Microscopi e tecniche Microscopiche 2 parte. TaglioTaglio per mezzo di un microtomo, che produce...
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Microscopi e tecniche
Microscopiche
2 parte
•TaglioTaglio per mezzo di un microtomo, che produce sezioni dello spessore di 1-10mm.
•MontaggioMontaggio delle sezioni su vetrini per microscopia.
Sezione non colorata
Tagliare fettine così sottili di campioni biologici di diversa consistenza può essere problematico
-Ecco perché occorre INCLUDERE
-Esistono diversi mezzi di inclusione che conferiscono diversa consistenza ai campioni.
PARAFFINA
RESINA
MIX DI PARAFFINA E RESINE
•ColorazioneColorazione delle sezioni con il metodo più appropriato.– I coloranti sono a base acquosa, per cui si
elimina lo xilene attraverso passaggi in etanolo.
Colorazione automatizzata
ColorazioniColorazioni•ColorazioneColorazione con un
colore brillante di certe componenti del tessuto
•Contro Contro colorazionecolorazione del resto del tessuto con un colore contrastante
Ematossilina/EosinaEmatossilina/Eosina
• EmatossilinaEmatossilina ha affinità per le molecole cariche negativamente (DNA, RNA ed alcune proteine).
• EosinaEosina ha affinità per le molecole cariche positivamente (proteine del citosol).
Perchè questa "slide" Perchè questa "slide" è blu …è blu …
• Se una porzione di tessuto o di una cellula si colora di blu/porporablu/porpora, viene detta basofilabasofila
• È colorata dall'ematossilinaematossilina
• NucleiNuclei e ribosomiribosomi generalmente sono basofili
… … e questa rossa ?e questa rossa ?
• Se una porzione si colora in rosso rosso /arancio /rosa/arancio /rosa, viene detta acidofilaacidofila o o eosinofilaeosinofila
• È colorata dall'eosinaeosina • Sono proteine del
citosol
Altre colorazioniAltre colorazioni• PASPAS
– Per sostanze ricche in zuccheri (muco)
• Tricromica Tricromica (Azan Mallory) *(Azan Mallory) *
– Per i tessuti connettivi
– Le fibre si colorano in blu•Con E&E sono rosa. Le aree bianche sono lipidiLe aree bianche sono lipidi
Adiposo Bianco
• Osmio o Sudan blackOsmio o Sudan black– Per grasso
/lipidi/mielina– I lipidi non incorporano
coloranti acquosi
• Argento ed oroArgento ed oro– Per fibre delicate e
processi cellulari
• GiemsaGiemsa– Per le cellule del
sangue– Simile ad E&E
Mielina
Cellule nervose
Cellule del sangue
Come si osserva il Come si osserva il campione?campione?
• Attraverso un buon microscopio ottico
• Fotografandolo• Misurandolo
Per avere un'idea Per avere un'idea delle dimensioni delle dimensioni delle strutture delle strutture osservate si può osservate si può usare come usare come riferimento un riferimento un eritrocita (eritrocita (˜̃ 8 8 micron)micron)
Interpretate il Interpretate il campione!!!campione!!!
• Dovete pensare in 3 3 dimensionidimensioni
• Sezioni seriali Sezioni seriali sono l'ideale per l'interpretazione e la ricostruzione
Ricostruzione per mezzo Ricostruzione per mezzo di sezioni serialidi sezioni seriali
Microscopia Elettronica Microscopia Elettronica a Trasmissione a Trasmissione
• Elettroni hanno una lunghezza d'onda corta– Alta risoluzione
• Sezioni molto sottili e coloranti elletrondensi
• Gli elettroni passano attraverso il campione
MICROSCOPIA ELETTRONICA
Il microscopio elettronico a trasmissione (TEM)
limite di risoluzione di questo strumento è di 0,2 nm
Un fascio di elettroni attraversa il campione e viene proiettato su uno schermo che trasforma in toni di grigio il numero di elettroni da cui viene colpito.
Condensatore e obiettivo non sono costituiti da lenti, ma da campi magnetici, che hanno lo scopo di deviare le traiettorie degli elettroni verso l'asse.
La maggiore risoluzione del TEM permette di visualizzare strutture non visibili con il microscopio ottico
Risoluzione dell'occhioRisoluzione dell'occhio: 0.2 mm = 200 µmRisoluzione del MORisoluzione del MO: 2,000 Angstroms = 200nmRisoluzione del TEMRisoluzione del TEM: 2 Angstroms
1 mm = 1000 µm1 µm = 1000 nm1 nm = 10 Angstroms
PinocitosiPinocitosi
-I campioni devono essere molto più sottili di
quelli per il microscopio ottico a luce trasmessa
-Non vengono usati coloranti ma sostanze dense
agli elettroni semplicemente per dare contrasto o
anche per marcare anticorpi
Microscopia elettronica
Preparationedel campione
•Fissazione•glutaraldeide•Tetrossido osmio
•Deidratazione•etanolo
(passaggi)• Inclusione•Resine plastiche
•Taglio•ultramicrotomo
(spessore 50-100 nm)
•Colorazione•Metalli pesanti
Cellula eucariotica
Nucleo interfasico
Preparazione di Campioni Preparazione di Campioni Biologici per TEMBiologici per TEM
•1 Acquisizione1 Acquisizione del campione e taglio in pezzi (1cm3)
•2 FissaggioFissaggio del campione con glutaraldeide e poi tetrossido di osmio– L’osmio è un metallo pesante che si
lega ai lipidi, rendendoli elettrondensi (neri)
– Coloranti non legano i lipidi, che nelle sezioni appaiono chiari.
DisidratazioneDisidratazione dei campioni tramite passaggi in soluzioni a concentrazione crescente di etanolo.
InclusioneInclusione dei campioni in piccoli blocchi di resina.
TaglioTaglio dei campioni inclusi con un ultra-microtomoultra-microtomo dotato di lama al diamante (a volte vetro). – La superfice da analizzare
deve essere di circa 0.2 mm. – Lo spessore della sezione
varia da 40 a 100 nm (di solito 65-80 nm).
Montaggio delle Montaggio delle sezionisezioni su di una griglia.
Colorazione Colorazione delle sezioni con nitrato o acetato di uranile e citrato di piombo.
Visualizzazione al TEM
Fotografia, sviluppo ed analisi delle immagini
Vari tipi di Vari tipi di MicroscopiaMicroscopiaElettronicaElettronica
•Transmissione (TEM)Transmissione (TEM)•Scansione (SEM)Scansione (SEM)•Shadow-castingShadow-casting•Freeze-fractureFreeze-fracture•Freeze-etchingFreeze-etching•CryoEMCryoEM•Negative StainingNegative Staining
Microscopia Elettronica a Microscopia Elettronica a ScansioneScansione
• SEM fa una SEM fa una scansione scansione della della superfice del superfice del campionecampione
• Produce Produce immagini 3-immagini 3-DD
IL MICROSCOPIO ELETTRONICO A
SCANSIONE (SEM)
Nel SEM (ed in genere nella microscopia
elettronica) viene sfruttata l’interazione di un
fascio di e- con il campione per ricavare
informazioni sul campione stesso come nel
microscopio luce a riflessione viene utilizzato un
fascio di fotoni
Non vengono registrati gli e- che attraversano il campione bensì quelli secondari che sono emessi a seguito dell’urto del fascio di elettroni contro di esso
Tridimensionalità
La caratteristica preminente delle immagini ottenute con il SEM è l’eccezionale tridimensionalità
- Ciglia e microvilli
Glomerulo renale
Preparazione dei Preparazione dei campioni per SEMcampioni per SEM
•AcquisizioneAcquisizione del del campionecampione– Trattandolo con cura in Trattandolo con cura in
modo da non danneggiare modo da non danneggiare la superficiela superficie
• FissazioneFissazione ee disidratazionedisidratazione
• Non si includeNon si include
• Poggiato su di un Poggiato su di un supporto e supporto e ricoperto con um ricoperto con um metallometallo– Oro, cromo, Oro, cromo,
palladio, carbonepalladio, carbone– Deve essere Deve essere
elettron-conducente elettron-conducente (non elettrondenso)(non elettrondenso)
• Visualizzato al Visualizzato al microscopiomicroscopio
• FotografatoFotografato• Si possono Si possono
analizzare le analizzare le componenti componenti chimiche tramite chimiche tramite raggi Xraggi X