Mikrobiyal, Bitki ve Hayvan Biyoteknolojisikisi.deu.edu.tr/asli.memisoglu/Biyoloji...

C H A P T E R

PowerPoint® Lecture by:

Lisa Werner

Pima Community College

Mikrobiyal,

Bitki ve Hayvan

Biyoteknolojisi

6

Çeviri: Aslı Sade Memişoğlu

© 2013 Pearson Education, Inc.

Konu başlıkları – Mikrobiyal Biyoteknoloji

• Giriş

• 1 Mikropların yapısı

• 2 Araç olarak mikroorganizmalar

• 3 Çeşitli günlük uygulamalarda mikropların

kullanımı

• 4 Aşılar

• 5 Mikrobiyal genom

• 6 Biyoyakıt üretimi için mikropların kullanımı

• 7 Mikrobiyal tanı

• 8 Biyoterörle mücadele


Giriş

• Mikroplar (mikroorganizmalar) çıplak göz ile

görülemeyen, ancak mikroskop altında

görülebilen küçük organizmalardır. – Bakteriler, mantarlar, algler, ve protozoa

• Dünyada oluşan ilk yaşam çeşidi bakterilerdi ve

3.5 milyar yıldır varlar

• Dünyanın yaşayan bölümünün %50’sini

bakterilerin oluşturduğu düşünülmektedir


Giriş

• İnsanlar mikropları geleneksel biyoteknolojide uzun

zamandır kullanmaktalar.

• Mikroplar rekombinant DNA teknolojisinin de

temelini oluşturur.

• Bakteri türlerinin %1’inden azı tanımlanmış, kültür

ortamında çalışılmıştır.

– Dolayısıyla mikropların biyoteknolojiye gelecekteki

katkısını ancak hayal edebiliyoruz.

• Ökaryot mikroplar: maya, alg, protozoa

• Prokaryotlar: bakteri ve arkea


2 Araç olarak mikroorganizmalar

1. Mikroplardan elde edilen enzimler

– Besin üretiminden, moleküler biyoloji araştırmalarına

farklı uygulamalarda kullanılır.

– Taq DNA polimeraz

• Isıya dayanıklı termofil mikroptan elde edilmiştir – PCR’da

kullanılır.

– Selülaz

• Hayvan yemlerinin daha kolay sindirilebilmesini sağlar

• Taşlanmış kotlar

– Subtilisin

• Çamaşır deterjanları – lekelerdeki proteinleri parçalar


2. Transformasyon – Bakterilerin yabancı

DNA’yı içlerine almaları

• Bakteriler büyük miktarlarda protein üretmek için kullanılır.

3. Belirteç olarak mikrobiyal proteinler

– Biyoluminesans – deniz organizmalarının

kullandığı ışık üretme yöntemini kullanmak

• Vibrio fisheri gibi, deniz canlıları üzerinde

yaşayan bakterilerdeki lux genleri bu ışığı üretir


.

– Lux genleri klonlanmış ve gen ifadesi

çalışmalarında kullanılmaya başlanmıştır.

• Klonlanmış lux geni hayvan veya bitki hücrelerine

aktarıldığında bu hücreler o proteini üretir ve gen

ifadesinin göstergesi olarak ışıma yaparlar.



3 Mikropları çeşitli günlük uygulamalarda

kullanmak

1. Gıda ürünleri

– Ekmek, yoğurt, peynir, alkollü içecekler

– FDA (Gıda ve ilaç idaresi) tarafından onaylanan ilk

rekombinant gıda maddesi peynir yapımı için kullanılan

bir enzimdir.

– Geleneksel enzim olan renin, buzağı midesinden

ayrıştırılır.

– Rekombinant renin olan kimosin, klonlanmış ve

bakteride üretilmiştir – daha ucuz ve üretimi daha kolay.


2. Fermentasyon – oksijen yokluğunda şekerlerden

enerji üretmek.

– Laktik asit fermentasyonu: yoğurt, ekşi krema, sirke,

peynir ve ekmek yapımında kullanılır.

– Alkol fermentasyonu: bira, şarap, şampanya yapımı


kullanmak


3.Tedavi proteinleri

– Tıbbi açıdan önemli proteinlerin üretiminde de

bakteriler kullanılır.

– İnsülin


kullanmak


Rekombinant bakterilerde üretilen tıbbi proteinler

Protein İşlev Uygulama

Dnaz DNA parçalayan enzim Kistik fibroz tedavisi

Eritropoietin Alyuvar üretimini tetikler Anemi tedavisi

Faktör VIII Kan pıhtılaştırma faktörü Hemofili tedavisi

Granülosit koloni tetikleyen faktör Akyuvar büyümesini tetikler Kemik iliği nakillerinde

Büyüme hormonu Kemik ve kas büyümesini tetikler Cücelik tedavisi. İneklerde büyüme ve

süt üretimini artırır

İnsülin Hücrelerin glukoz emilimi için gerekli Diyabet tedavisi

hormon

İnterferon ve interlökin Kan hücresi üretimini artıran faktörler Lösemi gibi kanserlerin tedavisinde

Aşılar Bakteri ve virüs enfeksiyonlarını

engellemek için bağışıklık sistemini

uyarır


4. Antibiyotikler

– Mikropların büyümesini engellemek için diğer

mikroplar tarafından üretilir

– 1928 Alexander Fleming - penisilin

– Çoğunluğu bakteriler tarafından üretilir


kullanmak



kullanmakHücre duvarı sentezinin engellenmesi Protein sentezinin engellenmesi

Transkripsiyon Translasyon

Eşlenme

DNA eşlenmesi

ve

transkripsiyonun

engellenmesi

Hücre

metabolizması

için gereken

enzim

aktivitesinin

engellenmesi

Hücre zarına

hasar verme

Antibiyotiklerin etki mekanizmaları


• Antibiyotikler– Antibiyotiklerin yanlış kullanımı dirençli bakterilerin

artmasına sebep olmuştur.

– Antibiyotikler sınırlı sayıda yöntemle bir bakteri hücresini durdurur. Bu sebeple, bir çeşit antibiyotiğe direnç kazanılınca genelde diğer pek çoğuna da direnç kazanılmış olur.

– Farklı etki mekanizması olan antibiyotiklerin geliştirilmesi gerekmektedir.

– Mikrobiyologlar farklı çevrelerde araştırmalar yaparak yeni anti mikrobik maddeler keşfetmeye çalışmaktadır.

– Bugünlerde bakteri öldürücü genetiği değiştirilmiş virüs tedavisi geliştirilmesi düşünülmektedir


kullanmak


4 Aşılar

• İlk aşı 1796 - Edward Jenner

– Çiçek hastalığına karşı canlı sığır çiçek virüsünü

kullanmıştır

• Aşılar – Belirli bir patojen tarafından

enfeksiyona karşı bağışıklık sistemini

uyarmak için, patojenin tamamı veya

parçalarının ağız veya enjeksiyon yoluyla

insana verilmesidir.


• Aşı yapımı için 3 temel yöntem

– Alt birim aşılar bakteri veya virüsün bazı

bölümlerinin enjeksiyonu

– Değiştirilmiş aşılar yaşlandırma veya

büyüme ortamı değiştirilerek zayıflatılmış

virüs veya bakterilerin enjeksiyonu

– Öldürülmüş aşılar tamamen öldürülmüş

patojenin kulllanılması

4 Aşılar


• Günümüzde alt birim aşılarının çoğunluğu

rekombinant DNA teknolojisi ile mikropların

içerisinde üretilmektedir.

– Hepatit B

• Virüsün dış yüzey proteinlerini kodlayan genler

klonlanmış ve maya hücrelerinde üretilmiştir.

– Gardasil, insan papilloma virüsü aşısı (HPV)

– HIV aşısı

4 Aşılar


• Influenza: Grip virüsleri çok hızlı mutasyona

uğradıkları için her yıl yeni aşılar üretilir.

– Influenza A dünya çapında salgınlara sebep

olmaktadır.

• 1918’de 20 milyon kişi öldü

• Kuş gribi (H5N1) 2003’te Asya’da tavuklar arasında salgına

sebep oldu - 200milyon kuş.

– İnsanlar arasında enfeksiyon fazla yayılmadı.

– H5N1’in mutasyona uğrayarak insanlara geçmemesi için aşılar

geliştirildi.

• 2009’da, domuz gribi (H1N1) bir aşı sayesinde kontrol

edilebildi

4 Aşılar


• Tüberküloz (TB)

– Mycobacterium tuberculosis

• Her yıl 2-3 milyon ölüm

• Akciğerlerde lezyonlar

• Çok fazla dirençli bakteri sebebiyle dünya sağlık

örgütü alarm verdi

• Bill ve Melinda Gates Derneği ve diğerleri,

araştırma için $30 milyon verdiler

• Genomu dizilendi, yeni proteinler keşfedildi ve yeni

aşılar klinik deneylerde

4 Aşılar


• Sıtma

– Plasmodium falciparum denilen protozoa

paraziti sebep olur ve böceklerden bulaşır

• Çocuklarda her yıl yarım milyar yeni vaka, her yıl 3

milyon ölüm

• Plasmodiyum tipleri sıtma ilaçlarına karşı direnç

geliştiriyor

• Tüm genom mikro çipleri yeni hedefler belirlemek için

kullanılmaktadır.

4 Aşılar


5 Mikrobiyal genomlar

• 1994 Mikrobiyal Genom Programı (MGP)

– Çevre biyolojisi, araştırma, endüstri ve sağlık

alanlarında uygulama potansiyeli olan

mikroorganizmalar ve protozoa patojenlerinin

genomlarının tamamını dizilemek

• Neden dizilemek isteyelim?

– Streptococcus pneumoniae, 2001’de genomu dizilendi

ve bakteri yüzeyinde pek çok yeni protein keşfedildi

• Yeni tedavilerin yolunu açabilir

– Yeni türlerin bulunması

• Biyoremediasyon veya başka işler için

• Hastalık yapan tiplerin keşfi


• 2008’de ABD ulusal sağlık enstitüsü (NIH)

İnsan mikrobiyom projesini duyurdu

– İnsanlar üzerinde veya içinde yaşayan 600 adet

mikrop türünün genomlarının dizilenmesi.



• Projenin hedefleri:

– Bireyler ortak bir mikrobiyom paylaşıyor mu?

– Mikrop komünitelerini nasıl aldığımız ve devam

ettirdiğimizi belirlemek

– Mikrobiyomu etkileyen koşullar ve sağlıkla ilişkisi

– Analiz için yeni yöntemler geliştirmek



• Viral genomik


Dizilenen tıbbi açıdan önemli virüs genomları

Virüs İnsan hastalığı Dizilendiği yıl

Ebola virüsü Kanamalı ebola ateşi 1993Hepatit A virüsü Hepatit A 1987Hepatit B virüsü Hepatit B 1984Hepatit C virüsü Hepatit C 1990Herpes simpleks, tip I Uçuk 1988İnsan bağışıklık yetmezliği virüsü (HIV-1) AIDS 1985İnsan papilloma virüsü Rahim ağzı kanseri 1985İnsan polio virüsü Çocuk felci 1981İnsan rinovirüsü Grip 1984İnfluenza A virüsü

H5N1 (kuş gribi) Ciddi grip 2007H1N1 (Domuz gribi) Ciddi grip 2009

SARS-ciddi akut solunum koronavirüsü Ciddi akut solunum sendromu 2003Variola virüsü Çiçek 1992


• Sentetik genomlar

oluşturmak: Bir bakteri

türünün işlevsel sentetik

genomu üretildi

– M. mycoides JCVI-syn 1.0 genomu sentetik olarak

üretildi.

– Cansız bir nesneden yeni bir yaşam formu

oluşturmadı fakat yine de sentetik genomların yaşamı

sürdürebildiği kanıtlandı.

– Yeni bakteri veya hücre türleri tasarlanıp, istenilen

görevi yapmak üzere programlanabilir!!!

– Etik sorunlar!

5 Mikrobiyal genomlarM. Mycoides genomu

tasarla

1.8 Mb genomu içeren 10000

bazlık kaset DNA’ları kimyasal

olarak sentezle

E.Coli bakterisinde

klonlama

S.Cerevisiae içinde tüm

genomun birleştirilmesi

M.Capricolum içine transfer


6 Biyoyakıt üretimi

• Sadece ABD yılda 140 milyar galon yakıta ihtiyaç

duymaktadır

• Tahıldan, yılda 5 milyar galon etanol üretmekteyiz.

– Çok karlı veya verimli değil

• Biyorafineriler, bitki sapları veya diğer ürünlerdeki selülozu

şekere dönüştürebilir ve bu da sürdürülebilir etanol üretimi

için kullanılabilir.

• Günümüzde mikroplar selülozu şekere veya şekeri alkole

daha verimli dönüştürmeleri için genetik olarak

değiştirilmektedir.

• Doğada da biyoyakıt üretimi için kullanışlı enzimler üreten

yeni mikroplar halen araştırılmaktadır.


7 Mikrobiyal tanı

• Mikrobiyal tanı – mikropları tanımlamak ve

izlemek için kullanılan yöntemler

• Bakteri tespit stratejileri

– Restriksiyon analizi, PCR ve DNA dizileme

– Klinik örneklerin karşılaştırılabilmesi için veri

tabanları bulunmaktadır.

– Gıdalardaki bakterileri tespit etmek için

kullanılmakta.


Örnek (kan,

tükürük)

Bakteri hücreleri

Restriksiyon analizi PCR analizi DNA dizileme

Restriksiyon enzim

kesiminden sonra

DNA parçaları Hedef DNA

PCR cihazında

çoğaltma

Agaroz

elektroforezi

ÖrnekBakteri DNA’sının

çoğaltılması

DNA

dizileme

Dizi analizi

Bilinen dizilerle veri

tabanında karşılaştır

Bakterinin tanımlanması


7 Mikrobiyal tanı

• Bulaşıcı hastalıkların tespiti için mikroçipler

– Affymetrics şirketi SARS çipi geliştirdi

• Üzerinde ~30,000 prob (DNA parçası) var – bunlar tüm virüs

genomunu temsil ediyor

– Mikroçipler ayrıca belirli bir patojendeki ani değişimleri

(mutasyonları) de tespit edilmesi için kullanılıyor.


7 Microbial Diagnostics

Farklı patojenlere konakçının cevapları tanımlanır


8 Biyoterör

• Biyoterör – İnsanlara veya gıda için bağımlı

oldukları hayvan/bitkilere zarar vermek

amacıyla biyolojik materyal kullanımı.

• Sadece 12 civarında organizma verimli

şekilde kültürde büyütülebilir, elde edilebilir

ve biyoterörde kullanılabilir

• Hava yoluyla, tarım uçakları veya su yoluyla

uygulanır.


POTANSİYEL BİYOLOJİK SİLAHLAR

Patojen Hastalık tehdidi ve genel semptomlar

Brucella (bakteri) Çiftlik hayvanlarını enfekte eder. İnsan ve hayvanlarda brusellosise

yol açar. Uzun süreli ateş ve halsizlik. Hafif veya ölümcül olabilir

Bacillus anthracis (bakteri) Şarbon. Deri tipi, deride tedavi edilebilir lezyonlar oluşturur.

Solunursa grip benzeri semptomlarla başlayıp zaatürreye çevirir –

genelde ölümcüldür.

Clostridium botulinum (bakteri) Botulizm. Bakterinin kendisi veya toksini içeren yiyeceklerle bulaşır.

Kaslarda farklı derecelerde felç. Solunum veya kalpte felç ölümle

sonuçlanır.

Ebola virüsü veya Marburg virüsü Her ikisi de kanamalı ateşe yol açar. Ciddi ateş, kas/eklem ağrısı,

kanama

Francisella tularensis (bakteri) Tularemi. Solunum çökmesi, şok ve ölümle sonuçlanabiken

solunum inflamasyonu

İnfluaenza virüsleri (büyük ve bulaşıcı bir grup) Nezle. Ciddiyeti ve sonuçları virüs tipine göre değişir.

Rickettsia (birkaç bakteri tipi) Tifüs ve kayalık dağlar lekeli humması gibi farklı hastalıklar

Variola virüsü Çiçek. Titreme, yüksek ateş, sırt ağrısı, başağrısı, cilt lezyonları

Yersinia pestis (bakteri) Hıyarcıklı veba. Yüksek ateş, baş ağrısı, lenf düğümlerinin şişmesi,

şok, dolaşımın çökmesi, organ yetmezliği, çoğunlukla birkaç gün

içinde ölüm


GIDA KAYNAKLARINA YÖNELECEK BİYOSİLAHLAR İÇİN POTANSİYEL PATOJENLER

Hastalık Hedef/taşıyıcı Patojen

Hayvan Hastalıkları

Ayak ve ağız hastalığı çiftlik hayvanları Ayak ve ağız virüsü

Afrika domuz gribi Domuzlar Afrika domuz gribi virüsü

Bitki hastalıkları

Tahıllarda Kök pası (mantar) arpa, yulaf, buğday Puccinia spp.

Güney mısır yaprağı küfü (mantar) mısır Bipolaris maydis

Pirinç yanığı (mantar) pirinç Pyricularia grisea

Patates küfü (mantar) patates Phytophthora infestans

Turunç pamukçuğu (bakteri) turunç Xanthomonas axonopodis

Zoonoz (hayvandan insana geçen hastalıklar)

Brucellosis (bakteri) çiftlik hayvanları Brucella melitensis

Japon beyin iltihabı (virüs) sivrisinek

ŞArbon (bakteri) çiftlik hayvanları Bacillus anthracis


8 Biyoterör

• Biyosilahlara karşı biyoteknoloji

– ABD’de 2001’deki şarbon saldırıları buna

hazırlıklı olunmadığını gösterdi

– Bir saldırının tespit edilebilmesi için hava ve su

kaynaklı patojenlerin sahada test edilmesi

gerekir.

– Pentagon’da şarbon sırasında, Körfez savaşı,

Afganistan ve Irak savaşlarında kullanılan tespit

yöntemleri başarılı olmadı.

– Daha hassas ve kesin biyosensörlere gereksinim

var.

• PCR temelli

• Protein mikroçipler


Kandaki

proteinler

Bir şarbon proteinine

karşı antikor

Bir çiçek proteinine

karşı antikor

Bir grip proteinine

karşı antikor

Antikor çipi

Floresan

boyalı 2.

antikor

Boyalı

antikor

Kandaki proteinler

Şarbon antikoru

Bağlanmamış

antikorlar

Kanda şarbon

proteinleri

olduğunu

gösteren

floresan nokta

Okuma


8 Biyoterör

• Biyosilahlara karşı biyoteknoloji

– Bir saldırı olduğunda antibiyotik gibi tedavi

ilaçlarına ihtiyaç olacak

– Ülkeler stok yapmalı

– Aşılar biyosilahlara maruz kalmadan kullanılmalı

– Eğer bilinmeyen veya genetiği değiştirilmiş

organizmalar kullanılırsa bu ilaçlar bile etkili

olmayacaktır

C H A P T E R


Lisa Werner


Bitki

BiyoteknolojisiÇeviri: Aslı Sade

Memişoğlu


Başlıklar

• 1 Tarımın geleceği: Bitki transgeniği

• 2 Bitki transgenetiğinde kullanılan

yöntemler

• 3 Pratikte uygulamalar

• 4 Sağlık ve çevre açısından endişeler


1 Tarımın geleceği:

Bitki transgeniği

• Dünya nüfusu son 40 yılda ikiye katlandı

fakat ekilebilir arazi sadece %10 arttı

• Geleneksel yöntemlerle bitki ıslahı çok

fazla insanın beslenebilmesini sağladı

• Son yıllarda, doğrudan gen transferi

sayesinde daha verimli ve yeni bitkilerin

geliştirilmesi süreci hızlanmıştır.


• Bitki transgenetiği– genlerin doğrudan bitkilere

aktarımı

– Bitki aşısı, kendi pestisitlerini üreten bitkiler ve

herbisitlere dirençli bitkiler geliştirilmesi.

• 2008 yılında 25 ülkeden 13.3 milyon çiftçi

transgenik bitkiler ekmiş durumdaydı.

– Bunların %90’ı gelişmekte olan ülkelerdeydi

• 2009’da dünya çapında belli başlı önemli bitkiler

transgenikti

– Soya fasulyesinin %70’i, mısırın %40’ı, pamuğun

%10’u

• Önemli bir tartışma konusu

1 Tarımın geleceği:

Bitki transgeniği


1. Geleneksel ıslah ve hibritleme

– İki bitki tipi arasında çaprazlama ve

sonrasında hibrit nesil ile ata nesli arasında

tekrarlı geri çaprazlama.

• Yıllarca sürebilir

– Poliploid bitkiler (Çoklu kromozom setine

sahip bitkiler)

• İstenilen karakterleri

özellikle artırır – ör: büyüklük

• Bir tek gen yerine tüm

kromozom aktarılabilir

2 Bitki transgenetiğinde yöntemler


2. Klonlama – tek bir hücreden bitkiyi

üretmek

1) Protoplast birleştirme farklı türlerin

protoplastlarını birleştirmektir

2) Yaprak parçaları tekniği

• Yapraktan küçük diskler kesilir

• Genetiği değiştirilmiş bitkileri enfekte eden bir toprak

bakterisi ile gen aktarımı yapılır

2 Bitki transgenetiğinde yöntemler


Yaprak kesilir

Parçalanır

Hücre duvarı

Koful

Sitoplazma

Çekirdek Hücre

zarı

Bitki hücreleriSelülaz, şeker ve

tuz içeren çözeltiye

koyulur

Yıkanır

Artıklardan kurtulmak

için sentrifüjlenir

Protoplastlar

yüzer

Hücre duvarı

artıkları çöker

Protoplastlar

Protoplast hücresi

Filtre kağıtları

Besin içeren agar

Agara yerleştirilmiş

besleyici hemşire hücreler

2-3 hafta sonra

koloniler aktarılır

Gövde gelişir

Sitokinin yüksek

auksin düşük agar

2-4 hafta sonra kök

oluşumunu tetikleyen ağara

aktarılır

Kültür kabı

Sitokinin yok

Auksin düşük

besiyeri

3 hafta sonra

toprağa aktarılır

Hibrit bitki

Protoplast birleştirme


Yaprak diskleri

kesilir

Agrobakter içeren

besiyerinde büyütülür

ve bakteriyi içine

alanlar seçilimle seçilir

Hemşire hücreleri üzerindeki

filtre kağıdına aktarılır2-3 gün büyütülür

Gövde büyümesini

tetikleyen besiyeri

Hemşire hücreler büyüme

faktörleri salgılar

2-3 hafta

Gövde büyürKök büyümesini tetikleyen

besiyerine aktarılır

Kökler büyür

3 hafta sonra

toprağa aktarılır

Transgenik bitki

Yaprak parçaları tekniği


Gen susturma

Normal domates

Normal mRNA

(anlamlı)PG

proteini

PG sebebiyle

doğal çürüme

PG geni

Anlamlı mRNA

Anlamsız mRNATransgenik

domates

Anlamsız

mRNA

Sentetik

anlamsız

gen 3 hafta

çürümeyen

domates


Tütün mozaik virüsü

RNA molekülü

1. Virüsün kılıf RNA’sı DNA’ya

dönüştürülür ve TI plazmidine klonlanır

2. Agrobaktere transformasyon

3. Virüsü yapraklara ekle

Antibiyotik direnç

geni

Virüs

kılıfı

geni

Bitki hücresi

Virüs

kılıfı

geni

Transgenik

bitki

Kontrol

bitki

Kontrol yaprak

öldü

Yaprak

yaşadı

Gen aktarılmış

bitkiler kültürde

büyütülür

Bitki kromozomu içinde

yeni geni taşıyan Ti

plazmidi

1.Bitki aşıları

– Aşı geni, bitkinin

DNA’sına yerleştirilir

– Örnek: Tütün mozaik

virüsünün bir geni tütün

bitkisine aktarılır

• Virüs geninin kodladığı

protein, bitkinin

bağışıklık sistemini

uyarır

• Bitki artık virüse karşı

bağışıklık kazanmıştır

3 Pratik uygulamalar


2. Genetik pestisitler

– Bacillus thuringiensis (Bt)

zararlı böcekleri ve larvalarını

öldüren bir bakteridir

– 50 yıldan fazla bir süredir

doğal pestisit olarak

kullanılmaktaydı

– Bt genlerin bir bitkinin

DNA’sına aktarılabilir

• Belirli böceklere karşı

kendiliğinden savunma sağlar

– Kral kelebeklerle ilgili

tartışmalar



3. Güvenli saklama

– Her yıl tarım ürünlerinin saklanması sırasındaki böcek

istilaları sebebiyle milyonlarca dolar kaybedilmektedir

– Avidin proteini üreten transgenik mısır bu istilalara

karşı dirençlidir

4. Herbisit direnci

– Otları öldüren geleneksel ilaçlar, bitkilere de zarar

vermektedir.

– Genel herbisitlere karşı bitkileri dirençli hale getirmek

için genetik müdahaleler yapılabilir

– Otların daha hafif ve çevre dostu herbisitlerle yok

edilmesini sağlayabilir



4. Herbisit direnci

– Örnek: glifosat direnci: normalde önemli bir

biyokimyasal yolakta yer alan bir enzimi

engeller.

– Transgenik bitkiler glifosattan etkilenmeyen

alternatif bir enzim üretir

– Günümüzde üretilen çoğu soya fasülyesi

herbisit direnç geni içerir

– Maalesef glifosata dirençli otlar da evrimleşti

– Sonuçta bunu engellemek için tozlaşmayan

kısır bitkiler üretildi



5. Artırılmış besin içeriği

– Altın pirinç, vücutta A vitaminine dönüştürülen

beta karoten içerecek biçimde transgenik

yapılmıştır.

– Çevreci örgütlerin endişeler ile ilgili

konuşmaları sebebiyle 2011 itibaryle çiftçiler

bu pirinci ekmemektedir



6. Farmakolojide bitki biyoteknolojisi

– Bitkiler ideal protein fabrikaları olabilirler

– İlaç üretimi için kullanılabilirler

• Soğuk zincir gerektirmeyen, ucuz ve yenilebilir

aşılar

• «Moleküler tarım" insan sağlığı için gerekli olan

moleküllerin

– Fitokimyasallar, antikorlar, kan ürünleri, sitokinler,

büyüme faktörleri, hormonlar, enzimler



7. Bitki biyoteknolojisi geleceği: yakıtlar

– Biyoyakıt: biyolojik ürünlerden elde edilen yakıttır.

– Fosil yakıtlara alternatif yakıtlara ihtiyaç artmaktadır

– Fakat henüz çok verimli üretim yapılamamaktadır.

• Gelecekte, bitki artıklarını etanole dönüştürmek

üzere, şekere dönüştürmek isteniyor

• Algler petrole yeni alternatif olabilir



4 Sağlık ve Çevre endişeleri


4 Sağlık ve çevre endişeleri

• İnsan sağlığı

– Normalde bitkide olmayan yabancı genlerin

etkisi

• Alerjik tepkiler

• Seçilim için kullanılan antibiyotik direnç genleri,

insanlardaki bakterilere geçebilir mi?

• Kansere sebep olur?

– Bugüne kadar bilim bu görüşleri

destekleyecek kanıt bulamamıştır


4 Sağlık ve çevre endişeleri

• Güvenlik endişeleri bir endüstriyi sarsacak

kadar güçlü olabilir

– 2000 yılında patatesi işleyen fabrikalar GD

patatesleri almayı bıraktılar.

– Tehlikelerine dair bir işaret bulunamadı

• Çevre

– Böcek veya ota direnç genleri otlara yayılabilir

– Az sayıda uzman bunun olacağını

düşünmekte; daha fazla çalışma gerekiyor

• Düzenlemeler

– satıştaki gıdalar kontrol ediliyor

– yetiştirme yöntemleri denetleniyor

C H A P T E R


Lisa Werner


Hayvan

Biyoteknolojisi


Konu başlıkları

• Hayvan biyoteknolojisine giriş

1 Araştırmada hayvanlar

2 Klonlama

3 Transgenik hayvanlar


Hayvan biyoteknolojisine giriş

• Genetiği değiştirilmiş hayvanların kullanım

alanları

– Yeni tedaviler geliştirmek

– Gıda ihtiyacını karşılamak

– İnsanlar dahil tüm hayvanların biyolojisini

anlamak

• Bilimsel ve etik problemleri beraberinde

getirmektedir.



• Hayvan modelleri

– Hayvanlar ve insanlar arasında pek çok genetik ve fizyolojik benzerlik vardır.

– Geçtiğimiz yüzyılda gerçekleşen tıbbi gelişmelerin çoğunluğuna hayvanlarla yapılan araştırmalar ön ayak olmuştur.

• Çiçek aşısı

• Diyaliz

• Katarakt ameliyatı

– Hayvan sağlığında da önemli gelişmeler yaşandı

• Biyoteknoloji sayesinde 111 adet veteriner malzemesi ve aşısı üretilmiştir.


• Hayvanlar yerine sadece hücreler

kullanılamaz mı?



• Genellikle kullanılan hayvanlar

– Safkan fare ve sıçanlar

• Kullanılan diğer türler

– Zebrabalığı, meyve sineği, yuvarlak

solucanlar

• Köpekler, maymunlar, şempanzeler,

kediler deney hayvanlarının %1’den azını

oluşturmaktadır.



• Zebra balıkları 3cm uzunluğundadır, bu sayede

küçük alanlarda çok miktarda büyütülebilirler

– Nesiller arasında 3 ay vardır

– Bir dişi ortalama 200 yavru yapar

– Zebra balıkları gelişim ve genetik çalışmaları için

idealdir.

• Hızlı büyüme

• Embriyo yumurtanın içinde görülebilir

• Yumurtaya gen aktarımı kolaydır – Bir verici anneye ihtiyaç

yoktur



• Erken ilaç toksisite deneyleri için sıçanlar,

farelere göre daha uygundur

– İlaca yanıtları insanlara daha çok benzer

– Büyük vücutları, cerrahi ve fizyolojik

deneylere daha uygundur

– Üzerlerinde daha fazla toksik deney

yapıldığından daha iyi anlaşılmıştır



• Kedi, köpek ve primatlar kendilerine has

biyolojileri önemli olduğunda belirli

durumlarda kullanılır

– Köpeklerin akciğer ve kardiyovasküler

sistemleri insanlarla benzerdir.

– Maymun ve şempanzeler HIV’e duyarlılık

açısından insana benzeyen tek türdür.

• Son 20 yılda deneylerde kullanılan bu

hayvanların sayıları azalmaktadır



• Amerikan Gıda ve İlaç Kurumunun (FDA)

zorunlu tuttuğu mevzuata göre yeni ilaç,

tıbbi uygulama ve kozmetik ürünler

güvenlik testlerinden geçmelidir.



İLAÇ ONAYI İÇİN GEÇİLMESİ GEREKEN TEST FAZLARI

FDA faz testleri, insanlarda denenmeden önce hayvan deneylerini gerektiren klinik öncesi testleri içerir. Eğer ilaç adayının

toksik olmadığı ve faydası olduğu kanıtlanırsa Araştırmada Yeni İlaç statüsü kazanır. Eğer 3 fazlı insan testlerini geçerse Yeni

İlaç Başvurusu statüsüne geçer. Bu durumdaki bir ilaç 2.5 yıl daha test edilir. TOPLAM 12 yıl.

Klinik öncesi test Faz I Faz II Faz III FDA Faz IV

Yıl 3.5 1 2 3 2.5 Toplam 12

Test yapılan Laboratuvar 20-80 sağlıklı 100-300 1000-3000

hayvanları gönüllü hasta hasta

gönüllü gönüllü

Amaç Güvenlik ve Güvenlik ve Etki ve Etki doğrulama, Değerlendirme, Onaydan

biyolojik doz yan etki uzun süreli kullanım onay sonra

aktivite yan etkileri değerlen

dirme

Başarı oranı 5000 bileşik 5’i faz testlerine girer 1’i onay alır

değerlendirilir


• Hücre kültüründeki ilk denemeler yüksek

toksisiteye işaret ederse, zaten hayvan

deneylerine hiç geçilmez.

• Lab-hayvanlarıyla ön çalışmalarda, herhangi bir

toksik durumun gözden kaçmaması için

birbirine benzeyen türler seçilir.

• Emilim hızı, kimyasal metabolizması ve vücuttan

atılım için gereken süre hayvan modellerinde

belirlenebilmektedir

• Önemli problemler tespit edilirse, ilaç klinik

çalışmalara giremez.



• Hayvan modellerine alternatifler

– Hücre kültürü ve bilgisayar modelleri

• Hücre kültürü

– Maddelerin toksisitesini görme amaçlı öncül deneyler

– Biyoloji açısından temel sorulara cevap verir

– Yaşayan bir organizmadaki etkileri hakkında bilgi

veremez

• Bilgisayar Modelleri

– Belirli moleküler ve kimyasal yapılar ve bunların

etkileşimlerinin simülasyonlarını içerir.

– Programlama ve fizyoloji bilgisiyle sınırlıdır.



• Hayvan Araştırmalarında düzenlemeler

– Federal Hayvan Refahı Hareketi: Deney

hayvanlarının barınması, beslenmesi,

temizliği ve tıbbi bakımlarına belirli standartlar

getirir

– Üniversite Değerlendirme Kurulları: Her

araştırmacılar deneylerinde hayvan

kullanımının gerekli olduğunu kanıtlamalıdır,

en uygun hayvanı seçmelidir ve mümkün olan

en az sayıda hayvanı kullanmalıdır



2 Klonlama

• 1997’de bir yetişkin hayvanın hücre

çekirdeğinden ilk defa olarak bir hayvan

klonlandı

– Koyun Dolly

• İnsan klonlamasına yönelik endişeleri

ortaya çıkardı

• Dolly büyük bir buluştu, çünkü erişkin bir

hücreden geliştirilmişti

– Özellikleri bilinen bir yetişkinin tam kopyası


Yumurta verici

Yumurtalar toplanır

ve kültürde büyütülür

Yumurta

Sitoplazma

Yumurtadan DNA

çıkarılırSomatik hücre verici

Somatik hücreler

kültürde büyütülürSomatik hücre çekirdeği

yumurta sitoplazması

yanına yerleştirilir

Yumurta sitoplazması ve

somatik hücre çekirdeği

düşük elektrik yükü ile

birleştirilir

1-hücre klonlanmış

embriyo

Kültür aktive edilir

– 7 gün

Klonlanmış blastosist

Embriyo transfer edilir

– 278 gün

Klonlanmış inek

• Bir yetişkinden klon

üretmek

– Yetişkin canlının somatik bir

hücresinden alınan DNA,

başka bir hayvandan alınan

yumurtaya aktarılır

– Yumurtanın DNA’sı daha önce

alınmıştır

– Verici hücrenin DNA’sı yumurta

hücresine aktarılır

– Bölünmesi için uyarılır

– Embriyo taşıyıcı anneye

yerleştirilir.

– Koyun, domuz, keçi, sığır,

klonlanmıştır

2 Klonlama


2 Klonlama

• Klonlamada sınırlar

– Verici hücre yaşayan bir

organizmadan gelmelidir.

– Klonlar tam olarak aynı

değildir.

• Çevre ve deneyimler tarafından farklı şekillendirilir.

– Başarı oranı düşüktür

• Dolly 277 denemenin sonucudur

• Karbon Kopya adı verilen kedi 87 denemenin

ürünüydü

– Klonlar zamanından önce yaşlanabilirler

• Kısa telomerler


2 Klonlama

• Klonlamanın geleceği

– Halen genç bir bilimdir ve deneysel

çalışmaların artması gerekmektedir.

– Klonlanmış hayvanlar araştırmalarda

avantajlıdır çünkü aynı genetik yapı sayesinde

uygulamaların sonuçları daha güvenilir olur.

• Gelişim, yaşlanma ve hastalıkların hücresel ve

moleküler temellerini anlama açısından çok değerli

olabilir

– Nesli tükenen hayvanların üretimi için

kullanılabilir.

–


Pronükleus

Erkek ve dişi

çekirdeklerin

birleşmeden önceki

döllenmiş yumurtaYabancı DNA

çekirdeklerden birine

enjekte edilir

Yumurtalar

taşıyıcı anneye

aktarılır

Yavruların %10-%30

arası yabancı

DNA’yı içerir

Yabancı

DNA’yı

içeren fareler

üretilir


• Hayvanlara

yabancı genetik

madde aktarımı



• Çiftlik hayvanlarının üretimini artırmak için gen

aktarımı kullanılabilir

– Daha hızlı büyüme için gen = daha hızlı pazara verilir

ve daha düşük maliyetli

• Daha sağlıklı gıdalar için kullanılabilir

– Kolesterol üretiminde görev alan genlerle biraz

oynanırsa, daha düşük kolesterol içeren yumurta

üretimi sağlanabilir.

– Herman, adındaki boğa insan laktoferin genini

taşıyordu ve bu da yavrularının sütündeki demir

miktarını artırıyordu.



• Hayvanları hastalıklara karşı dirençli yapacak genler aktarılabilir

• Mastite (süt bezlerinin iltihabı) dirençli inekler üretildi

– S. Aureus bakterisini öldüren bir gene sahipler

– İlk veriler başarılı görünüyor

• Kanada’da EnviroPig üretildi

– Tükürüğünde fitaz enzimi üreten domuz

– Fitaz domuzların yiyeceğindeki fosfatları parçalar,

böylece domuzlar daha az fosforlu dışkı üretirler

– Fosfor domuz çiftliklerinin başlıca kirlilik kaynağıdır



• Gıda güvenliğinde gelişmeler

– Çiftlik hayvanlarına hastalık direç genleri

aktarımı, her yıl besin zehirlenmesinden

kaynaklanan binlerce ölümü azaltabilir.

– Ayrıca antibiyotik kullanımını da azaltacaktır!!


İnsan

DNA’sı

İnsan bağışıklık genlerini

içeren yapay kromozom inek

somatik hücrelerine aktarılır

İneğin kendi bağışıklık genleri susturulur

İnsan bağışıklık

genleri içeren canlı

Üretim

Antijenle uyarılma

Serum toplama ve saflaştırma

İnsan antikorları

• Biyoreaktör olarak

transgenik hayvanlar

– Hayvan vücutları protein

üreten biyoreaktörler olarak

kullanılabilir

– İstenilen proteinin geni hedef

hücreye aktarılır

– Klonlama teknikleriyle, bu

hücre yetişkin bir hayvan

olmak üzere büyütülür

– İstenilen proteince zengin

süt veya yumurta üretir




• Biyoreaktör olarak transgenik hayvanlar

– Biyoçelik, kurşun geçirmez yelekleri ve cerrahi iplikleri güçlendirmek için kullanılabilir

• Dünyadaki en güçlü malzemelerden biri olan örümcek ağı proteini geni, keçilede aktarıldı ve sütlerinde üretilmesi saglandı

– Bir insan geni olan, Atryn, kalıtsal pıhtılaşma eksikliği olan hastalar için gereklidir

• Süt bezlerinde Atryn geni taşıyan transgenik keçiler, geleneksel yöntemlerden çok daha hızlı, ucuz ve güvenilir şekilde bu proteini üretiyor.

C H A P T E R


Lisa Werner


UYGULAMA

DNA parmak izi

ve adli

biyoteknoloji


Konu başlıkları

• Giriş

• 1 DNA parmak izi nedir?

• 2 DNA parmak izi hazırlama

• 3 DNA’yı kullanmak

• 4 DNA ve delil kuralları

• 5 Ailesel ilişkiler ve DNA profilleri

• 6 İnsan harici DNA analizi


Giriş

• Adli bilim – kanun ve bilimin birleşimi

• Tarihten örnekler

– 1800’ler – fotoğraf

– Erken 1900’ler – parmak izi

• DNA parmak izi – 1985

– Her bireyin genetik altyapısında bulunan

özgün imza


1 DNA parmak izi nedir?

• Her birey kendine özgü gen setleri taşır

– DNA’nın kimyasal yapısı aynıdır fakat baz

çiftlerinin sıralanışında farklar bulunur

• Her hücre, organizmayı tanımlayan bir

DNA setine sahiptir

• DNA’nın sadece %0.1’i kişiden kişiye

değişir


1. birey 2. birey

Uzun parçalar

Kısa parçalar

1. birey 2. birey

Restriksiyon enzim ile kesim


• DNA profilleme genomun küçük bir

bölümüne dayanır• 1-100 baz çifti arasında değişen tekrarlı diziler

• Her birey bazıları anneden, bazıları da babadan

gelen tekrarlı diziler içerir


Tekrarlı

dizilerin

anatomisiKromozom

Kromozom lifi

lifi

DNA zinciri

Yan dizi Tekrarlı dizi (TTA)8 yan dizi


• FBI, kendi DNA

parmak izi

kütüphanesinde

analiz ve

karşılaştırma için,

13 özgün tekrar

dizisi seçmiştir• Birleşik DNA Indeks

Sistemi (CODIS)

1 DNA parmak izi nedir?

13 CODIS lokusu


• DNA parmak izi karşılaştırmalı bir süreçtir

– Olay yerinden alınan örnekler, şüpheli DNA ile

karşılaştırılmalıdır

– En iyi şüpheli DNA’sı taze alınmış kandır

• Lökositler

– 10 yıllık örneklerin DNA’ları bile PCR kullanılarak analiz

edilebilir

• DNA örnekten ayrıştırılır• Kimyasal olarak

• Mekanik olarak

• PCR – olay yerinde bulunan DNA’nın analiz

edilebilecek miktara çoğaltılması

– CODIS’te belirlenen tekrarlı dizi bölgelerinin çoğaltılması

için yan dizilere yönelik primerler kullanılır

2 DNA parmak izi hazırlamak


2 DNA parmak izi hazırlamakTekrarlı bölge 1 Tekrarlı bölge 2

Olay yeri

DNA’sı

Şüpheli

DNA’sı

Tekrar sayıları uyumlu Tekrar sayıları uyumsuz

Çoğaltılmı

ş Olay

yeri

DNA’sı

Çoğaltılmış

şüpheli

DNA’sı

Uzun parçalar

Kısa parçalar


– Tekrarlı dizi analizi

• PCR ile çoğaltmadan sonra alleller elektroforezle

ayrılır ve tespit edilir

• Homolog kromozomlardaki allellerin tekrar sayıları

belirlenir



• FBI 13 adet tekrarlı dizi bölgesi

kullanmaktadır

– İki bireyin 13 lokusta da aynı DNA profiline

sahip olma olasılığı milyarda 1’den azdır

– Her tekrar bölgesindeki tekrar sayısı kişiye

özgüdür ve allel olarak adlandırılır

• Ör: Kromozom 7’deki D7S820 bölgesi 5 ila 16

GATA tekrarı içerir

• D7S820 bölgesinde 10 ve 15 allellerine sahip bir

kişi, bunların 10 tekrarlı allelini bir ebeveynden ve

15 tekrarlı olanını diğer ebeveynden almıştır



3 Sonuca varmak

• Olay yerinden alınan delil ile bilinen bir

kaynaktan alınan örnek karşılaştırılır

• Karşılaştırmalar eleme prensibine dayanır

– Bir fark bulunana kadar analiz devam eder.

– İstatistiksel olarak kabul edilebilir bir miktarda

testten sonra bir fark bulunamazsa, örneklerin

eşleşme olasılığı yüksek anlamına gelir


3 Sonuca varmak

Sonuçlar: Dorothy Smith, bıçak üzerinde bulunan kan örnekleri (Knife blade stain A ve B)

şüpheli listesinden elenebilir. Kimliği belirsiz kişi (Jane Doe) şüpheli listesinden elenemez.


• Narborough Kasabası cinayetleri

– 1983’de genetik parmak izinin ilk defa kullanımı rapor edilmiştir

– İngiltere’de bir cinsel saldırı ve cinayet vakası• Baş şüphelinin DNA’sı olay yerinde bulunan DNA ile

eşleşmedi

• Polis civardaki 5500 muhtemel şüpheliden örnek topladı

• Hiçbir DNA örneği olay yerindekiyle eşleşmedi

• Sonuçta anlaşıldı ki şüphelinin bir arkadaşı, şüphelinin yerine örnek vermişti

3 Sonuca varmak


• Görgü tanıklarının ifadesi DNA testinden

daha güvenilir midir?

• Hills Ormanı tecavüzleri

– Victor Lopez 3 kadına cinsel saldırıda

bulunmakla suçlandı

• Görgü tanığı ifadesine göre saldırgan siyahiydi

fakat Lopez siyah değildi

– Lopez‘in DNA’sı olay yeri ile eşleşti

3 Sonuca varmak


• Simpson/Goldman cinayetleri

– DNA analizi için 2 kurban dahil 45 örnek toplandı.

Olay yerinde, şüphelinin evinde ve arabasında kan

damlaları bulunmuştu

– Ön duruşmalarda olay yerinden alınan DNA

örneklerinin O. J. Simpson’ınki ile eşleştiği bildirildi

– Savunma avukatları delil toplanması, kayıt tutulması

ve test yöntemlerine itiraz ettiler

– Delillerle oynanma

ihtimali belirdi

– DNA delili

kullanılamadı

4 DNA ve delil kuralları


5 DNA profilleri ve aile ilişkileri

• Babalık testi

– Bu adam, çocuğun babası mıdır?

Anne

Çocuk

Baba?


• Mitokondri DNA’sı

– Tekrarlı dizileri analiz edilemeyen örnekler bu

yöntemle incelenir

• Çekirdek yapısı taşımayan eski örnekler (aç,

kemik, diş)

– Sadece anneden kalıtılır

– 1 milyon yılda 1 defa rastgele mutasyon

sebebiyle %’1 değişime uğrar



Mavi ile gösterilen

kişilerin mtDNA

profili

Farklı bir kişinin

mtDNA profiliBüyük DNA

parçaları

Küçük DNA

parçaları

Erkek Dişi

Belirli bir dişinin tüm

çocuklarında aynı mtDNA

profili gözlenir


• Y-Kromozom Analizi

– Babadan oğula doğrudan geçer

– Erkekler arasındaki ilişkileri takip etmek için

veya pekçok erkek şüpheli içeren delilleri

incelemek için kullanılır



http://www.nytimes.com/library/national/science/050200sci-genetics-evolution.html

http://www.nytimes.com/library/national/science/050200sci-genetics-evolution.html


6 İnsan harici DNA analizi

• Cabernet Sauvignon üzümlerinin ataları– Fransa’da hibrid üzümler daha az değerli

kategorisindedir

– cabernet sauvignon üzümlerinin atasının cabernet franc ve sauvignon blanc olduğu DNA yöntemleriyle belirlenmiştir

• Bir avcının yasadışı ayı öldürdüğü kanıtlanmıştır– Mağaradaki bir ayıyı öldürmek yasaktır

– Bir tanık mağaranın içinde ateş edildiğini bildirmiştir

– Mağara ve ayıdan alınan kan örnekleri uyuşmuştur

• Bu siteden kendiniz sanal labda

elektroforez yapabiliyorsunuz.

– https://learn.genetics.utah.edu/content/labs/ge

l/


https://learn.genetics.utah.edu/content/labs/gel/

Ödev 8

• Bir kadın, bir erkek ve 4 çocukları için DNA parmak izi

analizi (jel görüntüsü) verilmiştir. Test tek bir lokus için

yapılmıştır (bir kişi için sadece 2 allel bulunur). Buna

göre hangi çocuk, bu çiftin biyolojik çocuğu olmayabilir?


Çocuk 1

Çocuk 2

Anne

Baba

Çocuk 3

Çocuk 4

Mikrobiyal, Bitki ve Hayvan Biyoteknolojisikisi.deu.edu.tr/asli.memisoglu/Biyoloji...

Documents

Transcript of Mikrobiyal, Bitki ve Hayvan Biyoteknolojisikisi.deu.edu.tr/asli.memisoglu/Biyoloji...