MLPA Multiplex Ligation-dependent

Probe Amplification

Mesut Akpunar

MLPA tekniği

• MLPA tek bir nüklotid değişikliği olan dizilerin dahi ayrımını sağlayacak şekilde, 50 kadar farklı genomik DNA veya RNA dizisindeki normal olmayan kopya sayısının tespitini sağlayan bir multipleks PCR yöntemidir.

• İlk kez 2002 yılında (Schouten JP et al. Nucleic Acids Res).

• Bugüne kadar MLPA tekniği kullanılarak 750’den fazla makale yayınlandı. • Her yıl 1,000,000’ dan fazla çalışma MLPA ile yapılıyor.

• Dünya genelinde 80 ülkede, 800’den fazla lab’da rutin olarak kullanılmakta.

NOT:

MLPA çalışması için sadece bir termalcycler ve kapiler elektroforez cihazına ihtiyaç duyulur.

Aynı anda 96 numuneyi 24 saat içinde sonuç alacak şekilde işleme tabi tutmak mümkündür.

MLPA’nın getirdiği avantajlar

MLPA, kopya sayısı belirlenmesi konusunda diğer tekniklere karşın daha hassastır. (Dizi analizi (sekans) ve DHPLC gibi yöntemler, genellikle kopya sayısı değişikliği tespitinde başarısız kalmaktadır)

İyi karakterize edilmiş delesyon ve amplifikasyonlar PCR ile belirlenebilse de, çoğunlukla delesyonların tam kırılma noktaları bilinmemektedir.

FISH ile tespiti mümkün olmayan sık tek gen değişiklerinin (çok kısa diziler 50-70 nt) belirlenebilmesi sağlaması bakımından avantaj sunmaktadır.

“Array CGH” ile karşılaştırdığımızda, MLPA daha az maliyetli ve daha az karmaşık bir yöntemdir.

MLPA tüm genomu hedefleyen araştırma taramaları için uygun olmamakla birlikte, birçok rutin uygulama için“array” tabanlı tekniklere iyi bir alternatiftir.

45 farklı dizilimi hedefleyen MLPA reaksiyonu, sadece 20 ng insan DNA’sı gerektirir (~3000 hücre) ve sadece bir nükleotitteki farklılığı içeren dizilimleri ayırt edebilme potansiyeline sahiptir.

MLPA Probları

Problardan biri sentetik diğeri ise M-13 türevli bir oligonukleotit. Bu propların kullanılması ile 130-481 nucleotitlik ürünler meydana gelir.

Her iki prob da sentetik oligonükleotit olursa oluşacak ürün miktarı 94-130 nucleotit büyüklüğünde olacak. Çünkü bunlar stuffer sequence içermezler.

Bugün, göreceli olarak sık rastlanan (Duchenne, DiGeorge sendromu, SMA) hastalıklardan daha nadir görülenlerine (hereditary pancreatitis, Antithrombin deficiency, Birt-Hogg-Dube sendromu) kadar 300’ün üzerinde prob seti kullanıma hazır olarak piyasaya sunulmuştur.

Birinci safhada;

DNA denature edilir MPLA prob karışımı ile bir gece inkübasyon.İki prob tamamen komşu dizilere hybridize olur

Ligasyon aşamasında sadece birbirine komşu hedeflere hybridize olmuş iki probun bağlanması gerçekleşir

PCR reaksiyonu sırasında sadece bağlı problar çoğaltılacağından, prob bağlı ürünün sayısı, örnekteki hedef dizi sayısı için bir ölçü teşkil eder.

Kapiler elektroforez kullanılarak çoğaltılmış ürünler ayrıştırılır.

Bağlanmamış prob oligonüklotidler bir primer dizisi içerirler.

Sonuç olarak, bunlar eksponansiyel olarak çoğaltılmaz ve bir işaret de üretemezler.

MLPA yönteminde, bu yüzden bağlanmamış probların bertarafı gereksizdir ve bu da yöntemin uygulanmasını kolaylaştırır.

MLPA Reaksiyonu

MLPA reaksiyonunu beş safhaya ayırılabilir ;

1. DNA denaturasyonu (Heat 5 mins at 98°C)

2. MLPA problarının hibridizasyonu (Incubate 1 minute at 95°C + 16 hours hybridization at 60°C)

3. ligasyon (bağlanma) reaksiyonu (Add ligase mix and incubate 15 minutes at 54°C; Heat to inactivate the ligase: 5 minutes 98°C)

4. PCR reaksiyonu (Add primers, dNTPs and polymerase; Start PCR)

5. Amplifiye ürünün elektroforez ile ayrıştırılması

6. Veri analizi (Determine RELATIVE size of the fluorescent peaks, Compare results to reference samples)

Kullanım alanları;

Mutasyon analizleri

Tek nükleotit polimorfizim

DNA metilasyon analizi

mRNA kantitasyonu

Hücre hatlarının ve dokuların kromozom analizleri

Gen kopya sayılarının analizi

Kanser genlerindeki ( BRCA1, BRCA2, hMLH1 ve  hMSH2) duplikasyon ve

delesyonların tespiti

Anöploidi tespiti

Prenetal teşhis…vb.

Detection of Chr. X copy number: 1, 2 or 3 copies per cell

X

Male

Female

Triple X

Not: 0.65≥ deletion

1.35≤ gain

Heterozygous deletion ASPA gene

Heterozygous deletion

ASPA gene exon 1-6

Reference sample1

1

5

5

4

4

3

3

2

2

6

6

Homozygous deletion ASPA gene

Homozygous deletion

ASPA gene exon 1-6

Reference sample

1 5 4 3 2 6

1

54

32 6

Major applications of MLPA

- mutation detection -

ERBB2 ERBB2NeuroD2

SALSA MLPA kit P004 ERBB2 – Breast tumor samples

ERBB2 amplification

BRCA1 deletionBRCA1 BRCA1

Methylation detection• Epigenetics– Regulation of gene transcription due to methylation of CpGnucleotides located within the promoters.– Example: Hypermethylation of the MGMT promoter in braintumors.

• Imprinting– Regions of the genome where the methylation patterns arepreserved in the same way as they were inherited from theparents.– Examples: The chr.15 Prader-Willy/Angelman region and the chr.11 Beckwidt-Wiedemann region.

Detection of aberrant CpG island methylation.

DNA methylatedNo digestion probe signal present.

DNA unmethylatedProbe-sample hybrid digested no probe signal.

MS-MLPA: promotors tumor suppressor genes

No digestion

HhaI digestion (blood derived DNA):Reference probes remain intact, no HhaI site

ME001 probemix: 15 reference probes without HhaI sites; 26 probes for sequences with HhaI sites that are unmethylated in blood derived control DNA but sometimes methylated in tumor DNA.

MLPA discriminates sequences that differ in only a single nucleotide & can be used to detect known point mutations.

Probes specific for known mutations can be included

CFTR DF508 carrier

Both alleles wild type

CFTR DF508/ DF508 patient

-Spinal Muscular Dystrophy –

• The SMN1 and SMN2 genes are very closely related.• Important difference: one nucleotide change in exon 7.• P021 SMA probemix:– copy number of both SMN1 and SMN2– used for patient samples.• P060 SMA carrier probemix:– copy number changes of SMN1– used for carrier screening.• The presence of zero, one, two, three and four copies of SMN1or SMN2 can be determined.• In 95% of the cases, the cause of SMA can be detected by oneMLPA reaction.

Major applications of MLPA

SALSA MLPA kit P060 – SMA carrierReference sample: 2 copies SMN1, exon 7

SMA carrier: 1 copy SMN1 exon 7