Jenis-jenis Mikroskop

A. Mikroskop CahayaMikroskop cahaya merupakan alat optik yang menggunakan cahaya tampak untuk menghasilkan gambar yang diperbesar dari sebuah objek atau spesimen yang diproyeksikan ke retina mata atau ke alat pencitraan. Dua komponen mikroskop yang penting dalam pembesaran gambar adalah (1) lensa objektif yang mengumpulkan cahaya yang dibiaskan oleh spesimen dan membentuk bayangan nyata yang diperbesar diantara bidang gambar dekat dengan lensa okuler, dan (2) lensa kondensor yang memfokuskan cahaya dari illuminator ke daerah kecil pada spesimen (Murphy, 2001). Pengaturan dari komponen-komponen mikroskop cahaya ditunjukkan pada Gambar 1.

Gambar 1. Komponen mokroskop cahaya(Murphy, 2001)

Selain itu juga terdapat lensa okuler yang berbentuk silinder yang mengandung dua atau lebih lensa. Fungsi lensa ini adalah untuk membawa gambar ke fokus mata. Masing-masing lensa okuler dapat dipertukarkan dan banyak lensa okuler yang berbeda dapat dimasukan dengan derajat pembesaran yang berbeda. Nilai pembesaran lensa okuler adalah 20x, 50x, dan 10x. Pada beberapa mikroskop dengan kinerja tinggi, konfigurasi optik dari lensa objektif dan okuler yang sesuai dapat memberikan kinerja optik yang baik (Watt, 1997). Gambar 2 menunjukkan produksi gambar dari mikroskop cahaya.

Gambar 2. Produksi gambar dari mikroskop cahaya. Cahaya dari sumber fokus pada spesimen melalui lensa kondensor, yang diperbesar untuk mengahasilkan gambar yang sebenarnya. Gambar kemudian memasuki lensa objektif, yang diperbesar untuk menghasilkan gambar. Gambar yang sebenarnya kemudian diperbesar lagi menggunakan lensa okuler untuk menghasilkan gambar virtual yang dapat dilihat oleh mata (Chan, et a/., 1986)

Preparat atau spesimen yang digunakan pada mikroskop cahaya dapat berupa preparat non-permanen yang dapat diperoleh dengan menambahkan air pada sel hidup di atas kaca objek, dan preparat permanen yang dapat diperoleh dengan melakukan fiksasi yang bertujuan untuk membuat sel dapat menyerap warna dan mengawetkannya. Pembuatan sayatan, dilakukan hingga setipis mungkin agar mudah diamati di bawah mikroskop. Preparat kemudian dilapisi dengan monomer resin melalui proses pemanasan karena pada umumnya jaringan memiliki tekstur yang lunak dan mudah pecah setelah mengalami fiksasi, kemudian dilanjutkan dengan pemotongan menggunakan mikrotom. Setelah dilakukan penyayatan, dilanjutkan dengan pewarnaan, yang bertujuan untuk memperbesar kontras antara preparat yang akan diamati dengan lingkungan sekitarnya (Lemmer et al., 2008). Preparat diamati dengan menggunakan lensa objektif yang menghasilkan gambar yang diperbesar dari objek pada bidang gambar lensa okuler. Ketika melihat pada mikroskop, lensa okular bersama-sama kornea mata dan lensa memproyeksi gambar ke retina yang menginterpretasikannya ke otak sebagai gambar virtual yang diperbesar sekitar 25 cm didepan mata (Lemmer et al., 2008). Total pembesaran spesimen dapat dihitung dengan formula: Total pembesaran = Pembesaran lensa objektif x Pembesara lensa okuler. Gambar 3 menunjukkan tipe lensa pada mikroskop cahaya.

Gambar 3. Pembesaran dan numerical aperture pada mikroskop cahaya. (A) Tiga lesa objektif mkroskop cahaya. Dari kiri ke kanan, pembesaran lensa 10x, 20x, dan 40x serta numerical aperture 0.40, 0.70, dan 0.85. (B) lensa okuler dengan pembesaran 10x, (C) lensa kondensor dengan numerical aperture 1.25. Tuas pada bagian kanan atas digunakan untuk membuka dan menutup iris diagram dan menyesuaikan jumlah cahaya yang memasuki spesimen (Pgard and Jason W. Fleischer, 2011).

Mikroskop cahaya dapat dimodifikasi untuk meningkatkan kemampuan untuk menghasilkan gambar dengan kontras tanpa pewarnaan, diantaranya adalah mikroskop medan terang, mikroskop medan gelap, mikroskop fase kontras dan mikroskop flourosens. Pada mikroskop medan gelap (Gambar 4B), pertimbangan khusus digunakan sehinga hanya cahaya yang dipantulkan spesimen yang memasuki lensa objektif. Mikroskop fase kontras (Gambar 4C) menggunakan komponen potik khusus untuk mendapatkan perbedaan yang lebih halus pada komponen sitplasma dan ir uuntuk menghasilkan kontras. Mikroskop flouresens (4D) menggunakan pewarnaan flourosens yang memancarkan flourosens ketika beriluminasi dengan cahaya ultraviolet. Pada beberapa kasus, spesimen memiliki secara alami senyawa kimia yang berflourosens dan pewarnaan tidak dibutuhkan (Lemmer et al., 2008).

Gambar 4. Tipe mikroskop cahaya. (A) Mikrograf medan terang dari jamur Penicillum, (B) Mikrograf medan gelap dari beberapa Paramecium, (C) Mikrograf fase kontras dari Amoeba, (D) Mikrograf Flourosens dari Mycobacterium kansasii (Lemmer et al., 2008).

B. Mikroskop ElektronMikroskop elektron merupakan mikroskop yang menggunakan cahaya untuk mempercepat elektron sebagai sumber iluminasi. Dikarenakan panjang gelombang elektron dapat mencapai 100.000 kali lebih pendek dibandingkan foton cahaya tampak, mikroskop elektron memiliki kekuatan resolusi yang lebih besar dibandingkan mikroskop cahaya dan dapat mengungkapkan struktur dari objek yang lebih besar (Erni et al., 2009).Mikroskop elektron digunakan untuk memperlajari ultrastruktur spesimen biologis dan inorganik termasuk mikroorganisme, sel, makromolekul, sampel biopsy, logam, dan kristal (Rudenberg et al., 2010). Dua tipe utama mikroskop elektron adalah transmission electron microscopy dan scanning electron microscopy.

1. Transmission Electron Microscopy (TEM)Transmission electron microscopy merupakan teknik mikroskop dimana sinar ditransmisi melalui spesimen yang sangat tipis (ultra-thin), dan berinteraksi dengan spesimen ketika melaluinya. Sebuah gambar dibentuk dari interaksi transmisi elektron melewati spesimen; gambar diperbesar dan difokuskan pada alat pencitraan, seperti layar flourosens, pada lapisan film fotografik atau dideteksi dengan sensor seperti kamera charge-coupled device (CCD). Gambar 5 menunjukkan layout mikroskop TEM.

Gambar 5. Sumber elektron pada TEM berada pada bagian atas, dimana sistem lensa (4, 7, dan 8) memfokuskan sinar pada spesimen dan kemudian memproyeksikan ke layar (10). Kontrol sinar berada pada bagian kanan (13 dan 14) (Jie et al., 2003)TEM terdiri dari beberapa komponen, termasuk didalamnya sistem vakum tempat dilaluinya elektron, sumber emisi untuk menghasilkan aliran elektron. Berikut adalah komponen-komponen yang terdapat pada TEM beserta penjelasannya.

a. Ruang VakumRuang vakum merupakan tempat dimana interaksi elektron terjadi, TEM standar mempunyai tekanan rendah, yaitu sekitar 10-4 Pa. Hal ini dimaksudkan untuk mengurangi perbedaan tegangan antara katoda dan ground, dan juga untuk mengurangi frekuensi tumbukan elektron dengan gas atom. TEM membutuhkan film yang harus diganti secara teratur setiap kali ada objek sehingga TEM dilengkapi dengan sistem pemompaan ganda dan airlocks (Stoian, 2006).b. Specimen stagesSpecimen stages merupakan bagian yang fungsinya seperti meja preparat di mikroskop, yaitu berfungsi untuk meletakkan objek atau preparat. Pada TEM, specimen stages ini berupa jaring-jaring yang bisa kita sebut dengan grid. Ukuran grid TEM standar ditunjukkan seperti cincin berdiameter 3,05 mm, dengan ukuran ketebalannya mulai dari 100 pM. Sampel diletakkan pada grid dengan ukuran sekitar 2,5 mm. Grid biasanya terbuat dari tembaga, molibdenum, emas atau platinum. Untuk spesimen Elektron transparan memiliki ketebalan sekitar 100 nm, tetapi nilai ini tergantung pada tegangan percepatan (Stoian, 2006).c. Electron gunElectron gun merupakan bagian dari TEM yang sangat penting, electron gun inilah yang menghasilkan partikel-partikel elektron. Electron gun memiliki beberapa komponen penting yaitu filament, sebuah biasing circuit, sebuah Wehnelt cap, dan sebuah extraction anode. Elektron dapat di ekstraksi dengan menghubungkan filamen ke komponen power supply negatif, elektron "dipompa" dari pistol elektron ke lempeng anoda, dan kolom TEM. Pinstol ini dirancang untuk membuat berkas elektron keluar dari rangkaian dalam beberapa sudut tertentu, yang dikenal sebagai semiangle perbedaan pistol, . Dengan membentuk silinder Wehnelt sedemikian rupa sehingga memiliki muatan negatif lebih tinggi dari filamen itu sendiri untuk membuat elektron keluar dari filamen dengan cara diverging. Pada operasi yang tepat, pola elektron dipaksa untuk memusat dengan diameter ukuran minimum crossover pistol (Stoian, 2006).

Gambar 6. Diagram penampang lintang dari perakitan electron gun, mengilustrasikan ekstraksi elektron (Stoian, 2006)

d. Electron lensLensa elektron dirancang dengan cara meniru lensa optik, dengan memfokuskan sinar sejajar pada beberapa constant focal length. Lensa dapat beroperasi elektrostatis atau magnetis. Mayoritas lensa elektron untuk TEM menggunakan kumparan elektromagnetik untuk menghasilkan lensa cembung. Untuk lensa ini bidang yang dihasilkan harus radial simetris, deviasi dari simetri radial lensa magnetik dapat menyebabkan aberasi seperti astigmatisme, spherical and chromatic aberration. lensa elektron dibuat dari besi, komposit besi-kobalt atau kobalt nikel (Qiu et al., 2014).

Gambar 7. Diagram desain lesa split polepiece TEM (Qiu et al., 2014)

Seluruh komponen termasuk yoke, kumparan magnet, pole, polepiece, dan sirkuit kontrol eksternal. Polepiece harus diproduksi dengan cara yang sangat simetris. Kumparan yang menghasilkan medan magnet berada di dalam yoke. Biasanya kumparan dapat digunakan dengan tegangan tinggi, oleh karena itu memerlukan isolator untuk mencegah hubungan arus pendek pada komponen lensa. Thermal distributor digunakan sebagai peredam panas yang dihasilkan oleh energi yang hilang dari gulungan coil.e. AperturesApertures merupakan lingkaran pelat logam yang terdiri dari sebuah cakram logam kecil yang cukup tebal. Apertures digunakan untuk mengarahkan elektron agar dapat berjalan secara aksial. Hal ini dapat menyebabkan efek simultan, yaitu apertures dapat mengurangi berkas intensitas dan menghilangkan elektron yang tersebar di berbagai sudut tinggi, yang mungkin disebabkan oleh proses-proses yang tidak diinginkan seperti aberration, atau karena difraksi dari interaksi dalam sampel.Dengan adanya aperture, elektron sentral dalam TEM menyebabkan dua efek simultan Pertama, aperture mengurangi intensitas berkas elektron yang disaring dari balok, yang mungkin diinginkan dalam kasus sampel balok sensitif. Kedua, penyaringan ini menghilangkan elektron yang tersebar pada sudut tinggi, yang mungkin disebabkan oleh proses-proses yang tidak diinginkan seperti aberration bola atau berwarna, atau karena difraksi dari interaksi dalam sampel.Sebuah Transmisi Elektron Mikroskop memiliki desain dengan mikroskop cahaya biasa, hanya perbedaannya TEM menggunakan cahaya sedangkan mikroskop cahaya menggunakan elektron.Dengan menggunakan tabung sinar katoda atau filamen (sumber untuk menghasilkan elektron yang sangat baik) dalam ruang hampa,elektron dipercepat menuju spesimen yang diberikan dengan menciptakan perbedaan potensial. Serangkaian magnet dan lubang logam digunakan untuk memfokuskan uap elektron menjadi monokromatik balok, yang kemudian bertabrakan dengan spesimen dan berinteraksi sesuai dengan kerapatan dan muatanmaterial.Interaksi ini sangat dipengaruhi oleh bagaimana spesimen yang telah disiapkan (Qiu et al., 2014). Adapun Sinyal utama yang dapat dihasilkan oleh TEM cukup banyak, antara lain:1. Diffraction contrast : dipakai untuk mengkarakterisasi kristal, biasanya digunakan untuk menganalisa defek, endapan, ukuran butiran dan distribusinya.2. Phase contrast : dipakai untuk menganalisa kristalin material.3. Mass/thickness contrast : dipakai untuk karakterisasi bahan amorf berpori, polimer, dan material lunak lainnya.4. Difraksi elektron5. Characteristic X-ray (EDS)

Prinsip kerja TEM dimulai dari sumber emisi (pistol elektron) yaitu tungsten filament dan sumber lanthanum hexaboride (LaB6). Dengan menghubungkan pistol ini dengan sumber tegangan tinggi (biasanya ~ 100-300 kV) pistol akan mulai memancarkan elektron baik dengan termionik maupun emisi medan elektron ke sistem vakum. ekstraksi ini biasanya dibantu dengan menggunakan silinder Wehnelt. Interaksi elektron dengan medan magnet akan menyebabkan elektron bergerak sesuai dengan aturan tangan kanan, sehingga memungkinkan elektromagnet untuk memanipulasi berkas elektron. Penggunaan medan magnet akan membentuk sebuah lensa magnetik dengan kekuatan fokus variabel yang baik. Selain itu, medan elektrostatik dapat menyebabkan elektron didefleksikan melalui sudut yang konstan. Dua pasang defleksi yang berlawanan arah dengan intermediete gap akan membentuk arah elektron yang menuju lensa (Ruska et al., 1931).Berbeda dengan mikroskop optik yang lensanya bisa langsung difungsikan, optik TEM bisa cepat berubah, TEM memiliki kekuatan lensa yang berubah-ubah. Lensa TEM memungkinkan adanya konvergensi, dengan sudut konvergensi yang sesuai variabel parameter, TEM berkemampuan untuk mengubah perbesaran dengan cara memodifikasi jumlah arus yang mengalir melalui kumparan, lensa quadrupole atau lensa hexapole.Biasanya TEM terdiri dari tiga tahap lensing. Tiga tahapan itu adalah lensa kondensor, lensa objektif, dan lensa proyektor. Lensa kondensor bertanggung jawab untuk pembentukan balok primer, sedangkan fokus lensa objektif datang melalui sampel itu sendiri (dalam STEM mode pemindaian, ada juga lensa objektif atas sampel untuk membuat konvergen insiden berkas elektron). Lensa proyektor digunakan untuk memperluas sinar ke layar fosfor atau perangkat pencitraan lain, seperti film. Pembesaran TEM berasal dari rasio jarak antara spesimen dan lensa objektif. Selain itu, lensa Quad dan hexapole digunakan untuk koreksi distorsi balok asimetris, yang dikenal sebagai astigmatisme. Perlu dicatat bahwa konfigurasi TEM optik sangat berbeda dengan kenyataannya.Sistem Pencitraan dalam TEM terdiri dari layar fosfor, partikel sulfida seng dibuat sehalus mungkin (10-100 pM) untuk pengamatan langsung oleh operator. sistem perekaman gambar berdasarkan film atau doped YAG yang digabungkan CCD layar. Perangkat ini dapat dihapus atau dimasukkan ke dalam jalur balok oleh operator sesuai kebutuhan.

Secara umum, elektron dihamburkan oleh partikel di udara, yang diperlukan untuk memperbaiki (dan mempercepat) elektron yang disimpan dalam ruang hampa untuk mencegah interaksi yang tidak diinginkan. Oleh karena itu, untuk melihat spesimen hidup di bawah TEM sulit untuk dilakukan. Selain itu, elektron tidak dapat menembus spesimen yang sangat tebal lapisannya, karena hanya dapat menembus 50-100 nm. Menurut Williams (1998), agar pengamat dapat mengamati preparat dengan baik, diperlukan persiapan sediaan dengan tahap sebagai berikut:a. Preparation of thin sectionsPengambilan sampel dengan ferri osmium (menstabilisasikan bilayer dan protein) dan glutaldehid (biasanya dilakukan di awal; ikat silang protein dengan ikatan kovalen)memungkinkan spesimen untuk mengalami dehidrasi dan diresap oleh resin monomer.Spesimen dalam bentuk ini dapat diiris dengan baik dengan pisau berlian atau ultra-mikrotom untuk membuat bagian tipis yang bebas dari air dan zat volatil.Prosedur ini, kurang umum digunakan, oleh karena itu digantikan oleh rapid freezing.b. Rapid freezingPembuatan lapisan tipis suatu specimen yang diuji dengan TEM tidak menjamin bahwa specimen tersebut dapat dilihat di bawah mikroskop menyerupai struktur dalam bentuk (ikatan kovalen protein yang bermasalah) yang sebenarnya.Untuk memastikan sepenuhnya, specimen harus diawetkan tanpa merusak struktur aslinya yang dimungkinkan untuk pembekukan cepat spesimen dengan sedemikian rupa sehingga mencegah molekul-molekul air dari menata ulang strukturnya sendiri.Denganmemasukkan spesimen ke dalam sebuah polesan blok tembaga dingin dengan helium, airsangat dingin dimasukkan ke dalam es vitreous.Spesimen ini kemudian dapat diiris dengan sebuah ultramikrotom. c. Pelapisan/pewarnaanPelapisan bertujuan untuk memperbesar kontras antara preparat yang akan diamati dengan lingkungan sekitarnya. Pelapisan/pewarnaan dapat menggunakan logam berat seperti uranium dan timbal.