Métodos de Extracción Del ARN Y ARN

8/17/2019 Métodos de Extracción Del ARN Y ARN

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Co$eta #e $a

%uestra&' 4na colecta y mane$o apropiado de la muestra permite o#tener!D" íntegro y sin contaminantes& dependen del tipo de muestra (ue se usara-

($antas&' 7e colecta te$ido +oliar 1te$ido $o%en ya (ue contiene m,s células porunidad de peso (ue el te$ido %ie$o y posee menos polisac,ridos y poli+enoles(ue di)cultan la extraccin2 e inmediatamente se congela en nitrgeno lí(uidopara e%itar la +ormacin de cristales y (ue se sinteticen meta#olitossecundarios después de la a#scisin. 7i el te$ido es o#tenido de in%ernaderos oculti%o in %itro& no es necesario congelar el material& se puede hacer laextraccin directamente& y se almacena el te$ido a 68 9C antes de laextraccin.

An!%a$es&' :n te$idos se corta el te$ido en peda'os pe(ue;os 1aprox. .


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para e%itar la degradacin del !D" por accin de las D"asas. :$- semillas&pl,ntulas& te$idos )#rosos o %iscosos y hongos.

6Pistilos u homogenei'adores- Los pistilos disgregan la muestra mediante+riccin con la pared del tu#o (ue contiene la muestra& adicionalmente sepuede utili'ar alg?n material a#rasi%o como %idrio pul%eri'ado o resinas.

Cuando se utili'an dispositi%os es necesario colocar el tu#o so#re una camade hielo& lo cual e%ita (ue el !D" se +ragmente por el calor (ue genera la+riccin. Con te$idos congelados se recomienda (ue el te$ido se disgregue enpresencia de nitrgeno lí(uido.

)o%ogene!*a!"n -u.%!a: La muestra se mantiene en solucin a altastemperaturas en presencia de detergentes& proteasas y agentes caotrpicos(ue rompen las uniones entre las células o (ue incluso pueden per+orar lamem#rana celular. :$- #acterias

L!s!s e$u$ar&' Durante el proceso de lisis las interacciones entre las moléculas(ue con+orman la pared& la mem#rana celular y nuclear se modi)can o

destruyen permitiendo (ue los ,cidos nucleicos se li#eren& esto se reali'amediante detergentes 17D7& 5riton o detergentes comerciales2& tam#ién seemplean métodos +ísicos& como a(uellos #asados en ultrasonido& pero como unmecanismo de de+ensa natural& las células contienen en'imas (ue destruyen al!D" 1!D"asas2. Para esto se utili'an métodos +ísicos& tales comodesnaturali'acin por calor 1a temperaturas de @


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restos de etanol se eliminan con un la%ado con etanol al y el remanentese elimina por e%aporacin.

Re#!so$u!"n #e$ ADN

4na %e' (ue se ha eliminado el etanol& el paso siguiente es hidratar el !D"

para mantenerlo en solucin. :n el caso de emplear agua& el pE de#e ser de para permitir la redisolucin completa del !D" y e%itar una hidrolisis ,cida.Cuando se utili'a una solucin amortiguadora& es pre+eri#le utili'ar unasolucin de 5ris6ECl a m0 y :D5! a .0 a un pE de 8. 1loG 5:2 paraalmacenar el material. Cuando se est, disol%iendo el !D" es importante e%itarel pipeteo y la agitacin agresi%a pues se pueden +ragmentar moléculas de altopeso molecular. 4na opcin (ue e%ita la +ragmentacin consiste en incu#ar a


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• Posteriormente se adiciona agua o solucin amortiguadora al centro dela mem#rana& se espera (ue el !D" se hidrate& se centri+uga pararecuperarlo de la matri' y resuspederlo.

:n el protocolo de perlas magnéticas se utili'a una solucin #,sica de tris6EClm0 con un pE de 8.< para neutrali'ar la carga de perlas. :l !D" se separade las perlas y se trans)ere a otro tu#o& mientras (ue las perlas son retenidaspor el magneto.

La mayoría de los Iits tienden a ser generales a la hora de su aplicacin& perose dise;an con un propsito especí)co. :$emplo- 4n Iit para extraer !D" desangre total& considera la presencia de hemoglo#ina y eritrocitos durante elproceso.

Dicho método ser, m,s agresi%o en comparacin con un Iit dise;ado paraextraer !D" de células o te$idos animales. :n los manuales proporcionados porlas +,#ricas se detallan adem,s de los pasos a seguir en cada caso-

La cantidad de muestra recomendada y el rendimiento esperado de acuerdo altipo de te$ido 1n%itrogen H


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• ProporcinO&8 es !D" puro& si el %alor es me$or (ue &8 indica lapresencia de proteínas.

Co%pro5a!"n De La Integr!#a# De$ ADN (or E$etro6ores!s

• La integridad del !D" se puede o#ser%ar mediante electro+oresis en gel

de agarosa.• 7i !D" est, integro& se de#e o#ser%ar una #anda estrecha cercana al

po'o en el (ue se coloc la me'cla del !D".• 7i est, +ragmentado se o#ser%ar, una #anda de m,s de cm de ancho

o un sendero luminoso en el carril de la muestra.

A$%aena%!ento De$ ADN

4na %e' (ue el !D" ha sido puri)cado& cuanti)cado y anali'ado medianteelectro+oresis& una parte de la muestra se puede almacenar a = 9C para los

an,lisis inmediatos y el material restante a 6H 9C o 68 9C& para unapreser%acin por %arios meses. :n este ?ltimo caso es con%eniente (ueel !D" se conser%e en soluciones con #a$a concentracin de sales para inhi#irla accin de D"asas contaminantes.

Venta7as 8 Des2enta7as De Los (rotoo$os De Extra!"n Tra#!!ona$es 8 Co%er!a$es

La o#tencin de !D" íntegro y puro es una parte +undamental para el #uendesempe;o de las técnicas utili'adas en #iología molecular.

4na de las %enta$as de utili'ar métodos tradicionales es su #a$o costo& así como un alto rendimiento. 7in em#argo& en ocasiones el material o#tenido est,+ragmentado. :stos métodos son suscepti#les de contaminacin& %ariacin yerrores por los m?ltiples pasos de manipulacin.

:n los ?ltimos a;os ha aumentado el uso de los de métodos de extraccincomerciales de#ido a (ue la matri' permite capturar selecti%amenteal !D" haciendo posi#le o#tener un extracto de alta pure'a con moléculasíntegras* al tiempo (ue se reduce el n?mero de pasos en la extraccin y sedisminuye la posi#ilidad de contaminacin con !D" o !3" exgeno.


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Fig. Venta7as 0 #es2enta7as #e $os %3to#os tra#!!ona$es 0 o%er!a$es#e extra!"n 0 pur!4a!"n #e ADN&

(erspet!2as

4no de los o#$eti%os principales de los métodos modernos de extraccin esautomati'ar el proceso& mediante el uso de Iits y extractores autom,ticosro#oti'ados con la mínima inter%encin de operadores& (ue permitan me$orarla precisin& o#tener resultados reproduci#les y reducir el tiempo de

extraccin& en particular cuando se re(uiere procesar una gran cantidad demuestras.

La extraccin de !D" íntegro y sin contaminantes es esencial para tener éxitoen la o#tencin de datos genéticos& es el primer paso en la lista de técnicasmoleculares (ue nos lle%ar,n a comprender me$or y conser%ar la di%ersidad#iolgica a partir del conocimiento de genes y genomas (ue anteriormente erainaccesi#le para le ecología y la e%olucin.

(rotoo$os #e extra!"n #e ADN !%p$e%enta#os en e$ $a5orator!o #eE2o$u!"n Mo$eu$ar 0 Exper!%enta$ #e$ Inst!tuto #e Eo$og.a

:n el la#oratorio se utili'an tres tipos de métodos para la extraccin de !D"&modi)cados de protocolos pre%ios-

− :xtraccin de !D" en #acterias gram negati%as− :xtraccin de !D" en plantas− :xtraccin de !D" en animales

:stos métodos se #asan en la lisis celular& eliminacin de proteínas&precipitacin y limpie'a del !D"& de#ido presentan algunas %enta$as- son


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econmicos& no se mane$an compuestos (uímicos txicos o contaminantes alam#iente y se o#tienen grandes cantidades de !D"* pero tam#ién tienendes%enta$as como- la pure'a del !D" no es a#soluta y en algunas especies seo#tiene un !D" parcialmente degradado 1en peda'os2.

7e utili'an pa(uetes comerciales cuando se re(uiere !D" de alta calidad o

#ien se trata de organismos de cierto grado de comple$idad como algunas#acterias Bram positi%as o plantas (ue naturalmente producen gran cantidadde compuestos secundarios. !lgunos pa(uetes comerciales de altorendimiento son- P43B:"& Q4!B:"& 0LP/3:& B:"53!& 0oio& etc.

Extra!"n De ADN De 9ater!as Gra% Negat!2as

. /#tener un culti%o nue%o de #acterias. :n un microtu#o de .< ml agregar.< ml de sul+ato de magnesio m0 y resuspender en él una asada de#acterias.

H. Centri+ugar a =


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. Culti%ar las #acterias en medio slidas& po#res en nutrientes& durante eltiempo necesario para o#tener un crecimiento a#undante pero de células

$%enes.

H. :n un tu#o de .< ml estéril agregar .< ml de sul+ato de magnesio m0

N. !gregar una asada pe(ue;a de #acterias 1calculando una cantidad de Hcolonias medianas2 y homogenei'ar per+ectamente TpipeteandoU sua%emente.

=. ncu#ar en hielo durante min.


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@. Centri+ugar a xg y eliminar per+ectamente el so#renadanteescurriendo en papel secante.

. ncu#ar el #otn a @


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• Filtrar la +ase acuosa con un tro'o de algodn estéril insertado en la#oca del tu#o y so#re éste recuperar el so#re6 nadante en un tu#onue%o.

• !gregar HMN del %olumen de so#renadante o#tenido con isopropanol +río16H9C2& agitar sua%emente e incu#ar a 6H9C por hr.

• 0e'clar sua%emente& y centri+ugar los tu#os a H xg a @9C por minutos. :liminar el so#renadante& de$ar secar el #otn de !D" y resuspender en .< ml de agua ultra pura. ncu#ar a @


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:xisten en ocasiones muestras %erdaderamente complicadas& en estos casosse inicia el proceso con una maceracin en alcohol etílico al S@& lo (ue rompelos mucopolisac,ridos y nos permite seguir con los procedimientos normales.Cuando es necesario limpiar el !D" por(ue se encuentra muy saturado desales o proteínas (ue impiden la ampli)cacin de productos de PC3 utili'amosel siguiente método-

L!%p!e*a #e $as %uestras on 6eno$'$oro6or%o

• !gregar


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:l método utili'ado con m,s +recuencia es el de BP7 1por sus siglas en inglés*,cido tiosanato de guanidina& +enol& sarcosyl2 desarrollado por Chomc'ynsIi y7acchi 1S82. Cada uno de estos componente $uega un papel especí)co- el,cido tiosanato de guanidina es sumamente +uerte y tiene un alto poderdenaturali'ante* el +enol& al estar acidi)cado& pro%oca (ue el !D" se acumuleen la inter+ase entre la +ase acuosa y la del +enol& de$ando al !3" en la +aseacuosa* el sarcosyl& por su parte& es un detergente muy potente (ue ayuda a lalisis celular& pero no reempla'a la ruptura +ísica de las células (uegeneralmente se logra con micro es+eras de %idrio agitadas con la ayuda de un%rtex o de un homogeni'ador celular 1como ead6eater2. 7in em#argo& esimportante tratar las muestras con !D"asas li#res de !3"asas.

9OOM

:l método //0& desarrollado por oom et al. 1SS2 lle%a a ca#o laextraccin con el ,cido tiosanato de guanidina& separando los ,cidos nucleicoscon #ase en su alta a)nidad para enla'arse en matrices de sílica& en %e' de

utili'ar +enol. Dado (ue este método aisla tanto !D" como !3"& resultaesencial utili'ar las nucleasas especí)cas para !D" (ue lo eliminen de lamuestra. !lgunas compa;ías han creado pa(uetes de extraccin #asados eneste principio& (ue utili'an matrices de sílica dise;adas para +a%orecer elenlace de !3" 1como 3"easy de Q!B:"2. Las moléculas grandes de !3"&incluyendo !3"r y !3"m& son insolu#les en soluciones con altasconcentraciones de sal& por lo (ue durante su precipitacin es com?n utili'arcloruro de litio 8 0 1li#re de !3"asas2 e incu#ar las muestras a >C durantedos horas antes de centri+ugar. 7in em#argo& este método no de#e ser utili'adopara !3" (ue ser, sometido a transcripcin re%ersa 1%éase m,s adelante2.

Transr!p!"n Re2ersa

:sta técnica permite pasar& en sentido in%erso al dogma central de la #iologíamolecular& de !3" a !D". :l primer paso es con%ertir el m!3" en !D"complementario 1c!D"2 a partir de la acti%idad de la re%erso transcriptasa.:sta en'ima existe en la naturale'a como parte del mecanismo de replicacinen %irus& y utili'a un t!3" como oligonucletido o primer.

M3to#o ut!$!*a#o para transr!p!"n re2ersa para expres!"n #e genes!n2o$ura#os en $a 47a!"n #e n!tr"geno en %uestras au,t!as 1??? #e$ @!t #e (ro%ega #e RT'(CR

X !gua ultra pura sin nucleasas 1H8 l2

X uer de %irus de mielo#lastosis de a%e


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X Ciclo

X N min a =H9 C

:l c!D" +ormado durante la transcripcin re%ersa es posteriormente utili'adoen la reaccin de PC3 para ampli)carlo e identi)car el gen (ue esta#a

originalmente expres,ndose en nuestra muestra.M3to#o para a!s$a%!ento #e ARN tota$ #e %uestras #e aguaa%5!enta$es Rneas0B Fa$"n eta$&> 1??

. Colectar muestras de agua en )ltros D43!P/3: 10illipore& Corp. 7an José& C!. :4!2.

H. Colocar )ltros con las células hacia +uera dentro de tu#os :ppendor+ de.< ml con micro es+eras de %idrio y con la solucin 3L5 (uecontiene,cido tiosanato de guanidina y A6mercaptoetanol 1(ue desacti%amoléculas comple$as y ayuda en la lisis celular2.

N. !plicar %i#racin con %rtex o con homogeni'ador celular 1%i#racin min& colocar en hielo min& %i#racin min2.=. Centri+ugar 1H min x xg2 y trans+erir el supernadante 1con !3"2 a

tu#o colector nue%o. !gregar N


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Pre%iamente calentar a 8>C el uer de :xtraccin en un #a;o de agua& o+raccionar en tu#os de &

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