Metodos de Siembra
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GUIAS DE LABORATORiO
DE MiCROBIOLOGíA
Bac. Luz Adiela Gómez Leal
TABLA DE CONTENIDO
Capitulo I 1. Generalidades
1.1. Recomendaciones para el trabajo en el laboratorio de microbiología1.2. Recomendaciones especiales para el manejo del microscopio1.3 .Recolección y transporte de muestras para exámenes microbiológicos.1.4. Conservación de las muestras
Capitulo II2. Clases de muestras para exámenes bacteriológicos 2.1. Recolección de órganos y tejidos2.2. Recolección de materias fecales2.3. Recolección de semen2.4. Recolección de orina2.5. Muestras de sangre2.6. Muestras de suero sanguíneo2.7. Muestras de leche2.8. Obtención de líquidos orgánicos mediante punción2.9. Muestras de heridas abiertas y abscesos2.10. Muestras de piel y órganos accesorios2.11. Muestras de agua para exámenes bacteriológicos2.12. Biopsias2.13. Muestras para anaerobios2.13.1. Toma de las muestras para anaerobios2.13.2. Transporte de las muestras para anaerobios2.13.3. Examen directo de anaerobios2.13.4. Cultivos primarios de anaerobios2.13.5. Incubación de anaerobios2.13.5.1. Jarras de anaerobiosis2.13.5.2. Cámaras de anaerobiosis 2.13.5.3. Tubos previamente reducidos y anaerobiamente esterilizados (pras)2.13.6. Procedimientos de aislamiento de anaerobios
Capitulo III3. Procesamiento de muestras en el Laboratorio 3.1. Procesamiento de muestras en el laboratorio 3.2. Procedimiento de un Coprocultivo3.3. Aislamiento e Identificación de Yersinia Enterolítica3.4. Aislamiento e Identificación de Campylobacter
Capitulo IV4. Acción de agentes físicos y químicos sobre las bacterias 4.1. Generalidades4.1.1. Esterilización: 4.1.2. Desinfección:4.1.3. El desinfectante4.1.4. Antisepsia4.1.5. Antiséptico4.1.6. Saneamiento4.1.7. Germicida4.1.8. Bactericida4.1.9. Bacteriostático4.2. Agentes antimicrobianos4.2.1. Acción de agentes químicos
4.2.1.1. Principales grupos de agentes químicos utilizados en bacteriología4.2.1.1.1. Fenol y sus derivados4.2.1.1.2. Alcoholes4.2.1.1.3. Yodo4.2.1.1.4. Cloro y sus derivados4.2.1.1.5. Metales pesados y sus compuestos4.2.1.1.6. Colorantes4.2.1.1.6.1. Colorantes de trifenilmetano:4.2.1.1.6.2. Colorantes de acridina 4.2.1.1.7. Detergentes sintéticos4.2.1.1.8. Ácidos y álcalis4.2.1.1.9. Glutaraldehido4.2.1.1.10. Quimioesterilizadores gaseosos4.2.2. Acción de agentes físicos4.2.2.1. Calor seco4.2.2.2. Calor húmedo4.2.2.3. Esterilización fraccionada4.2.2.4. Agua hirviente4.2.2.5. Bajas temperaturas4.2.2.6. Desecación4.2.2.7. Presión osmótica4.2.2.8. Radiaciones4.2.2.8. Luz ultravioleta4.2.2.9. Rayos x4.2.2.10. Rayos gamma4.2.2.11. Rayos catódicos o haz de electrones4.2.2.12. Electricidad4.2.2.13. Filtración4.3. Muerte exponencial de una bacteria
Capitulo V5. Pruebas microbiológicas5. 1. Examen fresco5. 2. Coloraciones5.2.1. Preparación de una extensión para teñirse.5.2.2. Secado5.2.3. Fijación 5.2.3.1. Fijación por alcohol5.2.3.2. Fijación por calor5.2.3.3. Fijación por alcohol en frío5.2.3.4. Fijación por acido ósmico5.3. Clases de colorantes5.3.1. Colorantes ácidos5.3.2. Colorantes básicos5.3.3. Colorantes neutros5.3.4. Colorantes indiferentes5.4. Examen de las coloraciones5.5. Clases de coloraciones5.5.1. Coloración simple5.5.2. Coloración con azul de metileno5.5.3. Coloraciones diferenciales5.5.3.1. Coloración de gram5.5.3.2. Coloración acido alcohol resistente5.5.3.2.1. Técnica de coloración de Ziehl- neelsen5.5.3.2.2 Coloración de Kin Youn o método frío
5.5.3.3. Coloración para espiroquetas5.5.3.4. Coloración para rickettsias5.5.3.5. Coloración para micoplasma5.5.3.6. Coloración para chlamydias 5.5.3.7. Coloraciones diferenciales para parásitos.5.5.3.8. Coloración de endosporas5.5.3.8.1. Coloración Shaffer- Foulton5.5.3.9. Coloración para flagelos5.5.3.9.1. Método de Leiffson5.5.3.10. Coloración para Cápsulas5.5.3.10.1. Método de Hiss5.5.3.10.2. Método de John5.5.3.10.3. Método de Tinta China5.5.3.11. Coloración de Gránulos Metacromáticos5.5.3.11.1. Método de Neisser5.5.3.11.2. Método de Albert5.5.3.12. Coloración de Vacuolas Lipídicas5.5.3.13. Coloración de Sangre5.5.3.13.1. Método de Wright5.5.3.13.2. Método de Giemsa5.5.3.14. Coloración Nuclear5.5.3.15. Coloración de la Pared celular5.5.3.16. Coloraciones para Hongos5.6. Medios de cultivo5.7. Requerimiento de las bacterias para su desarrollo5.7.1. Necesidades nutritivas5.7.2. Necesidades elementales: 5.7.3. Necesidades energéticas:5.7.4. Necesidades especificas en factores de crecimiento:5.8. Condiciones fisicoquímicas: 5.9. Clasificación de los medios de cultivo5.9.1. En cuanto a la consistencia puede ser:5.9.2. Según su composición nutricional pueden ser:5.9.3. Según su composición bioquímica, los medios de cultivos pueden 5.10. Medios de transporte5.11. Preparación de medios de cultivo5.12. Esterilización5.13. Descripción del autoclave5.14. Funcionamiento5.15. Mecanismo5.16. Elección de los diferentes medios de cultivo5.17. Ejemplos de medios de cultivo5.7. Métodos de siembra y aislamiento de cultivo puro5.7. Técnica de siembra por estrías en caja de petri.5.8. Técnica de siembra por agotamiento en caja de petri.5.9. Técnica de siembra por aislamiento en caja de Petri5.9.1. En cuanto a la consistencia 5.9.2. Según su composición nutricional 5.9.3. Según su composición bioquímica 5.10. Técnica por superficie en caja de petri.5.11. Técnica de siembra en profundidad en caja de Petri.5.12. Técnica de siembra en agar inclinado.5.13. Técnica de siembra en medio líquido.5.14. Técnica de siembra por sedimentación5.15. Técnica de siembra en medios con pipeta
5.16. Técnica de siembra masiva
Bibliografía
CAPITULO I
1. GENERALIDADES
1.1. RECOMENDACIONES PARA EL TRABAJO EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA
1. Para entrar al Laboratorio debe tener puesta la bata o blusa.
2. Utilice gorro, guantes y tapabocas.
3. Trabaje con la puerta del laboratorio cerrada
4. Limpie la superficie de la mesa con solución desinfectante al
principio y al final de la sesión de laboratorio.
5. Mantenga la mesa libre de todo lo que no sea esencial.
6. Debido a la patogenicidad de los microorganismos es necesario
desarrollar técnicas de asepsia, al manejarlos y transferirlos evite el
contacto con las manos, no coma, beba o fume en el laboratorio, ni
lleve ningún material a la boca (rótulos, lápices).
7. Los medios e instrumentos de trabajo debe marcarlos
adecuadamente (clase de medio, nombre, fecha experimento).
8. Trabaje cerca del mechero prendido.
9. No ponga ningún elemento de trabajo en contacto con el cuerpo.
10. Evite al máximo transitar por el laboratorio.
11. Evite formar aerosoles.
12. Emplee pipeteadores...
13. Las agujas y asas deben esterilizarse en la llama, poniendo al rojo
todo el alambre antes y después de su uso y deben colocarse con el
alambre hacia arriba dentro del frasco o una gradilla; nunca deben
estar sobre los mesones.
14. Esterilice el material contaminado en bolsas o recipientes destinados
para tal fin.
15. De cuenta inmediata al profesor de cualquier accidente como
cortaduras, quemaduras ó derramamiento de cultivo y procure
evitarlos.
16. Si se riega un cultivo microbiano, cubra el área con un desinfectante
como el hipoclorito de sodio al 2% o fenol al 5%, tápelo con una hoja
de papel periódico y notifique al profesor.
17. Lávese las manos antes de salir del laboratorio.
18. Todos los reactivos y equipos deben dejarse organizados y en sus
sitios respectivos al final de cada clase.
1.2. RECOMENDACIONES ESPECIALES PARA EL MANEJO DEL
MICROSCOPIO
1. No toque nunca los lentes con los dedos.
2. No limpie los lentes con etanol
3. No limpie los soportes o la platina con xilol.
4. Si es necesario limpiar los lentes hágalo con papel apropiado (papel
de arroz), con una bayetilla o un aplicador.
5. Nunca deje que un objetivo toque el portaobjetos o cubreobjetos.
Tenga presente las distancias de trabajo establecidas para cada uno
de los objetivos. No deje el portaobjetos puesto cuando no está
mirando al microscopio ni deje la luz prendida.
6. Nunca enfoque hacia abajo mirando por el ocular, mire lateralmente
para calcular la distancia de trabajo, así se evitarán rupturas de
placas y destrucción de los lentes de los objetivos.
7. No force los tornillos o ajustes. Todos ellos deben funcionar
suavemente.
8. No separe ningún lente del microscopio.
9. No intercambie lentes con otros microscopios.
10. No incline la platina del microscopio cuando trabaje con inmersión o
con preparaciones en fresco.
11. No limpie los lentes internamente con papel, esto desprenderá la
capa antirreflejante, utilice sólo pincel.
12. Mantenga limpia y seca la platina del microscopio, limpie el objetivo
de inmersión después del uso.
13. Al terminar práctica, retire el portaobjeto del microscopio, déjelo en
el objetivo de bajo aumento.
14. Respecto al condensador de abajo, asegúrese que la parte mecánica
de la platina no sobresalga de la misma.
15. Cuando termine su uso límpielo y guárdelo cubierto en su caja.
16. Al trasladar el microscopio cójalo con ambas manos, una por la base
y
Con la otra por el brazo, pues de otra manera pueden
presentarse
Accidentes costosos.
1.3. RECOLECCIÓN Y TRANSPORTE DE MUESTRAS PARA
EXÁMENES MICROBIOLÓGICOS.
En la mayoría de los casos la presentación clínica de una enfermedad debe
ser complementada con el análisis de diversos tipos de muestras tomadas
de los animales enfermos o muertos con el objeto de establecer de una
manera segura la etiología y llegar a un diagnóstico acertado de la
enfermedad. Es necesario enviar muestras a un centro de investigación o
de diagnóstico que suministre los resultados requeridos para el diagnóstico
definitivo de la enfermedad
En general la Microbiología diagnóstica se basa en la búsqueda del agente
etiológico de las enfermedades infecciosas y en la demostración de la
respuesta inmunológica del paciente a un germen con el cual se logra
instaurar de una manera racional el uso de métodos profilácticos basados
en la utilización de vacunas o en la recomendación del empleo de una
terapia antimicrobiana especifica.
Los resultados que arrojan estos análisis dependen de la naturaleza de la
muestra del cuidado con que sea tomada, del tiempo de recolección, de la
eficiencia técnica de quien realiza los exámenes de laboratorio, del criterio
con que sea tomada y de la adecuada selección de la muestra.
El Médico Veterinario de campo debe ser competente para realizar algunas
técnicas sencillas que le permitan verificar el diagnóstico rápido y seguro
de una enfermedad infecciosa. Debe conocer con seguridad cómo, cuándo,
y donde tomar muestra que exámenes se deben llevar a cabo en el
laboratorio, y cómo y cuándo se deben llevar las muestras al laboratorio
para determinaciones confirmativas.
Es recomendable observar los siguientes pasos en la recolección y envío de
muestras:
1- El primer paso para la toma de muestras es la selección o escogencia de
los animales que se van a utilizar; los animales en estado avanzado de la
enfermedad son los más aconsejables, pudiéndose sacrificar para tomar las
muestras en la mejores condiciones en caso de que no se disponga de
animales recientemente muertos o que no se pueda tomar muestras de los
animales vivos.
Cuando la enfermedad se presenta en un grupo de animales, las muestras
se deben tomar de más de un animal enfermo y en diferentes estados de la
enfermedad.
En caso de animales muertos, se procurará tomar la muestra de los más
recientemente fallecidos o sacrificados.
2- En ciertas circunstancias se puede enviar al laboratorio animales enfermos
que presentan síntomas avanzados de enfermedad.
En algunas especies (bovinos, equinos) es preferible, por su tamaño, el
envío de determinados órganos, sin embargo, en aves y pequeños animales
se puede remitir todo el animal, a menos que sea necesario el envío de
muestras determinadas bajo condiciones especiales de conservación, o que
el laboratorio quede demasiado distante y sea necesario el envío por
correo.
3- Para evitar contaminaciones durante las necropsias, las muestras para
investigaciones bacteriológicas y virológicas se deben tomar antes de las
muestras para parasitología o histología.
4- Acompañando a la muestra debidamente identificada se debe incluir la
historia completa del caso, con los siguientes datos:
a) Nombre completo y dirección del propietario del animal
b) Reseña del animal incluyendo especie, sexo, edad, raza etc.
c) Población animal por especies, indicando en lo posible la distribución
d) Presentación de la enfermedad (fecha de iniciación, forma de
presentación, curso agudo, sobagudo o crónico).
e) Signos observados.
t) Número de animales enfermos o muertos por día.
g) Distribución de los animales afectados respecto a los sanos.
h) Vacunaciones: tipo de vacunas empleadas, número de animales
vacunados, fecha de las vacunaciones etc.
i) Relación completa de los hallazgos de necropsia.
j) Tratamientos realizados.
k) Naturaleza de alimentación.
1) Posibilidad de contacto de los animales enfermos con los de las fincas
vecinas.
m) Historia de brotes presentados en lugares adyacentes.
n) Localización de la finca incluyendo las vías de comunicación tales como,
carreteras, caminos, ríos y quebradas que la comuniquen con otras fincas.
o) Si es posible, se debe incluir un mapa o esquema de la finca con sus
principales características, lo mismo que las poblaciones vecinas.
p) Nombre del Médico Veterinario, dirección y teléfono.
5- Todos los frascos que se utilicen para el envío de las muestras se deben
esterilizar previamente, en caso de que esto no sea posible se deben hervir
durante 20 minutos.
6- Los frascos o recipientes se deben rotular con el número o identificación
del animal y del órgano del cual se toma la muestra para que sirva de
referencia clara al protocolo que acompañe la muestra.
7- Cada muestra de tejidos u órganos se deben enviar en frasco separado.
Esta recomendación es de importancia sobre todo para las muestras
destinadas a exámenes bacteriológicos y virológicos, por el riesgo que se
contaminen unos con otros.
8- Los recipientes para el transporte de las muestras deben ser de boca
ancha y con tapa rosca que asegure el cierre hermético.
9- Al solicitar un examen microbiológico se debe hacer en forma clara con
el fin de orientar al técnico en su análisis.
10- Se debe tener en cuenta el tiempo que se va a demorar el transporte de
la muestra. En caso de aves, de un lugar cercano (1 hora) se puede enviar
el cadáver. De un lugar distante (6-8 horas) se deben enviar aves enfermas;
y de sitios más lejanos, muestras de tejido y órganos.
11- Se debe tomar una cantidad suficiente que permita el examen
completo. 12- En lo posible para evitar interferencias con los aislamientos
de bacterias.
13- En la recolección de todo tipo de muestras el instrumental empleado
debe esterilizarse previamente ya sea a la llama, al calor seco, a la
ebullición, al vapor, etc., y según sea su naturaleza. El procedimiento
empleado se debe realizar tomando todas las precauciones de asepsia
necesaria
1.4. CONSERVACION DE LAS MUESTRAS
Las muestras para exámenes de laboratorio se pueden conservar en
diversas formas.
Refrigeración: Para la remisión de muestras se pueden enviar refrigeradas
en:
Hielo natural: Este método de refrigeración es adecuado solo si las
muestras se Empacan convenientemente y la distancia al laboratorio no es
muy grande. El hielo puede preservar las muestras durante 18-24 horas en
climas fríos, en climas cálidos solamente puede conservadas por 8-12
horas.
Las muestras para empacar en hielo se deben colocar dentro de un
recipiente a prueba de agua y éste a su vez dentro de otro más grande con
hielo y a aserrín de madera.
Hielo seco: Este método se puede utilizar si la congelación de la muestra
no Interfiere con los procedimientos del laboratorio. La muestra se debe
colocar dentro de un recipiente a prueba de agua; el hielo seco envuelto en
papel deberá rodear la muestra. No se debe colocar el hielo en contacto
directo con la muestra, ni en recipientes herméticos debido a que la
presión resultante de la volatilización puede dar lugar a explosiones.
Preservativos químicos: No se deben agregar sustancias bactericidas a las
muestras destinadas a exámenes bacteriológicos, sin embargo se pueden
emplear algunas sustancias bacteriostáticas como fenol al 0.5%; mertiolate
al 1x10.000 y glicerina al 50% en muestras obtenidas para aislamiento
virales. Estas soluciones se emplean cuando es necesario reducir el
crecimiento bacteriano al mínimo.
CAPITULO II
CLASES DE MUESTRAS PARA EXÁMENES BACTERIOLÓGICOS
El tipo de muestras que se debe tomar para examen bacteriológico se
escoge según los signos y síntomas observados en el animal vivo durante el
examen clínico, según las lesiones halladas en la necropsia, y según el
diagnóstico presuntivo de la enfermedad.
Si los signos o síntomas señalan una porción especifica o parte afectada del
animal, la muestra se debe tomar de ese punto y no de otro lugar.
Si las lesiones encontradas a la necropsia sugieren la presencia de un
agente microbiano, las muestras a tomar se limitaran exclusivamente a los
órganos afectados y no a los normales.
Cuando se sospecha una septicemia o bacteremia, se deben tomar
muestras de sangre, corazón y de aquellos órganos a través de los cuales
pasa la sangre tales como: bazo, hígado, riñones y ganglios linfáticos.
Cuando la enfermedad afecta un órgano o tejido determinado como sucede
en actinobacilosis y carbón sintomático, bastará con tomar la muestra de la
lengua o muslos afectados respectivamente.
Las muestras se deben tomar de aquellos sitios u órganos que evidencien la
presencia de lesiones y no de otro lugar.
RECOLECCIÓN DE ORGANOS Y TEJIDOS
La toma de órganos, al tiempo de la necropsia para examen microbiológico,
debe estar basada en la historia clínica, síntomas presentados y las lesiones
de necropsia. Al tomar órganos o porciones de los mismos para el
diagnóstico bacteriológico se deben evitar en lo posible la contaminación
con gérmenes extraños, estas muestras se deben recolectar antes de abrir
el tracto digestivo.
El contacto de la superficie de órganos abdominales con material intestinal,
puede causar excesiva contaminación haciéndose muy difícil el examen en
estas condiciones.
Al recolectar tejidos para examen bacteriológico se debe tomar suficiente
cantidad para que el técnico obtenga muestras representativas. En
animales pequeños se debe conservar el órgano completo, mientras que en
animales grandes las muestras representativas se tomarán de los órganos
incluyendo el sitio de la lesión que debe ser removido cuidadosamente y
depositado en un recipiente, para los exámenes subsiguientes. Los órganos
se pueden guardar en bolsas plásticas que se sellarán herméticamente.
Los tejidos de deben colocar en recipientes estériles y pasados
inmediatamente a refrigeración. En gran parte el éxito en el intento de
aislamiento depende de la rapidez con que se realicen la toma y el examen
de las muestras.
RECOLECCION DE MATERIAS FECALES
Estas muestras se deben tomar directamente del recto en la forma más
asépticamente posible utilizando guantes de caucho y colocándolas en un
recipiente estéril.
En caso de utilizar hisopos en la toma de materias fecales, se colocan en un
tubo con medio de transporte estéril (caldo tioglycolate) nunca se deben
tomar del suelo, debido a la gran cantidad de gérmenes ambientales
contaminantes que pueden enmascarar el resultado de la prueba
bacteriológica.
RECOLECCION DE SEMEN
El semen normalmente es estéril, sin embargo; es susceptible de
contaminarse a su paso por la uretra. Su recolección se hace mediante el
empleo de electroeyaculador o vagina artificial, colocándose en frascos
estériles sin preservativos para ser enviado al laboratorio en refrigeración.
RECOLECCIÓN DE ORINA
La orina es secretada por los riñones en forma estéril a menos que estos
estén afectados. La orina en la vejiga normalmente se halla estéril pero a
su paso por la uretra puede contaminarse.
En los animales pequeños la muestra se debe tomar por punción de la
vejiga urinaria en condiciones absolutamente estériles.
En los animales grandes, el método adecuado es la extracción de orina
mediante el empleo de una sonda vesical y se envía en refrigeración al
laboratorio.
MUESTRAS DE SANGRE
Muestra de sangre completa: Se deben tomar bajo completas
condiciones asépticas con la ayuda de tubos vacutainer o de jeringas
estériles. El área de la piel sobre la vena se lava y desinfecta con algodón y
alcohol, evitando el contacto de las manos u otros objetos con el área
desinfectada. La cantidad de sangre a tomar varía entre 5 y 10 mI que se
pueden verter en un medio de cultivo (50-100) que permite el crecimiento
de microorganismos. Si no es posible el empleo de medios nutritivos se
envía al laboratorio debidamente refrigerada y adicionada con un
anticoagulante estéril.
MUESTRAS DE SUERO SANGUINEO
1- Deben tomarse aproximadamente 20mI de sangre de cada animal. No se
debe sangrar en recipientes plásticos, ya que el suero no se separa del
coagula satisfactoriamente.
2- Cada tubo con sangre debe identificarse con los datos del animal del
cual se colectó la muestra.
3- Los tubos con sangre se dejan a la temperatura del laboratorio hasta
cuando se forme el coágulo una vez formado se colocan en el refrigerador
para alcanzar una óptima retracción.
4- El suero transvasado a tubos cónicos se centrífuga a 1.500 R.P.M por 10
minutos removiéndose cuidadosamente el suero y eliminándose los
glóbulos rojos que forman un paquete en el fondo del tubo.
5- El suero de cada tubo, que debe ser claro, se decanta en viales plásticos
o de vidrio
Resistente, ojalá con tapa de rosca, dejándose un espacio entre el nivel de
suero y la tapa.
6- Cada tubo debe ser identificado con la misma numeración usada al
colectar la sangre,
Escribiendo, los números claros y con un marcador a prueba de líquidos.
7- Una vez que los tubos han sido identificados y sellados deben colocarse
en una bolsa
Plástica, que luego se guarda en el termo con hielo seco.
8- Los sueros deben conservarse congelados hasta el momento de su
entrega al Laboratorio
9- Los envíos de suero deben acompañarse con un protocolo en el cual se
consigne el nombre de la finca, número de libreta sanitaria, municipio,
sector y área, propietario, raza, número de animales en el predio,
identificación de cada animal, edad y sexo y otras características que se
consideren de interés de acuerdo con el tipo de estudio que se adelanta.
MUESTRAS DE LECHE
Antes de proceder a la recolección es necesario lavar la ubre con agua y
jabón y aplicarle una solución desinfectante.
Se desechan los dos primeros chorros de leche y se recogen unos 10 mí de
cada cuarto en recipientes estériles, numerándolos de acuerdo al cuarto de
donde se toma la leche y anotando además la identificación del animal.
Para el control de un hato se deben tomar muestras del total de animales
en explotación, haciendo al mismo tiempo los exámenes físicos de la leche y
de la ubre.
OBTENCIÓN DE LÍQUIDOS ORGÁNICOS MEDIANTE PUNCIÓN
En ciertos casos para exámenes bacteriológicos está indicado el empleo de
punciones para colectar las muestras líquidas ya sea de las cavidades
abdominales, toráxicos, articulares o de los edemas, abscesos y
hematomas. La técnica de punción varía según el lugar en donde de toma
la muestra teniendo en cuenta ciertas normas.
El sitio de la piel donde se va hacer la punción se debe lavar y desinfectar
completamente. Las jeringas, agujas y trucares deben estar limpios y
estériles, lo mismo que los tubos o frascos empleados para recoger la
muestra. Cuando el espécimen no puede ser aspirado o tomado por lo
denso del material, se puede inyectar en el sitio, determinada cantidad de
solución salina estéril o un medio de cultivo, con el fin de poder aspirar con
mayor facilidad el fluido a examinar.
MUESTRAS DE HERIDAS ABIERTAS Y ABSCESOS
En heridas abiertas o abscesos lo mismo que para frotis de garganta los
escobillones o hisópos de algodón colocados en tubos de ensayo,
especialmente si el palo del escobillón se inserta a través del tapón del
tubo. Este material se esteriliza y luego se emplea para la toma de la
muestra.
A menudo es difícil recobrar el agente causal en la herida pues ella
contiene muchos gérmenes extraños por lo tanto se debe proceder a la
limpieza previa de la herida antes de la toma de la muestra. Se debe evitar
en lo posible el contacto del escobillón con la superficie sana de la piel no
comprometida en la lesión.
Una vez tomada la muestra se procede inmediatamente pero si ello no es
posible se debe evitar que se seque, colocándola en un tubo estéril con 2-3
ml de medio de cultivo o solución salina estéril quebrando el escobillón
para eliminar la parte que ha estado en contacto con las manos.
MUESTRAS DE PIEL Y ORGANOS ACCESORIOS
Estos tipos de muestras se toman especialmente para la identificación de
parásitos, pero en algunos casos es necesario utilizarlas para el análisis de
hongos y otras clases de gérmenes.
Las costras o masas costráceas se guardan en tubos bien cerrados o en
frascos de cuello ancho tapados con corchos, solo en casos extremos se
deben guardar en un sobre o papel plegado.
Las raspaduras cutáneas húmedas se introducen en frascos humedecidos
con solución salina estéril.
Pequeñas cantidades de muestras líquidas se pueden enviar en tubos
capilares después de cerrar sus extremos a la llama o con parafina.
MUESTRAS DE AGUA PARA EXAMENES BACTERIOLOGICOS
Las muestras de agua se pueden tomar de lugares diferentes, agua de
acueducto o de yacimientos, pozos, ríos, quebradas, filtros, y algibes.
En caso de agua de acueducto, las llaves se desinfectaran cuidadosamente
y se suelta el agua durante varios minutos antes de tomar la muestra la
cual se recoge en frascos estériles de boca ancha de vidrio o plástico no
tóxico con capacidad de 120 ml, cuidando que al taparlos herméticamente
quede poca cantidad de aire entre el nivel del líquido y la tapa.
Las muestras se deben enviar refrigeradas antes de 24 horas de la toma,
rotuladas con el nombre del sitio de donde se toma la muestra, hora, fecha,
si contiene cloro y nombre de la entidad o persona que la solicita.
En caso de muestras tomadas de pozos, ríos y quebradas se utiliza el
mismo tipo de recipiente. Se acostumbra anudarles un cordel alrededor del
cuello, dejarlos caer en el centro del pozo o estanque hasta cuando se
llenen completamente y taparlos; en caso de aguas de río se introduce el
frasco unos 20 cm de profundidad y se toma en sentido contrario de la
corriente evitando que la mano toque la boca del frasco.
En caso de aguas quietas, se hace conveniente tomar varias muestras de
diferentes sitios, previa agitación del área a muestrear.
Se acostumbra anudarles un cordal alrededor del cuello, dejarlos caer en el
centro del pozo hasta cuando se llene y taparlos.
BIOPSIAS
Las biopsias son muestras que se toman al animal vivo; pueden ser
superficiales o profundas, según el tejido afectado.
Existen normas especiales para tomar esta muestras según el órgano del
animal de donde se vayan a extraer, para tomar esta clase de muestras las
condiciones de asepsia deben ser extremas.
Las condiciones de transporte son las mismas que para otro tipo de
muestras.
MUESTRAS PARA ANAEROBIOS
Todos los órganos y tejidos pueden estar involucrados en infección
anaeróbica y todos los tipos de infección vistos con bacterias aeróbicas o
facultativas pueden alIarse t también con organismos anaeróbicos.
Los indicios que sugieren posible infección con anaerobioos son los
siguientes:
1- Descargas malolientes.
2- Localización de infecciones en proximidades a superficies mucosas.
3- Tejidos necróticos, gangrena o formación de pseudo membranas.
4- Gas en tejidos o secreciones.
5- Endocarditis con hemocultivos negativos.
6- Infección asociada con malignidad u otros procesos que produzcan
destrucción tisular y que estén asociados con trastornos de la
circulación.
7- Infecciones relacionadas con la administración de aminoglucósidos
(vías oral, parenteral o tópica).
8- Tromboflebitis séptica.
9- Cuadros bacterèmicos con ictericia.
10-Infecciones después de mordeduras.
11-Presencia de “gránulos de azufre” en exudados.
12-Cuadros típicos de gangrena gaseosa.
13-Síndromes clínicos que sugieren infección anaeróbica como aborto
séptico, infecciones después de cirugía gastrointestinal.
Toma de las muestras para anaerobios
Le endometritis puerperal o post-parto se presenta con una frecuencia de
1.4%. El clostridium pentringens puede ser aislado de cavidad endometrial
y su importancia solamente puede ser determinada con un perfecto
conocimiento del cuadro clínico de la paciente.
El líquido amniótico debe ser colectado por amniocentesis para cultivo
durante el trabajo de pato o en la ruptura prematura de la membrana
amniótica en pacientes que hayan presentado fiebre, sufrimiento fetal, olor
fétido del líquido amniótico y leucocitosis. Este líquido debe ser procesado
para preparación directa de Gram, cultivos aeróbicos y anaeróbicos; deben
también tomarse muestras de sangre para hemocultivos en condiciones
aeróbicas o anaeróbicas. Generalmente cocos gram positivos anaeróbicos,
algunas especies de Bacteroides, Fusubacterium necrophorum,
Fusabacterium nucleatum y algunas especies de clostridium.
En muestras de contenido intestinal y materia fecal los principales
patógenos involucrados son: Clostridium difficile C. perfringens, C.
botulinum y C. septicum.
La técnica preferida para recoger la mayor parte de especímenes es por
aspiración con aguja y jeringa con el objeto de protegerla muestra en lo
posible de contacto con el aire. El embolo se baja completamente, se aspira
el material y luego se eliminan con cuidado unas gotas de la muestra. En
caso de disponer de poco material, se aspira primero una sustancia o medio
como Cisteína Hidrocloruro o Caldo tioglicoloto y luego la muestra.
Cuando sea posible es deseable obtener muestras de tejidos más bien que
exudados para cultivos anaeróbicos. Las muestras de tejidos pueden
indicar más seguramente la bacteriológica del proceso infeccioso y las
bacterias anaeróbicas sobreviven más fácilmente en este tipo de muestra.
Transporte de las muestras para anaerobios
Algunos anaerobios como el Clostridium perfringes, son moderadamente
resistentes al contacto con oxigeno y pueden sobrevivir por días si solo se
mantienen húmedos. Sin embargo, otros anaerobios no toleran ni breves
exposiciones al aire. Aerobios obligados y organismos facultativos
permanecen viables en un sistema anaeróbico, por consiguiente el
transporte universal para muestras bacteriológicas, donde puedan
detectarse las formas anaeróbicas o aeróbicas, puede ser un recipiente
anaeróbico.
Los materiales con jeringa deben ser inyectados en tubos libres de oxigeno,
(al vació); es importante sin embargo, que éstos tubos contengan (en lo
posible) unas gotas de resarzurina acuosa (0.0003% concentración final), y
que sean guardados en la oscuridad para preservar el indicador, un color
rosado, que indica aireación, puede presentarse después de agregar la
muestra, pero deberá ser sólo temporal. Cisteína Hidrocloruro es
agregado en algunos recipientes comerciales para facilitar la reducción.
Cuando se emplea aguja y jeringa para aspirar muestras, éstas pueden ser
llevadas directamente al laboratorio si la aguja se inserta en un tapón
estéril de caucho. Este método puede emplearse sólo cuando la muestra
pueda ser procesada inmediatamente.
El método de hisopo no es aconsejable para tomar muestras anaeróbicas
debido al exceso de aireación. Debe utilizarse solo cuando la aspiración es
imposible o muy difícil de hacer. En estos casos debe emplearse un medio
de transporte como el medio semisólido de Cary y Blair o medio de
Tioglicolato previamente calentado.
Todas las muestras deben refrigerarse para disminuir el crecimiento de
especies facultativas que puedan presentarse si el cultivo no puede
hacerse en dos horas.
La muestra debe ser colocada en un medio de transporte adecuado para
bacterias anaerobias, medio de caldo de carne, medio de tioglicolato 135º
C o medio de Cary-Blair previamente pre-reducidos pueden ser utilizados.
Cuando no se dispone de los medios de transporte mencionados la muestra
se puede transportar en la misma jeringa utilizada para la toma, teniendo
cuidado de desalojar cualquier burbuja de aire del interior de la jeringa,
debe colocarse un tapón de caucho estéril para taponar la aguja enviando
la muestra rápidamente al laboratorio para procesarla.
Examen directo de anaerobios
El examen directo al microscopio del material clínico es muy importante.
La morfología típica de muchos anaerobios es una guía valiosa para la
selección de medios y técnicas especiales. Deben aislarse todos los
organismos que se observan en un frotis directo.
Entre los indicios bacteriológicos que sugieren una posible afección con
anaerobios están los siguientes:
-Coloración de Gram que revele:
1-Organismos pálidos, coloreados irregularmente pleomórficos, largos y
delgados
2-Bacilos Gram negativos con terminación recta.
3- Bacilos grandes, anchos Gram positivos a veces pueden ser Gram
negativo o bacilos pequeños con esporas.
4-Bacilos Gram positivos delgados ramificados o filamentosos.
5- Cocos Gram negativos diminutos o pequeños. En pares o masas o cocos
Gram negativos mayores en tamaño.
-Falla de cultivar organismos aeróbicamente o con técnicas anaerobias
inadecuadas especialmente si los organismos fueron vistos en coloración
de Gram de la muestra original.
-Gas, olor pútrido en las muestras o cultivos.
-Colonias características en agar sembrado anaerobicamente.
-Crecimiento en medios altamente selectivos para anaerobios.
Cultivos primarios de anaerobios
Las muestras son inoculadas tanto en medios sólidos como líquidos,
dependiendo especialmente de los medios sólidos. La composición de estos
medios es generalmente complejo para suplir las necesidades nutritivas
de los organismos más exigentes. Hay varios medios satisfactorios no
selectivos con sangre para el aislamiento primario de bacterias anaeróbicas
tales como el agar sangre brucela, el Brain Heart Infusión suplementado
con sangre. Agar sangre lacada (congelada y descongelada).
Otros medios que pueden emplearse incluso en el transporte de muestras
especialmente de hisopos, es el medio de Tioglicoloto que puede ser
suplementado para anaerobios.
El cultivo en medios líquidos no debe ser empleado como el único medio
para el aislamiento de anaerobios de muestras clínicas. El aislamiento de
anaerobios es más pobre en medios líquidos que cajas de agar en jarras de
anaerobiosis y la cuantificación es imposible.
En muchos laboratorios los medios líquidos son utilizados como referencia
cuando no se obtiene crecimiento en medios sólidos en anaerobiosis o
cuando ha habido fallas en la anaerobiosis de los cultivos o cuando se ven
formas morfológicamente diferentes de las observadas en láminas
colocadas de cultivos en medios sólidos.
Como medios selectivos están el Agar sangre con kanamicina y vancimicina
(preparada también con sangre congelada y descongelada).
Incubación de anaerobios
Los tres principales métodos de incubación anaeróbica son:
1-Método de la jarra anaeróbica.
2-Método de la cámara anaeróbica.
3-Método del “Roll Tube”
Jarras de anaerobiosisLas condiciones de anaerobiosis pueden conseguirse por medio de este
sistema (jarras Gaspar, Oxoid, entre otras), que utilizan sobres
generadores de CO2 y H2. Algunas de estas jarras pueden ser utilizadas
para el sistema de evacuación – reemplazo. Este sistema utiliza la
extracción del aire de la jarra sellada, provocando un vacío de 25 pulgadas
de Hg.
Este proceso se repite 5 veces, llenando la jarra con gas libre de oxigeno
como N2 entre cada evacuación.
El llamado final de la jarra se hace con una mezcla gaseosa que contenga
80-90% de N2, 5-10% de H2 y 5-10 % de CO2.
La utilización de las jarras con el sistema de sobres de sobres generadores
de H2 y CO2, tiene grandes ventajas sobres otros métodos de
anaerobiosis; el catalizador que se utiliza está formado por unas bolitas de
aluminio recubiertas de paladio que se colocan dentro de una redecilla de
alambre. No existe riesgo de explosión utilizando este catalizador “frió “y
su uso resulta más ventajoso que el otro de tipo de catalizadores. Este
catalizador se inactiva por la humedad, el H2S y otros metabolitos
bacterianos, pero pueden reactivarse después de cada uso calentándolo a
160º C en horno seco durante 1 1/2 a 2 horas. La producción de
anaerobiosis por este sistema, se basa en la producción de C02 y H2 a
partir de las dos sustancias químicas que vienen en el sobre generador en
forma de pastillas, las cuales al agregarles agua se ponen en contacto,
reaccionando y dando como productos finales H2 y CO2; el H2 reacciona
con el O2 que se encuentra en la campana formando agua, por lo cual el
oxigeno molecular queda excluido.
Esta reacción tiene lugar luego de que se han colocado en la campana el
sobre generador y el catalizador y la campana ha sido cerrada
herméticamente. Puede utilizarse un indicador de anaerobiosis que
consiste en una tira de papel de filtro impregnada en una solución de azul
de metileno; en el momento en que hay reducción completa, la tira pierde
su color, quedando blanca; como estas campanas son transparentes,
pueden observarse sin dificultad la decoloración del azul de metileno; otros
indicios de que la reacción ha tenido lugar, son el calentamiento que se
produce en la parte superior de la jarra alrededor del catalizador y el
empañamiento de las paredes de la campana.
Precauciones en el manejo de la campana de anaerobiosis.
1- No debe utilizarse la campana en la proximidad de mecheros
encendidos, debido a la producción de H2 que es inflamable y puede
producirse un incendio.
2- El tornillo de la prensa de cierre, debe apretarse fuertemente pero
no deben utilizarse instrumentos para ello, es suficiente el cierre con
la fuerza de los dedos.
Cámaras de anaerobiosis
Llamada también Cámaras de guantes; son fabricadas en plástico flexible
ò como gabinetes rígidos herméticos. La manipulación de los elementos
contenidos en la cámara se efectúa por medio de guantes sellados a ella. El
material se introduce y se retira de la cámara mediante un dispositivo de
intercambio que por lo general es un compartimiento rígido, con una
puerta interior y otra exterior, este dispositivo se une a la cámara por
medio de un cierre hermético; puede evacuarse y volverse a llenar por
medio de flujos rápidos de gas libre de oxigeno. La cámara propiamente
dicha, se mantiene en condiciones anaerobias en forma permanente,
mediante el uso de un catalizador de paladio y 3-10% de H2en la atmósfera
interior.
Tubos previamente reducidos y anaerobiamente esterilizados (pras)Estos tubos se preparan combinando los componentes del medio, hirviendo
el líquido para extraer el aire y tratándolo después con gas libre de
oxigeno. Mientras los medios son esterilizados o inoculados, o en el
momento de subcultivos se impide la entrada de aire a los recipientes por
medio de tratamiento con gas libre de oxigeno. Para reducir el oxigeno del
medio se le agrega antes de la esterilización, un agente reductor.
Estos tubos PRAS pueden ser inoculados por métodos cerrados o abiertos;
para la primera se utiliza una jeringa con aguja y se inocula a través de un
tapón de goma. El método abierto consiste en quitar el tapón de goma e
insertar una cánula desde cuyo extremo fluye gas libre de oxigeno.
Mientras el tubo está abierto se puede efectuar una inoculación con asa o
pipeta Pasteur.
Procedimientos de aislamiento de anaerobios
Seleccione los diferentes tipos de colonias y subcultive en CO2 aerobiosis y
anaerobiosis. Haga coloración de Gram y anote la morfología Aquellas que
crezcan en CO2 y anaerobiosis pero no en aerobiosis se consideran
microaerofílicas y determine cuáles son facultativas y cuáles son
anaerobios estrictos.
Cuándo una bacteria no es aislada de especímenes en las cuales está
realmente presente puede ser debido a las siguientes razones:
1- La coloración de Gram no fue hecha directamente de la muestra
clínica. Si organismos presentes en el frotis fallan para crecer es
porque, seguramente requieren medios especiales o hay fallas en la
incubación o las técnicas empleadas son defectuosas.
2- Fallas en realizar los cultivos con la suficiente prontitud.
3- Al empleo de medios líquidos como único sistema de cultivo.
4- Defecto de suplementos nutritivos en los medios.
5- Falla en el empleo de medios de cultivo.
6- Falla en el empleo de buena anaerobiosis.
7- Falla en el chequeo de los recipientes para prevenir entrada del aire.
8- Catalizadores fuera de uso.
9- Empleo de gases tóxicos en la anaerobiosis.
10-Falla de incluir CO2 que es requerido por muchas especies de
gérmenes.
11-Falla en mantener los cultivos el tiempo suficiente de incubación.
CAPITULO III
PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO
PROCESAMIENTO DE MUESTRAS EN EL LABORATORIO
Pasos a seguir en el aislamiento y la identificación de bacterias de especimenes clínicos
HISTORIA CLINICANATURALEZA DE
LA MUESTRAPATOGENO
SOSPECHOSOMUESTRA DIRECTA
1- SELECCIÓN E INOCULACION DE MEDIOS PRIMARIOS. INCUBACION REQUERIDA.
2. ESTUDIO MORFOLOGICO DE LAS COLONIAS EN EL MEDIO Y DE LA MORFOLOGIA CELULAR TEÑIDAS CON COLORANTES DE GRAM DE COLONIAS
SELECCIONADAS.
3. INICIACION DE CULTIVOS PUROS EN MEDIO SOLIDOS O EN CALDOS.
4. ESTUDIO DE EXTENSIONES COLOREADAS CON GRAM.PRUEBA DE LA CATALASA, PRUEBA DE LA OXIDASA, ETC.
5. SELECCIÓN E INOCULACION EN MEDIOS DIFERENCIALES.
INCUBACION
6. LECTURAS DE PRUEBAS DIFERENCIALES Y PRUEBAS SEROLOGICAS INDICADAS
7. IDENTIFICACION FINAL DE LOS ORGANISMOS
MUESTRA DE HECES EN MEDIO DE CARY BLAIR O BUFFER GLICERINADO
E M B Mc Conkey
SS o Hektoen Caldo Selenito, Tetrationato o GN
37ºC/ 24 horas 37ºC/ 24 horas37ºC/ 24 horas
Colonias Fermentadas
Colonias no fermentadas o de pto. negro
Colonias no fermentadas
A. Nutritivo Citrato
37º C X 24 Horas
Colonias Citrato Negativo
Prueba Serológica
SS. o HektoenIncubar 37ºC / 24
Horas
Colonias no fermentadas o de pto.
negro
Series Bioquímicas
Inc. 37ºC / 24 Horas
Colonias bioquímicamente compatibles con Enteropatógenos
Prueba Serológica
PROCEDIMIENTO DE UN COPROPCULTIVO
3.3. AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE YERSINIA ENTEROCOLÍTICA
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE CAMPYLOBACTER
AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE YERSINIA ENTEROCOLITICA
MUESTRAS DE HECESMEDIO DE CARY BLAIR
2 Agar SS 2 Agar Mac Conkey 2 Agar Selectivo para Yersinia
37ºC 25ºC 37ºC 25ºC 37ºC 25ºC
24 horas 48 horas 24 horas 48 horas 24 horas 48 horas
25ºC 25ºC 25ºC
24 horas 24 horas 24 horas
4 - 5 COLONIAS COMPATIBLES CON YERSINIA
Kliglero o TSICaldo Urea Indol
Kliglero o TSICaldo Urea Indol
Kliglero o TSICaldo Urea Indol
Colonias Urea (+) Lactosa (-)
Identificación Bioquímica CompletaMicro I.D., API o Enterotubo
CAPITULO IV
AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE CAMPYLOBACTER
SUSPENSION FRESCOMEDIO
SKIRROW
LEUCOCITOSMOVILIDAD
EXTENDIDOA. DE
METILENO
42º C 48 HORAS
ATMOSFERAMICROEROFILICA
COLONIAS COMPATIBLES
FRESCO OXIDASA CATALASA
MUESTRA DE HECESMEDIO DE TRANSPORTE CARY BLAIR
MOVILIDAD (+) (+) (+)
DIAGNOSTICO DIFERENCIAL
CEFALOTINA25 ºC
A. NALIDI-XICO43ºC
C. FETUS SUBSP JEJUNI - + S R
C. FETUS SUBSP, FETUS + - R S
ACCIÓN DE AGENTES FÍSICOS Y QUÍMICOS SOBRE LAS BACTERIAS
GENERALIDADES
Los microorganismos se eliminan, inhiben, o matan por medio de agentes físicos y químicos. Se cuenta con una gran variedad de técnicas y agentes que actúan de maneras muy diferentes y cada uno, en la práctica tiene sus propias limitaciones.Es necesario entender el significado de varios términos empleados para referirse a la acción de los agentes físicos y químicos sobre las bacterias.
EsterilizaciónSe define como el procedimiento que elimina todos los microorganismos vivos de los objetos tratados. Puede ser llevado a cabo por exposición letal a agentes físicos o químicos o en el caso especial de soluciones por filtración. DesinfecciónEs un proceso generalmente menos letal que la esterilización el cual elimina virtualmente todos los microorganismos patógenos reconocidos, pero no necesariamente todas las formas microbianas; por ejemplo, pueden persistir esporas; la desinfección se hace siempre sobre objetos inanimados.
El DesinfectanteEs generalmente una sustancia química que se aplica sobre superficies u objetos inanimados con el fin de destruir agentes infecciosos.
AntisepsiaSe refiere a la aplicación tópica de sustancias químicas en una superficie corporal, para destruir o inhibir los microbios.
AntisépticoToda sustancia que actúa matando microorganismos o impidiendo su crecimiento. El término se utiliza para agentes que se aplican tópicamente en tejidos vivos.
SaneamientoConsiste en reducir la población microbiana a niveles no peligrosos por medio de un agente por lo regular químico, que mata el 99,9 % de las bacterias en crecimiento; los agentes para el saneamiento se aplican casi siempre a objetos inanimados, generalmente para cuidado de equipos y utensilios para la alimentación, sin necesidad de esterilización.
Germicida (microbicida)(Microbicida) Agente que mata las formas en desarrollo (vegetativas), pero no necesariamenente las esporas; en la práctica se utiliza como desinfectante.
BactericidaAgente que mata bacterias
BacteriostáticoAgente que inhibe la multiplicación de las bacterias.
AGENTES ANTIMICROBIANOS
Son los que matan o interfieren el crecimiento y la actividad de los microorganismos. Los antimicrobianos se utilizan en el tratamiento de infección, pueden ser de dos clases, a saber: antibióticos quimioterapéuticos, según que sean producidos por un microorganismo o sintetizados en el laboratorio.
Acción de agentes químicosGran número de compuestos químicos en concentraciones apropiadas, son capaces de matar o inhibir los microorganismos.
Debido a las grandes variaciones en el ambiente y a la cantidad y diversidad de organismos, no es posible prescribir un solo agente para eliminar o reducir la flora microbiana; por ello es importante conocer las sustancias químicas con que contamos para cada propósito, sus características y eficacia como agentes antimicrobianos.
Es necesario considerar algunas características que deben tener los agentes químicos antimicrobianos, como son:
1. Actividad antimicrobiana: Capacidad de la sustancia para matar microorganismos,
2. Solubilidad :La sustancia debe ser soluble en agua u otros disolventes para poder ser eficaz.
3. Estabilidad:Los cambios en la sustancia deben ser mínimos para no afectar su acción germicida.
4. No deberá ser tóxica al hombre ni a los animales cuando se usan como antisépticos.
5. La preparación deberá ser homogénea en su composición de tal manera que los ingredientes activos, se encuentren en cada aplicación.
6. La sustancia no debe reaccionar con material orgánico.
Algunos desinfectantes tienen afinidad por las proteínas y otros materiales orgánicos y cuando se usan estos en preparaciones en las que hay cantidades considerables de material orgánico, no habrá desinfectante disponible para actuar sobre los microorganismos.
7. La sustancia debe actuar sobre los microorganismos a temperatura ambiente, o a temperatura ambiente, o a ambiente corporal.
8. El compuesto químico que se utilice no debe corroer ni manchar especialmente cuando se usa con metales o telas.
9. Es deseable que el agente químico utilizado tenga olor agradable o que sea inoloro.
10.Capacidad detergente. Un agente químico que sea desinfectante y detergente a la vez, será más eficaz por su acción limpiadora
11.Disponibilidad.
El compuesto deberá estar disponible en grandes cantidades y a precios razonables.
Principales grupos de agentes químicos utilizados en bacteriología.
Fenol y sus derivadosEstos compuestos actúan desnaturalizando las proteínas y dañando luego las membranas celulares. Algunos reducen considerablemente la tensión superficial. Los compuestos fenólicos son bactericidas o bacteriostáticos, dependiendo de la concentración en que se preparen.
El ácido fénico (FENOL) puro, cristalino, es incoloro. Se emplean soluciones acuosas entre el 2 y el 5 % para desinfectar materiales como esputo, orina, heces instrumentos de laboratorio.
Los cresoles (derivados del FENOL) son varias veces más potentes como germicidas que el fenol, los cresoles tienen solubilidad limitada en agua, pero forman rápidamente emulsiones en jabones líquidos y álcalis siendo ésta la forma en que se emplean.
AlcoholesLos alcoholes desnaturalizan las proteínas y dañan la membrana celular por ser disolventes de lípidos; también son agentes deshidratantes su acción se facilita en presencia de agua.
El alcohol etílico (CH3CH2OH) a concentraciones entre el 50 y 70 %, es efectivo contra células vegetativas no productoras de esporas.
El alcohol metílico CH3OH es menos bactericida que el etílico y es además altamente tóxico. Los alcoholes superiores: propílico, isopropílico son más germicidas que el etílico. El alcohol propílico y el isopropílico en concentraciones entre 40 y 80%, son útiles como antisépticos en la piel. El alcohol etílico al 70%, reduce la flora microbiana de la piel y sirve para la desinfección de los termómetros bucales.
YodoLa actividad antimicrobiana del yodo, se explica por su capacidad oxidante y, además, por la halogenación de las unidades de tirosina de las enzimas y proteínas celulares que necesitan de tirosina para su actividad.
Es agente bactericida eficaz, tiene propiedades esporicidas pero esta acción está condicionada por la cantidad de materia orgánica y el grado de deshidratación, además posee propiedades fungicidas y antivirales.
El yodo puro es poco soluble en agua, pero disuelve bien en alcohol, se usa como agente germicida en forma de tintura de yodo al 2%; también se usa en formas yodóforas que son mezclas con agentes que tienen actividad superficial y transportan y solubilizan el yodo. Uno de estos compuestos es la polivinilpirrolidona PVP-1. Las sustancias yodóforas son germicidad y tienen la ventaja de no manchar y ser poco irritantes.
Las soluciones de yodo se usan principalmente como antisépticos en la piel.
Cloro y sus derivadosEl cloro ya sea como gas o en combinaciones, como hipocloritos, cloraminas, representa uno de los desinfectantes de uso más común.
La acción germicida del cloro libre y sus compuestos está dada por la formación de ácido hipocloroso cuando se agrega al agua. En forma similar los hipocloritos y las cloraminas sufren hidrólisis con la formación de ácido hipocloroso; éste, a su vez, se descompone liberando oxígeno que oxida los constituyentes celulares y produce por tanto, muerte de los microorganismos, el uso más generalizado del cloro es como purificador del agua.
Los hipocloritos de sodio y de calcio son ampliamente usados en la industria y el hogar; se los puede adquirir en forma de polvo o soluciones y a distintas concentraciones dependiendo del uso. El hipoclorito de calcio en concentración entre el 5 y 60%, se usa para desinfectar equipos de lecherías y utensilios de restaurantes.En el laboratorio se recomienda el hipoclorito de sodio al 1% para descontaminar muestras, especialmente de esputo que se procesan para micobacterias.
Metales pesados y sus compuestosLos metales pesados y sus compuestos actúan sobre los microorganismos desnaturalizando las proteínas celulares; algunos compuestos actúan sobre enzimas que contienen grupos sulfhídricos.Los metales pesados más utilizados son: mercurio, arsénico, plata y cobre; se usan generalmente como compuestos inorgánicos tales como: cloruro-mercurio, óxido-mercurio y mercurio amoniacal; estos compuestos son bactericidas en diluciones de 1:1000, pero su uso es limitado debido a su acción corrosiva y a la alta toxicidad en animales. Los mercuriales orgánicos como el mertiolate y mercurio-cromo, son menos tóxicos y se usan como antisépticos. Entre los compuestos coloidales de plata el más utilizado como antiséptico es el nitrato que se emplea en gotas al 1% para prevenir la oftalmía gonocóccica en recién nacidos; otros menos empleados son el lactato y el picrato de plata.
ColorantesLos colorantes más utilizados como agentes antimicrobianos son derivados de la acridina y del trifenilmetano; su acción sobre las bacterias es debida a la afinidad por las proteínas del cromosoma y la interferencia con los
procesos de oxidación celular. Anteriormente eran utilizados como antisépticos para heridas e infecciones de piel; actualmente su uso está limitado al tratamiento de lesiones dermatológicas.
Colorantes de trifenilmetano:Se incluyen en ellos el verde de malaquita, el verde brillante y el cristal violeta. Como regla general los microorganismos gram positivos son más susceptibles a estos compuestos que los gram negativos; el cristal violeta inhibe cocos gram positivos. El verde de malaquita inhibe Staphylococcus aureus. Estos colorantes son utilizados para la preparación de medios de cultivo selectivos, también se los ha utilizado para la diferenciación en especies de algunos géneros bacterianos, el cristal violeta se usa también como fungicida.
Colorantes de acridina Entre los compuestos de uso clínico están la proflavina y la acriflavina que han sido utilizadas en la limpieza de heridas.
Detergentes SintéticosLos detergentes son depresores de la tensión superficial o agentes humectantes. Se clasifican químicamente así: aniónicos cuando su propiedad detergente la realizan los aniones, ejemplo de ellos es el jabón sulfato laurílico de sodio; catiónicos cuando su propiedad detergente la realizan cationes ejemplo: derivados de amonio cuaternario; los no iónicos no tienen actividad antimicrobiana eficaz. Se han propuesto para estos varios modos de acción antimicrobiana como inhibición, enzimática, desnaturalización de las proteínas, ruptura de la membrana celular; al parecer la inhibición o muerte de las células de debe a la combinación de varias acciones.
Los compuestos cuaternarios de algunos detergentes tienen aplicaciones para el saneamiento y desinfección dada su acción germicida y detergente aunada a otros factores como solubilidad, estabilidad, baja toxicidad y no ser corrosivos.
Ácidos y ÁlcalisLos microorganismos se ven afectados en su metabolismo y aún pueden morir cuando tienen cambios bruscos de ph. La acción letal de los ácidos minerales como el clorhídrico y el sulfúrico, está en función del grado de disociación y por ello de la concentración final de hidrogeniones. Así mismo la acción desinfectante de los álcalis, depende de la disociación de los iones hidróxido; en general los álcalis fuertes, son más efectivos contra las bacterias gram negativas y los virus que contra las gram positivas y lo protozoos.
Las micobacterias son particularmente resistentes a los álcalis; por esta razón se utilizan soluciones básicas como NaOH al 4% para descontaminar esputos y otras muestras cuando se van a cultivar para estas bacterias.
Los ácidos son fuertes y los álcalis son esporicidas pero su aplicación es limitada por la naturaleza cáustica y corrosiva de sus soluciones. En general los ácidos son más eficaces que los álcalis.
Glutaraldehido
Es un dialdehido que actúa contra bacterias, hongos y virus; es utilizado en medicina para esterilizar instrumentos urológicos, de óptica y otros.
Quimioesterilizadores GaseososSe utilizan para esterilizar productos hechos con materiales que se deterioran a altas temperaturas o con sustancias liquidas. En este procedimiento los materiales se exponen al gas en un cuarto cerrado y a temperatura ambiente durante un tiempo determinado por el grado de contaminación. Los agentes más comúnmente usados son: el óxido de etileno, la beta propiolactona y el formol.
El óxido de etileno se usa para esterilizar materiales sensibles al calor y a la humedad en hospitales, industrias y laboratorios, tiene gran poder de penetración, pero actúan lentamente contra los microorganismos; acciona mediante reacciones de alquilacíon con los compuestos como las enzimas y otras proteínas.
La beta propiolactona tiene actividad bactericida, fungicida y viricida; su uso se ha restringido por sus supuestas propiedades carcinogénicas.
El formol es un líquido que contiene 37 a 40% de formaldehído; la vaporización del formaldehído en recinto cerrado y durante un tiempo mínimo de dos horas, produce esterilización; este procedimiento es utilizado en salas de cirugía en donde la acción de los vapores debe permanecer por 24 horas.
Acción de Agentes FísicosLas fluctuaciones de las condiciones físicas a las que están sometidas las bacterias tienen efectos inhibidores e incluso letales sobre ellas; más aún existen muchas circunstancias en que es necesario destruir poblaciones microbianas por medio de agentes físicos.
Hay muchos agentes físicos para reducir o eliminar cada grupo microbiano; los más utilizados son: calor seco, calor húmedo, congelación, radiación, desecación y filtración.
Calor SecoLa esterilización segura mediante calor seco requiere la aplicación de 160ºC. Durante dos horas, para alcanzar esta temperatura puede utilizarse horno de gas, eléctrico, o doméstico. La esterilización por calor seco se usa para material de vidrio como pipetas, cajas de petri, balones, etc, también para objetos metálicos.
Calor HúmedoVapor a presión:
El calor en la forma de vapor a saturación y a presión es el agente mas practico y confiable para esterilizar; vapor a presión proporciona temperatura superiores a las que se obtienen por ebullición, además tiene otras ventajas como calentamiento rápido, penetración y humedad en abundancia que facilitan la coagulación de las proteínas, esta técnica es preferida para esterilizar la mayor parte de los materiales de laboratorio tales como: material contaminado, medios de cultivo y soluciones siempre y cuando no se altere su composición química. Para matar bacterias
incluyendo esporas, es necesario que el vapor esté a 15 libras de presión (121ºC) y se mantenga su acción por 15 minutos como mínimo.
El aparato diseñado para usar vapor a presión regulada se llama autoclave. Consiste esencialmente en una cámara de vapor de doble pared, equipado con dispositivos que permiten que la cámara se llene de vapor a saturación y se mantenga a la temperatura y presión deseadas durante el período requerido.
Existen varios modelos de autoclave entre ellos el manual que es de mayor uso en laboratorios clínicos y e autoclave con controles automáticos, más utilizado en clínicas y hospitales. El tiempo necesario para alcanzar la esterilización dependerá de la naturaleza del material a esterilizar, del tipo de recipiente y del volumen.
Algunos materiales no deben esterilizarse en autoclave entre ellos sustancias que no se mezclen con el agua, como grasas y aceites, porque no pueden ser alcanzados por el vapor y así los microorganismos contenidos en ellas sobrevivirán. También algunas sustancias pueden alterarse por la acción del calor húmedo como plásticos o metales que se oxiden, para este tipo de sustancias y materiales debe recurrirse a otro método de esterilización.
Esterilización FraccionadaAlgunos medios bacteriológicos y sustancias químicas no pueden calentarse a mas de 100ºC sin sufrir alteración; para esterilizar estos materiales pueden utilizarse la tindalización o esterilización fraccionada. Este método implica el calentamiento del material a 100ºC durante 15 minutos, luego se la lleva a incubación a 37ºC por 24 horas para permitir la germinación de esporas resistentes; este procedimiento de calentamiento e incubación, se repite durante tres días; en esta técnica se utiliza un aparato llamado esterilizador de Arnold; aunque se puede obtener el mismo resultado usando el autoclave con el vapor fluente.
Agua HirvienteLas células vegetativas se destruyen en pocos minutos al ser expuestas al agua hirviente, pero algunas esporas bacterianas resisten en la ebullición durante muchas horas.
Con la práctica de exponer instrumental durante períodos cortos al agua hirviente se obtiene más desinfección que esterilización; por tal razón no se puede usar en el laboratorio como método de esterilización.
Bajas TemperaturasLas temperaturas inferiores a la optima para el desarrollo hacen caer el índice metabólico y si la temperatura es bastante baja el desarrollo y el metabolismo cesan; las bajas temperaturas son útiles para preservar cultivos de bacterias, pueden ser almacenados durante largos periodos a la temperatura del refrigerador de 4ºC a 7ºC o en congelador a temperatura de 20ºc a 70ºc bajo cero.
Este almacenamiento se hace en tubos de tapa de rosca con agar inclinado ó agar blando sembrado en picadura.
DesecaciónLa desecación de las células microbianas produce una declinación en la población viable total. El tiempo de sobrevivencia de los microorganismos después de la desecación varía según varios factores como son: la especie de microorganismo, el proceso y el material en que se hace. Se sabe que las esporas de los microorganismos son sometidos a gran deshidratación en estado de congelación y después a secado al vacío. Esta es una forma de conservar cepas o materiales biológicos en general por largos períodos.
Presión OsmóticaLos cambios en la concentración de sales o azúcares en el medio donde se encuentren las bacterias afectan el crecimiento de ellas; la mayor parte de los microorganismos son inhibidos por concentraciones elevadas de sales o azúcares.
RadiacionesLos microorganismos pueden ser sometidos a radiaciones electromagnéticas o acústica y a partículas subatómicas; estas radiaciones en general producen daños a la célula que pueden variar desde cambios a nivel genético hasta muerte de los microorganismos.
El método de esterilización por medio de radiaciones se conoce como esterilización fría y se utiliza para sustancias sensibles al calor, en las industrias farmacéuticas y de alimentos. Las radiaciones más utilizadas para este fin son:
Luz UltravioletaLa luz ultravioleta es absorbida por muchos materiales celulares pero más por ácidos nucleicos a los cuales causa gran daño. Las longitudes de onda alrededor de 2.650 Å tienen mayor eficacia como bactericidas; se pueden obtener lámparas que emiten concentraciones elevadas de luz ultravioleta en su región más efectiva éstas lámparas germicidas, se usan profusamente para reducir la población microbiana en quirófanos, cuartos de llenado aséptico en la industria farmacéutica y de alimentos y para tratar superficies contaminadas; en el laboratorio éstas lámparas están instaladas en cámaras de seguridad en donde se procesan muestras con gérmenes que pueden transmitirse por aerosoles.
RAYOS XSon letales para microorganismos y formas superiores de vida, tienen gran capacidad de penetración sin embargo son de poco uso para el control de poblaciones microbianas por su alto costo y además porque las radiaciones salen en todas direcciones a partir del punto de origen. Los rayos x han tenido más uso para producir microbianos.
Rayos GammaEstas radiaciones tienen mucha energía y son emitidas por ciertos isótopos radioactivos como Co60; tienen gran poder de penetración y son letales para todas las formas de vida incluso los microorganismos; se las ha utilizado para alimentos empacados.
Rayos Catódicos o Haz de Electrones
Son microbicidas a velocidades extremas, se usan actualmente para esterilizar material quirúrgico, drogas y otros materiales; presentan la ventaja de que el material puede ser esterilizado después de empacado y a temperatura ambiente.
ElectricidadEl paso de corriente eléctrica a través de líquidos que contengan bacterias mata un porcentaje de ellas. La causa de muerte puede atribuirse a alza en temperatura o a cambios químicos como producción de cloro y ozono, la aplicación de este sistema para esterilizar es limitada.
FiltraciónAlgunos materiales como sueros animales o humanos, o sustancias como enzimas, vitaminas y antibióticos, son termolábiles y además sensibles a la acción de otros agentes físicos; por tanto se hace necesaria su esterilización por filtración.Existen filtros bacteriológicos de asbestos (Filtros Seitz), otros filtros trabajan con tierra de diatomeas, como el filtro de Berkefeld, filtros de porcelana como los Chamberland Pasteur, filtros de fibra de vidrio; para la utilización de un determinado filtro debe tenerse en cuenta además del tamaño, del poro, otros factores como carga eléctrica de los microorganismos y naturaleza de los líquidos a filtrar. Los filtros más usados en laboratorios y en la industria, son los de membrana o moleculares que ésta compuestos de membranas porosas delgadas como papel, o de acetato de celulosa.
MUERTE EXPONECIAL DE UNA BACTERIAEl efecto que el calor ejerce en las células vivas, depende de la temperatura (intensidad del calor) y además del tiempo de exposición a dicha temperatura. Por lo tanto, el analizar la relación del calor con la vida-microbiana se ha de tener presente que los factores actuantes son tanto la temperatura como el tiempo de exposición a la misma.Esta muerte puede entenderse como la pérdida irreversible de la habilidad para reproducirse. Cuando una población microbiana pura es expuesta a un agente letal, la cinética de muerte es casi siempre exponencial. Si el logaritmo del número de sobrevivientes se lleva a una curva como función del tiempo de exposición se obtiene una línea recta, su inclinación negativa define la ruta de muerte. La rata de muerte nos dice solamente qué fracción de la población inicial sobrevive en un periodo dado de tratamiento. Para determinar el verdadero número de sobrevivientes se debe conocer el tamaño de la población.
Desde hace mucho tiempo se sabe que la destrucción de las bacterias por el calor tiene lugar en forma coordinada con el tiempo, por lo tanto el orden de muerte de las células vegetativas y esporuladas se hace en forma logarítmica. Si se somete al calor una población de células conocida y se determina el número de supervivientes a intervalos sucesivos de tiempo, anotando en la gráfica los logaritmos de los números hallados en relación a los tiempos, se obtiene una línea recta. Dicha curva indica que el orden de las muertes es logarítmico y que la proporción de mortalidad es constante.
MaterialesSubtilis en forma esporulada- Baño María a 90º C
- Agar Plate. Count- Cajas de Petri estériles- Tubos estériles- Pipetas de 1.0 ml.- Solución salina- Pipeta de 10 ml.- Cinta de enmascar- Lápiz de cera- Reloj
Procedimiento1. Coloque 10,0 ml de una suspensión de esporos (1012/ml) en un tubo de
ensayo e inmérsalo en el baño maría a 90º C. durante dos minutos. La exposición de dos minutos servirá como tiempo choque de calor y destruirá las células vegetativas. Al cabo de los dos minutos tome 1.0 ml de la suspensión de esporos y viértalo en un tubo que contiene 9.0 ml de solución salina.
2. Marque el tubo como tiempo cero3. Siembre 1.0ml de la dilución por el método de profundidad o
Empareado4. A intervalos de 10, 20, 30 y 40 minutos inmersa nuevamente el tubo de
ensayo en el baño maría a 90º C. durante dos minutos, tome 1.0 ml de la muestra y haga las diluciones correspondientes.
5. Verse una delgada capa de agar sobre la totalidad de las cajas que vaya a usar. Deje solidificar.
6. Coloque 1.0 ml de las diluciones correspondientes en cajas por duplicado y agrégueles una capa de agar. Por movimientos de rotación sobre la mesa homogenice la muestra con el agar. Deje solidificar.
7. Coloque una tercera capa de agar e incube todas las cajas a 37º C por 24 horas.
8. Grafique el número de supervivientes a cada tiempo y calcule los siguientes valores = “D” y “Z”.
D = __________T__________ Log 10 Ni - Log10 NF
D = Tiempo necesario para disminuir una población bacteriana en un 90% a una temperatura constante.
T = Tiempo de calentamiento.
Log10 Ni = Número inicial de esporas al tiempo 0.
Log10 NF = Número final de esporas al cabo de 40 minutos de calentamiento.
Z = T2_-__T1____ Log10 Ni - Log10 NF
Z = Número de grados centígrados necesarios para disminuir 10 veces el valor D.
T2 y T1 = Temperaturas
Log10 Ni = Número inicial de esporas en un ciclo logarítmico Log10 NF = Número final de esporas en el siguiente ciclo logarítmico
Valor F: Microorganismos que mueren a 121.5ºC.Método en Profundidad1. Coloque 10.0 ml de una suspensión de esporos (1012/ml) en un tubo de
ensayo e inmérsalo en el baño maría a 90º C durante 2 minutos. La exposición de dos minutos servirá como choque de calor y destruirá las células vegetativas, al cabo de los dos minutos tome 1.0 ml. el cual representa el tiempo cero. Haga diluciones de acuerdo a las instrucciones dadas.
2. A intervalos de 10”, 20”, 30” y 40 minutos tome muestras y haga las diluciones correspondientes.
3. Coloque por duplicado 1.0 ml de la dilución correspondiente en las cajas de petri.
4. Verse una delgada capa de agar plate-count (Tº de 44º C) sobre el ml de la dilución por movimientos de rotación sobre la mesa homogenice la muestra con el agar, deje solidificar.
5. Coloque una segunda capa de agar. Deje solidificar e incube todas las cajas a 37º C por 24 horas.
6. Grafique el número de sobrevivientes a cada tiempo y calcule los siguientes valores “D y Z”
CAPITULO V
PRUEBAS MICROBIOLÓGICASEl examen microscópico de las muestras clínicas es el primer paso para seguir en el proceso de una muestra, aunque no permite la identificación precisa de las bacterias que en ella se encuentran. Dicho examen debe complementarse con otros métodos que permitan llegar al aislamiento e identificación final de los gérmenes presentes, sin embargo es una etapa imprescindible, ya que orienta sobre los pasos a seguir en el procesamiento y solamente se prescinde de él cuando no existe ninguna probabilidad de obtener orientación, lo cual depende de la naturaleza de la muestra. El estudio microscópico se puede realizar mediante dos técnicas: Examen Fresco y con Coloraciones.
EXAMEN FRESCOEn este caso se estudian las bacterias vivas, solamente se coloca la muestra entre lámina y laminilla y nos permite observar:Las bacterias presentes Su cantidad Su morfología Su motilidadExisten algunas técnicas de este examen en fresco utilizadas en casos especiales tales como:
Técnica del campo oscuroSe emplea para detectar bacterias cuyo diámetro es tan delgado que supera el poder de resolución del microscopio, como son las espiroquetas.
Técnica de contraste de faseRequiere equipo especial, es valiosa en cultivo de tejido y estudio de estructura celular.
Técnica de tinta china o tinción negativa Se utiliza fundamentalmente para detectar la envoltura externa que tienen algunas bacterias u hongos
COLORACIONESLas coloraciones tienen por objeto la observación de la morfología bacteriana brindan información sobre su estructura y disposición, permiten la diferenciación de la morfología y la agrupación.
Preparación de una Extensión para teñirse.Los pasos a seguir en la preparación de una muestra para tinción, son:1-Hacer el frotis o extendido sobre la placa
2-Fijación del extendido3-Aplicación del colorante
Se toman láminas perfectamente limpias y marcadas, se coloca en ellas una gota de solución salina cuando se trata de cultivos en medios sólidos se toma la colonia cuyo estudio interesa con una asa bacteriológica estéril, se homogeniza perfectamente en la gota de solución salina y se deja secar a temperatura ambiente y se fija al calor.
Cuando un cultivo líquido es el de estudio se deposita en el centro de un portaobjeto una pequeña cantidad del producto a examinar tomando con asa o pipeta estéril, extendiéndola tratando de obtener una película delgada y homogénea ; Cuando el producto es muy denso , como material purulento, para garantizar una extensión fina puede diluirse previamente con solución salina estéril.
SecadoPuede realizarse a temperatura ambiente o acelerarlo, calentando ligeramente el extendido.
Fijación Tiene por objeto adherir el frotis al portaobjeto y fijar la morfología bacteriana por coagulación rápida de proteínas.Existen varias técnicas de fijación; solo algunas coloraciones especiales, no requieren este paso.
Fijación por AlcoholTécnica ampliamente utilizada, consiste en verter sobre la lámina algunas gotas de alcohol absoluto, luego dejarlo actuar por un minuto, se escurre y el resto del alcohol es inflamado.
Fijación por CalorTécnica muy utilizada, el reverso de la placa es pasado repetidas veces por la llama de un mechero teniendo la precaución de controlar el calor con el dorso de la mano, puesto que éste altera la morfología de los elementos celulares.
Fifación por Alcohol en frióSe utiliza el alcohol etílico absoluto el cual se deja actuar de 1 a 2 minutos. Escurrir y dejar secar.
Fijación por Ácido ÓsmicoUtilizado sólo para algunas coloraciones especiales. Se utiliza el ácido ósmico al 1%. Los vapores de dicho ácido son muy tóxicos
CLASES DE COLORANTESPara colorear las bacterias se disponen de gran cantidad de compuestos orgánicos clasificados en tres grupos:Colorantes de trifenil metanoColorantes de oxacina Colorantes de tiamina.Los colorantes naturales son los extraídos de animales y plantas.El carmín, extraído de la cochinilla.La hematoxicilina, extraída del palo de Campache
El Índico y la Brasilina, son extraídos de leguminosas.Estos colorantes son nucleares y se utilizan fundamentalmente en técnicas histológicas.Los colorantes artificiales son extraídos de alquitrán de hulla, son colorantes de anilina. Pueden clasificarse en ácidos básicos, neutros e indiferentes. El examen microscópico puede suministrar diversas informaciones, a saber:Presencia o ausencia de bacterias Morfología bacteriana Características tintoriales Reacción celular y citológica
Colorantes ÁcidosSon colorantes citoplasmáticos ácido pícrico, aurantía, iftalínas (Eosina: sales sódicas de la fluorescencia bromada).
Colorantes BásicosSon colorantes nucleares derivados de trifenilmetano: fucsina básica, cristal violeta, tiaminas, tioninas, azul de toluidina, azul de metileno.
Colorantes NeutrosSon sales compuestas de un colorante ácido y uno básico. Ejemplo: la Eosina azul de metileno.
Colorantes IndiferentesGeneralmente solubles en alcohol e insolubles en agua: Sudan III, negro Sudán B.
En bacteriología son utilizados especialmente los colorantes básicos por la alta basofília del citoplasma bacteriano. Los colorantes ácidos son utilizados en general como colorantes de contraste y los neutros e indiferentes se utilizan únicamente para coloraciones especiales. Constituyen los colorantes una ayuda valiosa para la identificación y el estudio de las bacterias. Estas normalmente son transparentes, por lo cual se hace difícil su observación en detalles. Como las bacterias reaccionan de manera diferente a los distintos colorantes, permitiendo su clasificación.Los colorantes ácidos, tienen afinidad por el protoplasma, mientras que los básicos tienen afinidad por el núcleo celularHay que anotar, que las bacterias no tienen un núcleo definido y las sustancias nucleares se hallan esparcidas en el protoplasma, condensándose a veces más en unos puntos que en otros.
Los colorantes se combinan químicamente con el protoplasma bacteriano, si la célula no ha muerto el proceso mismo de la tinción las elimina.
EXAMEN DE LAS COLORACIONESSe hace sin utilizar cubreobjetos, sobre el extendido coloreado y seco, se deposita una gota de aceite de inmersión, utilizando el objetivo de alto poder (100 X), el cual debe sumergirse en la gota de aceite. Resumen:
1. Preparación de la extensión o frotis2. Fijación3. Tinción4. Lavar5. Secar por debajo6. Secado total al ambiente7. Agregar una gota de aceite de inmersión.8. Examinar con el objetivo de inmersión.
CLASES DE COLORACIONES
Coloración SimpleEs la coloración de las bacterias por la aplicación de una solución colorante. El frotis fijado se inunda con el colorante por un tiempo establecido, después del cual, la placa es lavada con agua, secada y observada al microscopio. En general se utiliza como colorante la fucsina o un colorante azul (Azul de metileno, de toluidina, o de tionina).Por lo regular las células se tiñen uniformemente. Este tipo de coloración permite apreciar la morfología bacteriana:Bacterias en forma redonda – los cocos. Estos pueden estar aislados o agrupados en forma característica: en parejas, diplococos; en acúmulos, los Estafilococos, en cadenas, los Estreptococos etc.Esta agrupación depende del eje en el cual se realice la división celular.Bacterias alargadas en forma de bastón – los bacilosSus extremos pueden ser redondeados, puntiagudos o rectos. Algunas veces estos bacilos son muy cortos semejando cocos, a éstos se les denomina “Cocobacilos”.Bacterias en forma de coma, los VibrionesBacterias en forma de filamentos helicoidales muy delgadas, las Espiroquetas presentan ondulaciones en todo el cuerpo.Bacterias filamentosas y ramificadas – los Actinomicetos.Los filamentos a veces pueden fragmentarse, presentando formas bacilares u ovoidales.
Coloración con Azul de MetilenoLa tinción simple con azul de metileno, del desarrollo de cultivos en tubos de agar inclinado loeffler de posibles bacilos diftéricos puede revelar la presencia de los gránulos metacromáticos característicos del corynebacterium diptheriae y observar la morfología de las bacterias fusiformes y espiroquetas en nuestras orales.
Procedimiento1- Haga un extendido de la muestra en un portaobjetos .Fíjelo con
calor suave.2- Cubra la lámina con el colorante (Azul de Metileno).3- Espere 7 minutos y lave con agua corriente 4- Deje secar a temperatura ambiente5- Observe al microscopio con objetivo de alto poder (100 X )
Resultado: La Bacteria se observa de color azul
Fig.1 Diplococos vistos con Coloración Simple
Coloraciones Diferenciales
Coloración de GramHan Christiam Gram fue quien ideó este método en 1874. Es la coloración más corriente en bacteriología.Las bacterias mediante esta, técnica se dividen en dos grandes grupos, según conserven o no el primer colorante en el método (violeta genciana) a pesar de subsiguiente tratamiento con el colorante (alcohol acetona).Estos gérmenes se denominan Gram positivos porque retienen la violeta, no dejándose decolorar por el alcohol acetona, y aparecen de color violeta o azulesLas bacterias gram negativas, son decoloradas por el alcohol y toman la safranina apareciendo de color rojo o rosado.Base de la coloración La diferencia en la coloración es explicable con base en las diferencias de la estructura y la composición de la pared celular. Las bacterias Gram negativas contienen un porcentaje más alto de lípidos que las bacterias Gram positivas; el tratamiento con el alcohol extrae lípidos, con lo cual se aumenta la porosidad o permeabilidad de la pared celular Gram negativa; así el complejo cristal violeta-yodo puede extraerse, y de esta manera se tiñen con el colorante de contraste. La pared celular de las bacterias Gram positivas por su bajo contenido de lípidos, se deshidrata durante el tratamiento con alcohol, disminuyendo los poros, por lo tanto la permeabilidad se reduce. Imposibilitándose la extracción del complejo cristal violeta-yodo.
Técnica de la coloración de Gram1. Teñir la extensión o frotis por 1 minuto con cristal violeta.2. Lavar con agua corriente.3. Agregar lugol de Gram por 1 minuto.4. Lavar con agua corriente.5. Decolorar con alcohol acetona hasta cuando la preparación pierda todo
el colorante.6. Lavar con agua corriente.7. Coloración de contraste con solución acuosa de fucsina diluida por 1
minuto.8. Lavar con agua corriente, secar a Tº ambiente y observar en inmersión.
Resultado: Los Gram positivos se tiñen de color violeta o azul. Los Gram negativos se tiñen de color rojo rosado.
Fig.2 Cocos Gram positivos en Fig.3 Cocos Gram positivos en Cadena Racimo
Fig.4 Cocobacilos Gram negativos Fig.5 Diplococos Gram negativos
Coloración Ácido Alcohol ResistenteReciben este nombre algunas bacterias (Mycobacterium tuberculoso, paratuberculoso, lepra) que son de difícil coloración, pero que una vez que han tomado el colorante, lo conservan aún después del tratamiento con alcohol ácido esta propiedad se debe a que en su composición participan una gran cantidad de sustancias de naturaleza cérea que impiden a los colorantes la penetración en su protoplasma.Para conseguir que retengan el colorante deben calentarse la preparación hasta la emisión de vapores sin que llegue a la ebullición.Las micobacterias son las únicas bacterias que producen grandes cantidades de lípidos en el interior de la célula bacteriana. Estos lípidos se extraen por medio de disolventes de grasas y se ha demostrado que uno de sus componentes, una cera de alcoholes superiores combinados con un ácido graso complicado: "ácido micólico” goza de ácido resistencia. Técnica de coloración de Ziehl- NeelsenEs un procedimiento muy utilizado en el laboratorio de rutina, fundamentalmente empleado para las Micobacterias.
El frotis fijado es sometido a los siguientes pasos:1. Cubrir la preparación con fucsina fenicada y calentar suavemente, hasta
la emisión de vapores, durante 15 minutos, retire el calor, y vuélvalo a aplicar cuando desaparezcan los vapores, adicione colorante en caso de derramarse o evaporarse.
2. Volver a pasar el hisopo por debajo de la lámina hasta completar 15 minutos
3. Lavar con agua corriente.
4. Decolorar con alcohol ácido hasta cuando las partes más finas no tengan colorantes y las gruesas tomen un color rojizo.
5. Lavar con agua corriente.6. Cubrir el frotis con azul ziehl-Neelsen durante 7 minutos.7. Lavar con agua corriente.8. Dejar secar a Tº ambiente y observar con objetivo de inmersión.
Resultado: Los Bacilos Acido Alcohol Resistente se observan de color rojo sobre el fondo azul.
Fig.6 Bacilo Tuberculoso Fig.7 Bacilo Paratuberculoso
Coloración de Kin Youn o Método fríoCon el método en frío se requieren los mismos reactivos pero se emplea una solución más concentrada de fucsina fenicada que hace innecesario el calentamiento.Bacilo de la tuberculosis (de la lepra y paratuberculoso) se tiñen de rojo y se destacan sobre un El fondo azul.
VentajasEsta técnica es más simple y rápida que el método en caliente. Facilita además el examen de gran número de muestras.
Materiales- Un cronómetro- Láminas porta objeto limpias y secas- Hisopos estériles- Fucsina fenicada de kinyoun- Mezcla de ácido y etanol- Azul de metileno
Procedimiento1. Fijar el extendido o frotis a la llama.2. Coloque el portaobjeto a través de las varillas de vidrio sobre el
fregadero3. Agite bien el frasco de fucsina antes de usarla.4. Vierta la fucsina durante 5 minutos sobre el portaobjeto, cada
portaobjeto debe quedar completamente cubierto por este colorante.5. Lavar suavemente con agua. Enjuague cada portaobjeto
minuciosamente bajo el chorro de agua del grifo o con agua de un frasco de lavado.
6. Escurrir bien.
7. Decolorar con mezcla de ácido y etanol durante 2 minutos.8. Lavar suavemente con agua.9. Cubrir el extendido durante 30 segundos con azul de metileno de ziehl
Neelsen.10.Lavar suavemente con agua de grifo.11.Dejar secar a temperatura ambiente y observar en inmersión.
Las bacterias teñidas por este método se clasifican como ácido – alcohol- resistente si retienen la fucsina fenicada y aparecen de color rojo y no ácido – alcohol –resistente si el alcohol ácido las decoloró y se tiñen de azul porque toman el colorante de contraste (Azul de metileno).
Base de la coloraciónLos ácidos micólicos (los lípidos de la pared celular de las micobacterias) forman un complejo con los colorantes derivados del trifenilmetano;(fucsina, violeta, auramina, rosanilina), el cual no es disuelto con la utilización de solventes orgánicos como el alcohol –ácido. La tinción con Auramina facilita la lectura de las placas para Micobacterias, pero requiere el empleo de un microscopio fluorescente.
Coloración para EspiroquetasEstas bacterias generalmente son observables con la técnica del campo oscuro, pero pueden emplearse coloraciones especiales para observarlas en el microscopio de luz, tales como la coloración de VAGO y la impregnación argéntica o coloración de FONTANA-TRIBONDEAU
Coloración para RickettsiasEstas bacterias son estudiadas por medio de las coloraciones de MACCHIAVELLO, STAMP Y GIEMSA.
Coloración para MicoplasmaEstas bacterias por carecer de pared celular, requieren de coloraciones especiales para poderlos detectar, estas son: coloración de DIENES y de GIEMSA.
Coloración para Chlamydias En estas bacterias por ser intracelulares obligadas, su detección se basa en la observación de los cuerpos de inclusión que forman en la célula huésped; para esto se dispone de varios tipos de coloraciones a saber: de GIEMSA, GIMENEZ, MACCHIAVELLO, YODO y FLUORESCENCIA.
Coloración Diferenciales para Parásitos.Diversas coloraciones diferenciales son empleadas para mejorar la visualización y destacar la estructura interna de quistes como trofozoitos u otras formas de parásitos, especialmente de los que se encuentran en heces.Aunque estas coloraciones son realizadas habitualmente por los patólogos, pueden solicitarse a los microbiólogos que las incluyen en sus protocolos.
Coloración de EndosporasLos bacilos, producen cuerpos resistentes conocidos como endosporas que se forman en el interior de las células, los colorantes sencillos no penetran la pared de la espora y por ella, la célula con su endospora contiene un cuerpo oval, incoloro, cuando se utiliza cristal violeta o azul de metileno,
las endosporas deben ser teñidas por colorantes fuertes o bien la coloración por aplicación de calor, el colorante primario es en el método de shaffer foulton, el verde de malaquita que penetra en la endospora. El colorante secundario, es la safranina. El observador apreciara células de color rojo o rosa que contienen endospora verde.
Materiales- Láminas portaobjeto limpias, secas y desengrasadas.- Verde de malaquita al 5%- Fucsina acuosa al 0.5%. Método de Shaeffer – Foulton1. Cubrir la preparación con verde malaquita solución acuosa al 5%, y
calentar hasta el desprendimiento de vapores tres o cuatro veces durante un minuto.
2. Lavar con agua hasta quitar el exceso de colorante.3. Aplicar solución acuosa de fucsina al 0.5% durante 30 segundos4. Lavar con agua.5. Dejar secar a temperatura ambiente y observar en inmersión.
Resultado: Bacilo o parte vegetativa de color rojo y espora de color verde
Fig.8 Bacilos Esporulados Fig.9 Bacilos Esporulados
Coloración para FlagelosLos flagelos de las bacterias son invisibles en las preparaciones corrientes, y para demostrarlos deben emplearse cultivos bacterianos recientes, de 12 – 18 horas. En un tubo que contenga 5 c.c. de caldo, se diluye material procedente del crecimiento en superficie del agar, hasta producir ligera turbidez. Se lleva a la estufa durante una hora a 38ºC. Depositar sobre el porta objeto absolutamente limpio dos o tres gotas sin mezclarlas ni extenderlas. Es esencial que el porta objetos no tenga restos de ácido, y cuando se flamee debe hacerse en la parte azul de la llama para que se eliminen las partículas de carbón que pueden depositarse con la parte superior de la llama.La extensión se debe dejar secar al aire y nunca debe fijarse pasándola a través de la llama.El método de tinción que ha dado resultados más satisfactorios es el propuesto por Leifson.
Método de Leiffson1. Preparar una solución al 1,2% de fucsina básica garantizada para
tinción flagelar en alcohol etílico de 95%.2. Preparar una solución al 3% de ácido tánico en agua destilada.3. Preparar una solución al 1.5% de cloruro sódico.
4. Se prepara una solución madre mezclando a partes iguales las tres soluciones anteriores, y se conserva en el frigorífico.
5. Al hacer la tinción se añade 1 ml de colorante a la extensión y se deja que actúe de 5 a 15 minutos, según la edad del colorante y la temperatura del aire en el laboratorio.
6. Durante la tinción se forma un precipitado sobre el portaobjetos, debido a la evaporación del alcohol. Cuando dicho precipitado adquiera un color herrumbroso, se arrastra el colorante del portaobjeto mediante lavado.
7. Tras el lavado, se escurre suavemente el portaobjeto y se deja secar a temperatura ambiente.
La extensión se examina bajo objetivo de inmersión. Los flagelos aparecen rosados o rojos, mientras que el cuerpo aparece bacteriano sin teñir o débilmente rosado.Puede hacerse una tinción de contraste con azul de metileno, dejando que el colorante corra sobre el porta objeto.
Coloración para CápsulasLas cápsulas de las bacterias son frágiles y no se tiñen por los métodos corrientes.
Método de Hiss1. Extensión, desecación y fijación.2. Teñir con violeta de genciana, aceite de anilina o fucsina fenicada,
durante 5 segundos, o hasta el desprendimiento de vapores.3. Eliminar el exceso de colorante con solución acuosa de sulfato de cobre
al 20%.4. Secar con papel y al aire. No lavar.
Método de JohneEs adecuado especialmente para demostrar las cápsulas del bacilo del carbunco en preparaciones de sangre o de tejidos.1. Sacar al aire la extensión y fijar.2. Teñir con solución acuosa de violeta de genciana al 2% calentando
ligeramente durante un cuarto o medio minuto.3. Lavar rápidamente con agua.4. Lavar durante 6-10 segundos con ácido acético al 1-2%.5. Lavado en agua; montar en agua, bajo cubre objetos, para su examen.
Método de la Tinta ChinaLos gérmenes que van a examinarse se mezclan en una gota de tinta china colocada sobre un porta objeto. La mezcla se extiende con el borde de otro porta objeto, haciendo una extensión delgada. Se deja secar la preparación y se examina con objetivo seco de alto poder. Las bacterias capsulazas aparecen como zonas claras rodeando al microorganismo. La tinta ha sido desalojada por el material capsular. Las bacterias no capsuladas aparecen como diminutas motas brillantes.En vez de dejar secar la tinta china puede colocarse un cubre objetos sobre la gota de mezcla y se examina bajo objetivo seco de gran aumento. Las bacterias capsuladas se observan flotando en la tinta.
Resultado: Fondo obscuro, cápsula transparente; dentro de la cápsula se observa la bacteria.
Fig. 10 Bacterias Encapsulada
Coloración de Gránulos Metacromáticos
Método de Neisser1. Preparar la extensión de modo habitual.2. Cubrir la preparación durante 10-30 segundos, con la solución 1,
preparada del modo siguiente: Azul de metileno 0,1 gr. Alcohol absoluto 20,0 ml. Ácido acético glacial 5,0 ml. Agua destilada 100,0 ml.3. Lavar con agua.4. Tinción de contraste con parto de Bismarck o safranina diluida (es
preferible ésta) unos segundo.5. Secar y examinar.
Los gránulos aparecen de color azul-negruzco y el soma bacteriano de color pardo o rojizo, según el colorante de contraste.
Método de Albert1. Preparar la extensión del modo habitual.2. Teñir durante 1 minuto con solución 1, preparada así:
Azul de toluidina 0, 15 gr.Verde de metilo 0,20 gr.Ácido acético (glacial) 1,00 ml.Alcohol (95%) 2,00 ml.Agua destilada 100,00 ml.Tras dejarlo reposar durante un día, la solución se filtra y está lista para su empleo.
3. Tinción durante 1 minuto con solución 2 preparada del modo siguiente:Yodo 2,0 gr. Yoduro potásico 3,0 gr.Agua destilada 300,0 ml.
4. Lavado con agua, secado y examen.
Los gránulos se tiñen en negro, las estriaciones en cruz en azul y las partes intermedias en verde claro.
Coloración de Vacuolas Lipídicas
Se utiliza la coloración de NEGRO SUDAN o la coloración por FUCSINA O AZUL DE METILENO.
Coloración De Sangre
Método de WrightEl colorante puede adquirirse en forma líquida o en polvo, con el cual se prepara una solución saturada que se emplea como solución madre. El colorante puede prepararse añadiendo a 20 ml de solución madre 5ml de alcohol metílico. Se cubre la extensión sanguínea y se deja actuar un minuto. Se añade luego solución buffer o agua destilada gota a gota, luego se sopla con una pipita hasta que en la superficie del líquido aparece un brillo metálico. Se deja actuar durante 5 minutos; luego se arrastra el colorante con agua destilada, se seca y se examina con o sin aceite de inmersión. Se debe tener en cuenta eliminar la capa de brillo durante el lavado, pues forma un precipitado sobre la extensión, si se deja.
Fig.11 Glóbulos Rojos
Método de Giemsa1. Aplicar a las extensiones húmedas el siguiente fijador durante doce
horas.Alcohol etílico (99%) 1 parteSolución acuosa saturada de Cl2Hg 2 partes
2. Lavar con agua durante unos segundos.3. 3. Tratar con solución de Lugol durante 5 minutos.4. Lavar con agua y luego con thiosulfato sódico al 0.5%.5. Tinción con colorantes de Giemsa de 8 a 10 horas.6. Lavar y montar.
Coloración NuclearSe ha empleado la reacción de Feulgen y sus numerosas modificaciones para demostrar el material nuclear en las bacterias.Esta reacción suele utilizarse para indicar la presencia de aldehídos pero se considera que indica la presencia de DNA.Muestran cuerpos cromáticos en las células de Escherichia coli y dos especies de Bacillus.Los frotis fijados con vapor ósmicos son sometidos a la hidrólisis moderada con IN Hcl (7-8 minutos a 58ºC) y después de ellos son tratados con reactivos de Schiff. El color rosa pálido indica DNA. El RNA no se colora después de hidrólisis ácida, el color producido por DNA suele no ser intenso pero otros colorantes se han usado con éxito: Colorante de Giemsa, Azur A o tionina.
Coloración de la Pared CelularLas paredes celulares pueden teñirse con azul alciano, violeta cristal después de aplicar ácido tánico, como madente o con verde metilo. El método de Bisset y Hale incluye la inmersión de los frotis delgados en solución de ácido fosfomolibdico al 1% durante 3 a 5 minutos y después de ello aplicar verde metilo al 1% durante el mismo tiempo.Después de lavar y secar se examina el frotis con aceite de inmersión, las paredes celulares adquieren color violáceo o verde oscuro, el atoplasma queda sin teñir. Ejemplo de una cell de bacillus mycoides teñida con este método.Se hacen patentes las paredes de la cell.
. Coloraciones para HongosLos elementos de los hongos pueden visualizarse en materiales fijados por diversas decoloraciones. La coloración con ácido peryódico – Shiff (Pas) es probablemente una de las mejores tinciones generales, ya que la mayoría de los hongos presentes en materiales clínicos (esputo-tejido) tomara la coloración.El polisando capsular de ciertos hongos, especialmente cryptococcus neoformans toman un color rosa brillante con la coloración de mucicarmín, que ha demostrado ser muy útil para diferenciar este hongo en los tejidos.
PREPARACIÓN DE COLORANTESPara coloración de Gram:
Violeta de Genciana Violeta 10grEtanol o alcohol al 95% 200mlAgua 1800ml.Se deja reposar 24 horas y luego se filtra
LugolYodo 20grYoduro de potasio 40grAgua 2000ml.Se disuelve el yoduro con el agua y luego se disuelve el yodo.
Alcohol Acetona Se prepara a partes iguales con acetona comercial y alcohol puro.
SafraninaSafranina 4grAlcohol puro 160ml.Agua 1600ml.
Fucsina Fenicada De ZiehlSolución madre de fucsinaFucsina básica 10gEtanol de 95º 100ml.
Triturar la fucsina en un mortero agregando el alcohol poco a poco , transvasar a un frasco oscuro , en caso de no poseer un mortero , mezclar
la fucsina con el alcohol directamente en el frasco ; agitar diariamente durante ocho días , con esto se busca extraer la mayor cantidad posible de colorante del polvo de fucsina .A este procedimiento se le denomina Maduración del colorante .Rotular “Solución madre de fucsina“.
Solución de fenol al 5%Fenol 5ml.Agua destilada 95mlColocar cristales de fenoles un tubo de ensayo grande o vaso de precipitado para llevarlo al baño María Hasta que se fundan. Medir 5ml. Con pipeta y completar a 100ml con agua destilada.
Solución de trabajo de fucsina Solución madre (filtrada) 10ml.Solución de fenol al 5% 90ml.Envasar en frasco oscuro y rotular “Solución de trabajo de Fucsina “
Azul de MetilenoSolución madre de azul de metilenoAzul de metileno 10grEtanol de 95ª 100mlSe prepara en la misma forma que la solución madre de fucsina, dejándolo madurar durante 8 días y rotular “Solución Madre de Azul de Metileno “
Solución de trabajo
Solución madre (filtrada) 30ml.Agua destilada 70ml.Envasar en frasco oscuro y rotular “Solución de Trabajo de Azul de Metileno “
Alcohol AcidoAcido clorhídrico 3mlEtanol de 95ª 97mlAgregar el ácido sobre el alcohol lentamente, envasar en frasco oscuro o transparente, y rotular “Alcohol Acido”.
Coloración de AlbertAzul de toluidina 0.15grVerde de metilo oVerde de malaquita 0.02grAlcohol puro 2 mlAcido acético glacial 1 mlAgua destilada 100 ml
MEDIOS DE CULTIVOUn medio de cultivo bacteriológico es un sustrato en el cual una bacteria encuentra los elementos nutricionales necesarios para realizar su metabolismo en forma similar a como lo hace cuando se encuentra en la naturaleza.Los medios de cultivo constituyen un procedimiento indispensable en el estudio y diagnostico de los agentes infecciosos. Son ambientales
artificiales, semejante a su medio natural elaborados con los nutrientes apropiados para cada microorganismo y las condiciones ambientales favorables de Ph, presión osmótica, gases, humedad, etc .a fin de que puedan vivir y desarrollarse.
En ellos las bacterias crecen y se reproducen dando como resultado la formación de colonias en los medios sólidos y enturbiamiento, grumos, natas, velos o producción de gas en los líquidos. Por lo tanto, en especial en los medios de cultivo sólidos, pueden obtenerse cultivos puros a partir de una célula bacteriana con los cuales pueden efectuarse pruebas para su identificación.Los medios se pueden preparar a partir de sustancias naturales, como leche desnatada, o a partir de productos comerciales deshidratados, que contienen los ingredientes en cantidades exactas.Los medios comerciales traen adherida al recipiente la etiqueta con las instrucciones de preparación y la proporción del medio deshidratado que debe pesarse para un litro. Por lo tanto, basándose en esta proporción se pueden hacer los cálculos necesarios para las cantidades requeridas
Un cultivo bacteriológico puede efectuarse para diferentes propósitos, ejemplo:
1. Aislamiento e identificación de una bacteria.2. Pruebas de esterilidad de diferentes productos.3. Análisis bacteriológico de aguas, alimentos, ambientes.4. Producción de productos biológicos tales como toxoides, vacunas,
antígenos, etc.5. Pruebas de sensibilidad a antibióticos.
Gracias a investigaciones acerca del metabolismo bacteriano pudieron entenderse mejor los requerimientos nutricionales de las bacterias y se produjeron entonces medios de cultivo donde se obtuviera crecimiento rápido y abundante, se comprobó que hay compuestos simples que pueden ser fácilmente utilizados por las bacterias entre los cuales tenemos principalmente carbono, hidrógeno, oxigeno, nitrógeno, carbohidratos, alcoholes, aminoácidos, sales minerales, etc.
En todo examen microbiológico se hace necesario llevar a cabo un cultivo para evidenciar las bacterias:1-Porque el número de bacterias sea muy pequeño para ser observado microscópicamente. 2-Para aislar y separar las distintas especies que puedan estar presentes en un producto patológico.4-Para cultivos complementarios.3-Para identificar las bacterias aisladas.
REQUERIMIENTO DE LAS BACTERIAS PARA SU DESARROLLO Necesidades NutritivasLa mayoría de las bacterias son cultivables en medios artificiales a condición de que éstos les proporcionen todos los elementos necesarios para su multiplicación y crecimiento en forma asimilable.A este respecto, las necesidades de las bacterias son variables, por ejemplo hay microorganismos autotróficos que se multiplican en medios
puramente inorgánicos y sintetizan todos sus compuestos orgánicos a partir de CO2 y de sales de amonio o de nitratos y su energía la extraen de oxidación de azufre; estos microorganismos autotróficos se encuentran ampliamente difundidos en el suelo, pero la mayor parte de las bacterias y entre ellas las patógenas son más exigentes, necesitando compuestos orgánicos tales como carbohidratos, vitaminas, aminoácidos, etc. para desarrollarse.Estas bacterias reciben el nombre de Heterotróficas. Algunas bacterias no se dé desarrollan en medios artificiales, necesitando células vivas para hacerlo, son los parásitos obligados.Todo medio de cultivo debe llenar las necesidades bacterianas en cuanto a:
Necesidades ElementalesSon aquellas que cubren los requerimientos de carbono, nitrógeno hidrógeno, oxígeno, azufre, fósforo y pequeña de K, Ca, Mg, Y hierro.
Necesidades EnergéticasLa energía necesaria para el desarrollo bacteriano puede ser sintetizada por las bacterias a partir de la energía luminosa, bacterias fotosintéticas. La mayoría de las bacterias utilizan la energía liberada por reacciones oxido-reducción. Bacterias quimiosintéticas.
Necesidades Específicas en Factores de CrecimientoHay algunas bacterias que necesitan además, algunos compuestos que no son capaces de sintetizar, los “Factores de crecimiento. “Entre ellos, aminoácidos, bases púricas, pirimídicas y vitaminas.
CONDICIONES FISICOQUIMICASLa composición de un medio de cultivo no es la única condición necesaria para el desarrollo bacteriano, éste no se producirá si no se cuenta con ciertas condiciones fisicoquímicas:
1. Hidratación: En la presencia de agua en el medio, es indispensable para el desarrollo bacteriano.
2. Temperatura: Debe ser óptima según la especie bacteriana. Entre 18ºC y 45 ºC para las bacterias psicrófilas; para los mesófilos generalmente 35 ºC a 37 ºC; superior a 45 ºC para las termófilas.
3. Presión Osmótica: La mayor parte de las bacterias son muy tolerantes a las variaciones de presión, pero en general los medios de cultivo son isotónicos.
4. pH: Es de gran importancia, el pH óptimo está generalmente en el punto neutro, pudiendo variar entre 5 y 9; algunas bacterias exigen pH extremo alcalino otro ácido.
5. Potencial de Oxido Reducción: Ciertas bacterias son facultativas, es decir, que pueden multiplicarse tanto en presencia como en ausencia de oxígeno. Otras son aerobias estrictas, sólo se multiplican en la superficie de los medios de cultivo, de estas algunas son microaerofílicas y se multiplican mejor a presencia parciales de oxigeno. Hay un grupo de bacterias, anaerobias estrictas, deben preservarse para su crecimiento, del contacto con el oxigeno.
CLASIFICACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
Los medios de cultivo bacteriológicos son numerosísimos y pueden clasificarse bajo varios criterios, y un mismo medio de cultivo puede pertenecer a varios de los parámetros de la clasificación.
En cuanto a la consistencia 1. Puede ser:2. Líquidos: Se utilizan para obtener crecimiento desordenado de
bacterias sin lograr aislamiento de estas.3. Sólidos: Contienen una sustancia que les da consistencia, por algún
tiempo fue utilizada la gelatina; pero debido a que algunas bacterias la licuan, fue reemplazada por el agar (extracto de algas marinas) que incorporado al medio en una concentración más o menos 2% produce una solidificación estable.
4. Semisólidos: Poseen una concentración menor de agar que las anteriores, se emplea generalmente para conservación de cepas y para observar movilidad.
Según su Composición Nutricional 1. Simples: Medios con pocos requerimientos nutricionales que se
emplean para bacteria, poco exigentes pueden ser líquidos ó sólidos, el agar nutritivo y el caldo nutritivo son ejemplos de medios simples.
2. De enriquecimiento: Son medios líquidos que contienen sustancias como proteínas, petonas, carbohidratos, infusiones de tejidos u otras sustancias que permiten un crecimiento exhuberante de las bacterias, se utilizan para el cultivo primario en la mayoría de las muestras clínicas entre ellos están el caldo tioglicolato de sodio, el caldo de infusión de cerebro y corazón (BHI).
3. Medios Ricos: Son medios sólidos que se preparan a partir de una base rica en sustancias nutritivas, a las cuales se les adicionan productos biológicos que los hacen más ricos tales como sangre, la mayoría de las veces de animales (carnero, conejo, caballo), obtenida estérilmente y desfibrinada, suero sanguíneo, líquido ascítico humano, hemoglobina, plasma, etc., entre ellos tenemos Agar sangre, Agar chocolate, medio de Bordet-Gengou, Thayer-Martín. Se utilizan para cultivar bacterias muy exigentes en cuanto a sus requerimientos nutricionales.
Según su composición Bioquímica
Los medios de cultivos por lo general contienen sustancias químicas inhibidoras del crecimiento de algunas bacterias, indicadores de pH para visualizar las reacciones que puedan ocurrir, carbohidratos sobre los cuales actúan algunas bacterias bien sea acidificando o alcalinizando y sales de metales con los cuales reaccionan los productos del metabolismo bacteriano produciendo reacciones visibles por la presencia de citocromos.
1. Selectivos: Contienen sustancias que inhiben el crecimiento de algunas bacterias que permiten el crecimiento de otras, gracias a la presencia de sustancias inhibidoras. Se emplean cuando se tiene una mezcla de bacterias que se quieren separar .Pueden ser líquidos o sólidos (la mayoría). Entre ellas tenemos: Agar salmonella shiguella (Agar SS), Agar Azida de sodio, Caldo tetrationato de sodio, Thayer - Martín, Medio de Lowestein Jensen, Agar Chocolate, Agar Bismato
de Wilson Blair, Agar saldo Manita, Agar Baird – Parker, Agar Edwar’s.
2. Diferenciales: Se emplean para diferenciar bacterias a partir de una mezcla de ellas se usan principalmente para demostrar la producción de ácidos a partir de un carbohidrato contenido en el medio, haciéndose visible la reacción por un cambio de color que se produce y gracias a la presencia de un indicador de pH. Por lo general son medios sólidos y entre ellos tenemos el Agar Mac Conkey, el agar (Eosina azul de metileno), EMB, Agar Endo, el citrato de sodio.
3. De Identificación Bioquímica: Se emplean como su nombre lo indica para identificar una especie bacteriana basándose en sus propiedades bioquímicas, solamente se emplean cuando se tiene un cultivo puro, pueden ser sólidos o líquidos como ejemplo de ellos tenemos el Agar TSI, Agar Simmons citrato, caldo urea, caldo de MR-UP (Rojo de metilo-Voges proskawer), agar SIM, etc.
MEDIOS DE TRANSPORTESon medios que se utilizan para transportar muestras al laboratorio, cuando por alguna circunstancia estas tardarán algún tiempo para ser procesadas o cuando se sospechan microorganismos muy susceptibles a cambios ambientales, especialmente de pH. Básicamente un medio del transporte, contiene una solución tampon (Buffer) y una mínima cantidad de requerimientos nutricionales (las necesarias para que un microorganismo sobreviva sin multiplicarse) tratando en lo posible de que la muestra se conserve tal como fue tomada hasta el momento de la siembra. Los más comúnmente utilizados son secreciones purulentas, sanguinolentas, serosas y material de autopsias.
PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVOLa preparación de un medio de cultivo comercial deshidratado debe efectuarse de acuerdo a las instrucciones que vienen en la etiqueta del envase. Debe usarse solamente material de vidrio debidamente lavado, libre de productos químicos; el agua que se usa para disolver el medio debe ser destilada o desmineralizada a menos que se especifique otra condición especial. Las cantidades del medio indicadas en la etiqueta deben ser pesadas con toda precisión y el volumen de agua medido exactamente. Para lograr completa disolución del polvo debe calentarse el medio al calor directo o al baño María (preferiblemente) agitando continuamente. El calentamiento para lograr disolución completa necesaria especialmente en medios que contengan agentes solidificantes, y la esterilización deben efectuarse en el menor tiempo posible; excesivo en cualquier momento de la preparación del medio debe evitarse debido a que hay sustancias que pueden desnaturalizarse por exceso de calentamiento. Cuando un medio contiene estas sustancias inestables al calor, como algunos carbohidratos, deben disminuirse la temperatura 121oC a 118 o 116 oC (10 libras de presión). Lo mismo que el tiempo de esterilización a 12 minutos.
Materiales:- Medio de cultivo- Agua destilada- Fiolas- Espátulas
- Balanza- Papel de filtro- Mechero- Mallas de Adbesto- Agitador- Cajas de petri- Tubos taparosca- Probetas- Pipetas - Cinta indicadora de esterilidad- Autoclave
La preparación de un medio de cultivo comercial deshidratado debe efectuarse de acuerdo a las instrucciones que vienen en la etiqueta del envase debe usarse material de vidrio debidamente lavado, libre de productos químicos, el agua que se usa para disolver el medio debe ser destilada o desmineralizada. La cantidad del medio indicadas en la etiqueta debe ser pesada con toda precisión y el volumen del agua medido exactamente. Para lograr completa disolución del polvo debe calentarse el medio al calor directo o en un baño maría, agitando continuamente. Cuando un medio sustancias inestables al calor como algunos carbohidratos, debe disminuirse la temperatura de 121ºC a 118ºC o 116ºC (10 libras de presión), lo mismo que el tiempo de esterilización a 12 minutos.Estas sustancias sin embargo, deben esterilizarse preferiblemente por filtración y luego agregarse en condiciones de esterilidad a la base estéril. Este procedimiento debe efectuarse en diferentes clases de filtros; tales como los Seitz o los de membranas que permiten la filtración de cantidades abundantes de medio. El material utilizado debe estar estéril y manipularse asépticamente. Si hay necesidad de agregar sustancias enriquecedoras tales como sangre, suero, plasma, etc., debe tenerse la precaución de que la base del medio este a temperatura adecuada para que no se desnaturalicen algunos componentes de la sustancia enriquecedora, la cual debe agregarse suavemente en condiciones de estricta esterilidad y mezclarse teniendo cuidado de que la agitación sea también suave para evitar la formación de espuma. Los medios de cultivo que van a versarse en tubo deben repartirse antes de ser esterilizados, los medios para versar en caja se colocan de 12 a 15 ml del medio.Se tapan con algodón las fíolas, se les coloca un papel de aluminio se sellan con cinta indicadora de esterilización y se llevan al autoclave donde se usa la esterilización por calor húmedo la mayoría de los medios se esterilizan a 15 libras/pulgadas de presión (aproximadamente 121ºC) por 15 minutos a no ser que la etiqueta indique tiempo y presión diferentes.Una vez retirados los medios de él autoclave, se dejan reposar a temperatura ambiente, se versan y se dejan solidificar.Se toman al azar algunos tubos o cajas y se llevan a la incubadora de 35º - 37ºC durante 24 horas para realizarle la prueba de esterilidad. El resto de cajas y tubos se llevan a la nevera donde se almacenarán para evitar resecamiento y contaminación. Los tubos o cajas que se usaran para probar la esterilidad del medio deben descartarse.El enriquecimiento con sangre o suero para propósitos de orden nutricional o para detección de hemólisis debe efectuarse cuidadosamente, la sangre debe obtenerse de animales sanos; puede usarse de carnero,
conejo, caballo y humana, obtenida estérilmente y desfibrinada con perlas de vidrio. Si se desea aislar Estreptococo la mejor sangre es la de carnero desfibrinada, porque las reacciones hemolíticas de los Estreptococos son más nítidas, porque es inhibido el crecimiento del Haemophilus hemoliticus una bacteria “no patógena” cuyas colonias pueden confundirse con las de Estreptococo beta.La sangre de conejo desfibrinada es una segunda escogencia debido a que aunque la hemólisis es correcta, permite el crecimiento del Haemophilus hemoliticus.La sangre de caballo desfibrinada puede dar reacciones hemolíticas incorrectas.La sangre humana, del banco de sangre ofrece la ventaja de ser fácil de conseguir, pero debido a que es oxalatada o nitratada además de tener dextrosa, tiene las desventajas de que los anticoagulantes son inhibidores del crecimiento de algunas bacterias, y la dextrosa puede dar falsas reacciones hemolíticas de algunos Estreptococos. Además, la presencia de anticuerpos y agentes antimicrobianos, puede influir como inhibidores del crecimiento de algunas bacterias. Como base para la preparación del agar sangre, debe usarse una base rica, preferiblemente tripticasa soya agar, en ausencia de ésta puede usarse el agar columbia; la concentración de la sangre no debe ser mayor del 5%; el medio debe repartirse en capas delgadas (10-15ml. de medio en cada caja de petri).
ESTERILIZACIONPuede efectuarse de varias maneras, por lo general se usa esterilización por calor húmedo (Autoclave) o esterilización por filtración. En bacteriología la mayoría de los medios se esterilizan a 15LBS de presión (aproximadamente 121oC) por 15 minutos a no ser que la etiqueta indique tiempo y presión diferentes.
DESCRIPCION DEL AUTOCLAVEEsencialmente es una cámara de vapor de doble pared (un cilindro interno y uno externo) una tapa que se fija por medio de pernos una arandela de caucho asegura su hermeticidad. La tapa contiene: Un indicador de presión. Una válvula de seguridad, una espita de escape de vapor.
FUNCIONAMIENTOVerter agua en el cilindro externo (que tape el fondo). Colocar el material, o los medios de cultivo que se van a esterilizar dentro de la camisa (cilindro interno) e introducirlo dentro del cilindro externo, colocar la tapa, apretar los pernos por parejas (los dos que quedan uno frente al otro). Cuando el agua hierve, el vapor elimina el aire de él autoclave. El escape por la espita de vapor, que estará abierta, es entonces irregular. Un chorro continuo indica la eliminación, completa del aire, con lo que se puede cerrar ya la espita (válvula) manualmente.A medida que se genera más vapor en la cámara, se eleva la presión, con ella la temperatura; si queda aire dentro del aparato, la temperatura en la cámara será más baja que la deseada. Cuando la presión ha subido a 15 libras, se tiene la temperatura deseada (121oC). En este momento la perilla se coloca en medio y se deja el tiempo deseado de esterilización (chequeando que la presión permanezca constante).No es la presión la que mata a los microorganismos sino la temperatura elevada del vapor; si la presión sube excesivamente hay peligro de explosión.
Cuando se he terminado el tiempo de esterilización, se apaga y se espera que descienda la presión; cuando ésta es nula se abre la espita del escape de vapor y el aire penetra en el aparato Solamente entonces puede abrirse la tapa y retirar los objetos. Si se abre sin haber descendido del todo la presión, los contenidos en los tubos y balones, ascienden y mojan los algodones que los cubren con posibilidad de que el medio se derrame y pueda contaminarse. El autoclave no debe llenarse en exceso, ya que esto impide la buena circulación del vapor y la salida del aire lo que en última instancia, llevaría a la no esterilización de los medios de cultivo.
MECANISMOLos gérmenes son muertos por coagulación de su protoplasma. La eficacia depende del agua contenida en el interior de los gérmenes. La resistencia de la espora se explica por su escaso contenido de agua.Este tipo de esterilización (autoclave) tiene varias ventajas: Calentamiento rápido, penetración y humedad en abundancia que facilitan la coagulación de las proteínas.Para garantizar la eficacia se la esterilización el método más seguro consiste en contaminar con esporas algunos de los medios a esterilizar, y cultivar luego dicho medio; se considerará satisfactorio el resultado de la prueba, si no se desarrollan las esporas en el medio. Existen para este objetivo, preparaciones comerciales de esporas bacterianas.
ELECCION DE LOS DIFERENTES MEDIOS DE CULTIVOLos medios de cultivo deben seleccionarse con base en los posibles microorganismos que pueden contener las muestras. De preferencia se usarán medios selectivos, siempre que se indique la bacteria que quiere investigarse igual para las muestras que no tienen asociación de flora normal como L.C.R., liquido ascético, cardiaco etc.Deben incluirse siempre un caldo de enriquecimiento (BHI), no así, a las muestras que como orina, esputo, secreción faríngea, vaginal van a tener una cantidad variable de flora normal.
EJEMPLOS DE MEDIOS DE CULTIVO
Para Salmonella Shiguella: Medios Selectivos: SS XLD Hektoen Bismuto de Wilson Blair Medios Diferenciales: Desoxicolato EMB MacConkey Caldos de Enriquecimiento: Selenito Tetrationato GN
Neisserias: Thayer Martin Agar chocolate (cuando la bacteria se
encuentra como flora única)
Corynebacterias: Agar chocolate con Telurito de Potasio Medio de Loeffler
Enterococo: Caldo Azida Glucosa
Caldo púrpura de bromocresol
Micobacterias: Middlebrook, 7 Hg, 7 H1o, 7 11 Dubos Zula Proskawer Copenhague Lowestein Jensen Ogawa
Coniformes: EMB MacConkey Endo Desoxicolato Caldo lactosado bilis verde brillante
Brucilla: Medio de Castañeda (Medio difásico con Tripticasa Soya Agar y Tripticasa soya caldo.
Bordetella: Agar Bordet Genyou Agar de Chocolate (Eugonagar)
Agar de Soya Tripticasa con extracto de hemina y levadura.
Ag ar GC con Isovitalex X y hemoglobina.
Stafhilococcus aureus: Agar Sangre Agar Salado Manita Agar Vogel Johson
Fig.12 Algunos Medios de Cultivo
METODOS DE SIEMBRA Y AISLAMIENTO DE CULTIVO PUROSe denomina cultivo al desarrollo de bacterias u otros microorganismos en medios de laboratorio.
Las diferentes especies de bacterias que se desarrollan en la misma clase de medios de cultivo pueden tener aspecto muy diferentes y por lo tanto el conocimiento de la apariencia o de las características del cultivo de las especies, es útil para reconocer a ciertos tipos de bacterias; así mismo, puede servir como un medio que haga posible identificar las especies.
Dada la gran variedad de microorganismos que pueden estar presentes en una muestra, las grandes diferencias bioquímicas que presentan las bacterias, aún las que pertenecen a un mismo género o especie y las características comunes a muchas de ellas, se hace necesario separarlos completamente si se quiere estar seguro de una completa y correcta identificación en el laboratorio ya se apara fines investigativos, industriales, clínicos, etc. Esta separación es lo que se conoce como un aislamiento bacteriano que puede demostrarse por la formación de colonias en medios de cultivos sólidos.
La identificación de colonias se hace con base en sus características externas, como son: Tamaño, color, textura, forma, reacciones bioquímicas etc.Estas características pueden observarse aún en siembras que contengan más de dos microorganismos, ya que cada uno de ellos se manifiesta como es, independiente de la presencia de otros en el mismo medio.El éxito o fracaso de un intento de aislamiento de colonia depende de la manera como se haga el extendido inicial de la muestra, la cantidad de microorganismos presentes en el inóculo y la consistencia del medio de cultivo empleado para tal fin.
Existen gran variedad de técnicas por medio de las cuales las diferentes especies de una muestra natural, pueden ser aisladas y desarrollarse como cultivo para:
TÉCNICA DE SIEMBRA POR ESTRÍAS EN CAJA DE PETRI.a. Con un asa bacteriológica curva estéril se pasa una porción de la
muestra o de la colonia que quiere aislarse a un extremo de la superficie de un medio de cultivo.
b. Con pase rápido del asa cargada con el material haga estrías hacia adelante.
c. Esterilice el asa y déjela enfriar.d. Tape la caja, márquela adecuadamente e incúbela invertida a 37 oC por
18-24 horas.
Fig.13 Método de Estriación
TÉCNICA DE SIEMBRA POR AGOTAMIENTO EN CAJA DE PETRI.a. Con un asa bacteriológica curva estéril se pasa una porción de la
muestra o de la colonia que quiere aislarse a un extremo de la superficie de un medio de cultivo.
b. Con pase rápido del asa cargada con el material haga estrías hacia delante y hacia atrás, hasta la mitad de la caja.
c. Esterilice el asa y déjela enfriar.d. Sin tomar nueva muestra, toque la última línea de la siembra y
extiéndala perpendicular a la primera estriación.e. Esterilice el asa y en el espacio sin sembrar tocando la última línea de la
segunda estriación, extienda perpendicularmente como en el caso anterior.
f. Tape la caja, márquela adecuadamente e incúbela invertida a 37º C por 24 horas.
TÉCNICA DE SIEMBRA POR AISLAMIENTO EN CAJA DE PETRI.a. Con un asa bacteriológica recta esterilizada tome la colonia y realice 5
líneas en un extremo de la caja sin romper el medio.b. Esterilice el asa y déjela enfriar.c. Tome el asa y sin tomar nueva muestra toque las líneas de la siembra
anterior y realice otras cinco líneas sin romper el medio.d. Esterilice el asa y déjela enfriar.e. Tome el asa y sin tomar nueva muestra y tocando las líneas de la
siembra anterior realice otras cinco líneas sin romper el medio.f. Esterilice el asa y déjela enfriar.g. Repita el paso en el espacio libre de la caja,h. Esterilice el asa y déjela enfriar.
I. Tape la caja, márquela adecuadamente e incúbela invertida a 37º C por 18-24 horas.
TÉCNICA POR SUPERFICIE EN CAJA DE PETRI.Para sembrar por superficie en placa se utiliza una varilla de cristal estéril para esparcir la muestra. Esta operación hace posible adelgazar la muestra de tal manera que en la superficie las bacterias separadas unas de otras.
Procedimientoa. Colocar 0.1 ml de la dilución 10-1 en el centro de la caja de petri.b. Con la varilla de vidrio estéril extenderla por toda la superficie de la
caja en todos los sentidos.c. Tape la caja, márquela adecuadamente e incúbela invertida a 37º C por
24 horas. TÉCNICA DE SIEMBRA EN PROFUNDIDAD EN CAJA DE PETRI.El principio de la técnica de la placa invertida es la dilución de la muestra en tubos con agar fundido y enfriado.Se necesita hacer diluciones en más de un tubo para obtener colonias bien aisladas, si es que no se conoce la magnitud de la población bacteriana de la muestra antes de manejarla.El medio se mantiene en estado líquido a una temperatura de 45º C para permitir que el inóculo se distribuya adecuadamente en el medio.
Procedimiento1. Se toman tres tubos marcados con A B y C y cada uno contiene 9 ml de
S.S.2. En el tubo A se pone una parte proporcional de la suspensión original.
Este tubo se pone entre las dos manos y se agita por rotación para mezclar el medio con el inóculo.
3. Se hace transferencia de 10 ml del tubo A al tubo B y del tubo B al tubo C.
4. Con una pipeta estéril tomamos: 10 ml del tubo A y lo pasamos a una caja de petri estéril, luego le adicionamos una capa delgada del agar fundido que está a una temperatura de 45º C, se mezcla, moviendo la caja 8 veces hacia arriba, 8 veces hacia abajo. 8 hacia la izquierda y 8 hacia la derecha.
5. Se deja la caja sobre el mesón hasta que solidifique el medio.6. Luego se adiciona una segunda capa de agar delgada y se deja
solidificar, se marca adecuadamente y se llevan a incubar invertidas a 37º C por 24 horas.
7. El mismo procedimiento se realiza con los tubos B y C.
Después de la incubación las cajas se examinan para buscar las que tengan colonias aisladas. De esta caja se pueden aislar cultivos puros de bacterias, sembrando una porción de una de las colonias aisladas en un nuevo medio de cultivo.
TÉCNICA DE SIEMBRA EN AGAR INCLINADO.Utilizando asa recta estéril tomar una colonia e introducir el asa en un tubo que contiene un agar inclinado hasta la mitad del fondo aproximadamente.Sacar el asa por el sitio de inoculación y haciendo movimientos de vaivén, se hacen estrías en la superficie del medio, flamear la boca del tubo y
taparlo, esterilizar el asa y llevar el tubo a incubar a 37º C durante 24 horas.
TÉCNICA DE SIEMBRA EN MEDIO LÍQUIDO.a. Con un asa bacteriológica curva estéril, se toma una porción de la
muestra o de la colonia, se introduce en un tubo de ensayo que contiene un medio de cultivo líquido (caldo) y haciendo movimientos rotativos se desprende la muestra o la colonia del asa bacteriológica, flamear la boca del tubo, taparlo, esterilizar el asa y llevar el tubo a incubar 24 horas a 37º C.
b. La presencia de turbidez, natas indica que hay crecimiento bacteriano.
TECNICA DE SIEMBRA POR SEDIMENTACIONTomar una muestra del medio ambiente por la técnica de sedimentación en placa, que consiste en abrir la caja de petri que contiene el medio de cultivo durante 10 minutos en el sitio deseado, taparla, marcarla y llevarla a la incubadora 24 horas a 37º C.
TECNICA DE SIEMBRA EN MEDIOS CON PIPETASe adiciona la muestra, por las paredes del tubo con una pipeta estéril, directamente sobre el medio líquido, para evitar que se formen burbujas dentro del medio.
TECNICA DE SIEMBRA MASIVA La técnica de siembra masiva se realiza con escobillón, sobre la superficie de un medio de cultivo solido.Se toma la muestra con un escobillón o hisopo estéril, se desliza en varias direcciones sobre la superficie del agar, con el fin de obtener desarrollo microbiano en forma de capa uniforme.
LECTURA DE CULTIVO A LAS 24 HORAS.Observar bien el aspecto de estas colonias. Estas características generales son:- Tamaño: Depende de la especie bacteriana, pero también del medio y de la calidad del aislamiento (las colonias demasiado cercanas entre sí, no alcanzan su talla máxima), los límites de tamaño de las colonias varían des muy pequeños (punta de alfiler), que miden solamente unas fracciones de milímetros de diámetro hasta colonias muy grandes que miden de 5 a 10 mm. La mayoría de las bacterias forman colonias de tamaño limitado de acuerdo con el período de incubación, otras como algunas especies de Pseudónimas, Bacillus y Proteus se desarrollan sobre todo la superficie del agar.- Margen o borde: Los bordes de las colonias bacterianas son de diferentes tipos según la especie de que se trate, pueden formar un círculo perfecto como las orillas de una gota o mostrar gran variedad de irregularidades como salientes, redondas, hendiduras irregulares, proyecciones filiformes o proyecciones en forma de raíz.- Relieve: Las colonias pueden ser muy finas, aplanadas, tener una depresión central (cóncavas) elevadas o abombadas mostrando diferentes grados de convexidad. ASPECTO DE LA SUPERFICIEPuede ser lisa: colonias S (Smooth) o rugosa: Colonia R (Rough), el aspecto puede ser también cremoso, húmedo, etc. CONSISTENCIA
Esta característica se refiere a si la colonia es o no mucosa. Este aspecto puede evidenciarse al tomar una colonia con una asa y observar si es filante.
CROMOGÉNESIS O PIGMENTACION.Las colonias pueden estar coloreadas (pigmentadas) o sin color (no pigmentadas), algunas especies se caracterizan por los matices que presentan, de rojo, amarillo, café y violeta.
CARACTERISTICAS ÓPTICASLas hay opacas, transparentes u opalescentes.
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