Microscopia Electrnica de Trasmisin

MICROSCOPIA ELECTRNICA DE TRANSMISININTRODUCCINLa Microscopia Electrnica de Transmisin ha contribuido significativamente al conocimiento de la clula y su funcin. La utilizacin de un fino haz de electrones acelerados a una gran velocidad como fuente de iluminacin, confieren al microscopio electrnico una alta resolucin, lo que le convierte en una herramienta indispensable en muchos campos de la biologa y la medicina, cuando se trata de estudiar la ultra-estructura de clulas y tejidos. En esta tcnica, un haz de electrones acelerados a una gran velocidad al aplicarles una elevada diferencia de potencial, atraviesa la muestra, producindose la dispersin de los mismos en diferentes trayectorias caractersticas de la ultra-estructura del material observado. Colocando una barrera fsica de pequea apertura angular por debajo del plano de la muestra, los electrones dispersados segn ciertos ngulos, sern eliminados del haz, siendo la imagen formada menos intensa en aquellas zonas correspondientes a una mayor masa de la misma. La imagen formada es aumentada y proyectada sobre una pantalla fluorescente para su visualizacin en tiempo real, pudiendo registrarse tanto digitalmente como en negativos para su estudio posterior. [1]Dentro de la familia de microscopios electrnicos, se encuentran el microscopio electrnico de transmisin (TEM) y el microscopio electrnico de barrido (SEM). Cada uno de ellos, permite el estudio de diferentes caractersticas de una muestra. El SEM provee informacin sobre morfologa y caractersticas de la superficie, mientras que con el TEM podemos observar la estructura interna y detalles ultra-estructurales.Un gran avance se ha alcanzado con la incorporacin de tcnicas de procesamiento de imgenes para revelar detalles especficos de inters, algunos de ellos ligados a la ultra-estructura de la muestra. [2]Nos proporciona una gran informacin como: La informacin estructural especfica de la muestra segn las prdidas especficas de los diferentes electrones del haz. El conjunto de electrones que atraviesan la muestra son proyectados sobre una pantalla fluorescente formando una imagen visible o sobre una placa fotogrfica registrando una imagen latente. Se puede evaluar detalladamente las estructuras fsicas y biolgicas proporcionando unos 120.0000 aumentos sobre la muestra. BREVE HISTORIA

Las ideas que llevaron a la puesta a punto del microscopio electrnico de alta resolucin tuvieron su origen en muy diversos estudios, el descubrimiento del electrn como partcula cargada con masa en reposo; los haces de estas partculas se pueden desviar y concentrar mediante campos elctricos y magnticos con este principio se construyo el primer oscilgrafo y dio pie para que Luis de Broglie en 1924 lanzara su extraordinaria hiptesis segn la cual haba de asociar una naturaleza ondulatoria a cada partcula material, Y en particular a los electrones. Dedujo la frmula para la longitud de onda de dichas ondas materiales donde es la constante de Planck, la masa de la partcula y su velocidad. Si se sustituyen valores de esta ecuacin para un electrn acelerado por un potencial de 60.000 voltios, resulta una longitud de onda de solo 0,05 , lo que representa 1/100.000 de la luz visible. Poco despus, en 1926, E. Schrdinger comenz el desarrollo de la mecnica ondulatoria haciendo uso de las analogas mecnico-pticas demostradas por W.R. Hamilton en 1830, y combinndolas con las ideas de De Broglie. En 1927 La hiptesis de De Broglie fue confirmada experimentalmente con haces electrnicos por Davisson y Germer en los Estados Unidos y por Thomson y Reid en Inglaterra. Los primeros en desarrollar el microscopio electrnico fueron Ruska y Max Knoll, hacia la dcada de 1930 (Bozzula y Bartlerr, 1997).Con el desarrollo del microscopio electrnico se lleg al territorio celular desconocido hasta el nivel del nanmetro, pero el escaso poder de penetracin del haz de electrones hizo necesario el desarrollo de tcnicas que dejaran las muestras a examinar de extraordinaria finura (una millonsima de centmetro) y su examen debe realizarse bajo intenso vaco. Adems de la construccin de instrumentos necesarios para reducir las muestras a cortes ultra finos (Duve, 1988). El primer microscopio electrnico fue usado por ingenieros y fsicos. El uso del microscopio en el campo de la Biologa, fue en sus inicios para estudios puramente descriptivos, pero con el tiempo se ha usado en estudios experimentales. Para el desarrollo y origen de la Biologa Celular fue determinante la aparicin del microscopio electrnico. Actualmente su uso es multidisciplinario (Bozzula y Bartlerr, 1997). En 1926 despus de 15 aos de estudio sobre la trayectoria de los electrones en campos magnticos, H. Busch pblico un artculo en el que mostraba que un campo elctrico o magntico con simetra axial era capaz de actuar como una lente para los electrones u otras partculas cargadas. El trabajo de Busch atrajo la atencin de los fsicos del momento hacia una consecuencia prctica importante de las teoras de De Broglie y Schrdinger, y dio origen a una nueva ciencia de instrumentacin que se conoce desde entonces como ptica electrnica, ciencia que busco el desarrollo de la microscopia electrnica. [3]NATURALEZA DE LAS ONDAS DE ELECTRONESDe Broglie mostr que una partcula movindose a una velocidad cercana a la de la luz tena una forma de radiacin asociada con ella. Esta relacin est expresada por:

donde es la longitud de onda, hla constante de Plank, m la masa de la partcula y v su velocidad.Si la partcula es un electrn y su velocidad 1/3 de la velocidad de la luz, = 0.05 A. que es 100.000 veces ms corta que la luz verde. Por lo tanto, la resolucin de un microscopio que emplee este tipo de radiacin ser mucho mejor que la de un microscopio de luz.La naturaleza precisa de estas ondas de electrones es difcil de entender en trminos de la fsica clsica y su descripcin se hace mediante la mecnica cuntica.Las ondas de electrones se pueden pensar como un quantum o paquete de radiacin que acompaa a cada electrn en su trayectoria, es parte de l y permanece con l. Las caractersticas de estas ondas dependen de la posicin exacta de un dado electrn en el espacio y en el tiempo; puede expresarse como la probabilidad de encontrar al electrn en esa posicin.Las ondas de electrones no deben confundirse con radiacin electromagntica, como la que se produce cuando un haz electrnico interacta con la materia, pierde energa y produce una radiacin cuya longitud de onda pertenece al espectro electromagntico.EL MICROSCOPIO ELECTRNICO EN ESENCIAFundamentos: Las radiaciones electromagnticas poseen una longitud de onda de propagacin muy corta. Los electrones se desvan de su trayectoria recta de propagacin cuando atraviesan un campo magntico circular. Al producirse un alto vaco los electrones se desprenden de la fuente luminosa formada por wolframio incandescente.Fuente y flujo de electrones La fuente es un ctodo constituido por un filamento de wolframio incandescente. Los electrones son trmicamente arrancados a baja velocidad. Los electrones son acelerados mediante la creacin de un alto potencial (cilindro de Wehnelt), el cual permite una trayectoria rectilnea de los electrones de muy baja longitud de onda. Los electrones se desvan de su trayectoria al atravesar un acampo electromagntico (lente electromagntica). La desviacin se acenta al colocar varias lentesUn haz muy desviado, muy abierto, se recoge en una pantalla fluoroscpica para poder ser visible al ojo humano.

MICROSCOPA ELECTRNICA DE TRANSMISIN CONVENCIONAL (TEM)

La Microscopa Electrnica es una poderosa herramienta que permite la caracterizacin de materiales utilizando para ello un haz de electrones de alta energa que interacta con la muestra. La formacin de imagen en microscopa de transmisin es bsicamente un fenmeno de interferencia, y en general se puede hacer una analoga entre los principios de la ptica geomtrica y el funcionamiento de un microscopio de transmisin.En un microscopio ptico convencional la resolucin viene dada por la longitud de onda con que se ilumina el objeto (unos 550 nm). Si fuera posible disponer de una radiacin de longitud de onda mucho menor, y de lentes que la focalizaran, la resolucin alcanzable sera mucho mayor. El empleo de un haz de electrones rpidos, con energas tpicas de 100-400 keV, satisface estas condiciones. La longitud de onda de los electrones del haz incidente viene dada por:

(1)

donde h es la constante de Plank, p el momento y E el voltaje acelerador de los electrones, y e y m la carga y masa del electrn. La masa y el voltaje incluyen efectos relativistas. Para electrones de 200kV la longitud de onda es de unos 0.0025 nm. [4]El valor de sta determina el rango angular de la dispersin o scattering dentro de la muestra (del orden de 10-2 radianes). En TEM convencional un haz de electrones que procede de un can ilumina el espcimen, a travs de un sistema de lentes, tal como se esquematiza en la figura 1. Los electrones extrados del filamento y focalizados por el sistema de lentes interaccionan con la muestra y son dispersados, siendo entonces focalizados por la lente objetivo. Despus una o ms lentes proyectoras proporcionan una imagen con los aumentos convenientes. Desafortunadamente, la conservacin de lasamplitudes y fases en la funcin de onda electrnica entre la superficie de salida de la muestra y el plano de la imagen solo sera posible mediante el empleo de una lente perfecta con una apertura angular infinita. Sin embargo, las lentes magnticas son pobres en comparacin con las pticas, y sus aberraciones limitan el rango angular de la radiacin dispersada que se puede utilizar para extraer informacin til. Estos efecto aumentan rpidamente con la apertura angular, limitando seriamente la resolucinalcanzable. El lmite de resolucin viene dado por:

(2)donde CS es el coeficiente de aberracin esfrica y es longitud de onda de los electrones.

Figura 1: Esquema de funcionamiento de un microscopio electrnico de transmisin, en que se muestran los dos modos bsicos de operacin: (a) proyeccin del diagrama de difraccin sobre la pantalla, y (b) proyeccin de la imagen sobre la pantalla. En ambos casos la lente intermedia selecciona el plano focal anterior o el plano imagen de la lente objetivo respectivamente como objeto para formar el correspondiente diagrama de difraccin de electrones o la imagen.

En comparacin con otras radiaciones de longitud de onda similar (rayos x, neutrones) los electrones interactan fuertemente con la materia. Para dispersin o scattering elstico, los recorridos libres medios en slidos cambian desde unos cientos de Angstroms para los elementos ms ligeros a unas decenas para los ms pesados para electrones de 200 keV. En procesos inelsticos, con recorridos libres medios de cientos o miles de angstroms el haz incidente pierde energa para crear excitaciones en la muestra. Para alta resolucin, los procesos de dispersin elstica son esenciales.Un haz de electrones de alta energa propagndose a travs de un cristal admite una descripcin anloga a la de los electrones de conduccin de un slido, salvo por la alta energa. La interaccin entre los electrones es despreciable, y su movimiento no influye apreciablemente en las vibraciones de la red cristalina (aproximacin adiabtica). Se puede simplificar el problema reducindolo al del movimiento del haz de electrones en el potencial V(r) creado por los ncleos. El proceso de dispersin de la radiacin es complicado, dado que las amplitudes de las ondas dispersadas no estn dadas por la suma de las amplitudes dispersadas por los tomos individuales.

En primera aproximacin, y anlogamente a como se hace en ptica, se puede decir que una onda electrnica atravesando una muestra delgada sufre un cambio de fase cuando la onda entra en un medio con una distribucin de potencial. Para electrones, los ngulos de dispersin son pequeos (10-2 radianes). Al atravesar una muestra delgada (10 nm) el electrn no sufre un desplazamiento lateral mayor que 1 . En estas condiciones el cambio de fase que sufre la onda electrnica depende de la distribucin de potencial a lo largo de la lnea recta de la trayectoria a travs del objeto. Por este motivo, un haz de electrones que atraviesa un objeto caracterizado por una distribucin de potencial (x,y,z) en la direccin z sufre un cambio de fase que es funcin de las coordenadas x,y, y proporcional a la proyeccin del potencial en la direccin z: (3)

El cambio de fase relativo entre una onda que se transmite en el vaco (=0) y una que lo hace a travs de un objeto vendr dado por el producto de (xy) y una constante de interaccin, , que describe la intensidad de la interaccin del haz con la materia. El efecto de este cambio de fase sobre la onda se puede escribir como el producto de la funcin de onda incidente por una funcin de transmisin:

(4)

Esta ecuacin se conocecomo aproximacin fase-objeto (phase object aproximation - POA). Para tener en cuenta los procesos inelsticos, que pueden evitar que algunos electrones contribuyan a la imagen, se puede incluir estos ltimos como un efecto de absorcin representable por una funcin (x,y,z) con una proyeccin (xy).

As, la funcin de transmisin se puede escribir:(5)Aunque la aproximacin POA tiene sus limitaciones es til porque enfatiza la naturaleza no lineal del scattering de los electrones en un slido, es decir, cambios en el potencial proyectado no dan cambios proporcionales en la funcin de transmisin. Para un tomo pesado aislado las diferencias de fase desde el centro al exterior pueden llegar a variar hasta en un factor . Si la onda electrnica pasa sucesivamente por varios tomos a lo largo de una columna los cambios de fase se superponen, y la naturaleza no lineal de la funcin (5) asegura que las amplitudes dispersadas no se suman linealmente.Para muestras delgadas, la funcin de onda electrnica en la superficie de salida se puede describir como una funcin bidimensional 1 (xy) representada como el producto de la onda incidente 0(xy) y la funcin de transmisin de la muestra, q(xy). El proceso de formacin de imagen dentro del microscopio, pues, es producir una representacin ampliada de 1(xy), con el objeto de extraer informacin sobre la estructura de la muestra.El proceso de formacin de la imagen en TEM es un fenmeno de interferencia tremendamente complejo, y la extraccin de informacin sobre la estructura de la muestra no es un proceso directo. Por ejemplo, si despreciamos los efectos de absorcin el nico efecto de una muestra delgada es cambiar la fase de la radiacin incidente. En este caso la imagen perfectamente en foco no mostrara contraste, y mejorar el contraste equivale a obtener imgenes fuera de foco. La interpretacin de las imgenes, pues, necesita de un clculo o simulacin que ayude a comparar la imagen con la estructura real de la muestra.

MICROSCOPIO ELECTRNICO DE TRANSMISIN En un microscopio electrnico de transmisin (TEM), los electrones de una fuente, como la de un can de electrones, entran en la muestra, se dispersan al pasar a travs de ella y se enfocan con un lente de objetivo, se amplifican mediante un lente amplificador (proyector) y finalmente producen la imagen deseada. En la figura 2 se puede leer en el mismo orden de izquierda a derecha (direccin CTEM). La longitud de onda de los electrones en el haz incidente viene dada por la siguiente ecuacin: (6)donde la energa adquirida por los electrones es E = eV y V es el voltaje de aceleracin, expresado en kilovoltios. Si hay tomos pesados muy separados, entonces domina la dispersin, con ngulos de dispersin promedios, dados por la expresin = /d, donde d es el dimetro atmico promedio. Para un voltaje de aceleracin de 100 kV y para un dimetro atmico promedio de 0.15 nm, obtenemos = 0.026 radianes o 1.5. Las imgenes se forman porque los diferentes tomos interactan y absorben electrones en diferente extensin. La situacin en la que tomos individuales de los elementos pesados se separan ms que varios parmetros de red se puede resolver mediante la tcnica TEM.

Figura 2. Diagrama del rayo en un microscopio electrnico de transmisin convencional (paso superior) y en un microscopio electrnico de transmisin de barrido (paso inferior). Se indica la difraccin electrnica del rea seleccionada (SAED), la apertura (Ap) y la muestra (Mues); asi como los lentes de objetivo (Obj) y el proyector (proy) o condensador (cond).

Los electrones interactan con ms fuerza con la materia que los rayos X o los neutrones que posean energas o longitudes de onda comparables. Para una dispersin normal de electrones de unos 100 keV, la distancia promedio atravesada por los electrones se llama paso libre promedio, que vara desde varias docenas de nanmetros para elementos ligeros hasta decenas o quizs centenas de nanmetros para elementos pesados. Los mejores resultados por microscopia electrnica se han obtenido con pelculas de grosores comparables al paso libre promedio. Pelculas mucho ms finas exhiben una dispersin demasiado pequea para poder ofrecer imgenes tiles, mientras que en las pelculas gruesas domina el fenmeno de dispersin mltiple, que provoca una imagen borrosa y difcil de interpretar. Las muestras gruesas se pueden estudiar por la deteccin de los electrones dispersados hacia atrs. Un microscopio electrnico de transmisin puede formar imgenes mediante el uso de la difraccin electrnica del rea seleccionada (SAED), abertura localizada entre los lentes del objetivo y el proyector, como se muestra en la figura 2. La parte principal del haz electrnico transmitido por la muestra consiste en electrones que no han sufrido dispersin alguna.

Figura 3. Posiciones de los detectores de seales en una columna de microscopio electrnico.

El haz tambin contiene electrones que han perdido energa mediante dispersin inelstica, sin desviacin de su paso, as como electrones que han sido reflejados por varios planos cristalogrficos hk. Para poder producir lo que se llama una imagen de campo brillante, la abertura se inserta de tal forma que slo permita que pase el haz de electrones transmitidos sin desviacin, como se muestra en la figura 3. El detector o la pantalla de visualizacin observa la imagen de campo brillante. Si la apertura se coloca para seleccionar uno solo de los haces reflejados de un plano particular hk, como resultado se genera una imagen de campo oscuro en la pantalla de visualizacin. Los detalles de la imagen de campo oscuro que se forma pueden depender del haz difractado especfico (para un plano hk particular), que se selecciona para formar la imagen. La figura 3 muestra las posiciones donde se encuentra localizada la apertura de campo brillante (BF) y de campo oscuro (DF). Para ilustrar esta tcnica de imgenes presentamos en la figura 34 las imgenes de una superaleacin de hierro de la austerita con una estructura FCC que contiene precipitados de 2-3 nm de Ni3(Ti, Al) con una estructura FCC. El patrn de difraccin en la figura 4a, obtenido sin que se hayan usado filtros, muestra manchas grandes y brillantes correspondientes a la superaleacin y manchas pequeas y dbiles de las nanopartculas'. En la imagen de campo brillante, ofrecida en la figura 4b, apenas se pueden ver las partculas , pero los campos de tensin elstica generados por ellas, se pueden observar con claridad. Si se selecciona el haz de la mancha de difraccin ', sealado por la flecha en la figura 4a, para colocar la apertura SAED, la imagen de campo oscuro resultante, presente en la figura 4c, muestra muy claramente las posiciones de los precipitados .Una tcnica llamada procesamiento de imagen se puede usar para aumentar la informacin que se puede obtener de una imagen TEM y para resaltar algunas caractersticas que se encuentren prximas al ruido de fondo. Si es una imagen transformada de Fourier, obtenida por la tcnica altamente eficiente llamada transformada de Fourier rpida, entonces se obtiene una informacin similar a la del patrn de difraccin directo, un ejemplo de las ventajas del procesamiento de imgenes aparece en la secuencia de imgenes de la figura 5 para una nanopartcula de Ni soportada sobre un sustrato de SiO2. La figura 5a muestra la imagen original, mientras que la figura 5b ofrece la transformada de Fourier, que tiene la apariencia de un patrn de difraccin. Las figuras 5c y 5e ilustran los pasos sucesivos en el procesamiento de las imgenes y la figura 5f corresponde a la imagen de un sustrato de SiO2, obtenida por la sustraccin de la imagen de la partcula. Finalmente, la figura 5g presenta la reconstruccin de la nanopartcula de los datos procesados.

Figura 4. Figuras obtenidas por un microscopio electrnico de transmisin de precipitados de Ni2(Ti, Al) de 2 a 3 nm de dimetro, en superaleaciones de hierro; mostrando el patrn de difraccin de la zona FCC que presenta manchas grandes y brillantes de la superaleacin y manchas dbiles de los precipitados (a) imagen de campo brillante mostrando los campos de tensin elstica de 25 nm alrededor de las marginalmente visibles partculas de fase (b) y imgenes de campo oscuro obtenidas usando una apertura SAED para dejar pasar la mancha de difraccin ' marcada con una flecha en (a), (c) La imagen (c) muestra las partculas del precipitado '

Figura 5. Procesamiento de imgenes de microscopio electrnico de transmisin para una partcula de Ni sobre un sustrato de SiO2, que muestra la imagen original de campo brillante (a) la imagen del tipo de patrn de difraccin por transformada de Fourier rpida (b) la imagen procesada con el filtro de apertura mostrado en la figura insertada (c) la imagen con un procesamiento ulterior con el filtro de apertura mostrado en la figura insertada (d) la imagen procesada final (e) la imagen del sustrato SiO2 obtenida por sustraccin de la imagen de la partcula (f) y el modelo de nanopartcula construido desde los datos procesados (g).

COMPONENTES DEL MICROSCOPIO ELECTRNICO DE TRANSMISIN (TEM)

Can electrnico:El tipo ms [usado de can electrnico consiste de un filamento de alambre de tungsteno (10) doblado en forma de V. El electrodo de control se denomina cilindro de Wehndt, y tiene una apertura circular de 1 a 3 mm de dimetro centrada en el pice del filamento. La superficie cncava hace las funciones de nodo, y utilizando una superficie convexa la imagen de la fuente electrnica puede reducirse en tamao respecto al electrodo cncavo. 1,a intensidad total dd haz de ctodo a nodo puede ser de 10 a 400 microamperios, pero solamente una pequea fraccin die ste llega hasta la muestra.Condensadores:Los dos condensadores son capaces de dar una amplia gama de intensidad ajustando el can electrnico. Esto reduce el rea iluminada en la muestra. Sin embargo, otras partes de la muestra tambin sufren los efectos del haz electrnico. El primer condensador reduce la imagen de la fuente mientras que el segundo condensador obtiene la adecuada intensidad de iluminacin.Plataforma para la colocacin de la muestra:La plataforma para colocar la muestra est situada en frente del objetivo.Se introduce la muestra en la columna del microscopio a travs de una abertura.Objetivo:El objetivo es la lente ms importante en eil microscopio electrnico. La distancia foca1 de esta lente est comprendida entre 1 y 5 milmetros, siendo 1.l mm la ms frecuente\. Cuanto menor 0s la distancia focal, mayor es la resolucin. Debido a que el haz de imagen tiene la mxima apertura angular en el primer objetivo, esta lente controla la calidad de la imagen producida. Se puede corregir la aberracin esfrica usando un "stigmator", que es un dispositivo que permite, introducir metal para compensar la inhornogeneidad inherente de la lente, y obtener elevada resolucin. Otro accesorio importante, permite regular la apertura del objetivo, la cual limita la dispersin de los electrones, evitando as la degradacin de la imagen. Esta apertura mejora el contraste siendo 20 y 40 micrmetros (pm) los ms frecuentes. [5]

Lente intermedia:La lente intermedia puede aumentar o disminuir la imagen. Se puede conseguir esto, alimentando o disminuyendo la potencia de la corriente a esta lente.Lente de proyeccin:La lente (de proyeccin corresponde al ocular del microscopio ptico. Su funcin es la de proyectar la imagen real sobre la pantalla fluorescente, y permite una amplia gama de aumentos. Se puede variar la ampliacin de 100 X hasta 300.000 X usando lentes intermedias y de proyeccin.Cmara de observacin:La cmara de observacin y la pantalla fluorescente estn situadas en el fondo de la columna. La imagen se enfoca sobre un punto marcado y el enfoque fino se consigue con unos binoculares de 6 y 20 X. El dimetro del punto de enfoque es de 100, pm, por 10 tanto la imagen debe ser mayor que [este dimetro para ser resuelta. La cmara de observacin est protegida por un vidrio grueso de plomo para evitar la emisin de rayos X.Cmara fotogrfica:La cmara fotogrfica est situada debajo de la pantalla fluorescente. La pantalla fluorescente est sujetada por m lado, y al quitar el paso del haz electrnico la imagen se centra sobre la pelcula fotogrfica. Se pueden usar varios tipos de pelculas y placas de vidrio.

Figura 6. Partes del microscopio electrnico de transmisin.COMPARACION ENTRE MICROSCOPIOS DE LUZ Y ELECTRONICOLos microscopios de luz y electrnico son esencialmente, idnticos. Tanto uno como otro nos permiten amplificar aquellos objetos que son indistinguibles a nuestro ojo. La diferencia fundamental entre los dos es la fuente de iluminacin. Mientras el microscopio de luz utiliza un haz de luz en el rango de las longitudes de onda del visible, el microscopio electrnico emplea un haz de electrones de muy corta longitud de onda que permite obtener una mayor resolucin.Figura 7. Esquema simplificado, ilustrando la semejanza entre microscopio ptico y microscopio electrnico de transmisin. MICROSCOPIOELECTRONICOMICROSCOPIODE LUZ

IluminacinHaz de electronesHaz de luz

Longitud de onda0.037 - 0.086 2000 - 7500

LentesElectromagnticasVidrio

MedioVacoAtmsfera

Resolucin3 2000

Magnificacin100 x - 450000 x10 x - 2000 x

FocalizacinElctricaMecnica

ContrasteScatteringAbsorcin - Reflexin

Una tabla comparativa, entre ambos microscopios se muestra a continuacin. Cabe destacar que la misma, involucra caractersticas generales de los microscopios electrnicos y no considera las diferencias particulares entre TEM y SEM.

Tabla 1. Comparacin entre microscopio electrnico y de luzSIMULACIN DE IMGENES

El problema del clculo de imgenes se convierte en el problema de calcular las amplitudes de las ondas electrnicas en el plano imagen, el plano focal de la lente objetivo y la superficie de salida de la muestra. Normalmente es necesario dividir el clculo en tres partes: 1) Modelizacin de la estructura cristalina de la muestra. 2) Calcular la funcin de onda a la salida de la muestra. 3) Calcular la misma funcin en el plano imagen tras imponer los efectos de la lente objetivo en la onda electrnica de la superficie de salida de la muestra (aplicar la funcin de transferencia del microscopio).De las distintas aproximaciones comnmente utilizadas por los diversos programas la que resulta ms apropiada para nuestra estructura es el formalismo basado ben dividir el cristal, de grosor z en diversas rodajas delgadas de espesor z (multislice method). Para cada rodaja el potencial cristalino se proyecta en un plano (normalmenteel plano de entrada de la rodaja), e introduce una modulacin en la transmitancia de sta. La propagacin del frente de ondas al siguiente corte se asume que tiene lugar en el vaco, a lo largo de una distancia muy pequea, z, y as se reproduce la propagacin del haz a travs de toda la muestra. Esta aproximacin es equivalente a la que se hace en ptica mediante la aproximacin de Fresnel de la ecuacin de la difraccin de Rayleigh- Sommerfeld, en la que el objeto es reemplazado por un nmero infinito de fuentes puntuales secundarias que emiten ondas esfricas, con una amplitud compleja igual al producto del frente de ondas incidente por la transmitancia del objeto. Este mtodo ofrece una solucin directa de la integral equivalente a la ecuacin de Schrdinger dependiente del tiempo(4).Tras calcular la funcin de onda electrnica es necesario tener en cuenta la influencia de la lente objetivo. La distribucin de amplitudes del diagrama de difraccin en el plano focal de la lente objetivo se calcula mediante la transformada de Fourier de la funcin de onda a la salida de la muestra, modulada con un factor de fase asociado a la aberracin esfrica y el desfoco de la lente:(6)

donde representa la transformada de Fourier, T(u,v) es la funcin de transferencia de la lente y u,v son coordenadas en el espacio recproco.

La funcin de onda en el plano imagen viene dada por una transformada deFourier inversa(7)

Y la distribucin de intensidad en la imagen se obtiene multiplicando la funcin de onda en el plano imagen por su conjugada. (8)

PODER RESOLUTIVO

Poder resolutivo de un microscopio: capacidad de poder distinguir dos puntos muy prximos entre s, o mximo nmero de lneas que aparecen a la observacin separadas entre s en la unidad de superficie. Resolucin del ojo humano (= 0.1 mm.): Imposibilidad distinguir puntos separados por una distancia menor. Los microscopios aumentan una imagen hasta la resolucin visual humana. Dimetro de la imagen aumentada, d: (9)Ec. AbbeK, cte. del medio de la lente; n, ndice de refraccin del espacio lente-objeto; , hemingulo de incidencia Microscopio luz ordinaria:d = 0.2 micrasAu = x 550Microscopio luz ultravioleta:d = 0.1 micras Au = x 1000Microscopio electrnico:d = 510 Armstrong Au = x 166000 Al aumentar una imagen no se aumenta el poder resolutivo, la imagen se ve ms borrosa.El aumento mximo til es aquel en el que los objetos se separen por la distancia lmite de resolucin del ojo humano (0.1 mm). [6]

Figura 8. Micrografa electrnica de Transmisin de un polmero. (1cm=0.2 micras)

Figura 9. Bacilos en divisin y mitocondria (60.000X)

LMITE DE RESOLUCIN DEL MICROSCOPIO ELECTRNICO

Tericamente,Si V = 100 kV,= 0,004 nm

D = 0,002 nm. En la prctica, 0,2 nm, para algunos materiales.Figura 10. Distancia entre tomos de Au: 0,2 nm

Por lo tanto debido a las imperfecciones de las lentes electromagnticas, al [7] contraste de las muestras y a la lesin por radiacin, la resolucin en muestras biolgicas de la TEM es de 2 nm. FUENTE DE ELECTRONES

En el filamento los electrones se desprenden por el mecanismo de emisin termoinica. Los electrones de desprenden de un metal por calentamiento elctrico, al oponer una resistencia al paso de corriente. El metal ha de poseer baja afinidad electrnica y baja vaporizacin (larga vida del filamento). Mnima oxidacin del filamento: Realizar el vaco Suministrarle la menor temperatura Duracin mxima depende de: - Punto fusin del metal - Temperatura de trabajo - Voltaje de aceleracin de los electrones El filamento ms comn es de tungsteno (baja afinidad electrnica y alto punto de fusin). Para la aceleracin de los electrones desprendidos se promueve una diferencia de potencial entre el ctodo y el nodo.

ABERRACIONES

La discordancia que existe entre la imagen que se forma y la que se debiera formar; segn la teora de la produccin de imgenes en ptica fotnica y electrnica, se expresa en las aberraciones Aberraciones cromticas: producidas por la variacin de los ndices de refraccin segn las distintas longitudes de onda. Aberraciones geomtricas: producidas aunque el haz sea monocromtico. Las aberraciones se deben tanto a los defectos de construccin del las lentes o forma del campo magntico, as que tambin son consecuencia de la aplicacin de las leyes de refraccin de los haces electrnicos al atravesar dichas lentes. Las diferentes aberraciones pueden ser corregidas en gran manera manipulando el microscopio.

VENTAJAS Y DESVENTAJAS

Los elevados costos de los equipos y la debida adecuacin de una infraestructura para el buen funcionamiento hacen que esta tcnica , se convierten en acceso de investigadores privilegiados . Si embargo, es comn contratar estos servicios por horas o por fotografas requeridas. Los costos de reactivos tambin dan un factor decisivo para la eleccin de esta tcnica. Aun cuando este proceso de investigacin sea costoso, proporciona resultados muy precisos de amplia resolucin y magnificacin. La tcnica de preparacin de las muestras cumple con protocolos establecidos, pero son vulnerables y variados al tipo de investigacin que se realice, contando ms con la experiencia del investigador. La complejidad de los equipos, lo hacen susceptibles a la descalibracin. Nuevamente encontrar las condiciones ptimas requiere de un proceso tedioso y prolongado. La manipulacin de reactivos se torna peligroso por la elevada condicin toxica de los mismos.

Las imgenes obtenidas son monocromticas y planas siendo necesario, en algunos casos, un tratamiento posterior mediante anlisis de imgenes con un software especializado.

APLICACIONES

Observar y fotografiar zonas de la muestra, desde 10 aumentos a 200.000, con una resolucin espacial de 5 nm. Medicin de longitudes nanomtricas. Distincin, mediante diferentes tonos de grises, de zonas con distinto nmero atmico medio. Anlisis cualitativo y cuantitativo de volmenes de muestra en un rango de una a varios millones de micras cbicas. Mapas de distribucin de elementos qumicos, en los que se puede observar simultneamente la distribucin de hasta ocho elementos, asignando un color diferente a cada uno. Perfiles de concentracin, es decir, la curva de variacin de la concentracin de un elemento qumico entre dos puntos de la muestra. Observas la ultraestructura de clulas, bacterias, etc. Localizacin y diagnstico de virus. Control del deterioramiento de los materiales. Control de tratamientos experimentales. Grado de cristalinidad y morfologa. Defectos en semiconductors. Determinacin de estructura cristalina en minerales, metales, etc. Determinacin de impurezas, precipitados, etc. Identificacin de bordes de grano e interfaces en metales. Estudio de fases y zonas cristalinas en polmeros. Determinacin de tamao de partcula en catalizadores, minerales, etc. Identificacin de planos cristalinos. Cambios estructurales de materiales sometidos a diferentes tratamientos trmicos. Realizacin de estudios de histoqumica para identificar compuestos especficos. Estudios de ultra-estructura de tejidos vegetales y animales. Reconocimiento de virus. Estudios de cito-qumica. Estudios de estructuras moleculares.BIBLIOGRAFA[1] http://www.uam.es/investigacion/servicios/sidi/especifica/transmision.html[2]http://www.criba.edu.ar/cribabb/servicios/secegrin/microscopia/apunte_col.htm[3]http://www.javeriana.edu.co/Facultades/Ciencias/neurobioquimica/libros/celular/microelectrans.htm[4] http://ocw.uc3m.es/ciencia-e-oin/caracterizacion-de-materiales/material-de-clase-1/Unidad_4_Tema_TEM.pdf[5] http://upcommons.upc.edu/revistes/bitstream/2099/6074/1/Article03.pdf[6] http://www.uco.es/~iq2sagrl/TranspMicroscopia.ppt[7]http://www.unizar.es/departamentos/bioquimica_biologia/docencia/biologiacelular/archivos/T03.1_Microscopia.ppt