I PENUNTUNPRAKTIKUMBIOREMEDIASI MOHAMAD YANI JURUSAN TEKNOLOGIINDUSTRI PERTANIAN FAKULTAS TEKNOLOGIPERTANIAN INSTITUT PERTANIANBOGOR 2002 , \ DAFTAR 151 Halaman I.PENDAHULUAN....................................... ... ......... .............. .....1-1 1.1. BIOREMEDIASI.................................................................... 1-1 1.2. BIODEGRAD!ISIPOLUTAN ORGANIK ..................................... 1-2 i 1.3. JENIS POLUl a.NORGANIK................................................... 1-3 1.4.lINGKUP PEllELITIAN BIOREMEDIASI.................................. 1-4 II.ISOLASI,KARAK1ERISASIDANIDENTIFIKASI MIKROBA POTENSIAL DARILOKASI TERKONTAMINASI.................................................2-1 2.1.ISOLASI MIKROBA ........................ '"...... ... ......... ......... ........2-1 2.2.PENGAWETAN MIKROBA ....................................................2-3 2.3.PENGUJIANISOLAT........................... .................................2-3 2.4.PERTUMBUHANISOLAT ......................................................2-6 ~ 2.5.IDENTIFIKASIISOLAT .........................................................2-8 III.PROTOKOL UNTUK MENENTUKAN KINETIKA BIOAVAILABILITAS DANBIODEGRADASIPOLUTAN ORGANIK TANAHDALAM SISTEM TANAH UNTUK MENINGKATKAN BIOREMEDIASI TANAH YANG TERPOLUSI........................ ............ ...... ...... ...... ...... ......... .......3-1 3.1.PENDAHULUAN...... ...... ......... ......... ... ...... ......... ...............3-1 3.2.BAHAN............................................................................3-6 3.3.METODE......... ...... .......................................... .... ........ ....3-9 3.4.CATATAN........................................................................3-15 IV.PENGUJIANBIODEGRADASI MINYAK BUMI............... ........ ........4-1 4.1.PENGUJIAN BIODEGRADASILIMBAH MINYAK BUMI DAtAM AIR .................................................................................4-1 4.2.PENENTUAN MINYAK DALAM AIR SECARA GRAVIMETRI.....4-3 IV.SIMULASIPENGUJIAN TREATABILITAS LABORATORIUM UNTUK MEMPERKIRAKAN KESIAPANLAHAN.......................................5-1 ii 5.1.EVALUASI TRETABILITAS .............................................. .5-1 5.2.METODA PENGUJIAN TREATABILITAS.............................5-4 5.3.STUDIKASUS TENTANGUJITREATABILITASKHUSUS......5-7 5.4.STUDIKASUS TERHADAP EVALUASILABORATORIUM KOMPLEKS...............................................................5-13 LAMPIRAN - LAMPI RAN................................. '"............... ... ... ... .....L iii OAFTAR LAMPIRAN Lampiran1.Oaftar analisis contoh limbah minyak bumi dan batas regulasinya padaKep.04/Bapedall09/1995 dan metoda analisisnya................................................................L 1 Lampiran 2.Analisis Total Petroleum Hydrocarbon (TPH) dengan GC/FIOPIO (Modifikasi EPA 8015/8020)...... ... ...... ... ......... .........L2 1I Lampiran 3.Prosedur analisis C.N.dan P............ ...... .......................L3 Lampiran 4.Penghitungan bakteri pengurai hidrokarbon secara MPN.......L4 Lampiran 5.Peratuan tentang pengolahan minyak bumi (Kep.Bapedal) .. ...L5 iv KATA PENGANTAR PujisyukurpenulispanjatkankepadaAllahYangMahaKuasa,atassegala rahmatyangtelahdiberikansehinggapenulismampumenyelesaikanpenulisan penuntunpraktikumBioremediasi.Tujuanpenulisanpenuntuniniadalahuntuk membantumahasiswa dalam memahami teknologi bioremediasi dan menerapkan teori yang mereka peroleh dari kuliah untuk dicoba dilaboratorium dan lapangan. PadakesempataninipenulissampaikanterimakasihkepadaDr.Jr.Anas MiftahFauzi,M.Eng.danDr.Jr.NastitiSiswiIndrasti,sebagaipengajarmatakuliah bioremediasiyangtelahmemberikanarahandanmasukanmateripraktikum.Selain itu,terimakasihkepadaFaridaYulianti,STP.atasbantuannyadaJampengetikan materi dan pengeditan. Kritik dan saran perbaikan materi praktikum ini sangat diharapkan, dan semoga penuntunpraktikuminidapatmenambahwawasandanketerampifanmahasiswadan pembaca umumnya. Bogor,Nopember 2002 Penulis , I.PENDAHlILUAN 1.1.BIOREMEDIASI Bioremediasimerupakanbagiandaribioteknologilingkunganyang memanfaatkanprosesalamibiodegradasidenganmenggunakanaktivitas mikroba yangdapat memulihkanlahantanah,air dansedimendarikontaminasi terutamasenyawaorganik.Mikrobatelahdigunakanuntukmenghilangkan bahanorganikdanbahankimiaberacunlainnyadarilimbahdomestikdan keluaranindustriselamabeberapatahunterakhir.Halyang"baru"dari bioremediasiadalahpenanganancepatpadapengolahanlimbahsuatuindustri sejakbeberapadekadeini,danpenerimaannyasebagaisuatumetodayang efektif danekonomissebagaialternatif untukmembersihkantanah,permukaan air,dankontaminasiairtanahdengankandungansejumlahbahanberacun, sepertirekalsitrandankimia.Bioremediasimenjadipilihanteknologiuntuk pemulihan(remediasi) dari berbagailingkungan yangterkontaminasi.khususnya lahanyangterkontaminasihidrokarbondariminyakbumi(petroleum)(Cookson, 1995 dan Crawford dan Cravlford,1996). Bioremediasijugamenjadisuatubidangintensifuntukpenelitiandan pengembangandalamakademisi,pernerintahdanindustridibeberapanegara. Perkembanganini,sehagiandisebabkanperundanganbaru yangmensyaratkan perlindungan yang lebihketat terhadap lingkungan dan kewajiban membersihkan lahanyangterkontaminasi.Besarnyapendanaanantarapenelitiandasardan terapandalambioremediasiolehinstansipemerintahmaupunindustriswasta tetahmeningkatdalambeberapadekadeini.Hasilnyaberupakemajuanyang cepatpadapengembanganefektivitas,ekonomisdalamprosesmikrobial bioremediasi.Padapandanganyanglebihluas,terjadipeningkatanaktivitas dalambidangmikrobiologilingkungan,suatubidangilmuyangmencakup spektrumdisiplinyangmeliputiphisiologimikrobialdanekologi.kimiaorganik. biokimia,kimiaairdantanah,geologi.hidrologi,danteknik.Padapenelitian lingkungandiperguruantinggi.bioremediasimenjadiilmupengetahuanyang Juasdankompleksantaraaspekdasardanterapanyangmemerlukandan melibatkanmultidisiplindanmembutuhkansuatupusatpeneJitianbioremediasi tersendiri.Hal inimerupakan tantanganbagi parapenelitiuntuktetap mengikuti perkembanganyangcapatdaribioremediasi,khususnyaarahandiversitas 1-1 fingkungandankontaminan,sebagaimana anekapendekatanbioremediasiyang muncul dalam beberapa tahun terakhir. Hampirsebagianbesarkimiaorganikdanbeberapainorganikjuga merupakansubstratprosesenzimatismelaluiaktivitasmikroorganismehidup. Hampirseluruhpolutanlingkungandimasyarakatmajumeliputikimiadanaksi enzimyangbiasanyadisebutdenganistilahbiodegradasi.Biodegradasidapat meliputibanyakprosesdengankeluaranyangamatberbedadan konsekuensinya.Misalnya,polutanxenobiotikmungkindapatdimineralisasi, diubahmenjadiprodukoksidasisempurnasepertikarbondioksida,atau ditransformasikanmenjadisenyawalainyanglebihsederhanadantidak berbahayaatauberacun,terakumulasidalamtubuhmikroorganisma,atau terpolimerisasiatauterikatsecaraalamidalamtanah,sedimen,atauair.Lebih darisatuprosesmungkint e ~ a d iuntukpolutantunggalpadawaktuyang bersamaan.Phenomenaprosestersebutsangatberpengaruhterhadapsukses tidaknyapengolahanpolutanxenobiotikdalamteknologiprosesbioremediasi (Cookson,1995 dan Crawford dan Crawford,1996). 1.2.BIODEGRADASI POlUlAN ORGANIK Jenispolutanorganikyangdapatdibiodegradasidilaporkansebagai berikut (CrawforddanCrawford,1996):BlEX, minyak bumi,polisiklikaromatik hidrokarbon(PAH),PCB,senyawanitroaromatik,phenolberkhlor,senyawa alifatikterklorinasi,danmetal.Prinsipbiodegradasiminyakbumisecara sederhanaadalahsebagaiberikut.Limbahminyakbumiyangterdiridari berbagaijeniskomponenmulaiC4 - C40,didegradasiolehmikrobamenjadi senyawasederhanasepertiC02,asamorganicsederhana,biomass acell. Namundemikian,selaluterdapatsenyawa-senyawayangtidakdapat dibiodegradasi olehmikroba.Sekumpulanmikroba tertentuakanmendegradasi komponen minyak bumi secara berurutan dan berantai.Populasi yanghidup dan berkembang sesuai dengan keberadaan substrat yang tersedia padasuatu saat. Selainminyakbumi,pestisidamerupakanlimbahpotensialyangsulit didegradasi.Oegradasimikrobialterhadappestisidabukanmerupakan penemuanbaru,tetapitelahlamadikenal.Penelitianawalterhadapdegradasi pastisida dihadapkanpada kegagalanpadasaat dilakukanpengulanganaplikasi padatanahuntukmengontrolpestisidapertanian.Fenomenainimerupakan masalahyangdipertimbangkanolehindustripertanian,tetapimerupakan 1-2 keuntunganekologibagiparaahUdaninsinyurlingkungan.Pengulangan aplikasiinimenghasilkanpengembanganmirobialyangsacaraefektif menghasilkanpestis idayangaplikatif.Mekanismeyangpastiuntukadaptasi mikrobialterhadappastisidabelumdimengertLMekanismeinidapatberupa pertumbuhanpopulasiyangsederhanaatauterjadiperubahansecaragenetika. Mikroorganismedapatmemperolehmaterigenetikyangmenyandikan mekanismebiokimiapentingdalamhubungannyadengansubstratpotensial yangbaru.Alternatifnya,mikroorganismemungkinmenghasilkankomponen untukmenghilangkantoksisitas,sehinggalebihbaikbaginyadaripada menggunakannya sebagai sumber energi. Prinsip degradasi untuk pestisida, insektisida. dan herbisida tidak berbeda dengankomponenorganikpadaumumnya.Bahanpestis ida,insektisida,dan herbisida ini disajikan dalam bagian yang terpisah karena komponenini ini sering ditemuisebagaikontaminanyangterpisahdarikomponenorganik yanglain dan sebagianbesardi antaranyatidaksangatsulituntuk dibioremediasi.Kemudian dari sudut pandanginsinyur,bahankimia pestisida,insektisida,danherbisidaini biasanya diperlakukan sendiri danakan menjadi pertimbangan yang terpisah. 1.3.JENIS KONTAMINAN Jeniskontaminanyangperludibioremadiasiadalahsenyawaxenobiotik (termasukpestisida),yaitusenyawaciptaanmanusiayangsulitdibiodegradasi oleh mikroba, serta senyawa turunan rninyakbumi. Lebih dari 125 herbisida, 300 insektisida, dan 325 fungisida telah terdaftar dalamUnited State (Kearney,1972).Bahan kimia ini menunjukkan bervariasinya struktur bahan kimia yang tidak sama,sebagian di antaranya sangat resisten dan beberapayanglaindapatdidegradasimenjadikomponenyangmemiliki toksisitasyanglebihtinggidaripadasebelumdidegradasi.Keberadaan komponeninidalamtanahmerupakanfungsidanbeberapavariabel,dan rnenarikuntukmengukurkeberadaannyadalamtanahdalamrangka mengevaluasimanfaatnya.Alexander(1977)telahmelaporkanbeberapadata denganmenekankanbahwaperiodeaktualdariklodane,DDT.dieldrindan heptaklor mungkin lebih lama (3 - 10 tahun). Selainitusenyawazatwarnasintesisumumnyasulitdidegradasioleh mikroba.Sejumlahzatwarnatekstilyangmerupakanbahanpencelupmampu didegradasi oleh jamurP.chrysosporium berikut ini. TabeI1.1.Mineralisasi Bahan Pencelup Azo Oleh P.chrysosporium Bahan PencelupPersen Mineralisasi dalam 12 Hari 4-fenilazofenol26-38 4-fenilazo-2-metoksifenol21-48 Dispersi yellow 343 4-fenilazoanilin26 N,N-dimetil-4-fenilazoanilin30-46 Dispersi orange40-43 Pelarut yellow 145-23 Tropaeolin 0tidak ada data Orange IItidak ada data Congo redtidak ada data Sumber:Spadaro (1992) : Cripps (1990) 1.4.LlNGKUP PENELITIAN BIOREMEDIASI Masing-masingtempatlim bahberbahayamenawarkanparameteryang membutuhkanoperasiremediasiyangpotensial.Bentukkontaminandisuatu tempat umumnya terdiri atas padatan(tanah dan sludge) dan cair (kolam dan air tanah).yangdapatdiklasifikasikanberdasarkanbahanyangmembutuhkan penanganan.Teknologipengolahanbiologiuntukbahanyangterkotaminasiini dibagi menjadiempatkatagori:(1)fasebiopengolahan-padat(Iandfarming).(2) fasebiopengolahan-slurry.(3)fasepengolahanbioreaktor-cair.dan(4) biopengolahanin-situ.Prosespengolahanyangspesifikmembutuhkanfungsi fisiklkimiakontaminanalamidanmatrikdimanakontaminaniniditemukan. Pengolahanyangkompleksbiasanyamembutuhkansatuataulebihkombinasi prosesdiatasdanjugaintergasidenganprosesfisiklkimiauntukremediasi secara menyeJuruh pada suatu tempat. ApabilaadasatupertimbanganprosesbioJogiuntukremediasi kontaminasispesifiksuatutempat,makapertimbanganinipentinguntuk mendapat informasi yangmengindikasikan keberhasilansebelummalaksanakan remediasipadaskalapenuh.Pengujiantreatibilitasdilaboratorium menghasilkandatauntukmengevaluasikesiapanprosespadatempattertentu dan mengidentifikasi parameter yangpantas untuk impJementasi. PengujiantreatabiJitasdilaboratoriummenirupengolahanyang diantisipasiuntukpenggunaandilapangan.Pengujianinidilakukandalam 1-4 beberapacarayangberbeda,tergantungpadatipepengolahanpadaskala penuhyangdiantisipasi.Secaraumum,adatidagipepengujian:(1)kajiandi nampan(fasepadat),(2,kajianerlenmeyer(fasecairdanfaseslurry),dan(3) kajiankolom(in-situ).Derajatspesifisitasdankompleksitaspengujianspesifik akansangattergatungpadakebutukanp e k e ~ a a ndanpadajumlahinformasi yangdiperlukanuntukmembuatkeputusanyangrealististentangkeperluan pengolahanuntukmembersihkantempattertentu.Kajiandilakuakkndariyang masihsederhana,dimana satuujiaktif dibandingkandengankontrokinaktif dan hanyahilangnyakontaminantargetyangdiamati,sampaipegujiangandayang kompleks, dimana beberapa parameter fisik,kimia dan mikrobiologi divariasikan. Tujuanutamadaripegujianpadabench-scaletreatmetadalahuntuk mencapai hasil awalapakah pengolahan seperti ini yangpotensial untuk aplikasi dilapangan.Keberhasilanpegujianpadaskalabenchakanmenghasilkandata yangcukuptentangkemampuanpengolahanuntukmeremediasikontaminan untukmenjaminpercobaandilahan.Berdasarkanpadaprosesyangspesifik danluasnyatempat,pengujianlahanpadaskalapilotmungkintepatsebelum mengawali pengolahan pada skala penuh. Daftar Pustaka : Cookson, J.T.1995.Bioremediation Engineering: Design and Application. McGraw-Hili, Inc., Toronto. Crawford,R.L.danD.L. Crawford.1996.Bioremediation principles and applications.Cambridge University Press.Cambridge. Shaheen, E.I.1992.Technology of Environmental Pollution Control.Pen Well Books Tulsa, Oklahoma. 1-:'l II. ~ S O L A S I JKARAKTERISASI DAN IDENTIFIKASI MIKROBA POTENSIAL DARI LOKASI TERKONTAMINASI 2.1.ISOLASI MIKROBA Prosesbioremediasi menggunakan konsorsiummikroba,untuk itudiperlukan sumber mikroba lokal dalamberbagai jenis yangdapat mendegradasi minyakbumi (senyawa organik) dengan cepat.Jenis bakteri lokal (indigenous bacteria) diisolasi darisamplelimbahyangadadilokasilahanatautanahterknontaminasiminyak bumiclalamwaktuyangrelatiflama,sehinggadiharapkantelahtumbuhmikroba pendegradasiminyakbumtTidaksemua mikrobayangterdapat dilokasi(alam) dapatditumbuhkandilaboratonum.Mikrobaaerobiklebihmudahditumbuhkan daripadamikroba anaerobic.Baktendiisolasidenganmenggunakan mediumNA (NutrientAgan,sedangkankapangdiisolasidenganmenggunakanmediumPDA (PotatoDextroseAgar).Padakegiataniniakandilakukanpercobaanisolasi bakteriataukapangaerobikdenganmenggunakanmediayangsederhana. Beberapakegiatanyangdiperlukanuntukisolasi,pengujiandanpemeliharaan mikroba. Bahan 1.Tanah,airatausedimenterkontaminasiminyakbumiataukontaminanB3 lainnya dalam waktu yanglama. 2.Kontainerataubotolplastikyangbersihdantelahdisterilisasidenganbilasan alcohol untuk sampel tanah. 3.Tabung pengencer yangbensi 10 ml akuades steril 4.MediaNA danPDA dalam cawan p::::tri masing-masing 6 buah. Peralatan 1.Peralatan untuk menumbuhkan bakteri : pipet,batangpenyebar, lampu sprittus 2.Clean bench 3.Autoclave 4.Cawan petri, tabung reaksi, tabung ulir 5.Inkubator 2-1 Prosedur isolasi mikroba 1.Ambilsedikit sample (1gram)(tanah. air atau sedimen)masukkan dalam tabung pengencer yangtelahberisilarutanfisiologis(1-2%NaCI)atauakuadessecara . aseptis. 2.Buat pengenceran sampel pada tabung yanglain sampai 10-4.10-5,dan 10-6 3.Pindahkan1 ml biakan dari tabung pengencer ke atas media NA dan PDA dalam cawanpetri,masing-masingduaulangan.kemudianratakandenganbatang glass.Bisa juga dilakukan goresan 4 kuadran dengan menggunakna ose. 4.Inkubasikan pada suhu 30C,3PC atau suhu ruang selama 2-3 hari 5.Setelahterlihatadapertumbuhanbakteriataukapang.ambilsinglekoloni secepatnyadangoreskanataupindahkankemediaNAatauPDAyangbaru. Setelahterlihattumbuhkembalipadamediabaru,lanjutkanpemurnianisolat hingga benar-benar tidak ada isolat lain yang tumbuh. 6.Pad apemurnianisolatinidapatdilakukanbeberapakali,hinggabenar-benar mumiatautidakterkontaminasiolehlainnyadengancaramelihatdibawah mikroskop. 7.Amati morphologi isolat secara visual pada cawanpetri dan dibawahmikroskop. Catet hasil pengamatan pada Tabel berikut. 8.Isolatyangtumbuh,dimumikankembaliuntukmeyakinkankantidak terkontaminasi oleh yang lainnya dan disimpan sebagai stok sementara. TabeI2.1.Pengamatan isolasi mikroba NoKodeSumberlMediaSuhuMorphologi secara isolatlokasitumbuhinkubasivisual (wama, bentuk NAPDA3037koloni, dll) 1 2 3 4 5 2-2 2.2.PENGAWETAN MIKROBA Prosedur pengawetan mikroba : 1.Setelah murni, isolat diperbanyak dalam media agar miring dan cawanpetri untuk dilakukan pengujian karakterisasi isolat. 2.Pengawetanisolatdilakukanpuladalammediacair(Nutrientbrothataumedia lainnya),denganpenambahangliserolsteril20 - 50%.Tuangkan0.8mlkultur segarpadaakhirphaselogaritmiknyakedalamtabungeppendorfsterildan tambahkan 0.2ml gliserol steril,kemudiantutup tabung dan beri label kodeisolat dantanggalpembuatan.Setelahitu,simpansecarabertahappadasuhu-20C (penyimpananpadasuhuiniakanmengawetkanmikrobaselamabeberapa bulan)selama1-2hari,kemudianpindahkankefrezersuhu-70Cuntuk penyimpanan beberapa tahun. 3.Bilatelahisolattelahdikarakterisasiataudiidentifikasi,makapengawetan mikrobaselaiandilakukaknsepertidiatas,lakukanpulapengawetandengan Iyopilisasidalamtabunghampaudarayangdapatdisimpanpadasuhukamar selama beberapa tahun. 2.3.PENGUJIANISOLA T Pengujiankemampuanmikroba dilakukan dengan menggunakan media selektif baikdalampadamediapadatmaupuncairoPengujianpadamediapadatdilakukan untuk mengetahui kemampuan isolat dalam mendegradasi atau menggunakan substrat tertentu.Sedangkanpengujianpadamediacairdilakukanuntukmenentukanlaju degradasi substrat (subtsrat terbaik hasilpengujian pertama). 2.3.1.Pengujian pada media selektif padatI Pengujiankemampuanisolatterhadapsenyawakontaminanataupolutan tertentudapatdilakukandenganmenggunakanmediaselektif.Mediainiterdiridari komponenmineraldansebagaisumbernitrogen,kemudiansumberkarbonnyadapat menggunakansenyawapolutantarget.Pengujianinidilakukansebagaitahapan seleksiisolat berdasarkankemampuannyamemanfaatkansumber karbondariminyak diesel,minyaktanahatauturunanminyakbumilainnya,Asumsinya,isolatyang 2-3 mampumemanfaatkansumbersatu-satunyakarbonyangberasaldariminyakdiesel berarti bisa mendegradasi komponen hidrokarbon dalam minyak diesel. Sebelumpengujiandilakukan,substratminyakyangakandiujikanterlebih dahuludisaring menggunakanmembranorganik kedalam tabungulir sterilsetelahitu diletakkandibawahsinarultravioletselama20menit.Seluruhprosespersiapan substrattersebutdilakukansecaraaseptisuntukmenghidaritumbuhnya mikroorganisme kontaminan.Sebanyak 2 persenminyak tersebut kemudiandilarutkan dalamCarbonMinimalSaltsCultureMedia(CMSC)yangsudahdisteriliasidengan autoklaf.Mediayangsudahhomagenselanjutnyadituangkecawanpetrimasingmasingsebanyak15- 20ml.Isolatdigoreskankemediayangsudahpadatuntuk diamati pertumbuhannya setiap hari. Komposisi CMSC adalah sebagai berikut : Table 2.1.Komposisi media mineral CMCS dalam 1 liter akuades. BahanBerat K2HP04.3H2O2.2 9 KH2P04 0.73g (NH4)2S041 9 NaCI30g MgS040.2 9 * Agar15 g ** *Tambahkansetelahmediaselesaidiautoklaf dansuhunyamencapaisuhu ruang. **Untuk media padat. Untuk kebutuhan seleksi kemampuan isolat dalam menderadasi sumber karbon yanglain,dapatdilakukanpengujiandenganmenggantikansumberkarbondari polutanlainnya.PolutanB3 antara lainPCB,PAH,PCP,atau senyawa turunnya,dan sebagainya. 2-4 2.3.2.Pengujian pad a media padat dengan substrat berbeda Selainmenggunakanmediaselektifdiatas,dapatpulamenggunakanmedia mineral yangmengandungnitrogen (yeast ekstrak),kemudiansumber karbonnyadari senyawa polutan target diujikan dalam spot kertas saring sebagai berikut : 1.SiapkanmediaCMCS(bisajugaditambahkanyeastekstrak)padat.Siapkan media tadi dalam cawanpetri sepertibiasa, dan beri label media yang sesuai. 2.Siapkansubstratminyakbumi(sludge,pelumas,diesel,bensin,minyaktanah), minyakmakanIminyaksawitatauminyakgoreng.Semuabahandisterilasi terpisah dengan cara tiltrasi dan sinar UV selama 20 menit. 3.Siapkan pula cincin stainless stell (diameter 5mm) ataubulatan kertas saringyang dibuat dengan punch hole, kemudian sterilkan dengan panas atau kering. 4.Tuangkan0.1mlsuspensibakteriyangsegarkedalammasing-masingcawan yangberisimediapadat.kemudiantebarkandenganbatanggelaspenyebar sampairata (homogen). 5.Pasang5cincinpadamediayangberisimikroba,kemudiantuangkan1001-11substratminyaksteril.Caralainadalahdenganmencelupkanbulatankertas sa ringkedalamsubstrat.kemudiantempelkandiatasmediayangteJah disebarkan mikroba (Lihat Gambar) 6.Inkubasikankultur cawantersebutpadasuhuyangsesuai(300 atausuhuruang) selama2-7hari.Amatipertumbuhanmikrobapadadaerahsekitarcine inatau bulatan kertas saring yang berisi substrat. 7.Bilamikrobadapattumbuhdisekitarcincinataubahkandapattumbuhdiatas bulatankertassaring,menandakanbahwamikrobaterse butdapat menggunakan atau mendegradasi substrat terse but,seperti diperlihatkan pada Gambar2.1. 8.Catat pengamatan tersebut dalam table. 2-5 Gambar2.1.Contohpengujianisolatdenganmenggunakan5jenis substrat,mulaidanatassearahjarumjam:lim bah minyakbumi(1),olilpelumas(2),minyakdiesel(3), minyak goreng (4) dan minyak tanah (5). Tabel2.2.Pengujian pertumbuhan isolat pada media padat dengan substrat minyak NoKode isolatPert:.ambuhan pada substrat yang diujikan SludgePelumasdieselkerosinm. sawit 1 2 3 4 5 2.4.PERTUMBUHAN ISOLAT Karaktensasiisolat yangpenting adalahpengukuran grafik pertumbuhanisolat dalammediacairoKecepatanoksidasiminyakbumidilakukandalammediacair denganmenggunakanmediummineraldan5substratyangsamadandibandingkan dengankontrolsubstrat tanpamikroba.Kecepatanpelarutanminyakdalammedium danoksidasiminyakolehmikrobadiamatisecarafisikkimiadenganmengamati perubahan: kekentalan,konsistensi, wama, homogenitas, kekeruhan media, dan pH. 2-6 Prosedur 1.Siapkan stok isolat pada media padat atau cair yang sehat dan segar. 2.SediakanmediacairCMCSyangmengandungsenyawapolutantargetpad a konsentrasi 1, 5, dan 10 % pada botol serum atau botol berulir volume 100 ml. 3.Inokulasikanisolatpad a media cair dan inkubasikanpadashaker incubator suhu 30DC. 4.Padaselang24jam.ambil2mlsamplesecaraaseptis,ukurpH.kekeruhan (OD660 denganspektrophotometer).Kemudianinkubasikankembali seperti yang lainnya. 5.Amati perubahan pada media bakteri dan kosistensi substrat. 6.CatathasilpengamatanpadaTabelberikut.Bilaperlucatatperubahanlainnya pada lembaran lain. 7.Buat grafik perubahan kekeruhan dan pH terhadap waktu. 8.Bilaterlihatgrafikmenujukkanhasilmendekatiphasepertumbuhanlogaritmik. makaperludiJakukanpengamatanpadaselang12jamatau6jam,untuk mendapakan phase Iogartitmik yangbaik. Tabel2.3.Pengamatan visual kultur bakteri dan konsistensi substrat Kode isolat Substrat yang diujikan Mulai pengamatan Hariltanggal Pukul 2-7 I 2.5.IDENTIFIKASI ISOLA T 2.5.1.Pengujian gram Sesuai dengan bahan identifikasi yang tersedia untuk bakteri gram negatif, maka lakukan pengujian gram terhadap isolat bakteri. 2.5.2.Identifikasi Bakteri Prosedur identifikasi isolat menggunakan Microbact 1.Specimen diinokulasikan ke media, inkubasi selama 18 - 24 jam. 2.lakukan uji oksidasi. 3.Ambil koloni tunggal yangsudahdiisolasi dart kultur berumur 18 - 24 jam yang ditumbuhkan pada media nonselektif atau punselektif.[Bilakoloniterlalu keeil ataupertumbuhannyaterhambat,inokulasikankolonikedalam3mllarutan peptonlaluinkubasikanpadasuhu35Cselama4 jam.Pindahkan2- 3 tetes ke dalam 3 ml garam fisiologis.] 4.Siapkan suspensi isolat dalam 3 ml garam fisiologis steril, kocok hingga merata. Hari ke Kultur BakteriKonsistensi substrat kekeruhanwarnapHkekeruhanvolumewarna 0 1 2 3 4 5 6 7 " 14 2-8 5.Inokutasikanmasing-masinsumurujidengan3tetesatau100IIIsuspensi kultur sampai larlltan memenuhi setengah tinggi sumur tarutan. 6.Teteskan minyak mineral steril pada sumur: 7.Padakulturdenganhasilujioksidasinegatif,minyakditeteskanpadasumur bertanda lingkaran hitam penuh. 8.Padakulturdenganhasilujioksidasipositif.minyakditeteskanpadasumur bertanda lingkaranhitam putus-putus. 9.Inkubasi18- 24jamEnterobacteriaceaeatau48jamuntukberbagaibasilus gram negatif. 10. Cocokkanhasil tes dengan tabel warna.Tambahkan reagent yangsesuaipada sumurdenganlingkaranhijau.Pastikanprosespembentukanwamaterjadi dengan sempurna. 2.5.3.Identifikasi Kapang Proseduridentifikasikapangsecarasederhanadapatdilakukandengan mengamatimorphologikapangdibawahmikroskop,dandibandingkandenganbuku manual identifikasi kapang. Daftar Pustaka Sheehan,D.(ed).1997.Methods inBiotechnology: Bioremediationprotocols. Humana Press, New Jersey. 2-9 III.PROTOKOL UNTUK MENENTUKANKINETIKA BIOAVAILABILITAS DANBIODEGRADASIPOLUTAN CRGANIK TANAHDALAM SISTEM TANAHUNTUK MENINGKATKAN BIOREMEDIASI TANAH YANG TERPOLUSI 3.1.PENDAHULUAN Kajiantreatabilitaspentinguntukmensukseskanimplementasiteknologi bioremediasibaiksecarainsitumaupunexsitu.Sedikittempatterkontaminasiyang identikdanhanyadapatdiaplikasikandalamjumlahyangterbatas.Beberapaveriabel yangmempengaruhikeberhasilanprosesbioremediasiyangmerupakanfungsidan kondisilingkungan.tipekontaminan,danmediayangterkontaminasi.Protokoluntuk melakukankajiantreatabilitasdiperlukanuntuk mengevaluasikeefektifansubstratprimer, substrat tambahan.aseptor elektron dan modelnya untuk pemindahan elektron. Pengetahuantentangkinetikabioremediasidiperlukanuntukmengetahui kemampuanteknologibioremediasiinsitumaupunexsitu.Kajianlaboratoriumuntuk menentukankecepatanbiodegradasidapatdigunakansebagaiujipenseleksianuntuk menentukankecepatandankeluasanbioremediasiyangmungkindicapaiselama remediasidanuntukmenyediakankriteriadesain.Secaratradisional,kinetika biodegradasi secara in situ telah ditentukan denganmenggunakan mikrokosm tanah.yang sulituntuk.dimodelkansecaramatematika.Kajianlaboratoriummeliputireaktorslurry tanahyangtelahdilaporkanolehBachmannet a/.().KaplandanKaplan.Mihelcic dan Luthy,danBrunnereta/.()Saatinitidakadametodologiyangsistematisuntuk menentukan kinetika biodegradasi kontaminan dalam sistem tanah yang padat. Biodegradasidalamtanahmerupakanprosesyangagakkompleks.yangmeliputi difusikontaminankedalammatriktanahyangberongga.adsorpsikepermukaantanah, danbiodegradasi dalambiofilmyangada pad a partikel tanahdan dalamporiyangbesar, dan juga dalamikatan dan faseair bebas setelah desorpsi dari permukaan tanah.Dalam reaktor slurry tanah,biodegradasikontaminan terjadi dalam fasecair olehmikroorganisme darimatrik tanahdanolehbiofilmterimobilisasipad apermukaanpartikeltanah.Dalam sistemtanahyangpadat,biodegradasit e ~ a d idalamfaseairbebasdanairterikat, 3-1 terutamaolehmikroorganismetanahyangterimobilisasidankontribusimikrobiotayang tersuspensi dalam air.Kontribusi mikrobiota ini kedl karena kadar air yangrendah. Babinilebihmenitikberatkankajianbiodegradasiterhadapfenol,beberapaalkil fenol(p-cresol,2,4-dimetilfenol,katekol,hidroquinon,danresorcinol),danhidrokarbon polisiklikaromatik(PAH)terseleksi(nafialena,fenantrena,acenafialena,dan acenafiilena).Modelmatematikauntukslurrytanah,air,reaktorkolomatautabung berporidigunakanuntukmenentukandifusivitaskontaminandankinetikabiodegradasi dalam slurry tanah dansistem tanah yangpadat.Informasi tentang difusivitas kontaminan danbiokinetikadalamtanahdapatdigunakanuntukmengevaluasisegalasesuatuyang dapat dicapaipad a titikakhir untukbermacam-macamteknologitreatmenttanah,seperti biotreatment slurry tanah, land farming,bioventing,atau bioremediasi in situ. 3.1.1.Fenol dan Fenol Tersubstitusi Fenolmerupakansalahsatukomponenorganikyangtelahdigunakansecaraluas secaraterusmenerus,danmerupakanunitstrukturdasaruntukbermacam-macam komponen organik sintesis, termasuk bahan kimiapertanian.Fenol dan fenol tersubstitusi merupakankontaminanyangadadidalamtanahdanair.Keberadaannyadalamtanah atauairmungkindisebabkanolehdegradasipestisidadanbahankimialainyang diaplikasikan secarasengaja terhadap tanahatauolehpembuangandengan sengajadari proses pabrikasi,produksi energi, dan prosedur penanganan limbah. Fenoltelahdilaporkan terdapat dalamlimbahdari pembakarandankonversibahan bakar fosil.Karenakomponenfenolikmerupakanfraksiyangsignifikandarikomponen organikterlarutdalamairyangadadalamlim bahcairdariprosesindustri,maka komponeninipentingdalampengaturanpemilihanpenangananlim bahdan konsentrasinyamerupakansubjek dalampengujiankualitasair.Komponenorganik juga menjadiperhatian,karenakomponeninilebihterlarutsehinggamemilikimobilitasyang lebihtinggi padapermukaantanah,tidak seperti komponenpolisiklik.Teknik penanganan untukmeminimalkanmobilitasdanbahayadarilimbahkimiaberacunharusdidasarkan padapengetahuantentangkomposisipolutanorganikdaninteraksiantarapolutan tersebut dengan zat organik tanah. 3-2 Diskusiyanglebihdetailtentangliteraturyangmalatarbelakangipenyerapandan biodegradasi komponenfenoltelah ditampilkan dimuka.Halini telah disimpulkanbahwa biodegradasidalambioremediasitanahmungkindihambatolehfaktorabiotik,seperti penyerapan komponen pada partikel tanah dan olehbahan organik. 3.1.2.Hidrokarbon Polisiklik Aromatik (PAH) SifatfisikadankimiayangmempengaruhiinteraksiantaraPAHdengantanah, pentinguntukmengevaluasitransporasinyadansecarakebetulan,komponenterse but adadidalamtanahdansedimen,yangtidakdikarakterisasiataudihitung.Penyerapan diketahuisebagaifaktor pentingdalammenentukan faktor ketidaksengajaandarimolekul hidrofobik terse but dalamsistem airlsedimen atautanahlair.Pengalamanyangdiperoleh darikajianterhadapremediasitanahsecarabiologimenunjukkanbahwabiodegradasi mungkindihambatolehfaktorabiotik.Halinidianggapbahwasatufaktoryang menyebabkanpenurunankemampuanbiodegradasikomponenadalahpenyerapan terhadappartikeltanahdanbahanorganik.Kemudian,kemampuanbiodegradasiPAH yang terserap dalam tanahmungkin berhubungan dengan keefektivan degradasi mikrobia! dan juga terhadap perkiraan resiko toksikologi.Karenapengetahuan tentang faktor abiotik terse butmasihkurang,makapentinguntukmenentukankarakteristiktanahyang mempertahankanbiodegradasiPAHdanuntukmenelitihubunganbiodegradabilitasdan biotoksisitasPAHyangterserap.MekanismedimanapolutansepertiPAHmemasukiair tanahperludipelajaridandiidentifikasi,dantekniksesuaiuntukmemperkirakan perjalanannyadalamIingkunganperairanperluuntukdikembangkan.Karenasifat hidrofobikPAH,penyerapanmenjadisangatpentingdalammenentukantransportasinya danketidaksengajaannyadalamsistemsubpermukaantanah.Diskusiyanglebihdetail tentangPAH,ketidaksengajaandalamlingkungan,danbiodegradasidalamtanahtelah disajikan di muka. 3.1.3.Penentuan Kinetika Biodegradasi Dengan Menggunakan Respirometri 8aru-baruini,beberapapenelitianmelaporkanpenggunaanrespirometriuntuk mengevaluasikinetikabiodegradasipolutanorganikdalamtanah.Analisisrespiromeri 3-3 terhadapbiologicaloxygendemand(BOD)dalamjangkapanjangtelahdicobauntuk kajianskalabenchuntukmemantaLirespirasibak1erisecarakontinyuselama pertumbuhand a ~ a mcampuranlimbahorganikdariairdantanahyangterkontaminasi, untukmemperkirakanpotensialuntukmenstimulasibiodegradasilimbahtersebut. Informasiinidigunakanuntukmembuatpenentuanawalmengenaikebutuhaneksplorasi bioremediasi lebih lanjut sebagai potensi teknologiremediasi yang digunakan pada tempat yang terkontaminasi,sebelum pengujian skala pilot. Kajiantreatabilitasmenggunakanrespirometerelektrolitikdanbiometeruntuk menentukanpotensialbiodegradasiminyakmentah(lumpurpengeboran,bahanyang tertinggalltersisa,dan hidrokarbon berat)sebagai kontaminanpada tanahyangterpolusi. Datatreatabilitasmenyediakanefisiensibiotreatmentlimbahpetroleumdandigunakan untuk memastikan waktu pembersihan (clean up) dengan bioremediasi. Panggunaanradioisotopdalamkajianbiodegradasidapatmeningkatkan sensitifitaspengukuranbiodegradasidengansignifikandanmemperkirakansecara realististerhadapbiodegradasiyangdapatdicapaidenganinterferensianalitikyang minimum dari matrik lingkungan, pada konsentrasi yangbiasanya melebihi kisaran metode screening.Produk biodegredasi mungkin dapat dihitung dengan menggunakan kombinasi pembagiandanteknikdeteksiradiokimia.Baru-baruini,teknikinidikembangkanuntuk pengukurankoefisienkinetikaMonod,hasilmikrobial,dankoefisienkematianindogen, melaluipengukurankecepatanawaldalamdurasipercobaanyangsingkatdengan menggunakan substrat yangradiolabel. Aplikasitekniksubstratradiolabelbaru-baruin;telahdikembangkanmenjadi penentubiodegradasiterhadapkomponenorganikdalamtanah.Teknikradiolabel digunakanuntuk mempelajari keberadaanpentaklorofenol (PCP) dan timbalkloridadalam tanah,efeknyaterhadapmikrobiota,dankemampuanuntukmengembalikankerusakan terhadapberbagaitipetanah,padakonsentrasisubstratyangberbeda.Kajianjuga dilaporkanpadadeterminasikecepatanbiomineralisasikomponenkimiadengankarbon C-14 dalam minyak bumitersuspensi secara aerobik dan anaerobik. Pengembanganmodelbiodegradasiterhadappolutanorganikdalamtanah adalah sulit, karena adanya beberapa faktor yang kompleks,meliputi : 1.Adanyadifusibarier komponen,oksigenataunutrien.dalamporimikrodan makrotanah 3-4 2.Pengaruh penyerapan kimia ke tanah lempung dan bahan humic. 3.Adanya bahan organik lain yangbiodegradabeledalam tanah. 4.Perubahanpertumbuhanmikrobiotayangdihasilkandariprotozoaparas it terhadap populasi biodegradasi. 5.Pengaruh kelarutan komponen pada fase cairo 6.Formasibiofilmpadaperrnukaantanahdalamhubungannyadengankultur tersuspensi. 7.Adanya mikrobiota tanah yang tidak teraklimatisasi. Hampir semua modelkinetikabiodegradasimengabaikanpenyerapankontaminan padapartikeltanah,yangmenunjukkanpentingnyapemindahankontaminan.Secara kinetika.penyerapanmerupakanprosesduafase.dengantahapawalyangcepat1 jam)yangdiikutiolehfasepanjangyanglebihlambat(hari).yangdikontrololehdifusi terhadap adsorpsi internal. Tanahmemilikibermacam-macamukuranpori,dengankira-kira50%daritotal volume pori memiliki pori dengan jari-jari