohe

Ionenstärke erreicht wurde, bildete sich eine Grenzschicht aus, welche die Acetonitril- und

die wässrige Phase von einander abtrennte. Die deutlich lipophileren Säurechloride

reicherten sich hingegen in der organischen Phase an. Da Acetonitril zu den nicht

protischen Lösungsmitteln gezählt wird, waren die Säurechloride weitestgehend vor

Hydrolyse/Alkoholyse geschützt. An der Grenzfläche kam es dann zur Reaktion mit dem in

der wässrigen Phase gelösten Edukt XLIII. Wahrscheinlich fand auch eine partielle

Hydrolyse statt, die höhere Ausbeute (56 %) und die Verwendung weniger Äquivalente

Säurechlorid sprachen aber für die Überlegenheit dieser präparativen Variante. Es galt

jedoch zu beachten, dass aus den abreagierten Säurechloriden bei Umsetzung äquimolare

Mengen an HCl freigesetzt wurden. Daher war es unter Umständen nötig, Natronlauge zu

ergänzen, um erneutes Ausfällen der Edukte zu verhindern.

Diese Technik sollte auch für Reaktionen mit dem an der Seitenkette um ein

Kohlenstoffatom verlängerten Edukt XLIV zum Einsatz kommen (Abb. 37 und Tab. 5). Bei

den verhältnismäßig lipophilen Derivaten LXIII und LXIV wiesen die Edukte 4-Methoxy- und

4-Brombenzoylchlorid keine ausreichende Löslichkeit mehr in Acetonitril auf. Durch einen

Austausch mit Tetrahydrofuran konnte auf diesen Befund reagiert und die negativen

Auswirkungen abgewendet werden. Tetrahydrofuran bildete ebenso wie Acetonitril trotz

eigentlicher Mischbarkeit mit Wasser auf Grund der hohen Salzkonzentration ein

Zweiphasen-System aus. Zumindest für das Bromderivat konnte mit dem

Lösungsmittelaustausch eine beachtliche Ausbeutensteigerung auf 82 % erreicht werden.

Abb. 37: Umsetzung von N-[4-(1H-Tetrazol-5-yl)pyridin-2-yl]propan-1,3-diamin-Hydrochlorid (XLIV) zu den entsprechenden Derivaten: i) Carbonsäure-, Sulfonsäure oder Kohlensäurechlorid, NaOH, Wasser/ACN/THF, Raumtemperatur, bis zu 24 h.



Tab. 5: Übersicht der dargestellten Derivate basierend auf N-[4-(1H-Tetrazol-5-yl)pyridin-2-yl]propan-1,3-diamin-Hydrochlorid (XLIV) mit jeweiligem Rest R.

Carbonsäureamide

LXI LXII LXIII LXIV

Sulfonsäureamide

LXV

Carbamate

LXVI LXVII

Neben der erfolgreichen Umsetzung der Diamin-Seitenketten zu Amiden oder Carbamaten,

sollte ebenfalls die freie Hydroxygruppe der Aminoalkohol-Seitenkette für weitere

Reaktionen adressiert werden. Die Bildung eines Esters fungierte dafür als eine Möglichkeit

(Abb. 38). Der Vorteil lag darin, dass das sehr hydrophile Molekül XLVI durch den unpolaren

Ester eine ausgeglichenere Polarität erhielt. Als nachteilig war die Hydrolyseempfindlichkeit

einzuschätzen. Da zum Zeitpunkt dieser Synthese die oben beschriebene Arbeitstechnik

unter Verwendung eines Zweiphasen-Systems noch nicht etabliert war und deshalb nur auf

eine Kaliumhydroxid-Lösung als Lösungsmittel zurückgegriffen wurde, war die Ausbeute

der Synthese entsprechend niedrig (3 %). Erst nach Vorliegen biologischer Testdaten sollte

entschieden werden, ob die Synthese einer ganzen Reihe von Estern des Typs LXVIII

sinnvoll wäre. Bei positiven Resultaten hätte dann mit der Zweiphasen-Arbeitstechnik ein

Weg zur Verfügung gestanden, mit welchem in kürzester Zeit eine Substanzbibliothek hätte

erstellt werden können.

Abb. 38: Derivatisierung von 2-{[4-(1H-Tetrazol-5-yl)pyridin-2-yl]amino}ethan-1-ol-Hydrochlorid (XLVI) zum entsprechenden Benzylester: i) Benzoylchlorid, KOH-Lösung, Raumtemperatur, 18 h.

Neben der Synthese der hydrolyselabilen Ester war auch die Darstellung verschiedener

Ether geplant. Die klassische Ethersynthese mit Natriumhydrid und Alkylbromid (modifiziert



nach Bream et al.200) im apolaren Lösungsmittel wurde dabei ebenso untersucht wie die

Umsetzung mit Iodmethan katalysiert durch Silber(I)-oxid201,202 (Abb. 39). Beide

Etherbildungen schlugen aber fehl, weshalb weiterhin versucht wurde, zwei Alkohole unter

Sulfonsäurekatalyse in einer Dean-Stark-Apparatur zu einem Ether zu kondensieren203.

Auch diese Synthese gestaltete sich nicht erfolgreich. Ein letzter Versuch wurde deshalb

mit dem Ziel unternommen, den Alkohol mittels Thionylchlorid zunächst in sein Alkylchlorid

umzuwandeln204. Dies gelang jedoch ebenfalls nicht. Allen diesen nicht wie geplant

verlaufenden Synthesen ist die Verwendung eines apolaren, nicht protischen

Lösungsmittels gemein. Das Edukt XLVI ist aber wie die Edukte XLIII und XLIV nahezu

unlöslich in aprotischen Lösungsmitteln und kann wie bereits beschrieben nur in basischem

Methanol oder Wasser gelöst werden. Diese Eigenschaft wurde als Hauptgrund für die

fehlgeschlagenen Etherbildungen in Betracht gezogen. Ein Alkylierungsversuch in

protischen Lösungsmitteln erschien jedoch als keine sinnvolle Alternative, da dort das

Alkylanz vor allem mit dem Lösungsmittel abreagieren würde. Weiterhin bestand die

interessante Fragestellung, ob es bei einer Alkylierung überhaupt zu einer Derivatisierung

des Alkohols oder eventuell doch des Tetrazols gekommen wäre. Dass sich Tetrazole leicht

alkylieren lassen, wird im weiteren Verlauf dieser Arbeit aufgezeigt.

Abb. 39: Fehlgeschlagene Synthese von Ethern und Azomethinen: i) Iodmethan, NaH/Ag2O, aprotisches Lösungsmittel, bis 100 °C, mehrere h; ii) Thionylchlorid, Toluen, Rückfluss, mehrere h; iii) entsprechender Aldehyd bzw. Keton (hier Propionaldehyd), ohne Lösungsmittel/MeOH/ACN/Dioxan, Raumtemperatur bis 120 °C, mehrere Tage, Mikrowellenreaktor.

Ähnliche Beobachtungen konnten bei der Umsetzung von XLIII mit Aldehyden oder

Ketonen gemacht werden (Abb. 39). Der Azomethinbildung, eine sehr pH-empfindliche

Reaktion wie Untersuchungen zeigten205, sollte eine Reduktion mit Natriumboranat

nachgestellt werden, um ein sekundäres Amin zu erhalten. Trotz großer Überschüsse an

Aldehyd/Keton und intensiver Energiezufuhr über den Mikrowellenreaktor gelang es nicht,

die Bildung eines Azomethins nachzuweisen. Es wurde daher auch probiert, methanolische

Suspensionen mit Natronlauge oder Salzsäure gerade so einzustellen, dass sich die Edukte



lösten, das pH-Optimum der Reaktion aber noch nicht verlassen wurde. Hierbei blieb der

Erfolg jedoch aus.

Daher kann zusammengefasst werden, dass die 4-(1H-Tetrazol-5-yl)pyridin-2-amine

und -thiole bzw. -thioether in großer Mannigfaltigkeit synthetisierbar waren. Die über die

Substitution mit Diaminen oder Aminoalkoholen neu eingeführte funktionelle Gruppe konnte

nach Optimierung der Reaktionsbedingungen für zahlreiche Acylierungen genutzt werden.

1.2.2.2 4-(1H-Tetrazol-5-yl)picolinamide

Der amphotere Charakter der Tetrazolylpyridine besaß einen eher negativen Einfluss vor

allem auf die Löslichkeit der Moleküle. Es war daher angebracht, neben den bislang

verwendeten +M-Substituenten auch solche einzubringen, die durch einen Elektronenzug

die basischen Eigenschaften des Pyridinstickstoffatoms abschwächen. Eine in Position 2

befindliche Carbonylkomponente übt einen –M- und –I-Effekt auf das Restmolekül aus und

kann damit einen Beitrag zur Herabsetzung der Basizität leisten.

Als zweckdienlich hatte sich dafür eine radikalische Alkoxycarbonylierung im Zweiphasen-

System erwiesen, welche als Abwandlung der Minisci-Reaktion aufgefasst werden kann206

(Abb. 40). Anders als in den vorherigen Synthesen kam als Edukt hierbei das

unsubstituierte Isonicotinnitril (LXXII) zum Einsatz. Mit Hilfe von Ethylpyruvat und der

Radikalstarterkombination aus Wasserstoffperoxid und Eisen(II)-sulfat wurde ein

Ethoxycarbonylradikal erzeugt, welches hauptsächlich das in Position 2 vorhandene Proton

substituierte. Heinisch und Lötsch gaben zu beachten, dass sowohl die Verhältnisse von

Peroxid zu Substrat, als auch die Volumina von Wasser und Dichlormethan eingehalten

werden müssen207-209. Zwar hätte die Empfehlung ein Verhältnis von 1:10 (Substrat zu

Peroxid) einzuhalten die besten Ausbeuten generieren sollen, auf Grund der

unökonomischen Verhältnisse wurde jedoch eine Substrat-Peroxid-Konstellation von 1:3

gewählt. Die damit erhaltene Ausbeute lag bei etwas mehr als 50 %. Hierbei liefen jedoch

kaum Nebenreaktionen ab, so dass weder Dimere noch doppelt substituierte Produkte

gefunden wurden. Die Aufreinigung beschränkte sich daher auf Basisanwendungen wie

Flüssig-Flüssig-Extraktion und Waschen mit Diethylether. Das so erhaltene in Position 2

modifizierte Derivat LXXIII konnte dann mit der etablierten Synthesemethode in sehr guten

Ausbeuten zum entsprechenden Tetrazol LXXIV umgesetzt werden.



Abb. 40: Syntheseschema für die 4-(1H-Tetrazol-5-yl)picolinamide: i) Ethylpyruvat, FeSO4∙7H2O, H2O2, H2SO4, Dichlormethan, Wasser, –5 °C, 30 min; ii) NaN3, TEA∙HCl, Toluen, 110 °C, 16 h; iii) Amin, Ethanol, 165-185 °C, bis zu 2 h, Mikrowellenreaktor; iv) NaOH, MeOH/Wasser, Rückfluss, 3 h; v) Amin, HATU, DIPEA, DMF, bis zu 50 °C, bis zu 24 h.

Tab. 6: Übersicht der dargestellten 4-(1H-Tetrazol-5-yl)picolinamide mit jeweiligem Rest R.

Carbonsäureamide aus Aminolyse Carbonsäureamide aus HATU-Kupplung

LXXVI

LXXX

LXXVII

LXXXI

LXXVIII

LXXIX

Die eingeführte Esterfunktion bot eine Grundlage für Umsetzungen mit Aminen zu

entsprechenden 4-(1H-Tetrazol-5-yl)picolinamiden (Tab. 6). Die direkte Aminolyse war

jedoch nur mit flüssigen und benzylischen oder aliphatischen Aminen im Überschuss unter

Einsatz des Mikrowellenreaktors möglich. Bereits bei dem Derivat LXXIX, dessen Edukt

4-(Thiophen-2-yl)benzylamin als Feststoff vorlag und nur etwas mehr als äquimolar



zugesetzt wurde, war eine Umsetzung kaum mehr durchführbar. Es konnte zwar das

gewünschte Produkt isoliert werden, allerdings reichte die erhaltene Menge gerade nur für

die Aufnahme eines 1H-NMR-Spektrums zur Überprüfung der Identität des Stoffes aus. Bei

einem eher elektronenarmen primären aromatischen Amin wie 2-Aminobenzimidazol

gelang die Aminolyse dann wie erwartet nicht mehr. Das Derivat LXXX sollte aber

dargestellt werden, da es nach theoretischen Betrachtungen interessante

Wasserstoffbrücken-Donoreigenschaften und -Akzeptoreigenschaften erwarten ließ210. Um

dieses Ziel zu erreichen, musste deshalb eine alternative Syntheseroute gesucht und

beschritten werden.

Diese Herausforderung wurde erneut unter Zuhilfenahme eines Kupplungsreagenzes

angegangen (Abb. 40). Dafür musste als erstes die freie Säure LXXV durch Esterhydrolyse

hergestellt werden. Diese wurde mit methanolischer Natronlauge unter Rückfluss mit

nahezu quantitativen Ausbeuten durchgeführt. Die anschließende Kupplung fand dann mit

O-(7-Azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N′,N′-tetramethyluronium-hexafluorphosphat (HATU, Abb.

41) statt (modifiziert nach Dakin et al.211). Bei dieser Synthese greift das Carboxylat von

LXXV (deprotoniert durch die Hilfsbase DIPEA) den Uronium-Teil von HATU nucleophil an

und bildet dabei ein acyliertes und geladenes Isoharnstoffderivat aus. Dieses wird rasch

von dem entstandenen 7-Azabenzotriazol-1-olat zu einem Aktivester umgesetzt, wobei

Tetramethylharnstoff als Nebenprodukt generiert wird. Der Aktivester steht dann zur

weiteren Umsetzung mit einem Amin oder Alkohol zur Verfügung212,213.

Durch die Verwendung von HATU konnte das Benzimidazolderivat LXXX wie angestrebt

synthetisiert werden. Die Ausbeute von nur 8 % war der aufwendigen Aufreinigung

geschuldet und spiegelte nicht die gute Umsetzung wider. Mit dem Butylderivat LXXXI

konnte noch ein zweites Produkt unter Zuhilfenahme von HATU hergestellt werden.

Abb. 41: O-(7-Azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N′,N′-tetramethyluronium-hexafluorphosphat (HATU) (gezeigt ist die Uronium-Form, eine Guanidinium-Form ist ebenfalls beschrieben)

Die dargestellten 4-(1H-Tetrazol-5-yl)picolinamide zeigten wie vermutet eine bessere

Löslichkeit in diversen Lösungsmitteln. So war es möglich, die NMR-Spektren komplett in

DMSO-d6 aufzunehmen, so dass diese nicht wieder umständlich als Na+-Salz in D2O

vermessen werden mussten. Diese Tatsache ist sehr wahrscheinlich der Absenkung der

Basizität des Pyridinstickstoffatoms zu verdanken. Die coplanare Anordnung des

Tetrazolylpyridins ist nach wie vor gegeben und wurde sogar um das sp2-hybridisierte

Kohlenstoffatom des Carbonsäureamids erweitert. Eventuell kann das Sauerstoffatom



dieser Gruppe sogar dafür genutzt werden, um zusammen mit dem Pyridinstickstoffatom

einen Chelatkomplex mit dem katalytischen Eisen-Kation der KDM4-Enzymreihe zu bilden.

Sollte sich dieser Befund in den biologischen Testungen erhärten, stünde mit der Aminolyse

oder der HATU-Kupplung ein etablierter Weg zur Verfügung, um zügig neue Derivate mit

diversen Seitenketten zu synthetisieren.

1.2.2.3 4-(1H-Tetrazol-5-yl)pyridin-2-hydroxamsäure

Trotz ähnlicher Synthesewege von 4-(1H-Tetrazol-5-yl)pyridin-2-hydroxamsäure und der

4-(1H-Tetrazol-5-yl)picolinamide, muss die Darstellung in einem gesonderten Unterkapitel

behandelt werden, da hinsichtlich Polarität und Komplexierungseigenschaften zum Teil

ausgeprägte Unterschiede existieren.

Als Edukte standen wieder der Ester LXXIV und die Carbonsäure LXXV zur Verfügung

(Abb. 42). In der Patentliteratur war die Synthese einer Pyridin-2-hydroxamsäure

ausgehend von dem entsprechenden Ester beschrieben214. Die Umsetzung mit wässriger

Hydroxylamin-Lösung sollte von katalytischen Mengen Kaliumcyanid profitieren. Bei dem

Versuch, diese Vorschrift auf das hier vorgestellte Molekül zu übertragen, konnten jedoch

lediglich die Ausgangsstoffe zurückgewonnen werden. Aus diesem Grund wurde sich einer

Methode bedient, bei welcher die Carbonsäure mit Hilfe von Oxalylchlorid in das

entsprechende Carbonsäurechlorid übergeführt wurde215. Hierbei kam jedoch

Dichlormethan als Lösungsmittel zum Einsatz, in dem die Pyridincarbonsäure LXXV

erwartungsgemäß als kleines und sehr polares Molekül nahezu keine Löslichkeit zeigte.

Deshalb wurde ein Austausch des Lösungsmittels notwendig. In Dimethylformamid war

LXXV ausreichend gut löslich, da Dimethylformamid aber selber mit Oxalylchlorid reagieren

konnte, stellte diese Wahl nur einen Kompromiss dar. Anhand bläulich-grüner

Verfärbungen während der Synthese ließen sich die Nebenreaktionen optisch verfolgen.

Abb. 42: Die Synthese von 4-(1H-Tetrazol-5-yl)pyridin-2-hydroxamsäure gelang nur durch Umsetzung des korrespondierenden Säurechlorids: i) NH2OH-Lsg., KCN, THF/MeOH, bis 40 °C, 28 h; ii) Oxalylchlorid, NH2OH∙HCl, DIPEA, DMF, Raumtemperatur, 18 h.

Die nach Fällung mit Salzsäure notwendige Säulenchromatographie zeigte die wohl

markanteste Eigenschaft der Hydroxamsäuren auf: Es kam zu einer Violettfärbung des

Zielprodukts noch während der chromatographischen Aufarbeitung, womöglich durch

Schwermetallspuren im Kieselgel. Diese für Hydroxamsäuren typische Färbung von deren



Komplexen mit vielen Metallkationen kann zur Analytik und das Konzept der Chelatisierung

mittlerweile auch zur Therapie genutzt werden. Durch Umkristallisation aus Wasser wurde

dann aus dem gefärbten Rohprodukt ein ausreichend reines Endprodukt erhalten.

Dass es sich bei Hydroxamsäuren oftmals um promiskuitive Liganden vieler

Metalloenzyme, sogenannte „Dirty Drugs“, handelt, ist durchaus verständlich, da prinzipiell

viele unterschiedliche Kationen adressiert werden können. Im Falle der schon

besprochenen Histon-Desacylase-Hemmer scheint es aber durch einen spezifischen

Aufbau möglich zu sein, eine gewisse Selektivität zu erreichen, obgleich mit ähnlichen

Strukturen auch DNA-Methyltransferasen inhibiert werden konnten216,217. In der

Fachinformation zu Panobinostat, einem in Deutschland zugelassenen HDAC-Inhibitor für

Patienten mit rezidiviertem und/oder refraktärem Multiplen Myelom, heißt es218: „Die

Behandlung von Tumorzellen mit Panobinostat führte zu einem dosisabhängigen Anstieg

der Acetylierung der Histone H3 und H4 sowohl in vitro als auch in präklinischen Xenograft-

Tiermodellen, was auf eine zielgerichtete Hemmung hinweist.“ Die allgemeine Aussage,

dass es sich bei Hydroxamsäuren immer um unselektive Inhibitoren handeln muss, scheint

mittlerweile nicht mehr haltbar zu sein.

Ob die hier vorgestellte 4-(1H-Tetrazol-5-yl)pyridin-2-hydroxamsäure einen inhibierenden

Einfluss auf die KDM4-Enzymreihe zeigen konnte, sollte durch biologische Tests geklärt

werden. Bei positiven Befunden bleibt die Frage nach der Selektivität aber unausweichlich.

1.2.2.4 [4-(1H-Tetrazol-5-yl)pyridin-2-yl]methanamine

Neben den bisher vorgestellten Tetrazolylpyridinen, welche an Position 2 direkt mit einem

Hetero- oder einem Carbonylkohlenstoffatom verknüpft waren, sollten im Folgenden

Strategien entwickelt werden, um eine Methylengruppe als Spacer zwischen Pyridinring

und einem neu eingeführten Stickstoffatom zu integrieren. Als Grundlage dieser

Betrachtung dienten zahlreiche, bereits eingangs erwähnte Inhibitoren mit Pyridin-4-

carbonsäure-enthaltenden Strukturen vor allem aus der Patentliteratur. Diese wiesen in der

Regel IC50-Werte im einstelligen mikromolaren Bereich gegen verschiedene Vertreter der

KDM4-Enzymreihe auf. Die Methylenbrücke verhindert eine weitere Beteiligung des freien

Elektronenpaares des eingeführten Heteroatoms am mesomeren System des Pyridins. Die

Auswirkungen auf physikochemische Eigenschaften wie Wasserlöslichkeit und

Acidität/Basizität sollten auch deshalb untersucht werden, weil die bisher dargestellten

4-(1H-Tetrazol-5-yl)pyridin-2-amine eine generell schlechte Löslichkeit zeigten.

Die Einführung der Methylengruppe wurde über verschiedene Wege realisiert. Für die

Synthese des nicht weiter derivatisierten [4-(1H-Tetrazol-5-yl)pyridin-2-yl]methanamins

(LXXXVIII) gelang dies nach zahlreichen Optimierungsversuchen mit einem Austausch



eines Chlorsubstituenten gegen eine Cyanogruppe mit anschließender Reduktion (Abb.

43).

Abb. 43: Syntheseschema für [4-(1H-Tetrazol-5-yl)pyridin-2-yl]methanamin (LXXXVIII): i) u. a. CuCN, NMP, 240 °C, 30 min, Mikrowellenreaktor; ii) Tritylchlorid, TEA, THF, Raumtemperatur, 17 h; iii) Zn(CN)2, Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0), DMF, 160-190 °C, 20-30 min, Mikrowellenreaktor; iv) Benzylbromid, K2CO3, Aceton, 50 °C, 1,5 h; v) H2, Pd/C, MeOH, Raumtemperatur, 24h.

Die Cyanierung eines Bromaromaten wurde bereits in Abschnitt 1.2.1.1 diskutiert und stellte

eine gewisse Herausforderung dar. Bei dem Edukt XXXV handelte es sich aber um einen

elektronenarmen Aromaten, welcher zusätzlich in Position 2 mit einem Chloratom eine

verhältnismäßig gute Abgangsgruppe besaß. Ein Austausch im Sinne einer klassischen

SNAr lag deshalb nahe. Zusätzlich wurden weiterhin die Bedingungen der ebenfalls schon

erwähnten Rosenmund-von-Braun-Reaktion angewendet. Überraschenderweise konnte

damit kein Zielprodukt erhalten werden. Da jedoch CN– ein gutes Nucleophil darstellte,

wurde die Vermutung gestützt, dass 2-Chlor-4-(1H-tetrazol-5-yl)pyridin für die nucleophile

aromatische Substitution nicht mehr zugänglich war. Um die Aktivierungsenergie zu

senken, wurden deshalb unter anderem zwei Katalysatoren eingesetzt:

Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0) mit Kaliumcyanid als Cyanidquelle219 und

BrettPhos Pd G3, welches Palladium in der Oxidationsstufe +2 enthielt, in Kombination mit

Kaliumhexacyanidoferrat(II)220. Weiterhin wurde auch beachtet, dass sich Katalysatoren-

deaktivierender Cyanwasserstoff aus der Reaktion von saurem Tetrazol und der

Cyanidquelle bilden konnte. Deshalb wurden die Experimente auch mit dem

N Cl

N

NN

HN

i

N

N

NN

HN

N

N Cl

N

NN

N

ii

N Cl

N

NN

N

iv

iii

N

N

NN

N

N

iii

N

N

NN

N

NN

N

NN

HN

NH2

v

XXXV

LXXXIV LXXXV

LXXXIII

LXXXVI LXXXVII LXXXVIII



entsprechenden Natriumtetrazolat durchgeführt. Es war jedoch nicht möglich, das cyanierte

Derivat LXXXIII zu synthetisieren. Neben Spuren von Wasser, welche zur Protonierung von

Cyanidionen geführt haben könnten, durfte weiterhin die Cyanidquelle nicht im Überschuss

eingesetzt werden, da sich dies negativ auf die Umsetzung ausübte129. Eine andere

mögliche Ursache für das Scheitern der Reaktion lag in der Koordinierungsbereitschaft des

Tetrazols. Palladium-haltige Tetrazolkomplexe sind bekannt und verhältnismäßig leicht

herzustellen221. Es war daher nicht auszuschließen, dass die eingesetzten Palladium-

Liganden-Kombinationen zu nicht katalytisch wirkenden Palladium-Tetrazol-Komplexen

umgesetzt wurden. Mit einer Alkylierung des Tetrazolrings würde die Fähigkeit zu

Koordinierung an Metalle stark eingeschränkt werden, weshalb die Suche nach einer

passenden Schutzgruppe an dieser Stelle unausweichlich wurde.

Getestet wurden hierzu zum einen die Triphenylmethyl- (Trityl-) und zum anderen die

Benzyl-Gruppe (Bn). Beide Reste konnten durch klassische Alkylierungsreaktionen mit den

jeweiligen Chloriden oder Bromiden und einer Hilfsbase zum Abfangen des substituierten

Protons eingefügt werden. Der Austausch mit der sperrigen Trityl-Gruppe erfolgte mit nur

mäßigen Ausbeuten von etwa 25 % (modifiziert nach Nisnevich et al.222). Ein Grund hierfür

könnte die Durchführung der Umsetzung bei Raumtemperatur gewesen sein, wobei durch

Erhitzen eventuell die Ausbeuten hätten gesteigert werden können. Dieser Punkt erschien

aber unerheblich, da beim Einfügen der Cyanidgruppe eine unerfreuliche Beobachtung

gemacht wurde: Statt des derivatisierten Pyridins wurde Tritylcyanid als Hauptprodukt

erhalten. Dementsprechend ließ sich schlussfolgern, dass die Trityl-Schutzgruppe an

Tetrazolen sehr empfindlich gegenüber nucleophilen Angriff reagierte und somit ungeeignet

für die gegebene Fragestellung war. Dieser Befund wurde auch von bisherigen

Untersuchungen im Arbeitskreis gestützt, da es bereits bei der Umkristallisation aus

Methanol zur Umsetzung des Trityl-geschützten Tetrazols zum Methylether des

Triphenylmethans kam113.

Die Benzyl-Schutzgruppe entwickelte sich klassischerweise aus dem Kontext der

Alkoholfunktionen und schützt diese als benzylischen Ether223. Die Entschützung kann

unter Palladium-katalysierten, reduktiven Bedingungen mit Wasserstoff erfolgen und hat

damit gleichzeitig den Vorteil, dass das Nitril zum entsprechenden Amin umgesetzt werden

kann224. Somit können Abspaltung der Schutzgruppe und der letzte geplante

Reaktionsschritt unter denselben Bedingungen und damit auch in einem Ansatz

abgehandelt werden (Abb. 43).

Da Tetrazole in einem Tautomerengemisch von 1H- und 2H-Isomer vorliegen, sind

folgerichtig auch Alkylierungen an Position 1 und 2 möglich. Moutevelis-Minakakis et al.

publizierten eine Benzylierung eines C-substituierten Tetrazols mit Hilfe von Benzylbromid

und Kaliumcarbonat in Aceton225. Die Autoren gingen in ihrer Arbeit ausschließlich von einer

Alkylierung in Position 1 des Tetrazols aus. Im Gegensatz dazu zeigten Nelson et al., dass



Alkylierungen in Acetonitril mit Triethylamin zu einem Regioisomerengemisch führte226. Es

sind ferner systematische Untersuchungen vorhanden, die verdeutlichten, dass die

entsprechenden Reste an Position 1 und 5 der Tetrazole ausschlaggebend für die

Verhältnisse der Produkte waren227. Eine Umsetzung mit Benzylalkohol im stark Sauren

sollte ausschließlich zu einer Alkylierung an Position 2 führen228. Um ein isomerenreines,

selektiv an Position 1 alkyliertes Produkt zu erhalten, könnte beispielsweise von einem

N-Benzylamid ausgegangen werden229.

Anmerkung: Aus Gründen der Übersicht werden in dieser Arbeit nur die

Alkylierungsprodukte der 1H-Tetrazoltautomere aufgezeigt. Der Sinn einer

Schutzgruppe besteht darin, Reaktionen zu ermöglichen, die ohne diese nicht oder

nur schlecht durchführbar sind, oder um Nebenreaktionen zu vermeiden. Da es in

der Natur einer Schutzgruppe liegt, in späteren Reaktionsschritten wieder aus dem

Molekül entfernt zu werden, erschien eine röntgenkristallographische Untersuchung

als nicht zwingend notwendig. Aus den NMR-Spektren wird das Alkylierungsmuster

nicht deutlich, es wurde aber stets nur mit einem Regioisomer gearbeitet.

Wie bei der benannten Alkylierung nach Moutevelis-Minakakis et al. konnte nach der

Flüssig-Flüssig-Extraktion mit Ethylacetat und verdünnter Natronlauge nur ein alkyliertes

Produkt durch dünnschichtchromatographische Kontrolle aufgefunden werden. Dieses

wurde zwar noch weiter säulenchromatographisch gereinigt, aber nur um noch

überschüssiges Benzylbromid und farbige Nebenprodukte zu entfernen. Dementsprechend

wurde offenbar kein Regioisomerengemisch erhalten, was für die weiteren

Reaktionsschritte einen positiven Aspekt darstellte.

Die weitere Umsetzung gestaltete sich ebenfalls erfolgreich, wenn gleich nur mit mäßigen

Ausbeuten. Die Substitution des Chloratoms von LXXXVI gegen eine Cyanogruppe

funktionierte mit Kupfer(I)-cyanid bei hohen Temperaturen nur in Spuren. Besser gelang

die Variante mit Zinkcyanid und Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0) im

Mikrowellenreaktor230-232. Limitierend hierbei waren aber zum einen die hohen Kosten des

Katalysators, der zwar nur zu 5 mol%, aber aufgrund der großen molaren Masse bis zu

200 mg je Ansatz zugesetzt wurde. Zum anderen konnte die Ausbeute von knapp 25 %

nicht weiter gesteigert werden, obwohl unter anderem längere Reaktionszeiten bei höheren

Temperaturen und eine Erhöhung der Katalysatormenge ausprobiert wurden.

Die darauffolgende Reduktion des Nitrils und die gleichzeitige Abtrennung der

Schutzgruppe wurden dann mit Wasserstoff und Pd/C in Methanol mit einer Ausbeute von

knapp 50 % realisiert. Bei der Aufreinigung zeigte sich erneut, dass der amphotere

Charakter, welcher bei der benzylierten Vorstufe aufgrund der fehlenden Acidität des

Tetrazols nicht gegeben war, zu negativen Einflüssen auf die chromatographischen



Eigenschaften in Form von starkem Tailing führte. Trotzdem konnte das eigentliche

Zielmolekül [4-(1H-Tetrazol-5-yl)pyridin-2-yl]methanamin (LXXXVIII) synthetisiert werden

und stünde theoretisch für weitere Kettenverlängerungen über das mit einer

Methylenbrücke verknüpfte primäre Amin zur Verfügung. Die Gesamtausbeute von etwa

8 % für alle drei Schritte reichte praktisch aber nicht annähernd, um eine genügende Menge

an Ausgangsstoff bereitzustellen, um die geplanten Derivate zu synthetisieren. Aus diesem

Grund wurden drei neue Synthesewege entwickelt, welche im Folgenden vorgestellt

werden sollen (Abb. 44).

Abb. 44: Geplante Syntheserouten für [4-(1H-Tetrazol-5-yl)pyridin-2-yl]methanamin-Derivate: i) Reduktion von 4-(1H-Tetrazol-5-yl)picolinamiden; ii) reduktive Aminierung von 4-(1H-Tetrazol-5-yl)picolinaldehyd; iii) nucleophile Substitution von Sulfonaten ausgehend von [4-(1H-Tetrazol-5-yl-pyridin-2-yl)methanol.

Eine alternative Möglichkeit stellte die Reduktion der Carbonsäureamide der zum Teil

bereits vorhandenen Picolinamide dar. Grundlegendes Problem hierbei war die überaus

schlechte Löslichkeit der Stoffe in Lösungsmitteln wie Diethylether oder Tetrahydrofuran.

Carbonsäureamide sind verhältnismäßig stabil gegenüber reduktiven Angriffen und

benötigen daher starke Reduktionsmittel wie beispielsweise Lithiumalanat. Da protische

Lösungsmittel gänzlich ungeeignet für die Reduktion mit Lithiumalanat sind, wird

üblicherweise ein aliphatischer Ether als Lösungsmittel benutzt233-235.

Diese Reaktionsbedingungen kamen bereits bei den Verbindungen LVII und LXI zum

Einsatz, wobei die Amide an den Seitenketten zu den entsprechenden sekundären Aminen

reduziert werden sollten. Wahrscheinlich auf Grund der Löslichkeit schlug dieser Versuch

jedoch fehl. Auch eine fortlaufende Benutzung einer Soxhlet-Apparatur über 96 Stunden,

welche das Lösungsmittel kontinuierlich recyclierte, ermöglichte es nicht, das gewünschte

reduzierte Amid zu erhalten. Bei der Reduktion der Verbindungen LVII und LXI kamen

sowohl Aluminiumchlorid als katalytisch wirkende Lewis-Säure236, als auch der polarere

Bis(2-methoxyethyl)ether (Diglyme) mit komplexierenden Eigenschaften237 erfolglos zum



Einsatz. Eine Teilumsetzung konnte bei der Verwendung von (Di-)Boran beobachtet

werden, welches zweckdienlich aus Natriumboranat und elementarem Iod in

Tetrahydrofuran in situ hergestellt wurde238. Der resultierende Boran-Tetrahydrofuran-

Komplex ist ein effektives Reduktionsagenz und vermag auch Amide zu reduzieren239.

Jedoch gelang es nicht, die intermediären Boran-Amin-Komplexe so zu spalten, dass das

gewünschte Amin isoliert werden konnte. Stattdessen wurde das ursprüngliche Amid

erhalten. Die Reduktion mit dem BH3-THF-Komplex war also geprägt durch die

Reversibilität der einzelnen Reaktionsschritte240, was die Umsetzung generell schwierig

gestaltete.

Da es immer wieder zu Schwierigkeiten vor allem auf Grund der Löslichkeit (Amphoterie)

kam und Erfahrungen zur Tetrazolalkylierung bereits vorlagen, wurde auch bei dem Edukt

LXXIV das acide Tetrazolproton gegen eine Benzylgruppe substituiert (Abb. 45). Nach

Aufbereitung durch Flüssig-Flüssig-Extraktion mit Ethylacetat und Kaliumcarbonat-Lösung

konnte im Übrigen wieder nur ein Regioisomer mittels Dünnschichtchromatographie

nachgewiesen werden.

Abb. 45: Benzylierung von 4-(1H-Tetrazol-5-yl)picolinsäureethylester (LXXIV): i) Benzylbromid, K2CO3, Aceton, Rückfluss, 2 h.

Das resultierende Benzyltetrazolderivat LXXXIX besaß nun eine ausreichend hohe

Lipophilie, um in vielen aprotischen Lösungsmitteln solvatisierbar zu sein. LXXXIX konnte

anschließend in sehr guten Ausbeuten einer weiteren Aminolyse unterzogen werden, um

die Morpholin-enthaltende Verbindung XC zu generieren (Abb. 46).

Die direkte Überführung in das korrespondierende Amin XCII mit Hilfe von Lithiumalanat

schlug allerdings auch hier fehl. Löslichkeitsprobleme konnten nun nicht mehr die Ursache

für den Misserfolg darstellen, da eine klare Lösung des Edukts XC in Tetrahydrofuran

vorlag. Die Vermutungen gingen eher dahin, dass das verwendende Lithiumalanat trotz

Lagerung im Exsikkator schon partiell hydrolytisch zersetzt worden war. Bei der Reaktion

mit Wasser kam es zwar zur Gasentwicklung, jedoch nicht annähernd in der heftigen Weise,

wie es in den Sicherheitsdatenblättern erwähnt wird. Da die Zielmoleküle jedoch später

über andere Wege erzielt werden konnten, wurden keine weiteren Untersuchungen mit

Lithiumalanat mehr vorgenommen.



Abb. 46: Reduktion eines Amids mit Hilfe von PCl5 und NaBH4: i) 3-Morpholinopropylamin, EtOH, 55 °C, 72 h; ii) LiAlH4, THF, Rückfluss, 24 h; iii) PCl5, DCM, Rückfluss, 5 h; iv) NaBH4, EtOH, 0 °C-Rückfluss, 45 min; v) H2, Pd/C, MeOH, 35 °C, 6 h.

Da sich mittlerweile einige Reduktionsmöglichkeiten verschiedener Amide in dieser Arbeit

als sehr zeitintensiv und erfolglos herausgestellt hatten, sollte eine letzte und eher weniger

bekannte Variante auf ihre Eignung untersucht werden. Carbonsäureamide können auch

mit dem in protischen Lösungsmitteln verhältnismäßig stabilen Reduktionsmittel

Natriumboranat in guten Ausbeuten reduziert werden, wenn sie vorher durch ein

Chlorierungsagenz wie Phosphoroxychlorid241 oder Phosphorpentachlorid242 „aktiviert“

wurden. Diese Chlorierungen fanden überwiegend in Dichlormethan durch Erhitzen unter

Rückfluss statt. Das resultierende Chloriminium-Ion (auch als Vilsmeier-Komplex bekannt)

war ausreichend reaktiv, um in Ethanol mit Natriumboranat oder auch elementarem Zink

reduziert zu werden243. Eine gesonderte Isolierung der Spezies war nicht vorgesehen, es

wurde lediglich das Lösungsmittel im Teilvakuum entfernt. Der Rückstand konnte dann in

Ethanol aufgenommen und anschließend erfolgreich zum sekundären Amin reduziert

werden. Die Rohausbeute von etwa 35 % wäre dann als ausreichend angesehen worden,

wenn die Entschützung des Tetrazols quantitativ verlaufen wäre. Da es hier allerdings zu

einer noch geringeren Ausbeute kam, konnte gerade nur so viel Zielprodukt XCIII isoliert



werden, dass die Analytik vervollständigt und eine ausreichende Menge für die biologische

Testung zur Verfügung gestellt werden konnte. Damit stellte dieser Weg zwar die erste

erfolgreiche Reduktion einen Amids mit Tetrazolylpyridin-Grundstruktur in dieser Arbeit dar,

gleichermaßen musste aber auch festgestellt werden, dass die Ausbeuten nicht optimal

waren. Ferner ging die Diversität der Syntheseroute dahingehend verloren, dass erst jedes

einzelne Picolinamid hergestellt werden musste. Eine Aufzweigung des Synthesewegs erst

auf letzter oder vorletzter Stufe wäre für die Effizienz in Hinblick auf die Darstellung einer

Substanzbibliothek wünschenswert gewesen. Es wurde daher beschlossen, vergleichbare

Reduktionen anderer Amide nicht weiter zu verfolgen.

Stattdessen erfolgten Experimente, die eine nucleophile Substitution am Aliphaten

vorsahen, um die entsprechenden [4-(1H-Tetrazol-5-yl)pyridin-2-yl]methanamin-Derivate

zu erhalten (Abb. 44, Weg iii). Durch das Überführen einer Alkoholfunktion in einen

Sulfonsäureester, sollte letzteres als gutes Nucleofug genutzt werden, um eine Substitution

mit einem Amin zu ermöglichen. Hierbei würde erst im letzten Schritt eine Verzweigung des

Synthesewegs erfolgen, eine hohe Diversität der so darstellbaren Produkte wäre also

gegeben.

Eine Besonderheit von 4-(1H-Tetrazol-5-yl)picolinsäureethylester (LXXIV), welche auch die

Grundlage des hier beschriebenen Wegs der nucleophilen Sulfonatsubstitution

mitbegründete, ist die spezielle Reduktionsanfälligkeit der Esterfunktion. Diese ist an

Position 2 des Pyridinrings lokalisiert und damit einem starken Elektronenzug ausgesetzt.

Dadurch kommt es zu einer Intensivierung der ohnehin vorhandenen positiven

Polarisierung des Carbonylkohlenstoffatoms, welches auf Grund dessen von dem

verhältnismäßig milden Reduktionsmittel Natriumboranat angegriffen werden kann. Der

Vorteil von Natriumboranat wiederum ist seine Stabilität gegenüber protischen

Lösungsmitteln. Es war hierbei also nicht notwendig, den Ester LXXIV mit einer

Schutzgruppe zu derivatisieren. Stattdessen konnte dieser direkt in einem Tetrahydrofuran-

Methanol-System mit Natriumboranat in guten Ausbeuten zum korrespondieren Alkohol

XCIV umgesetzt werden (Abb. 47).

Die Reduktion von an Elektronenmangelaromaten lokalisierten Carbonsäureestern wäre

auch in anderen Medien als in einem Tetrahydofuran-Methanol-Gemisch möglich

gewesen244,245. Es wurde ebenfalls eine Kombination aus Dioxan und Wasser

ausprobiert246. Hierbei kam es allerdings durch den basischen pH-Wert, verursacht durch

die partielle Hydrolyse von Natriumboranat zu Natriumhydroxid im Wässrigen, auch zu einer

Esterhydrolyse. Die freie Säure ließ sich von dem ebenfalls sehr polaren Alkohol nur schwer

abtrennen, weshalb das wasserfreie Medium zu bevorzugen war. Mit Polyethylenglycol 400

stünde dafür ein geeignetes Lösungsmittel zur Verfügung247.



Abb. 47: Syntheseschema für [4-(1H-Tetrazol-5-yl)pyridin-2-yl]methanamin-Derivate über eine nucleophile Substitution von Sulfonaten: i) NaBH4, THF/Methanol, Rückfluss, 20 h; ii) Methansulfonylchlorid oder Tosylchlorid, TEA, 4-DMAP, THF/DMF, 0 °C-Raumtemperatur, bis zu 36 h (Intermediate nicht isoliert); iii) entsprechendes Amin, DMF, 60-80 °C, bis zu 72 h.

Die Hydrophilie des Alkohols XCIV erwies sich hingegen bei dem Schritt der Darstellung

des Sulfonsäureesters als hinderlich. In Tetrahydrofuran kam es lediglich zu einer

Suspendierung, erst durch Zugabe von Dimethylformamid wurde eine nahezu feststofffreie

Lösung erhalten. Bedingt durch die Ergänzung von Dimethylformamid kam es aber

wahrscheinlich zu Nebenreaktionen, welche auch durch Zugabe des Katalysators 4-DMAP

nicht verhindert werden konnte.

Es war nicht vorgesehen, die empfindlichen Sulfonate zu isolieren, dennoch wurde ein

Versuch unternommen, diese auf Grund der entstandenen Nebenprodukte mittels

Säulenchromatographie aufzureinigen. Der Beweis, dass es sich um reaktive Intermediate

handelte, wurde auch direkt erbracht, da nach Eluieren über Kieselgel kein

Zwischenprodukt mehr gefunden werden konnte. Es kam wohl zu einer Reaktion bereits

während der Chromatographie, was jedoch als Beweis dafür gesehen wurde, dass das

gewünschte Sulfonat vorlag.

Das ungereinigte Sulfonat konnte alternativ direkt durch Zugabe eines entsprechenden

Amins als Eintopfsynthese zum sekundären Amin umgesetzt werden (modifiziert nach

Chelucci et al.248). Vier Derivate waren in Planung (Tab. 7), wobei die Umsetzung mit

Vertretern von aliphatischen, benzylischen und primären aromatischen Aminen erprobt

wurde. Nur mit den 3-Aminochinolin- und 4-Fluorbenzylamin-Substituenten konnte das

gewünschte Produkt erhalten werden. Allerdings waren die Ausbeuten der Reaktion so

gering, dass die erhaltene Menge nur für eine vollumfängliche Analytik der Stoffe

N

N

NN

HN

O

O

LXXIV

N

N

NN

HN

OH

iii

N

N

NN

HN

OS

O

O

i

N

N

NN

HN

OS

O

O

N

N

NN

HN

HN

R

ii

XCIV

XCV

XCVI



ausreichte. Über diesen Weg war es jedoch nicht möglich, genügend Substanz für eine

biologische Testung zur Verfügung zu stellen. Bei der Reaktion mit 3-Aminopropan-1-ol und

3-Picolylamin konnte überhaupt kein Zielprodukt isoliert werden.

Tab. 7: Übersicht der Derivate mit [4-(1H-Tetrazol-5-yl)pyridin-2-yl]methanamin-Grundstruktur hergestellt über den Sulfonsäureester-Weg mit jeweiligem Rest R.

Erfolgreiche Substitution Fehlgeschlagene Substitution

XCVII XCIX

XCVIII C

Einen möglichen Grund für die niedrigen Ausbeuten stellte die aufwendige Aufreinigung

dar. Dadurch, dass sich bereits bei der Veresterung Nebenprodukte bildeten, konnten diese

dann ebenfalls mit dem Amin weiterreagieren. Eine Abtrennung der Zielprodukte war daher

aufwendig und nur mit zwei aufeinanderfolgenden chromatographischen Verfahren

möglich. Der eingangs erwähnte Vorteil der Reduktionsmöglichkeit des Edukts in Methanol

und damit auch die Abwesenheit einer Schutzgruppe am Tetrazolring führte dazu, dass die

Löslichkeit im zweiten Schritt des Sulfonsäureester-Wegs nicht mehr ausreichend war, um

auf Dimethylformamid als Lösungsmittel verzichten zu können. Somit wäre folglich eine

Benzylierung auch hier eventuell sinnvoll gewesen, um nicht nur die Nebenreaktion zu

begrenzen und damit die Ausbeuten zu steigern, sondern auch um eine größere Vielfalt an

Derivaten zu ermöglichen.

An dieser Stelle kann zusammengefasst werden, dass es mit den bisher vorgestellten

Wegen der Amidreduktion und der nucleophilen Substitution von Sulfonsäureestern nicht

möglich war, eine ausreichende Anzahl und Menge an gewünschten [4-(1H-Tetrazol-5-

yl)pyridin-2-yl]methanamin-Derivate zu gewinnen. Diese Struktur ist aber in Hinblick auf die

Inhibition der KDM4-Enzymreihe äußerst vielversprechend und sollte daher nicht verworfen

werden. In der Patentliteratur wird häufig mit einer reduktiven Aminierung gearbeitet (u. a.

in98), um entsprechende methylenverbrückte Amine zu erhalten. Ob diese Methode auch

auf die hier präsentierten Tetrazolylpyridine übertragbar war, soll im Folgenden erläutert

werden (Abb. 44, Weg ii).

Dafür musste im ersten Schritt der entsprechende Ester selektiv zum korrespondieren

Aldehyd reduziert werden. Erfahrungen aus dem Sulfonsäureester-Weg zeigten, dass eine

Reaktion mit Natriumboranat in methanolischer Lösung bereits zur Reduktion bis zum

Alkohol führte. Ein selektiveres Reduktionsmittel stellt hingegen Diisobutylaluminiumhydrid



(DIBAL, Abb. 48) dar. Durch die sperrigen Substituenten soll ein Mehrfach-Angriff auf das

Ester-Carbonylkohlenstoffatom verhindert und damit eine Weiterreduktion zum Alkohol

vermieden werden. Üblicherweise erfolgt die Reaktion bei tiefen Temperaturen (bis –75 °C)

in Toluen249 oder Tetrahydofuran250,251. Die Verwendung dieser Lösungsmittel machte es

erforderlich, dass hier wieder mit der benzylgeschützten Verbindung LXXXIX gestartet

werden musste, um eine ausreichende Löslichkeit zu garantieren und um

Neutralisationsreaktionen mit dem basisch reagierenden DIBAL zu unterbinden. Nach

einigen Versuchen konnten dann die optimalen Bedingungen für die Reduktion zum

Aldehyd CI gefunden werden (Abb. 48). Die Reaktionstemperatur wurde mit einem

Ethylacetatbad kontrolliert, welches mit flüssigem Stickstoff bis kurz über den Schmelzpunkt

(–83 °C) heruntergekühlt wurde. An Stelle der vorgeschlagenen vier Äquivalente DIBAL

(nach Swahn et al.251) wurden nur drei Äquivalente benutzt. Theoretisch konnte dieser

Überschuss bereits ausreichen, um eine Weiterreduktion zu initiieren. Wahrscheinlich auf

Grund der starken Kühlung wurde diese jedoch nicht beobachtet.

Abb. 48: Optimierte reduktive Aminierung als dritter Weg der Herstellung von [4-(1H-Tetrazol-5-yl)pyridin-2-yl]methanamin-Derivaten: i) DIBAL, THF, –80 °C, 5 h; ii) entsprechendes Amin, NaBH4, MeOH, 0 °C-Rückfluss, 2-4 h; iii) H2, Pd/C, MeOH, Raumtemperatur, 1,5-4,5 h. Rechts: Strukturformel von DIBAL (Diisobutylaluminiumhydrid).

Durch Zugabe von Wasser und Essigsäure wurde überschüssiges DIBAL nach erfolgter

Reaktion zersetzt. Bei der anschließenden Flüssig-Flüssig-Extraktion gab es zu beachten,

dass die wässrige Phase nicht zu stark alkalisch eingestellt wurde, da es ansonsten zu

einer Gelbildung kam, vermutlich auf Grund von Aluminium- und Aluminiumhydroxid-

haltigen Verbindungen. Die hohe Viskosität machte eine Extraktion mit Ethylacetat

unmöglich, war jedoch durch Zugabe von wenigen Tropfen Essigsäure reversibel. Die

orangene Färbung nach Ansprühen des isolierten Produktes mit 2,4-Dinitrophenylhydrazin-

Reagenz auf der Kieselgelplatte zeigte an, dass der Aldehyd wie erhofft nicht weiter zum



Alkohol reduziert wurde, da die entsprechenden Alkohole nicht zu orangefarbenen

Hydrazonen reagieren können. Auf Grund von farbigen Verunreinigungen, die vor allem bei

der Hydrolyse des überschüssigen DIBAL entstanden, musste noch eine

Säulenchromatographie zur Aufreinigung durchgeführt werden. Die Gesamtausbeute der

Reduktion ist mit 80 % als gut zu bewerten.

Tab. 8: Übersicht der dargestellten [4-(1H-Tetrazol-5-yl)pyridin-2-yl]methanamin-Derivate über den Weg der reduktiven Aminierung mit jeweiligem Rest R.

Dargestellte Verbindungen Nichterhaltene Zielstruktur

XCVIII

C

CII

CIII

CIV

CV

Der Aldehyd CI konnte dann mit einem primären Amin zum entsprechenden Azomethin

umgesetzt werden. Diese Reaktion wurde in Methanol unter Rückfluss durchgeführt und

war je nach Gegebenheiten des Amins mehr oder weniger vollständig. Auch hier war es

nicht vorgesehen, das Azomethin zu isolieren, sondern den Glasaufbau im Sinne einer

Eintopfreaktion direkt mit Wasserstoff zu fluten, damit sowohl das Azomethin zum

sekundären Amin reduziert als auch die benzylische Schutzgruppe abgespalten werden

konnte. Somit beinhaltete diese Syntheseoperation wiederum gleich zwei sequentielle

Reaktionsschritte, wodurch diese Durchführung gewisse ökonomische Vorteile aufwies. Auf

diese Art konnte das Amin CII mit zwei Methoxysubstituenten in mittelmäßigen Ausbeuten

hergestellt werden (Tab. 8). Das bereits über den Sulfonsäureester-Weg dargestellte

O

O



Derivat XCVIII musste auf Grund der geringen Ausbeuten erneut synthetisiert werden. Mit

dem Weg der reduktiven Aminierung waren die Erträge allerdings nicht wesentlich höher.

Gänzlich unmöglich war es, das Amin C mit einer zweiten Pyridinstruktur herzustellen.

Bei der Darstellung einiger [4-(1H-Tetrazol-5-yl)pyridin-2-yl]methanamin-Derivate kam es

während des Syntheseverlaufs zu einer unerwünschten Abspaltung benzylischer

Strukturelemente. Dabei konnte ein Trend beobachtet werden: Je stärker

elektronenziehend der Substituent war (3,4-Dimethoxy < 4-Fluor < Pyridin), desto eher

wurde auch die Amin-verbindende Methylengruppe durch die reduktiven Bedingungen

abgetrennt. Exemplarisch konnte dafür ein Bruchstück aus der Synthese von C isoliert

werden, welches im 1H- und 13C-NMR-Spektrum die gleichen Signale aufzeigte, wie das

bereits zuvor synthetisierte [4-(1H-Tetrazol-5-yl)pyridin-2-yl]methanamin (LXXXVIII) (Abb.

49). Als Hauptgrund konnten die zu lang gewählten Reduktionszeiten ausgemacht werden.

Bei den Aminen XCVIII, C und CIII betrug der Kontakt mit Wasserstoffatmosphäre bis zu

24 h. Diese sollten daher im Folgenden gekürzt werden. Da es sich bei der Schutzgruppe

aber ebenfalls um eine benzylische Struktur handelte, waren solche Arten von

Nebenreaktionen nicht gänzlich auszuschließen.

Abb. 49: Bei der Synthese von C und CIII kam es unter den Reaktionsbedingungen von H2 und Pd/C nicht nur zur Abspaltung der Schutzgruppe, sondern auch zur Abtrennung anderer Strukturen (rot).

Auf Grund dieser Befunde wurde dazu übergegangen, einen weiteren Isolierungsschritt zu

integrieren. Hintergrund waren auch die nicht immer vollständig gelungenen

Azomethinbildungen, weshalb jetzt zwei Äquivalente Amin anstelle eines äquimolaren

Verhältnisses eingesetzt wurden. Es wurde ferner davon abgesehen, Reduktion und

Entschützung in einem Schritt durchzuführen. Stattdessen sollte die Doppelbindung des

Azomethins erst selektiv durch Natriumboranat reduziert werden (Abb. 48). Damit das

überschüssige Amin und die anorganischen Salze keine störendenden Einflüsse auf die

Entschützung ausübten, wurde eine Flüssig-Flüssig-Extraktion mit Ethylacetat und

Natriumhydrogencarbonat-Lösung zwischengeschaltet. Das noch geschützte und damit

lipophile Amin reicherte sich in der organischen Phase an, während die polaren Amine und

Salze in der Wasserphase verblieben. Nach Entfernen des Ethylacetats wurde dann die

Schutzgruppe nach bekannter Methode mit Wasserstoff an Pd/C entfernt (eine gesonderte

Analytik der noch benzylgeschützten Amine war nicht vorgesehen). Mit den bereits

gesammelten Erfahrungen der Entschützung wurde in der Folge die Reaktion mit Hilfe der



Dünnschichtchromatographie detailliert verfolgt. Statt der bisherigen 24 h musste die

Hydrogenolysezeit auf maximal 4,5 h heruntergesetzt werden, wobei auch hier große

individuelle Schwankungen auftraten. So konnte bei dem Cyclopropylderivat CIII bereits

nach 1,5 h ein methylsubstituiertes Tetrazolylpyridin isoliert und analytisch ausgewertet

werden (Abb. 49). Die Ausbeute des Zielprodukts CIII betrug aber trotzdem etwa 34 %,

weshalb sich die aufwendigen Verlaufskontrollen als unabdingbar erwiesen. Die Amine CIV

und CV konnten dann in noch besseren Ausbeuten dargestellt werden (Hydrogenolysezeit

hier bis 4,5 h) (Tab. 8). Mit der Einführung des Tyramin-Restes bei Derivat CV konnte ferner

bewiesen werden, dass dieser Weg auch mit reaktiven Gruppen, wie einem Phenol,

erfolgreich durzuführen war.

Dass die Abspaltung von Benzylgruppen ein kritischer Parameter sein kann, konnte bereits

gezeigt werden252. Die Entschützung ist unter anderem abhängig von der Zeit, Temperatur,

Palladiumbeladung und Größe der Kohlepartikel. Bei sehr ähnlichen Strukturen wie einem

benzylgeschützten Tetrazol und einem benzylischen Amin war es daher schwierig, eine

ausreichende Selektivität zu erreichen. Für zukünftige Versuche wäre es daher eventuell

ertragreicher, wenn nicht mit einem unsubstituierten Schutzgruppenaromaten gearbeitet

würde, sondern dieser mit elektronenziehenden Gruppen verknüpft wäre. Dadurch könnte

das Tetrazol in geringerer Zeit entschützt werden, während das restliche Molekül (noch

nicht) angegriffen würde. In der hiesigen Arbeit konnten aber mit dem Weg der reduktiven

Aminierung fünf Derivate mit einem methylenverbrückten Amin hergestellt werden, welche

auf ihre inhibitorischen Eigenschaften gegenüber der KDM4-Enzymreihe getestet werden

sollten. Damit stellte dieser Weg zugleich den erfolgreichsten dar, da bei den anderen zwei

präsentierten Syntheserouten für die Darstellung von Derivaten mit [4-(1H-Tetrazol-5-

yl)pyridin-2-yl]methanamin-Struktur entweder die Ausbeuten oder die Substanzanzahl stark

eingeschränkt war. Bei erfolgreicher Testung stünde dann mit dem hier präsentierten Weg

eine Möglichkeit zur Verfügung, mit welcher eine große Anzahl an Derivaten in kurzer Zeit

dargestellt werden könnte. Mit einer Optimierung der Schutzgruppe wäre die Erstellung

einer solchen Substanzbibliothek eventuell noch einfacher möglich.

1.2.2.5 4-(1H-Tetrazol-5-yl)picolinsäure/2,4-Di(1H-tetrazol-5-yl)pyridin

Bei den bisher synthetisierten Substanzen ging es vor allem um die Art der Seitenkette in

Position 2 des Pyridinrings und damit auch um den Erkenntnisgewinn hinsichtlich der Wahl

der Länge, des Verbrückungstyps oder des Heteroatoms, um an dieser Stelle günstige

Einflüsse auf die inhibitorischen Eigenschaften gegen die KDM4-Enzymreihe erzielen zu

können. Um aber ebenfalls einen direkten Vergleich mit der Leitsubstanz Pyridin-2,4-

dicarbonsäure (Abb. 50) ziehen zu können, mussten entweder beide

Carbonsäurefunktionen oder nur eine durch einen Tetrazolring substituiert werden.



4-(1H-Tetrazol-5-yl)picolinsäure (LXXV) wurde bereits im Rahmen der Untersuchungen zu

Picolinamiden (Abschnitt 1.2.2.2) synthetisiert und stand deshalb in ausreichender Menge

zur Verfügung.

Abb. 50: Bioisosterer Austausch der Carboxygruppen von Pyridin-2,4-dicarbonsäure: i) CuCN, NMP, 240 °C, 30 min; ii) NaN3, TEA∙HCl, Toluen, 105 °C, 24 h.

Für die Darstellung von 2,4-Di(1H-tetrazol-5-yl)pyridin (CVII) musste hingegen erst Pyridin-

2,4-dicarbonitril (CVI) hergestellt werden, um im Anschluss beide Cyanogruppen

gleichzeitig in ein Tetrazol zu überführen (Abb. 50). Zum Zeitpunkt der Synthese lagen

durch die vorherigen Cyanierungsexperimente Erfahrungen über die Gegebenheiten dieser

anspruchsvollen Reaktion vor. In einer weiteren Umsetzung von 2-Chlorisonicotinnitril

(XXXIV) im Sinne einer SNAr mit Kupfer(I)-cyanid in Dimethylformamid (modifiziert nach

Alemparte et al.253) konnte zwar ein Produkt erhalten werden. Dieses zeigte aber im 1H-NMR-Spektrum ein 6H-Integral bei einer chemischen Verschiebung von δ = 3,05 ppm,

was mit den zwei Methylgruppen des Dimethylformamids in Verbindung gebracht werden

könnte. Durch einen Wechsel des Lösungsmittels zu N-Methyl-2-pyrrolidon konnte das

Dicyano-Produkt CVI letztlich erhalten werden. Auf Grund der geringen Ausbeute wurde

noch eine zweite Variante ausprobiert. In der Originalarbeit kamen bei dieser Kaliumcyanid,

Dimethylformamid und [18]Krone-6 als Kalium-Chelatbildner zum Einsatz254. Letzteres

wurde aber durch das ebenfalls chelatisierende Eigenschaften gegenüber kleineren

Kationen besitzende Lösungsmittel Diglyme ersetzt. Die Erträge lagen hierbei mit 10 %

jedoch noch niedriger als bei der Reaktion mit Kupfer(I)-cyanid (25 % Ausbeute). Da

allerdings die gleichzeitige Tetrazolierung beider Cyanogruppen gut von statten ging und

das Molekül ohnehin nicht weiter derivatisiert werden sollte, waren die erhaltenen Mengen

an Dicyano-Produkt CVI aus beiden Reaktionen ausreichend. Eventuell wäre auch ein Weg

über das entsprechende Pyridin-N-oxid des Isonicotinnitrils (LXXII) möglich gewesen255.

Durch die Oxidation wird der elektronenarme Charakter des Pyridinrings an den Positionen

i

N Cl

N

N

ii

N

N

NN

HNN

NN N

N

HN

N N

N

NN

HN

OH

O

O

OH

O

OH

LXXV

XXXIV CVI CVII

2,4-PDCA



2 und 4 aufgehoben und der Heteroaromat wäre damit an diesen Stellen für eine

elektrophile aromatische Substitution zugänglich.

1.2.3 Synthese von Carbonsäure- und Pyridin-beinhaltenden KDM4-Inhibitoren

Neben dem direkten Vergleich der Pyridin-2,4-dicarbonsäure mit 2,4-Di(1H-tetrazol-5-

yl)pyridin, welcher zur Abschätzung der Auswirkungen der bioisosteren Substitution dienen

sollte, wurde ferner das literaturbekannte Motiv der Pyridin-4-carbonsäure auf zwei der

schon synthetisierten Tetrazolylpyridine übertragen. Dabei sollten die Substanzen 3-{[4-

(1H-Tetrazol-5-yl)pyridin-2-yl]amino}propan-1-ol-Hydrochlorid (XLVII) und N-⟨2-{[4-(1H-

Tetrazol-5-yl)pyridin-2-yl]amino}ethyl⟩methansulfonamid-Hydrochlorid (LIX) so verändert

werden, dass sich statt der Tetrazol- eine Carbonsäurefunktion an Position 4 des

Pyridinrings befindet.

Abb. 51: Darstellung der 4-Pyridincarbonsäurederivate: i) NaOH, EtOH, Wasser, Rückfluss, 3 h; ii) Ethylendiamin, 180 °C, 1 h, Mikrowellenreaktor; iii) Methansulfonylchlorid, ACN, Wasser, 0 °C-Raumtemperatur, 20 h; iv) 3-Aminopropan-1-ol, 120 °C, 22 h.

Für den ersten Schritt des Synthesewegs konnte auf dasselbe Edukt zurückgegriffen

werden, welches auch schon bei den 4-(1H-Tetrazol-5-yl)pyridin-2-aminen genutzt wurde

(Abb. 51). Hierbei wurde allerdings nicht mehr mit Natriumazid gearbeitet, statt dessen kam

eine Mischung wässriger Natronlauge mit Ethanol zum Einsatz194,256. Die basenkatalysierte

Hydrolyse führte unter Abgabe von Ammoniak zur Ausbildung einer Carboxygruppe.

Letztgenannte konnte über die Öffnung der Rückflussapparatur gut wahrgenommen

werden, weshalb die Vollständigkeit der Reaktion nicht mittels



Dünnschichtchromatographie detektiert, sondern auf Grund des abklingenden

Ammoniakgeruchs erkannt wurde.

Die anschließende nucleophile Substitution mit dem entsprechenden Amin im

Mikrowellenreaktor oder im Rundkolben brachte interessante Beobachtungen hervor. Zum

einen besaßen alle synthetisierten 2-Aminoisonicotinsäurederivate eine hervorragende

Wasserlöslichkeit. Die dazu äquivalenten Tetrazolylpyridine hingegen waren nahezu

unlöslich in Wasser. Das galt sowohl für Hydrochlorid-Salze als auch für Nicht-

Hydrochloride. Lediglich durch die Zugabe von Ammoniak oder NaOH/KOH konnte das

Tetrazol in das Tetrazolat-Salz überführt und damit wasserlöslich gemacht werden. Da die

4-Pyridincarbonsäuren CIX-CXI aber folglich nicht mehr als Hydrochloride gefällt werden

konnten, erschwerte sich damit zum einen auch die Isolierung dieser Stoffe. Zum anderen

konnten durch massenspektrometrische Untersuchungen Hinweise darauf gefunden

werden, dass Amidbildungen mit der freien Carbonsäurefunktion bei der Synthese von CIX

auftraten (Abb. 51, CXII). Prinzipiell sollte die Formung von Amiden aus der verhältnismäßig

unreaktiven Carbonsäure ohne weitere Zugabe von Katalysatoren erschwert sein. Aufgrund

der harschen Reaktionsbedingungen erschien der massenspektrometrische Nachweis von

Amiden aber plausibel. Dieses Nebenprodukt musste in einem weiteren Schritt hydrolysiert

werden und wurden daher mit Salzsäure im Überschuss unter Rückfluss für mehrere

Stunden erhitzt. Durch anschließendes Einengen des Reaktionsansatzes auf einen

Bruchteil des Ausgangsvolumens und durch Lagerung im Kühlschrank konnte letztendlich

eine Ausfällung des Produkts aus der noch stark sauren Lösung provoziert werden. Die

weitere Derivatisierung des Diamin-Derivates CIX wurde dann mit dem schon

beschriebenen Zweiphasen-System (Abschnitt 1.2.2.1) erfolgreich durchgeführt.

Tab. 9: Gegenüberstellung von (berechneten) physikochemischen Eigenschaften der Substanzen XLVII und CXI. 1 Osiris Property Explorer, 2 Molinspiration bioactivity score v2016.03, 3 ChemBioDraw v. 13.

Substanz XLVII CXI

Summenformel C9H12N6O C9H12N2O3 Molare Masse 220,23 196,20 Wasserlöslichkeit Sehr schwer löslich Leicht löslich Anzahl H-Donatoren 3 3 Anzahl H-Akzeptoren 7 5 clogP1 –0,14 –0,09 clogP2 –0,09 0,40 clogP3 0,01 0,06

Eine direkte Gegenüberstellung der 3-Aminopropan-1-ol-Derivate zeigte einige

Unterschiede in den physikochemischen Eigenschaften auf (Tab. 9). Neben der

Wasserlöslichkeit wurde nochmals deutlich, dass Tetrazole mehr Wasserstoffbrücken-

Akzeptoren besitzen. Die allgemeine Annahme, dass Tetrazolsysteme gegenüber ihren



Carbonsäureanaloga lipophiler sind, konnte zumindest mit den drei verwendeten

Kalkulationsprogrammen nicht gestützt werden. Dabei gilt es aber auch zu berücksichtigen,

dass die Algorithmen auf Inkrementrechnungen und Datenbanken beruhen und für

Tetrazole schlichtweg weniger Daten-Input vorhanden ist. Unbestritten blieb aber, dass die

synthetisierten Moleküle zu den polareren Vertretern ihrer Art gehörten.

Mit den zwei hier präsentierten 4-Pyridincarbonsäuren lagen weitere Moleküle vor, welche

in einem Direktvergleich zeigen können, ob die entsprechenden Tetrazolanaloga ebenso

für die Hemmung der KDM4-Enzymreihe geeignet sind. Dadurch sollten Struktur-

Aktivitätsbeziehungen generiert werden, welche in zukünftigen Arbeiten bei der Darstellung

von weiteren KDM4-Inhibitoren benutzt und weiterentwickelt werden können.

1.2.4 Biologische Testung/Analyse der Kristallstrukturen

Für die Evaluation der inhibitorischen Aktivitäten wurden die in dieser Arbeit vorgestellten

Substanzen an die Albert-Ludwigs-Universität Freiburg versendet. Im Arbeitskreis von Prof.

Dr. Manfred Jung konnte auf zwei verschiedene Testsysteme zurückgegriffen werden. Der

Formaldehyd-Dehydrogenase-Assay (FDH-Assay), welcher auf einer Reduktion von NAD+

zu NADH unter Oxidation des freiwerdenden Formaldehyds zu Ameisensäure beruht,

konnte für die Substanzen zumeist auf Grund von Eigenfluoreszenz nicht verwendet

werden. Stattdessen kam ein Antikörper-basierter Lanthanide-Chelate-Excite-Assay

(LANCE-Assay) zum Einsatz. Die Funktionsweise soll im Folgenden kurz erläutert werden

(Abb. 52).

Das Prinzip basiert auf dem Förster-Resonanzenergietransfer (FRET), bei dem ein Donor

nach entsprechender Anregung seine Energie strahlungslos über Dipol-Dipol-

Wechselwirkungen auf einen Akzeptorfarbstoff überträgt (vgl.257). Dieser wiederum kann

die ihm übertragene Energie in Form von Licht einer bestimmten Wellenlänge abgeben,

welche zur Messung genutzt werden kann. Der Donor ist in diesem Falle Europium. Das

Lanthanoid ist an einen Antikörper gebunden, welcher dimethyliertes Lysin in Position 9 am

humanen Histon H3 (H3K9me2) erkennt. Dieses liegt nur dann vor, wenn das ursprünglich

hinzugegebene Histonfragment (H3K9me3) vorher durch KDM4A im Assay demethyliert

werden konnte. Das Histonfragment besitzt ferner ein Biotin-Label, welches dazu dient, im

zweiten Schritt des Assays von Streptavidin gebunden zu werden. Dieses ist wiederum

Träger des Akzeptorfarbstoffs LANCE Ultra ULight. Sind sowohl Eu-Antikörper als auch

Streptavidin-ULight gebunden und in räumlicher Nähe zueinander (~10 nm), kann nach

entsprechender Anregung der FRET eintreten. Als Positivkontrolle wurde im Assay

2,4-PDCA verwendet, als Negativkontrolle diente DMSO. Zum Teil wurden lediglich



Vortests durchgeführt, das heißt, dass hier nur prozentuale Inhibitionen bei gegebener

Konzentration an Substanz vorlagen.

Abb. 52: Funktionsweise des LANCE-Assays: i) Durch die Zugabe von KDM4A, 2OG, FeSO4 und Ascorbinsäure wird die enzymatische Reaktion gestartet, welche ein H3K9me3-Fragment in ein H3K9me2-Fragment unter Abgabe von Formaldehyd demethyliert; ii) der Europium-markierte Antikörper bindet spezifisch an das H3K9me2-Fragment, während Streptavidin an Biotin bindet; iii) durch Anregung von Europium mit Licht und der räumlichen Nähe zum Ultra-ULight-Farbstoff kann es zu einem FRET kommen, welcher eine Emission von Strahlung auslöst.

Das aromatische Tetrazolhydrazid IX mit einer zusätzlichen primären aromatischen

Aminofunktion zeigte keine wesentlichen inhibitorischen Eigenschaften gegenüber KDM4A

auf (Tab. 10). Dies ist auch deshalb verwunderlich, weil die bereits im Arbeitskreis

synthetisierten Aryltetrazolhydrazide nachweislich im katalytischen Zentrum von KDM4D

binden können113. Diese zeigten im LANCE-Assay jedoch ebenfalls kaum Inhibition. Die

Unterschiede der KDM4A mit der KDM4D sind jedoch nur außerhalb des katalytischen

Zentrums zu finden (Abschnitt 1.1.1.2) und sollten daher nicht Grund für die

gegensätzlichen Beobachtungen sein. Die zusätzliche Aminofunktion ist damit offenbar

nicht in der Lage, das Chelatisierungspotential des Carbonsäurehydrazids mit einem

weiteren freien Elektronenpaar zu unterstützen.



Tab. 10: Biologische Testung der Aryltetrazolhydrazide, 1 Enzyminhibition bei 250 µmol/L.

Substanz Strukturformel Inhibition gegen KDM4A IX

IC50 = 206,0 ± 42,3 μM

XVI

86 %1

Dazu nicht kongruent war, dass das zweite Aryltetrazolhydrazid XVI basierend auf einem

Chinazolingerüst eine gute, wenn auch nicht komplette Hemmung von KDM4A bei einer

Konzentration von 250 µmol/L zeigte. Damit war diese Substanz deutlich stärker

inhibitorisch wirksam als die Variante mit freier Aminofunktion. Eventuell war die

Erweiterung des planaren Systems ursächlich für den Befund. Es wurde jedoch kein IC50-

Wert bestimmt, was zu Klärung der genauen Aktivität aber unbedingt nachgeholt werden

sollte.

Tab. 11: Ergebnisse der biologischen Testung der 4-(1H-Tetrazol-5-yl)pyridin-2-amine.

Substanz Seitenkette Enzyminhibition gegen KDM4A bei 250 µmol/L

XXXVI

22 %

XLV

51 %

XLVII

42 %

LVIII

37 %

LIX

54 %

LXI

25 %

Als nicht inhibitorisch wirksam zeigten sich viele Vertreter der 4-(1H-Tetrazol-5-yl)pyridin-

2-amine und -2-thioether. Die wenigen schwach aktiven Substanzen tragen aliphatische

Reste unterschiedlicher Kettenlänge (Tab. 11). Diese endeten sowohl mit freien Amino- als

auch Hydroxygruppen, konnten aber auch von amidischer Struktur sein. Am stärksten

inhibitorisch gegen KDM4A zeigte sich die Verbindung LIX mit einer terminalen

Methylsulfonamid-Gruppe. Diese verfügte über einen Wasserstoffbrückendonor und drei

H-Akzeptoren. Stoffe mit aromatischen Seitenketten konnten keine Inhibitionen aufzeigen,



obwohl literaturbekannte Substanzen mit Arylseitenkette durchaus in der Lage waren, eine

starke Hemmung auf die enzymatische Aktivität von KDM4A auszuüben. Auch deshalb liegt

es nahe, dass der Einfluss einer direkten Verknüpfung von Heteroatom und Pyridinring nicht

günstig war. Ob der bioisostere Austausch ebenfalls im kausalen Zusammenhang mit den

mäßigen Ergebnissen stand, wird aus den folgenden Testreihen ersichtlich.

Die 4-(1H-Tetrazol-5-yl)picolinamide LXXVI-LXXXII zeichneten sich durch eine im

Vergleich zu den bisher beschriebenen Tetrazolderivaten bessere Löslichkeit in vielen

Medien aus, wahrscheinlich durch Absenkung der Basizität des Pyridinstickstoffatoms.

Auf die biologischen Daten hatte diese Änderung allerdings wenig Einfluss. Die getesteten

Picolinamide waren ebenfalls nur mäßige Inhibitoren der KDM4A (Tab. 12). Die Substanz

LXXVII mit Morpholinrest zeigte mit einem IC50-Wert von etwa 100 µM noch die beste

Inhibition. Im Vergleich zu den bereits bekannten, auf Pyridin-4-carbonsäure basierenden

Hemmstoffen, ist die inhibitorische Potenz als gering einzustufen.

Tab. 12: Biologische Testung der 4-(1H-Tetrazol-5-yl)picolinamide und -hydroxamsäure. 1 Es konnte keine vollständige Sigmoidfunktion erhalten werden, weshalb die Werte nur als Näherung zu betrachten sind (eventuell kam es bei höheren Konzentration zu Aggregation der Substanzen). 2 Enzyminhibition bei 250 µmol/L.

Substanz Seitenkette Inhibition gegen KDM4A LXXVI

IC50 = 161,3 ± 8,6 µM1

LXXVII

IC50 = 100,0 ± 28,8 µM1

LXXVIII

26 %2

LXXX

43 %2

LXXXI

keine Inhibition

LXXXII

Assay-Interferenz

Gänzlich überraschend neben den bisher eher mäßigen Ergebnissen war, dass bei der

Testung der Hydroxamsäure LXXXII kein auswertbares Ergebnis erhalten werden konnte.

Für diesen Stoff wurde angenommen, dass es durch die zusätzlichen chelatisierenden

Eigenschaften der Hydroxamsäurefunktion in jedem Falle zu einer Inhibition kommen



würde. Weshalb es zu einer Überlagerung im Assay kam, konnte nicht geklärt werden.

Stünden nur Daten aus dem LANCE-Assay bezüglich der 4-(1H-Tetrazol-5-yl)picolinamide

und 4-(1H-Tetrazol-5-yl)pyridin-2-hydroxamsäure zur Verfügung, müsste davon

ausgegangen werden, dass auch diese für weitere Forschungsarbeiten wenig Relevanz

besäßen. Dass dem aber nicht so war, lag vor allem an Ergebnissen, welche durch

isotherme Titrationskalorimetrie und Röntgenkristallstrukturanalyse gewonnen wurden. Die

Resultate werden weiter unten in diesem Kapitel aufgezeigt.

Eine große Erwartungshaltung bestand gegenüber den Strukturen der [4-(1H-Tetrazol-5-

yl)pyridin-2-yl]methanamine, weil die Ergebnisse der Substanz XXXVIII mit freier terminaler

Aminofunktion recht früh vorlagen (Tab. 13). Mit einem IC50-Wert von etwa 21 µM bot das

verhältnismäßig kleine Molekül eine gute Grundlage für weitere Derivatisierungs-

experimente. Aus diesem Grund wurden auch die drei Wege zur Darstellung der

Methanamine eingehend untersucht, da unbedingt ein effizienter Syntheseweg für diese

Testkandidaten gefunden werden sollte. Die Route der reduktiven Aminierung des

Aldehyds wurde allerdings erst als letztes eingeschlagen.

Tab. 13: Biologische Testung der [4-(1H-Tetrazol-5-yl)pyridin-2-yl]methanamine. 1 Enzyminhibition bei 125 µmol/L, 2 Enzyminhibition bei 250 µmol/L.

Substanz Seitenkette Inhibition gegen KDM4A XXXVIII IC50 = 20,9 ± 3,6 µM XCII

(Tetrazol mit Bn-Gruppe)

57 %1

XCIII

Assay-Interferenz

XCVIII

51 %2

CII

19 %2

CIII

keine Inhibition

CIV

49 %2

CV

41 %2 HN

OH



Methanamine mit aromatischen Seitenketten (XCVIII, CIV und CV) zeigten eine moderate

Inhibition, was verdeutlichte, dass bei den 4-(1H-Tetrazol-5-yl)pyridin-2-aminen nicht

unbedingt die Seitenkette ursächlich für die schwache Hemmung von KDM4A war. Die

Cyclopropylgruppe von CIII hob offenbar die hemmenden Einflüsse auf, eine

underivatisierte Aminogruppe war damit Bestandteil des potentesten Inhibitors. Eine

Überraschung zeigte sich bei der noch benzylgeschützten Substanz XCII: Trotz der nicht

vorhandenen Acidität des Tetrazolrings konnte eine Inhibition im Vortest beobachtet

werden. Dies widersprach den Erwartungen, denn in vorherigen Befunden im Arbeitskreis

hatte sich gezeigt, dass eine Methylierung des Tetrazols zur Inaktivität des Moleküls in

Hinblick auf hemmende Einflüsse gegenüber KDM4A führte85. Eine Ermittlung des

IC50-Wertes mit Mehrfachbestimmung wäre deshalb wünschenswert gewesen, um etwaige

zufällige Phänomene auszuschließen. Die entschützte Verbindung XCIII führte dann

wiederum zu einer Interferenz im Assay und damit zu einem nicht auswertbaren Ergebnis.

Es gelang also nicht, die Aktivität von [4-(1H-Tetrazol-5-yl)pyridin-2-yl]methanamin

(XXXVIII) durch Derivatisierung der Seitenkette zu steigern. Die bisher erhaltenen

Resultate ließen an der Eignung des bioisosteren Austausches der Carbonsäure durch ein

Tetrazol zweifeln. Aus diesem Grund wurden mehrere Paare von ansonsten gleichen

Molekülen synthetisiert (Tab. 14).

Bei dem Molekülpaar LIX und CX zeigte sich eindeutig, dass das Tetrazolderivat der

Carbonsäure unterlegen war. Hier betrug der Faktor etwa zwei. Noch drastischer fiel der

Vergleich von XLVII und CXI aus, wobei sich das Molekül mit Tetrazolsubstituent etwa

sechsfach weniger inhibitorisch wirksam zeigte. Erschwerend kam hinzu, dass die

Löslichkeiten der Tetrazolylpyridine einer vollständigen Hemmung der KDM4A im Wege

standen.

Der Vergleich der direkten Mimetika von 2,4-PDCA stützte die Theorie, dass 4-(1H-

Tetrazol-5-yl)pyridine deutlich weniger gut als Inhibitoren der KDM4A agierten als

vergleichbare Isonicotinsäuren. Das Monotetrazolderivat LXXV war etwa um den Faktor

200 weniger inhibitorisch wirksam als 2,4-PDCA, das Bistetrazol CVII wiederum zwei Mal

weniger aktiv als LXXV. Da die Inhibition mit 2,4-PDCA im gewählten Assay sehr

ausgeprägt ausfällt (aufgrund der niedrigen Enzymkonzentration im LANCE-Assay werden

im Vergleich zu vielen anderen Assays merklich niedrigere Werte erhalten), weichen die

Werte von literaturüblichen IC50-Werten von 2,4-PDCA (etwa 0,7 µM) deutlich ab. Ein

Vergleich mit Literaturwerten wäre daher weniger ungünstig ausgefallen, es zeigt sich aber

einmal mehr, dass der Vergleich von IC50-Werten schwierig ist und am besten Daten aus

ein und demselben Testsystem in Relation gesetzt werden sollten, um Fehlinterpretationen

zu vermeiden.



Tab. 14: Direkte Gegenüberstellung der Tetrazolylpyridine mit Isonicotinsäuren, 1 Auf Grund von Sättigung wegen geringer Löslichkeit konnte eine vollständige Hemmung des Enzyms nicht erreicht werden. Die Werte sind daher nur als Näherung anzusehen.

Substanz Seitenkette Inhibition gegen KDM4A LIX

IC50 = 206 ± 5 µM1

CX

IC50 = 90,7 ± 27,1 µM

XLVII

IC50 = 314 ± 124 µM1

CXI

IC50 = 57,5 ± 20,3 µM

2,4-PDCA

IC50 = 0,027 ± 0,012 µM

LXXV

IC50 = 6,44 ± 2,90 µM

CVII

IC50 = 13,6 ± 0,6 µM

Zusammenfassend zeigten die Ergebnisse des LANCE-Assays, dass die Kombination von

Tetrazol und Pyridin offenbar keine gleichwertige Alternative gegenüber der Verknüpfung

aus Carbonsäure und Pyridin war. Der direkte Austausch an Position 4 führte zu einer



deutlichen Aktivitätsminderung gegenüber der Inhibition von KDM4A. Eindeutige Aussagen

zur Beschaffenheit der Seitenkette waren jedoch deutlich schwieriger zu treffen. Die beste

Inhibition konnte mit einer unsubstituierten Aminofunktion mit Methylenbrücke erzielt

werden. Dennoch zeigten auch einige Picolinamide und Pyridine, welche mit einem

Stickstoffatom direkt verknüpft waren und einen aliphatischen Rest trugen, moderate

Aktivitäten. Die biologischen Testungen lieferten also wertvolle Hinweise darauf, dass

einige der synthetisierten Substanzen das Potential besaßen, an das katalytische Zentrum

von KDM4A zu binden. Die aber zum Teil flachen Struktur-Aktivitätsbeziehungen sollten mit

Hilfe der Röntgenstrukturanalyse verifiziert und damit auch ein beträchtlicher Zugewinn an

Informationen über die Bindungsmodi generiert werden.

In der Folge konnten am Helmholtz-Zentrum Berlin für Materialien und Energie mit Hilfe der

Photonenquelle BESSY II in der Arbeitsgruppe Makromolekulare Kristallographie um

Dr. Manfred Weiss vier Kristallstrukturen von KDM4D (gekürzt auf Aminosäure 1-342) mit

den Isonicotinsäuren CX und CXI sowie mit den Tetrazolen LXXVII und LXXXII

(Picolinamid/Hydroxamsäure) gelöst werden. Zusätzlich wurden in Experimenten mit

isothermer Titrationskalorimetrie (ITC) für drei der vier Stoffe Bindungsaffinitäten bestimmt.

Als Diskussionsgrundlage für die Bindungsmechanismen soll im Folgenden die

Kristallstruktur von Krojer et al. (PDB: 4D6Q) dienen. Diese zeigt den pan-Inhibitor

2,4-PDCA im katalytischen Zentrum von KDM4D. Allgemein werden zur Komplexierung des

zentralen Nickel(II)-Kations (aus Stabilitätsgründen für das physiologische Eisen(II)-Kation

eingesetzt) die Aminosäuren Histidin 192 und 280 (bei KDM4A His 188/276) sowie

Glutaminsäure 194 (bei KDM4A Glu 190) benötigt. Das Pyridin-Stickstoffatom und ein

Sauerstoffatom der Carbonsäure an Position 2 der 2,4-PDCA chelatisieren das Kation, so

dass mit einem zusätzlichen Wassermolekül das Ni2+-Atom von insgesamt sechs Liganden

umschlossen wird. Eine zusätzliche Wechselwirkung der 2,4-PDCA erfolgt über die

Carbonsäure in Position 4 mit Tyrosin 136 und Lysin 210 (bei KDM4A Tyr 132 und Lys 206).

Eine weitere Interaktion kann ferner vom zweiten Sauerstoffatom der ortho-ständigen

Carbonsäure mit Lysin 245 (bei KDM4A Lys 241) erfolgen. Damit besetzt der Ligand

2,4-PDCA die Bindetasche mit zahlreichen Wechselwirkungen und formt dabei starke

Interaktionen wie Chelate und Wasserstoffbrücken aus. Tendenziell ist auch eine

Salzbrücke aus negativ geladenem Carboxylat und positiv geladener Aminogruppe des

Lysins 210 eine Möglichkeit (Gesamtübersicht in Abb. 53 und Tab. 15).


Abb. 53: Kristallstrukturen der Liganden CX (o. l.), CXI (o. r.), LXXVII (u. l.) und LXXXII (u. r.) im katalytischen Zentrum von KDM4D (Erklärungen siehe Text und Tab. 15).


Tab. 15: Übersicht der Bindungsmodi der Liganden 2,4-PDCA, CX, CXI, LXXVII und LXXXII in KDM4D. 1 über Wassermoleküle mit Ligand in Wechselwirkung.

Interaktion mit in Position 2,4-PDCA CX CXI LXXVII LXXXII

Ni2+ - Chelat über Pyridin-N-Atom und 2-Carboxygruppe

Koordination über Pyridin-N-Atom

Koordination über Pyridin-N-Atom

Chelat über Pyridin-N- und 2-Carbonyl-O-Atom

Chelat über Pyridin-N- und 2-Hydroxamsäure-N-Atom

Tyrosin 136 4-Carboxygruppe 4-Carboxygruppe 4-Carboxygruppe - 4-Tetrazol Lysin 210 4-Carboxygruppe 4-Carboxygruppe 4-Carboxygruppe 4-Tetrazol 4-Tetrazol Histidin 90 - Seitenkette-

Sulfonamid-O-Atom

- - -

Tyrosin 179 - - - Seitenkette-Morpholin-O-Atom

-

Phenylalanin 189 gegebenenfalls π-π-Stacking Alanin 190 - Seitenkette-

Sulfonamid-O-Atom

Seitenkette-OH - -

Glutaminsäure 194 - - - - 2-Hydroxamsäure-OH Lysin 245 2-Carboxygruppe - - - 2-Hydroxamsäure-

Carbonyl-O-Atom Sonstiges1 - Asparagin 202 Glutamin 88,

Asparaginsäure 139 und Lysin 245

Lysin 245 - Asparagin 202 und Asparagin 284



Bei den Isonicotinsäurederivaten CX und CXI ist das Stickstoffatom der Seitenkette direkt

an den Pyridinring gebunden. Dieser Abstand führte dazu, dass eine Komplexierung über

zwei Heteroatome nicht mehr stattfinden konnte, lediglich das Pyridin-Stickstoffatom

koordinierte an das zentrale Metallkation. Die Carbonsäure in Position 4 interagierte in

gleicher Weise wie es bei 2,4-PDCA vorzufinden ist (Wasserstoff- oder Salzbrücke mit

Tyrosin 136 und Lysin 210). Bei den Seitenketten kam es ebenfalls zur Ausbildung von

Wasserstoffbrücken, wobei beide Stoffe Alanin 190 adressierten. Bei Substanz CX diente

dafür ein Sauerstoffatom des Sulfonamids, bei CXI konnte die Brücke durch die terminale

Hydroxyfunktion ausgebildet werden. Ferner war Verbindung CX in der Lage, mit Hilfe des

anderen Sulfonamid-Sauerstoffatoms mit Histidin 90 in Wechselwirkung zu treten. Die

Fähigkeit zum π-π-Stacking mit Phenylalanin 189 blieb bei beiden Verbindungen, wie auch

bei 2,4-PDCA, wahrscheinlich gegeben. Insgesamt betrachtet entsprachen damit die

Bindungsmodi größtenteils den Erwartungen. Durch den Verlust der Chelatbildung wurde

allerdings ein großer Teil des Bindungspotentials unterbunden, weshalb es spätestens hier

eindeutig wurde, dass eine direkte Verknüpfung der Seitenkette in Position 2 über ein

Stickstoffatom mit dem Pyridinsystem keine optimale Kombination darstellte.

Das Picolinamid LXXVII hingegen war in der Lage, das Ni2+-Kation mit Hilfe des Pyridin-

Stickstoffatoms und des Carbonyl-Sauerstoffatoms zu komplexieren. Allerdings rückte mit

Tyrosin 136 ein wichtiger Interaktionspartner für das Tetrazol aus der Bindetasche heraus.

Somit stand nur Lysin 210 für eine Salz- oder Wasserstoffbrücke zur Verfügung. Es wurde

ferner ersichtlich, dass sich das Tetrazol nicht in die gleiche Ebene wie das Pyridin

orientierte. Die längere Seitenkette fand in der Bindetasche genügend Platz und wurde

terminal durch das Morpholin-Sauerstoffatom am Tyrosin 179 über eine Wasserstoffbrücke

fixiert (nicht gezeigt). Interessant war weiterhin, dass sich die Seitenkette in eine andere

Richtung ausrichtete als es bei jener von Substanz CXI der Fall war. Dies spricht für die

Größe der Bindetasche und damit auch für die mögliche Diversität der dort

akkomodierbaren Seitenketten. Durch die fehlende Wechselwirkung mit Tyrosin 136 wurde

aber klar, dass die Bindetasche durch LXXVII nicht optimal besetzt wurde. Worin die

Ursache des „Herausdrückens“ der Aminosäure aus der Bindetasche zu begründen war,

konnte nur gemutmaßt werden. Eventuell war es bei der Komplexierung durch Pyridin-

Stickstoffatom und Carbonyl-Sauerstoffatom zu einer Verschiebung weg von der optimalen

Position gekommen. Ein Indiz dafür könnte sein, dass die Carbonylfunktion ebenfalls nicht

mit dem Pyridinring in einer Ebene stand. Auch hier lag eine gewisse Torsion vor.

Die wohl interessantesten Befunde kamen durch die Hydroxamsäure LXXXII zu Tage (auch

in Abb. 54 mit Überlagerung von CXI). Nach der ungeklärten Assay-Interferenz war nicht

klar, ob diese Substanz das Potential besitzen würde, um überhaupt im katalytischen

Zentrum von KDM4A zu binden. Die röntgenkristallographischen Untersuchungen konnten

aber zeigen, dass sich LXXXII trotz des Tetrazols in vergleichbarer Art und Weise wie



2,4-PDCA in die Bindetasche der KDM4D einfügen konnte. Die wichtige Chelatisierung des

Ni2+-Kations erfolgte durch die Pyridin- und Hydroxamsäure-Stickstoffatome. Besonders

relevant war dabei, dass die Hydroxamsäure nicht über ihren üblichen Mechanismus (beide

Sauerstoffatome) komplexierte, sondern untypischerweise dazu das Stickstoffatom

benutzte und wahrscheinlich als tautomere Imidsäure vorlag. Dies könnte auch in Hinblick

auf die Selektivität einen wichtigen Aspekt darstellen, da Hydroxamsäuren mitunter zu den

Pan-Assay Interference Compounds (PAINS), welche zu unspezifischen falsch-positiven

Ergebnissen in Screening-Tests führen können, gezählt werden. Erfreulicherweise war nun

sowohl das Lysin 210 als auch das Tyrosin 136 an einer Wasserstoff- oder Salzbrücke mit

dem Tetrazol beteiligt. Damit wurde auch zum ersten Mal der Beweis erbracht, dass die

Tetrazolylpyridinstruktur in Kontrast zu Isonicotinsäureverbindungen einen vergleichbaren

Bindungscharakter aufwies. Ferner konnten über beide Sauerstoffatome der

Hydroxamsäure noch Glutaminsäure 194 und Lysin 245 mit einer Wasserstoff- oder

Salzbrücke adressiert werden. Die erhoffte Bildung eines „π-π-Sandwich“-Komplexes mit

Phenylalanin 189 und Tyrosin 181, wie es bei der ursprünglichen Leitstruktur 2-(1H-

Tetrazol-5-yl)essigsäurehydrazid noch der Fall war, blieb jedoch aus.

Abb. 54: Superimposition der Liganden CXI und LXXXII: Der Tetrazolring nahm mehr Platz als die Carbonsäuregruppe in Anspruch und war minimal verschoben. Die Seitenkette der Hydroxamsäure orientierte sich nach vorn, während der Hydroxypropyl-Rest nach hinten in die Bindetasche gelenkt wurde.

Es war damit unstrittig, dass die vier hier vorgestellten Inhibitoren im katalytischen Zentrum

der KDM4D binden würden. Zusätzlich konnten KD-Werte erhalten werden, welche am Max-

Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin in Berlin durch Dr. Piotr Małecki in ITC-

Experimenten erhoben wurden. Die Liganden CX und CXI führten jeweils zu mittelmäßigen


Zusammenfassung und Ausblick Kapitel 1 | 81

Werten von KD = 35 µM und KD = 37 µM. Auf Grund der nicht vorhandenen Chelatisierung

überraschte dieses Ergebnis allerdings nicht. Ein Wert für LXXVII wurde nicht ermittelt. Die

Hydroxamsäure LXXXII zeigte jedoch mit KD = 0,5 µM eine Bindungsaffinität im

submikromolaren Bereich. Damit bietet LXXXII zugleich eine Grundlage für mögliche

weitere Inhibitoren, welche zum Beispiel von einer längeren Seitenkette profitieren könnten.

Das Tetrazolessigsäurederivat XXVI ohne Hydrazidfunktion verschob bei den Soaking-

Experimenten mit KDM4D das Metallkation im katalytischen Zentrum. Das heißt, dass der

Ligand dort kurzeitig lokalisiert war, jedoch nicht mitkristallisiert werden konnte. Das spricht

dafür, dass das Hydrazid ein obligatorisches Element der Tetrazolhydrazide darstellte und

dass die übrigen Bindungsmechanismen nicht ausreichten, um ein „Festhalten“ im

katalytischen Zentrum zu garantieren. Das Indolderivat XXXI zerstörte bei den Soaking-

Experimenten die Kristalle von KDM4D, weshalb hier keine Röntgenuntersuchungen

stattfinden konnten.

1.3 Zusammenfassung und Ausblick Kapitel 1

Im Rahmen dieser Promotionsarbeit sollten Inhibitoren der KDM4-Enzymreihe mit

unterschiedlichen Kombinationen von funktionellen Gruppen synthetisiert werden.

Basierend auf einer im Arbeitskreis gefundenen fragmentartigen Leitstruktur aus der Klasse

der Tetrazolhydrazide wurden aromatische und aliphatische Motive ausgewählt und

erfolgreich synthetisiert. Neben den aliphatischen Essigsäurederivaten konnte ein komplett

neuer Weg basierend auf Anthranilsäure etabliert werden. Als zweiter Grundkörper,

welcher wiederum auf dem literaturbekannten Inhibitor Pyridin-2,4-dicarbonsäure basierte,

wurde Tetrazolylpyridin gewählt. Es sollte evaluiert werden, welchen Einfluss und welche

synthetischen Herausforderungen der bioisostere Austausch der Carboxygruppe durch

einen Tetrazolring besaß beziehungsweise mit sich brachte. Ferner ging es darum,

systematisch den Einfluss der Seitenkette auf mögliche Bindungsmechanismen zu

ergründen. Neben der direkten Anknüpfung von Heteroatomen an das Tetrazolylpyridin-

Grundgerüst konnten außerdem Syntheserouten etabliert werden, welche Bindungen über

Carbonylgruppen ermöglichten und auch zur Darstellung von methylenverbrückten Aminen

als Seitenkette genutzt werden konnten. Die zahlreichen Verbindungen sollten dann zum

einen an der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Arbeitskreis von Prof. Dr. Manfred Jung

in einem biologischen Assay auf ihre inhibitorischen Eigenschaften gegenüber KDM4A

getestet und zum anderen am Helmholtz-Zentrum Berlin für Materialien und Energie in der

Arbeitsgruppe Makromolekulare Kristallographie um Dr. Manfred Weiss im Rahmen von

Kristallisationsexperimenten begutachtet werden.

Die Ergebnisse der biologischen Testungen fielen insgesamt durchschnittlich aus. Bei den

Tetrazolhydraziden konnte mit 3-Amino-2-methyl-6-(1H-tetrazol-5-yl)chinazolin-4(3H)-on


82 | Zusammenfassung und Ausblick Kapitel 1

(XVI) eine verhältnismäßig aktive Substanz gefunden werden, welche in zukünftigen

Arbeiten noch näher untersucht und gegebenenfalls weiter derivatisiert werden sollte. Für

die Tetrazolylpyridine war festzustellen, dass der bioisostere Austausch zu Änderungen von

physikochemischen Eigenschaften führte, gleichzeitig aber auch die inhibitorische Potenz

gegenüber KDM4A erniedrigte. Bei dem Design der Seitenkette waren Verknüpfungen des

Pyridinrings mit Carbonylgruppen und methylenverbrückten Aminen zu bevorzugen.

Durch die Ergebnisse der Röntgenkristallographie konnte eindeutig gezeigt werden, dass

die direkte Verknüpfung von Pyridin und Stickstoffatom mit einem Verlust der Fähigkeit zur

Chelatisierung einherging. Der Bindungsmodus der Hydroxamsäure LXXXII konnte jedoch

beweisen, dass Tetrazolylpyridine grundsätzlich auch in der Lage waren, wichtige

Interaktionen mit KDM4D auszubilden. Mit einer Dissoziationskonstanten im

submikromolaren Bereich lag sie ferner in vergleichbarer Größenordnung wie die

Leitstruktur Pyridin-2,4-dicarbonsäure.

Daher konnten im Rahmen dieser Arbeit nicht nur weitere Bindungsmodi aufgeklärt,

sondern ein aktives Molekül mit bioisosterem Tetrazolring synthetisiert werden. Auf dessen

Grundlage wäre es unter anderem möglich, die Seitenkette über einen Ester der

Hydroxamsäure zu verlängern. Weiterhin könnte die ausgeprägte Hydrophilie des

Tetrazolylpyridins mit dem Konzept des Prodrug-Designs gesenkt werden, unter anderem

durch die Verwendung eines Doppelester-Konzeptes258. Damit wäre nicht nur die

Wahrscheinlichkeit der Penetration von Zellmembranen erhöht, sondern auch einige

Syntheseschritte, die von der Amphoterie der Tetrazolylpyridine negativ beeinflusst waren,

einfacher durchführbar.

Die Kristallstrukturen konnten inzwischen in der Protein Data Bank hinterlegt werden (6F5T,

6F5R, 6F5S, 6F5Q).

Auswirkungen von epigenetischer (Fehl-)Regulation auf psychische Erkrankungen

Überleitung | 83

2 Auswirkungen von epigenetischer (Fehl-)Regulation auf psychische Erkrankungen

Die bisherigen Betrachtungen von epigenetischer Regulation waren vor allem auf

neoplastische Ereignisse fokussiert. Deshalb überrascht es auch nicht, dass die derzeit

zugelassenen Arzneistoffe (DNMT- und HDAC-Inhibitoren, LSD1-Inhibitoren in klinischer

Prüfung) tumorspezifische Indikationen besitzen. Da das Wissen um das Epigenom in den

letzten Jahren aber rasant zugenommen hat, wurden in jüngster Zeit zahlreiche

experimentelle Befunde erhalten, welche vermuten lassen, dass mit niedermolekularen

Modulatoren von epigenetische Regulationsmechanismen-beeinflussenden Enzymen eine

Vielzahl von Krankheiten behandelt werden könnte.

Ein Schwerpunkt zielt dabei auf die (indirekte) Verstrickung von Histon-Demethylasen und

depressiven Erkrankungen ab. In einer Veröffentlichungen von Ambrosio et al. wurde der

Zusammenhang zwischen LSD1 und Autophagozytose hergestellt259. Die Autoren

beabsichtigten damit zwar auf mögliche Konsequenzen bei der Regulation von

Neuroblastomen hinzuweisen, stellten jedoch einen Signalweg vor, welcher

Überschneidungen mit möglichen Therapieoptionen von depressiven Patienten nahe legt.

Ambrosio et al. fanden heraus, dass LSD1 an die Promoterregion von Sestrin2 (SESN2)

bindet und so dessen Expression unterdrückt. Wurde nun die Funktion von LSD1 mit

Tranylcypromin oder E12 (Abb. 9) unterdrückt, stieg die Expressionsrate von SESN2.

Dieser üblicherweise Stress-induzierte Vertreter der Sestrin-Familie wiederum hemmte

dann als wichtiger Regulator des „mammalian target of rapamycin complex 1“ (mTORC1)

Signalwegs dessen Aktivität. Es wird vermutet, dass die Wirkmechanismen neuartiger

Antidepressiva wie NV-5138 (Struktur noch nicht veröffentlicht) oder Ketamin (Arzneistoff

bisher als Analgetikum/Anästhetikum zugelassen) ebenfalls einen Sestrin/mTORC1-

Mechanismus beinhalten und somit, zumindest theoretisch, Parallelen mit der Regulation

von LSD1 auftreten könnten260,261.

Für die JmjC-enthaltende KDM7B konnte ebenfalls eine Verbindung mit dem mTOR-

Signalweg nachgewiesen werden. Mäuse mit ausgeschalteter KDM7B zeigten ein

gemindertes Lernverhalten und kognitive Defizite, welche sich unter Gabe des mTOR-

Inhibitors Sirolimus merklich besserten262. Walsh et al. führten gleichermaßen Experimente

mit KDM7B-defizienten Mäusen durch, fanden dabei jedoch keine Anhaltspunkte für eine

nachteilige Entwicklung. Dafür entdeckten sie, dass durch den Knockout eine erhöhte

Resilienz gegenüber Stress-induzierten Angst- und Depressions-ähnlichen

Verhaltensmustern erreicht werden konnte. Dadurch, dass sie ebenfalls einen

Zusammenhang zwischen Serotoninrezeptoren und KDM7B sahen, stellten sie für KDM7B

eine Rolle als mögliches neues Target für die weitere Erforschung von depressiven

Erkrankungen in Aussicht263.


84 | Überleitung

Auch Auswirkungen der Regulation der KDM4-Enzymreihe auf die Pathologie der

Depression wurden im Mausmodell bereits untersucht und sind im Hinblick auf die in dieser

Arbeit synthetisierten Inhibitoren von besonderem Interesse264. In ersten Versuchsreihen

führten Pathak et al. mit Nagern gängige fünf- oder zehntägige Angst- und Stresstests

durch, wie bespielweise einen Aufenthalt im Labyrinth oder eine erzwungene

Schwimmprüfung. Neben resilienten Mäusen konnten durch die Tests ebenfalls

depressionsähnliche Phänotypen (u. a. Anhedonie und sozialer Rückzug) beobachtet

werden. Diese zeigten im Nucleus accumbens, einer wichtigen Region des

Belohnungszentrums, unterschiedliche Expressionsprofile der mRNA von KDM4A-D auf.

Anschließend sollte die Herunterregulation mancher KDMs durch die Stresstests nur mit

Hilfe der Applikation von den KDM-Inhibitoren Dimethyloxalylglycin (DMOG, Diester von

N-Oxalylglycin um Zellgängigkeit zu erreichen), ML-324 (ein Derivat von E18 mit

8-Hydroxychinolingrundkörper) oder JIB-04 (E17) (Abb. 10) untersucht werden. Unter der

Gabe von DMOG und ML-324 kam es wie in den Stresstests zur Ausbildung von

Depressions-ähnlichen Phänotypen. Die Anwendung von JIB-04 führte jedoch nicht zu

Merkmalen depressiver Erkrankungen, was die Autoren damit begründeten, dass JIB-04

als unselektiver pan-Inhibitor (u. a. gegen KDM5A/6B) galt. Auch wenn die letzte

Begründung durchaus fraglich erscheint (NOG wird ebenfalls als pan-Inhibitor eingeordnet),

so konnte die Arbeitsgruppe um Pathak zeigen, dass die Ausbildung von Depressions-

ähnlichen Phänotypen mit der (Herunter-)Regulation der Aktivitäten von KDM4-Enzymen

zusammenhing und sich durch die Gabe von deren Inhibitoren ebenfalls initiieren ließ.

Trotzdem diese Befunde nur experimenteller Natur waren und im Nagermodell durchgeführt

wurden, so hätten KDM4-Inhibitoren jedoch, wenn sie zur Behandlung von

Tumorerkrankungen eingesetzt würden, ein erhebliches Potential für Nebenwirkungen,

welches beachtet werden müsste.

Dass psychosozialer Stress sogar Auswirkungen auf Folgegenerationen haben könnte,

zeigten Serpeloni et al. mit ihren Forschungsergebnissen265. Sie belegten, dass

Misshandlungen während der Schwangerschaft zu Änderungen im DNA-

Methylierungsmuster führten. Diese Strukturen konnten dann nicht nur bei den Kindern,

sondern auch bei den Kindeskindern nachgewiesen werden. Dabei wurden Genregionen

methyliert, welche mit Symptomen von Depressionen und Posttraumatischen

Belastungsstörungen assoziiert waren. Die Autoren wiesen zwar klar aus, dass damit nicht

automatisch ein kausaler Zusammenhang zwischen der Entwicklung des Phänotyps der

Enkelkinder und dem großmütterlichen Stress bestand, konnten aber dennoch ihre

Vermutungen untermauern, dass die mit psychischen Erkrankungen assoziierte

Grundlagen (vererbbar) im Epigenom gespeichert wurden.


Überleitung | 85

Die genannten Literaturbeispiele stellen sehr wahrscheinlich nur den Anfang des

epigenomischen Verständnisses in Hinblick auf psychische Erkrankungen, speziell der

Depression, dar. Es konnte experimentell gezeigt werden, dass verschiedene Epigenetik-

assoziierte Enzyme an Krankheitsgeschehen und Ausbildung Depressions-ähnlicher

Phänotypen beteiligt waren. Die weitere Erforschung der Depression und deren Therapie

ist angesichts der Anzahl der Betroffenen und des hohen Leidensdrucks von eminenter

Bedeutung. Der zweite Teil dieser Arbeit soll einen Beitrag zur Analyse einer neuen

Therapieoption bei der Behandlung von depressiven Patienten leisten, in dem eine

leistungsfähige Nachweismethode für möglicherweise antidepressiv wirkende Metaboliten

eines bekannten Arzneistoffs zur Verfügung gestellt wird. Trennung, qualitative und

quantitative Erfassung von chiralen Metaboliten des Arzneistoffs Ketamin können zukünftig

zur Aufklärung der molekularen Targets beitragen, die an der ungewöhnlich schnell

eintretenden antidepressiven Wirkung im menschlichen Organismus beteiligt sind.

Analytische Untersuchungen von Ketamin und dessen Metaboliten

86 | Vorbetrachtungen

3 Analytische Untersuchungen von Ketamin und dessen Metaboliten

3.1 Vorbetrachtungen

3.1.1 Depressive Erkrankungen und leitliniengerechte Therapie

Bei der Depression handelt es sich um eine psychische Störung, welche durch einen

Zustand deutlich gedrückter Stimmung, Interessenlosigkeit und Antriebsminderung über

einen längeren Zeitpunkt gekennzeichnet ist266. Die World Health Organization beziffert die

Prävalenz der Depression weltweit auf 322 Millionen Menschen. Davon werden in

Deutschland 4,1 Millionen mit der Diagnose Depression konfrontiert, was etwa 5,2 % der

deutschen Gesamtpopulation ausmacht267. Erkrankte leiden häufig an verringerter

Leistungsfähigkeit268, einem Mangel an gesundheitsbezogener Lebensqualität269 und

gesteigerter Mortalität270. Der von der Erkrankung ausgehende Leidensdruck für die

Patienten ist hoch, da in zentraler Art und Weise das Wohlbefinden und Selbstwertgefühl

beeinträchtigt wird271. Neben den starken persönlichen Einschränkungen entstehen den

Volkwirtschaften durch depressionsassoziierte direkte und indirekte Kosten Schäden in

Milliardenhöhe272.

Die aktuelle S3-Leitline „Unipolare Depression“ der AWMF273 bietet umfassende

Informationen zur Einteilung verschiedener Depressionsarten, Diagnosekriterien und

Therapieoptionen und soll im Folgenden nur partiell besprochen werden. Neben

zahlreichen nicht-medikamentösen Behandlungsoptionen wie Psychotherapie,

somatischer Therapieverfahren und Aufklärungsangebote für Patienten und Angehörige,

stellt die Pharmakotherapie eine existenzielle Säule der Interventionen dar.

Wie häufig in der Entwicklung der Arzneimittel erfolgte auch die Entdeckung der ersten

antidepressiv wirkenden Substanzen nach dem Serendipitätsprinzip. So wurde bei der

Behandlung von Tuberkulosepatienten mit dem aus Isoniazid abgeleiteten Iproniazid die

Beobachtung gemacht, dass sich ein großer Teil des Patientenkollektives einer

gesteigerten Fröhlichkeit erfreute274. Die Bezeichnung des entdeckten APIs als „Psychic

Energizer“ deutet schon an, dass das Wissen um die Depression als komplexes

Krankheitsgeschehen im Jahr 1957 als eher begrenzt einzuschätzen ist. Trotzdem

resultierte daraus der erste zugelassene MAO-Hemmer. Diese Klasse von Arzneistoffen ist

jedoch heute nicht mehr Mittel der ersten Wahl, da sie zu viele Interaktionen mit anderen

Medikamenten verursacht (unter anderem Serotonin-Syndrom) und penibel auf eine

tyraminarme Zusammensetzung der Nahrung geachtet werden muss. An dieser Stelle soll

noch einmal Tranylcypromin hervorgehoben werden, da es eben auch einen potenten

Inhibitor der LSD1 darstellt. Dieser Bestandteil der epigenetischen Regulation wurde schon

im ersten Teil dieser Arbeit ausführlich besprochen. Es soll nur noch darauf hingewiesen


Vorbetrachtungen | 87

werden, dass sich bei erfolgreichem Abschluss der klinischen Pilotstudien zur Therapie der

akuten myeloischen Leukämie der Indikationsbereich des MAO-Hemmers schlagartig

ändern könnte66,67.

Relativ zeitgleich zur Entdeckung von MAO-Inhibitoren wurde an der Weiterentwicklung von

Antipsychotika mit Phenothiazin-Grundgerüst geforscht. Der erste Vertreter der Tri- und

tetrazyklischen Antidepressiva (TZA) war Imipramin und wurde ursprünglich nicht für die

Indikation Depression sondern Schizophrenie entwickelt. Während erster Studien an

Patienten konnte jedoch beobachtet werden, dass diese sich gegenseitig unterhielten, an

Spielen teilnahmen oder sogar teilweise wieder lachen konnten275. Nach offizieller

Zulassung waren Iproniazid und Imipramin damit die ersten beiden Vertreter von APIs,

welche erfolgreich für die Therapie von depressiven Erkrankungen eingesetzt wurden. Mit

der Aufklärung ihrer Mechanismen trugen sie ferner zur Erkenntnis bei, dass das

Krankheitsgeschehen an einen Mangel von Serotonin, Noradrenalin und Dopamin im

zentralen Nervensystem geknüpft sein muss (Monoamin-Hypothese)276. Auf dieser

Hypothese aufbauend, konnten mittlerweile mehrere Klassen von Antidepressiva entwickelt

werden.

Heute kommen neben den MAO-Hemmern und TZA weitere Gruppen von Antidepressiva

zum Einsatz: Selektive Serotonin-Rückaufnahme-Inhibitoren (SSRI), Selektive Serotonin-

/Noradrenalin-Rückaufnahme-Inhibitoren (SSNRI), α2-Rezeptor-Antagonisten, Selektive

Noradrenalin- und Dopamin-Rückaufnahme-Hemmer, Melatonin-Rezeptor-Agonisten

sowie Lithiumsalze, Trazodon und Johanniskraut(-extrakte) (Tab. 16).

Tab. 16: Übersicht über pharmakotherapeutische Möglichkeiten bei Depression (modifiziert nach Hiemke et al.277).

Wirkstoffgruppe Beispiele Tri- und tetrazyklische Antidepressiva Amitriptylin, Amitriptylinoxid, Clomipramin

Desipramin, Doxepin, Imipramin, Maprotilin, Nortriptylin, Trimipramin

Selektive Serotonin-Rückaufnahme-Inhibitoren

Citalopram, Escitalopram, Fluoxetin, Fluvoxamin, Paroxetin, Sertralin, Vortioxetin

Monoaminoxidase-Inhibitoren Moclobemid, Tranylcypromin Selektive Serotonin-/Noradrenalin-Rückaufnahme-Inhibitoren

Venlafaxin, Duloxetin

α2-Rezeptor-Antagonisten Mianserin, Mirtazapin Selektiver Noradrenalin- und Dopamin-Rückaufnahme-Hemmer

Bupropion

Melatonin-Rezeptor-Agonisten Agomelatin Sonstige Trazodon, Lithiumsalze, Phytopharmaka

(Hypericum perforatum)



Cipriani et al. ermittelten und verglichen in einer aktuelle Metaanalyse über 500 Studien mit

mehr als 100000 Patienten zur Therapieeffektivität und -verträglichkeit von Antidepressiva

zum Teil untereinander oder gegen Placebo, und kamen dabei zu einer eindeutigen

Aussage: Jedes Antidepressivum ist wirksamer als Placebo278! Gleichzeitig wurde auch

erwähnt, dass in Sachen Verträglichkeit nahezu jedes Verum dem Placebo unterlegen sei.

Gelistet wurden teils stark therapieeinschränkende unerwünschte Arzneimittelwirkungen

(UAW) wie anticholinerge Effekte, Gewichtszunahme, Sedierung, erhöhte

Blutungsneigung, Verlängerung der QTc-Zeit im EKG mit Risiko potentiell

lebensbedrohlicher Herzrhythmusstörungen, Bluthochdruckkrisen,

Leberfunktionsstörungen oder mögliche Induktion von Agranulozytose273.

Neben den zahlreichen UAWs spielt die „Lag-Time“, also die Zeit, welche benötigt wird

damit das Antidepressivum seine gewünschte Wirkung entfaltet, eine große Rolle.

Allgemein wird mindestens eine Woche, eher jedoch zwei bis vier Wochen, therapiert, bevor

mit den beabsichtigten Therapieeffekten zu rechnen ist279,280. Diese Zeitspanne kann vor

allem für Patienten mit ausgeprägten Suizidgedanken bereits zu lang sein.

Einen letzten herausgenommenen Punkt stellen die therapieresistenten Depressionen dar.

Nach vier- bis sechswöchiger Therapiedauer nach Neueinstellung eines Patienten, soll die

Wirksamkeit systematisch überprüft werden281. Bei Nichteintreten der gewünschten Effekte

stehen zum Teil evidente Behandlungsoptionen zur Verfügung: Durch ein therapeutisches

Drug Monitoring (TDM) können Non-Adhärenz oder Resorptionsstörungen bei Patienten

aufgedeckt, der Wechsel zu einem anderen Antidepressivum bzw. eine Dosiseskalation

kann erwogen werden. Die Augmentation mit Lithium bzw. Antipsychotika der 2. Generation

nimmt neben der Kombination zweier Antidepressiva einen hohen Stellenwert ein281.

Dennoch gelingt es mit den vorhandenen Medikationsschemata nicht immer eine

Chronifizierung der Erkrankung zu verhindern.

Damit gilt zwar zusammenfassend, dass die bisher in der Therapie eingesetzten

Antidepressiva wirksam sind, wenngleich auch nicht immer optimal. Daher ist es sinnvoll

weitere Substanzen in klinischen Studien zu testen, die auf den ersten Blick eventuell nicht

direkt in das nach bisherigem Kenntnisstand gelehrte Krankheitsgeschehen involviert sind,

wodurch sich neue molekulare Mechanismen eröffnen können. Das Beispiel des NMDA-

Rezeptorantagonisten Ketamin zeigt auf, dass es sich dabei nicht immer um neue APIs

handeln muss, sondern dass das Prinzip des „Repurposing“ ein weiterer Weg sein kann,

Arzneistoffe für eine neue Indikation zu entdecken.



3.1.2 Ketamin als neue Therapiestrategie zur Behandlung (therapieresistenter) depressiver Erkrankungen

Ketamin (rac-2-(2-Chlorphenyl)-2-(methylamino)cyclohexan-1-on, KET) (Abb. 58) wurde in

den 1960er Jahren das erste Mal beschrieben282 und ging chemisch aus dem Anästhetikum

Phenylcyclohexylpiperidin (Phenylcyclidin, PCP) (Abb. 57) hervor. Dieses zeigte ein

ungünstiges Risiko-Nutzen-Verhältnis, weshalb eine nebenwirkungsärmere und weniger

missbrauchsanfälligere Variante gesucht wurde283. Die WHO führt KET als Anästhetikum in

der Liste der unentbehrlichen Arzneimittel auf284. Des Weiteren ist es für verschiedene Arten

der Analgesie zugelassen285.

Abb. 55: Aufbau des heterotetrameren NMDA-Rezeptor-Komplexes286: GluN1- (blau) und GluN2-Untereinheit (orange) unterteilt in aminoterminale Domäne (ATD), Ligandenbindungsdomäne (LBD) und transmembranäre Domäne (TDM).

Seine therapeutische Wirkung entfaltet KET hauptsächlich über einen Antagonismus an

Glutamat-Rezeptoren. Diese können in G-Protein-gekoppelte und ionotrope Rezeptoren

unterteilt werden. Letztere stellen die wichtigere Untergruppe für den molekularen

Mechanismus von KET dar. Hier kann weiter in N-Methyl-D-aspartat- (NMDA, Abb. 55),

α-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionsäure- (AMPA) und Kainat-Rezeptoren

unterteilt werden. Die Namen rühren daher, dass die entsprechende Substanz unter

experimentellen Bedingungen als Agonist am jeweiligen Rezeptor wirkt. Glutamat als

wichtigster exzitatorischer Neurotransmitter ist unter anderem essentiell für Lern- und

Gedächtnisvorgänge287.



Abb. 56: Schematische Darstellung der Funktionsweise des NMDA-Rezeptors: Im offenem Zustand (u. a. durch Bindung von L-Glutamat und Glycin in den jeweiligen Bindetaschen der LBD) wird die Rezeptorpore von einem Mg(II)-Kation blockiert, durch Depolarisation der Zelle wird das blockierende Mg(II)-Kation kurzzeitig ausgetauscht und ermöglicht den Wechsel von Na+ und Ca2+ in und K+ aus der Zelle, „Porenblocker“ (nicht-kompetitive Antagonisten) wie Ketamin und MK-801 binden an der PCP-Bindestelle und beeinflussen somit das Öffnungsverhalten und die Signalweiterleitung (Polyamin- und Zn2+-Bindetasche nicht gezeigt).

KET blockiert den geöffneten NMDA-Rezeptor nicht-kompetitiv nahe der Position, an der

unter physiologischen Bedingungen ein Magnesium(II)-Kation die Ein- bzw. Auslasspore

besetzt (Abb. 56). Es verhindert damit den Austausch von Ca2+, Na+ und K+-Ionen und

beeinflusst auch die nachgeschaltete Bindung von Ca2+ an Calmodulin, welche in noch

weiteren Schritten unter anderem zu einer Aktivierung verschiedener Kinasen und zur

Freisetzung von Stickstoffmonoxid führt283. Es konnte gezeigt werden, dass das S-Isomer

von KET gegenüber dem R-Enantiomer eine drei bis vier Mal höhere Affinität zum NMDA-

Rezeptor besitzt288. Andere Wirkungen von KET wie z. B. an Opioid- und Sigmarezeptoren

oder dopaminerge Effekte werden ebenfalls beschrieben289.

Erste Untersuchungen aus dem Jahr 1990 zeigen eventuelle Zusammenhänge zwischen

antidepressiven Verhaltensmustern und NMDAR-Antagonismus290. Mäuse, mit denen ein

erzwungener Schwimmtest durchgeführt wurde, zeigten bei Gabe eines kompetitiven

(AP-7) und eines nicht-kompetitiven (MK-801, Abb. 57) NMDAR-Antagonisten

dosisabhängig eine Linderung der Symptome, die durch den Stresstest provoziert wurden.

Abb. 57: Strukturformeln von ausgewählten NMDAR-Antagonisten.

Die Hinweise, dass NMDA-Rezeptoren im Krankheitsgeschehen der Depression mitwirken,

verdichteten sich weiter in Untersuchungen, bei denen Imipramin über zwei Wochen

appliziert wurde291. Dabei kam es zu Modulationen des NMDAR-Komplexes, woraus die

Autoren schlossen, dass auch glutamaterge Signalwege von Antidepressiva betroffen sein



müssen. Im Jahr 2000 konnten die Folgerungen aus Grundlagenforschung und

Tierversuchen dann in einer kleinen klinischen Studie bewiesen werden292: Einem

Patientenkollektiv von neun depressiven Freiwilligen wurde eine subanästhetische Dosis

Ketamin i. v. verabreicht. Innerhalb von drei Tagen zeigten sich robuste Verbesserungen

der durch die Depression verursachten Symptome. Damit wurde der Weg für einen

regelrechten „Ketaminboom“ geebnet, welcher bis heute anhält und mittlerweile auch in der

Populärpresse angekommen ist293.

KET wird im ersten Schritt des Metabolismus (Abb. 58) überwiegend durch Cytochrom

P450 3A4 zu Norketamin (NK) demethyliert. NK besitzt noch etwa ein Fünftel der Potenz

von KET. Ausgehend von NK ist ferner eine Dehydrierung sowohl zu Dehydronorketamin

(DNK), als auch eine Hydroxylierung an den Positionen 4, 5 und 6, möglich. Jede

eingeführte OH-Funktion resultiert in einem zweiten Chiralitätszentrum, welches in der

Summe eine Bildung von zwölf verschiedenartigen Hydroxynorketaminen (HNK)

ermöglicht. Theoretisch ist ebenfalls die direkte Hydroxylierung von KET denkbar und

würde zu zwölf Hydroxyketaminen (HK) führen. Über die Alkoholfunktionen lässt sich

außerdem eine glykosidische Bindung mit Glucuronsäure ausbilden (vgl.294-296).

Mittlerweile existieren Übersichtsarbeiten und Reviews, welche bisherige

Probandenstudien zusammenfassen und analysieren297-299. Danach ist mit einem Eintritt

der antidepressiven Wirkung nach einmaliger intravenöser Gabe nach zwei bis vier Stunden

zu rechnen und hält bis zu sieben Tage an. Bei therapieresistenter Depression scheint sich

KET zu einer substanziellen Alternative zu entwickeln, was sich auch in der Anzahl und

Ausrichtung momentan laufender klinischen Studien widerspiegelt300-302. Völlig

nebenwirkungsfrei ist KET dabei jedoch nicht: Trotz guter Verträglichkeit wurden

psychotomimetische Effekte (u. a. Agitation, Paranoia und Psychosen, jedoch viel seltener

als unter anästhetischer Dosierung), Schläfrigkeit/Sedierung, erhöhter Blutdruck und

dissoziative Zustände während und bis zu einer Stunde nach der Infusion registriert.

Letzteres erklärt auch das erhöhte Missbrauchspotential des Wirkstoffes (u. a.

Halluzinationen und Out-of-Body-Phänomene). Eventuell steht die Inzidenz der

Nebenwirkungen im Zusammenhang mit der Art und Häufigkeit der Applikation. So musste

eine Studie mit mehrfacher intranasaler Gabe von KET auf Grund von schwerwiegenden

Nebenwirkungen abgebrochen werden303, bei den bisher häufiger durchgeführten Studien

mit einmaliger i. v. Dosierung war das Nebenwirkungsprofil deutlich günstiger.


Abb. 58: In vivo Metabolismus von Ketamin (mod. nach294,296,304,305): i) Demethylierung von Ketamin führt zu Norketamin, ii) durch anschließende Dehydrierung wird Dehydronorketamin erhalten, iii) die Hydroxylierung von Norketamin kann an insgesamt drei Positionen erfolgen und führt somit zu 12 Hydroxynorketamin-Metaboliten, iv) auch eine vorangestellte Hydroxylierung ist möglich, welche 12 Hydroxyketamin-Derivate zur Folge hat, v) eine anschließende Demethylierung führt wiederum zu den 12 Hydroxynorketaminen. Die neu eingeführte Alkoholfunktion kann für eine Kupplung mit Glucuronsäure genutzt werden. Racemisches Norketamin-d4 wurde als interner Standard benutzt. Nur die hervorgehobenen Metaboliten waren für die SFC-MS-Methode relevant, weshalb auch auf die explizite Darstellung aller möglichen Enantiomere bzw. Diastereomere verzichtet wurde.

O

NH

Cl

O

NH2

Cl

O

NH2

Cl

HO

OCl

D

D

D

DNH2

O

NH

Cl

O

NH2

Cl

HO

O

NH2

Cl

HO

O

NH2

Cl

HO

O

NH2

Cl

O

NH2

Cl

O

NH2

Cl

O

NH

Cl

O

NH

ClO

NH

Cl

HO

OHHO

O

NH2

Cl O

NH2

Cl

HOOH

R-Ketamin S-Ketamin

2R,4R-Hydroxyketamin2S,4S-Hydroxyketamin2R,4S-Hydroxyketamin2S,4R-Hydroxyketamin



R-Norketamin S-Norketamin

R-Dehydronorketamin

S-Dehydronorketamin

2R,6R-Hydroxynorketamin 2S,6S-Hydroxynorketamin

2R,6S-Hydroxynorketamin 2S,6R-Hydroxynorketamin

weitere Konjugation mit Glucuronsäure mgl.

rac-Norketamin-d4

2R,4R-Hydroxynorketamin2S,4S-Hydroxynorketamin2R,4S-Hydroxynorketamin2S,4R-Hydroxynorketamin

2R,5R-Hydroxynorketamin2S,5S-Hydroxynorketamin2R,5S-Hydroxynorketamin2S,5R-Hydroxynorketamin

weitere Konjugation mit Glucuronsäure mgl. weitere Konjugation mit Glucuronsäure mgl.

i

iiiii

iii

iv

v



In einer Konsenserklärung, welche aber explizit keine Leitlinie darstellen soll, werden

Hinweise für die potentielle Off-Label-Therapie und die damit zusammenhängende

Patientensicherheit genannt306. Die Dosierung ist hierbei bedeutend geringer, in der Regel

0,5 mg/kg, als bei der Allgemeinanästhesie (1,0-2,0 mg/kg285), jedoch vergleichbar mit den

in der Schmerztherapie üblichen Mengen. S-KET wird üblicherweise in der Anästhesie mit

0,5-1,0 mg/kg dosiert307, in der Therapie von depressiven Erkrankungen wurde bisher

größtenteils racemisches KET untersucht.

Ob die Wirkung von KET ausschließlich über einen Antagonismus von NMDA-Rezeptoren

ausgeübt wird, ist mittlerweile umstritten. Der in der Alzheimer-Therapie eingesetzte

moderate NMDAR-Antagonist Memantin (Abb. 57) konnte in kleineren Studien nicht die

gleichen positiven Effekte bei Depression aufzeigen wie KET308. Eine im Jahr 2016

veröffentlichte Studie wies im Nagermodell nach, dass 2R,6R-HNK (Abb. 58) ebenfalls

durch Stresstests verursachte depressionsähnliche Symptome lindern kann305. Interessant

ist dabei der nicht NMDA-abhängige Mechanismus, stattdessen konnte eine Beeinflussung

der glutamatergen Signalgebung über den AMPA-Rezeptor nachgewiesen werden. In der

Folge kam es zu wissenschaftlichen Diskussionen, unter anderem darüber, dass

Nagermodelle nicht ohne weiteres auf den Menschen übertragbar seien und dass R-KET

in Experimenten eine mitunter länger anhaltende antidepressive Wirkung gezeigt hätte309-

313. In einer weiteren klinischen Studie konnte außerdem dargelegt werden, dass intranasal

appliziertes S-KET ebenfalls gute Wirkungen bei therapieresistenter Depression aufzeigt314.

Da es in vivo nicht zur Racemisierung kommt, können dementsprechend bei der Applikation

von S-KET an Position 2 keine R-konfigurierten Metabolite entstehen315. Die Idee jedoch,

dass 2R,6R-HNK bei ähnlicher Effektivität nebenwirkungsärmer als die Muttersubstanz sein

könnte, veranlasste die erstbeschreibenden Autoren zur Patentierung der Substanz316.

Andere molekulare Ansätze untersuchen eine Beeinflussung von glutamatergen Neuronen

in der lateralen Habenula im Epithalamus317 oder auch antiinflammatorische und

immunmodulierende Eigenschaften von KET318. Es bleiben also noch vielfältige Fragen auf

molekularer Ebene offen. Die für die Patienten wichtigen Punkte der Dosierung,

Langzeitanwendung, -effektivität und -sicherheit, sowie die Frage, ob es sinnvoller ist KET

oder einen Metaboliten zu applizieren, scheinen einer offiziellen Zulassung für die Indikation

(therapieresistente) Depression bislang noch im Weg zu stehen. Aber gerade für die

Analytik der biologischen Matrices von Probandenproben unter anderem zur Dosisfindung

und Metabolitenaufklärung ist es von Wichtigkeit, dass Tools und Methoden zur Verfügung

gestellt werden, die den hohen Ansprüchen von Richtigkeit und Präzision genügen.

Aufgrund der mittlerweile über 50-jährigen Geschichte der Anwendung von KET als

Arzneistoff, sind demgemäß diverse analytische Methoden beschrieben. Neben

zahlreichen gaschromatographischen Methoden (u. a. 294,295,319,320), soll vor allem auf

flüssigchromatographische Verfahren eingegangen werden. Hierbei wird das



Hauptaugenmerk häufig auf die Trennung von KET und NK, welches als Hauptmetabolit

angesehen wurde, gelegt321,322, wobei auch enantioselektive Methoden für beide Analyten

zahlreich beschrieben wurden323-325. Dass es sich dabei nicht immer um Analysetechniken

für den bestimmungsgemäßen Gebrauch von KET handeln muss, wird unter anderem in

Methoden gezeigt, welche neben der Erfassung von KET auch andere basische

Substanzen mit Missbrauchspotential wie Amphetamine oder Opioide einschließen326.

Weitere Methoden beschreiben die Mitauftrennung des Metaboliten DHK327. Ein aktueller

Review gibt eine Übersicht über chromatographische Methoden seit dem Jahr 2000328. HK-

und HNK-Metabolite wurden mittlerweile ebenfalls untersucht304,329. Im Abschnitt 3.4

werden einzelne Publikationen im Kontext der hier vorgestellten SFC-MS-Methode genauer

verglichen und diskutiert.

Jeder Entwicklung eines chromatographischen Verfahrens liegt eine möglich exakte

Problemstellung zu Grunde. Wichtige Parameter sind neben der Anzahl und Art der

Analyten auch die Probenmatrix, zu erwartende Messbereiche und Anforderungen an

Analysengeschwindigkeit und Probenvorbereitung. Auch das Umweltbewusstsein rückt

immer mehr in den Vordergrund. Mit konkreten Bezug auf diese Arbeit lassen sich folgende

Prämissen zentralisieren: Eine parallele und enantioselektive Quantifizierung von rac-KET,

rac-DHK, rac-NK, rac-6-HNK und rac-NK-d4 innerhalb einer Methode soll ermöglicht

werden. Für die Probenmatrix wird Urin gewählt, der Messbereich muss so bemessen sein,

dass bei einer Infusion von 5 mg rac-KET alle Metaboliten quantifizierbar sind. Ferner soll

die Probenvorbereitung einen sinnvollen Beitrag zur Reduktion der Matrixbelastung leisten.

Die Methode sollte dabei schnell sein und einen unnötig hohen Verbrauch an Lösungsmittel

vermeiden. Mit Hilfe bisher wenig genutzter Tools, wie der Superkritischen

Fluidchromatographie, können neue Akzente in der Analytik gesetzt werden. Im Folgenden

wird daher eine kurze Einführung in die Möglichkeiten gegeben.

3.1.3 Allgemeines zur Superkritischen Fluidchromatographie und ihre Vorteile

Die Superkritische Fluidchromatographie (SFC) nutzt neben der GC und der HPLC eine

dritte Art der Interaktionsmöglichkeit von stationärer und mobiler Phase. Die Bezeichnung

leitet sich aus der Verwendung von überkritischen (im englischen Sprachgebrauch auch

superkritischen) Stoffen als mobile Phase ab. Zur Überführung von chemischen

Verbindungen aus ihrer Gas- oder Flüssigphase in den überkritischen Zustand, muss der

kritische Punkt überschritten werden. Gleichen sich die Dichten von Gas- und Flüssigphase

bis zu diesem Punkt noch an, kann der Aggregatzustand nach Überschreiten dieses Punkts

nicht mehr unterschieden werden. Der kritische Punkt ist stoffspezifisch und abhängig von

der Temperatur und dem Druck. In der SFC wird vor allem Kohlenstoffdioxid verwendet.

Bereits bei 31,0 °C und 73,8 bar kann hier der überkritische Zustand erreicht werden. Im



Gegensatz zu den in dieser Hinsicht ähnlichen Gasen Distickstoffmonoxid oder Ammoniak

sind weitere Vorteile vorhanden: Kohlenstoffdioxid ist nicht brennbar beziehungsweise

brandfördernd, nicht toxisch, relativ inert und kostengünstig. Des Weiteren steht auch die

Senkung des Verbrauchs von Methanol und Acetonitril als klassische organische

Bestandteile von mobilen Phasen in der Chromatographie im Fokus. Aus diesem Grund

wird die SFC der Green Chemistry zugeordnet.

Die Idee der Benutzung von überkritischen Stoffen als mobile Phase ist nicht neu. Bereits

im Jahr 1958 wurde die Nutzung überkritischer Fluide für die chromatographische

Separierung von Analyten vorgeschlagen330. Es dauerte anschließend vier Jahre bis zur

ersten konkreten Umsetzung dieser Idee331. Die erste kommerziell erhältliche SFC-Anlage

wurde in den frühen 1980er Jahren von der Firma Hewlett-Packard eingeführt332, während

die ersten Kopplungen von SFC-Geräten mit Massenspektrometern in den späten

1980er/frühen 1990er Jahren beschrieben wurde333,334. Doch trotz des großen Potentials

und zahlreicher Publikationen konnte sich die SFC gegenüber der HPLC und GC bisher

nicht durchsetzen. Seit einigen Jahren bieten nun die drei großen Hersteller von

Chromatographiesystemen Agilent, Waters und Shimadzu technische Lösungen für die

SFC an. Durch die verbesserte und weiterentwickelte Technik sollen Unterschiede in

Zuverlässigkeit und Robustheit von HPLC- und GC-Systemen im Gegensatz zu SFC-

Anlagen minimiert werden.

Abb. 59: Schematischer Aufbau eines SFC-MS-Systems (BPR: Back Pressure Regulator, PDA: Photo Diode Array Detektor).

Der Aufbau von SFC-Maschinen ähnelt im Wesentlichen dem der HPLC (Abb. 59). Ein

neues Bauteil ist die CO2-fördernde Pumpe, welche im Falle der in dieser Arbeit

verwendeten Shimadzu-Anlage das Kohlendioxid in flüssiger Form über ein Steigrohr aus

der CO2-Vorratsflasche entnimmt. Um sicherzustellen, dass das Kohlendioxid erst nach der

Analyse wieder in den gasförmigen Zustand übergeht, ist dem System ein Restriktor (Back

Pressure Regulator, BPR) nachgeschaltet, welcher standardmäßig einen Rückdruck von

150 bar (individuell anpassbar) erzeugt. Da sich das CO2 nach der Passage des BPR

entspannt und so gegebenenfalls nicht genügend Flüssigkeit für ein konstantes Spray für

die Elektrospray-Ionisation (ESI) zur Verfügung steht, ist noch eine weitere Pumpe



notwendig. Diese wird Makeup-Pumpe genannt, greift nicht in die eigentliche Analyse ein

und ist ausschließlich für die Aufrechterhaltung eines konstanten Sprühnebels in der ESI

zuständig.

Überkritische Fluide besitzen ähnliche Dichten wie Flüssigkeiten, jedoch auch das

Diffusionsvermögen, die Oberflächenspannung und Viskosität von Gasen. Somit vereinen

sie das Lösungsvermögen und die Elutionskraft einer Flüssigkeit mit dem hohen

Massentransfer und der guten Penetration in poröse stationäre Phasen von Gasen335.

Diese Eigenschaften ermöglichen hohe Flussraten, geringe Rückdrücke über die Säule und

kurze Analysezeiten bei nicht benachteiligter Auflösung und Peakform.

Dass überkritisches CO2 (sCO2) die gleichen Eigenschaften wie kurzkettige

Kohlenwasserstoffe innehat, stimmt nur bezogen auf die Polarität. Beide besitzen einen

streng hydrophob ausgeprägten Charakter. Hingegen können beispielsweise die freien

Elektronenpaare an den Sauerstoffatomen des Kohlendioxids genutzt werden, um

Wasserstoffbrückenbindungen auszubilden, was wiederum Auswirkung auf Selektivität und

Retention haben kann336. Um auch stärker polare Analyten eluieren zu können, kann dem

sCO2 ein Modifier zugesetzt werden, welcher über die Modifier-Pumpe der mobilen Phase

beigemengt wird. Üblicherweise werden dafür Meth-, Eth- oder Isopropanol verwendet.

Auch der Zusatz von Acetonitril oder sogar kleinen Anteilen von Wasser können eine Option

darstellen. Hier ergibt sich jedoch ein Punkt, welcher nicht nur zu Terminologiefragen führt:

Bei Zunahme des Modifiers ändert sich auch der kritische Punkt der mobilen Phase. So

kann es eintreten, dass beispielsweise in einem steilen Gradienten der überkritische

Zustand unterschritten wird. Hier wird dann, vor allem in der englischen Literatur, von einem

subkritischen Zustand gesprochen, welcher so jedoch nicht definiert ist, da unterhalb des

kritisches Punkts lediglich der gasförmige oder flüssige Zustand existiert337. Es gibt jedoch

Untersuchungen, bei denen die CO2-Phase bewusst nur in einem flüssigen Zustand

gehalten wurde338, mit dem Ergebnis, dass die Chromatogramme mit über- oder

subkritischen mobilen Phasen kaum differieren. In diesem Zusammenhang fiel auch der

Begriff der Convergence Chromatography. Es muss aber in jedem Falle gewährleistet sein,

dass, sofern mehrere Komponenten für das Fließmittel verwendet werden, keine

Phasentrennung eintritt. Diese würde nicht nur zu einem erhöhten Rauschen im

Detektorsignal führen, sondern kann auch die eigentliche Trennung nachhaltig negativ

beeinflussen339,340.

Ein Review und ein Editorial aus dem Jahr 2014 heben die besondere Stellung der SFC in

der Analyse von chiralen Molekülen hervor341,342. Es konnte gezeigt werden, dass vor allem

die Kombination von hohen Flussraten und Polysaccharidphasen einen gewissen

Synergismus besitzt. Allerdings sind durchaus auch Nachteile vorhanden: das allgemeine

Knowhow in der Methodenentwicklung ist verglichen mit dem in der HPLC marginal, die

Anschaffungskosten von SFC-Geräten sind nach wie vor ungleich höher als für etabliertere



Flüssigchromatographen und durch die komplexen Zusammenhänge von Druck,

Temperatur, Dichte und damit auch Polarität von mobilen Phasen gibt es viele Parameter,

welche die SFC sehr vielschichtig machen. So ist es wenig verwunderlich, dass selbst in

einem aktuellen Review aus dem Jahr 2018 die Hauptanwendung der SFC bei der Analyse

von klinischen Proben im chiralen Bereich gesehen wird343.

Zusammenfassend sollte gesagt werden, dass die SFC keinesfalls als Ersatz von HPLC

oder GC zu behandeln ist, sondern vielmehr ein ergänzendes Verfahren darstellt. Die Vor-

und Nachteile sind seit Jahrzehnten bekannt, die Umsetzung nach wie vor noch

zurückhaltend. Es soll somit auch ein Ziel dieser Arbeit sein, weitere Erfahrungen im

Umgang mit der SFC zu sammeln und diese dem Fachpublikum zugänglich zu machen.

3.1.4 Besonderheiten der Analyten bei der Detektion mit einem Single-Quadrupol-Massenspektrometer

Eine Besonderheit der Analyten findet sich in ihrer unterschiedlichen

Isotopenzusammensetzung, begründet vor allem in den zwei stabilen Chlor-Isotopen 35Cl

und 37Cl. Die relative Molekülmasse eines 37Cl-enthaltenden KET-Moleküls ähnelt dem

eines 35Cl-enthaltenden 6-HNK-Moleküls, wenn beide ansonsten aus den häufigen

Stabilisotopen 1H, 12C, 14N und 16O zusammengesetzt sind. Auch Überschneidungen

hinsichtlich eines NK- und eines DNK-Analyten mit entsprechender

Isotopenzusammensetzung sind vorhanden (Tab. 17). Ein solches Auftreten von isobaren

Überlappungen kann die Selektivität einer Methode erheblich beeinträchtigen. Das Single-

Quadrupol-Massenspektrometer (SQMS), welches für diese Arbeit genutzt wurde, kann

aufgrund unzureichender Massengenauigkeit nicht zwischen den genannten

Isotopenzusammensetzungen unterscheiden.

Dieses Phänomen kann jedoch instrumentell oder chromatographisch gelöst werden: durch

die Benutzung eines hochauflösenden Massenspektrometers, z. B. durch die Kombination

einer Quadrupol-Ionenfalle und eines Flugzeitmassenanalysators (IT-TOF), ist die

Auflösung der Molekülmassen so exakt, dass auch im ppm-Bereich differenziert werden

kann. Ein Triple-Quadrupol-Massenspektrometer (QqQ, Tandem-MS oder MS/MS) erreicht

diese Massengenauigkeit zwar nicht, durch das Vorhandensein einer Kollisionszelle, in

welcher Fragmentierungen der Moleküle möglich sind, weist das Tandem-MS aber eine

erhöhte Selektivität auf. Das Mutter-Ion wird dabei von dem ersten Quadrupol durch sein

Masse-Ladungsverhältnis (m/z) selektiert und anschließend in der Kollisionszelle

fragmentiert. Die entstanden Tochter-Ionen werden zur Quantifizierung (Quantifier-Ion) und

zur Bestätigung der Messung (Qualifier-Ion) genutzt. Diese Massenübergänge (Transition)

sind in der Regel spezifisch für jedes Molekül, weshalb das Tandem-MS eine sehr hohe



Selektivität aufweist. Beide instrumentelle Lösungen kommen für die gegebene

Fragestellung jedoch aufgrund der sehr hohen Anschaffungskosten nicht in Frage.

Tab. 17: Isotopenverteilung der zu untersuchenden Metaboliten (1 nur der drei häufigsten Isotope).

Stoffname

Summenformel Isotopenverteilung1 [M+H+] für Quantifizierung Rel. Molekülmasse Fraktion (%)

Ketamin (KET) C13H16ClNO 237,0920 238,0920 239,0920

65,3 9,6 21,6

238

Norketamin (NK)

C12H14ClNO 223,0763 224,0763 225,0763

66,1 8,9 21,8

224

Dehydronor-ketamin (DNK)

C12H12ClNO 221,0607 222,0607 223,0607

66,1 8,9 21,8

222

6-Hydroxynor-ketamin (6-HNK)

C12H14ClNO2 239,0713 240,0713 241,0713

65,9 8,9 21,9

240

Norketamin-d4

(NK-d4) C12H10D4ClNO 227,1010

228,1010 229,1010

66,1 8,9 21,8

228

Der effizientere Weg auch mit einem SQMS eine ausreichende Selektivität für Stoffe mit

isobaren Überlappungen zu erreichen, liegt in der zufriedenstellenden

chromatographischen Separierung der einzelnen Stoffe. Nur wenn sich die

Retentionszeiten signifikant unterscheiden (bei einer Auflösung > 1,5) und diese robust

über mehrere Messreihen hinweg und unter eventuellen Beeinträchtigungen von

Matrixbestandteilen bestehen bleibt, kann davon ausgegangen werden, dass die

vorliegende Methode den Anforderungen einer Validierung genügt.

3.1.5 Parameter der Validierung von chromatographischen Methoden

Die DIN EN ISO/IEC 17025:2005 (Überarbeitung 2018) für die allgemeinen Anforderungen

an die Kompetenz von Prüf- und Kalibrierlaboratorien beschreibt die Validierung als

Bestätigung durch Untersuchung und Bereitstellung eines Nachweises, dass die

besonderen Anforderungen für einen speziellen Gebrauch erfüllt werden. Praktische

Umsetzungen für unter anderem chromatographische Methoden erfolgen in der Regel

durch nationale oder internationale Gesellschaften oder Institutionen und sind angepasst

an die jeweiligen Erfordernisse. Für das Validierungsprozedere in dieser Arbeit wurden

hauptsächlich die Richtlinien der European Medicines Agency (EMA)344, welche in einigen

Punkten von denen der Food and Drug Administration (FDA)345 ergänzt wird, angewendet.

Die darin vorgeschlagenen Parameter sollen im Folgenden kurz erläutert werden.



3.1.5.1 Selektivität

Selektivität ist die Fähigkeit, alle Analyten von Interesse nebeneinander und ohne

gegenseitige Störungen zu bestimmen. Nicht nur die bereits herausgearbeitete Thematik

der isobaren Überlappungen bei der Detektion mit dem SQMS (Abschnitt 3.1.4), sondern

auch die Komplexität der Matrix erschweren den Nachweis dieses Parameters. Neben dem

Vermessen von Leerwerten zur Ermittlung von Systempeaks wird weiterhin die Erfassung

von Matrixsignalen aus sechs verschiedenen Leermatrices gefordert. Es geht dabei nicht

um die völlige Abwesenheit von Fremdsignalen, was bei einer komplexen Matrix wie Urin

ohnehin nicht möglich wäre, sondern vielmehr um das Verhältnis der Signale von Analyt zu

Matrix, welches eine bestimmte Schwelle, bezogen auf die Bestimmungsgrenze und den

internen Standard (IS), nicht überschreiten darf. Dem Goldstandard, nämlich die

Identifizierung der unbekannten Peaks anhand von zertifiziertem Referenzmaterial

vorzunehmen, konnte größtenteils entsprochen werden, da zum einen die Wege des

Metabolismus bekannt und zum anderen alle Standards (bis auf die 6-HNK-Enantiomere)

in zertifizierter Qualität käuflich zu erwerben waren.

3.1.5.2 Kalibrierfunktion

Die Kalibrierfunktion gibt den Zusammenhang von Messsignal zur Analytenkonzentration

über den Messbereich an. Für den Unterpunkt wurde bewusst auf die Bezeichnung

„Linearität“ verzichtet, da diese einen Zusammenhang auf Grundlage der mathematischen

Gleichung � = � + ∗ � impliziert. Es ist aber keineswegs vorgeschrieben, ein lineares

Modell für die Kalibierfunktion zu wählen. So spricht die EMA-Richtlinie von einem

„einfachen und adäquaten Zusammenhang des Messsignals und der Konzentration der

Analyten“. Es ist also nicht vorgeschrieben, welche mathematische Regression zu wählen

ist, solange die notwendige Reproduzierbarkeit erreicht wird. Es soll lediglich der

einfachste, aber auch der akkurateste Zusammenhang gewählt werden. Als

Beurteilungsparameter können beispielsweise die optische Betrachtung der

Geraden/Kurve, die Analyse der Korrelationskoeffizienten bzw. des Bestimmtheitsmaßes

oder auch mathematische Tests auf Linearität (z. B. F-Test nach Mandel) herangezogen

werden.

Die Proben der Kalibrierung sollen auf dem gleichen Weg hergestellt werden, wie auch die

Probandenproben. Neben sechs unterschiedlichen Kalibrierkonzentrationen, werden

ebenfalls eine Blank-Probe (double blank, verarbeitete Matrix ohne Analyten und ohne IS)

und eine Null-Probe (single blank, verarbeitete Matrix ohne Analyten aber mit IS)

vorgeschlagen. Der Arbeitsbereich soll den zu erwartenden Bereich abdecken und wird

nach unten von der Bestimmungsgrenze (LLOQ, Lower Limit Of Quantification) und nach

oben von dem Upper Limit Of Quantification (ULOQ) begrenzt.



Die durch die mathematische Funktion berechneten Messpunkte sollen von den

Nominalmesswerten (die Werte, die als richtig angesehen werden) nicht mehr als ±15 %

abweichen, im Bereich des LLOQ sind Abweichungen auf ±20 % zu begrenzen. Die

Herstellung der Proben für die Kalibrierfunktion erfolgt vorzugsweise frisch an jedem

Messtag.

3.1.5.3 Unterstes Quantifizierungslevel

Die Bestimmungsgrenze oder auch LLOQ ist die Konzentration, bei welcher der Analyt mit

hinreichender Richtigkeit und Präzision noch zuverlässig quantifiziert werden kann. Sie

sollte den zu erwartenden Konzentrationen angepasst sein und bildet den niedrigsten

Kalibrierlevel ab. Praktisch sollte das LLOQ mindestens dem fünffachen Signal der Blank-

Probe entsprechen. Ältere Richtlinien sehen aber zum Teil auch das Signal/Rausch-

Verhältnis als maßgebend an346. Dieses sollte mindestens 10 betragen.

3.1.5.4 Richtigkeit

Die Richtigkeit ist einer der wichtigsten Parameter einer Validierung und ist ein Maß für die

Übereinstimmung von gemessenem Wert gegenüber dem Nominalwert. Sie ist somit

Ausdruck für den systematischen Fehler und wird üblicherweise in Prozent (als Abweichung

vom wahren Wert) angegeben. Ermittelt wird die Richtigkeit mit Hilfe von Qualitätskontrollen

(QC), welche in Analogie zu den Probanden- und Kalibrierproben, aber separat, hergestellt

werden. Es wird ferner unterschieden, ob die QCs innerhalb eines Analysenlaufs (within-

run) oder verschiedener Analysenläufe (between-run) gemessen werden. Für beide sollen

mindestens jeweils 5 Proben vermessen werden, welche den Bereich vom LLOQ, über ein

mittleres (medium QC, 30-50 %) bis in ein hohes Niveau (high QC, ab 75 %) der Kalibration

abdecken. Die erhaltenen Werte sollen auch hier nicht mehr als ±15 % von den

Nominalwerten, am LLOQ ±20 %, abweichen.

3.1.5.5 Präzision

Die Präzision ist als Maß für die Übereinstimmung unabhängiger Analysenergebnisse

untereinander anzusehen (Streuung der Analysenergebnisse). Mit ihr kann der zufällige

Fehler, üblicherweise als Standardabweichung oder relativer Standardabweichung

(Variationskoeffizient), ausgedrückt werden.

Praktisch kann die Präzision mit denselben Proben erfasst werden, mit denen auch die

Richtigkeit bestimmt wird. Wichtig ist hierbei, dass within-run und between-run QCs

verwendet werden, welche sich über den gesamten Kalibrierbereich erstrecken. Die

Grenzen von ±15 % bzw. ±20 % (LLOQ) vom Nominalwert sind einzuhalten.


Methodenentwicklung und Validierung | 101

3.1.5.6 Wiederfindung, Matrix-Effekte und Stabilität

Die Wiederfindung eines Analyten einer Methode entspricht dem Verhältnis der

Messsignale einer Probe, welcher im Rahmen der Probenvorbereitung mit Matrix

verarbeitet wurde und der gleichen Probe, welche den Nominalwert repräsentiert (im

Normalfall eine Probe aus der Verdünnungsreihe ohne Matrix). Die Richtlinie sagt explizit,

dass die Wiederfindung nicht 100 % betragen muss, es geht vielmehr darum, dass Analyt

und IS reproduzierbar, einheitlich und präzise isoliert werden. Auch hier sollen drei

Konzentrationsbereiche (niedrig, mittel und hoch) abgedeckt werden. Der Vergleich soll mit

nicht extrahierten Proben vorgenommen werden, für welche eine 100%ige Wiederfindung

vermutet wird.

Vor allem bei massenspektrometrischen Methoden kann es durch Anwesenheit von Matrix

zur Erhöhung oder Erniedrigung der Ionenausbeute kommen347-350. Deshalb lässt die EMA-

Richtlinie auch auf Effekte der Matrix auf die Ionisierung von Analyten prüfen. Praktisch ist

dafür ein Abgleich der Signale von einem Analyten, welcher erst nach Aufarbeitung einer

Blank-Matrix zugesetzt wurde, und eines Analyten, welcher matrixfrei verarbeitet wurde,

möglich. Insgesamt sollen die Matrices von sechs individuellen Spendern stammen. Die

Konzentrationen orientieren sich wieder an niedrigen, mittleren und hohen Bereichen der

Kalibriergeraden. Die relative Standardabweichung zwischen den sechs interindividuellen

Matrices soll nicht mehr als 15 % betragen.

Detaillierte Untersuchungen zur Stabilität sind für die Qualität der Methode unabdingbar.

Es werden folgende Stabilitäten unterschieden: Einfrier-Auftau-Stabilität (Freeze-and-

Thaw-Stability), Bench-Top-Stabilität, Langzeitstabilität, Stammlösungsstabilität und

Stabilität der verarbeiteten Proben. Die zu lagernden Proben sollen mit einer frisch

zubereiteten Kalibrierfunktion vor und nach der Lagerung verglichen werden und dabei nicht

mehr als ±15 % des Nominalwertes abweichen.

3.2 Methodenentwicklung und Validierung

3.2.1 Entwicklung und Optimierung einer SFC-MS-Methode

Bei der Wahl der stationären Phase spielen mehrere Faktoren eine Rolle. So muss die

Säule SFC-kompatibel sein. Viele HPLC-Säulen sind auch SFC-beständig, zum Teil

unterscheiden sie sich aber in ihrem Dichtungsmaterial. Proteinphasen wie beispielsweise

immobilisiertes humanes Serum Albumin (HSA) oder α1-acid Glycoprotein (AGP) auf

porösem Silicagel sind laut Herstellerangaben nicht mit der SFC kombinierbar. Jedoch

bedienen sich bereits Methoden, die erfolgreich KET und einige KET-Metabolite getrennt

haben, letzterem Säulenmaterial304,329. Hingegen sind Polysaccharid-Phasen sehr gut

geeignet für überkritische Fließmittel. Besonders vorteilhaft scheinen Kieselgele zu sein,


102 | Methodenentwicklung und Validierung

welche mit einer Cellulose- oder Amyloseschicht überzogen wurden. So konnte bisher in

einer Säulenevaluation Ketamin zumindest im LC-Modus zufriedenstellend chiral getrennt

werden351. Gleichzeitig schlug jedoch die Trennung mit überkritischen mobilen Phasen fehl.

2R,6R-HNK und sein Enantiomer wurden erstmals auf einer Amylose-Phase separiert329,

allerdings nicht im SFC-Modus. Dennoch könnte die Lux Amylose-2 der Firma Phenomenex

mit Amylose-tris(5-chlor-2-methylphenylcarbamat) als Packungsmaterial eine geeignete

stationäre Phase darstellen (Abb. 60). Neben der helikalen Struktur der Amylose, werden

Möglichkeiten der Interaktion zwischen Analyt und stationärer Phase über

H-Brückenbindungen, Dipol-Dipol- sowie π-π-Wechselwirkungen ermöglicht. Auch

Halogen-Brücken wären über das chlorierte Phenylcarbamat denkbar.

Abb. 60: Amylose-tris(5-chlor-2-methylphenylcarbamat).

Um einen ersten Eindruck davon zu bekommen, ob die gewählte stationäre Phase geeignet

war, wurde die Trennung mit Standardparametern begonnen. So wurde zuerst auf das

Massenspektrometer als Detektor verzichtet, da die Optimierung von Ionisation und

Desolvatation für einen Gesamtüberblick an dieser frühen Stelle der Entwicklung zu

komplex wäre. Die Bedingungen sind in Tab. 18 angegeben und führten zu dem

Chromatogramm in Abb. 61. Die Analyten waren mit 50 µg/mL bewusst hoch konzentriert,

um in jedem Falle Signale zu erhalten.

Tab. 18: SFC-Parameter für den Scoutlauf mit der Lux Amylose-2.

Parameter Wert Flussrate (mL/min) 3 Mob. Phase (%) A (CO2) 90

B (Methanol + 0,1 % NH3) 10 Modus isokratisch Detektion (DAD) (nm) 220



Abb. 61: Erster Trennungsversuch von Ketamin-, Norketamin- und 6-Hydroxynorketamin-Enantiomeren mit 10 % MeOH (+0,1 % NH3) als Modifier.

Das Hauptaugenmerk bei der Bewertung des erhaltenen Chromatogramms lag auf der

Grundlinientrennung der beiden 6-HNK-Enantiomere. Unter den gegeben Bedingungen

wurde dieser Anforderung vollkommen entsprochen. Beide Stoffe wiesen eine einwandfreie

Peaksymmetrie ohne Tailing mit Basislinientrennung auf. Erfreulicherweise waren auch die

NK-Enantiomere unter diesen Parametern trennbar. Es zeigte sich aber eine

Überschneidung mit S-KET, was jedoch für die massenspektrometrische Analyse später

nicht relevant war, da zwischen KET und NK keine isobaren Überlappungen auftreten.

Weiterhin wurde klar, dass die Separierung der KET-Enantiomere die größte

Herausforderung darstellte, da hier keine Basislinientrennung erzielt werden konnte. Die

Analyten waren in diesen Scoutläufen nur teilweise gemischt und nicht mit Matrix belastet,

des Weiteren fehlte zu diesem Zeitpunkt noch DNK als weiterer Metabolit. Dennoch zeigten

diese ersten Versuche, dass die stationäre Phase in Kombination mit der SFC für die

Bearbeitung der Problemstellung geeignet zu sein schien.

Um die bisherige ungenügende Trennung der KET-Enantiomere zu optimieren, sollte der

Effekt verschiedener Modifier untersucht werden. Neben den Alkoholen Methanol und

Isopropanol (IPA), sollte auch der Einfluss von Acetonitril (ACN) evaluiert werden. Letzteres

verfügt über zwei π-Bindungen, welche mit den delokalisierten π-Elektronen des

aromatischen Systems des KETs in Wechselwirkung treten können. Abb. 62 zeigt die

Ergebnisse der isokratischen Trennung mit einer Flussrate von 3 mL/min und einem

Modifier-Anteil von 10 % unter Zusatz von 0,1 % NH3.

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0 9,5 min

-1000

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

10000

11000

12000

13000

14000

uV

R-KET S-KET

R/S-NK 2S,6S-HNK 2R,6R-HNK



Abb. 62: Untersuchungen des Einflusses von verschiedenen Modifiern auf die Trennleistung des Systems in Bezug auf die Trennung von racemischem Ketamin.

Die Auflösung war zweifelsohne bei der Verwendung von Isopropanol als organischen

Modifier am besten. Sie überschritt auch den kritischen Wert von 1,5, welcher eine

Basislinientrennung indiziert. Acetonitril als Modifier führte zu einer geringfügig besseren

Trennung als bei Verwendung von Methanol, allerdings zu Lasten der Peakform.

Interessant war ebenfalls der Vergleich der Retentionszeiten: Mit Methanol als Modifier

eluierten die Peaks im Mittel schon nach 2,4 min, mit Isopropanol nach 3,4 min und mit

Acetonitril nach 3,5 min. Das würde auch der Reihenfolge der Elutionskraft an einer

Normalphase entsprechen. Wird sCO2 simplifiziert als Hexan angenommen, erscheint

diese Betrachtungsweise nicht allzu abwegig. Weiterhin wird diese Theorie von dem Fakt

unterstützt, dass die erhaltene Reihenfolge der Retentionszeiten (erst KET, dann NK und

deutlich später HNK) einem Abfall der clogP-Werte (kalkuliert mit ChemBioDraw,

Version 13) entsprach (Abb. 61). Ketamin (clogP=2,93) eluierte als erstes, während das

weniger lipophile demethylierte NK (clogP=2,41) eine in diesem Dreierfeld mittlere

Retentionszeit aufwies. Das deutlich polarere HNK (clogP=1,58) wurde folglich mit

größerem Abstand eluiert. Es scheint also durchaus Parallelen zwischen den Mechanismen

von Normalphasen-Chromatographie und SFC zu geben. Dies sollte aber keinesfalls

verallgemeinert werden, da sich die Befunde ausschließlich auf die Lux Amylose-2 als

stationäre Phase beziehen.

Neben dem Modifier selber spielt auch das Additiv, welches dem Modifier zugegeben wird,

eine beachtliche Rolle für die Selektivität und Auflösung. So wurde z. B. bei einer chiralen

Trennung von rac-Phenylalaninmethylester auf einer Chiralpak AD Säule mit 20 % Ethanol

0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 min-0,25

0,00

0,25

0,50

0,75

1,00

1,25

1,50

1,75

2,00

2,25

2,50

2,75

3,00

3,25

3,50

3,75

4,00

4,25

4,50

4,75

5,00

5,25

5,50

5,75

(x1,000,000)

ACN: RS=0,99

MeOH: RS=0,87

IPA: RS=1,54

cps



als Modifier nur ein Peak erhalten. Unter Zusatz von 0,1 % Cyclohexylamin zum Modifier

erfolgte schon eine teilweise Trennung der Enantiomere und bei einer Additivkonzentration

von 1,0 % Cyclohexylamin wurde das Racemat basisliniengetrennt352. Somit könnte der

Effekt eines Additivs eventuell den des Modifiers noch übersteigen, ist aber in jedem Falle

eine Untersuchung wert. Aufgrund der direkten Kopplung mit dem Massenspektrometer

sollten allzu schwer verdampfbare Amine vermieden werden, weshalb sich die Auswahl des

Additivs auf wässrige Ammoniaklösung beschränkte.

Die Auswirkungen auf die Auflösung von den KET-Enantiomeren bei unterschiedlichen

Konzentration von NH3 im Modifier waren deutlich (Abb. 63). Als organische Komponente

wurde hier aufgrund der erfolgreichen Vortests Isopropanol gewählt. Die NH3-Beigaben

betrugen 0,02, 0,05 und 0,075 %, die Flussrate 3 mL/min bei 8 % organischem Modifier.

Bei der niedrigsten Konzentration an NH3-Zusatz erfolgte keine Trennung zwischen den

KET-Enantiomeren. Bei 0,05 % kam es immerhin zu einer teilweisen Trennung, welche bei

0,075 % noch einmal zunahm. Die erhaltene Basislinientrennung wurde offensichtlich nur

ab einer Additivkonzentration von über 0,1 % NH3 erreicht (Abb. 62). Damit können die

Befunde aus der eingangs erwähnten Literatur, dass das Additiv einen ausgeprägten

Einfluss auf das Trennergebnis hat, bestätigt werden.

Abb. 63: Verbesserung der Auflösung bei der Trennung von racemischen Ketamin durch unterschiedliche NH3-Konzentrationen.

Folglich wäre es sinnvoll gewesen, mit einer NH3-Konzentration von 0,1 % weiter zu

arbeiten. Allerdings wurde dies erschwert durch drastisch ansteigende Rückdrücke, die

nach etwa fünf bis zehn Injektionen auftraten. Ein anschließender Spülgang mit über 50 %

Methanol vermochte das Problem nur kurzzeitig zu lösen. Laut Hersteller soll die Säule mit

0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 min

0,00

0,25

0,50

0,75

1,00

1,25

1,50

1,75

2,00

2,25

2,50

2,75

3,00

3,25

3,50

3,75

4,00

4,25

4,50

4,75

5,00

5,25

5,50

5,75

6,00

6,25

6,50

6,75

(x100,000)cps

RS=0 bei 0,02 % NH3

RS=0,47 bei 0,05 % NH3

RS=0,87 bei 0,075 % NH3



basischen Zusätzen bis zu einer Konzentration von 0,5 % im organischen Laufmittel

kompatibel sein353. Da es auch nach vielen Injektionen nicht zu einer Änderung des

Trennungsbildes kam, war die chemische Degradation des chiralen Rückgrats der

stationären Phase oder der Kieselgelbasis auszuschließen. Um dennoch den steigenden

Rückdrücken entgegenzuwirken, wurde ein Gradient implementiert und ein Spülmethode

alle 10-15 Injektionen mit 25 % Methanol ohne Zusätze mit anschließender 20-minütiger

Einspülphase zwischengeschaltet (Tab. 19). Ferner wurde die Startkonzentration des

Modifiers auf 8 % festgelegt, da damit die besten Peakformen aller Analyten erzielt wurden.

Tab. 19: Integration des finalen Gradienten für die SFC-Methode.

Zeit (min) A (CO2) (%) B (IPA+0,075 % NH3) (%)

0–7 92 8 7,01–7,25 80 20 7,26–11 80 20 11,01–11,25 92 8 11,26–15 92 8

Bisher lag das Augenmerk vor allem auf der Optimierung der chromatographischen

Eigenschaften der Methode. Da die zu erwartenden Zielkonzentrationen von KET

beziehungsweise seiner Metaboliten im Urin bekannt waren (niedrige zweistellige ng/mL),

mussten die Nachweis- bzw. Bestimmungsgrenzen der Methode auch entsprechend

angepasst werden. Massenspektrometer besitzen in der Regel höhere Sensitivitäten als

PDAs. Außerdem sind sie weniger anfällig gegenüber Drifts oder Rauschen, wenn CO2 ein

Bestandteil der mobilen Phase ist und die SFC im Gradientenmodus betrieben wird.

Ein Parameter bei der Optimierung der Empfindlichkeit des SQMS ist das Drying-Gas.

Dieses dient der Entfernung von Lösungsmittelmolekülen während des

Ionisierungsprozesses. Sind die Analyten nicht vollständig desolvatisiert, kann die

Ionisierung und somit auch die Empfindlichkeit der Methode ungünstig beeinflusst

werden354.

Im Folgenden wurden mehrere Injektionen mit verschiedenen Drying-Gas-Flüssen (0, 5 und

10 L/min) und (2S,6S)-HNK bei einer Konzentration von 100 ng/mL durchgeführt (Abb. 64).

Während bei Abwesenheit des Trocknungsgases nicht einmal die Nachweisgrenze erreicht

wurde, lag bei einen Drying-Gas-Fluss von 10 L/min das Signal/Rausch-Verhältnis (S/N)

bei über 60. Allein mit dieser Einstellung konnte die Empfindlichkeit der Methode um mehr

als den Faktor 20 gesteigert werden.



Abb. 64: Auswirkungen des Drying-Gas-Flusses auf das Signal/Rausch-Verhältnis.

Des Weiteren wurde auch der Effekt der Heat-Block-Temperatur untersucht. Dieses Bauteil

umschließt die Ansaugöffnung des SQMS und dient ebenfalls der Desolvatation. Die

Variation der Temperatur von 200 auf 300 und 400 °C zeigte jedoch keine Unterschiede in

den S/N-Verhältnissen. Ein ähnlicher Befund zeigte sich nach Änderung der Interface

Voltage von 4,5 kV auf 4,8 kV, bei dem das S/N-Verhältnis ebenfalls nicht verbessert

werden konnte.

Da Ketamin bzw. dessen Metaboliten durch die Aminofunktion eine mäßig stark basische

Gruppe besitzen, ist es empfehlenswert durch Säurezugabe den Protonierungsprozess der

ESI zu unterstützen. Es wurde bereits gezeigt, dass die Zugabe von NH3 in den Modifier

unabdingbar für ein gutes Trennungsbild war, weshalb es nicht sinnvoll gewesen wäre, dem

Elutionsmittel auch noch Säure hinzuzufügen. Dafür bot sich jedoch die Makeup-Pumpe

an, da diese die Flüssigkeit erst nach Passage der Säule zusetzt. Aus diesem Grund wurde

Methanol mit 0,1 % Ameisensäure als Makeup-Flüssigkeit verwendet.

Ein letzter Schritt zum Erreichen der notwendigen Nachweisgrenze lag in der

Probenvorbereitung. Durch Aufkonzentrieren der Proben war es möglich die Methode

sensitiver zu gestalten. In der Praxis wurde eine Flüssig-Flüssig-Extraktion mit Methyl-tert-

butylether (MTBE) unter vorheriger Zugabe einer Natriumcarbonat-Lösung, welche die

Protonierung der Aminofunktion der verschiedenen Analyten zurückdrängen sollte,

gewählt. Bei einem Ausgangsvolumen von 1 mL Probe und einem Rekonstitutionsvolumen

von 100 µL Methanol für den eingeengten MTBE, konnte die Nachweisgrenze erneut um

den Faktor 10 gesenkt werden.

7,0 7,5 8,0 8,5 9,0 9,5 10,0 10,5 11,0 11,5 12,0 12,5 13,0 min

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0,40

0,45

0,50

0,55

0,60

0,65

0,70

0,75

0,80

0,85

0,90

0,95

1,00

1,05

1,10

1,15

(x100,000)

S/N=2,6 bei 0 L/min

S/N=18,8 bei 5 L/min

S/N=61,1 bei 10 L/min

cps



3.2.2 Validierung der SFC-MS-Methode

3.2.2.1 Selektivität

Neben den im Optimierungsteil präsentierten Wechselwirkungen der Analyten

untereinander, kann auch die Matrix einen erheblichen Grund für Interferenzen und

fluktuierende Retentionszeiten darstellen355. Urin als Matrix beinhaltet hauptsächlich polare

Bestandteile wie anorganische Salze, Abbauprodukte aus dem Purinstoffwechsel,

Harnstoff und Kreatinin. Des Weiteren können unphysiologische Exkretionen bei

Krankheitsgeschehen stattfinden (z. B. Glucose, Proteine oder Bakterien). Bei Einnahme

von Xenobiotika können auch diese oder davon abstammende Metaboliten die Analyse

stören.

Der Schritt der Probenvorbereitung war bereits essentiell: durch die Flüssig-Flüssig-

Extraktion mit dem sehr lipophilen MTBE verteilten sich die Analyten in der organischen

Phase, während die polaren Matrixbestandteile in der wässrigen Phase verblieben. Damit

konnten Interaktionsmöglichkeiten von Analyt und Matrix bereits vor dem eigentlichen SFC-

Lauf minimiert werden. Der simplifizierte Ansatz der ausschließlichen Verdünnung von

Matrix als Probenvorbereitung (Dilute-and-Shoot) hat große Vorteile hinsichtlich

Zeitersparnis und Lösungsmittelverbrauch. Allerdings wird damit auch ein erhöhtes

Wechselwirkungspotential in Kauf genommen. So konnte für basische Analyten gezeigt

werden, dass es mitunter zu Verlängerung von Retentionszeiten kam356, wenn Urinproben

im Rahmen der Probenvorbereitung ausschließlich verdünnt werden.

Die Analyse der Null-Probe (verarbeitete Matrix versetzt mit IS) zeigte, dass sich die

Grundlinien der Massenspuren der Analyten weitestgehend im Bereich des üblichen

Rauschens befanden (Abb. 65). Lediglich für die KET-Spur (schwarz) konnte ein

Matrixsignal im frühen Bereich des Chromatogramms festgestellt werden. Die NK-d4-

Enantiomere wurden einwandfrei aufgetrennt und zeigten ebenfalls keine

Signalüberschneidungen mit der Matrix.

Eine Auftrennung aller Analyten war möglich (Abb. 66). NK-, DNK- und HNK-Enantiomere

wurden basisliniengetrennt. Sehr wahrscheinlich führten die Beeinflussung der Substanzen

untereinander und die Anwesenheit von Matrix dazu, dass, trotz vorheriger Optimierungen

zur Trennung der KET-Enantiomere, diese nicht mehr basisliniengetrennt wurden. Solange

dieser Befund aber robust ist, sollte eine Validierung trotzdem möglich sein, da durch die

Integrationstools softwareseitig eine Reihe an Möglichkeiten zur Verfügung gestellt werden,

um auch nicht grundliniengetrennte Peaks reproduzierbar zu integrieren.

Die bereits in Absatz 3.1.4 vorgestellte Thematik der isobaren Überlappung war ebenfalls

gut ersichtlich (Abb. 66). So erschienen in der HNK-Spur (blau) KET-Signale, sowie DNK-

Peaks in der NK-Massenspur (Magenta). Da die entsprechenden Stoffe aber bestens



voneinander abgetrennt wurden, war davon auszugehen, dass die Methode die nötige

Selektivität für die gegebene Aufgabenstellung besaß.

Abb. 65: Repräsentative Null-Probe mit racemischem Norketamin-d4 als internen Standard.

Abb. 66: Repräsentative Probe (Matrix mit Analyt versetzt) aus einem Validierungslauf bei einer Konzentration von 5 ng/mL je Analyt.

Unterstützt wurden diese Daten von den Standardabweichungen und

Variationskoeffizienten der Retentionszeiten aus den Validierungsläufen (Tab. 20). Die

relativen Standardabweichungen lagen zwischen 0,9 und 1,8 %. Obwohl die in dieser Arbeit

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 min0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

45000

50000

55000

60000

65000

70000

75000

80000

85000

90000

95000

100000

105000

110000

115000

120000 R/S-NK-d4

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 min

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

45000

50000

55000

60000

65000

70000

75000

80000

85000

90000

95000

100000

105000

110000

115000

R-KET S-KET

R/S-NK

2S,6S-HNK 2R,6R-HNK

R/S-DNK



eingangs zitierten Richtlinien dahingehend keine spezifizierten Grenzen vorschreiben, sind

Werte unter 2 % als akzeptabel anzusehen.

Da zum Zeitpunkt der Methodenerstellung bzw. -validierung nur KET und HNK als

enantiomerenreine Verbindungen zur Verfügung standen, konnte auch nur für diese eine

einwandfreie Zuordnung der Stereodeskriptoren stattfinden. DHK und NK waren

ausschließlich als Racemat käuflich zu erwerben, weshalb im Folgenden zum Teil die

stereochemischen Deskriptoren gegen die anonymisierende Bezeichnungen En1 und En2

ausgetauscht werden. In Absatz 3.3 wird ergänzend erläutert, wie zumindest für DHK

anhand von stereoselektiver Verstoffwechslung eine Zuordnung der Enantiomere erfolgen

könnte.

Tab. 20: Mittelwerte und relative Standardabweichungen der Retentionszeiten aus den Kalibrierläufen (5 Läufe mit jeweils 6 Werten, � = 30).

Substanz MW Retentionszeit ± SD (min) RSD (%)

R-Ketamin 4,514±0,061 1,36 S-Ketamin 4,691±0,053 1,14 Norketamin En1 4,844±0,056 1,16 Norketamin En2 6,088±0,092 1,51 Dehydronorketamin En1 6,964±0,131 1,87 Dehydronorketamin En2 7,389±0,137 1,85 2S,6S-Hydroxynorketamin 8,355±0,092 1,09 2R,6R-Hydroxynorketamin 9,047±0,087 0,96 Norketamin-d4 En1 4,798±0,057 1,19 Norketamin-d4 En2 6,025±0,088 1,46

3.2.2.2 Kalibrierfunktion

Aufgrund der besonderen Anfälligkeit von Massendetektoren gegenüber komplexen

Matrices, gilt die Verwendung von internen Standards bei der Quantifizierung von Analyten

als notwendig. In dieser Arbeit wurde vierfach deuteriertes Norketamin (Austausch aller

vorhandenen Aromatenprotonen) als IS verwendet. Dieser Massenunterschied von 4 u ist

positiv zu bewerten, da bereits gezeigt werden konnte, dass bei einem Massenunterschied

von nur 2 u Interferenzen auftreten können357. Ferner wurde im Absatz 3.1.4

herausgearbeitet, dass keine weiteren isobaren Überschneidungen mit anderen Analyten

auftreten. Strenggenommen handelte es sich beim IS um zwei Substanzen, da auch dieser

nur als Racemat erhältlich war. Die Trennung beider Enantiomere gelang aber

reproduzierbar, weshalb entschieden wurde, das früher eluierende Enantiomer des IS auf

das zuerst eluierende Enantiomer eines chiralen Analytenpaares zu beziehen. Die zweite

eluierende Substanz des IS wurden dann auch auf den zweiten Stoff des jeweiligen

Enantiomerenpaares bezogen (vgl. Tab. 20, z. B. R-KET/NK-d4 En1 und S-KET/NK-d4

En2).



Abb. 67: Vergleich der quadratischen (links) gegenüber der linearen (rechts) Kalibrierfunktion für 2S,6S-Hydroxynorketamin, 2R,6R-Hydroxynorketamin und S-Ketamin.

Zur Ermittlung des mathematischen Zusammenhangs zwischen Analytenkonzentration und

Messsignal wurde das Verhältnis aus den Peakflächen des Analyten zum

korrespondierenden IS gegen den Quotienten aus Konzentration des Analyten und

Konzentration des IS aufgetragen und im ersten Schritt subjektiv beurteilt. Anhand der drei

repräsentativen Beispiele 2S,6S-Hydroxynorketamin, 2R,6R-Hydroxynorketamin und

S-Ketamin eines Validierungstages wurde deutlich, dass die Zuhilfenahme einer

quadratischen Regression eventuell favorisiert werden sollte. Es konnte gezeigt werden,

dass bei einer Kurve die Messpunkte häufiger Überschneidungen mit dieser zeigten, als es

bei einer Geraden der Fall war (Abb. 67). Die Analyse der Regressionsvariablen und des

Bestimmtheitsmaßes (fett hervorgehoben in Tab. 21) ließ ferner vermuten, dass die lineare

Regression der quadratischen im gegebenen Zusammenhang unterlegen war. Es sollte ein

Wert für R² von über 0,995 angestrebt werden. Die erhaltenen Bestimmheitsmaße für die

2S,6S-HNK

2R,6R-HNK 2R,6R-HNK

2S,6S-HNK

S-KET S-KET

0.0 25.0 50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 Conc. Ratio0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

1.50

1.75

2.00

2.25

2.50

Area Ratio

1 2 3

4

5

6

7

0.0 25.0 50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 Conc. Ratio0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

1.50

1.75

2.00

2.25

2.50

Area Ratio

1 2 3

4

5

6

7

0.0 25.0 50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 Conc. Ratio0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

Area Ratio

1 2

4

5

6

7

0.0 25.0 50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 Conc. Ratio0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

Area Ratio

1 2

4

5

6

7

0.0 25.0 50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 Conc. Ratio0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

1.50

1.75

2.00

2.25

2.50

Area Ratio

1 2 3

4

5

6

7

0.0 25.0 50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 Conc. Ratio0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

1.50

1.75

2.00

2.25

2.50

Area Ratio

1 2 3

4

5

6

7



linearen Regressionen der Beispiele erreichten diesen Wert nicht und waren somit auch

denen der quadratischen unterlegen.

Tab. 21: Variablen und Bestimmtheitsmaß bei quadratischer und linearer Kalibrierfunktion für 2S,6S-Hydroxynorketamin, 2R,6R-Hydroxynorketamin und S-Ketamin.

Substanz Variable Quadratische Funktion � = � ∗ �� + ∗ � + � Lineare Funktion � = � ∗ � + � 2S,6S-Hydroxynorketamin a −2,1034e−5 0,0130

b 0,0172 - c −0,0265 0,0463 R² 0,9995 0,9922

2R,6R-Hydroxynorketamin a −2,6715e−5 0,0130 b 0,0183 - c −0,0517 0,0408 R² 0,9996 0,9879

S-Ketamin a −8,1469e−5 0,0546 b 0,0701 - c −0,0870 0,2322 R² 0,9997 0,9932

Eine weitere graphische Aufarbeitung der Daten war mit Hilfe eines Residuenplots möglich.

Dieser zeigte anschaulich, wie ausgeprägt die einzelnen Messpunkte von den berechneten

Werten der Kalibrationskurve/-gerade abwichen (Abb. 68). Je dichter die Residuen um die

Abszissenachse streuten, desto eher konnte davon ausgegangen werden, dass das

mathematische Modell den Sachverhalt zufriedenstellend widerspiegelte. Bei allen drei

Graphen wurde deutlich, dass die quadratische Regression (rote Vierecke) vor allem im

oberen Kalibrierbereich besser beschreibend war als die lineare (blaue Rauten).

Die mathematische Signifikanz der Regression kann nach Mandel berechnet werden

(Abschnitt 4.4.5). Sie ist ein letzter Indikator dafür, welches Modell benutzt werden sollte.

Der Vergleich der Reststandardabweichungen (Tab. 22) der drei Beispiele zeigte bereits

an, dass eine Regression weniger Streuung besaß, wenn sie nach 2. Ordnung erfolgte.

Somit war es dann auch nicht mehr verwunderlich, dass die Prüfwerte in allen Fällen größer

waren als die Vergleichsgröße der F-Tabelle. Daher war die quadratische Regression als

signifikant besser anzusehen als die lineare.



Abb. 68: Residuenplots für die entsprechenden linearen und quadratischen Kalibrationen aus Abb. 67 für 2S,6S-Hydroxynorketamin, 2R,6R-Hydroxynorketamin und S-Ketamin.

Es wurde also visuell und mathematisch deutlich, dass es zu einer Art Sättigung kam.

Häufig wird an dieser Stelle der Kalibrierbereich verkleinert, um den Zusammenhang zu

linearisieren. Da die Richtlinien eine andersartige Regression als die lineare aber nicht

kategorisch ausschließen, sondern verständlicherweise nur eine robuste Methode und

konstante experimentelle Bedingungen fordern, wurde die Regression 2. Ordnung für die

Validierung gewählt.

Tab. 22: Reststandardabweichung sy² und Mandel-Linearitätstest für die Kalibration aus Abb. 67 (6-Hydroxynorketamin 7-Punkt-Kalibration, S-Ketamin 6-Punkt-Kalibration) (1 � = 99%, �� = 1, �� =� − 3).

Substanz Reststandardabweichung (sy²) Prüfwert PW (nach Mandel)358

Vergleichsgröße1 linear quadratisch

2S,6S-HNK 0,00956 0,00082 53,85 21,19 21,19 2R,6R-HNK 0,01400 0,00143 44,86

S-KET 0,20084 0,01100 70,01 34,11

Eine Übersicht über den Kalibrierbereich und die Mittelwerte der Bestimmtheitsmaße der

Kalibrierkurven konnte aufgezeigt werden (Tab. 23). Die zurückgerechneten

-0,100

-0,050

0,000

0,050

0,100

0,150

0,00 20,00 40,00 60,00 80,00 100,00 120,00 140,00 160,00 180,00 200,00

Res

idue

n d i

Conc. Ratio

Residuenplot 2S,6S-Hydroxynorketamin

Residuen linear

Residuen quadratisch

-0,150

-0,100

-0,050

0,000

0,050

0,100

0,150

0,200

0,00 20,00 40,00 60,00 80,00 100,00 120,00 140,00 160,00 180,00 200,00

Res

idue

n d i

Conc. Ratio

Residuenplot 2R,6R-Hydroxynorketamin

Residuen linear


-0,450

-0,300

-0,150

0,000

0,150

0,300

0,450

0,600

0,00 20,00 40,00 60,00 80,00 100,00 120,00 140,00 160,00 180,00 200,00

Res

idue

n d i

Conc. Ratio

Residuenplot S-Ketamin

Residuen linear




Konzentrationen für jeden Messpunkt auf der jeweiligen Kalibrierkurve am entsprechenden

Validierungstag sind in Absatz 4.4.6 angegeben. Hierbei konnten die Zielvorgaben der

Richtlinien (±15 % bzw. ±20 % am LLOQ für die Richtigkeit) eingehalten werden, weshalb

die Methode für den Punkt Kalibrierfunktion als valide anzusehen war.

Tab. 23: Übersicht der Arbeitsbereiche und Bestimmtheitsmaße für die Validierungsläufe (� = 5).

Substanz MW R²±SD Arbeitsbereich (ng/mL)

R-Ketamin 0,9997±0,0001

5-200

S-Ketamin 0,9990±0,0009 Norketamin En1 0,9995±0,0004 Norketamin En2 0,9995±0,0006 Dehydronorketamin En1 0,9990±0,0010 Dehydronorketamin En2 0,9991±0,0007 2S,6S-Hydroxynorketamin 0,9994±0,0005 2R,6R-Hydroxynorketamin 0,9992±0,0005

3.2.2.3 Unterstes Quantifizierungslevel

Aus dem Arbeitsbereich der Kalibriergeraden ergab sich das LLOQ von 5 ng/mL. Bei dieser

Konzentration konnte den Anforderungen an Präzision und Richtigkeit noch zuverlässig

entsprochen werden. Es wurde ersichtlich, dass die Signale von den HNK-Enantiomeren

bei gleicher Konzentration kleiner waren als die der anderen Analyten (Abb. 66).

Folgerichtig ließen die Validierungsdaten auch vermuten, dass zumindest für KET, NK und

DHK theoretisch ein LLOQ von 3 ng/mL möglich gewesen wäre. Dieses hätte aber zu einem

unverhältnismäßigen Mehraufwand bei der Erstellung der Kalibrierkurven geführt, weshalb

darauf verzichtet wurde. Die Nachweisgrenze (Lower Limit of Detection, LLOD) betrug für

KET, NK und DHK 1 ng/mL und für HNK 3 ng/mL. Diese wurde optisch aus dem Vergleich

von Messsignal und Rauschen bestimmt.

3.2.2.4 Präzision und Richtigkeit

Der Nachweis der Präzision und Richtigkeit wurde an dieser Stelle zusammengelegt, da

die Erfassung der beiden Parameter mit den gleichen Proben geschah. Zur Abdeckung des

gesamten Kalibrierbereiches wurden drei Konzentrationen gewählt, welche ein niedriges

(dreifacher LLOQ, 9 oder 15 ng/mL), ein mittleres (100 ng/mL) und ein hohes

Konzentrationslevel (ULOQ, 200 ng/mL) abbildeten. Für die within-run Evaluierung wurden

sechs Proben an einem Tag vermessen, während die between-run Bestimmungen mit fünf

Proben an fünf unterschiedlichen Tagen erfolgte (Tab. 24). Die vorgeschlagenen Grenzen

von ±15 %, bzw. 20 % am LLOQ, wurden in allen Fällen eingehalten. Die Methode konnte

daher in Hinsicht auf Präzision und Richtigkeit als valide eingestuft werden.


Tab. 24: Übersicht der Validierungsparameter Präzision und Richtigkeit (between-run � = 6, within-run � = 5).

Substanz Nominalkonz. (ng/mL)

Gemessene Konz. ± SD (ng/mL) Präzision (%) Richtigkeit (%) between-run within-run between-run within-run between-run within-run

KET

R 9 8,79±0,45 9,06±0,29 5,16 3,17 −2,28 0,71 15 15,17±2,15 15,61±1,17 14,20 7,51 1,15 4,11 200 186,75±13,09 193,28±5,37 7,01 2,78 −6,62 −3,36

S 9 8,36±0,45 8,87±0,65 5,38 7,31 −7,10 −1,40 15 15,56 ±1,58 15,46±1,19 10,13 7,70 3,74 3,06 200 213,83±15,70 197,26±5,15 7,34 2,61 6,92 −1,37

NK

En1 15 14,54±0,95 14,94±0,99 6,53 6,61 −3,07 −0,43 100 103,54±4,06 98,77±4,06 3,92 4,11 3,54 −1,23 200 196,19±5,97 192,45±4,17 3,04 2,17 −1,90 −3,77

En2 15 15,03±0,69 15,96±0,49 4,59 3,04 0,19 6,43 100 102,83±3,76 108,66±6,79 3,65 6,25 2,83 8,66 200 199,13±6,41 195,10±7,31 3,22 3,74 −0,43 −2,45

DNK

En1 15 14,95±0,79 15,33±1,55 5,27 10,10 −0,35 8,13 100 104,58±7,44 95,98±7,27 7,12 7,58 4,58 −4,11 200 203,73±14,03 201,99±10,40 6,89 5,15 1,87 0,99

En2 15 15,00±0,29 15,97±0,71 1,96 4,42 0,01 6,45 100 102,84±3,61 103,25±5,57 3,51 5,39 2,84 3,25 200 202,72 ±19,27 191,48±4,86 9,51 2,54 1,36 −4,26

HNK

2S,6S 15 14,97±0,42 15,87±0,49 2,82 3,07 −0,23 5,77 100 95,49 ±7,21 100,96±8,57 7,55 8,49 −4,51 0,96 200 181,94±15,42 196,73±10,45 8,48 5,31 −9,03 −1,63

2R,6R 15 15,29±1,21 14,83±0,88 7,89 5,95 1,93 −1,09 100 96,88±7,61 92,02±2,11 7,86 2,29 −3,12 −7,98 200 183,56±14,45 178,56±5,11 7,87 2,87 −8,22 −10,72



3.2.2.5 Wiederfindung, Matrix-Effekte und Stabilität

Die Wiederfindung der Analyten wurde bei drei Konzentrationsstufen (9, 15, 200 ng/mL) durch

Vergleich von Proben ohne Matrixbelastung (100 % Wert) mit Matrix-belasteten Proben

durchgeführt (� = 6). Folgende Resultate ergaben sich bei dem Vergleich: KET (91-108 %), NK

(78-94 %), DNK (76-96 %) und HNK (62-81 %). Damit waren die Wiederfindungen für KET, NK

und DNK als gut zu bewerten, es werden in den Richtlinien jedoch keine spezifischen Grenzen

vorgegeben. Für HNK lag die Wiederfindung niedriger, was eventuell dem Umstand geschuldet

sein könnte, dass dieser Metabolit durch die zusätzliche Hydroxy-Gruppe am Molekül eine

erhöhte Polarität aufweist und sich deshalb weniger stark in der lipophilen Phase bei der Flüssig-

Flüssig-Extraktion anreicherte. Entscheidend ist aber vor allem das konstante Verhältnis bei der

Extraktion von Analyt zu IS. Wäre dieses nicht reproduzierbar gewesen, hätten auch Präzision

und Richtigkeit der Methode nicht gezeigt werden können. Aus diesem Grund war davon

auszugehen, dass die Wiederfindung während allen Analysenläufen robust war.

Die Evaluation der Matrix-Effekte erfolgte mit einem Abgleich einer Matrix-unbelasteten Probe

(100 % Wert) und einer Matrix-Probe, welche erst nach der Extraktion mit Analyt versetzt wurde

(post-extraction sample) (Tab. 25). Es kam bis auf zwei Werte (bei 15 ng/mL für HNK-

Enantiomere) zu keiner Verstärkung oder Abschwächung des Messsignals, weshalb davon

ausgegangen wurde, dass die Probenaufarbeitung in Kombination mit der Auswertung unter

Nutzung eines IS und Massendetektion geeignet für die Quantifizierung der vorliegenden

Analyten war.

Tab. 25: Ergebnisse der Matrixeffekt-Experimente (� = 6).

Substanz Matrixeffekt (%) bei entsprechender Konzentration 9 ng/mL 15 ng/mL 200 ng/mL MW

R-Ketamin 89,7 94,2 90,2 91,4 S-Ketamin 89,7 113,9 95,7 99,8 Norketamin En1 98,9 105,3 95,8 99,9 Norketamin En2 98,7 105,7 97,5 100,7 Dehydronorketamin En1 95,8 101,4 89,3 98,6 Dehydronorketamin En2 99,5 105,7 95,1 100,1 2S,6S-Hydroxynorketamin 116,9 126,2 98,2 121,5 2R,6R-Hydroxynorketamin 113,0 122,4 96,3 110,6

Auf die Stabilitätsdaten soll hier nur kurz eingegangen werden, da diese bereits ausführlich

besprochen wurden329. Es konnte gezeigt werden, dass die Analyten mindestens drei Einfrier-

Auftau-Vorgänge überstehen und auch bei Raumtemperatur bis zu 3 h stabil sind. Dazu

ergänzend wurde die Autosampler-Stabilität bei 6 °C für 96 h untersucht, mit dem Ergebnis,

dass es hierbei zur keiner nennenswerten Degradation kam (Gehalt zwischen 85 und 106 %).


Anwendung der SFC-MS-Methode auf Proben einer klinischen Studie als Proof-of-Concept | 117

Anhand der Resultate des Validierungsprozesses war davon auszugehen, dass die präsentierte

SFC-MS-Methode den Anforderungen der o. g. Richtlinien entsprach. Die Überprüfungen zu

Selektivität, Kalibrierfunktion, Nachweis- und Bestimmungsgrenzen, Präzision, Richtigkeit,

Wiederfindung, Matrix-Effekte und Stabilität konnten in den geforderten Maßen erbracht

werden. Daher besaß die Methode die nötige Zuverlässigkeit und Robustheit und sollte geeignet

sein, auch Urinproben von Probanden, welche an einer pharmakokinetischen Studie zur

Untersuchung von Ketaminmetabolismus teilgenommen haben, zu analysieren.

3.3 Anwendung der SFC-MS-Methode auf Proben einer klinischen Studie als Proof-of-Concept

Im Rahmen einer pharmakokinetischen Pilotstudie, sollten die Besonderheiten des

Metabolismus von Ketamin evaluiert werden359. Hierbei lag ein Fokus auch darauf, ob es zu

einer favorisierten Verstoffwechslung eines Enantiomeres kommt und sich somit bestimmte

chirale Metabolite eher bilden als andere. Die Studie wurde in der Klinischen Pharmakologie

Greifswald unter Aufsicht von Prof. Dr. Werner Siegmund und Prof. Dr. Stefan Oswald

durchgeführt.

Das zu dieser Arbeit zugehörige Probandenkollektiv bestand aus drei männlichen Freiwilligen

(25-29 Jahre alt, mit einem BMI von 20,7±1,0 kg/m²), welche im Rahmen nationaler und

internationaler Regulatorien ihre Zustimmung zur Teilnahme abgegeben hatten. Die Studie

wurde von der Ethik-Kommission der Universitätsmedizin Greifswald (MV01/14) bewilligt. Den

Probanden wurden 5 mg rac-Ketamin (Ketamin-ratiopharm, Ratiopharm GmbH) als 30-minütige

Infusion i. v. verabreicht. Die Urinproben wurden vor und 24, 48 und 72 h nach der

Arzneimittelapplikation gesammelt.

An dieser Stelle soll noch betont werden, dass das Ziel der Analyse der Studienproben vor allem

war, die Anwendbarkeit der validierten SFC-MS-Methode aufzuzeigen. Repräsentative klinische

Aussagen waren aufgrund der geringen Probandenanzahl nicht möglich und auch nicht Fokus

dieser Arbeit. Deshalb werden nur die Konzentrationen der Urinproben zum entsprechenden

Zeitpunkt angegeben, nicht aber die Gesamtexkretionsmengen.

Die Chromatogramme der Proben eines Probanden werden beispielhaft vorgestellt (Abb. 69 bis

Abb. 72). Die Zuordnungen gestalten sich wie folgt: braune Spur zum Zeitpunkt vor, blaue Spur

24 h nach, magenta Spur 48 h nach und die schwarze Spur 72 h nach Applikation von Ketamin.

Alle Metaboliten beziehungsweise die Ursubstanzen konnten einwandfrei identifiziert und der

Verlauf der Bildung bzw. Elimination verfolgt werden. Die Wahl der Matrix erfolgte nicht

grundlos, da die Konzentrationen von Metaboliten gegenüber Ketamin im Urin deutlich erhöht

sind. Bei Plasmauntersuchungen wurde jedoch hauptsächlich die Ursubstanz gefunden304. So

verwunderte es auch nicht, dass die KET-Enantiomere die kleinsten Konzentrationen aufzeigten


118 | Anwendung der SFC-MS-Methode auf Proben einer klinischen Studie als Proof-of-Concept

und bereits nach 48 h unter das LLOQ fielen. NK und vor allem DNK wurden in deutlich höheren

Konzentrationen ausgeschieden. Mit Fokus auf den wichtigsten Metaboliten 2R,6R-HNK fielen

noch zwei weitere HNK-Metaboliten auf. Eine genauere Zuordnung dieser Metaboliten gleicher

Masse war aber ohne authentisches Referenzmaterial nicht ohne weiteres möglich, es handelte

sich aber sehr wahrscheinlich um Diastereomere (2S,6R-HNK und 2R,6S-HNK) oder

Regioisomere (4- oder 5-HNK) von 2S,6S/2R,6R-HNK.

Abb. 69: Repräsentative Probe eines Studienteilnehmers, Massenspur von Ketamin.

Abb. 70: Repräsentative Probe eines Studienteilnehmers, Massenspur von Norketamin.

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 min

-25000

0

25000

50000

75000

100000

125000

150000

175000

200000

225000

250000

275000

300000

325000

350000

375000

400000

R-KET S-KET

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 min

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

80000

90000

100000

110000

120000

130000

140000

150000

160000

170000 R/S-NK


Anwendung der SFC-MS-Methode auf Proben einer klinischen Studie als Proof-of-Concept | 119

Abb. 71: Repräsentative Probe eines Studienteilnehmers, Massenspur von 6-Hydroxynorketamin.

Abb. 72: Repräsentative Probe eines Studienteilnehmers, Massespur von Dehydronorketamin.

Die Mittelwerte der Analyten aus den Urinproben der drei Probanden wurden ermittelt (Tab. 26).

In Übereinstimmung mit Literaturangaben war DNK als Hauptmetabolit anzusehen304,329. Ferner

findet sich in diesen Quellen ein Verhältnis von etwa 1 zu 1,15-1,30 der DNK-Enantiomere.

Diese Werte konnten nicht nur bestätigt, sondern auch dazu genutzt werden, um den chiralen

Deskriptor zuzuordnen. Somit würde es sich bei DHK En 1 um das S-konfigurierte und bei DHK

En2 um das R-konfigurierte Enantiomer handeln. Die erhobenen Daten ließen weiterhin

vermuten, dass es sich bei 2R,6R-HNK um das bevorzugte Isomer handelte. Der Abgleich mit

der Literatur war hierbei jedoch deutlich schwieriger, da bisher nur eine HPLC-Methode

beschrieben wurde, die in der Lage ist, die 6-HNK-Enantiomere chiral zu trennen.

Es kann also zusammengefasst werden, dass die validierte SFC-MS-Methode für die Analyse

von Urinproben aus klinischen Studien einsetzbar war. Neben qualitativen Aussagen zum

Auftreten von Metaboliten, ließen sich außerdem die Enantiomere getrennt quantifizieren und

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 min

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

45000

50000

55000

60000

65000

70000

75000

80000

85000

90000

2S,6S-HNK 2R,6R-HNK

weiterer HNK-Metabolit weiterer HNK-Metabolit

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 min

0

25000

50000

75000

100000

125000

150000

175000

200000

225000

250000

275000

300000

325000

350000 R/S-DNK


120 | Gegenüberstellung der SFC-MS-Methode mit literaturbekannten LC-Methoden

aus diesen Daten Verhältnisse von Enantiomerenpaaren beziffern. Damit kann die präsentierte

Methode einen großen Benefit für zukünftige klinische Studien leisten.

Tab. 26: Übersicht der Konzentrationen aus den Probandenproben (Werte unterhalb des LLOQ sind als Schätzung anzusehen).

Substanz Gemessene Konzentration ± SD (ng/mL) 0-24h 24-48h 48-72h

R-Ketamin 10,32±1,94 1,05±0,12 0,79±0,00 S-Ketamin 12,51±3,41 1,82±0,24 1,66±0,32 Norketamin En1 16,65±4,18 2,64±0,15 1,95±0,33 Norketamin En2 17,60±4,44 1,76±4,44 2,40±2,38 Dehydronorketamin En1 36,54±7,66 5,69±1,23 2,85±0,76 Dehydronorketamin En2 42,19±2,42 6,90±2,02 3,50±0,36 2S,6S-Hydroxynorketamin 24,16±6,68 3,70±0,57 3,11±1,51 2R,6R-Hydroxynorketamin 29,86±9,75 7,37±4,62 5,04±0,95

3.4 Gegenüberstellung der SFC-MS-Methode mit literaturbekannten LC-Methoden

Da Ketamin kein neues API darstellt, sondern im Rahmen des „Repurposing“ für eine neue

mögliche Indikation entdeckt wurde, sind bereits zahlreiche HPLC-Methoden publiziert. Ein

Review aus dem Jahr 2017 (Publikation erst 2018) trägt dem Rechnung328 und wurde schon

genauer im Absatz 3.1.2 besprochen. Daher sollen an dieser Stelle nur Vergleiche mit den

wichtigsten Publikationen vor (Moaddel et al.304 und Hasan et al.329) und nach (Ramiole et al.360

und Toki et al.361) Veröffentlichung der präsentierten Methode im Journal of Pharmaceutical and

Biomedical Analysis erörtert werden.

Moaddel et al.304 publizierten die wohl komplexeste Methode gemessen an der Anzahl der

getrennten Analyten. An einer Eclipse XDB-C18 Säule konnten neben KET, NK, DNK und

2S,6S/2R,6R-HNK auch die sich dazu diastereomer verhaltenden 2S,6R/2R,6S-HNK sowie die

Regioisomere 4- und 5-HNK getrennt werden. Die entsprechenden Glucuronsäure-Konjugate

wurden ebenfalls mit betrachtet. Neben der verhältnismäßig langen Laufzeit von 30 min ist der

größte Nachteil, dass hierbei keine chirale Separierung ermöglicht wurde. Dafür stellten die

Autoren eine zweite Methode zur Verfügung, welche in der Lage war, KET, NK und DNK

innerhalb von 20 min chiral (Chiral-AGP Säule) zu trennen. Zugegebenermaßen lag der

physiologische Hintergrund der Methoden nicht bei depressiven Erkrankungen, sondern bei der

Therapie des komplexen regionalen Schmerzsyndroms. Das könnte ein Grund sein, warum sich

nicht weiter der enantioselektiven Analyse von hydroxylierten Metaboliten gewidmet wurde. Da

aber mittlerweile genug Befunde vorhanden sind, die 2R,6R-HNK ein großes Potential in der


Gegenüberstellung der SFC-MS-Methode mit literaturbekannten LC-Methoden | 121

Therapie von Depressionen prognostizieren, sind diese Methoden weniger für die aktuelle

Problemstellung geeignet.

Hasan et al.329 übernahmen beide Methoden von Moaddel et al. größtenteils, konnten dabei die

Laufzeit der achiralen Methode (XTerra MS C18 Säule) auf 6 min deutlich verkürzen,

verzichteten dafür aber auf HNK und Hydroxyketamin als Analyten. Zusätzlich wurden auch das

LLOQ und der Verbrauch an Probenmaterial abgesenkt. Die größte Neuerung lag allerdings in

der Implementierung einer dritten Methode, welche die 6-HNK Enantiomere trennen konnte.

Hierfür wurde von uns die Lux Amylose-2 als Säule vorgeschlagen und beschafft. Der größte

Nachteil ist zweifelsohne die ausgedehnte Laufzeit von 60 min. Damit war es die erste

Publikation, welche die Trennung dieses Enantiomerenpaares aufzeigte, gleichwohl die

Verwendung von drei Methoden nebeneinander mit einem effizienten Zeitmanagement nur

schwerlich zu verbinden ist.

Ramiole et al.360 legten ihren Schwerpunkt weniger auf die chromatographische Entwicklung als

vielmehr auf die vergleichende Probenvorbereitung. Dafür evaluierten sie die Effekte von

Flüssig-Flüssig-Extraktion mit Chloroform, Acetonitril-induzierter Proteinfällung und

Festphasenextraktion. Die HPLC-Methode benutzte die Atlantis T3C18 als Säule und schafft die

Trennung von DNK, NK und KET in 7 min. Hierbei fand keine chirale Separation der einzelnen

Enantiomere statt.

Eine der neuesten publizierten Methoden im Rahmen der Ketaminanalyse stammt von Toki et

al.361. Mit Hilfe einer Chiralpak AS-3R konnten KET und NK in einer sehr kurzen Zeit von nur

5 min enantioselektiv voneinander getrennt werden. Der Fokus lag primär auf der Reduktion

von Probenmaterial auf wenige µL pro Analyse. Dies gelang, in dem die bereits angesprochene

Dilute-and-Shoot-Variante zur Probenvorbereitung berücksichtigt wurde. Wohlwissend, dass

dabei die Belastung mit Matrixbestandteilen für den Massendetektor außerordentlich hoch war,

wurde der Fluss der mobilen Phase nur über eine bestimmte Zeit in den Detektor zugelassen.

Eine Analyse weiterer Metabolite erfolgte deshalb nicht, um die bei diesem Vorgehen

unvermeidlichen Verunreinigungen des Detektors zu begrenzen.

Aus den vier Publikationen wird ersichtlich, dass jede Arbeit einer dezidierten Fragestellung

nachging und deshalb dort auch jeweils andere Schwerpunkte gesetzt wurden. Im Kontext der

chiralen Metabolitentrennung mit Fokus auf antidepressive Therapien, konnte keine der

vorgestellten Verfahren gänzlich überzeugen, da entweder mehrere Methoden pro Analyt

benötigt oder aber nicht alle relevanten Metaboliten in die Analyse eingeschlossen wurden.

Daher lässt sich der Schluss ziehen, dass die hier beschriebene SFC-MS-Methode zwar nicht

in allen Belangen überlegen war (z. B. LLOQ oder benötigte Zeit bzw. verwendetes

Matrixvolumen für Probenaufbereitung), in der gemeinsamen chiralen Analyse von 6-HNK, KET,

NK und DNK innerhalb einer Methode aber ein Alleinstellungsmerkmal besaß. Ferner waren

auch die Bezeichnungen effizient und umweltfreundlich zutreffend, da die Analyse mit 15 min


122 | Zusammenfassung und Ausblick Kapitel 3

bei vermindertem Verbrauch von organischem Lösungsmittel im direkten Vergleich sehr gut

abschneidete.

Einen gänzlich anderen Punkt betraf die leitliniengerechte Validierung der SFC-MS-Methode. In

den letzten Jahren wurden immer wieder SFC-Verfahren vorgestellt, die nur teilweise validiert

wurden, so in drei aktuellen Arbeiten aus dem Jahr 2018: die Publikationen über die Analyse

von aromatischen Kohlenwasserstoffen in kaffeehaltigen Getränken bzw. Dunkelbier362, die

enantioselektive Bestimmung von Fenbuconazol einschließlich Metaboliten in Früchten und

Gemüse363 und das Monitoring des Insektizids Thiacloprid in Treibhausgemüse364 brachten

allesamt Validierungsparameter zu Sprache, wenngleich sie in der Regel nicht ausführlich nach

EMA- oder FDA-Kriterien ausgeführt wurden. Dazu passend wurden in der Zusammenfassung

einer aktuellen Übersichtsarbeit über die SFC in der Bioanalytik noch einmal die inhärenten

Möglichkeiten hervorgehoben, aber auch festgestellt, dass die bisherigen Methoden oftmals

unzureichend validiert seien365. Bevor sich die SFC nicht mit den entsprechenden

Empfehlungen von ICH, FDA und EMA vollumfänglich decke, folgerten die Autoren, würde eine

Implementierung in die Routineanalytik nicht möglich seien.

3.5 Zusammenfassung und Ausblick Kapitel 3

Es scheint nur noch eine Frage der Zeit zu sein, bis Ketamin den Status „off-label“ für die

Therapie von depressiven Erkrankungen verlässt und Einzug in die Leitlinien findet. Der

Mechanismus und das tatsächlich wirksame Agens sind nach wie vor aber nicht genau bekannt

und benötigen noch weitere pharmakodynamische und analytische Untersuchungen. Die in

dieser Arbeit vorgestellte Methode kann einen wichtigen Beitrag dazu leisten. Anhand der

gängigen Validierungsparameter der EMA und FDA wurde die SFC-MS-Methode systematisch

optimiert und die Nachweise für Brauchbarkeit bzw. Zuverlässigkeit erbracht. Dabei wurden die

Vorteile, welche in der Natur der SFC liegen, ausgenutzt und führten zu einer Anwendung, die

vergleichbare LC-Methoden hinsichtlich Analysengeschwindigkeit, Umweltfreundlichkeit und

Selektivität zum Teil erheblich übertrifft. Des Weiteren wurde mit der erfolgreichen Publikation

der Ergebnisse dazu beigetragen, die Anwendungsmöglichkeiten zu präsentieren und damit

auch aufzuzeigen, dass die benötigte Robustheit für die Routineapplikation der SFC in der

Bioanalytik erreicht werden kann.

Zukünftig können solche Methoden ferner davon profitieren, dass sich die Probenvorbereitung

von den „klassischen“ Vorgehensweisen abwendet und mit neuen kombiniert wird. Dies konnte

bereits in einer Weiterentwicklung der SFC-MS-Methode im eigenen Arbeitskreis gezeigt

werden, bei der die Flüssig-Flüssig-Extraktion gegen eine Extraktion mit sCO2 ausgetauscht

wurde366. Durch die on-line Kopplung von Probenvorbereitung und Analysenlauf eröffnen sich

neue Möglichkeiten bezüglich Zeit- und Lösungsmittelersparnis.

Experimenteller Teil

Geräteparameter | 123

4 Experimenteller Teil

Die Wiedergabe von Gebrauchs-, Marken- und Handelsnamen oder Warenbezeichnungen in

dieser Arbeit berechtigt auch ohne besondere Kennzeichnung nicht zu der Annahme, dass

solche Namen im Sinne der Warenzeichen- und Markenschutz-Gesetzgebung als frei zu

betrachten wären und daher von jedermann benutzt werden dürften.

4.1 Geräteparameter

4.1.1 NMR-Spektroskopie

Gerät Bruker Biospin FT-NMR-Spektrometer Avance III 400 MHz

Messfrequenz 1H: 400,1 MHz; 13C, DEPT-135, HSQC, HMBC: 100,6 MHz

Messtemperatur 25 °C

Interner Standard Tetramethylsilan oder Lösungsmittelbasissignal

Software Bruker TopSpin (Version 2.1)

Angaben zur Kopplungskonstante J gelten für H,H-Kopplungen (i. d. R. werden nur die

Hauptkopplungen betrachtet), sofern nicht anders angegeben (allgemein: XJY,Z). Chemische

Verschiebungen sind in ppm (δ-Skala) angegeben und gelten in Relation zu Tetramethylsilan

bzw. dem Lösungsmittelbasissignal. Bei 13C-Spektren, die in D2O aufgenommen wurden, liegt

kein Basissignal vor, sodass hier die Spektren unkalibriert ausgewertet werden. Die

verwendeten Lösungsmittel sind bei den jeweiligen Spektrendaten angegeben. Die Zuordnung

der Signale in allen NMR-Spektren wurde wenn nötig mittels DEPT-135-, HSQC- und/oder

HMBC-Experimenten verifiziert. Die angegebenen Nummerierungen der Verbindungen

beziehen sich nur auf die Zuordnung der NMR-Signale und sind nicht IUPAC-konform.

Ungenauigkeiten der Kopplungskonstanten sind der Unschärfe der Spektren geschuldet

(gerundet auf Vielfache von 0,4 Hz).

4.1.2 Schmelzverhalten

Gerät Büchi Schmelzpunkt M-565

Die manuelle Bestimmung erfolgt mit Hilfe der Präzisionslupe mit zweieinhalbfacher

Vergrößerung, die automatische Bestimmung über eine Videokamera mit Videoaufzeichnung

mit sechsfacher Vergrößerung. Die Temperaturauflösung beträgt 0,1 °C. Der Schmelzpunkt

wird mit einer Messgenauigkeit von ± 0,3 °C bis 250 °C und von ± 0,3 °C bis ± 0,5 °C bei 250 °C

bis 400 °C, bei einer Aufheizrate von 0,5 °C/min bestimmt. Sämtliche Analysen wurden mit Hilfe


124 | Geräteparameter

des Probenverdichters M-569 vorbereitet. Bei allen Substanzen wurde vorher der ungefähre

Schmelzbereich durch eine Schnellmessung (5 °C/min) bestimmt und danach ab 10 °C

unterhalb der niedrigsten Schmelztemperatur mit der Rate von 1,0 °C/min gemessen.

4.1.3 Dünnschichtchromatographie/Schwerkraftsäulenchromatographie

Alle Analysen erfolgten auf TLC Silicagel 60 F254-Platten (Kieselgel auf Aluminiumfolie,

Schichtdicke 0,20 mm, Porengröße 60 Å, Partikelgröße 10–12 μm) der Firma Merck KGaA. Die

Detektion erfolgte mittels UV- (λ= 254 und 366 nm) oder Vis-Licht. Bei Bedarf wurden Ninhydrin-

Reagenz (0,15 g Ninhydrin in 47,5 mL Isopropanol und 2,5 mL Essigsäure), Ehrlich-Reagenz

(1 g 4-Dimethylaminobenzaldehyd in 25 mL Salzsäure und 75 mL Methanol), Eisen(III)-chlorid-

Reagenz (1 g FeCl3 in 50 mL Wasser und 50 mL Methanol) oder DNPH-Reagenz (0,2 g 2,4-

Dinitrophenylhydrazin in 40 mL Eisessig, 40 mL 25%iger Salzsäure und 20 mL Methanol) mit

eventuell anschließender Erwärmung (>150 °C) eingesetzt.

Bei der präparativen Säulenchromatographie kam Kieselgel 60 (Korngröße 20–45 µm,

Porengröße 60 Å) der Firma Carl Roth zum Einsatz. Dieses wurde auch zum Selberpacken der

Glassäulen (230×15 mm, Büchi) mit dem Büchi Sepacore Dry-Filling Set für die MPLC benutzt.

Die Bezeichnung der Durchführung erfolgt nach: Auftragsart (flüssig oder adsorbiert an

Kieselgur (aus Lösungsmittel)), qualitative Laufmittelzusammensetzung und quantitative

Laufmittelzusammensetzung und ist bei den jeweiligen Synthesen mit angegeben.

4.1.4 MIR-Spektroskopie

Gerät Bruker Optics Alpha FT-IR-Spektrometer

Probenkopf Platinum-ATR-Modul (Diamant)

Software Bruker Optics Opus (Version 7.5)

4.1.5 Mikrowellenreaktor

Gerät Anton Paar Monowave 300

Alle Synthesen wurden im Closed-Vessel-Verfahren in G30- (max. 20 mL) oder G10-Vials (max.

6 mL) durchgeführt. Die Temperaturkontrolle erfolgte mittels IR-Sensor am Boden des

Reaktionsraumes, die Druckkontrolle mit Hilfe eines Detektors oberhalb des Septums des

Reaktionsgefäßes. Alle Synthesen wurden unter Rühren durchgeführt. Über die Reaktor-interne

Software (Version 3.20) wurden die Maximalwerte für Temperatur, Druck und Leistung

eingestellt. Die Kameraüberwachung erfolgte über das Programm VLC-Mediaplayer.



4.1.6 MPLC

Gerät Büchi Sepacore Flash Chromatograph

Bestandteile Pump Manager: C-615, Pump Module: C-601, UV-Monitor: C-630,

Fraction Collector: C-660

Software Büchi SepacoreRecord (Version 1.3.1000.500)

4.1.7 Präparative HPLC

Gerät Shimadzu Prep LC

Bestandteile System Controller: CBM-20A, Solvent Delivery Module: LC-20AP,

Autosampler: SIL-20A, UV-Detector: SPD-20A, Fraction Collector:

FRC-10A, manuelles 6-Wege-Injektionsventil mit 5 mL Probenschleife

Software Shimadzu LabSolutions (Version 5.75 SP2)

Säule LiChrospher100 RP-18 endcapped, 5 μm, 250×25 mm

Die entsprechenden Laufmittelzusammensetzungen sind bei den einzelnen Substanzen

angegeben. Vor Injektion der Produktlösung wurde eine Filtration mittels PTFE-Filter (0,45 µm)

der Firma VWR vorgenommen.

4.1.8 Hochauflösende Massenspektrometrie (HRMS)

Gerät Shimadzu LCMS-IT-TOF

Bestandteile System Controller: CBM-20A, Solvent Delivery Module: LC-20AD,

Autosampler: SIL-20AC HT, Column Oven: CTO-20A, PDA: SPD-

M20A

Software Shimadzu LCMS Solution (Version 3.41)

Säule Chromolith SpeedRod RP-18 endcapped, 50×4,6 mm

Eine hohe Massenauflösung ist Bedingung für eine hohe Massengenauigkeit in der

Massenspektrometrie. Hochauflösende Massenspektren wurden nur von nicht

literaturbekannten Substanzen aufgenommen, um deren Masse mit hoher Genauigkeit zu

bestimmen und zu bestätigen. Alle Verbindungen wurden mittels ESI ionisiert. Die

monoisotopischen Massen gelten als bestätigt, wenn die experimentellen Daten ≤ 5 ppm vom

berechneten Wert abweichen. Die angegebenen Massen beziehen sich bereits auf die um ein

Proton korrigierten Massen (entsprechend der Ionisierung im positiven oder negativen Modus).

Als mobile Phase kam ein Methanol-Wasser-Gemisch (+0,1 % Ameisensäure) in angepasster

Zusammensetzung an die Polarität der Analyten zum Einsatz.


126 | Geräteparameter

4.1.9 SFC-MS

Gerät Shimadzu Nexera SFC/UHPLC switching system

Bestandteile System Controller: CBM-20A, Solvent Delivery Module: LC-20ADXR,

CO2 Delivery Module: LC-30ADSF, Back Pressure Regulator: SFC-30A,

Autosampler: SIL-30AC, Column Oven: CTO-20AC, Degasser:

DGU-20A5R

Software Shimadzu LabSolution (Version 5.82)

4.1.10 Visualisierung der Kristallstrukturen

Software Molecular Operating Environment 2018.1 (Chemical Computing Group)

Software PyMOL Molecular Graphics System Version 1.8.4.2 (Schrödinger LLC.)

4.1.11 Kristallographie (Institut für Biochemie, Greifswald)

Die röntgenkristallographische Untersuchung der Substanz N-[4-(1H-Tetrazol-5-yl)pyridin-2-

yl]ethan-1,2-diamin-Hydrochlorid (XLIII) erfolgte im Arbeitskreis von Prof. Dr. Carola Schulzke

am Institut für Biochemie der Universität Greifswald nach folgendem Ablauf:

Die Beugungsdaten wurden mit dem Einkristalldiffraktometer STOE-IPDS 2T bei

Raumtemperatur mit graphit-monochromatischer MoKα-Strahlung (λ = 0.71073 Å)

aufgenommen. Die Struktur wurde mittels direkter Methoden gelöst (SIR-92; Journal of Applied

Crystallography, 1994, 27, 435-436) und durch die Voll-Matrix-Methode der kleinsten Quadrate

(KQ-Methode) verfeinert (SHELXL-13; Acta Crystallographica Section A: Foundations of

Crystallography, 2008, 64, 112-122). Alle Nicht-Wasserstoffatome wurden durch anisotrope

Auslenkungsparameter verbessert. Alle Stickstoff-gebundenen Wasserstoffatome wurden

gefunden und frei verfeinert. Die Kohlenstoff-gebundenen Wasserstoffatome wurden ebenfalls

gefunden, dann jedoch als „riding“ behandelt und in ideale Positionen gesetzt mit einer

Restriktion der Auslenkungsparameter auf Uiso = 1,2 Ueq der entsprechenden gebundenen

Kohlenstoffatome.

Hergestellt wurde der Kristall mit Hilfe der Vapor-Diffusion-Methode. Dafür wurden etwa 20 mg

Substanz in leicht ammoniakalischem Methanol gelöst und in ein offenes Schnappdeckelgefäß

gegeben. Dieses wurde in ein größeres Becherglas, welches etwa bis zur Hälfte mit Diethylether

gefüllt war, gestellt und dann luftdicht verschlossen. Der Wachstumsprozess dauerte etwa 2

Wochen.



4.1.12 Kristallographie (BESSY II, Berlin) und isotherme Titrationskalorimetrie

Im Arbeitskreis Makromolekulare Kristallographie um Dr. Manfred Weiss (Helmholtz-Zentrum

Berlin für Materialien und Energie, Photonenquelle BESSY II) wurden die

Röntgenkristallstrukturen der Substanzen LXXVII, LXXXII, CX und CXI vermessen und

nachberechnet. Dafür wurde folgenden Methoden genutzt:

KDM4D-Proteinkristalle (KDM4D gekürzt auf Aminosäuresequenz 1-342) wurden unter

Verwendung der Sitting-Drop-Methode bei einer Temperatur von 291 K erhalten. Es wurden

dafür gleiche Volumina (0,4 µL) Protein- und Nicht-Proteinlösung in eine 96-Well-Mikrotiterplatte

(Intelli-Plate, Art Robbin Instruments) pipettiert (Kristallisierroboter Gryphon, Art Robbins

Instruments). Die Zusammensetzung der Nicht-Proteinlösung betrug 24 % PEG 3350,

180 mmol/L Ammoniumsulfat und 0,1 mol/L HEPES-Puffer (pH 7), während die Proteinlösung

eine Konzentration von 19 mg/mL KDM4D, 0,5 mol/L NaCl, 5 % Glycerol, 1 mmol/L Tris(2-

carboxyethyl)phosphin (TCEP) und 10 mmol/L HEPES-Puffer (pH 7,5) aufwies. Für die Soaking-

Experimente wurden die erhaltenen KDM4D-Kristalle in Nicht-Proteinlösung mit 10 mmol/L

NiCl2 eingeweicht und anschließend in Liganden-Lösung (hergestellt aus Nicht-Proteinlösung

mit 100-150 mmol/L Ligand) transferiert. Die Inkubationszeit betrug zwischen 30 Minuten und

24 Stunden. Anschließend wurden die Kristalle kurzzeitig in eine Frostschutzlösung bestehend

aus Nicht-Proteinlösung und 20 % Ethylenglycol getaucht und dann schockgefroren.

Zur Erhebung der Röntgenbeugungsdaten wurden die Abschnitte 14.1 und 14.3 am BESSY II

Synchrotron Berlin mit den Pilatus 6M bzw. Rayonix MX225 CCD Detektoren benutzt (The

European Physical Journal Plus, 2015, 130, 141). Integration und Anpassung der Daten wurden

mit der XDSAPP Software durchgeführt (Journal of Applied Crystallography, 2016, 49,

1085-1092). Die Strukturen wurden mit Hilfe von einfachen molekularen Ersatzmethoden mit

den gängigen Modellen aufgelöst und mit den Programmen refmac bzw. phenix.refine verfeinert

(Acta Crystallography Section D Biological Crystallography, 2011, 67, 355-367 und 2012, 68,

352-367). Die finalen Strukturen wurden anschließend manuell mit der Software Coot adjustiert

und in der Protein Data Bank hochgeladen.

Die Messungen der Bindungsaffinitäten von KDM4D mit den Liganden LXXXII, CX und CXI

erfolgte mit dem MicroCal PEAQ-ITC Mikrokalorimeter (Malvern Panalytical GmbH). Die

Experimente wurden in einer Lösung von 10 mmol/L HEPES-Puffer (pH 7,5), 5 % Glycerol und

1 mmol/L TCEP bei 20 °C durchgeführt. Die Proteinkonzentration wurde spektroskopisch

(λ = 280 nm) bestimmt. Die DMSO-Stammlösungen der Liganden wurden entsprechend mit

Puffer-Lösung auf Arbeitskonzentration verdünnt (Gesamtgehalt DMSO 0,4 bis 1 %). Um

thermische Mischungseffekte auszuschließen, wurden die KDM4D-Lösungen vorher den

entsprechenden DMSO-Konzentrationen der Liganden-Lösungen angepasst. Die eigentliche

Titration verlief in 13 bis 19 Schritten zu je etwa 2-3 µL Liganden-Lösung (bei 180 Sekunden


128 | Chemikalien

Spacing Time und 5 Sekunden Filtering Period). Die Datenauswertung aller Experimente

erfolgte mit der Software MicroCal PEAQ-ITC Analysis.

4.1.13 LANCE-Assay (Institut für Pharmazeutische Wissenschaften, Freiburg)

Die biologischen Daten wurden im Arbeitskreis von Prof. Dr. Manfred Jung an der Albert-

Ludwigs-Universität Freiburg nach folgender Vorgehensweise erhoben:

Der kommerziell erhältliche Antikörper-basierte LANCE-Assay (PerkinElmer) wurde in einem

Volumen von 10 μL in weißen OptiPlate-384-Mikrotiterplatten (PerkinElmer) durchgeführt. Der

verwendete 50 mmol/L HEPES-Puffer (pH = 7,5) enthielt 0,01 % Tween-20 und 0,01 % bovines

Serumalbumin (BSA). Die zu untersuchenden Substanzen (0-1000 μmol/L in DMSO) wurden

für 10 min bei Raumtemperatur mit einer Lösung aus 60 nmol/L KDM4A AS1–359 inkubiert.

Anschließend erfolgte der Zusatz von 100 μmol/L Ascorbinsäure, 5 μmol/L FeSO4, 1 μmol/L

2OG sowie 400 nmol/L biotinyliertem H3K9me3-Substrat (ARTKQTARK(me3)-

STGGKAPRKQLA-K(Biotin)) (BPS Bioscience). Der finale DMSO-Gehalt der Lösungen betrug

in allen Fällen 5 %. Die Proben wurden für 45 min bei Raumtemperatur inkubiert und die

Reaktion daraufhin durch Zugabe von 10 μL einer Lösung aus 2 nmol/L Europium-markiertem

anti-H3K9me2-LANCE-Antikörper (PerkinElmer), 50 nmol/L ULight-Streptavidin-Farbstoff

(PerkinElmer) und 1 mmol/L EDTA in 1X-LANCE-Detektionspuffer (PerkinElmer) gestoppt (alle

angegebenen Konzentrationen entsprechen den finalen Konzentrationen). Anschließend

erfolgte eine weitere Inkubation bei Raumtemperatur für 60 min. Für die Messung der FRET-

Intensität diente ein EnVision 2102-Multilabel-Plattenlesegerät (PerkinElmer) bei λex = 340 nm

und λem = 665 nm mit einer Verzögerung von 100 μs. Die Auswertung erfolgte mithilfe der

Software GraphPad Prism 4.00, wobei die IC50-Werte als Mittelwert von zwei unabhängigen

Experimenten errechnet wurden.

Der FDH-Assay kam auf Grund von Eigenfluoreszenz der getesteten Substanzen nicht zum

Einsatz. Um sicherzustellen, dass keine Interferenzen mit dem LANCE-Assay auftraten, wurde

als Negativkontrolle der Assay mit den Substanzen ohne Enzym durchgeführt, wobei keine

Änderung des Messsignals beobachtet werden konnte.

4.2 Chemikalien

Für den synthetischen Teil dieser Arbeit wurden Chemikalien so eingesetzt, wie vom Händler

geliefert wurde, sofern keine Trocknungsverfahren angegeben sind, und besaßen mindestens

die Reinheit „zur Synthese“. Bei dem verwendeten Wasser handelt es sich ausschließlich um

voll entsalztes Wasser.


Chemikalien | 129

Eine Auflistung der Chemikalien für den analytischen Teil findet sich in der nachfolgenden

Tabelle. Einzelne Standards aus dieser Tabelle wurden unentgeltlich vom National Center for

Advancing Translational Sciences des National Instiute of Health der USA zur Verfügung

gestellt.

Chemikalie Reinheit (%) oder Bezeichnung Hersteller Acetonitril 99,9 Fluka Analytical Ameisensäure 99,5 Fisher Chemical Ammoniak-Lösung, wässrig (25 %)

LC-MS grade Sigma-Aldrich

rac-Dehydronorketamin∙HCl Certified reference material Sigma-Aldrich (2S,6S)-Hydroxynorketamin (2R,6R)-Hydroxynorketamin

99,5 National Center for Advancing Translational Sciences

Isopropanol 99,95 Carl Roth rac-Ketamin∙HCl Certified reference material Sigma-Aldrich S-Ketamin∙HCl Arzneimittel Pfizer Kohlenstoffdioxid 99,995 Air Liquide Methanol 99,98 Carl Roth Methyl-tert-butylether 99,5 Merck Natriumcarbonat 99,9 VWR rac-Norketamin∙HCl Certified reference material Sigma-Aldrich rac-Norketamin-d4∙HCl Certified reference material Sigma-Aldrich Wasser ≤0,055 µS/cm, pH 5.0–6.0 In-Haus


130 | Beschreibung der Synthesen

4.3 Beschreibung der Synthesen

Hinweis: Bei nichtäquimolaren Verhältnissen oder nicht kompletten Umsätzen von Aziden

während der Tetrazolsynthese, müssen Azidreste unschädlich gemacht werden, da von ihnen

akute Gefahr für Mensch und Umwelt ausgeht. In dieser Arbeit wurden die zu neutralisierenden

Azidreste mit Salpetriger Säure (in situ Herstellung aus Natriumnitrit und verdünnte

Schwefelsäure) zu molekularem Stickstoff und Distickstoffmonoxid umgesetzt367. Bei

Kombination mit dem Lösungsmittel Dimethylformamid muss eine mögliche Entstehung von

potentiell kanzerogenen Nitrosaminen aus Aminverunreinigungen des Dimethylformamids

beachtet werden, welche wahrscheinlich auch ursächlich für einen aktuellen Rückruf von mit

Nitrosaminen verunreinigten Valsartan-Chargen war368.

4.3.1 Synthese von Tetrazol- und Carbonsäurehydrazid-beinhaltenden Substanzen

N-Acetylanthranilsäure (II)

Anthranilsäure (I) (20,0 g, 145 mmol) wird in einem Überschuss Acetanhydrid (etwa 200 mL)

suspendiert und unter Rückfluss für etwa 60 min erhitzt, wobei das Edukt komplett in Lösung

geht. Nach Erkalten des Ansatzes wird die Lösung in etwa 800 mL Eiswasser gegossen,

wodurch das Reaktionsprodukt in feinen Nadeln auskristallisiert. Diese werden abfiltriert und,

wenn nötig, aus 20%igem Ethanol (Wasser/Ethanol, 80:20, v/v) umkristallisiert.

Beschaffenheit: Farbloser kristalliner Feststoff.

Schmelzbereich: 184-187 °C (184-185 °C116).

Ausbeute: 99 %. 1H-NMR (DMSO-d6): δ = 2,13 (s, 3H, C(9)H3), 7,13 (t, 1H, C(5)H, 3J = 8,4 Hz), 7,57 (t, 1H, C(4)H,

3J = 8,0 Hz), 7,96 (d, 1H, C(3)H, 3J = 8,0 Hz), 8,45 (d, 1H, C(6)H, 3J = 8,4 Hz), 11,05 (s, 1H,

N(7)H), 13,56 (s, 1H, C(10)OOH). 13C-NMR (DMSO-d6): δ = 24,9 (C9), 116,5 (C1), 119,9 (C3), 122,5 (C5), 131,0 (C6), 133,9 (C4),

140,8 (C2), 168,4 (C8), 169,4 (C10).

MIR (ṽ): 3330 (w, νN-H), 3100-2300 (s, νO-H, assoziiert) cm−1.


Beschreibung der Synthesen | 131

N-Acetyl-5-bromanthranilsäure (III)

N-Acetylanthranilsäure (II) (15,8 g, 88 mmol) wird in so viel Wasser aufgeschlämmt, dass eine

komplette Durchmischung durch einen Magnetrührer möglich ist. Anschließend erfolgt die

langsame Zugabe von 1,3 Äq. Br2-Lösung (18,2 g, 114 mmol; Lösung aus 30,0 g KBr und

200 mL Wasser) mit Hilfe eines Tropftrichters über 1,5 h unter starkem Rühren. Nach erfolgter

Bromzugabe wird der Reaktionsansatz über Nacht unter einem gut arbeitenden Laborabzug

weitergerührt. Das erhaltene Produkt wird abfiltriert und, wenn nötig, aus 20%igem Ethanol

(Wasser/Ethanol, 80:20, v/v) umkristallisiert.

Beschaffenheit: Leicht rosafarbener amorpher Feststoff.


Ausbeute: 86 %. 1H-NMR (DMSO-d6): δ = 2,13 (s, 3H, C(9)H3), 7,75 (dd, 1H, C(4)H, 3J = 8,8 Hz), 8,03 (s, 1H,

C(6)H), 8,40 (d, 1H, C(3)H, 3J = 8,8 Hz), 10,95 (s, 1H, N(7)H), 13,90 (s, 1H, C(10)OOH). 13C-NMR (DMSO-d6): δ = 24,9 (C9), 113,9 (C1), 118,8 (C5), 122,1 (C3), 133,0 (C6), 136,4 (C4),

139,8 (C2), 168,0 (C8), 169,5 (C10).

MIR (ṽ): 3318 (w, νN-H), 3100-2300 (s, νO-H, assoziiert) cm−1.

5-Bromanthranilsäure (IV)

N-Acetyl-5-bromanthranilsäure (III) (18,5 g, 72 mmol) wird in 400 mL einer 1 mol/L Natronlauge

gelöst und unter Rückfluss für 4 h erhitzt. Nach Erkalten der Lösung wird mit HCl bis auf einen

pH-Wert von etwa 1-2 eingestellt. Dabei kommt es zur Fällung des Reaktionsproduktes. Dieses

wird abfiltriert und aus 25%igem Ethanol (Wasser/Ethanol, 75:25, v/v) umkristallisiert.

Beschaffenheit: Feine farblose Nadeln.




Ausbeute: 88 %. 1H-NMR (DMSO-d6): δ = 6,73 (d, 1H, C(3)H, 3J = 8,8 Hz), 7,34 (dd, 1H, C(4)H, 3J = 8,8 Hz), 7,75

(s, 1H, C(6)H), 8,72 (s, 2H, N(7)H2).

13C-NMR (DMSO-d6): δ = 104,5 (C1), 111,1 (C5), 118,6 (C3), 132,8 (C6), 136,1 (C4), 150,5

(C2), 168,3 (C8).

MIR (ṽ): 3474 (s, νN-H2), 3100-2300 (s, νO-H, assoziiert) cm−1.

5-Bromanthranilsäuremethylester (VI)

Es werden 10,0 g 5-Bromanthranilsäure (IV) (46 mmol) in 150 mL MeOH gelöst und im Eisbad

gerührt. Dazu werden langsam 22 mL Thionylchlorid (303 mmol) mit Hilfe eines Tropftrichters

zugegeben. Der anfangs gebildete Feststoff löst sich beim Erhitzen unter Rückfluss vollständig.

Nach 15 h Siedehitze wird das Methanol im Teilvakuum entfernt (es ist eine Waschflasche mit

Natronlauge zu benutzen, um die Vakuumpumpe zu schonen). Der Überstand wird in

Ethylacetat aufgenommen und mit gesättigter NaHCO3-Lösung extrahiert. Durch

anschließendes Trocknen über Na2SO4 und Einengen im Teilvakuum wird aus der organischen

Phase das Zielprodukt erhalten.

Beschaffenheit: Gelblich glänzender Feststoff.


Ausbeute: 64 %. 1H-NMR (DMSO-d6): δ = 3,79 (s, 3H, C(9)H3), 6,76 (d, 1H, C(3)H, 3J = 8,8 Hz und 2H, N(7)H2),

7,37 (dd, 1H, C(4)H, 3J = 8,8 Hz), 7,76 (s, 1H, C(6)H). 13C-NMR (DMSO-d6): δ = 51,7 (C9), 104,7 (C1), 110,1 (C5), 118,9 (C3), 132,2 (C6), 136,4 (C4),

150,4 (C2), 166,6 (C8).

MIR (ṽ): 3452 (s, νN-H2), 1684 (s, νC=O) cm−1.



5-Cyananthranilsäuremethylester (VII)

5-Bromanthranilsäuremethylester (VI) (2,9 g, 13 mmol) und 1,5 g CuCN (17 mmol, 1,3 Äq.)

werden trocken in einem Zweihalskolben vermengt. Die gesamte Apparatur mitsamt

Rückflusskondensator wird evakuiert und anschließend mit Stickstoff geflutet (insgesamt 3 Mal).

Die Zugabe von 20 mL NMP erfolgt über den mit einem Septum verschlossenen Seitenhals.

Unter Rückfluss (etwa 210 °C) wird für 2 h erhitzt. Das entstandene dunkle Rohprodukt wird in

300 mL gesättigte NH4Cl-Lösung gegossen. Anschließend wird die wässrige Phase mit

Ethylacetat extrahiert (gegebenenfalls können störende, weder in Wasser noch Ethylacetat

lösliche Feststoffe, abfiltriert werden). Nach dem Trocknen über Na2SO4 und Einengen der org.

Phase im Teilvakuum, wird eine zähe dunkle Masse erhalten, aus welcher mit siedendem

10%igem ACN (Wasser/ACN, 90:10, v/v) das gewünschte Produkt extrahiert werden kann. Bei

mitunter auftretender Harzbildung sollte die ACN-Wasser-Mischung abdekantiert werden. Aus

dieser kristallisiert beim Abkühlen der 5-Cyananthranilsäuremethylester.

Beschaffenheit: Farbloser watteartiger Feststoff.

Schmelzbereich: 124-126 °C.

Ausbeute: bis zu 54 %. 1H-NMR (DMSO-d6): δ = 3,82 (s, 3H, C(9)H3), 6,87 (d, 1H, C(3)H, 3J = 8,8 Hz), 7,45 (s, 2H,

N(7)H2), 7,57 (dd, 1H, C(4)H, 3J = 8,8 Hz), 8,05 (s, 1H, C(6)H).

13C-NMR (DMSO-d6): δ = 51,9 (C9), 95,8 (C5), 108,8 (C1), 117,4 (C3), 119,4 (C10), 136,1 (C6

und C4), 153,9 (C2), 166,3 (C8).

MIR (ṽ): 3464 (s, νN-H2), 2211 (s, νC≡N), 1707 (s, νC=O) cm−1.

HRMS (ESI, m/z), berechnet [C9H8N2O2 + H]+: 176,0586; gefunden: 176,0579.



5-(1H-Tetrazol-5-yl)anthranilsäuremethylester (VIII)

Es werden 1,9 g 5-Cyananthranilsäuremethylester (VII) (11 mmol) in 20 mL Toluen gelöst. Dazu

erfolgt die Zugabe von 880 mg NaN3 (14 mmol) und 1,9 g TEA∙HCl (14 mmol) (beide 1,3 Äq.).

Nach etwa 24 h Erhitzen bei 100 °C wird das Toluen im Teilvakuum eingeengt. Der

resultierende Überstand wird in Wasser aufgenommen und mit so viel Na2CO3 versetzt, bis ein

pH-Wert von 7-8 resultiert. Die wässrige Phase wird anschließend mit Ethylacetat extrahiert und

dann mit Salzsäure auf einen pH-Wert von 2 eingestellt. Der entstandene Niederschlag

entspricht dem gewünschten Produkt und kann durch Filtration gewonnen werden.

Beschaffenheit: Khakifarbener amorpher Feststoff.

Schmelzbereich: 231-233 °C unter Zersetzung.

Ausbeute: 78 %. 1H-NMR (DMSO-d6): δ = 3,87 (s, 3H, C(9)H3), 6,96 (d, 1H, C(3)H, 3J = 8,8 Hz), 7,2 (s, 2H,

N(7)H2), 7,88 (dd, 1H, C(4)H, 3J = 8,8 Hz), 8,45 (s, 1H, C(6)H).

13C-NMR (DMSO-d6): δ = 51,7 (C9), 108,6 (C1), 110,1 (C5), 117,3 (C3), 130,2 (C6), 132,22 (C4),

153,1 (C2), 156,0 (C10), 167,2 (C8).

MIR (ṽ): 3452 (s, νN-H2), 1678 (s, νC=O) cm−1.


5-(1H-Tetrazol-5-yl)anthranilsäurehydrazid (IX)

Es werden 550 mg 5-(1H-Tetrazol-5-yl)anthranilsäuremethylester (VIII) (2,5 mmol) in 10 mL

EtOH suspendiert und 2,2 mL N2H4∙H2O (80%ige Lösung in Wasser) hinzugegeben. Es

resultiert eine Lösung, welche für mindestens 8 h unter Rückfluss erhitzt wird. Nach Abkühlen

wird das Lösungsmittel azeotrop an einer Drehschieberpumpe, gegebenenfalls unter erneuter

Zugabe von 10 mL EtOH, entfernt. Der Überstand wird mit Hilfe von 50%igem Methanol



(Wasser/Methanol, 50:50, v/v) kristallisiert und aus dem gleichen Lösungsmittelgemisch

umkristallisiert. Nach Abfiltration wird das Produkt mit wenigen mL kaltem Aceton gewaschen.

Beschaffenheit: Khakifarbender amorpher Feststoff.


Ausbeute: 15 %. 1H-NMR (DMSO-d6): δ = 6,77 (s, 2H, N(7)H2), 6,85 (d, 1H, C(3)H, 3J = 8,4 Hz), 7,75 (dd, 1H,

C(4)H, 3J = 8,4 Hz), 8,08 (s, 1H, C(6)H), 9,66 (s, 1H, N(9)H). 13C-NMR (DMSO-d6): δ = 109,9 (C1), 114,3 (C5), 116,3 (C3), 127,6 (C6), 130,0 (C4), 151,2

(C2), 154,9 (C10), 167,8 (C8).

MIR (ṽ): 3475 (s, νN-H2), 1622 (s, νC=O) cm−1.

HRMS (ESI, m/z), berechnet [C8H9N7O + H]+: 219,0869; gefunden: 219,0878.

5-Iodanthranilsäuremethylester (XI)

8,0 g 5-Iodanthranilsäure (X) (30 mmol) werden in 120 mL MeOH gelöst und mit 9 mL H2SO4

versetzt. Der Reaktionsansatz wird anschließend für mindestens 24 h unter Rückfluss erhitzt.

Nach Einengen des Lösungsmittels im Teilvakuum, wird der Überstand in Wasser

aufgenommen, mit NaOH basisch eingestellt und mit Ethylacetat extrahiert. Durch

anschließendes Trocknen über Na2SO4 und Einengen im Teilvakuum wird aus der organischen

Phase das Zielprodukt erhalten.

Beschaffenheit: Dunkler amorpher Feststoff.

Schmelzbereich: ab 50 °C (83-85 °C144).

Ausbeute: 73 %. 1H-NMR (DMSO-d6): δ = 3,78 (s, 3H, C(9)H3), 6,64 (d, 1H, C(3)H, 3J = 8,8 Hz), 6,77 (s, 2H,

N(7)H2), 7,48 (dd, 1H, C(4)H, 3J = 8,8 Hz), 7,93 (s, 1H, C(6)H).


150,6 (C2), 166,5 (C8).

MIR (ṽ): 3460 (s, νN-H2), 1695 (s, νC=O) cm−1.



N-Acetyl-5-bromanthranilsäuremethylester (XII)

5-Bromanthranilsäuremethylester (VI) (2,3 g, 10 mmol) wird mit Acetanhydrid im Überschuss

(20 mL) 30 min unter Rückfluss erhitzt. Die abgekühlte Lösung wird in 500 mL Eiswasser

gegossen, wobei das gewünschte Produkt in feinen Nadeln auskristallisiert. Diese werden

abfiltriert und, wenn nötig, unter Verwendung von 50%igem Methanol (Wasser/Methanol, 50:50,

v/v) umkristallisiert.

Beschaffenheit: Feine farblose Nadeln.

Schmelzbereich: 128-129 °C (134-135 °C369)

Ausbeute: 88 %. 1H-NMR (DMSO-d6): δ = 2,12 (s, 3H, C(9)H3), 3,85 (s, 3H, C(11)H3), 7,77 (dd, 1H, C(4)H,

3J = 8,8 Hz), 7,96 (s, 1H, C(6)H), 8,13 (d, 1H, C(3)H, 3J = 8,8 Hz), 10,46 (s, 1H, N(7)H). 13C-NMR (DMSO-d6): δ = 24,5 (C9), 52,6 (C11), 114,6 (C1), 120,2 (C5), 123,3 (C3), 132,5 (C6),

136,3 (C4), 138,6 (C2), 166,2 (C10), 168,6 (C8).

MIR (ṽ): 3270 (m, νN-H), 1695 und 1681 (s, νC=O) cm−1.

N-Acetyl-5-cyananthranilsäuremethylester (XIII)

Die Herstellung erfolgt nach der Vorschrift für 5-Cyananthranilsäuremethylester (VII) mit zwei

Änderungen: N-Acetyl-5-bromanthranilsäuremethylester (XII) (2,4 g, 8,8 mmol) wird mit 1,0 g

CuCN (11 mmol) vermengt und in 15 mL NMP gelöst. Das Lösungsmittel zur Extraktion ist

50%iger IPA (Wasser/Isopropanol, 50:50, v/v).

Beschaffenheit: Blassgelber amorpher Feststoff.





3J = 8,4 Hz), 8,26 (s, 1H, C(6)H), 8,39 (d, 1H, C(3)H, 3J = 8,4 Hz), 10,77 (s, 1H, N(7)H). 13C-NMR (DMSO-d6): δ = 24,7 (C9), 52,8 (C11), 105,2 (C5), 118,0 (C1 und C12), 121,2 (C3),

134,8 (C6), 137,1 (C4), 143,1 (C2), 166,1 (C10), 169,1 (C8).

MIR (ṽ): 3253 (m, νN-H), 2225 (s, νC≡N), 1700 und 1682 (s, νC=O) cm−1.

N-Acetyl-5-(1H-tetrazol-5-yl)anthranilsäuremethylester (XIV)

Variante A: siehe Vorschrift für 5-(1H-Tetrazol-5-yl)anthranilsäuremethylester (VIII) mit

N-Acetyl-5-cyananthranilsäuremethylester (XIII) (275 mg, 1,3 mmol), 110 mg NaN3 (1,7 mmol)

und 240 mg (1,7 mmol) TEA∙HCl als Edukte. Aufgrund der minimalen Ausbeute ist Variante B

zu bevorzugen.

Variante B (nach Einhorn150): 600 mg 5-(1H-Tetrazol-5-yl)anthranilsäuremethylester (VIII)

(2,7 mmol) werden in 5 mL Pyridin gelöst und unter Eiskühlung langsam mit 277 µL (3,9 mmol,

1,4 Äq.) Acetylchlorid versetzt. Nach etwa 30-minütigem Rühren wird auf 40 °C für 2 h mit

aufgesetztem Trockenrohr erhitzt. Anschließend wird die Lösung in Eiswasser gegossen und

mit Salzsäure auf einen pH-Wert von 2 eingestellt. Der entstandene Niederschlag wird abfiltriert

und aus 50%igem MeOH (Wasser/MeOH, 50:50, v/v) umkristallisiert.

Beschaffenheit: Blassgelber amorpher Feststoff.



3J = 8,8 Hz), 8,45 (d, 1H, C(3)H, 3J = 8,8 Hz), 8,59 (s, 1H, C(6)H), 10,73 (s, 1H, N(7)H). 13C-NMR (DMSO-d6): δ = 24,7 (C9), 52,7 (C11), 118,2 (C1), 118,8 (C5), 121,6 (C3), 129,1 (C6),

132,0 (C4), 141,6 (C2), 153,6 (C12), 166,9 (C10), 168,8 (C8).

MIR (ṽ): 3261 (m, νN-H), 1690 (s, νC=O) cm−1.




3-Amino-2-methyl-6-(1H-tetrazol-5-yl)chinazolin-4(3H)-on (XVI)

500 mg N-Acetyl-5-(1H-tetrazol-5-yl)anthranilsäuremethylester (XIV) (1,9 mmol) werden in

10 mL MeOH gelöst und mit 2,5 mL N2H4∙H2O (80%ige Lösung in Wasser) versetzt.

Anschließend erfolgt Erhitzen unter Rückfluss für mindestens 8 h. Mit Hilfe einer

Drehschieberpumpe wird das Lösungsmittel azeotrop abdestilliert, gegebenenfalls unter

erneuter Zugabe von 10 mL MeOH. Der Überstand wird erst mit reichlich Ethylacetat, dann mit

Wasser, welches mit Salzsäure auf einen pH-Wert von 2 eingestellt wurde, gründlichst

gewaschen. Durch anschließendes Lösen des Stoffes in verdünnter Natronlauge und erneutem

Fällen aus der Lösung mit Salzsäure, wird der gewünschte Stoff als Präzipitat erhalten. Wenn

nötig, kann der Stoff mit der präparativen HPLC weiter aufgereinigt werden (gelöst in ACN/H2O,

50:50, v/v; A: H2O mit 0,1 % HCOOH und B: ACN, isokratisch, 30 % B).

Beschaffenheit: Bräunlicher amorpher Feststoff.

Schmelzbereich: ab 280 °C unter Zersetzung.

Ausbeute: 8 %. 1H-NMR (DMSO-d6): δ = 2,62 (s, 3H, C(8)H3), 5,88 (s, 2H, N(10)H2), 7,77 (d, 1H, C(3)H,

3J = 8,8 Hz), 8,39 (dd, 1H, C(4)H, 3J = 8,8 Hz), 8,78 (s, 1H, C(6)H). 13C-NMR (DMSO-d6): δ = 22,0 (C8), 120,2 (C1), 122,9 (C5), 124,4 (C6), 127,8 (C3), 131,8 (C4),

147,7 (C2), 155,8 (C11), 157,0 (C7), 159,9 (C9).

MIR (ṽ): 3324 (m, νN-H2), 1624 (s, νC=O) cm−1.


N-Acetyl-5-(5-methyl-1,3,4-oxadiazol-2-yl)anthranilsäuremethylester (XVII)



Es werden 400 mg 5-(1H-Tetrazol-5-yl)anthranilsäuremethylester (VIII) (1,8 mmol) in 7 mL

Acetanhydrid suspendiert und unter Rückfluss für mindestens 1 h erhitzt. Der Überschuss an

Acetanhydrid wird anschließend im Teilvakuum entfernt. Die Umkristallisation des Überstandes

erfolgt aus 30%igem MeOH (Wasser/Methanol, 70:30, v/v) mit Heißfiltration. Der beim Abkühlen

aus der filtrierten Lösung auskristallisierende Stoff entspricht dem Zielprodukt.

Beschaffenheit: Blassgelbe feine Nadeln.


Ausbeute: 52 %. 1H-NMR (DMSO-d6): δ = 2,18 (s, 3H, C(12)H3), 2,58 (s, 3H, C(14)H3), 3,92 (s, 3H, C(9)H3), 8,16

(dd, 1H, C(4)H, 3J = 8,8 Hz), 8,42 (s, 1H, C(6)H), 8,47 (d, 1H, C(3)H, 3J = 8,8 Hz), 10,75 (s, 1H,

N(7)H). 13C-NMR (DMSO-d6): δ = 10,6 (C14), 24,7 (C12), 52,7 (C9), 117,9 (C1), 121,5 (C3), 128,4 (C6),

131,4 (C4), 142,1 (C2), 162,9/163,9 (C10 und C13), 166,7 (C8), 168,9 (C11).

MIR (ṽ): 3262 (m, νN-H), 1709 und 1683 (s, νC=O) cm−1.


N-4-Fluorbenzoyl-5-(1H-tetrazol-5-yl)anthranilsäuremethylester (XIX)

Die Herstellung erfolgt nach der Vorschrift für N-Acetyl-5-(1H-tetrazol-5-

yl)anthranilsäuremethylester (XIV) Variante B mit folgenden Änderungen: 500 mg 5-(1H-

Tetrazol-5-yl)anthranilsäuremethylester (VIII) (2,3 mmol) werden in 5 mL Pyridin gelöst und mit

340 µL 4-Fluorbenzoylchlorid (2,9 mmol, 1,3 Äq.) unter Eiskühlung versetzt. Das Lösungsmittel

für die Umkristallisation ist Methanol.

Beschaffenheit: Farbloser amorpher Feststoff.


Ausbeute: 57 %. 1H-NMR (DMSO-d6): δ = 3,96 (s, 3H, C(9)H3), 7,45 (t, 2H, 2×C(14)H, 3J = 8,8 Hz), 8,04 (t, 2H,

2×C(13)H, 3J = 8,8 Hz), 8,29 (dd, 1H, C(4)H, 3J = 8,4 Hz), 8,68 (s, 1H, C(6)H), 8,73 (d, 1H,

C(3)H, 3J = 8,4 Hz), 11,71 (s, 1H, N(7)H).



13C-NMR (DMSO-d6): δ = 53,0 (C9), 116,1 (2JC,F = 22 Hz, 2×C14), 117,8 (C1), 121,5 (C3), 129,2

(C6), 130,0 (3JC,F = 9 Hz, 2×C13), 130,5 (4JC,F = 3 Hz, C12), 132,4 (C4), 142,0 (C2), 155,5 (C10),

163,3 und 165,8 (1JC,F = 249 Hz, C15), 163,9 (C11), 167,4 (C8).

MIR (ṽ): 3255 (w, νN-H), 1688 (s, νC=O) cm−1.

HRMS (ESI, m/z), berechnet [C16H12FN5O3 + H]+: 341,0924; gefunden: 341,0923.

N-Cyanmethyl-5-phenylvalerianamid (XXV)

700 mg Aminoacetonitril-Hydrochlorid (XXIV) (7,5 mmol) werden in einer Mischung aus 10 mL

Pyridin und 40 mL CH2Cl2 gelöst. Anschließend werden 2,1 g 5-Phenylvaleriansäurechlorid

(XXIII) (11 mmol, 1,5 Äq.) tropfenweise hinzugegeben und mindestens 20 h bei

Raumtemperatur gerührt. Durch Einengen des Reaktionsansatzes im Teilvakuum wird eine

sirupöse Masse erhalten, welche durch Flüssig-Flüssig-Extraktion mit Wasser (pH 2 mit

Salzsäure eingestellt) und Ethylacetat gewaschen wird. Die organische Phase wird mit Na2SO4

getrocknet und anschließend das Lösungsmittel im Teilvakuum entfernt. Der Überstand wird

anschließend säulenchromatographisch aufgearbeitet (gelöst in wenigen mL EtOAc, LM:

PE/EtOAc, 50:50, v/v).

Beschaffenheit: Blassgelber wachsartiger Feststoff.


Ausbeute: 74 %. 1H-NMR (CDCl3): δ = 1,67 (m, 4H, C(3)H2 und C(4)H2, 3J = 7,2 Hz), 2,24 (t, 2H, C(2)H2,

3J = 7,2 Hz), 2,63 (t, 2H, C(5)H2, 3J = 7,2 Hz), 4,13 (s, 2H, C(11)H2), 6,00 (s, 1H, N(10)H), 7,17-

7,28 (m, 5H, 2×C(7)H und 2×C(8)H und C(9)H). 13C-NMR (CDCl3): δ = 25,0 (C3), 27,5 (C11), 31,0 (C4), 35,7 (C5), 36,0 (C2), 116,3 (C12), 126,1-

128,6 (2×C7 und 2×C8 und C9), 142,2 (C6), 173,1 (C1).

MIR (ṽ): 3285 (s, νN-H), 2852 (m, νC-H2), 1655 (s, νC=O) cm−1.




N-(1H-Tetrazol-5-yl)methyl-5-phenylvalerianamid (XXVI)

Es werden 575 mg N-Cyanmethyl-5-phenylvalerianamid (XXV) (2,6 mmol) mit 190 mg NaN3

(2,9 mmol, 1,1 Äq.) und 160 mg NH4Cl (2,9 mmol, 1,1 Äq.) eingewogen. Nach Zugabe von

10 mL DMF wird für mindestens 24 h bei 105 °C erhitzt. Nach Einengen des Reaktionsansatzes

im Teilvakuum wird dieser mit K2CO3-Lösung aufgenommen und mehrfach mit Ethylacetat im

Scheidetrichter gewaschen. Ansäuern der wässrigen Phase (langsam wegen CO2- und

möglicher HN3-Entwicklung, Abzug!) führt zur Fällung des gewünschten Produktes. Nach

Abfiltration und Trocknung kann das Produkt, wenn nötig, aus 50%igem MeOH

(Wasser/Methanol, 50:50, v/v) umkristallisiert werden.



Ausbeute: 53 %. 1H-NMR (DMSO-d6): δ = 1,53 (t, 4H, C(3)H2 und C(4)H2, 3J = 6,8 Hz), 2,17 (t, 2H, C(2)H2,

3J = 6,8 Hz), 2,55 (t, 2H, C(5)H2, 3J = 6,8 Hz), 4,53 (s, 2H, C(11)H2), 7,16-7,27 (m, 5H, 2×C(7)H

und 2×C(8)H und C(9)H), 8,55 (s, 1H, N(10)H). 13C-NMR (DMSO-d6): δ = 24,5 (C3), 30,5 (C4), 32,3 (C11), 34,8 (C2 und C5), 125,6-128,3 (2×C7

und 2×C8 und C9), 142,0 (C6), 154,5 (C12), 172,6 (C1).

MIR (ṽ): 3283 (s, νN-H), 2853 (m, νC-H2), 1656 (s, νC=O) cm−1.

HRMS (ESI, m/z), berechnet [C13H17N5O − H] −: 259,1433; gefunden: 259,1432.

2-[4-(1H-Indol-3-yl)butylamido]-2-(1H-tetrazol-5-yl)essigsäureethylester (XXX)

510 mg 2-Amino-2-(1H-tetrazol-5-yl)essigsäureethylester-Hydrochlorid (XXIX) (2,5 mmol) und

500 mg 4-(1H-Indol-3-yl)buttersäure (XXVII) (2,5 mmol, 1,0 Äq.) werden in einem Eisbad in

30 mL wasserfreiem CH2Cl2 gelöst. Dazu werden erst 770 µL Diisopropylcarbodiimid (5,0 mmol,

2,0 Äq.) hinzugegeben und dann tropfenweise 840 µL DIPEA (5,0 mmol, 2,0 Äq.) addiert. Nach



30-minütigem Rühren bei 0 °C wird der Reaktionsansatz bei Raumtemperatur für weitere 20 h

durchmengt. Nach Einengen des Gemisches wird der Überstand mit K2CO3-Lösung

aufgenommen und im Scheidetrichter mit Ethylacetat gewaschen. Die wässrige Phase scheidet

nach Ansäuern mit Salzsäure ein bräunliches Öl ab, welches unter Eiskühlung zügig erstarrt.

Dieser Feststoff (gewünschtes Produkt) wird abfiltriert und mit heißem Diethylether mehrfach

gewaschen.



Ausbeute: 77 %. 1H-NMR (DMSO-d6): δ = 1,16 (t, 3H, C(18)H3, 3J = 7,2 Hz), 1,88 (m, 2H, C(6)H2, 3J = 7,2 Hz),

2,27 (t, 2H, C(5)H2, 3J = 7,2 Hz), 2,67 (t, 2H, C(7)H2, 3J = 7,2 Hz), 4,17 (q, 2H, C(17)H2, 3J = 7,2 Hz), 5,92 (d, 1H, C(2)H, 3J = 7,6 Hz), 6,95-7,07 (2×t, C(14)H und C(15)H, 3J = 7,6 Hz),

7,10 (s, 1H, C(9)H), 7,32 (d, 1H, C(16)H, 3J = 8,0 Hz), 7,48 (d, 1H, C(13)H, 3J = 8,0 Hz), 9,07

(d, 1H, N(3)H, 3J = 7,6 Hz), 10,75 (s, 1H, N(10)H). 13C-NMR (DMSO-d6): δ = 13,8 (C18), 24,1 (C6), 25,9 (C7), 38,9 (C5), 47,4 (C2), 61,8 (C17),

111,3 (C16), 114,0 (C8), 118,1 (C13 und C14), 120,8 (C15), 122,3 (C9), 127,1 (C12), 136,3

(C11), 154,0 (C19), 167,3 (C1), 172,7 (C4).

MIR (ṽ): 3357 und 3265 (m, νN-H), 1740 und 1640 (s, νC=O) cm−1.


2-[4-(1H-Indol-3-yl)butylamido]-2-(1H-tetrazol-5-yl)essigsäurehydrazid (XXXI)

Es werden 2-[4-(1H-Indol-3-yl)butylamido]-2-(1H-tetrazol-5-yl)essigsäureethylester (XXX)

(560 mg, 1,6 mmol) in 40 mL MeOH gelöst und mit 2,3 mL N2H4∙H2O (80%ige Lösung in

Wasser) versetzt. Die Umsetzung erfolgt unter Rückfluss für mindestens 6 h. Der

Reaktionsansatz wird im Hochvakuum an einer Drehschieberpumpe eingeengt und

anschließend über Nacht in einem Exsikkator (H2SO4!) von weiteren Hydrazinresten befreit. Es

erfolgt erst eine säulenchromatographische Aufarbeitung (adsorbiert an Kieselgur (aus MeOH),

LM: EtOAc/MeOH/NH3, 70:30:1, v/v/v), ehe die vorgereinigten Produktfraktionen vereint und mit

HN

NH

O

NH2

NN

NNH

ONH

12

3 45

67

19

89

10

11

16

15

12

13

14

1718

XXXI



Hilfe der präparativen HPLC weiter aufgearbeitet werden (gelöst in ACN/H2O/DMSO, 10:80:10,

v/v/v; A: H2O mit H3PO4 auf pH 2,7 eingestellt und B: ACN, isokratisch, 20 % B).

Beschaffenheit: Gräulicher amorpher Feststoff.


Ausbeute: 22 %. 1H-NMR (DMSO-d6): δ = 1,87 (m, 2H, C(6)H2, 3J = 7,6 Hz), 2,30 (t, 2H, C(5)H2, 3J = 7,6 Hz),

2,67 (t, 2H, C(7)H2, 3J = 7,6 Hz), 5,83 (d, 1H, C(2)H, 3J = 7,6 Hz), 6,95-7,05 (2×t, C(14)H und

C(15)H, 3J = 7,2 Hz), 7,10 (s, 1H, C(9)H), 7,32 (d, 1H, C(16)H, 3J = 8,0 Hz), 7,49 (d, 1H, C(13)H, 3J = 7,6 Hz), 8,73 (d, 1H, N(3)H, 3J = 7,6 Hz), 10,75 (s, 1H, N(10)H). 13C-NMR (DMSO-d6): δ = 24,3 (C6), 24,8 (C7), 34,6 (C5), 46,9 (C2), 111,3 (C16), 114,1 (C8),

118,2 (C13 und C14), 120,8 (C15), 122,3 (C9), 127,2 (C12), 136,3 (C11), 154,9 (C19), 165,5

(C1), 172,6 (C4).

MIR (ṽ): 3403 und 3273 (s, νN-H), 1704 und 1651 (s, νC=O) cm−1.


4.3.2 Synthese von Tetrazolylpyridinen und Isonicotinsäure-beinhaltenden Substanzen

2-Chlor-4-(1H-tetrazol-5-yl)pyridin (XXXV)

Es wird 2-Chlorisonicotinnitril (XXXIV) (20,0 g, 144 mmol) in 200 mL Toluen gelöst.

Anschließend werden 12,2 g Natriumazid (1,3 Äq., 187 mmol) und 25,8 g

Triethylammoniumchlorid (1,3 Äq., 187 mmol) hinzugegeben und der Reaktionsansatz für 18 h

bei 110 °C gerührt. Nach Abkühlen des Reaktionsgemisches auf Raumtemperatur wird so viel

wässrige Natronlauge zugesetzt, bis ein pH-Wert von etwa 12 eingestellt ist. Die wässrige

Phase wird dreimal mit 50 mL Ethylacetat gewaschen und anschließend mit konzentrierter

Salzsäure angesäuert, wodurch 2-Chlor-4-(1H-tetrazol-5-yl)pyridin ausgefällt wird. Nach

Filtration kann der resultierende Rückstand aus wässrigem Methanol (Wasser/MeOH, 85:15,

v/v) umkristallisiert werden. Die Lagerung erfolgt unter Lichtausschluss.





Ausbeute: 92 %. 1H-NMR (DMSO-d6): δ = 8,02 (d, 1H, C(3)H, 3J = 4,0 Hz), 8,07 (s, 1H, C(5)H), 8,66 (d, 1H,

C(2)H, 3J = 4,4 Hz). 13C-NMR (DMSO-d6): δ = 120,3 (C5), 121,2 (C3), 135,7 (C4), 151,3 (C6) 151,4 (C2), 154,8 (C7).

MIR (ṽ): 1611 (s, νC=N), 1400 (s, νC-Cl) cm−1.

HRMS (ESI, m/z), berechnet [C6H4N5Cl + H]+: 181,0155; gefunden: 181,0161.

N-Ethyl-4-(1H-tetrazol-5-yl)pyridin-2-amin-Hydrochlorid (XXXVI)

Es werden 500 mg 2-Chlor-4-(1H-tetrazol-5-yl)pyridin (XXXV) (2,7 mmol) mit 2,2 mL 70%iger

wässriger Ethylamin-Lösung (10 Äq., 27 mmol) versetzt und 25 Minuten bei 190 °C im

Mikrowellenreaktor erhitzt. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wird das Reaktionsgemisch in

20 mL Eiswasser gegossen und anschließend mit konzentrierter Salzsäure auf einen pH-Wert

von etwa 2 eingestellt, wobei das N-Ethyl-4-(1H-tetrazol-5-yl)pyridin-2-amin als

Hydrochloridsalz auskristallisiert. Das Zielprodukt wird abfiltriert und mit wenig heißem Methanol

gewaschen.



Ausbeute: 5 %. 1H-NMR (DMSO-d6): δ = 1,14 (t, 3H, C(9)H3, 3J = 7,2 Hz), 3,27 (m, 2H, C(8)H2), 6,39 (t, 1H,

N(10)H, 3J = 5,6), 7,04 (m, 2H, C(3)H und C(5)H, 3J = 5,2 Hz), 7,94 (d, 1H, C(2)H, 3J = 5,2 Hz). 13C-NMR (DMSO-d6): δ = 14,8 (C9), 35,5 (C8), 104,0 (C5), 109,3 (C3), 140,0 (C4), 147,6 (C2),

159,3 (C6), 159,6 (C7).

MIR (ṽ): 3199 (m, νN-H), 1638 (s, νC=N) cm−1.

HRMS (ESI, m/z), berechnet [C8H10N6 + H]+: 190,0967; gefunden: 190,0967.

Nachfolgende Synthesebeschreibungen, welche auf N-Ethyl-4-(1H-tetrazol-5-yl)pyridin-2-amin

(XXXVI) Bezug nehmen, meinen ebenfalls eine mikrowellengestützte Umsetzung im Closed-



Vessel-Verfahren und, wenn nicht anders angegeben, eine anschließende Fällung des

Hydrochloridsalzes aus einer entsprechenden Lösung.

N-Allyl-4-(1H-tetrazol-5-yl)pyridin-2-amin-Hydrochlorid (XXXVII)

Die Synthese erfolgt analog zu N-Ethyl-4-(1H-tetrazol-5-yl)pyridin-2-amin-Hydrochlorid (XXXVI)

mit folgenden Änderungen: 500 mg 2-Chlor-4-(1H-tetrazol-5-yl)pyridin (XXXV) (2,7 mmol)

werden mit 2,1 mL Allylamin (10 Äq., 28 mmol) bei 200 °C für 30 min umgesetzt. Die Fällung

des Hydrochlorids kann durch wenige mL Ethylacetat unterstützt werden. Als Waschflüssigkeit

wird Isopropanol verwendet. Das Zielprodukt kann, wenn nötig, aus Wasser umkristallisiert

werden.



Ausbeute: 9 %. 1H-NMR (DMSO-d6): δ = 3,98 (s, 2H, C(8)H2), 5,12 (dd, 1H, C(10)H2, 3J = 1,6 und 10,4 Hz), 5,24

(dd, 1H, C(10)H2, 3J = 2,0 und 18,4 Hz), 5,94 (m, 1H, C(9)H, 3J = 1,6 und 10,4 und 18,4 Hz),

7,14 (d, 1H, C(3)H, 3J = 5,6 Hz), 7,25 (s, 1H, C(5)H), 7,51 (s, 1H, N(11)H), 8,13 (d, 1H, C(2)H, 3J = 5,6 Hz). 13C-NMR (DMSO-d6): δ = 43,1 (C8), 105,6 (C5), 108,9 (C3), 115,4 (C10), 134,9 (C4), 135,3

(C9), 146,3 (C2), 155,8 (C6), 157,8 (C7).

MIR (ṽ): 3080 (m, νC=C-H), 1635 (s, νC=N) cm−1.


N-Cyclohexyl-4-(1H-tetrazol-5-yl)pyridin-2-amin (XXXVIII)

N NH

N

NN

HN

1

2

34

5

6

7

8

910

11

XXXVIII





werden mit 2,8 mL Cyclohexylamin (9 Äq., 24 mmol) und 0,9 mL DIPEA (2,0 Äq., 5,4 mmol) bei

190 °C für 1 h gerührt. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wird im Teilvakuum eingeengt und

der Überstand chromatographisch aufgereinigt (adsorbiert an Kieselgur (aus MeOH), LM:

EtOAc/Aceton/MeOH/Eisessig, 75:15:10:1, v/v/v/v). Das Zielprodukt kann, wenn nötig, aus

Methanol umkristallisiert werden.

Beschaffenheit: Leicht bräunlicher amorpher Feststoff.


Ausbeute: 6 %. 1H-NMR (D2O): δ = 0,92 (m, 3×1H, 2×C(9)H2 und C(11)H2), 1,10 (m, 2×1H, 2×C(10)H2), 1,34

(m, 1H, C(11)H2), 1,47 (m, 2×1H, 2×C(10)H2), 1,66 (m, 2×1H, 2×C(9)H2), 3,17 (m, 1H, C(8)H),

6,83 (s, 1H, C(5)H), 6,91 (d, 1H, C(3)H, 3J = 6,0 Hz), 7,73 (d, 1H, C(2)H, 3J = 6,0 Hz). 13C-NMR (D2O): δ = 24,4 (2×C10), 25,2 (C11), 32,3 (2×C9), 50,1 (C8), 106,0 (C5), 110,0 (C3),

137,8 (C4), 147,6 (C2), 158,5 (C6), 160,5 (C7).

MIR (ṽ): 3245 (m, νN-H), 1638 (s, νC=N) cm−1.


N-Benzyl-4-(1H-tetrazol-5-yl)pyridin-2-amin-Hydrochlorid (XXXIX)



werden mit 3,6 mL Benzylamin (8 Äq., 33 mmol) bei 190 °C für 30 min erhitzt. Das nach

Ansäuern und Abfiltrieren anfallende Zielprodukt (mitunter längere Lagerung im Kühlschrank

notwendig) kann aus Methanol umkristallisiert werden.

Beschaffenheit: Leicht gelblicher amorpher Feststoff.


Ausbeute: 9 %.



1H-NMR (D2O, Na+-Salz): δ = 4,27 (s, 2H, C(8)H2), 6,95 (s, 1H, C(5)H), 7,01 (d, 1H, C(3)H,

3J = 5,6 Hz), 7,13 (m, 1H, C(12)H), 7,19 (m, 4H, 2×C(10)H und 2×C(11)H), 7,83 (d, 1H, C(2)H, 3J = 5,6 Hz). 13C-NMR (D2O, Na+-Salz): δ = 45,1 (C8), 105,6 (C5), 110,5 (C3), 127,1-128,6 (2×C10 und

2×C11 und 12), 138,0 (C4), 139,1 (C9), 147,7 (C2), 158,9 (C6), 160,5 (C7).

MIR (ṽ): 3322 (m, νN-H), 1615 (s, νC=N) cm−1.


N-(Pyridin-3-yl-methyl)-4-(1H-tetrazol-5-yl)pyridin-2-amin-Hydrochlorid (XL)



werden mit 2,5 mL β-Picolylamin (2-(Aminomethyl)pyridin, 9 Äq., 24 mmol) bei 190 °C für 30

min durchmengt. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wird im Teilvakuum eingeengt und der

Überstand chromatographisch aufgereinigt (adsorbiert an Kieselgur (aus ammoniakalischem

MeOH), LM: EtOAc/Aceton/MeOH/Ammoniak, 50:30:20:1, v/v/v/v). Das erhaltene Produkt wird

mit Salzsäure in sein Hydrochloridsalz überführt und mit reichlich heißem Isopropanol

nachgewaschen.



Ausbeute: 10 %. 1H-NMR (D2O, Na+-Salz): δ = 4,22 (s, 2H, C(8)H2), 6,89 (s, 1H, C(5)H), 6,96 (d, 1H, C(3)H,

3J = 5,6 Hz), 7,10 (q, 1H, C(11)H, 3J = 4,8 und 8,0 Hz), 7,51 (d, 1H C(10)H, 3J = 8,0 Hz), 7,78

(d, 1H, C(2)H, 3J = 5,6 Hz), 8,15 (d, 1H, C(12)H, 3J = 4,4 Hz), 8,25 (s, 1H, C(13)H). 13C-NMR (D2O, Na+-Salz): δ = 42,4 (C8), 105,6 (C5), 110,6 (C3), 124,0 (C11), 135,2 (C9), 136,1

(C10), 137,9 (C4), 147,1 (C12), 147,4 (C13), 147,7 (C2), 158,5 (C6), 160,3 (C7).

MIR (ṽ): 3247 (m, νN-H), 1621 (s, νC=N) cm−1.




N-(3-Methoxybenzyl)-4-(1H-tetrazol-5-yl)pyridin-2-amin-Hydrochlorid (XLI)



werden mit 2,9 mL 3-Methoxybenzylamin (8 Äq., 23 mmol) bei 190 °C für 1 h erhitzt. Die

Präzipitation des Zielproduktes im Kühlschrank aus der salzsauren Lösung kann bis zu 14 Tage

betragen. Dieses Produkt wird aus einer Ethylacetat-Methanol-Mischung (EtOAc/MeOH, 70:30,

v/v) umkristallisiert.



Ausbeute: 3 %. 1H-NMR (D2O, Na+-Salz): δ = 3,35 (s, 3H, C(15)H3), 4,03 (s, 2H, C(8)H2), 6,36 (d, 1H, C(14)H,

3J = 8,0 Hz), 6,52 (s, 1H, C(10)H), 6,56 (d, 1H, C(12)H, 3J = 7,6 Hz), 6,78 (s, 1H, C(5)H), 6,82

(m, 1H, C(13)H, 3J = 8,0 Hz), 6,86 (d, 1H, C(3)H, 3J = 4,8 Hz), 7,70 (d, 1H, C(2)H, 3J = 5,2 Hz). 13C-NMR (D2O, Na+-Salz): δ = 44,9 (C8), 54,9 (C15), 105,4 (C5), 110,4 (C3), 112,2 (C10), 112,4

(C12), 119,6 (C14), 129,6 (C13), 137,9 (C4), 140,8 (C9), 147,6 (C2), 158,7 (C6 und C11), 160,3

(C7).

MIR (ṽ): 3254 (m, νN-H), 1657 (s, νC=N) cm−1.


N-(4-Chlorbenzyl)-4-(1H-tetrazol-5-yl)pyridin-2-amin-Hydrochlorid (XLII)



N NH

N

NN

HN

Cl

HCl

1

2

34

5

6

7

89

1011

12

XLII



werden mit 2,6 mL 4-Chlorbenzylamin (8 Äq., 21 mmol) für 30 min bei 190 °C durchmengt. Nach

Abfiltration des Hydrochloridsalzes wird mit Aceton und Isopropanol nachgewaschen.



Ausbeute: 32 %. 1H-NMR (D2O, Na+-Salz): δ = 4,04 (s, 2H, C(8)H2), 6,80 (s, 1H, C(5)H), 6,86 (d, 2×2H, 2×C(10)H

und 2×C(11)H), 6,91 (d, 1H, C(3)H, 3J = 5,2 Hz), 7,74 (d, 1H, C(2)H, 3J = 5,6 Hz). 13C-NMR (D2O, Na+-Salz): δ = 44,3 (C8), 105,4 (C5), 110,5 (C3), 128,2 (2×C10 und 2×C11),

131,8 (C12), 137,5 (C9), 137,9 (C4), 147,6 (C2), 158,6 (C6), 160,3 (C7).

MIR (ṽ): 1641 (s, νC=N) cm−1.


N-[4-(1H-Tetrazol-5-yl)pyridin-2-yl]ethan-1,2-diamin-Hydrochlorid (XLIII)



werden mit 1,8 mL Ethylen-1,2-diamin (10 Äq., 27 mmol) für 25 min bei 190 °C erhitzt. Das

Zielprodukt wird nach Abfiltration mit reichlich Methanol gewaschen.



Ausbeute: 62 %. 1H-NMR (D2O, Na+-Salz): δ = 2,79 (t, 2H, C(9)H2, 3J = 6,0 Hz), 3,21 (t, 2H, C(8)H2, 3J = 6,0 Hz),

6,89 (s, 1H, C(5)H), 6,99 (d, 1H, C(3)H, 3J = 5,6 Hz), 7,82 (d, 1H, C(2)H, 3J = 5,6 Hz). 13C-NMR (D2O, Na+-Salz): δ = 38,8 (C9), 39,0 (C8), 105,9 (C5), 110,6 (C3), 137,8 (C4), 146,8

(C2), 158,0 (C6), 160,0 (C7).

MIR (ṽ): 3428 (m, νN-H), 1643 (s, νC=N) cm−1.


N NH

N

NN

HN

NH2

1

2

34

5

6

7

8

9

XLIII

HCl



N-[4-(1H-Tetrazol-5-yl)pyridin-2-yl]propan-1,3-diamin-Hydrochlorid (XLIV)

Es werden 500 mg 2-Chlor-4-(1H-tetrazol-5-yl)pyridin (XXXV) (2,7 mmol) mit 2,2 mL Propan-

1,3-diamin (6 Äq., 16 mmol) im Rundkolben eingewogen und mit 0,5 mL Pyridin bei 135 °C für

10 h erhitzt. Anschließend wird das Pyridin im Teilvakuum entfernt, der Überstand mit Wasser

aufgenommen und so viel Salzsäure hinzugegeben bis ein pH-Wert von etwa 2 eingestellt ist.

Es erfolgt die Filtration des Präzipitats. Dieses wird in Ammoniak-Lösung gelöst und

anschließend erneut mit Salzsäure ausgefällt. Das Zielprodukt wird abfiltriert und mit Wasser

nachgewaschen.



Ausbeute: 52 %. 1H-NMR (D2O, Na+-Salz): δ = 1,70 (m, 2H, C(9)H2, 3J = 6,8 und 7,2 Hz), 2,87 (t, 2H, C(10)H2,

3J = 7,2 Hz), 3,00 (t, 2H, C(8)H2, 3J = 6,8 Hz), 6,72 (s, 1H, C(5)H), 6,89 (d, 1H, C(3)H, 3J = 5,2 Hz), 7,69 (d, 1H, C(2)H, 3J = 5,2 Hz). 13C-NMR (D2O, Na+-Salz): δ = 27,3 (C9), 37,4 (C10), 38,3 (C8), 105,5 (C5), 110,1 (C3), 137,5

(C4), 147,2 (C2), 158,7 (C6), 160,3 (C7).

MIR (ṽ): 3468 (m, νN-H), 1639 (s, νC=N) cm−1.


N-[4-(1H-Tetrazol-5-yl)pyridin-2-yl]butan-1,4-diamin-Hydrochlorid (XLV)

Butan-1,4-diamin (4,7 g, 20 Äq., 54 mmol) wird bei etwa 50 °C geschmolzen und mit 500 mg

2-Chlor-4-(1H-tetrazol-5-yl)pyridin (XXXV) (2,7 mmol) versetzt. Die Lösung wird für 48 h bei

100 °C gerührt. Anschließend erfolgt nach Abkühlen eine Verdünnung mit etwa 10 mL Wasser.



Durch Zugabe von Salzsäure wird das Zielprodukt ausgefällt und kann nach Abfilitration aus

einer Methanol-Lösung (MeOH/Wasser, 85:15, v/v) umkristallisiert werden.



Ausbeute: 23 %. 1H-NMR (D2O, Na+-Salz): δ = 1,27 (m, 4H, C(9)H2 und C(10)H2), 2,41 (t, 2H, C(11)H2,


(C3), 137,7 (C4), 147,6 (C2), 159,1 (C6), 160,6 (C7).

MIR (ṽ): 3207 (m, νN-H), 1626 (s, νC=N) cm−1.


2-{[4-(1H-Tetrazol-5-yl)pyridin-2-yl]amino}ethan-1-ol-Hydrochlorid (XLVI)

Für die Synthese werden 1,0 g 2-Chlor-4-(1H-tetrazol-5-yl)pyridin (XXXV) (5,4 mmol) in 8,0 mL

2-Aminoethan-1-ol (25 Äq., 135 mmol) gelöst und für 16 h bei 120 °C im Rundkolben erhitzt.

Nach Abkühlen wird mit 75 mL Wasser verdünnt und Salzsäure bis zur deutlich sauren Reaktion

hinzugegeben. Das gewünschte Produkt wird anschließend abfiltriert und aus Methanol

umkristallisiert.




6,86 (s, 1H, C(5)H), 6,94 (d, 1H, C(3)H, 3J = 5,2 Hz), 7,77 (d, 1H, C(2)H, 3J = 5,2 Hz). 13C-NMR (D2O, Na+-Salz): δ = 43,5 (C9), 60,2 (C8), 105,6 (C5), 110,3 (C3), 137,8 (C4), 147,4

(C2), 159,0 (C6), 160,4 (C7).

MIR (ṽ): 3177 (m, νO-H), 1620 (s, νC=N) cm−1.




3-{[4-(1H-Tetrazol-5-yl)pyridin-2-yl]amino}propan-1-ol-Hydrochlorid (XLVII)

Es werden 500 mg 2-Chlor-4-(1H-tetrazol-5-yl)pyridin (XXXV) (2,7 mmol) in 7,5 mL

3-Aminopropan-1-ol (37 Äq., 99 mmol) gelöst und zusammen für 48 h bei 120 °C erhitzt.

Anschließend erfolgt eine Verdünnung des Reaktionsansatzes mit 75 mL Wasser. Durch

Ansäuern mit Salzsäure wird das Hydrochloridsalz des Zielprodukts erhalten (Kristallisation

kann einige Tage in Anspruch nehmen). Das Endprodukt wird abfiltriert und aus methanolischer

Lösung (MeOH/Wasser, 85:15, v/v) umkristallisiert.

Beschaffenheit: Bräunlicher amorpher Feststoff.


Ausbeute: 26 %. 1H-NMR (D2O, Na+-Salz): δ = 1,63 (m, 2H, C(9)H2, 3J = 6,8 und 6,4 Hz), 3,03 (t, 2H, C(8)H2,


(C4), 147,4 (C2), 159,0 (C6), 160,4 (C7).

MIR (ṽ): 3194 (m, νO-H), 1624 (s, νC=N) cm−1.


1-[4-(1H-Tetrazol-5-yl)pyridin-2-yl]-4-methylpiperazin-Hydrochlorid (XLVIII)



werden mit 7,2 mL Methylpiperazin (24 Äq., 65 mmol) und 1,8 mL Pyridin (22 mmol) bei 220 °C

N N

N

NN

HN

N

HCl

1

2

34

5

6

7

8

9

10

XLVIII



für 30 min erhitzt. Die resultierende Lösung wird im Teilvakuum eingeengt. Der Überstand wird

anschließend in salzsaurem Methanol aufgenommen, wobei eine Suspension erhalten wird.

Das Zielprodukt kann aus dieser durch Filtration isoliert werden. Es erfolgt eine

säulenchromatographische Aufarbeitung des vom Lösungsmittel befreiten Filtrats (adsorbiert an

Kieselgur (aus ammoniakalischem MeOH), LM: EtOAc/MeOH/Ammoniak, 75:25:1, v/v/v). Das

Produkt wird mit Hilfe von Salzsäure in das Hydrochloridsalz überführt und abschließend mit

Methanol gewaschen.



Ausbeute: 23 %. 1H-NMR (D2O): δ = 2,97 (s, 3H, C(10)H3), 3,33 (t, 2×1H, 2×C(9)H2, 3J = 12,0 Hz), 3,66 (t, 2×1H,

2×C(8)H2, 3J = 12,0 Hz), 3,73 (d, 2×1H, 2×C(9)H2, 3J = 14,8 Hz), 4,33 (d, 2×1H, 2×C(8)H2, 3J = 14,8 Hz), 7,47 (d, 1H, C(3)H, 3J = 6,8 Hz), 7,77 (s, 1H, C(5)H), 8,04 (d, 1H, C(2)H, 3J = 6,8 Hz). 13C-NMR (D2O): δ = 43,0 (C10), 43,5 (2×C8), 52,0 (2×C9), 110,3 (C5), 111,8 (C3), 138,2 (C2),

141,0 (C4), 152,5 (C6), 156,6 (C7).

MIR (ṽ): 1611 (s, νC=N) cm−1.


2-{4-[4-(1H-Tetrazol-5-yl)pyridin-2-yl]piperazin-1-yl}ethan-1-ol-Hydrochlorid (XLIX)



werden mit 2 mL 1-(2-Hydroxyethyl)piperazin (6 Äq., 17 mmol) bei 220 °C für 45 min

durchmengt. Nach Ansäuern des Reaktionsansatzes mit Salzsäure wird dieser im Teilvakuum

eingeengt. Durch Zugabe von Methanol und kräftiges Durchmischen wird eine Suspension

erhalten, aus welcher durch Abfiltrieren das Rohprodukt gewonnen wird. Der resultierende

Feststoff wird chromatographisch gereinigt (adsorbiert an Kieselgur (aus Wasser),

LM: EtOAc/MeOH/Ammoniak, 70:30:1, v/v/v) und abschließend, nach Überführung in das

Hydrochloridsalz, mit Aceton und Ethanol gewaschen.





Ausbeute: 63 %. 1H-NMR (DMSO-d6): δ = 3,24 (s, 2×1H und 2H, 2×C(9)H2 und C(10)H2), 3,57 (m, 2×1H,

2×C(8)H2), 3,63 (d, 2×1H, 2×C(9)H2, 3J = 12,0 Hz), 3,83 (t, 2H, C(11)H2, 3J = 5,2 Hz), 4,56 (d,

2×1H, 2×C(8)H2, 3J = 13,6 Hz), 7,45 (d, 1H, C(3)H, 3J = 5,6 Hz), 7,98 (s, 1H, C(5)H), 8,34 (d,

1H, C(2)H, 3J = 5,6 Hz), 10,92 (s, 1H, N(12)H+). 13C-NMR (DMSO-d6): δ = 42,3 (2×C8), 50,6 (2×C9), 55,0 (C11), 57,8 (C10), 106,8 (C5), 110,8

(C3), 134,7 (C7), 146,3 (C2), 156,8 (C6).

MIR (ṽ): 3308 (m, νO-H), 1646 (s, νC=N) cm−1.


N-(3-Morpholinopropyl)-4-(1H-tetrazol-5-yl)pyridin-2-amin-Hydrochlorid (L)



werden mit 3,6 mL 3-Morpholinopropylamin (9 Äq., 24 mmol) für 1 h bei 190 °C erhitzt.

Anschließend wird mit 40 mL Ethanol verdünnt und mit Salzsäure angesäuert. Das Präzipitat

entspricht dem Zielprodukt und kann nach Abfiltrieren aus methanolischer Lösung

(MeOH/Wasser, 85:15, v/v) umkristallisiert werden.


Schmelzbereich: 250-251°C unter Zersetzung.

Ausbeute: 48 %. 1H-NMR (DMSO-d6): δ = 2,14 (t, 2H, C(9)H2, 3J = 7,6 Hz), 3,10 (s, 2×1H, 2×C(11)H2), 3,27 (t,

2H, C(10)H2, 3J = 7,6 Hz), 3,42 (s, 2×1H, 2×C(11)H2), 3,61 (s, 2H, C(8)H2), 3,92 (s, 2×2H,

2×C(12)H2), 7,46 (d, 1H, C(3)H, 3J = 6,4 Hz), 7,86 (s, 1H, C(5)H), 8,13 (d, 1H, C(2)H, 3J = 6,8 Hz), 9,49 (s, 1H, N(13)H), 11,31 (s, 1H, N(14)H+). 13C-NMR (DMSO-d6): δ = 22,2 (C9), 39,4 (C8), 51,1 (2×C11), 53,4 (C10), 63,1 (2×C12), 109,1

(C5), 110,6 (C3), 137,5 (C4), 138,2 (C2), 153,3 (C6), 155,3 (C7).



MIR (ṽ): 3523 (m, νN-H), 1626 (s, νC=N) cm−1.


2-Mercaptoisonicotinnitril (LII)

Es werden 500 mg (3,6 mmol) 2-Chlorisonicotinnitril (XXXIV) mit 410 mg (1,5 Äq., 5,4 mmol)

Thioharnstoff eingewogen und in 7,5 mL Ethanol gelöst. Der Ansatz wird bei 135 °C für 60 min

im Mikrowellenreaktor erhitzt und anschließend abgekühlt. Das Zielprodukt kristallisiert aus der

erkaltenden Reaktionslösung aus, wird anschließend filtriert und mit 50 mL Toluen in drei

Portionen gewaschen. Der Feststoff kann aus methanolischer Lösung (MeOH/Wasser, 90:10,

v/v) umkristallisiert werden.

Beschaffenheit: Intensiv gelbe wollige Nadeln.



C(2)H, 3J = 6,0 Hz), 14,04 (s, 1H, N(1)H). 13C-NMR (DMSO-d6): δ = 112,1 (C3), 116,2 (C4), 120,0 (C7), 137,6 (C5), 139,7 (C2), 178,4

(C6).

MIR (ṽ): 3147 (m, νN-H), 2236 (s, νC≡N) cm−1.

HRMS (ESI, m/z), berechnet [C6H4N2S − H] −: 136,0095; gefunden: 136,0096.

Anmerkung: Die Daten deuten darauf hin, dass es sich hierbei um das entsprechende Thioamid-

Tautomer handelt. Dafür sprechen der hohe Schmelzpunkt und vor allem die starke

Entschirmung des Signals des Schwefelatom-tragenden Kohlenstoffatoms im 13C-NMR-

Spektrum, welche für Carbonyl-Kohlenstoffatome charakteristisch ist.



2-(Benzylthio)isonicotinnitril (LIII)

2-Mercaptoisonicotinnitril (LII) (500 mg, 3,6 mmol) wird in 10 mL ACN gelöst. Dazu werden

620 µL Triethylamin (1,2 Äq., 4,5 mmol) pipettiert. Anschließend werden unter kräftigem Rühren

510 µL Benzylbromid (1,2 Äq., 4,3 mmol), welches in 5 mL ACN vorgelöst ist, hinzugegeben.

Nach mindestens 4 h Rühren bei Raumtemperatur wird der Ansatz im Teilvakuum eingeengt,

der Rückstand in Ethylacetat aufgenommen, filtriert und wieder eingeengt. Es folgt Waschen

mit Wasser und nach vollständiger Trocknung Umkristallisation aus n-Hexan.

Beschaffenheit: Farblose Nadeln.


Ausbeute: 46 %. 1H-NMR (DMSO-d6): δ = 4,46 (s, 2H, C(8)H2), 7,23-7,43 (m, 5H, 2×C(10)H und 2×C(11)H und

C(12)H), 7,55 (d, 1H, C(3)H, 3J = 5,2 Hz), 7,86 (s, 1H, C(5)H), 8,67 (d, 1H, C(2)H, 3J = 5,2 Hz). 13C-NMR (DMSO-d6): δ = 33,3 (C8), 116,4 (C4), 119,8 (C7), 121,0 (C5), 123,4 (C3), 127,2 (C12),

128,4-128,9 (2×C10 und 2×C11), 137,2 (C9), 150,4 (C2), 160,2 (C6).

MIR (ṽ): 2238 (s, νC≡N) cm−1.

2-(Benzylthio)-4-(1H-tetrazol-5-yl)pyridin (LIV)

Es werden 400 mg (1,7 mmol) 2-(Benzylthio)isonicotinnitril (LIII) mit 150 mg NaN3 (1,3 Äq.,

2,2 mmol) und 315 mg TEA∙HCl (1,3 Äq., 2,2 mmol) eingewogen und in 10 mL Toluen

suspendiert. Der Reaktionsansatz wird bei 100 °C für etwa 17 h mit aufgesetztem N2-Ballon

gerührt. Anschließend wird das Toluen im Teilvakuum entfernt. Der Überstand wird in

verdünnter Natronlauge aufgenommen und zwei Mal mit je 30 mL EtOAc gewaschen. Die

wässrige Phase wird dann mit Salzsäure auf einen pH-Wert von etwa 2 eingestellt, wobei das



Zielprodukt auskristallisiert. Anschließend erfolgt eine Aufreinigung mittels präparativer HPLC

(gelöst in MeOH/DMSO, 80:20, v/v; A: H2O und B: MeOH, Gradient, 0–7 min (B) 75 %, –9 min

(B) 100%, –15 min (B) 100 %, –16 min (B) 75%).



Ausbeute: 75 %. 1H-NMR (DMSO-d6): δ = 4,50 (s, 2H, C(8)H2), 7,23-7,45 (m, 5H, 2×C(10)H und 2×C(11)H und

C(14)H), 7,72 (d, 1H, C(3)H, 3J = 4,8 Hz), 7,88 (s, 1H, C(5)H), 8,70 (d, 1H, C(2)H, 3J = 4,8 Hz). 13C-NMR (DMSO-d6): δ = 33,4 (C8), 117,0 (C3), 118,3 (C5), 127,1 (C12), 128,4-128,9 (2×C10

und 2×C11), 132,6 (C4), 137,6 (C9), 150,6 (C2), 154,8 (C7), 159,7 (C6).

MIR (ṽ): 1607 (s, νC=N) cm−1.

HRMS (ESI, m/z), berechnet [C13H11N5S + H]+: 269,0735; gefunden: 269,0729.

N-⟨2-{[4-(1H-Tetrazol-5-yl)pyridin-2-yl]amino}ethyl⟩benzamid-Hydrochlorid (LVII)

Es werden 350 mg N-[4-(1H-Tetrazol-5-yl)pyridin-2-yl]ethan-1,2-diamin-Hydrochlorid (XLIII)

(1,5 mmol) und 220 μL Benzoylchlorid (1,2 Äq., 1,9 mmol) unter Eiskühlung in 2 mol/L

Natronlauge gelöst und in der Kälte gerührt. Nach 3 h werden weitere 40 μL Benzoylchlorid

(0,2 Äq.) hinzugegeben. Die Reaktionslösung wird für insgesamt 24 h bei Raumtemperatur

gerührt. Anschließend erfolgt die Zugabe von Salzsäure bis zur sauren Reaktion und wenigen

mL Ethylacetat. Das ausgefallene Hydrochloridsalz wird abfiltriert und abschließend mit

Ethylacetat, Methanol und Aceton gewaschen.



Ausbeute: 53 %. 1H-NMR (D2O, Na+-Salz): δ = 3,37 (m, 4H, C(8)H2 und C(9)H2), 6,89-6,90 (s, 2H, C(5)H und

C(3)H), 7,13 (m, 2H, 2×C(11)H), 7,27 (t, 1H, C(13)H, 3J = 7,6 Hz), 7,33 (d, 2H, 2×C(12)H, 3J = 7,6 Hz), 7,77 (d, 1H, C(2)H, 3J = 6,0 Hz).



13C-NMR (D2O, Na+-Salz): δ = 40,2 (C8), 40,7 (C9), 105,33 (C5), 110,3 (C3), 126,7 (2×C12),

128,3 (2×C11), 131,8 (C13), 133,1 (C10), 138,0 (C4), 147,6 (C2), 159,2 (C6), 160,3 (C7), 170,8

(C14).

MIR (ṽ): 3317 (m, vN-H), 1659 (s, vC=O), 1625 (s, νC=N) cm−1.


N-⟨2-{[4-(1H-Tetrazol-5-yl)pyridin-2-yl]amino}ethyl⟩buttersäureamid-Hydrochlorid (LVIII)

N-[4-(1H-Tetrazol-5-yl)pyridin-2-yl]ethan-1,2-diamin-Hydrochlorid (XLIII) (500 mg, 2,1 mmol)

wird unter Eiskühlung in 2 mol/L Natronlauge gelöst. Anschließend werden 250 μL Butyrylchlorid

(1,1 Äq., 2,3 mmol) in die weiterhin gut gekühlte Lösung hinzugetropft. Die Reaktion findet bei

Raumtemperatur für weitere 7 h statt. Danach werden erneut 120 μL Butyrylchlorid (0,5 Äq.)

hinzugegeben. Nachdem der Ansatz insgesamt 21 h reagieren konnte, wird konzentrierte

Salzsäure bis zur sauren Reaktion ergänzt. Die Kristallisationsdauer des Hydrochloridsalzes

kann bis zu 3 Wochen im Kühlschrank betragen. Das Präzipitat wird abfiltriert und mit

Ethylacetat gewaschen.



Ausbeute: 6 %. 1H-NMR (D2O, Na+-Salz): δ = 0,53 (t, 3H, C(12)H3, 3J = 7,2 Hz), 1,22 (q, 2H, C(11)H2,

3J = 7,2 und 7,6 Hz), 1,87 (t, 2H, C(10)H2, 3J = 7,6 Hz), 3,15 (s, 4H, C(8)H2 und C(9)H2), 6,81

(s, 1H, C(5)H), 6,89 (d, 1H, C(3)H, 3J = 5,2 Hz), 7,73 (d, 1H, C(2)H, 3J = 5,2 Hz). 13C-NMR (D2O, Na+-Salz): δ = 12,6 (C12), 18,7 (C11), 37,6 (C10), 38,9 (C9), 40,6 (C8), 105,3

(C5), 110,3 (C3), 137,9 (C4), 147,6 (C2), 159,0 (C6), 160,5 (C7), 177,2 (C13).

MIR (ṽ): 1672 (s, vC=O), 1625 (s, νC=N) cm−1.




N-⟨2-{[4-(1H-Tetrazol-5-yl)pyridin-2-yl]amino}ethyl⟩methansulfonamid-Hydrochlorid (LIX)


(2,1 mmol) unter Eiskühlung in 2 mol/L Natronlauge gelöst und anschließend mit 220 μL

Methansulfonylchlorid (1,4 Äq., 2,9 mmol) in 5 mL 2 mol/L Natronlauge versetzt. Der

Reaktionsansatz wird für 2 h in der Kälte und 4 h bei Raumtemperatur gerührt. Danach werden

erneut 315 µL Methansulfonylchlorid (2,0 Äq.) zugetropft und für weitere 24 h bei

Raumtemperatur gerührt. Durch Ansäuern mit Salzsäure erfolgt die Kristallisation des

Hydrochloridsalzes, welches erst abfiltriert, dann mit einem Wasser-Methanol-Gemisch

(Wasser/MeOH, 80:20, v/v) gewaschen und abschließend aus Wasser umkristallisiert wird.



Ausbeute: 15 %. 1H-NMR (D2O, Na+-Salz): δ = 2,66 (s, 3H, C(10)H3), 3,01 (t, 2H, C(8)H2, 3J = 6,4 Hz), 3,24 (t,

2H, C(9)H2, 3J = 6,4 Hz), 7,01 (s, 1H, C(5)H), 7,06 (d, 1H, C(3)H, 3J = 5,6 Hz), 7,91 (d, 1H,

C(2)H, 3J = 5,6 Hz). 13C-NMR (D2O, Na+-Salz): δ = 38,0 (C10), 43,5 (C8), 44,0 (C9), 105,6 (C5), 110,3 (C3), 138,0

(C4), 147,8 (C2), 159,2 (C6), 160,6 (C7).

MIR (ṽ): 3238 (m, vN-H), 1637 (s, νC=N) cm−1.

HRMS (ESI, m/z), berechnet [C9H13N7O2S + H]+: 283,0851; gefunden: 283,0846.

Ethyl-⟨2-{[4-(1H-tetrazol-5-yl)pyridin-2-yl]amino}ethyl⟩carbamat-Hydrochlorid (LX)


(0,9 mmol) in 20 mL ACN suspendiert und mit 2 mL Natronlauge (2 mol/L) versetzt. Bei



Raumtemperatur werden 120 μL und nach 1 h erneut 50 μL Chlorameisensäureethylester

(zusammen 2,0 Äq., 1,8 mmol) hinzugegeben. Nach insgesamt 2 h wird der Reaktionsansatz

mit konzentrierter Salzsäure angesäuert, der ausfallende Feststoff abfiltriert und verworfen. Das

Filtrat wird im Teilvakuum eingeengt und der Überstand aus wässrigem Methanol

(MeOH/Wasser, 90:10, v/v) umkristallisiert.



Ausbeute: 56 %. 1H-NMR (DMSO-d6): δ = 1,12 (t, 3H, C(11)H3, 3J = 7,2 Hz), 3,29 (q, 2H, C(8)H2, 3J = 6,0 Hz),

3,53 (d, 2H, C(9)H2, 3J = 5,2 Hz), 3,98 (q, 2H, C(10)H2, 3J = 7,2 Hz), 7,26 (t, 1H, N(13)H, 3J = 5,2 Hz), 7,40 (d, 1H, C(3)H, 3J = 6,4 Hz), 7,73 (s, 1H, C(5)H), 8,12 (d, 1H, C(2)H, 3J = 6,4 Hz), 9,00 (s, 1H, N(12)H). 13C-NMR (DMSO-d6): δ = 14,6 (C11), 39,0 (C9), 41,8 (C8), 59,8 (C10), 109,0 (C5), 110,1 (C3),

137,4 (C4), 138,9 (C2), 153,9 (C6), 155,5 (C7), 156,4 (C14).



N-⟨3-{[4-(1H-Tetrazol-5-yl)pyridin-2-yl]amino}propyl⟩acetamid-Hydrochlorid (LXI)

Es werden 200 mg N-[4-(1H-Tetrazol-5-yl)pyridin-2-yl]propan-1,3-diamin-Hydrochlorid (XLIV)

(0,8 mmol) in 20 mL ACN suspendiert. Zur Suspension werden 2 mL verdünnte Natronlauge

(2 mol/L) hinzugegeben, anschließend 110 μL Acetylchlorid (2,0 Äq., 1,6 mmol) ergänzt. Nach

3 h werden erneut 65 µL Acetylchlorid (1,2 Äq.) hinzugegeben, nach weiteren 3 h werden

nochmals 2 mL verdünnte Natronlauge und 65 µL Acetylchlorid addiert. Nach insgesamt 24 h

wird das Reaktionsgemisch im Teilvakuum eingeengt und der Überstand chromatographisch

aufgearbeitet (adsorbiert an Kieselgur (aus ammoniakalischem Methanol), LM:

EtOAc/Aceton/MeOH/Ammoniak, 60:20:20:1, v/v/v/v). Die Produktfraktionen werden mit

Salzsäure in ihr Hydrochloridsalz überführt und aus Methanol umkristallisiert.


N NH

N

NN

HN

NH

O

HCl

1

2

34

5

6

7

8

9

10

1112

LXI




Ausbeute: 31 %. 1H-NMR (D2O, Na+-Salz): δ = 1,56 (t, 2H, C(9)H2, 3J = 6,8 Hz), 1,82 (s, 3H, C(11)H3), 3,01 (t,

2H, C(10)H2, 3J = 7,2 Hz), 3,06 (t, 2H, C(8)H2, 3J = 6,8 Hz), 6,84 (s, 1H, C(5)H), 6,95 (d, 1H,

C(3)H, 3J = 5,6 Hz), 7,77 (d, 1H, C(2)H, 3J = 5,6 Hz). 13C-NMR (D2O, Na+-Salz): δ = 21,8 (C11), 27,8 (C9), 37,2 (C10), 39,0 (C8), 105,4 (C5), 110,1

(C3), 137,8 (C4), 147,6 (C2), 159,0 (C6), 160,5 (C7), 173,9 (C12).

MIR (ṽ): 1666 (m, vC=O), 1620 (s, νC=N) cm−1.

N-⟨3-{[4-(1H-Tetrazol-5-yl)pyridin-2-yl]amino}propyl⟩pivalinamid-Hydrochlorid (LXII)

N-[4-(1H-Tetrazol-5-yl)pyridin-2-yl]propan-1,3-diamin-Hydrochlorid (XLIV) (250 mg, 1,0 mmol)

wird in 20 mL ACN suspendiert, bevor 3 mL verdünnte Natronlauge (2 mol/L) hinzugegeben

werden. Im Anschluss werden 145 μL Pivalinsäurechlorid (1,2 Äq., 1,2 mmol) zugetropft und die

Reaktion für 4 h bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wird mit Salzsäure

versetzt und für 72 h im Kühlschrank zur Kristallisation belassen. Die Umkristallisation des

ausgefallenen Hydrochloridsalzes erfolgt aus wässrigem Methanol (MeOH/Wasser, 90:10, v/v).



Ausbeute: 27 %. 1H-NMR (D2O, Na+-Salz): δ = 0,71 (s, 9H, C12(H)3 und C(13)H3 und C(14)H3), 1,33 (m, 2H,

C(9)H2, 3J = 6,4 und 6,8 Hz), 2,78 (t, 2H, C(8)H2, 3J = 6,8 Hz), 2,84 (t, 2H, C(10)H2, 3J = 6,8 Hz),

6,64 (s, 1H, C(5)H), 6,74 (d, 1H, C(3)H, 3J = 5,2 Hz), 7,55 (d, 1H, C(2)H, 3J = 5,6 Hz). 13C-NMR (D2O, Na+-Salz): δ = 26,4 (C12 und C13 und C14), 27,9 (C9), 37,0 (C10), 38,1 (C11),

38,9 (C8), 105,2 (C5), 109,9 (C3), 137,7 (C4), 147,5 (C2), 158,8 (C6), 160,3 (C7), 181,9 (C15).

MIR (ṽ): 1657 (m, vC=O), 1625 (s, νC=N) cm−1.




N-⟨3-{[4-(1H-Tetrazol-5-yl)pyridin-2-yl]amino}propyl⟩-4-methoxybenzamid-Hydrochlorid

(LXIII)


(2,0 mmol) in 15 mL ACN suspendiert und mit 4 mL verdünnter Natronlauge (2 mol/L) versetzt.

Dann werden 470 mg 4-Methoxybenzoylchlorid (1,5 Äq., 3,0 mmol) in 15 mL Tetrahydrofuran

gelöst und zur ersten Lösung hinzugetropft. Der Ansatz rührt für etwa 3,5 h bei Raumtemperatur.

Die ACN/THF-Phase wird abgenommen, mit verdünnter Salzsäure angesäuert und am

Rotationsverdampfer eingeengt. Abschließend erfolgt eine säulenchromatographische

Aufarbeitung (adsorbiert an Kieselgur (aus wässriger Ammoniaklösung), LM:

EtOAc/MeOH/Ammoniak, 75:25:1, v/v/v), die Überführung in das Hydrochloridsalz und

Waschen mit Ethylacetat und Ethanol.




3,10 (t, 2H, C(10)H2, 3J = 6,4 Hz), 3,34 (s, 3H, C(15)H3), 6,33 (d, 2H, 2×C(13)H, 3J = 8,4 Hz),

6,58 (s, 1H, C(5)H), 6,74 (d, 1H, C(3)H, 3J = 5,6 Hz), 7,13 (d, 2H, 2×C(12)H, 3J = 8,8 Hz), 7,61

(d, 1H, C(2)H, 3J = 5,6 Hz). 13C-NMR (D2O, Na+-Salz): δ = 27,5 (C9), 37,9 (C10), 39,3 (C8), 55,0 (C15), 105,6 (C5), 109,8

(C3), 113,3 (2×C13), 125,3 (C11), 128,4 (2×C12), 137,5 (C4), 147,2 (C2), 158,7 (C6), 160,1

(C7), 161,3 (C14), 169,1 (C16).

MIR (ṽ): 1661 (m, vC=O), 1620 (s, νC=N) cm−1.




N-⟨3-{[4-(1H-Tetrazol-5-yl)pyridin-2-yl]amino}propyl⟩-4-brombenzamid-Hydrochlorid

(LXIV)

N-[4-(1H-Tetrazol-5-yl)pyridin-2-yl]propan-1,3-diamin-Hydrochlorid (XLIV) (400 mg, 1,6 mmol)

wird in 15 mL Tetrahydrofuran suspendiert und mit 3 mL verdünnter Natronlauge (2 mol/L)

versetzt. Dann werden 525 mg 4-Brombenzoylchlorid (1,5 Äq., 2,4 mmol), gelöst in 10 mL

Tetrahydrofuran, und weitere 2 mL verdünnte Natronlauge hinzugegeben. Nach 2,5 h Rühren

bei Raumtemperatur wird die organische Phase abgenommen, mit konzentrierter Salzsäure

versetzt und am Rotationsverdampfer eingeengt. Der Überstand wird chromatographisch

aufgereinigt (adsorbiert an Kieselgur (aus ammoniakalischem Methanol), LM:

EtOAc/MeOH/Ammoniak, 85:15:1, v/v/v). Nach Überführen in das Hydrochloridsalz erfolgt

abschließend ein Waschgang mit Ethanol und Diethylether.



Ausbeute: 82 %. 1H-NMR (DMSO-d6): δ = 1,90 (t, 2H, C(9)H2, 3J = 6,8 Hz), 3,38 (d, 2H, C(10)H2, 3J = 6,4 Hz),

3,43 (d, 2H, C(8)H2, 3J = 6,4 Hz), 7,35 (d, 1H, C(3)H, 3J = 6,4 Hz), 7,65 (s, 1H, C(5)H), 7,66 (d,

2H, 2×C(13)H, 3J = 8,8 Hz), 7,84 (d, 2H, 2×C(12)H, 3J = 8,4 Hz), 8,11 (d, 1H, C(2)H, 3J = 6,4 Hz),

8,71 (t, 1H, N(17)H, 3J = 5,6 Hz), 8,84 (s, 1H, N(16)H). 13C-NMR (DMSO-d6): δ = 27,9 (C9), 36,8 (C10), 38,9 (C8), 108,8 (C3), 109,0 (C5), 124,8 (C14),

129,3 (2×C12), 131,2 (2×C13), 133,5 (C11), 137,2 (C4), 139,7 (C2), 154,2 (C6), 155,7 (C7),

165,4 (C15).

MIR (ṽ): 1660 (s, vC=O), 1621 (s, νC=N) cm−1.

HRMS (ESI, m/z), berechnet [C16H16N7OBr + H]+: 401,0600; gefunden: 401,0580.



N-⟨3-{[4-(1H-Tetrazol-5-yl)pyridin-2-yl]amino}propyl⟩-4-methylbenzensulfonamid-

Hydrochlorid (LXV)

Für die Synthese werden 500 mg N-[4-(1H-Tetrazol-5-yl)pyridin-2-yl]propan-1,3-diamin-

Hydrochlorid (XLIV) (2,0 mmol) in 20 mL ACN suspendiert und 4 mL verdünnte Natronlauge

(2 mol/L) hinzugegeben. 570 mg para-Toluolsulfonsäurechlorid (1,5 Äq., 3,0 mmol) werden

ebenfalls in 20 mL ACN gelöst und in kleinen Portionen der ersten Lösung hinzugetropft. Nach

30 min Reaktionszeit bei Raumtemperatur wird der Reaktionsansatz mit Salzsäure angesäuert

und anschließend am Rotationsverdampfer eingeengt. Der Überstand wird in sehr wenig

Wasser aufgeschlämmt, abfiltriert und mit Ethylacetat gewaschen. Die abschließende

Aufreinigung erfolgt mit Hilfe der präparativen HPLC (gelöst in ammoniakalischem MeOH/H2O,

50:50, v/v; A: H2O und B: ACN, isokratisch, 45 % B).



Ausbeute: 17 %. 1H-NMR (D2O, Na+-Salz): δ = 1,49 (t, 2H, C(9)H2, 3J = 6,4 Hz), 1,78 (s, 3H, C(15)H3), 2,69 (t,

2H, C(10)H2, 3J = 6,8 Hz), 2,95 (t, 2H, C(8)H2, 3J = 6,0 Hz), 6,68 (s, 1H, C(5)H), 6,78 (d, 2H,

2×C(13)H, 3J = 8,0 Hz), 7,00 (d, 1H, C(3)H, 3J = 5,6 Hz), 7,32 (d, 2H, 2×C(12)H, 3J = 8,0 Hz),

7,79 (d, 1H, C(2)H, 3J = 5,6 Hz). 13C-NMR (D2O, Na+-Salz): δ = 20,1 (C15), 29,9 (C9), 38,9 (C8), 42,1 (C10), 105,7 (C5), 109,9

(C3), 126,1 (2×C12), 128,9 (2×C13), 137,6 (C4), 139,3 (C11), 141,6 (C14), 147,4 (C2), 159,0

(C7), 160,6 (C6).

MIR (ṽ): 1639 (s, νC=N) cm−1.


N NH

N

NN

HN

NH

S

1

2

34

5

6

7

8

9

10 12

1113

14

15LXV

O O

HCl



Isobutyl-⟨3-{[4-(1H-tetrazol-5-yl)pyridin-2-yl]amino}propyl⟩carbamat-Hydrochlorid (LXVI)


(1,4 mmol) in 20 mL ACN suspendiert und 3 mL verdünnte Natronlauge (2 mol/L) hinzugegeben.

Anschließend werden 290 μL Isobutylchlorformiat (1,6 Äq., 2,2 mmol) addiert und bei

Raumtemperatur gerührt. Nach 1 h werden weitere 200 μL (0,7 Äq., 1,0 mmol) ergänzt.

Insgesamt rührt die Reaktionslösung 2 h, wird mit Salzsäure versetzt und am

Rotationsverdampfer eingeengt. Der zurückbleibende Feststoff wird aus einer Isopropanol-

Methanol-Mischung (IPA/MeOH, 50:50, v/v) umkristallisiert, wobei der in der Siedehitze nicht

lösliche Überstand abfiltriert und verworfen wird. Aus dem Filtrat kristallisiert beim Abkühlen das

Zielprodukt aus.



Ausbeute: 33 %. 1H-NMR (DMSO-d6): δ = 0,87 (d, 6H, C(13)H3 und C(14)H3, 3J = 6,8 Hz), 1,72 (m, 2H, C(9)H2,

3J = 6,8 Hz), 1,82 (m, 1H, C(12)H, 3J = 6,8 Hz), 3,09 (q, 2H, C(10)H2, 3J = 6,4 Hz), 3,31 (d, 2H,

C(8)H2, 3J = 6,8 Hz), 3,72 (d, 2H, C(11)H2, 3J = 6,8 Hz), 7,14 (d, 1H, C(3)H, 3J = 5,6 Hz), 7,15

(s, 1H, N(16)H), 7,26 (s, 1H, C(5)H), 7,48 (s, 1H, N(15)H), 8,09 (d, 1H, C(2)H, 3J = 6,0 Hz). 13C-NMR (DMSO-d6): δ = 18,9 (C13 und C14), 27,6 (C12), 28,9 (C9), 38,0 (C10), 38,7 (C8),

69,7 (C11), 105,8 (C5), 108,7 (C3), 135,9 (C4), 145,2 (C2), 156,0 (C7), 156,5 (C17), 157,4 (C6).

MIR (ṽ): 1685 (s, vC=O), 1665 (s, νC=N) cm−1.


Benzyl-⟨3-{[4-(1H-tetrazol-5-yl)pyridin-2-yl]amino}propyl⟩carbamat-Hydrochlorid (LXVII)




(1,6 mmol) in 15 mL ACN suspendiert und mit 4 mL verdünnter Natronlauge (2 mol/L) versetzt.

Anschließend werden 315 μL Chlorameisensäurebenzylester (1,4 Äq., 2,2 mmol)

hinzugegeben. Nach 22 h bei Raumtemperatur wird Salzsäure addiert und am

Rotationsverdampfer eingeengt. Der Überstand wird aus Ethanol umkristallisiert (Heißfiltration).

Abschließend erfolgt die Aufreinigung mit Hilfe der präparativen HPLC (gelöst in MeOH/DMSO,

90:10, v/v; A: H2O und B: MeOH, Gradient, 0–2 min (B) 35 %, –5 min (B) 60 %, –6 min (B) 100

%, –14 min (B) 100 %, –14,5 min (B) 35 %, –20min (B) 35 %).



Ausbeute: 39 %. 1H-NMR (DMSO-d6): δ = 1,73 (m, 2H, C(9)H2, 3J = 6,8 Hz), 3,12 (d, 2H, C(10)H2, 3J = 6,8 Hz),

3,32 (d, 2H, C(8)H2, 3J = 6,8 Hz), 5,02 (s, 2H, C(11)H2), 7,14 (d, 1H, C(3)H, 3J = 5,6 Hz), 7,26

(s, 1H, C(5)H), 7,35 (m, 5H, 2×C(13)H und 2×C14H und C15H), 7,46 (s, 2×1H, N(17)H und

N(16)H), 8,09 (d, 1H, C(2)H, 3J = 5,6 Hz). 13C-NMR (DMSO-d6): δ = 28,9 (C9), 38,2 (C10), 38,7 (C8), 65,2 (C11), 105,8 (C5), 108,7 (C3),

127,7-128,3 (2×C13 und 2×C14 und C15), 135,8 (C4), 137,2 (C12), 145,3 (C2), 156,0 (C7),

156,2 (C18), 157,5 (C6).

MIR (ṽ): 1684 (s, vC=O), 1661 (s, νC=N) cm−1.


2-{[4-(1H-Tetrazol-5-yl)pyridin-2-yl]amino}ethylbenzoat-Hydrochlorid (LXVIII)

Für die Synthese werden 500 mg 2-{[4-(1H-Tetrazol-5-yl)pyridin-2-yl]amino}ethan-1-ol-

Hydrochlorid (XLVI) (2,1 mmol) in 2 mol/L Kalilauge gelöst und anschließend mit 1 mL in

Kalilauge verdünntem Benzoylchlorid (4,0 Äq., 8,4 mmol) versetzt. Der Ansatz wird bei

Raumtemperatur über Nacht gerührt. Durch Ansäuern mit Salzsäure wird das Hydrochloridsalz

ausgefällt, anschließend abfiltriert und mit Toluen gewaschen. Die abschließende

Umkristallisation erfolgt aus Methanol.

N NH

N

NN

HN

O

O1

2

34

5

6

7

8

9

10

1112

13

14

LXVIII

HCl




Schmelzbereich: ab 198 °C unter Zersetzung.


6,94 (s, 1H, C(5)H), 7,01 (d, 1H, C(3)H, 3J = 5,2 Hz), 7,36 (t, 2H, 2×C(12)H, 3J = 5,6 Hz), 7,41

(t, 1H, C(13)H, 3J = 6,0 Hz), 7,76 (d, 2H, 2×C(11)H, 3J = 6,0 Hz) 7,84 (d, 1H, C(2)H, 3J = 5,6 Hz). 13C-NMR (D2O, Na+-Salz): δ = 43,5 (C8), 60,3 (C9), 105,7 (C5), 110,3 (C3), 128,3 (2×C12),

128,8 (2×C11), 131,2 (C13), 136,2 (C10), 137,9 (C4), 147,5 (C2), 159,1 (C6), 160,5 (C7), 175,7

(C14).

MIR (ṽ): 1715 (s, vC=O), 1624 (s, νC=N) cm−1.


4-Cyanpicolinsäureethylester (LXXIII)

Für die Synthese werden 3,1 g Isonicotinnitril (30 mmol) (LXXII) zusammen mit 25 g

FeSO4∙7H2O (90 mmol) in ein hohes Becherglas eingewogen. Dazu werden 150 mL

Dichlormethan gegeben und unter Kühlung (–5 °C, NaCl/Eis) gerührt. Der Suspension werden

weiterhin 9 g H2SO4 (90 mmol) und 24 g Wasser hinzugefügt. In einem zweiten Gefäß erfolgt

die Vermengung von 16 g Ethylpyruvat (135 mmol) mit 10 g H2O2 (90 mmol, 30%ig in Wasser),

welches langsam und ebenfalls unter Eiskühlung (–5 °C, NaCl/Eis) hinzugegeben wird. Die

letztere Lösung wird dann der ersten unter kräftigem Rühren hinzugetropft und nach kompletter

Zugabe für etwa 15 min unter weiterer Eiskühlung gerührt. Anschließend wird der

Reaktionsansatz in Eiswasser gegossen, die Phasen getrennt und noch zwei Mal mit je 150 mL

Dichlormethan extrahiert. Nach Trocknen über Na2SO4 und Einengen der vereinigten

organischen Phasen im Teilvakuum wird eine zähe gelbe Masse erhalten, welche über Nacht

im Laborabzug kristallisiert. Es erfolgen abschließend 2-3 Waschgänge mit –21 °C kaltem

Diethylether. Der Feststoff wird dadurch entfärbt, die Waschlösung ist zu verwerfen.



Ausbeute: 53 %.



1H-NMR (CDCl3): δ = 1,47 (t, 3H, C(9)H3, 3J = 7,2 Hz), 4,52 (q, 2H, C(8)H2, 3J = 7,2 Hz), 7,72

(d, 1H, C(3)H, 3J = 4,8 Hz), 8,35 (s, 1H, C(5)H), 8,96 (d, 1H, C(2)H, 3J = 4,8 Hz). 13C-NMR (CDCl3): δ = 14,4 (C9), 62,9 (C8), 115,8 (C7), 122,0 (C4), 126,9 (C5), 128,2 (C3),

149,8 (C6), 151,0 (C2), 163,7 (C10).

MIR (ṽ): 2241 (w, νC≡N), 1715 (s, vC=O), cm−1.

4-(1H-Tetrazol-5-yl)picolinsäureethylester (LXXIV)

Es werden 3,0 g 4-Cyanpicolinsäureethylester (LXXIII) (17 mmol) in 50 mL Toluen gelöst.

Anschließend werden 1,4 g NaN3 (1,3 Äq., 22 mmol) und 3,0 g TEA∙HCl (1,3 Äq., 22 mmol)

hinzugegeben und der Reaktionsansatz für etwa 16 h bei 110 °C gerührt. Der Reaktionsansatz

wird im Teilvakuum eingeengt und mit so viel wässriger Natronlauge versetzt, bis ein pH-Wert

von etwa 12 eingestellt ist. Die wässrige Phase wird dreimal mit 50 mL Ethylacetat gewaschen

und anschließend mit konzentrierter Salzsäure angesäuert, wodurch 4-(1H-Tetrazol-5-

yl)picolinsäureethylester ausgefällt wird. Nach Abfiltration erfolgt Waschen mit Isopropanol.



Ausbeute: 88 %. 1H-NMR (DMSO-d6): δ = 1,38 (t, 3H, C(9)H3, 3J = 7,2 Hz), 4,42 (q, 2H, C(8)H2, 3J = 7,2 Hz), 8,24

(d, 1H, C(3)H, 3J = 4,8 Hz), 8,64 (s, 1H, C(5)H), 8,96 (d, 1H, C(2)H, 3J = 5,2 Hz). 13C-NMR (DMSO-d6): δ = 14,8 (C9), 61,6 (C8), 121,6 (C5), 124,0 (C3), 133,5 (C4), 148,9 (C6),

151,1 (C2), 155,0 (C7), 164,1 (C10).

IR (ṽ): 1724 (s, vC=O), 1610 (s, νC=N) cm−1.


N

N

NN

HN

O

O

1

2

34

5

6

7

8

910

LXXIV



4-(1H-Tetrazol-5-yl)picolinsäure (LXXV)

4-(1H-Tetrazol-5-yl)picolinsäureethylester (LXXIV) (500 mg, 2,3 mmol) wird in 10 mL Methanol

suspendiert. Dazu werden 365 mg Natriumhydroxid (4,0 Äq., 9,2 mmol), gelöst in 10 mL

Wasser, addiert und anschließend unter Rückfluss für 3 h erhitzt. Durch Ansäuern mit Salzsäure

fällt das Zielprodukt aus der Lösung aus und wird nach Abfiltrieren mit wässrigem Methanol

(MeOH/Wasser, 50:50, v/v) gewaschen.




C(2)H, 3J = 4,8 Hz). 13C-NMR (DMSO-d6): δ = 121,6 (C5), 123,7 (C3), 133,5 (C4), 149,7 (C6), 150,9 (C2), 155,0

(C7), 165,6 (C8).

MIR (ṽ): 3352 (m, vO-H), 1722 (m, vC=O), 1630 (s, νC=N) cm−1.


N-(4-Chlorbenzyl)-4-(1H-tetrazol-5-yl)picolinamid (LXXVI)

Es werden 470 mg 4-(1H-Tetrazol-5-yl)picolinsäureethylester (LXXIV) (2,1 mmol) mit 10 mL

Ethanol und 2,6 mL 4-Chlorbenzylamin (10 Äq., 21 mmol) versetzt. Der Reaktionsansatz wird

im Mikrowellenreaktor bei 175 °C für 30 min erhitzt. Nach Abkühlen der Lösung wird mit

Salzsäure angesäuert und anschließend abfiltriert. Durch Waschen mit 3×10 mL Ethanol wird

überschüssiges 4-Chlorbenzylamin∙HCl aus dem Überstand entfernt. Die Umkristallisation (zwei



Mal) des Filterkuchens erfolgt abschließend aus wässrigem Ethanol (EtOH/Wasser, 75:25, v/v)

(Heißfiltration in Siedehitze wegen nicht lösbaren Produkten notwendig).



Ausbeute: 36 %. 1H-NMR (DMSO-d6): δ = 4,53 (d, 2H, C(8)H2, 3J = 6,4 Hz), 7,38 (s, 4H, 2×C(10)H und 2×C(11)H),

8,23 (d, 1H, C(3)H, 3J = 5,2 Hz), 8,67 (s, 1H, C(5)H), 8,91 (d, 1H, C(2)H, 3J = 4,8 Hz), 9,57 (t,

1H, N(14)H, 3J = 6,4 Hz). 13C-NMR (DMSO-d6): δ = 41,9 (C8), 119,0 (C5), 123,4 (C3), 128,2 (2×C11), 129,2 (2×C10),

131,3 (C12), 133,7 (C4), 138,4 (C9), 149,9 (C2), 151,2 (C6), 155,0 (C7), 163,4 (C13).

MIR (ṽ): 3357(s, vN-H), 1649 (s, vC=O), 1614 (s, νC=N) cm−1.

HRMS (ESI, m/z), berechnet [C14H11N6OCl − H]−: 314,0683; gefunden: 314,0672.

N-(3-Morpholinopropyl)-4-(1H-tetrazol-5-yl)picolinamid-Hydrochlorid (LXXVII)

Die Synthese erfolgt analog zu N-(4-Chlorbenzyl)-4-(1H-tetrazol-5-yl)picolinamid (LXXVI) mit

folgenden Änderungen: 915 mg 4-(1H-Tetrazol-5-yl)picolinsäureethylester (LXXIV) (4,1 mmol)

werden mit 3,0 mL 3-Morpholinopropylamin (5,0 Äq., 20,5 mmol) und 15 mL Ethanol im

Mikrowellenreaktor für 45 min bei 165 °C erhitzt. Der Ansatz wird nach Abkühlen auf insgesamt

80 mL Ethanol Gesamtvolumen verdünnt und mit Salzsäure sauer eingestellt. Die

anschließende Fällung aus Ethanol findet bei –21 °C für etwa eine Stunde statt. Nach

Abfiltrieren erfolgt zweimaliges Umkristallisieren aus Ethanol. Das so erhaltene Produkt wird

abschließend mit reichlich Toluen, Tetrahydrofuran und Aceton gewaschen.



Ausbeute: 18 %. 1H-NMR (DMSO-d6): δ = 2,30 (m, 2H, C(9)H2, 3J = 8,0 Hz), 3,06 (s, 2×1H, 2×C(11)H2), 3,14 (m,

2H, C(10)H2, 3J = 8,0 Hz), 3,43 (m, 2H und 2×1H, C(8)H2 und 2×C(11)H2), 3,85 (2×s, 2×2H,



2×C(12)H2), 8,27 (d, 1H, C(3)H, 3J = 4,8 Hz), 8,67 (s, 1H, C(5)H), 8,88 (d, 1H, C(2)H, 3J = 5,2 Hz), 9,16 (t, 1H, N(14)H, 3J = 6,4 Hz), 10,98 (s, 1H, N(15)H+). 13C-NMR (DMSO-d6): δ = 23,4 (C9), 36,3 (C8), 50,9 (2×C11), 53,9 (C10), 63,2 (2×C12), 118,9

(C5), 123,3 (C3), 133,9 (C4), 149,8 (C2), 151,1 (C6), 155,1 (C7), 163,5 (C13).

MIR (ṽ): 3344 (s, vN-H), 1644 (s, vC=O), 1613 (s, νC=N) cm−1.


N-(4-Fluorphenylethyl)-4-(1H-tetrazol-5-yl)picolinamid (LXXVIII)


folgenden Änderungen: 1,0 g 4-(1H-Tetrazol-5-yl)picolinsäureethylester (LXXIV) (4,6 mmol)

werden mit 2,8 g 4-Fluorphenylethylamin (4,3 Äq., 20 mmol) und 6 mL Ethanol im

Mikrowellenreaktor für 45 min bei 180 °C erhitzt. Anschließend werden der Lösung 15 mL

Ethanol hinzugefügt und mit Salzsäure angesäuert, worauf ein Präzipitat gebildet wird. Dieses

wird abfiltriert und mit etwa 20 mL Ethanol nachgewaschen. Abschließend erfolgt

Umkristallisation aus Ethanol.



Ausbeute: 70 %. 1H-NMR (DMSO-d6): δ = 2,89 (t, 2H, C(9)H2, 3J = 7,6 Hz), 3,57 (q, 2H, C(8)H2, 3J = 7,6 Hz), 7,11

(t, 2H, 2×C(12)H, 3J = 8,8 Hz), 7,29 (t, 2H, 2×C(11)H, 3J = 8,4 Hz), 8,20 (d, 1H, C(3)H, 3J = 5,2 Hz), 8,64 (s, 1H, C(5)H), 8,87 (d, 1H, C(2)H, 3J = 5,2 Hz), 9,01 (t, 1H, N(15)H, 3J = 6,0 Hz). 13C-NMR (DMSO-d6): δ = 34,1 (C9), 40,4 (C8), 115,0 (2JC,F = 21 Hz, 2×C12), 118,8 (C5), 123,2

(C3), 130,4 (3JC,F = 8 Hz, 2×C11), 133,6 (C4), 135,4 (4JC,F = 3 Hz, C10), 149,8 (C2), 151,1 (C6),

155,0 (C7), 159,6 und 162,0 (1JC,F = 240 Hz, C13), 163,0 (C14).

MIR (ṽ): 3378 (s, vN-H), 1640 (s, vC=O), 1612 (s, νC=N) cm−1.

HRMS (ESI, m/z), berechnet [C15H13N6OF + H]+: 312,1135; gefunden: 312,1120.



4-(1H-Tetrazol-5-yl)-N-[4-(thiophen-2-yl)benzyl]picolinamid (LXXIX)


folgenden Änderungen: 385 mg 4-(1H-Tetrazol-5-yl)picolinsäureethylester (LXXIV) (1,8 mmol)

werden mit 480 mg 4-(Thiophen-2-yl)benzylamin (1,4 Äq., 2,5 mmol), 120 µL Triethylamin

(0,4 Äq., 0,8 mmol) und 3 mL Ethanol im Mikrowellenreaktor für 2 h bei 175 °C erhitzt.

Anschließend wird der Ethanol im Teilvakuum entfernt, der Überstand mit K2CO3-Lösung

aufgenommen und mit EtOAc extrahiert. Durch Ansäuern der wässrigen Phase wird das

Zielprodukt aus dieser Lösung ausgefällt. Abschließend erfolgt eine säulenchromatographische

Aufreinigung (adsorbiert an Kieselgur (aus Methanol), LM: EtOAc/DCM/MeOH/Essigsäure,

60:30:10:2, v/v/v/v), wobei das gewünschte Produkt aus den Zielfraktionen spontan

auskristallisiert.


Ausbeute: Spuren. 1H-NMR (DMSO-d6): δ = 4,54 (d, 2H, C(8)H2, 3J = 6,4 Hz), 7,12 (m, 1H, C(15)H, 3J = 3,6 Hz und

4,8 Hz), 7,39 (d, 2H, 2×C(10)H, 3J = 8,0 Hz), 7,47 (d, 1H, C(14)H, 3J = 3,2 Hz), 7,52 (d, 1H,

C(16)H, 3J = 4,8 Hz), 7,61 (d, 2H, 2×C(11)H, 3J = 8,0 Hz), 8,22 (d, 1H, C(3)H, 3J = 5,2 Hz), 8,67

(s, 1H, C(5)H), 8,90 (d, 1H, C(2)H, 3J = 5,2 Hz), 9,54 (s, 1H, N(18)H, 3J = 6,4 Hz).

Auf Grund der minimalen Ausbeute ist es nur gelungen, ein 1H-NMR-Spektrum zu vermessen

und auszuwerten. Die Konzentration war für das 13C-Spektrum bereits zu niedrig, weshalb

dieses nicht interpretiert werden konnte.

N-(1H-Benzimidazol-2-yl)-4-(1H-tetrazol-5-yl)picolinamid (LXXX)



Für die Synthese werden 250 mg 4-(1H-Tetrazol-5-yl)picolinsäure (LXXV) (1,3 mmol) und

175 mg 2-Aminobenzimidazol (1,0 Äq., 1,3 mmol) in 7 mL DMF gelöst. Dazu werden erst 1,1 mL

DIPEA (5,0 Äq., 6,5 mmol) und dann 990 mg HATU (2,0 Äq., 2,6 mmol) addiert. Der Ansatz

reagiert bei 50 °C für 15 h. Anschließend wird die dunkle Lösung mit Hilfe einer

Säulenchromatographie vorgereinigt (adsorbiert an Kieselgur (aus DMF, direkt aus dem

Ansatz), LM: EtOAc/DCM/MeOH/Ammoniak, 50:30:20:1, v/v/v/v). Abschließend erfolgt mit den

eingeengten Zielfraktionen eine Aufreinigung mittels präparativer HPLC (gelöst in

ammoniakalischem H2O; A: H2O+0,05 % NH3 und B: ACN, isokratisch, 15 % B) mit

nachfolgender Lyophilisation.

Beschaffenheit: Weißlich-gelber amorpher Feststoff.


Ausbeute: 8 %. 1H-NMR (DMSO-d6): δ = 7,19 (m, 2H, C(11)H und C(12)H, 3J = 6,8 Hz), 7,56 (m, 2H, C(10)H

und C(13)H, 3J = 6,8 Hz), 8,29 (d, 1H, C(3)H, 3J = 5,2 Hz), 8,80 (s, 1H, C(5)H), 8,93 (d, 1H,

C(2)H, 3J = 5,2 Hz). 13C-NMR (DMSO-d6): δ = 114,1 (C10 und C13), 119,5 (C5), 121,9 (C11 und C12), 123,9 (C3),

135,2 (C9 und C14), 136,9 (C4), 145,7 (C8), 149,5 (C6), 149,9 (C2), 156,5 (C7), 163,4 (C15).

MIR (ṽ): 3570 (w, vN-H), 1715 (m, vC=O), 1626 (s, νC=N) cm−1.


N-Butyl-4-(1H-tetrazol-5-yl-)picolinamid (LXXXI)

Die Synthese erfolgt analog zu N-(1H-Benzimidazol-2-yl)-4-(1H-tetrazol-5-yl)picolinamid

(LXXX) mit folgenden Änderungen: 165 mg 4-(1H-Tetrazol-5-yl)picolinsäure (LXXV) (0,9 mmol)

werden mit 90 µL Butylamin (1,0 Äq., 0,9 mmol) in 6 mL DMF gelöst. Dazu werden erst 770 µL

DIPEA (5,0 Äq., 4,5 mmol) und dann 650 mg HATU (2,0 Äq., 1,8 mmol) addiert. Der Ansatz

reagiert bei Raumtemperatur für 24 h. Anschließend wird das DMF bestmöglich im Teilvakuum

entfernt, der Überstand mit 30 mL Wasser aufgenommen und mit Salzsäure sauer eingestellt.

Nach Abfiltrieren des Präzipitats wird dieser Feststoff aus Ethanol umkristallisiert. Abschließend

erfolgt eine Aufreinigung mittels präparativer HPLC (gelöst in ammoniakalischem H2O;



A: H2O+0,05 % NH3 und B: ACN, isokratisch, 20 % B) mit nachfolgender Lyophilisation der

Zielfraktionen.



Ausbeute: 37 %. 1H-NMR (DMSO-d6): δ = 0,91 (t, 3H, C(11)H3, 3J = 7,2 Hz), 1,32 (m, 2H, C(10)H2, 3J = 7,2 Hz),

1,54 (m, 2H, C(9)H2, 3J = 7,2 Hz), 3,33 (dd, 2H, C(8)H2, 3J = 6,4 und 7,2 Hz), 8,19 (d, 1H, C(3)H, 3J = 4,8 Hz), 8,64 (s, 1H, C(5)H), 8,86 (d, 1H, C(2)H, 3J = 4,8 Hz), 8,91 (t, 1H, N(13)H, 3J = 6,4 Hz). 13C-NMR (DMSO-d6): δ = 13,7 (C11), 19,6 (C10), 31,2 (C9), 38,6 (C8), 118,8 (C5), 123,0 (C3),

134,2 (C4), 149,7 (C2), 151,4 (C6), 155,3 (C7), 163,1 (C12).



4-(1H-Tetrazol-5-yl)pyridin-2-hydroxamsäure (LXXXII)

4-(1H-Tetrazol-5-yl)picolinsäure (LXXV) (200 mg, 1,0 mmol) wird in 10 mL DMF gelöst und

unter Eiskühlung gerührt. Dieser Mischung werden 120 µL Oxalylchlorid (1,4 Äq., 1,4 mmol)

hinzugefügt. Nach etwa 30 min Rühren im Eisbad wird im Teilvakuum der Überschuss an

Oxalylchlorid entfernt und anschließend werden erst 525 µL DIPEA (3,0 Äq., 3 mmol) und dann

100 mg Hydroxylaminhydrochlorid (1,4 Äq., 1,4 mmol) addiert. Die Reaktion findet bei

Raumtemperatur für etwa 18 h statt. Die resultierende Lösung wird mit jeweils 10 mL Ethanol

und Wasser verdünnt und das Rohprodukt mit Hilfe von Salzsäure ausgefällt. Dieses wird

säulenchromatographisch aufgearbeitet (adsorbiert an Kieselgur (aus ammoniakalischem

Methanol), LM: EtOAc/MeOH/Essigsäure, 50:50:1, v/v/v) und abschließend aus Wasser

umkristallisiert.



Ausbeute: 21 %.



1H-NMR (DMSO-d6): δ = 8,18 (d, 1H, C(3)H, 3J = 5,2 Hz), 8,60 (s, 1H, C(5)H), 8,85 (d, 1H,

C(2)H, 3J = 5,2 Hz), 9,23 (s, 1H, N(8)H), 11,64 (s, 1H, O(9)H). 13C-NMR (DMSO-d6): δ = 118,8 (C5), 123,0 (C3), 133,8 (C4), 149,9 (C2), 151,3 (C6), 154,8

(C7), 160,6 (C10).



2-Chlor-4-(1-trityl-1H-tetrazol-5-yl)pyridin (LXXXIV)

Für die Synthese werden 3 g 2-Chlor-4-(1H-tetrazol-5-yl)pyridin (XXXV) (17 mmol) und 4,7 mL

Triethylamin (2,0 Äq., 34 mmol) abgewogen und in 20 mL THF vorgelöst. Dazu wird eine Lösung

aus 5,2 g Tritylchlorid (1,1 Äq., 18,7 mmol) in 15 mL THF hinzugefügt. Der Ansatz wird 17 h bei

Raumtemperatur gerührt. Entstandene Feststoffe werden abfiltriert und mit Tetrahydrofuran

nachgewaschen. Anschließend wird das Filtrat mit Natriumcarbonat-Lösung verdünnt und mit

Ethylacetat extrahiert. Nach Trocknen über Na2SO4 und Einengen der vereinigten organischen

Phasen im Teilvakuum wird der Überstand mittels Säulenchromatographie aufgearbeitet

(adsorbiert an Kieselgur (aus EtOAc), LM: Petrolether/EtOAc/Ammoniak, 90:10:1, v/v/v). Das

Zielprodukt kann, wenn nötig, aus Acetonitril umkristallisiert werden.



Ausbeute: 24 %. 1H-NMR (CDCl3): δ = 7,14 (m, 6H, 6×C(10)H), 7,37 (m, 9H, 6×C(11)H und 3×C(12)H), 7,94 (d,

1H, C(3)H, 3J = 5,2 Hz), 8,04 (s, 1H, C(5)H), 8,51 (d, 1H, C(2)H, 3J = 5,2 Hz). 13C-NMR (CDCl3): δ = 84,2 (C8), 119,9 (C5), 121,8 (C3), 128,1-130,5 (6×C10 und 6×C11 und

3×C12), 138,0 (C6), 141,1 (3×C9), 150,7 (C2), 152,6 (C4), 161,3 (C7).

MIR (ṽ): 1605 (s, νC=N) cm−1.

N Cl

N

NN

N

1

2

34

5

6

7

89

1011

12

LXXXIV



4-(1-Trityl-1H-tetrazol-5-yl)picolinnitril (LXXXV)

Anmerkung: Statt dem gewünschten Produkt wurde Tritylcyanid (2,2,2-Triphenylacetonitril)

erhalten!

2-Chlor-4-(1-trityl-1H-tetrazol-5-yl)pyridin (LXXXIV) (300 mg, 0,7 mmol), 85 mg Zn(CN)2

(1,0 Äq., 0,7 mmol) und 20 mg Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0) (2,5 mol%) werden in

ein Mikrowellengefäß eingewogen und mit 2 mL DMF versetzt. Anschließend wird im

Mikrowellenreaktor für 30 min bei 160 °C erhitzt. Die Feststoffe werden über Kieselgur abfiltriert

und der Filterkuchen mit Wasser und Ethylacetat nachgewaschen. Die zwei resultierenden

Filtrat-Phasen werden getrennt, die wässrige Phase anschließend erneut mit Ethylacetat

extrahiert. Nach Trocknen über Na2SO4 und Einengen der vereinigten organischen Phasen im

Teilvakuum, wird der Überstand mittels Säulenchromatographie aufgearbeitet (gelöst in

wenigen mL EtOAc, LM: Petrolether/EtOAc, 90:10, v/v).



Ausbeute: nicht bestimmt. 1H-NMR (CDCl3): δ = 7,22 (m, 6H, 6×C(3)H), 7,35 (m, 9H, 6×C(4)H und 3×C(5)H).

13C-NMR (CDCl3): δ = 57,6 (C1), 123,7 (C6), 128,3-129,0 (6×C3 und 6×C4 und 3×C5),

140,4 (3×C2).

MIR (ṽ): 2232 (w, νC≡N) cm−1.

4-(1-Benzyl-1H-tetrazol-5-yl)-2-chlorpyridin (LXXXVI)



Es werden 3 g 2-Chlor-4-(1H-tetrazol-5-yl)pyridin (XXXV) (17 mmol), 2,8 g Kaliumcarbonat

(1,2 Äq., 20 mmol) und 2,4 mL Benzylbromid (1,2 Äq., 20 mmol) in einen Rundkolben gegeben

und in etwa 50 mL Aceton suspendiert. Der Ansatz wird bei 50 °C für 90 min unter

Stickstoffatmosphäre erhitzt. Nach Abkühlen wird der ausgefallene Feststoff abfiltriert und mit

Aceton nachgewaschen. Das organische Lösungsmittel wird anschließend im Teilvakuum

entfernt, der Überstand in verdünnter Natronlauge aufgenommen und mehrfach mit Ethylacetat

extrahiert. Nach Trocknen über Na2SO4 und Einengen der vereinigten organischen Phasen im

Teilvakuum wird der Überstand mittels Säulenchromatographie aufgearbeitet (gelöst in wenigen

mL EtOAc, LM: Petrolether/EtOAc, 80:20, v/v). Das Zielprodukt kann, wenn nötig, aus Methanol

umkristallisiert werden.



Ausbeute: 70 %. 1H-NMR (CDCl3): δ = 5,83 (s, 2H, C(8)H2), 7,41 (m, 5H, 2×C(10)H und 2×C(11)H und C(12)H),

7,94 (d, 1H, C(3)H, 3J = 5,2 Hz), 8,06 (s, 1H, C(5)H), 8,52 (d, 1H, C(2)H, 3J = 5,2 Hz). 13C-NMR (CDCl3): δ = 57,5 (C8), 119,7 (C5), 121,7 (C3), 128,7-129,5 (2×C10 und 2×C11 und

C12), 132,9 (C9), 137,8 (C6), 150,8 (C2), 152,7 (C4), 162, 6 (C7).

MIR (ṽ): 1604 (s, νC=N) cm−1.


4-(1-Benzyl-1H-tetrazol-5-yl)picolinnitril (LXXXVII)

In ein Mikrowellengefäß werden 800 mg 4-(1-Benzyl-1H-tetrazol-5-yl)-2-chlorpyridin (LXXXVI)

(2,9 mmol) mit 170 mg Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0) (5 mol%) und 410 mg Zn(CN)2

(1,2 Äq., 3,5 mmol) eingewogen. Unter Stickstoffatmosphäre werden 10 mL DMF hinzugegeben

und anschließend das Gefäß noch einmal mit Stickstoff gespült. Die Reaktion findet im

Mikrowellenreaktor bei 190 °C für 20 min statt. Anschließend wird der Ansatz mit der fünffachen

Menge an Wasser verdünnt, über Kieselgur filtriert und der Filterkuchen mit reichlich Wasser

und Ethylacetat nachgewaschen. Nach Trennen der beiden flüssigen Phasen, wird die wässrige



Phase nochmals mit Ethylacetat extrahiert. Durch anschließendes Trocknen der vereinigten

organischen Phasen über Na2SO4 und Einengen im Teilvakuum wird das Rohprodukt erhalten,

welches nachfolgend chromatographisch aufgearbeitet wird (adsorbiert an Kieselgur (aus

EtOAc), LM: n-Hexan/EtOAc, 75:25, v/v). Die vereinigten, vom Lösungsmittel befreiten

Fraktionen werden in wenigen mL Ethanol gelöst und mit Hilfe von etwa 150 mL Petrolether bei

–21°C ausgefällt.

Beschaffenheit: Farbloser watteartiger Feststoff.

Schmelzbereich: 79-80°C.


8,23 (d, 1H, C(3)H, 3J = 5,2 Hz), 8,39 (s, 1H, C(5)H), 8,84 (d, 1H, C(2)H, 3J = 5,2 Hz). 13C-NMR (CDCl3): δ = 57,6 (C8), 116,9 (C13), 123,9 (C3), 125,7 (C5), 128,8-129,6 (2×C10 und

2×C11 und C12), 132,7 (C9), 135,1 (C6), 136,5 (C4), 152,1 (C2), 162,0 (C7).

MIR (ṽ): 2237 (w, νC≡N), 1610 (s, νC=N) cm−1.


[4-(1H-Tetrazol-5-yl)pyridin-2-yl]methanamin (LXXXVIII)

Für die Synthese werden 210 mg 4-(1-Benzyl-1H-tetrazol-5-yl)picolinnitril (LXXXVII) (0,8 mmol)

mit 300 mg Palladium auf Aktivkohle-Pulver (Pd/C, 10 %, wassernass) in einen Rundkolben mit

Seitenhals, welcher durch ein Septum verschlossen wurde, eingewogen. Anschließend wird der

Aufbau drei Mal evakuiert und mit Wasserstoff geflutet. Durch das Septum werden 50 mL

Methanol hinzugegeben und der Ansatz bei Raumtemperatur für etwa 24 h gerührt

(gegebenenfalls muss der H2-Ballon mehrmals nachgefüllt werden). Nachfolgend wird über

Kieselgur abfiltriert, der Überstand mit reichlich Methanol nachgewaschen und anschließend

das Filtrat vom Lösungsmittel im Teilvakuum befreit. Die abschließende Aufreinigung erfolgt mit

Hilfe der MPLC (adsorbiert an Kieselgur (aus ammoniakalischem MeOH), LM:

EtOAc/MeOH/Ammoniak, 65:35:1, v/v/v; stat. Phase: Biotage Snap Cartridge KP-Sil 25 g

(50 µm)).



Beschaffenheit: Leicht beigefarbener amorpher Feststoff.

Schmelzbereich: ab 250°C Zersetzung.

Ausbeute: 49 %. 1H-NMR (DMSO-d6): δ = 4,48 (s, 2H, C(8)H2), 7,25 (s, 2H, N(9)H2), 7,94 (d, 1H, C(3)H,

3J = 5,2 Hz), 8,09 (s, 1H, C(5)H), 8,64 (d, 1H, C(2)H, 3J = 5,2 Hz). 13C-NMR (DMSO-d6): δ = 50,6 (C8), 119,4 (C5), 119,8 (C3), 140,3 (C4), 149,4 (C2), 152,6 (C6),

158,6 (C7).

MIR (ṽ): 3335 (m, vN-H), 1618 (s, νC=N) cm−1.

HRMS (ESI, m/z), berechnet [C7H8N6 − H]−: 176,0810; gefunden: 176,0810.

4-(1-Benzyl-1H-tetrazol-5-yl)picolinsäureethylester (LXXXIX)

Es werden 2,3 g 4-(1H-Tetrazol-5-yl)picolinsäureethylester (LXXIV) (10 mmol), 1,7 g

Kaliumcarbonat (1,2 Äq., 12 mmol) und 1,4 mL Benzylbromid (1,2 Äq., 12 mmol) in einen

Rundkolben gegeben und in 45 mL Aceton suspendiert. Der Ansatz wird unter Rückfluss für

etwa 2 h unter Stickstoffatmosphäre erhitzt. Das organische Lösungsmittel wird anschließend

im Teilvakuum entfernt, der Überstand in Ethylacetat suspendiert und mehrfach mit verdünnter

K2CO3-Lösung gewaschen. Nach Trocknen über Na2SO4 und Einengen der organischen Phase

im Teilvakuum wird der Überstand mittels Säulenchromatographie aufgearbeitet (gelöst in

wenigen mL EtOAc, LM: DCM/EtOAc, 80:20, v/v). Die Kristallisation des Zielprodukts kann bis

zu vier Wochen dauern.



Ausbeute: 91 %. 1H-NMR (CDCl3): δ = 1,47 (t, 3H, C(9)H3, 3J = 7,2 Hz), 4,51 (q, 2H, C(8)H2, 3J = 7,2 Hz), 5,85 (s,

2H, C(11)H2), 7,41 (m, 5H, 2×C(13)H und 2×C(14)H und C(15)H), 8,19 (d, 1H, C(3)H, 3J = 5,2 Hz), 8,81 (s, 1H, C(5)H), 8,89 (d, 1H, C(2)H, 3J = 4,8 Hz).

N

N

NN

N

O

O

LXXXIX

1

2

34

5

6

711

1213

14

15

8

910



13C-NMR (CDCl3): δ = 14,6 (C9), 57,5 (C11), 62,4 (C8), 122,5 (C5), 123,9 (C3), 128,8-129,5

(2×C13 und 2×C14 und C15), 133,0 (C12), 136,3 (C4), 149,5 (C6), 150,9 (C2), 163,0 (C7),

165,0 (C10).

MIR (ṽ): 1740 (s, vC=O), 1607 (s, νC=N) cm−1.


4-(1-Benzyl-1H-tetrazol-5-yl)-N-(3-morpholinopropyl)picolinamid (XC)

Für die Synthese werden 2,7 g 4-(1-Benzyl-1H-tetrazol-5-yl)picolinsäureethylester (LXXXIX)

(8,7 mmol) in 60 mL Ethanol gelöst und mit 5,1 mL 3-Morpholinopropylamin (4,0 Äq., 35 mmol)

versetzt. Der Ansatz reagiert bei 55 °C für etwa 72 h. Nach Entfernen des Lösungsmittels erfolgt

eine säulenchromatographische Aufarbeitung des Überstandes (gelöst in wenigen mL EtOAc,

LM: EtOAc/DCM/MeOH, 65:25:10, v/v/v). Wenn erwünscht, kann die freie Base in Ethylacetat

gelöst und unter starkem Rühren HCl-Gas in den Rundkolben zum Ausfällen des

Hydrochloridsalzes eingeleitet werden.

Folgende Daten beziehen sich auf die freie Base:



Ausbeute: 93 %. 1H-NMR (CDCl3): δ = 1,83 (m, 2H, C(9)H2, 3J = 6,0 Hz), 2,55 (m, 2H und 4H, C(10)H2 und

2×C(11)H2, 3J = 6,4 Hz), 3,61 (q, 2H, C(8)H2, 3J = 6,0 Hz), 3,82 (t, 4H, 2×C(12)H2), 5,84 (s, 2H,

C(14)H2), 7,41 (m, 5H, 2×C(16)H und 2×C(17)H und C(18)H), 8,16 (d, 1H, C(3)H, 3J = 5,2 Hz),

8,69 (d, 1H, C(2)H, 3J = 5,2 Hz), 8,86 (s, 1H, C(5)H), 9,02 (s, 1H, N(19)H). 13C-NMR (CDCl3): δ = 25,5 (C9), 39,5 (C8), 54,0 (2×C11), 57,4 (C14), 58,1 (C10), 67,0 (2×C12),

119,8 (C5), 123,1 (C3), 128,9-129,4 (2×C16 und 2×C17 und C18), 133,0 (C15), 136,5 (C4),

149,0 (C2), 151,2 (C6), 163,4 (C13), 164,0 (C7).



N

O

N

NN

N

HN N

O

XC

1

2

34

5

6

714

15

16

17

18

8

913

1012

11

19



N-{[4-(1-Benzyl-1H-tetrazol-5-yl)pyridin-2-yl]methyl}-3-morpholinopropan-1-amin-

Dihydrochlorid (XCII) (ohne vorherige Isolation von XCI)

Schritt I (XCI): 4-(1-Benzyl-1H-tetrazol-5-yl)-N-(3-morpholinopropyl)picolinamid (XC) (400 mg,

1,0 mmol) und 415 mg PCl5 (2,0 Äq., 2,0 mmol) werden in 25 mL Dichlormethan gelöst und für

etwa 5 h unter Rückfluss erhitzt. Die farblose Lösung nimmt dabei eine rötliche Färbung an. Das

Lösungsmittel wird anschließend im Teilvakuum entfernt. Es resultiert ein bräunlicher,

schaumähnlicher Feststoff, welcher direkt weiter verarbeitet wird.

Schritt II (XCII): Der Überstand aus der Synthese von XCI wird in 50 mL Ethanol aufgenommen

und im Eisbad gekühlt. Zu der Lösung werden langsam und in gleichmäßigen Portionen 225 mg

NaBH4 (6 Äq., 6 mmol) gegeben. Nach etwa 15 min Rühren im Eisbad und Erliegen der

Gasentwicklung wird für 30 min unter Rückfluss erhitzt. Anschließend erfolgen das Entfernen

des Lösungsmittels und eine Flüssig-Flüssig-Extraktion mit Ethylacetat und K2CO3-Lösung.

Nach Trocknen über Na2SO4 und Einengen der organischen Phasen im Teilvakuum wird der

Überstand mittels Säulenchromatographie aufgearbeitet (adsorbiert an Kieselgur (aus EtOAc),

LM: DCM/EtOAc/MeOH/Ammoniak, 45:45:10:1, v/v/v/v). Zum Überführen der freien Base in das

Dihydrochlorid wird diese in Ethylacetat gelöst und anschließend HCl-Gas unter kräftigem

Rühren eingeleitet. Das Präzipitat wird anschließend abfiltriert und mit kaltem Aceton und wenig

Isopropanol gewaschen.



Ausbeute: 35 %. 1H-NMR (DMSO-d6): δ = 2,28 (m, 2H, C(9)H2, 3J = 7,2 Hz), 3,05 (s, 2H, C(11)H2), 3,14 (s, 2H,

C(10)H2), 3,20 (d, 2H, C(8)H2, 3J = 6,8 Hz), 3,37 (s, 2H, C(11)H2), 3,92 (m, 4H, 2×C(12)H2), 4,44

(s, 2H, C(13)H2), 6,08 (s, 2H, C(14)H2), 7,41 (m, 5H, 2×C(16)H und 2×C(17)H und C(18)H), 8,04

(d, 1H, C(3)H, 3J = 4,8 Hz), 8,19 (s, 1H, C(5)H), 8,83 (d, 1H, C(2)H, 3J = 5,2 Hz), 9,72 (s, 2H,

N(19)H2+), 11,64 (s, 1H, N(20)H+).



13C-NMR (DMSO-d6): δ = 19,6 (C9), 44,1 (C8), 50,1 (C13), 50,8 (2×C11), 52,9 (C10), 56,5 (C14),

63,0 (2×C12), 120,2 (C3 und C5), 128,4-128,9 (2×C16 und 2×C17 und C18), 133,8 (C15), 134,8

(C4), 150,4 (C2), 153,5 (C6), 162,3 (C7).

MIR (ṽ): 3382 (m, vN-H), 1607 (m, νC=N) cm−1.


N-{[4-(1H-Tetrazol-5-yl)pyridin-2-yl]methyl}-3-morpholinopropan-1-amin-Dihydrochlorid

(XCIII)

N-{[4-(1-Benzyl-1H-tetrazol-5-yl)pyridin-2-yl]methyl}-3-morpholinopropan-1-amin (XCII)

(350 mg, 0,9 mmol) wird mit 100 mg Pd/C (10 %, wassernass) in einen Rundkolben mit

Seitenhals eingewogen. Der Ansatz wird evakuiert und über ein Septum am Seitenhals etwa

50 mL Methanol zugesetzt. Anschließend wird der Aufbau mit Wasserstoff geflutet. Die

Reaktionszeit beträgt etwa 6 h bei 35 °C. Nach Abfiltrieren über Kieselgur wird der Filterkuchen

großzügig mit Methanol gewaschen, das Lösungsmittel anschließend im Teilvakuum entfernt

und der ölige Rückstand mit Hilfe von zugesetztem Ethylacetat kristallisiert. Die abschließende

Aufreinigung erfolgt mittels präparativer HPLC (gelöst in H2O; A: H2O mit 0,05 % NH3 und B:

MeOH, isokratisch, 15 % B) mit nachfolgender Lyophilisation der Zielfraktionen und Überführen

in das Dihydrochloridsalz.



Ausbeute: 11 %. 1H-NMR (DMSO-d6): δ = 1,82 (m, 2H, C(9)H2, 3J = 6,4 Hz), 2,42 (m, 2H und 4H, C(10)H2 und

2×C(11)H2, 3J = 6,4 Hz), 3,10 (t, 2H, C(8)H2, 3J = 6,4 Hz), 3,59 (s, 4H, 2×C(12)H2), 4,40 (s, 2H,

C(13)H2), 7,93 (d, 1H, C(3)H, 3J = 4,8 Hz), 8,04 (s, 1H, C(5)H), 8,61 (d, 1H, C(2)H, 3J = 5,2 Hz),

9,04 (s, 1H, N(14)H+). 13C-NMR (DMSO-d6): δ = 21,6 (C9), 46,6 (C8), 50,5 (C13), 53,0 (2×C11), 55,9 (C10), 65,9

(2×C12), 119,1 (C5), 119,8 (C3), 140,1 (C4), 149,3 (C2), 152,6 (C6), 159,0 (C7).

MIR (ṽ): 2952 (m, νC-H, aliphatisch), 1614 (s, νC=N) cm−1.




[4-(1H-Tetrazol-5-yl)pyridin-2-yl]methanol (XCIV)

4-(1H-Tetrazol-5-yl)picolinsäureethylester (LXXIV) (1,1 g, 5 mmol) wird mit 1,5 g NaBH4 (8 Äq.,

40 mmol) in einen Rundkolben eingewogen und in 100 mL Tetrahydrofuran suspendiert. Nach

fünfminütigem Erhitzen auf 70 °C werden dem Reaktionsansatz 25 mL Methanol zugesetzt. Die

Suspension klart unter heftiger Gasentwicklung auf. Es wird für weitere 20 h bei 70 °C erhitzt.

Nach Abkühlen werden 5 mL Wasser und so viel Salzsäure zugesetzt, bis ein neutraler pH-Wert

resultiert. Durch Entfernen der Lösungsmittel im Teilvakuum wird ein Überstand erhalten,

welcher durch eine kurze Säulenchromatographie von überschüssigen anorganischen Salzen

befreit wird (adsorbiert an Kieselgel (aus ammoniakalischem Methanol), LM:

EtOAc/MeOH/DCM/Essigsäure, 50:30:20:1, v/v/v/v). Nach Einengen der Zielfraktionen im

Teilvakuum wird das Zielprodukt mit reichlich Ethylacetat gewaschen.



Ausbeute: 83 %. 1H-NMR (DMSO-d6): δ = 4,69 (s, 2H, C(8)H2), 5,79 (s, 1H, O(9)H), 8,03 (d, 1H, C(3)H,

3J = 5,2 Hz), 8,21 (s, 1H, C(5)H), 8,72 (d, 1H, C(2)H, 3J = 5,2 Hz). 13C-NMR (DMSO-d6): δ = 63,6 (C8), 117,3 (C5), 119,2 (C3), 133,6 (C4), 149,1 (C2), 155,2 (C7),

163,1 (C6).

MIR (ṽ): 3350-3100 (s, vO-H, assoziiert), 1628 (s, νC=N) cm−1.


N-{[4-(1H-Tetrazol-5-yl)pyridin-2-yl]methyl}-chinolin-3-amin (XCVII)



Für die Synthese werden 150 mg [4-(1H-Tetrazol-5-yl)pyridin-2-yl]methanol (XCIV) (0,8 mmol)

zusammen mit 225 µL Triethylamin (2,0 Äq., 1,6 mmol) und 10 mg 4-(Dimethylamino)pyridin

(0,08 mmol) in einer Mischung aus 10 mL THF und 10 mL DMF gelöst. Dazu werden unter

Eiskühlung 95 µL Methansulfonylchlorid (1,5 Äq., 1,2 mmol) gegeben und unter langsamer

Erwärmung auf Raumtemperatur für mindestens 36 h gerührt. Zeigt die DC-Kontrolle eine

vollständige Umsetzung an, erfolgt die Zugabe von 460 mg 3-Aminochinolin (4,0 Äq.,

3,2 mmol). Anschließend wird für mindestens 48 h bei 80 °C erhitzt. Die resultierende dunkle

Lösung wird mit Hilfe einer Säulenchromatographie vorgereinigt (adsorbiert an Kieselgur (aus

DMF, direkt aus dem Ansatz), LM: EtOAc/MeOH/DCM/Essigsäure, 50:30:20:1, v/v/v/v).

Abschließend erfolgt mit den eingeengten Zielfraktionen eine Aufreinigung mittels präparativer

HPLC (gelöst in MeOH/DMSO, 70:30, v/v; A: H2O mit 0,05 % NH3 und B: ACN, Gradient, 0–4

min (B) 15 %, –10 min (B) 85%, –25 min (B) 85 %, –26 min (B) 15%) mit nachfolgender

Lyophilisation.

Beschaffenheit: Gelber amorpher Feststoff.


Ausbeute: 9 %. 1H-NMR (DMSO-d6): δ = 4,55 (s, 2H, C(8)H2), 7,02 (s, 1H, C(17)H), 7,09 (s, 1H, N(18)H), 7,33

(m, 2H, C(13)H und C(14)H, 3J = 8,4 Hz), 7,57 (d, 1H, C(12)H, 3J = 8,0 Hz), 7,77 (d, 1H, C(15)H, 3J = 7,6 Hz), 7,81 (s, 1H, C(3)H), 8,01 (s, 1H, C(5)H), 8,63 (s, 2H, C(2)H und C(10)H). 13C-NMR (DMSO-d6): δ = 48,1 (C8), 108,2 (C17), 117,6 (C5), 118,8 (C3), 124,0 (C13),

125,7 (C15), 126,5 (C14), 128,5 (C12), 129,3 (C16), 137,8 (C9), 140,1 (C11), 142,2 (C4), 143,7

(C10), 149,6 (C2), 157,5 (C7), 159,5 (C6).

MIR (ṽ): 3356 (w, vN-H), 1611 (s, νC=N) cm−1.


[4-(1H-Tetrazol-5-yl)pyridin-2-yl]-N-(4-fluorbenzyl)methanamin (XCVIII)

Variante A (Sulfonsäureester-Weg): Es werden 150 mg [4-(1H-Tetrazol-5-yl)pyridin-2-

yl]methanol (XCIV) (0,8 mmol) zusammen mit 225 µL Triethylamin (2,0 Äq., 1,6 mmol) und

10 mg 4-(Dimethylamino)pyridin (0,08 mmol) in 15 mL Tetrahydrofuran suspendiert. Dazu

werden unter Eiskühlung 70 µL Methansulfonylchlorid (1,1 Äq., 0,9 mmol) gegeben und unter



langsamen Erwärmen auf Raumtemperatur für mindestens 24 h gerührt. Zeigt die DC-Kontrolle

eine vollständige Umsetzung an, erfolgt die Zugabe von 365 µL 4-Fluorbenzylamin (4,0 Äq.,

3,2 mmol) und 20 mL DMF. Anschließend wird für mindestens 72 h bei 60 °C erhitzt. Die

resultierende orangefarbene Lösung wird mit Hilfe einer Säulenchromatographie vorgereinigt

(adsorbiert an Kieselgur (aus DMF, direkt aus dem Ansatz), LM: EtOAc/MeOH/DCM/Ammoniak,

50:30:20:1, v/v/v/v). Die abschließende Aufreinigung erfolgt mit Hilfe der präparativen HPLC

(gelöst in MeOH/H2O, 50:50, v/v; A: H2O mit 0,05 % NH3 und B: ACN, Gradient, 0–6 min (B)

10 %, –10 min (B) 85%, –25 min (B) 85 %, –26 min (B) 15%) und nachfolgender Lyophilisation.

Variante B (reduktive Aminierung): 4-(1-Benzyl-1H-tetrazol-5-yl)picolinaldehyd (CI) (200 mg,

0,8 mmol) wird mit 90 µL 4-Fluorbenzylamin (1,0 Äq., 0,8 mmol) in 20 mL Methanol gelöst und

für 24 h unter Rückfluss erhitzt. Nach Abkühlen der Lösung werden dem Ansatz 300 mg

Palladium auf Aktivkohle-Pulver (10 %, wassernass) und weitere 20 mL Methanol zugesetzt,

das System evakuiert und mit Wasserstoff geflutet. Der Ansatz reagiert bei Raumtemperatur für

etwa 22 h, gegebenenfalls muss während der Reaktion der Wasserstoff-Ballon wieder befüllt

werden. Der Katalysator wird anschließend über einem Bett aus Kieselgur abfiltriert und das

erhaltene Filtrat im Teilvakuum eingeengt. Es erfolgen zwei Säulenchromatographien (erste:

adsorbiert an Kieselgur (aus Methanol), LM: EtOAc/MeOH/DCM/Ammoniak, 50:30:20:1, v/v/v/v;

zweite: adsorbiert an Kieselgur (aus Methanol), LM: EtOAc/Aceton/MeOH/Essigsäure,

40:30:30:1, v/v/v/v) zur Aufreinigung des Rohprodukts. Die nach Einengen der Zielfraktionen

erhaltene ölige Substanz wird mit Hilfe von wenig Ethanol und reichlich Diethylether kristallisiert.

Beschaffenheit: Gräulicher amorpher Feststoff.

Schmelzbereich: 230-233°C unter Zersetzung.

Ausbeute: 5 % (A). 9 % (B). 1H-NMR (DMSO-d6): δ = 4,00 (s, 2H, C(9)H2), 4,09 (s, 2H, C(8)H2), 7,20 (t, 2H, 2×C(12)H,

3J = 8,0 Hz), 7,49 (t, 2H, 2×C(11)H, 3J = 7,6 Hz), 7,82 (d, 1H, C(3)H, 3J = 4,4 Hz), 8,01 (s, 1H,

C(5)H), 8,52 (d, 1H, C(2)H, 3J = 4,8 Hz), 8,73 (s, 1H, N(14)H). 13C-NMR (DMSO-d6): δ = 49,7 (C9), 50,5 (C8), 115,4 (2JC,F = 21 Hz, 2×C12), 119,3 (C5), 119,7

(C3), 129,1 (C10), 132,2 (3JC,F = 9 Hz, 2×C11), 140,5 (C4), 149,4 (C2), 153,1 (C6), 158,7 (C7),

161,0 und 163,5 (1JC,F = 244 Hz, C13).

MIR (ṽ): 1615 (s, νC=N) cm−1.

HRMS (ESI, m/z), berechnet [C14H13N6F + H]+: 284,1186; gefunden: 284,1185.



4-(1-Benzyl-1H-tetrazol-5-yl)picolinaldehyd (CI)

4-(1-Benzyl-1H-tetrazol-5-yl)picolinsäureethylester (LXXXIX) (1,0 g, 3,2 mmol) wird in einen

Rundkolben mit Seitenhals und aufgesetztem Trockenrohr eingewogen und in 20 mL trockenem

Tetrahydrofuran gelöst. Der Reaktionsansatz wird mit einer Mischung aus Ethylacetat und

flüssigem Stickstoff in einem Dewar-Gefäß auf etwa –80 °C gekühlt. Anschließend werden dazu

über den Seitenhals langsam 8,0 mL DIBAL (3,0 Äq., 9,6 mmol) (1,2 mol/L Lösung in Toluen)

hinzugegeben und für 5 h unter fortlaufender Kühlung gerührt. Die noch kalte Lösung wird dann

in eine Mischung aus 20 mL Wasser und 3 mL Essigsäure gegossen und für weitere 15 min

gerührt, bis die Gasentwicklung zum Erliegen kommt. Anschließend erfolgt eine Flüssig-Flüssig-

Extraktion mit Ethylacetat, die wässrige Phase wird vorher auf einen pH-Wert von etwa 8 mit

K2CO3 eingestellt. Nach Trocknen über Na2SO4 und Einengen der vereinigten organischen

Phasen im Teilvakuum wird der Überstand mittels Säulenchromatographie aufgearbeitet (gelöst

in wenigen mL EtOAc, LM: Petrolether/EtOAc, 50:50, v/v).

Beschaffenheit: Ockerfarbener amorpher Feststoff.



8,25 (d, 1H, C(3)H, 3J = 4,8 Hz), 8,64 (s, 1H, C(5)H), 8,92 (d, 1H, C(2)H, 3J = 4,8 Hz), 10,14 (s,

1H, C(8)H). 13C-NMR (CDCl3): δ = 57,5 (C9), 119,2 (C5), 124,9 (C3), 128,8-129,5 (2×C11 und 2×C12 und

C13), 132,9 (C10), 136,4 (C4), 151,3 (C2), 153,9 (C6), 163,0 (C7), 193,0 (C8).

MIR (ṽ): 1700 (s, vC=O), 1612 (s, νC=N) cm−1.


N

N

NN

N

O

H

1

2

34

5

6

79

1011

12

13

8

CI



[4-(1H-Tetrazol-5-yl)pyridin-2-yl]-N-(3,4-dimethoxybenzyl)methanamin (CII)

Für die Synthese werden 250 mg 4-(1-Benzyl-1H-tetrazol-5-yl)picolinaldehyd (CI) (0,9 mmol) in

20 mL Methanol gelöst und mit 140 µL 3,4-Dimethoxybenzylamin (1,0 Äq., 0,9 mmol) versetzt.

Es wird für 15 h unter Rückfluss erhitzt. Nach erfolgter Azomethinbildung wird der Ansatz nach

Abkühlen mit 300 mg Pd/C (10 %, wassernass) versetzt, die Glasapparatur evakuiert und mit

Wasserstoff geflutet. Nach 8 h Reaktionszeit bei Raumtemperatur wird der Katalysator über

Kieselgur abfiltriert und das Filtrat im Teilvakuum eingeengt. Die abschließende Aufreinigung

erfolgt mittels präparativer HPLC (gelöst in H2O/DMSO, 50:50, v/v; A: H2O und B: MeOH,

isokratisch, 50 % B) und anschließender Lyophilisation.



Ausbeute: 26 %. 1H-NMR (DMSO-d6): δ = 3,77 (s, 6H, 2×C(16)H3), 4,18 (s, 2H, C(9)H2), 4,32 (s, 2H, C(8)H2),

7,03 (m, 2H, C(14)H und C(15)H), 7,17 (s, 1H, C(11)H), 7,92 (d, 1H, C(3)H, 3J = 5,2 Hz), 8,05

(s, 1H, C(5)H), 8,62 (d, 1H, C(2)H, 3J = 5,2 Hz), 9,33 (s, 1H, N(17)H). 13C-NMR (DMSO-d6): δ = 49,9 und 50,2 (C8 und C9), 55,5 (2×C16), 111,6 (C14), 113,6 (C11),

119,5 (C5), 119,9 (C3), 122,8 (C15), 123,9 (C10), 140,5 (C4), 148,6 und 149,3 (C12 und C13),

149,5 (C2), 152,5 (C6), 158,6 (C7).

MIR (ṽ): 2835 (w, νC-H, aliphatisch), 1612 (s, νC=N) cm−1.


N-{[4-(1H-Tetrazol-5-yl)pyridin-2-yl]methyl}cyclopropanamin (CIII)

4-(1-Benzyl-1H-tetrazol-5-yl)picolinaldehyd (CI) (250 mg, 0,9 mmol) wird in 20 mL Methanol

gelöst und mit 130 µL Cyclopropylamin (2,0 Äq., 1,8 mmol) versetzt. Der Ansatz wird für etwa



1,5 h unter Rückfluss erhitzt. Anschließend wird im Eisbad heruntergekühlt, 140 mg NaBH4

(4,0 Äq.), welches in 5 mL Wasser suspendiert wurde, hinzugefügt und für 30 min weitergerührt.

Durch Einengen im Teilvakuum wird das Lösungsmittel entfernt. Der Überstand ist in verdünnter

NaHCO3-Lösung aufzunehmen und mit Ethylacetat zu extrahieren. Anschließend werden die

organischen Phasen wiederum vom Lösungsmittel befreit und der resultierende Überstand mit

300 mg Pd/C (10 %, wassernass) und 35 mL Methanol versetzt. Die Glasapparatur wird

evakuiert und mit Wasserstoff geflutet. Die Reaktionszeit beträgt 1,5 h bei Raumtemperatur. Der

Katalysator wird über Kieselgur abfiltriert, mit reichlich Methanol nachgewaschen und nach

Ansäuern mit Salzsäure wird das Filtrat im Teilvakuum eingeengt. Der resultierende Überstand

wird mit Ethanol digeriert, die Nebenprodukte abfiltriert und das Zielprodukt-enthaltende Filtrat

vom Lösungsmittel befreit. Die finale Aufreinigung erfolgt mittels präparativer HPLC (gelöst in

H2O/MeOH, 50:50, v/v; A: H2O und B: MeOH, isokratisch, 15 % B) und anschließender

Lyophilisation.


Schmelzbereich: ab 220 °C Zersetzung.

Ausbeute: 34 %. 1H-NMR (DMSO-d6): δ = 0,74 (m, 2H, C(11)H2,

3J = 6,8 Hz), 0,83 (m, 2H, C(10)H2, 3J = 7,2 Hz),

2,75 (m, 1H, C(9)H, 3J = 7,2 Hz), 4,44 (s, 2H, C(8)H2), 7,92 (d, 1H, C(3)H, 3J = 5,2 Hz), 8,07 (s,

1H, C(5)H), 8,60 (d, 1H, C(2)H, 3J = 5,2 Hz). 13C-NMR (DMSO-d6): δ = 3,5 (C10 und C11), 29,9 (C9), 51,6 (C8), 119,4 (C5), 119,8 (C3), 140,4

(C4), 149,4 (C2), 153,0 (C6), 158,5 (C7).

MIR (ṽ): 3249 (s, vN-H), 1617 (s, νC=N) cm−1.


1-[4-(1H-Tetrazol-5-yl)pyridin-2-yl]-N-[3-(trifluormethyl)benzyl]methanamin (CIV)

Die Synthese erfolgt analog zu N-{[4-(1H-Tetrazol-5-yl)pyridin-2-yl]methyl}cyclopropanamin

(CIII) mit folgenden Änderungen: 4-(1-Benzyl-1H-tetrazol-5-yl)picolinaldehyd (CI) (250 mg,

0,9 mmol) wird mit 260 µL 3-(Trifluormethyl)benzylamin (2,0 Äq., 1,8 mmol) in 20 mL Methanol

für 3 h unter Rückfluss erhitzt. Im Eisbad wird das Azomethin anschließend mit 140 mg NaBH4,



welches suspendiert in 5 mL Wasser vorliegt, reduziert. Es folgt eine Flüssig-Flüssig-Extraktion

mit Ethylacetat und NaHCO3-Lösung, wobei die erhaltenen organischen Phasen nach Trocknen

über Na2SO4 im Teilvakuum eingeengt werden. Der Überstand wird in etwa 50 mL Methanol

aufgenommen und mit 300 mg Pd/C (10 %, wassernass) versetzt. Nach Evakuieren der

Glasapparatur wird mit Wasserstoff geflutet und bei Raumtemperatur für 4 h unter Wasserstoff-

Atmosphäre gerührt. Anschließend wird über Kieselgur abfiltriert, das Lösungsmittel entfernt

und der ölige Rückstand mit Diethylether kristallisiert. Die abschließende Aufreinigung erfolgt

mittels präparativer HPLC (gelöst in Methanol; A: H2O und B: MeOH, isokratisch, 50 % B) und

anschließender Lyophilisation.



Ausbeute: 46 %. 1H-NMR (DMSO-d6): δ = 4,36 (s, 2H, C(9)H2), 4,39 (s, 2H, C(8)H2), 7,68 (t, 1H, C(14)H,

3J = 7,6 Hz), 7,78 (d, 1H, C(13)H, 3J = 8,0 Hz), 7,83 (d, 1H, C(15)H, 3J = 8,0 Hz), 7,93 (d, 1H,

C(3)H, 3J = 5,2 Hz), 7,96 (s, 1H, C(11)H), 8,07 (s, 1H, C(5)H), 8,62 (d, 1H, C(2)H, 3J = 5,2 Hz),

9,39 (s, 1H, N(17)H). 13C-NMR (DMSO-d6): δ = 49,8 (C9), 50,7 (C8), 119,5 (C5), 119,9 (C3), 122,7 und 125,4

(1JC,F = 270 Hz, C16), 125,5 (3JC,F = 4 Hz, C13), 126,9 (3JC,F = 4 Hz, C11), 129,2 (2JC,F = 32 Hz,

C12), 129,6 (C14), 133,8 (C10), 134,3 (C15), 140,4 (C4), 149,4 (C2), 152,8 (C6), 158,6 (C7).

MIR (ṽ): 1615 (s, νC=N) cm−1.

HRMS (ESI, m/z), berechnet [C15H13N6F3 + H]+: 334,1154; gefunden: 334,1156.

4-⟨2-{[(4-(1H-Tetrazol-5-yl)pyridin-2-yl)methyl]amino}ethyl⟩phenol (CV)

Die Synthese erfolgt analog zu N-{[4-(1H-Tetrazol-5-yl)pyridin-2-yl]methyl}cyclopropanamin

(CIII) mit folgenden Änderungen: 4-(1-Benzyl-1H-tetrazol-5-yl)picolinaldehyd (CI) (350 mg,

1,3 mmol) wird mit 360 mg Tyramin (2,0 Äq., 2,6 mmol) in 20 mL Methanol für 2,5 h unter

Rückfluss erhitzt. Im Eisbad wird das Azomethin anschließend mit 210 mg NaBH4, vorliegend

als Suspension in 5 mL Wasser, reduziert. Es folgt eine Flüssig-Flüssig-Extraktion mit

Ethylacetat und NaHCO3, wobei die erhaltenen organischen Phasen nach Trocknen über



Na2SO4 im Teilvakuum eingeengt werden. Der Überstand wird in etwa 50 mL Methanol

aufgenommen und mit 300 mg Pd/C (10 %, wassernass) versetzt. Nach Evakuieren der

Glasapparatur wird mit Wasserstoff geflutet und bei Raumtemperatur für 4,5 h unter

Wasserstoff-Atmosphäre gerührt. Anschließend wird über Kieselgur abfiltriert, das

Lösungsmittel entfernt und der Rückstand in wenig Ethanol aufgenommen, um aus dieser

Lösung das Zielprodukt mit Hilfe von Aceton/Diethylether (30:70, v/v) zu fällen. Das gewünschte

Produkt wird abfiltriert und abschließend mit wenig Isopropanol und reichlich Aceton

gewaschen.

Beschaffenheit: Leicht bräunlicher amorpher Feststoff.


Ausbeute: 54 %. 1H-NMR (DMSO-d6): δ = 2,86 (t, 2H, C(10)H2, 3J = 7,6 Hz), 3,16 (t, 2H, C(9)H2, 3J = 7,6 Hz),

4,37 (s, 2H, C(8)H2), 6,72 (d, 2H, 2×C(13)H, 3J = 8,4 Hz), 7,04 (d, 2H, 2×C(12)H, 3J = 8,4 Hz),

7,92 (d, 1H, C(3)H, 3J = 5,2 Hz), 8,05 (s, 1H, C(5)H), 8,60 (d, 1H, C(2)H, 3J = 5,2 Hz), 8,83 (s,

1H, N(16)H), 9,38 (s, 1H, O(15)H). 13C-NMR (DMSO-d6): δ = 31,1 (C10), 48,6 (C9), 50,9 (C8), 115,4 (2×C13), 119,3 (C5), 119,8

(C3), 127,3 (C11), 129,6 (2×C12), 140,5 (C4), 149,4 (C2), 153,1 (C6), 156,1 (C14), 158,7 (C7).

MIR (ṽ): 2957 (w, νC-H, aliphatisch), 1615 (s, νC=N) cm−1.


Pyridin-2,4-dicarbonitril (CVI)

Es werden 360 mg 2-Chlorisonicotinnitril (XXXIV) (2,6 mmol) in 13 mL NMP gelöst und mit

510 mg CuCN (2,2 Äq., 5,7 mmol) versetzt. Der Ansatz reagiert im Mikrowellenreaktor bei

240 °C für 30 min, wobei es zu einer ausgeprägten Schwarzfärbung kommt. Die

Reaktionslösung wird in ein Eisbad mit etwa 100 mL Wasser (+ wenige Tropfen NH3) gegossen

und mit Ethylacetat extrahiert. Nach Trocknen über Na2SO4 und Einengen der vereinigten

organischen Phasen im Teilvakuum wird der Überstand mittels Säulenchromatographie

aufgearbeitet (adsorbiert an Kieselgur (aus MeOH), LM: Petrolether/EtOAc, 80:20, v/v). Eine

abschließende Umkristallisation erfolgt aus n-Hexan mit wenig Diethylether.






C(2)H, 3J = 4,8 Hz). 13C-NMR (DMSO-d6): δ = 115,4 und 116,3 (C7 und C8), 121,3 (C4), 129,9 (C3), 130,8 (C5),

133,6 (C6), 152,3 (C2).

MIR (ṽ): 2246 (m, νC≡N) cm−1.

2,4-Di(1H-tetrazol-5-yl)pyridin (CVII)

Pyridin-2,4-dicarbonitril (CVI) (200 mg, 1,5 mmol) wird in 30 mL Toluen gelöst. Anschließend

werden 230 mg Natriumazid (2,3 Äq., 3,5 mmol) und 485 mg Triethylammoniumchlorid (2,3 Äq.,

3,5 mmol) hinzugegeben und der Reaktionsansatz für etwa 24 h bei 105 °C gerührt. Nach

Abkühlen des Reaktionsgemisches auf Raumtemperatur wird das Lösungsmittel im Teilvakuum

entfernt, der Überstand mit wässriger Natronlauge aufgenommen und einmal mit Ethylacetat

gewaschen. Anschließend wird die wässrige Phase im Eisbad mit konzentrierter Salzsäure

angesäuert und die entstandene Suspension für etwa 15 min weitergerührt. Nach Abfiltrieren

des Zielprodukts wird dieses mit Hilfe der präparativen HPLC aufgereinigt (gelöst in

MeOH/DMSO, 50:50, v/v; A: H2O mit 0,1 % Essigsäure und B: ACN, isokratisch, 15 % B).




C(2)H, 3J = 4,8 Hz). 13C-NMR (DMSO-d6): δ = 119,4 (C3), 122,8 (C5), 134,1 (C4), 145,0 (C6), 151,5 (C2), 154,6 und

155,1 (C7 und C8).

MIR (ṽ): 1619 (s, νC=N) cm−1.




2-Chlorisonicotinsäure (CVIII)

Für die Synthese werden 2,8 g 2-Chlorisonicotinnitril (XXXIV) (20 mmol) in 20 mL Ethanol gelöst

und mit 2,4 g NaOH (3 Äq., 60 mmol) in 10 mL Wasser versetzt. Die Lösung reagiert 3 h unter

Rückfluss, wobei die Reaktion dann beendet ist, wenn kein Ammoniakgeruch mehr

wahrgenommen werden kann. Anschließend wird das Lösungsmittel im Teilvakuum entfernt

und der resultierende Überstand ausgiebig mit Ethylacetat gewaschen. Das Zielprodukt wird in

Wasser aufgenommen, mit Salzsäure gefällt und anschließend abfiltriert. Wenn nötig, kann die

Substanz aus Wasser umkristallisiert werden.



Ausbeute: 64 %. 1H-NMR (DMSO-d6): δ = 7,83 (d, 2H, C(3)H und C(5)H, 3J = 4,8 Hz), 8,61 (s, 1H, C(2)H,

3J = 4,8 Hz), 14,01 (s, 1H, C(7)OOH). 13C-NMR (DMSO-d6): δ = 122,2 (C5), 123,5 (C3), 141,8 (C4), 151,1 (C2 und C6), 164,8 (C7).

MIR (ṽ): 1707 (s, vC=O), 1367 (s, νC-Cl) cm−1.

2-[(2-Aminoethyl)amino]isonicotinsäure-Hydrochlorid (CIX)

2-Chlorisonicotinsäure (CVIII) (1,4 g, 8,9 mmol) wird mit 5,9 mL Ethylendiamin (10 Äq.,

89 mmol) im Mikrowellenreaktor für 60 min bei 180 °C erhitzt. Anschließend wird im

Feinvakuum bei 70 °C überschüssiges Amin entfernt, der Überstand mit verdünnter Salzsäure

bis zur sauren Reaktion aufgenommen und am Rotationsverdampfer wieder eingeengt. Der so

erhaltene Feststoff wird mit reichlich Methanol digeriert, die Suspension filtriert und das

Zielprodukt-enthaltende Filtrat erneut im Teilvakuum eingeengt. Dem Rohprodukt werden etwa

15 mL Salzsäure (25 %ig) zugesetzt und auf Grund eventuell eingetretener Amidbildung wird

der Ansatz für 3 h unter Rückfluss erhitzt. Die Menge des Lösungsmittels wird in der Folge auf

etwa die Hälfte reduziert und der Ansatz über Nacht im Kühlschrank gelagert, wobei das



Zielprodukt aus der noch stark sauren Lösung auskristallisiert. Der Feststoff wird abfiltriert und

mit einer Mischung aus Tetrahydrofuran und Diethylether (50:50, v/v) mehrmals gewaschen.



Ausbeute: 72 %. 1H-NMR (D2O): δ = 3,28 (t, 2H, C(9)H2, 3J = 6,4 Hz), 3,75 (t, 2H, C(8)H2, 3J = 6,0 Hz), 7,27 (d,

1H, C(3)H, 3J = 6,4 Hz), 7,53 (s, 1H, C(5)H), 7,90 (d, 1H, C(2)H, 3J = 6,8 Hz). 13C-NMR (D2O): δ = 37,6 (C9), 39,5 (C8), 112,1 (C5 und C3), 136,4 (C2), 145,8 (C4), 153,3

(C6), 166,6 (C7).

MIR (ṽ): 3348 (m, νN-H), 1727 (s, vC=O) cm−1.


2-{[2-(Methylsulfonamido)ethyl]amino}isonicotinsäure (CX)

2-[(2-Aminoethyl)amino]isonicotinsäure-Hydrochlorid (CIX) (400 mg, 1,8 mmol) wird in 10 mL

Acetonitril suspendiert. Dazu wird so viel verdünnte Natronlauge gegeben, bis eine klare Lösung

entsteht. Dem Ansatz werden unter Eiskühlung 420 µL Methansulfonylchlorid (3 Äq., 5,4 mmol)

hinzugefügt und anschließend bei Raumtemperatur für 20 h gerührt. Das Lösungsmittel wird

dann im Teilvakuum entfernt und der Überstand chromatographisch aufgearbeitet (adsorbiert

an Kieselgur (aus ammoniakalischem Methanol), LM: EtOAc/MeOH/Ammoniak, 60:40:1, v/v/v).

Die Zielfraktionen werden vom Laufmittel befreit und anschließend aus wässrigem Ethanol

(EtOH/Wasser, 95:5, v/v) umkristallisiert. Abschließend wird das Zielprodukt mittels präparativer

HPLC gereinigt (gelöst in Wasser; A: H2O mit 0,1 % Essigsäure und B: MeOH, isokratisch, 10 %

B) und lyophilisiert.



Ausbeute: 29 %. 1H-NMR (DMSO-d6): δ = 2,89 (s, 3H, C(10)H3), 3,10 (t, 2H, C(9)H2, 3J = 6,4 Hz), 3,39 (t, 2H,

C(8)H2, 3J = 6,4 Hz), 6,88 (d, 1H, C(3)H, 3J = 5,6 Hz), 6,97 (m, 2H, C(5)H und N(12)H), 7,09 (d,

1H, C(2)H, 3J = 6,0 Hz), 8,10 (s, 1H, N(11)H), 13,25 (s, 1H, C(7)OOH).




148,4 (C4), 159,1 (C6), 166,7 (C7).

MIR (ṽ): 3156 (m, vN-H), 1677 (s, vC=O) cm−1.


2-[(3-Hydroxypropyl)amino]isonicotinsäure (CXI)

Es werden 1,0 g 2-Chlorisonicotinsäure (CVIII) (7,2 mmol) mit 10 mL 3-Aminopropan-1-ol

(18 Äq., 130 mmol) im Rundkolben für 22 h bei 120 °C erhitzt. Anschließend wird der Ansatz

mit 50 mL Wasser und 25 mL konzentrierter Salzsäure verdünnt (bis etwa pH 1-2) und während

Erhitzen unter Rückfluss für weitere 16 h gerührt. Das Gesamtvolumen wird dann im Teilvakuum

auf etwa ein Viertel des Ausgangswertes reduziert und der Ansatz bei 5 °C zur Kristallisation

belassen. Nach 12 h wird das Rohprodukt abfiltriert und mit Tetrahydrofuran nachgewaschen.

Die abschließende Aufreinigung erfolgt mittels präparativer HPLC (gelöst in Wasser; A: H2O und

B: MeOH, isokratisch, 30 % B) und Lyophilisation.



Ausbeute: 26 %. 1H-NMR (DMSO-d6): δ = 1,73 (m, 2H, C(9)H2, 3J = 6,4 Hz), 3,39 (s, 2H, C(8)H2), 3,50 (t, 2H,

C(10)H2, 3J = 6,4 Hz), 6,96 (d, 1H, C(3)H, 3J = 5,6 Hz), 7,28 (s, 1H, C(5)H), 8,02 (d, 1H, C(2)H, 3J = 5,6 Hz), 8,14 (s, 1H, N(11)H). 13C-NMR (DMSO-d6): δ = 31,5 (C9), 38,6 (C8), 58,1 (C10), 109,8 (C5), 111,7 (C3), 140,8 (C4),

142,4 (C2), 156,3 (C6), 165,5 (C7).

MIR (ṽ): 3240 (m, νO-H), 3182 (m, νN-H), 1713 (s, vC=O) cm−1.



Beschreibung der validierten SFC-MS-Methode | 195

4.4 Beschreibung der validierten SFC-MS-Methode

Die nachfolgenden Arbeitsanweisungen beziehen sich auf die optimierte und validierte SFC-

MS-Methode für die Trennung von rac-Ketamin, rac-Norketamin, rac-Norketamin-d4, rac-

Dehydronorketamin und rac-6-Hydroxynorketamin aus humanem Urin.

4.4.1 Probenvorbereitung

Eingefrorene Proben (−80 °C) oder tiefgekühlte Stammlösungen in Methanol (−21 °C, 1 g/mL

oder 100 µg/mL) werden langsam bei Raumtemperatur aufgetaut. Zu 1 mL Probe werden 10 µL

NK-d4 (Gesamtkonzentration 1 µg/mL), 750 µL Natriumcarbonat-Lösung (gesättigte Lösung

1 zu 1 mit Wasser verdünnt) und 4 mL MTBE gegeben. Nach dem automatisierten

Ausschüttelvorgang von 15 min und anschließendem fünfminütigen Abzentrifugieren bei

3200×g, wird die organische Phase abgenommen und im Stickstoff-Strom bei Raumtemperatur

abgedampft. Die Rekonstitution des Überstandes erfolgt in 100 µL Methanol.

Für die Kalibiergerade werden pro Messtag 6 Punkte gewählt (5, 10, 25, 50, 100 und 200 ng/mL,

Stammlösungen in Methanol). Die Proben werden wie oben beschrieben hergestellt, mit dem

Unterschied, dass statt 1 mL Probandenurin 1 mL eines Ketamin-unbelasteten Urins (zur

Verfügung gestellt von Labormitarbeitern) mitsamt zugesetzter Stammlösung verwendet wird.

Zur Überprüfung der Messungen eines Tages sollen weiterhin Qualitätskontrollen hergestellt

werden, welche mindestens drei verschiedene Konzentrationen (gemessen als Duplikat) oder

mindestens 5 % der Gesamtanzahl der Proben repräsentieren und den gesamten Messbereich

abdecken (z. B. 15, 100 und 200 ng/mL). Die Herstellung erfolgt auch hier analog den

Probanden- bzw. Kalibrierproben.

4.4.2 Säulenauswahl

Für die Methode wird die Säule Phenomenex Lux Amylose-2 (150×4,6 mm, 5 µm) verwendet.

Diese wird von einer Vorsäule (gleiches Material, 4×3,0 mm, 5 µm), eingespannt im

SecurityGuard System von Phenomenex, geschützt.


196 | Beschreibung der validierten SFC-MS-Methode

4.4.3 Chromatographische Parameter

Gerät Parameter Wert Pumpen Mob. Phase (A):

CO2 0–7 min → 8 %B 7,01–7,25 min → auf 20 %B 7,26–11 min → 20 %B 11,01–11,25 min → auf 8 %B 11,26–15 min → 8 %B

Mob. Phase (B): Isopropanol + 0,075 % NH3

Flussrate (A+B) 3,0 mL/min Mob. Phase (C): Methanol + 0,1 % HCOOH

0–15 min → 0,3 mL/min

Autosampler Temperatur 6 °C Injektionsvolumen 5 µL Säulenofen Temperatur 30 °C Rückdruckregulator A Temperatur 50 °C Druck 150 bar Rückdruckregulator B Temperatur 50 °C Druck 400 bar

4.4.4 MS-Parameter

Parameter Wert ESI Positiver Modus, SIM [M + H]+ 222, 224, 228, 238, 240 Event Time 0,05 sec Interface Voltage 4,5 kV Nebulizing-Gas 1,5 L/min Drying-Gas 12 L/min Interface-Temperatur 350 °C Heat-Block-Temperatur 300 °C Desolvation-Line-Temperatur 250 °C

4.4.5 Mathematische Prüfung auf Linearität358

Nach dem optischen Abgleich der linearen und quadratischen Regression gegeneinander und

dem Vergleich des Bestimmheitsmaßes R² für beide Arten der Kalibration, dient der

Linearitätstest nach Mandel der Abschätzung des richtigeren mathematischen Modells. Es wird

geprüft, ob die Regression 2. Ordnung (quadratisch) signifikant besser zutrifft als die Regression

1. Ordnung (linear). Zur Prüfung werden die jeweiligen Quadrate der Reststandardabweichung

aus linearer und quadratischer Regression hinzugezogen.

Im ersten Schritt werden dafür alle erforderlichen Variablen für den Regressionstyp 1. Ordnung � = � ∗ � + � und 2. Ordnung � = � ∗ �� + ∗ � + � bestimmt. Mit Hilfe dieser Regressionen

können dann die Residuen (entspricht dem vertikalen Abstand eines gemessenen Punktes von

der errechneten Geraden bzw. Kurve) wie folgt berechnet werden:



�� = �� − �� = Residuen �� = Messsignal an i-ter Stelle �� = der zu �� passende berechnete Wert aus der Regressionsfunktion

Die Standardabweichung der Residuen für eine Regression wird als Reststandardabweichung

sy bezeichnet. Diese Reststandardabweichungen können an dieser Stelle (für Funktion 1. und

2. Ordnung) bereits miteinander verglichen werden. Kleinere Werte geben an, dass die

Streuung der Messwerte um die Regressionsgerade bzw. um die Kurve kleiner und damit auch

geeigneter zur Beschreibung des Verhältnisses von Messsignal zur Analytenkonzentration ist.

Die Reststandardabweichungen werden wie folgt berechnet:

�� = 1� − 2"(��$��)²'�(�

für lineare Regressionen oder

��) = 1� − 3"(��$��)²'�(�

für quadratische Regressionen.

Wird hierbei herausgefunden, dass die Reststandardabweichung der linearen Regression

größer ist als die der quadratischen Regression, so sollte eine Funktion 2. Ordnung gewählt

werden.

Um eine mathematische Signifikanz nachzuweisen, kann der Prüfwert PW ermittelt werden.

Vorher ist jedoch die Differenz der Abweichungsvarianzen DS² zu ermitteln:

*+� = (� − 2) ∗ �� − (� − 3) ∗ ��)² �, = *+²��)²

Der erhaltene Prüfwert wird mit dem zutreffenden Wert aus einer F-verteilten Tabelle verglichen

(� = 99%, �� = 1, �� = � − 3). Für den Fall PW < F-Wert gilt, dass der Unterschied der linearen

Regression gegenüber der quadratischen nicht signifikant ist. Hierbei sollte das lineare Modell

verwendet werden. Im umgekehrten Fall PW > F-Wert gilt, dass die quadratische Regression

der linearen signifikant überlegen ist. Hierbei besteht keine direkte Proportionalität zwischen

Messsignal und Analytenkonzentration.


4.4.6 Sonstige experimentelle Daten

Zurückgerechnete Werte aus den Kalibrierläufen der Validierung der SFC-MS-Methode

Norketamine En1

(back calculated concentrations of the calibration standards, ng/mL)

Cal. Stand. (ng/mL)

K1 K2 K3 K4 K5

Mean (ng/mL) SD (ng/mL) Prec. (%) Acc. (%)

5 5,180 5,647 4,393 5,022 5,600 5,168 0,509 9,9 3,4 10 9,345 10,861 9,038 9,929 10,683 9,971 0,800 8,0 –0,3 25 24,349 24,984 27,505 24,958 24,574 25,274 1,275 5,0 1,1 50 52,129 45,437 51,049 50,472 47,709 49,359 2,733 5,5 –1,3 100 98,808 103,408 98,467 99,682 101,874 100,448 2,121 2,1 0,4 200 200,173 199,366 200,266 200,051 199,664 199,904 0,378 0,2 –0,1

Norketamine En2


Cal. Stand. (ng/mL)

K1 K2 K3 K4 K5 Mean (ng/mL) SD (ng/mL) Prec. (%) Acc. (%)

5 4,764 5,498 4,657 5,248 5,329 5,099 0,368 7,2 2,0 10 10,301 10,252 8,884 10,128 10,866 10,086 0,730 7,2 0,9 25 23,721 24,814 27,041 24,546 24,518 24,928 1,250 5,0 –0,3 50 56,789 48,731 51,773 49,377 49,675 51,269 3,290 6,4 2,5 100 96,091 100,934 98,134 100,605 100,433 99,239 2,079 2,1 –0,8 200 200,471 199,85 200,312 199,895 199,914 200,088 0,283 0,1 0,1


2S,6S-Hydroxynorketamine


Cal. Stand. (ng/mL)


5 5,185 5,698 5,784 4,799 5,612 5,416 0,415 7,7 8,3 10 8,909 10,375 8,345 8,390 11,177 9,439 1,272 13,5 –5,6 25 24,203 28,717 23,923 27,152 24,703 25,740 2,097 8,1 3,0 50 50,649 54,896 51,875 53,201 47,540 51,632 2,779 5,4 3,3 100 99,998 96,019 99,207 97,511 101,788 98,905 2,229 2,3 –1,1 200 199,980 200,505 200,131 200,327 199,728 200,134 0,301 0,2 0,1

2R,6R-Hydroxynorketamine


Cal. Stand. (ng/mL)


5 6,503 5,740 5,429 6,121 6,052 5,969 0,406 6,8 19,4 10 9,963 7,588 8,577 9,398 11,131 9,331 1,346 14,4 –6,7 25 21,673 28,043 24,201 29,194 23,778 25,378 3,136 12,4 1,5 50 48,600 63,663 51,780 54,355 47,675 53,215 6,413 12,1 6,4 100 102,383 90,157 99,106 96,116 102,416 98,036 5,123 5,2 –2,0 200 199,532 200,948 200,189 200,522 199,455 200,129 0,640 0,3 0,1


R-Ketamine


Cal. Stand. (ng/mL)


5 4,688 5,373 4,947 4,429 5,316 4,951 0,404 8,2 –1,0 10 9,635 10,330 8,940 10,007 10,168 9,816 0,553 5,6 –1,8 25 26,042 24,474 27,610 24,466 25,579 25,634 1,302 5,1 2,5 50 47,654 47,637 47,672 53,078 47,492 48,707 2,445 5,0 –2,6 100 101,290 101,865 100,729 98,022 101,426 100,666 1,533 1,5 0,7 200 199,810 199,689 199,932 200,305 199,813 199,910 0,237 0,1 0,0

S-Ketamine


Cal. Stand. (ng/mL)


5 4,980 4,630 4,521 4,412 5,549 4,818 0,461 9,6 –3,6 10 9,923 10,323 9,523 9,764 9,643 9,835 0,310 3,2 –1,6 25 26,456 24,204 28,709 24,272 23,208 25,370 2,212 8,7 1,5 50 54,580 52,954 56,207 53,873 49,698 53,462 2,418 4,5 6,9 100 96,465 97,975 94,956 97,507 101,098 97,600 2,273 2,3 –2,4 200 200,542 200,400 200,685 200,450 199,689 200,353 0,387 0,2 0,2


Dehydronorketamine En1


Cal. Stand. (ng/mL)


5 3,811 6,048 5,758 5,266 5,344 5,245 0,862 16,4 4,9 10 8,997 10,740 8,660 10,141 10,860 9,880 1,005 10,2 –1,2 25 25,165 26,546 25,567 25,715 24,665 25,532 0,698 2,7 2,1 50 57,101 42,899 47,392 47,853 48,637 48,776 5,163 10,6 –2,4 100 95,405 104,210 101,815 101,172 101,045 100,729 3,238 3,2 0,7 200 200,609 199,396 199,705 199,842 199,841 199,879 0,447 0,2 –0,1

Dehydronorketamine En2


Cal. Stand. (ng/mL)


5 4,139 6,612 5,919 5,185 5,675 5,506 0,921 16,7 10,1 10 9,877 10,951 9,621 9,806 11,259 10,303 0,746 7,2 3,0 25 26,298 24,374 24,503 26,397 23,412 24,997 1,304 5,2 0,0 50 55,482 43,151 46,556 48,174 48,967 48,466 4,513 9,3 –3,1 100 96,484 104,621 102,898 100,748 101,385 101,227 3,044 3,0 1,2 200 200,404 199,338 199,447 199,913 199,735 199,767 0,423 0,2 –0,1

K1-K5: calibration day 1-5

Cal. Stand.: calibration standard concentration

SD: standard deviation

Prec.: precision (coefficient of variation, standard deviation/Mean×100)

Acc.: accuracy (relative error, (measured concentration–spiked concentration)/spiked concentration×100)

Literaturverzeichnis

202 | Literatur

5 Literaturverzeichnis

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Eigenständigkeitserklärung

Eigenständigkeitserklärung | 225

Eigenständigkeitserklärung

Hiermit erkläre ich, dass diese Arbeit bisher von mir weder an der Mathematisch-

Naturwissenschaftlichen Fakultät der Universität Greifswald noch einer anderen

wissenschaftlichen Einrichtung zum Zwecke der Promotion eingereicht wurde.

Ferner erkläre ich, dass ich diese Arbeit selbstständig verfasst und keine anderen als die

darin angegebenen Hilfsmittel und Hilfen benutzt und keine Textabschnitte eines Dritten

ohne Kennzeichnung übernommen habe.

Unterschrift des Promovenden

Tabellarischer Lebenslauf

226 | Lebenslauf

Tabellarischer Lebenslauf

Hinweis: Der Lebenslauf wurde aus der elektronischen Version der Arbeit entfernt.

Eigene Publikationen, Poster und Vorträge

Publikationsliste | 227


Peer-Review-Artikel

Robert Hofstetter, Georg M. Fassauer and Andreas Link, Supercritical fluid extraction (SFE)

of ketamine metabolites from dried urine and on-line quantification by supercritical fluid

chromatography and single mass detection (on-line SFE–SFC–MS), Journal of

Chromatography B 2018, 1076, 77-83.

Georg M. Fassauer, Robert Hofstetter, Mahmoud Hasan, Stefan Oswald, Christina Modeß,

Werner Siegmund and Andreas Link, Ketamine metabolites with antidepressant effects:

Fast, economical, and eco-friendly enantioselective separation based on supercritical-fluid

chromatography (SFC) and single quadrupole MS detection, Journal of Pharmaceutical and

Biomedical Analysis 2017, 146, 410-419.

Mahmoud Hasan, Robert Hofstetter, Georg M. Fassauer, Andreas Link, Werner Siegmund

and Stefan Oswald, Quantitative chiral and achiral determination of ketamine and its

metabolites by LC–MS/MS in human serum, urine and fecal samples, Journal of

Pharmaceutical and Biomedical Analysis 2017, 139, 87-97.

Nicole Rüger, Georg Michael Fassauer, Christian Bock, Thomas Emmrich, Anja Bodtke and

Andreas Link, Substituted tetrazoles as multipurpose screening compounds, Molecular

Diversity 2017, 21, 9-27.

Corina Pfeifer, Sylvia Noll, Hagen Gerecke, Georg Fassauer, Thomas Jira, Yvonne

Remane, Jan Vogel, Roberto Frontini and Robert Reinhardt, A stability study of

amphotericin B, colistin and tobramycin in a hydrophilic suspension commonly used for

selective decontamination of the digestive tract by HPLC and in vitro potency

measurements, European Journal of Hospital Pharmacy 2017, 24, 235-241.

Corina Pfeifer, Georg Fassauer, Hagen Gerecke, Thomas Jira, Yvonne Remane, Roberto

Frontini, Jonathan Byrne and Robert Reinhardt, Purity determination of amphotericin B,

colistin sulfate and tobramycin sulfate in a hydrophilic suspension by HPLC, Journal of

Chromatography B 2015, 990, 7-14.


228 | Publikationsliste

Nicht-Peer-Review-Artikel

G. M. Fassauer and R. K. Hofstetter, Determination and quantification of ketamine and its

metabolites by means of supercritical-fluid chromatography and single quadrupole MS

detection, Shimadzu Application News 2018, No. SCA_190_038.

Vorträge

Georg M. Fassauer, A Comparative View of the Separation and Quantification of Ketamine

Metabolites Highlighting the Advantages of a Novel SFC-MS Method in Contrast to

Established LC-MS/MS Methods, 32nd International Symposium on Chromatography 2018,

Cannes, Frankreich (Accepted oral presentation).

Georg M. Fassauer, Substituted Tetrazoles as Multipurpose Screening Compounds,

Departmental Seminar Max Delbrück House 2017, Max-Delbrück-Centrum für Molekulare

Medizin, Berlin-Buch.

Poster

G. M. Fassauer, R. K. Hofstetter and A. Link, Ketamine metabolites with antidepressant

effects: fast, economical, and eco-friendly enantioselective separation based on SFC and

single quadrupole MS detection, DPhG Annual Meeting 2017, Saarbrücken.

Danksagung

Danksagung | 229

Danksagung

Als erstes möchte ich mich bei Prof. Dr. Andreas Link für die Aufnahme in seinen

Arbeitskreis, die Betreuung und jede Art von Unterstützung bedanken.

Dem NCATS des NIH, Division of Preclinical Innovation, aus Rockville, MD, USA,

insbesondere Patrick Morris, Ph.D., gilt mein Dank für die großzügige Überlassung

synthetisch hergestellter Ketaminmetaboliten, die nicht kommerziell verfügbar aber für

diese Arbeit von großer Bedeutung waren.

Mein Dank gilt ferner Sandra Wenzler, Dr. Martin Roatsch sowie allen beteiligten

Mitarbeitern aus dem Arbeitskreis von Prof. Dr. Manfred Jung der Albert-Ludwigs-

Universität Freiburg für die Durchführung der biologischen Testungen. Bei Drs. Piotr

Malecki und Manfred Weiss vom Helmholtz-Zentrum Berlin möchte ich mich für die

Bereitstellung von Röntgenkristallstrukturen und ITC-Daten herzlichst bedanken.

Auch Master-Student Patrik Zeyen hat mit seiner tatkräftigen Unterstützung und seinen

intensiven Internetrecherchen zum Erfolg dieser Arbeit beigetragen, wofür ich mich gerne

bei ihm bedanken möchte.

Für die Bearbeitung und Fertigstellung jeglicher NMR-, IR- oder HRMS-Anfragen möchte

ich mich bei Dr. Anja Bodtke, Maria Hühr und Michael Eccius bedanken. Sylvia Ewert und

Ruth Ball danke ich für die Bereitstellung und Organisation von Laborverbrauchsmaterial,

Glasgeräten und Chemikalien.

Meinen Kollegen im Praktikum der organischen Chemie PD Dr. Gregor Radau, Dr. Anja

Bodtke, Christoph Grathwol, Christian Bock und Dr. Christian Lemmerhirt danke ich für die

Kooperationsbereitschaft und angenehme Atmosphäre. Vielen Dank an alle Weggefährten

meiner Doktorandenzeit aus den Arbeitskreisen Link und Bednarski: Steffen Vojacek,

Christian Bock, Rupert Hofstetter, Christoph Grathwol, Abdrrahman Surur, Nicole Rüger,

Lukas Schulig, Stefan Lohmann, Dr. Thomas Emmrich, Drs. Heidi und Christian

Lemmerhirt, Dr. Steven Behnisch, Carsten Lange, Patrick Werth, Kristin Beirow und Lisa

Wolff, sowie alle Diplomanden und Wahlpflichtstudenten aus den Arbeitskreisen. Danke für

die Unterstützung und Gesellschaft innerhalb und außerhalb der Arbeitszeiten. Vielen Dank

dabei auch an alle Mitglieder der unterhaltsamen und konstruktiven Kaffeepausen.

Drs. Simon Merdivan und Mahmoud Hasan möchte ich ferner für die wertvollen Hinweise

rund um die HPLC danken. Erik Wollmer und Steffen Vojacek gebührt als immerwährende

Motivationsstütze an dieser Stelle noch ein besonderes Dankeschön. Des Weiteren möchte

ich mich bei den Korrekturlesern des Manuskripts PD Dr. Gregor Radau, Prof. Dr. Thomas

Jira und meinen Eltern bedanken.

Meinen Eltern, Großeltern und meiner Freundin Berit gilt ebenso ein herzlichstes

Dankeschön. Nicht nur für die Unterstützung während der Promotion, sondern auch auf den

vorherigen und zukünftigen Lebensabschnitten.

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