8/3/2019 Methyl at Ion Specific Pcr a Novel Pcr Assay for Methyl at Ion

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P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USAV o l . 9 3 , p p . 9 8 2 1 - 9 8 2 6 , S e p t e m b e r 1 9 9 6M e d i c a l S c i e n c e s

M e t h y l a t i o n - s p e c i f i c PCR: A n o v e l P C R a s s a y f o r m e t h y l a t i o ns t a t u s o f C pG i s l a n d s(DNA m e t h y l a t i o n / t u m o r s u p p r e s s o r g e n e s / p l 6 / p 1 5 )

J A M E S G . H E R M A N * t , J E R E M Y R . G R A F F * , SANNA M Y O HA NE N *, B AR R Y D . N E L K I N * , AND S T E P H E N B . B A Y L I N * t* O n c o l o g y C e n t e r a n d : D e p a r t m e n t o f M e d i c i n e , T h e J o h n s H o p k i n s M e d i c a l I n s t i t u t i o n s , 4 2 4 N o r t h B o n d S t r e e t , B a l t i m o r e , MD 2 1 2 3 1C o m m u n i c a t e d b y V i c t o r A . M c K u s i c k , J o h n s H o p k i n s H o s p i t a l , B a l t i m o r e , MD, J u n e 3 , 1 9 9 6 ( r e c e i v e d f o r r e v i e w A p r i l 3 , 1 9 9 6 )AB STRACT P r e c i s e m a p p i n g o f D N A m e t h y l a t i o n p a t -t e r n s i n CpG i s l a n d s h a s b e c o m e e s s e n t i a l f o r u n d e r s t a n d i n gd i v e r s e b i o l o g i c a l p r o c e s s e s s u c h a s t h e r e g u l a t i o n o f i m -p r i n t e d g e n e s , X c h r o m o s o m e i n a c t i v a t i o n , a n d t u m o r s u p -p r e s s o r g e n e s i l e n c i n g i n human c a n c e r . We d e s c r ib e a newm e t h o d , M S P ( m e t h y l a t i o n - s p e c i f i c P C R ) , w h i c h c a n r a p i d l ya s s e s s t h e m e t h y l a t i o n s t a t u s o f v i r t u a l l y a n y g r o u p o f C pGs i t e s w i t h i n a C pG i s l a n d , i n d e p e n d e n t o f t h e u s e o f m e t h y l -a t i o n - s e n s i t i v e r e s t r i c t i o n e n z y m e s . T h i s a s s a y e n t a i l s i n i t i a lm o d i f i c a t i o n o f DNA b y s o d i u m b i s u l f i t e , c o n v e r t i n g a l lu n m e t h y l a t e d , b u t n o t m e t h y l a t e d , c y t o s i n e s t o u r a c i l , a n ds u b s e q u e n t a m p l i f i c a t i o n w i t h p r i m e r s s p e c i f i c f o r m e t h y l a t e dv e r s u s u n m e t h y l a t e d DNA. M S P r e q u i r e s o n l y s m a l l q u a n t i -t i e s o f DNA, i s s e n s i t i v e t o 0 . 1 % m e t h y l a t e d a l l e l e s o f a g i v e nC pG i s l a n d l o c u s , a n d c a n b e p e r f o r m e d o n DNA e x t r a c t e df r o m p a r a f f i n - e m b e d d e d s a m p l e s . M S P e l i m i n a t e s t h e f a l s ep o s i t i v e r e s u l t s i n h e r e n t t o p r e v i o u s P C R - b a s e d a p p r o a c h e sw h i c h r e l i e d o n d i f f e r e n t i a l r e s t r i c t i o n e n z y m e c l e a v a g e t od i s t i n g u i s h m e t h y l a t e d f r o m u n m e t h y l a t e d DNA. I n t h i ss t u d y , w e d e m o n s t r a t e t h e u s e o f M S P t o i d e n t i f y p r o m o t e rr e g i o n h y p e r m e t h y l a t i o n c h a n g e s a s s o c i a t e d w i t h t r a n s c r i p -t i o n a l i n a c t i v a t i o n i n f o u r i m p o r t a n t t u m o r s u p p r e s s o r g e n e s( p 1 6 , p 1 5 , E - c a d h e r i n , a n d v o n H i p p e l - L i n d a u ) i n humanc a n c e r .

I n h i g h e r o r d e r e u k a r y o t e s , DNA i s m e t h y l a t e d o n l y a t c y -t o s i n e s l o c a t e d 5 ' t o g u a n o s i n e i n t h e CpG d i n u c l e o t i d e ( 1 ) .T h i s m o d i f i c a t i o n h a s i m p o r t a n t r e g u l a t o r y e f f e c t s o n g e n ee x p r e s s i o n , e s p e c i a l l y w h e n i n v o l v i n g C p G - r i c h a r e a s k n o w n a sCpG i s l a n d s , l o c a t e d i n t h e p r o m o t e r r e g i o n s o f many g e n e s ( 2 ,3 ) . W h i l e a l m o s t a l l g e n e - a s s o c i a t e d i s l a n d s a r e p r o t e c t e d f r o mm e t h y l a t i o n o n a u t o s o ma l c h r o m o s o m e s ( 3 ) , e x t e n s i v e m e t h -y l a t i o n o f CpG i s l a n d s h a s b e e n a s s o c i a t e d w i t h t r a n s c r i p t i o n a li n a c t i v a t i o n o f s e l e c t e d i m p r i n t e d g e n e s ( 4 , 5 ) a n d g e n e s o n t h ei n a c t i v e X - c h r o m o s o m e o f f e m a l e s ( 6 , 7 ) . A b e r r a n t m e t h y l -a t i o n o f n o r m a l l y u n m e t h y l a t e d C pG i s l a n d s h a s b e e n d o c u -m e n t e d a s a r e l a t i v e l y f r e q u e n t e v e n t i n i m m o r t a l i z e d a n dt r a n s f o r m e d c e l l s ( 8 ) a n d h a s b e e n a s s o c i a t e d w i t h t r a n s c r i p -t i o n a l i n a c t i v a t i o n o f d e f i n e d t u m o r s u p p r e s s o r g e n e s i n humanc a n c e r s ( 9 - 1 2 ) . I n t h i s l a s t s i t u a t i o n , p r o m o t e r r e g i o n h y p e r -m e t h y l a t i o n s t a n d s a s a n a l t e r n a t i v e t o c o d i n g r e g i o n m u t a -t i o n s i n e l i m i n a t i n g t u m o r s u p p r e s s o r g e n e f u n c t i o n ( 9 , 1 0 ) .T h e r e f o r e , m a p p i n g o f m e t h y l a t i o n p a t t e r n s i n CpG i s l a n d sh a s b e c o m e a n i m p o r t a n t t o o l f o r u n d e r s t a n d i n g b o t h n o r m a la n d p a t h o l o g i c g e n e e x p r e s s i o n e v e n t s .M a p p i n g o f m e t h y l a t e d r e g i o n s i n DNA h a s r e l i e d p r i m a r i l yo n S o u t h e r n h y b r i d i z a t i o n a p p r o a c h e s , b a s e d o n t h e i n a b i l i t yo f m e t h y l a t i o n - s e n s i t i v e r e s t r i c t i o n e n z y m e s t o c l e a v e s e -q u e n c e s t h a t c o n t a i n o n e o r more m e t h y l a t e d C pG s i t e s . T h i sm e t h o d p r o v i d e s a n a s s e s s m e n t o f t h e o v e r a l l m e t h y l a t i o ns t a t u s o f CpG i s l a n d s , i n c l u d i n g some q u a n t i t a t i v e a n a l y s i s( 1 3 ) , b u t r e q u i r e s l a r g e a m o u n t s o f h i g h m o l e c u l a r w e i g h t

DNA ( g e n e r a l l y 5 , t g o r m o r e ) , c a n d e t e c t m e th y l a t i o n o n l y i fp r e s e n t i n g r e a t e r t h a n a f e w p e r c e n t o f t h e a l l e l e s a n d c a n o n l yp r o vi d e i n f o r m a t i o n a b o u t t h o s e C pG s i t e s f o u n d w i t h i ns e q u e n c e s r e c o g ni z ed b y m e t h y l a t i o n - s e n s i t i v e r e s t r i c t i o n e n -z y m e s . A more s e n s i t i v e m e t h o d o f m e t h y l a t i o n d e t e c t i o nc o m b i n e s t h e u s e o f m e t h y l a t i o n - s e n s i t i v e e n z y m e s a n d P C R( 1 4 ) . A f t e r d i g e s t i o n o f DNA w i t h t h e e n z y m e , P C R w i l la m p l i f y f r o m p r i m e r s f l a n k i n g t h e r e s t r i c t i o n s i t e o n l y i f DNAc l e a v a g e h a s b e e n p r ev en te d b y m e t h y l a t i o n ( 1 5 , 1 6 ) . L i k eS o u t h e r n - b a s e d a p p r o a c h e s , t h i s m e t h o d c a n o n l y m o n i t o rC pG m e t h y l a t i o n i n m e t h y l a t i o n - s e n s i t i v e r e s t r i c t i o n s i t e s .M o r e o v e r , t h e r e s t r i c t i o n o f u n m e t h y l a t e d DNA m u s t b ec o m p l e t e , s i n c e a n y u n c l e a v e d DNA w i l l b e a m p l i f i e d b y P C Ry i e l d i n g a f a l s e p o s i t i v e r e s u l t f o r m e t h y l a t i o n . T h i s a p p r o a c hh a s b e e n u s e f u l i n s t u d y i n g s a m p l e s w h e r e a h i g h p e r c e n t a g eo f a l l e l e s o f i n t e r e s t a r e m e t h y l a t e d , s u c h a s t h e s t u d y o fi m p r i n t e d g e n e s ( 5 , 1 5 , 1 6 ) a n d X c h r o m o s o m e - i n a c t i v a t e dg e n e s ( 1 4 ) . H o w e v e r , d i f f i c u l t i e s i n d i s t i n g u i s h i n g b e t w e e ni n c o m p l e t e r e s t r i c t i o n a n d l o w n u m b e r s o f m e t h y l a t e d a l l e l e smake t h i s a p p r o a c h u n r e l i a b l e f o r d e t e c t i o n o f t u m o r s u p p r e s -s o r g e n e h y p e r m e t h y l a t i o n i n s m a l l s a m p l e s o r i n s a m p l e sw h e r e m e t h y l a t e d a l l e l e s r e p r e s e n t a s m a l l f r a c t i o n o f t h ep o p u l a t i o n .T h e c h e m i c a l m o d i f i c at i o n o f c y t o s i n e t o u r a c i l b y b i s u l f i t et r e a t m e n t h a s p r o v i d e d a n o t h e r m e t h o d f o r t h e s t u d y o f DNAm e t h y l a t i o n t h a t a v o i d s t h e u se o f r e s t r i c t i o n e n z y m e s ( 1 7 ) . I nt h i s r e a c t i o n , a l l c y t o s i n e s a r e c o n v e r t e d t o u r a c i l , b u t t h o s et h a t a r e m e t h y l a t e d ( 5 - m e t h y l c y t o s i n e ) a r e r e s i s t a n t t o t h i sm o d i f i c a t i o n a n d r e m a i n a s c y t o s i n e ( 1 8 ) . T h i s a l t e r e d DNAc a n t h e n b e a m p l i f i e d a n d s e q u e n c e d , p r o v i d i n g d e t a i l e di n f o r m a t i o n w i t h i n t h e a m p l i f i e d r e g io n o f t h e m e t h y l a t i o ns t a t u s o f a l l C pG s i t e s ( 1 7 ) . H o w e v e r , t h i s m e t h o d i s t e c h n i c a l l yr a t h e r d i f f i c u l t a n d l a b o r - i n t e n s i v e , a n d , w i t h o u t c l o n i n g o f t h ea m p l i f i e d p r o d u c t s , t h e t e c h n i q u e i s l e s s s e n s i t i v e t h an S o u t h -e r n a n a l y s i s , r e q u i r i n g - 25% o f t h e a l l e l e s t o b e m e t h y l a t e d f o rd e t e c t i o n ( 1 9 ) .We no w r e p o r t a n o v e l P C R m e t h o d , m e t h y l a t i o n - s p e c i f i cP C R ( M S P ) , w h i c h i s s e n s i t i v e a n d s p e c i f i c f o r m e t h y l a t i o n o fv i r t u a l l y a n y b l o c k o f CpG s i t e s i n a C pG i s l a n d . We d e s i g n e dp r i m e r s t o d i s t i n g u i s h m e t h y l a t e d f r o m u n m e t h y l a t e d DNA i nb i s u l f i t e - m o d i f i e d DNA, t a k i n g a d v a n t a g e o f t h e s e q u e n c ed i f f e r e n c e s r e s u l t i n g f r o m b i s u l f i t e m o d i f i c a t i o n . U n m o d i f i e dDNA o r DNA i n c o m p l e t e l y r e a c t e d w i t h b i s u l f i t e c a n a l s o b ed i s t i n g u i s h e d , s i n c e m a r k e d s e q u e n c e d i f f e r e n c e s e x i s t b e -t w e e n t h e s e DNAs. T h e f r e q u e n c y o f C pG s i t e s i n C pG i s l a n d sr e n d e r s t h i s t e c h n i q u e u n i q u e l y u s e f u l a n d e x t r e m e l y s e n s i t i v ef o r s u c h r e g i o n s . H e r e i n , we d e t a i l t h e M S P p r o c e d u r e a n ds h o w i t s u s e f o r d e t e c t i n g t h e a b e r r a n t m e t h y l a t i o n o f f o urt u m o r s u p p r e s s o r g e n e s i n human n e o p l a s i a .

MAT ERIALS AND METHODSD N A a n d C e l l L i n e s . G e n o m i c DNA w a s o b t a i n e d f r o m c e l ll i n e s , p r i m a r y t u m o r s , a n d n o r m a l t i s s u e a s d e s c r i b e d ( 1 0 - 1 2 ) .

A b b r e v i a t i o n s : M S P , m e t h y l a t i o n - s p e c i f i c PCR; V H L , von H i p p e l -L i n d a u .t T o whom r e p r i n t requests s h o u l d b e a d d r e s s e d .T h e p u b l i c a t i o n c o s t s o f t h i s a r t i c l e w e r e d e f r a y e d i n p a r t b y p a g e c h a r g ep a y m e n t . T h i s a r t i c l e m u s t t h e r e f o r e b e h e r e b y m a r k e d " a d v e r t i s e m e n t " i na c c o r d a n c e w i t h 1 8 U . S . C . 1 7 3 4 s o l e l y t o i n d i c a t e t h i s f a c t .

9 8 2 1

8/3/2019 Methyl at Ion Specific Pcr a Novel Pcr Assay for Methyl at Ion

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9 8 2 2 M e d i c a l S c i e n c e s : Herman e t a l .T h e r e n a l c a r c i n o m a c e l l l i n e was k i n d l y p r o v i d e d b y M i c h a elL e r m a n ( N a t i o n a l C a n c e r I n s t i t u t e , F r e d e r i c k , MD).B i s u l f i t e M o d i f i c a t i o n . DNA ( 1 , u g ) i n a v o l u m e o f 5 0 g l w a sd e n a t u r e d b y N a O H ( f i n a l c o n c e n t r a t i o n , 0 . 2 M) f o r 1 0 m i n a t3 7 C . F o r s a m p l e s w i t h n a n o g r a m q u a n t i t i e s o f human DNA,1 , u g o f s a l m o n spe r m DNA ( S i g m a ) was a d d e d as c a r r i e rb e f o r e m o d i f i c a t i o n . T h i r t y m i c r o l i t e r s o f 1 0 mM h y d r o q u i -n o n e ( S i g m a ) a n d 5 2 0 , u l o f 3 M s o d i u m b i s u l f i t e ( S i g m a ) a t pH5 , b o t h f r e s h l y p r e p a r e d , w e r e a d d e d a n d m i x e d , a n d s a m p l e swe re i n c u b a t e d u n d e r m i n e r a l o i l a t 5 0 C f o r 1 6 h r . M o d i f i e dDNA w a s p u r i f i e d u si ng t he W i z a r d DNA p u r i f i c a t i o n r e s i na c c o r d i n g t o t h e m a n u f a c t u r e r ( P r o m e g a ) a n d e l u t e d i n t o 5 0p t l o f w a t e r . M o d i f i c a t i o n w a s c o m p l e t ed b y N a O H ( f i n a lc o n c e n t r a t i o n , 0 . 3 M ) t r e a t m e n t f o r 5 m i n a t room t e m p e r a -t u r e , f o l l o w e d b y e t h a n o l p r e c i p i t a t i o n . DNAwas r e s u s p e n d e di n w a t e r a n d u s e d i m m e d i a t e l y o r s t o r e d a t - 2 0 C .G e n o m i c S e q u e n c i n g . G e n o m i c s e q u e n c i n g o f b i s u l f i t e -m o d i f i e d DNA ( 1 7 ) w a s a c c o m p l i s h e d u s i n g t h e s o l i d - p h a s eDNA s e q u e n c i n g a p p r o a c h ( 1 9 ) . B i s u l f i t e m o d i f i e d DNA ( 1 0 0n g ) was a m p l i f i e d w i t h p 1 6 g e n e - s p e c i f i c p r i m e r s 5 ' -TTTTTAGAGGATTTGAGGGATAGG ( s e n s e ) a n d 5 ' -C T A C C T A A T T C C A A T T C C C C T A C A ( a n t i - s e n s e ) . P C Rc o n d i t i o n s w e r e as f o l l o w s : 9 6 C f o r 3 m i n a n d 8 0 C f o r 3 m i n ,a f t e r w h i c h 1 u n i t o f T a q p o l y m e r a s e ( B R L ) w a s a d d e d ; t h e n3 5 c y c l e s o f 9 6 C f o r 2 0 s e c , 5 6 C f o r 2 0 s e c , 7 2 C f o r 9 0 s e c ;a n d f i n a l l y 5 m i n a t 7 2 C . T h e P C R m i x t u r e c o n t a i n ed lxb u f f e r ( B R L ) w i t h 1 . 5 mM M g C l 2 , 2 0 p m o l o f e a c h p r i m e r , a n d0 . 2 mM d N T P s . To o b t a i n p r o d u c t s f o r s e q u e n c i n g , a s e c o n dr o u n d o f P C R was p e r f o r m e d w i t h 5 p m o l o f n e st e d p r i m e r s .I n t h i s r e a c t i o n , t h e sense p r i m e r , 5'-GTTTTCCCAGTCAC-GACAGTATTAGGAGGAAGAAAGAGGAG, c o n t a i n sM 1 3 - 4 0 sequence ( u n d e r l i n e d ) i n t r o d u c e d a s a s i t e t o i n i t i a t es e q u e n c i n g , a n d t h e a n t i - s e n s e p r i m e r 5'-TCCAATTC-CCCTACAAACTTC i s b i o t i n y l a t e d t o f a c i l i t a t e p u r i f i c a t i o no f t h e p r o d u c t b e f o r e s e q u e n c i n g . P C R w a s p e r f o r m e d a sa b o v e , f o r 3 2 c y c l e s w i t h 2 . 5 mM M g C 4 2 . A l l p r i m e r s f o rg e n o m i c s e q u e n c i n g w e r e d e s i g n e d t o a v o i d an y CpGs i n t h esequence. B i o t i n y l a t e d P C R p r o d u c t s w e r e p u r i f i e d u s i n gs t r e p t a v i d i n - c o a t e d m a g n e t i c b e a d s ( D y n a l , O s l o ) , a n d s e -q u e n c i n g r e a c t i o n s were p e r f o r m e d w i t h S e q u e n a s e a n dM 1 3 - 4 0 s e q u e n c i n g p r i m e r u n d e r c o n d i t i o n s s p e c i f i e d b y t h em a n u f a c t u r e r ( U n i t e d S t a t e s B i o c h e m i c a l ) .P C R A m p l i f i c a t i o n . P r i m e r p a i r s d e s c r i b e d i n T a b l e 1( 2 0 - 2 4 ) w e r e p u r c h a s e d f r o m L i f e T e c h n o l o g i e s . T h e P C Rm i x t u r e c o n t a i n e d lx P C R b u f f e r ( 1 6 . 6 mM ammoniums u l f a t e / 6 7 mM T r i s , pH 8 . 8 / 6 . 7 mM M g C l 2 / 1 0 mM 2 - m e r -

c a p t o e t h a n o l ) , dNTPs ( e a c h a t 1 . 2 5 mM), p r i m e r s ( 3 0 0 ng e a c hper r e a c t i o n ) , a n d b i s u l f i t e - m o d i f i e d DNA ( ' 5 0 n g ) or un-m o d i f i e d DNA ( 5 0 - 1 0 0 n g ) i n a f i n a l v o l u m e o f 5 0 A l . P C Rs p e c i f i c f o r u n m o d i f i e d DNA a l s o i n c l u d e d 5 % d i m e t h y ls u l f o x i d e . R e a c t i o n s w e r e h o t - s t a r t e d a t 9 5 C f o r 5 m i n b e f o r et he a d d it i o n o f 1 . 2 5 u n i t s o f T a q p o l y m e r a s e ( B R L ) . A m p l i -f i c a t i o n was c a r r i e d o u t i n a H I y b a i d OmniGene t e m p e r a t u r ec y c l e r f o r 3 5 c y c l e s ( 3 0 sec a t 9 5 C , 3 0 sec a t t h e a n n e a l i n gt e m p e r a t u r e l i s t e d i n T a b l e 1 , a n d 3 0 sec a t 7 2 C ) , f o l l o w e d b ya f i n a l 4 - m i n e x t e n s i o n a t 7 2 C . C o n t r o l s w i t h o u t DNA w e r ep e r f o r m e d f o r e a c h s e t o f P C Rs . E a c h P C R ( 1 0 , l ) w a s d i r e c t l yl o a d e d o n t o n o n d e n a t u r i n g 6-8% p o l y a c r y l a m i d e g e l s , s t a i n e dw i t h e t h i d i u m b r o m i d e , a n d d i r e c t l y v i s u a l i z e d u n d e r UVi l l u m i n a t i o n .

R e s t r i c t i o n A n a l y s i s . Of t h e 5 0 , l I o f P C R m i x t u r e , 1 0 A l w a sd i g e s t e d w i t h 1 0 u n i t s o f B s t U I ( N e w E n g l a n d B i o l a b s ) f o r 4h r , a c c o r d i n g t o c o n d i t i o n s s p e c i f i e d b y t h e m a n u f a c t u r e r .R e s t r i c t i o n d i g e s t s w e r e e t h a n o l p r e c i p i t a t e d b e f o r e g e l a n a l y s i s .R E S U L T S

V a l i d a t i n g t h e D e s i g n S t r a t e g y f o r MSP: G e n o m i c S e q u e n c -i n g o f p l 6 . A n i n i t i a l s t u d y w a s r e q u i r e d t o v a l i d a t e w h e t h e r o u rs t r a t e g y f o r M S P w o u l d prove f e a s i b l e f o r a s s e s s i n g t h em e t h y l a t i o n s t a t u s o f C pG i s l a n d s . We n e e d e d t o d e t e r m i n ew h e t h e r t h e d e n s i t y o f m e t h y l a t i o n , i n k e y r e g i o n s t o b e t e s t e d ,w a s g r e a t e n o u g h t o f a c i l i t a t e o ur p r i m e r d e s i g n . We c h o s e t ot e s t t h i s f o r t h e p l 6 tumor suppressor gene i n w h i c h we ( 1 0 , 2 5 )a n d o t h e r s ( 2 6 , 2 7 ) h a v e d o c u m e n t e d t h a t h y p e r m e t h y l a t i o n o fa 5 ' C pG i s l a n d i s a s s o c i a t e d w i t h c o m p l e t e l o s s o f genee x p r e s s i o n i n many cancer t y p e s . H o w e v e r , o t h e r t h a n f o r C pGs i t e s l o c a t e d i n r e c o g n i t i o n sequences f o r m e t h y l a t i o n -s e n s i t i v e enzymes, t h e d e n s i t y o f m e t h y l a t i o n a n d i t s c o r r e l a -t i o n t o t r a n s c r i p t i o n a l s i l e n c i n g h a s n o t b e e n e s t a b l i s h e d . Wet h u s e m p l o y e d t h e g e n o m i c s e q u e n c i n g t e c h ni q u e t o e x p l o r et h i s r e l a t i o n s h i p . As h a s b e e n f o u n d f o r o t h e r C pG i s l a n d se x a m i n e d i n t h i s manner ( 1 9 , 2 8 , 2 9 ) , t h e C pG i s l a n d o f p 1 6 h a dno m e t h y l a t i o n a t any C pG s i t e i n t h o s e c e l l l i n e s a n d n o r m a lt i s s u e s p r e v i o u s l y f o u n d t o b e u n m e t h y l a t e d b y S o u t h e r na n a l y s i s ( F i g . 1 ; r e f s . 1 0 a n d 2 5 ) . H o w e v e r , i t w a s e x t e n s i v e l ym e t h y l a t e d i n cancer c e l l l i n e s s h o w n t o b e m e t h y l a t e d b yS o u t h e r n a n a l y s i s ( F i g . 1 ) . I n f a c t , a l l c y t o s i n e s w i t h i n C pGd i n u c l e o t i d e s i n t h i s r e g i o n w e re c o m p l e t e l y m e t h y l a t e d i n t h ecancers l a c k i n g p i 6 t r a n s c r i p t i o n . T h i s m a r k e d d i f f e r e n c e i nsequence f o l l o w i n g b i s u l f i t e t r e a t m e n t s u g g e s t e d t h a t o u r

T a b l e 1 . P C R p r i m e r s u s e d f o r M S PA n n e a l

P r i m e r t e m p . , G e n o m i cs e t S e n s e p r i m e r , * 5 ' 3 ' A n t i s e n s e p r i m e r , * 5 ' > 3 ' S i z e , b p C p o s i t i o n tp 1 6 - W t CAGAGGGTGGGGCGGACCGC CGGGCCGCGGCCGTGG 1 4 0 6 5 + 1 7 1p16-M TTATTAGAGGGTGGGGCGGATCGC GACCCCGAACCGCGACCGTAA 1 5 0 6 5 +167p 1 6 - U TTATTAGAGGGTGGGGTGGATTGT CAAC C C C AAAC C AC AAC C ATAA 1 5 1 6 0 +167p 1 6 - M 2 TTATTAGAGGGTGGGGCGGATCGC CCA CCTAAATCGACCTCCGA CCG 2 3 4 6 5 + 1 6 7p 1 6 - U 2 TTATTAGAGGGTGGGGTGGATTGT CCA CCTAAATCAA CCTCCA A CCA 2 3 4 6 0 +167p15-W C GC A C C C TGC GGC C AGA AGTGGC C GAGC GGC C GG 1 3 7 6 5 +46p l S - M GC GTTC GTATTTTGC GGTT C GTAC AATAA C C GA A C GA C C GA 1 4 8 6 0 +4 0p 1 5 - U TGTGA TGTGTTTGTA TTTTGTGGTT C CA TA CA ATA AC CA AA CA AC CA A 1 5 4 6 0 + 3 4VHL-M TGGAGGATTTTTTTGCGTACGC GAACCGAA CGCCGCGAA 1 5 8 6 0 -116VHL-U GTTGGAGGATTTTTTTGTGTATGT C C C A A A C C A A A C A C C A C A A A 1 6 5 6 0 - 1 1 8Ecad-M TTAGGTTAGAGGGTTATCGCGT TAACTAAAAATTC AC C TAC CG AC 1 1 6 5 7 - 2 0 5E c a d - U TAATTTTAGGTTAGAGGGTTATTGT C AC AAC C AATC AAC AAC AC A 9 7 5 3 -210* S e q u e n c e d i f f e r e n c e s b e t w e e n m o d i f i e d p r i m e r s a n d u n m o d i f i e d DNA a r e i n b o l d f a c e t y p e a n d d i f f e r e n c e s b e t w e e n m e t h y l a t e d / m o d i f i e d a n du m m e t h y l a t e d / m o d i f i e d a r e u n d e r l i n e d .t P r i m e r s w e r e p l a c e d n e a r t h e t r a n s c r i p t i o n a l s t a r t s i t e . G e n o m i c p o s i t i o n i s t h e l o c a t i o n o f t h e 5 ' n u c l e o t i d e o f t h e s e n s e p r i m e r i n r e l a t i o n t ot h e m a j o r t r a n s c r i p t i o n a l s t a r t s i t e d e f i n e d i n t h e f o l l o w i n g r e f e r e n c e s a n d G e n b a n k a c c e s s i o n n u m b e r s : p 1 6 ( m o s t 3 ' s i t e ) , X 9 4 1 5 4 ( 2 0 ) ; p l S , S 7 5 7 5 6( 2 2 ) ; V H L , U 1 9 7 6 3 ( 2 3 ) ; a n d E - c a d h e r i n , L 3 4 5 4 5 ( 2 4 ) .* W r e p r e s e n t s u n m o d i f i e d o r w i l d - t y p e p r i m e r s . M , m e t h y l a t e d - s p e c i f i c p r i m e r s ; a n d U , u n m e t h y l a t e d - s p e c i f i c p r i m e r s .

P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 9 3 ( 1 9 9 6 )

8/3/2019 Methyl at Ion Specific Pcr a Novel Pcr Assay for Methyl at Ion

3/6

P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 9 3 ( 1 9 9 6 ) 9 8 2 3H157

.....

H 2 4 9G A T C

: 4 8 8 :

p#:s w w R a s sR_i10!:

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4 1 w 4 ~

F I G . 1 . Genomic s e q u e n c i n g o f p 1 6 . The sequence s h o w n h a s t h emost 5 ' r e g i o n a t t h e b o t t o m o f t he g e l , b e g i n n i n g a t + 1 7 5 i n r e l a t i o nt o a m a j o r t r a n s c r i p t i o n a l s t a r t s i t e ( 2 0 ) . A l l c y t o s i n e s i n t h e u n m e t h y -l a t e d c e l l l i n e H249 h a v e b e e n c o n v e r t e d t o t h y m i d i n e , w h i l e a l l C s i nC pG d i n u c l e o t i d e s i n t h e m e t h y l a t e d c e l l H1 5 7 r e m a i n as C , i n d i c a t i n gm e t h y l a t i o n . D e s i g n a t e d b y t h e b r a c k e t ( ] ) i s a B s t U I s i t e , w h i c h i s a t-5 9 i n r e l a t i o n t o t h e t r a n s l a t i o n a l s t a r t s i t e i n GenBank sequenceU12818 ( 2 1 ) , b u t w h i c h i s i n c o r r e c t l y i d e n t i f i e d as CGAG i n sequenceX 9 4 1 5 4 ( 2 0 ) . T h i s CGCG s i t e r e p r e s e n t s t h e 3 ' l o c a t i o n o f t h e sensep r i m e r u s e d f o r p 1 6 MSP.s t r a t e g y f o r s p e c i f i c a m p l i f i c a t i o n o f e i t h e r m e t h y l a t e d oru n m e t h y l a t e d a l l e l e s was f e a s i b l e .P r i m e r D e s i g n f o r MSP. P r i m e r s w e r e d e s i g n e d t o d i s c r i m -i n a t e b e t w e e n m e t h y l a t e d a n d u n m e t h y l a t e d a l l e l e s f o l l o w i n gb i s u l f i t e t r e a t m e n t a n d t o d i s c r i m i n a t e b e t w e e n DNA m o d i f i e db y b i s u l f i t e a n d t h a t w h i c h h a d n o t b e e n m o d i f i e d . To a c c o m -p l i s h t h i s , p r i m e r sequences w e r e c h o s e n f o r r e g i o n s c o n t a i n -i n g f r e q u e n t c y t o s i n e s ( t o d i s t i n g u i s h u n m o d i f i e d f r o m mod-i f i e d DNA), a n d C pG p a i r s near t h e 3 ' e n d o f t h e p r i m e r s ( t op r o v i d e m a x i m a l d i s c r i m i n a t i o n i n t h e PCR b e t w e e n m e t h y l -a t e d a n d u n m e t h y l a t e d DNA). S i n c e t h e tw o s t r a n d s o f DNAar e no l o n g e r c o m p l e m e n t a r y a f t e r b i s u l f i t e t r e a t m e n t , p r i m -ers can b e d e s i g n e d f o r e i t h e r m o d i f i e d s t r a n d . F o r conve-n i e n c e , we h a v e d e s i g n e d p r i me r s f o r t h e sense s t r a n d . Thef r a g m e n t o f DNA t o b e a m p l i f i e d was i n t e n t i o n a l l y s m a l l , t oa l l o w t h e a s s e s s m e n t o f m e t h y l a t i o n p a t t e r n s i n a l i m i t e dr e g i o n a n d t o f a c i l i t a t e t h e a p p l i c a t i o n o f t h i s t e c h n i q u e t os a m p l e s , s u c h as p a r a f f i n b l o c k s , where a m p l i f i c a t i o n o f l a r g e rf r a g m e n t s i s n o t p o s s i b l e . I n T a b l e 1 , p r i m e r sequences ar es h o w n f o r a l l genes t e s t e d , e m p h a s i z i n g t h e d i f f e re nc e s i nsequence b e t w e e n t h e t h r e e t y p e s o f DNA t h a t are e x p l o i t e df o r t h e s p e c i f i c i t y o f M SP . Th e m u l t i p l e m i s m a t c h e s i n t h e s e

p r i m e r s , w h i c h a r e s p e c i f i c f o r t h e s e d i f f e r e n t t y p e s o f DNA,s u g g e s t t h a t e a c h p r i me r s e t s h o u l d p r o v i d e a m p l i f i c a t i o n o n l yf r o m t h e i n t e n d e d t e m p l a t e .MSP A n a l y s i s o f p 1 6 . We f i r s t t e s t e d t h e p r i me rs d e si g ne df o r p 1 6 o n DNA f r o m c a n c e r c e l l l i n e s a n d n o r m a l t i s s u e s f o rw h i c h t h e m e t h y l a t i o n s t a t u s h a d p r e v i o u s l y b e e n d e f i n e d b yS o u t h e r n a n a l y s i s ( 1 0 , 2 5 ) . I n a l l c a s e s , t h e p r i m e r s e t u s e dc o n f i r m e d t h e m e t h y l a t i o n s t a t u s d e t e r m i n e d b y S o u t h e r na n a l y s i s . F o r e x a m p l e , l u n g c a n c e r c e l l l i n e s U 1 7 5 2 a n d H 1 5 7 ,a s w e l l a s o t h e r c e l l l i n e s w i t h m e t h y l a t e d p l 6 a l l e l e s , a m p l i f i e do n l y w i t h t h e m e t h y l a t e d p r i m e r s ( F i g . 2 A ) . DNA f r o m n o r m a lt i s s u e s ( l y m p h o c y t e s , l u n g , k i d n e y , b r e a s t , a n d c o l o n ) a n d t h el u n g c a n c e r c e l l l i n e s H209 a n d H 2 4 9 , h a v i n g o n l y u n m e t h y -l a t e d p 1 6 a l l e l e s , a m p l i f i e d o n l y w i t h u n m e t h y l a t e d p r i m e r s( e x a m p l e s i n F i g . 2 A ) . P C R w i t h t h e s e p r i m e r s c o u l d b ep e r f o r m e d w i t h o r w i t h o u t 5% d i m e t h y l s u l f o x i d e . DNA n o tt r e a t e d w i t h b i s u l f i t e ( u n m o d i f i e d ) f a i l e d t o a m p l i f y w i t h e i t h e rs e t o f m e t h y l a t e d o r u n m e t h y l a t e d s p e c i f i c p r i m e r s , b u t r e a d i l ya m p l i f i e d w i t h p r i m e r s s p e c i f i c f o r t h e s e q u e n c e b e f o r e m o d -i f i c a t i o n ( F i g . 2 A ) . DNA f r o m t h e c e l l l i n e H157 a f t e r b i s u l f i t et r e a t m e n t a l s o p r o d u c e d a w e a k a m p l i f i c a t i o n w i t h u n m o d i f i e dp r i m e r s , s u g g e s t i n g a n i n c o m p l e t e b i s u l f i t e r e a c t i o n . We h a v eo c c a s i o n a l l y o b s e r v e d t h i s i n o t h e r s a m p l e s . H o w e v e r , t h i su n m o d i f i e d DNA, u n l i k e p a r t i a l l y r e s t r i c t e d DNA i n p r e v i o u sP C R a s s a y s r e l y i n g o n m e t h y l a t i o n - s e n s i t i v e r e s t r i c t i o n e n -z y m e s , i s n o t r e c o g n i z e d b y t h e p r i m e r s s p e c i f i c f o r m o d i f i e dDNA. I t t h e r e f o r e d o e s n o t p r o v i d e a f a l s e p o s i t i v e r e s u l t o ri n t e r f e r e w i t h t h e a b i l i t y t o d i s t i n g u i s h m e t h y l a t e d f r o m u n -m e t h y l a t e d a l l e l e s .We n e x t s o u g h t t o d e f i n e t h e s e n s i t i v i t y o f M S P f o r d e t e c t i o no f m e t h y l a t e d p l 6 a l l e l e s . DNA f r o m c e l l l i n e s w i t h m e t h y l a t e dp 1 6 a l l e l e s w a s m i x e d w i t h DNA w i t h u n m e t h y l a t e d p l 6 a l l e l e sb e f o r e b i s u l f i t e t r e a t m e n t . We c o u l d c o n s i s t e n t l y d e t e c t 0 . 1 %o f m e t h y l a t e d DNA ( " 5 0 p g ) p r e s e n t i n a n o t h e r w i s e u n -m e t h y l a t e d s a m p l e ( F i g . 2 B ) . We h a v e a l s o d e t e r m i n e d t h es e n s i t i v i t y l i m i t f o r t h e amount o f i n p u t DNA. A s l i t t l e a s 1 n go f human DNA, m i x e d w i t h s a l m o n s p e r m DNA a s a c a r r i e r ,w a s d e t e c t a b l e b y M S P ( d a t a n o t s h o w n ) .F r e s h human t u m o r s a m p l e s o f t e n c o n t a i n n o r m a l a n dt u m o r t i s s u e , m a k i n g t h e d e t ec t i o n o f c h a n g e s s p e c i f i c f o r t h et u m o r d i f f i c u l t . H o w e v e r , t h e s e n s i t i v i t y o f M SP s u g g e s t s i tw o u l d b e u s e f u l f o r p r i m a r y t u m o r s a s w e l l , a l l o w i n g f o rd e t e c t i o n o f a b e r r a n t l y m e t h y l a t e d a l l e l e s e v e n i f t h e y c o n -t r i b u t e r e l a t i v e l y l i t t l e t o t h e o v e r a l l DNA i n a s a m p l e . I n e a c hc a s e , w h i l e n o r m a l t i s s u e s ( l y m p h o c y t e s , l u n g , k i d n e y , a n dc o l o n ) w e r e u n m e t h y l a t e d a t t h e p l 6 l o c u s , t u m o r s f o u n d t o b em e t h y l a t e d a t t h e p 1 6 CpG i s l a n d b y S o u t h e r n a n a l y s i s a l s oc o n t a i n e d m e t h y l a t e d DNA d e t e c t e d b y M S P , i n a d d i t i o n t osome u n m e t h y l a t e d a l l e l e s ( e x a m p l e s i n F i g . 2 B ) . A n a l y s i s o fDNA f r o m p a r a f f i n - e m b e d d e d t u m o r s r e v e a l e d m e t h y l a t e da n d u n m e t h y l a t e d a l l e l e s ( e x a m p l e i n F i g . 2 B ) , a s s h o w n f o r t h esame p r i m a r y l u n g c a n c e r i n F i g . 2 B . To c o n f i r m t h a t t h e s er e s u l t s w e r e n o t u n i q u e t o t h i s p r i m e r s e t , w e u s e d a s e c o n dd o w n s t r e a m p r i m e r f o r p l 6 t h a t w o u l d a m p l i f y a s l i g h t l y l a r g e rf r a g m e n t ( T a b l e 1 ) . T h i s s e c o n d s e t o f p r i m e r s r e p r o d u c e d t h er e s u l t s d e s c r i b e d a b o v e ( F i g . 2 C ) , c o n f i r m i n g t h e m e t h y l a t i o ns t a t u s d e f i n e d b y S o u t h e r n b l o t a n a l y s i s .To v e r i f y f u r t h e r t h e s p e c i f i c i t y o f t h e p r i m e r s f o r t h em e t h y l a t e d a l l e l e s a n d t o c h e c k s p e c i f i c c y t o s i n e s f o r m e t h y l -a t i o n w i t h i n t h e r e g i o n a m p l i f i e d , w e t o o k a d v a n t a g e o f t h ed i f f e r e n c e s i n s e q u e n c e a t a m e t h y l a t i o n - s e n s i t i v e r e s t r i c t i o ns i t e b e t w e e n m e t h y l a t e d / m o d i f i e d DNA a n d u n m e t h y l a t e d /m o d i f i e d DNA. S p e c i f i c a l l y , t h e B s t U I r e c o g n i t i o n s i t e ,CGCG, w i l l r e m a i n CGCG i f b o t h C s a r e m e t h y l a t e d a f t e rb i s u l f i t e t r e a t m e n t a n d a m p l i f i c a t i o n b u t w i l l b e c o m e TGTGi f u n m e t h y l a t e d . D i g e s t i o n o f t h e a m p l i f i e d p r o d u c t s w i t hB s t U I w i l l t h e n d i s t i n g u i s h t h e s e tw o p r o d u c t s , a s r e s t r i c t i o n o fp 1 6 a m p l i f i e d p r o d u c t s i l l u s t r a t e s . O n l y u n m o d i f i e d p r o d u c t sa n d m e t h y l a t e d / m o d i f i e d p r o d u c t s , b o t h o f w h i c h r e t a i n t h e

M e d i c a l S c i e n c e s : Herman e t a l .

8/3/2019 Methyl at Ion Specific Pcr a Novel Pcr Assay for Methyl at Ion

4/6

9 8 2 4 M e d i c a l S c i e n c e s : Herman e t a l .A U n t r e a t e d N o r m n a l

U l 1 7 5 2 H157 D N A l y m p h o c y t e s* l JLu

M W t JUMMWL J M W U U M M W

B10 l U l n i g N o r m t a l

1 1 0 0 1 500 1 1 0 0 0 cancer I l u n g* W M U M 1 PAm M Am I M

F i x e d 1 0I j i l i g canicer

I I f A

H209 H249Li U M M W L l J M M W

P r i m a r yD H 2 ? 4 9 i S 1 ? 5 7 l t n i g c a n c e - rU t L M M Li U J M MB s t U l : * - + + - + +

C H249 H I 5 7 c a n i c e r E* t L M L J M Li M

1 1 2 0 9 1 2 4 9 H 1 5 ? L J 1 /52* U M L J M U M Li M

4 0 4 b p3 0 7 b p _2 4 0 b p

F I G . 2 . M SP o f p 1 6 . P r i m e r s e t s u s e d f o r a m p l i f i c a t i o n ar e d e s i g n a t e d as u n m e t h y l a t e d ( U ) , m e th y l a t ed ( M ) , o r u n m o d i f i e d / w i l d - t y p e ( W ) . * ,M o l e c u l a r w e i g h t m a r k e r p B R 3 2 2 - M s p I d i g e s t . ( A ) A m p l i f i c a t i o n o f b i s u l f i t e - t r e a t e d DNA f r o m cancer c e l l l i n e s a n d n o r m a l l y m p h o c y t e s , a n du n t r e a t e d DNA ( f r o m c e l l l i n e H 2 4 9 ) . ( B ) M i x i n g o f v a r i o u s amounts o f H157 DNA w i t h 1 , u g o f H249 DNA b e f o r e b i s u l f i t e t r e a t m e n t t o assesst h e d e t e c t i o n s e n s i t i v i t y o f M S P f o r m e t h y l a t e d a l l e l e s . M o d i f i e d DNA f r o m a p r i m a r y l u n g cancer s a m p l e , n o r m a l l u n g , a n d t h e p a r a f f i n - e m b e d d e d( f i x e d ) t i s s u e b l o c k o f t h i s p r i m a r y l u n g cancer ar e a l s o s h o w n . ( C ) A m p l i f i c a t i o n w i t h t h e p 1 6 - U 2 ( U ) p r i m e r s , a n d p 1 6 - M 2 ( M ) d e s c r i b e d i n T a b l e1 . ( D ) T h e a m p l i f i e d p 1 6 p r o d u c t s o f C w e r e r e s t r i c t e d w i t h B s t UI ( +) o r we re n o t r e s t r i c t e d ( - ) . ( E ) T e s t i n g f o r r e g i o n a l m e t h y l a t i o n o f C pGi s l a n d s w i t h M S P , u s i n g sense p r i m e r s p 1 6 - U 2 ( U ) a n d p 1 6 - M 2 ( M ) , w h i c h ar e m e t h y l a t i o n - s p e c i f i c , a n d a n a n t i s e n s e p r i m e r t h a t i s n o tm e t h y l a t i o n - s p e c i f i c .CGCG s i t e , ar e c l e a v e d b y B s t U I . P r o d u c t s a m p l i f i e d w i t hu n m e t h y l a t e d / m o d i f i e d p r i m e r s f a i l e d t o b e c l e a v e d ( F i g . 2 D ) .T h e p r i m e r s e t s d i s c u s s e d a b o v e we re d e s i g n e d t o d i s c r i m -i n a t e h e a v i l y m e t h y l a t e d C pG i s l a n d s f r o m u n m e t h y l a t e da l l e l e s . To d o t h i s , b o t h t h e upper ( s e n s e ) a n d l o w e r ( a n t i s e n s e )p r i m e r s c o n t a i n e d C pG s i t e s t h a t c o u l d p r o d u c e m e t h y l a t i o n -d e p e n d e n t sequence d i f f e r e n c e s a f t e r b i s u l f i t e t r e a t m e n t . M S Pm i g h t b e e m p l o y e d t o e x a m i n e more r e g i o n a l a s p e c t s o f C pGi s l a n d m e t h y l a t i o n . To e x a m i n e t h i s , we t e s t e d w h e t h e r m e t h y l -a t i o n - d e p e n d e n t d i f f e r e n c e s i n t h e sequence o f j u s t o ne p r i m e rw o u l d s t i l l a l l o w t he d i sc r i m i na t io n b e t w e e n u n m e t h y l a t e d a n dm e t h y l a t e d p l 6 a l l e l e s . T h e a n t i s e n s e p r i m e r u s e d f o r g e n o m i cs e q u e n c i n g , 5'-CTACCTAATTCCAATTCCCCTACA, wasu s e d a s t h e a n t i s e n s e p r i m e r , w h i c h c o n t a i n s no C pG s i t e s , a n dwas p a i r e d w i t h e i t h e r a m e t h y l a t e d o r u n m e t h y l a t e d sensep r i m e r ( T a b l e 1 ) . A m p l i f i c a t i o n o f t h e p r e d i c t e d 3 1 3 - b p P C Rp r o d u c t o n l y o c c u r re d w i t h t h e u n m e t h y l a t e d sense p r i m e r i nH209 a n d H249 ( u n m e t h y l a t e d b y S o u t h e r n ) a n d o n l y w i t h t h em e t h y l a t e d sense p r i m e r i n H157 a n d U 1 7 5 2 ( m e t h y l a t e d b yS o u t h e r n ) , i n d i c a t i n g t h a t m e t h y l a t i o n o f C pG s i t e s w i t h i n ad e f i n e d r e g i o n can b e r e c o g n i z e d b y s p e c i f i c p r i m e r s a n d d i s t i n -g u i s h b e t w e e n m e t h y l a t e d a n d u n m e t h y l a t e d a l l e l e s ( F i g . 2 E ) .The U s e o f MSP f o r t h e A n a l y s i s o f O t h e r G e n e s . Wee x t e n d e d o u r s t u d y t o i n c l ud e t h re e o t h e r genes t r a n s c r i p t i o n -a l l y s i l e n c e d i n human cancers b y a b e r r a n t h y p e r m e t h y l a t i o no f 5 ' C pG i s l a n d s . The c y c l i n - d e p e n d e n t k i n a s e i n h i b i t o r p15i s a b e r r a n t l y m e t h y l a t e d i n many l e u k e m i c c e l l l i n e s a n dp r i m a r y l e u k e m i a s ( 1 1 ) . F o r p15, M S P a g a i n v e r i f i e d t h em e t h y l a t i o n s t a t u s d e t e r m i n e d b y S o u t h e r n a n a l y s i s . T h u s ,n o r m a l l y m p h o c y t e s a n d cancer c e l l l i n e s SW48 a n d U 1 7 5 2 ,c o n t a i n i n g o n l y u n m e t h y l a t e d a l l e l e s o f p 1 5 a l l e l e s b y S o u t h e r na n a l y s i s ( 1 1 ) , a m p l i f i e d o n l y w i t h t h e u n m e t h y l a t e d s e t o fp r i m e r s , w h i l e t h e l u n g cancer c e l l l i n e H1618 a n d l e u k e m i ac e l l l i n e KG1A a m p l i f i e d o n l y w i t h t h e m e t h y l a t e d s e t o fp r i m e r s ( F i g . 3 A ) , c o n s i s t e n t w i t h p r e v i o u s S o u t h e r n a n a l y s i s

r e s u l t s ( 1 1 ) . DNA f r o m t h e c e l l l i n e R a j i p r o d u c e d a s t r o n gP C R p r o d u c t w i t h m e t h y l a t e d p r i m e r s a n d a w e a k e r b a n d w i t hu n m e t h y l a t e d p r i m e r s . T h i s was t h e same r e s u l t f o r m e t h y l -a t i o n o b t a i n e d p r e v i o u s l y b y S o u t h e r n a n a l y s i s ( 1 1 ) . N o n c u l -t u r e d l e u k e m i a s a m p l e s , l i k e t h e p r i m a r y tumors s t u d i e d f o rp 1 6 , h a d a m p l i f i c a t i o n w i t h t h e m e t h y l a t e d p r i m e r s e t a s w e l las t h e u n m e t h y l a t e d s e t . T h i s h e t e r o g e n e i t y a l s o m a t c h e dS o u t h e r n a n a l y s i s ( 1 1 ) . A g a i n , as f o r p l 6 , d i f f e r e n t i a l m o d i f i -c a t i o n o f B s t U I r e s t r i c t i o n s i t e s i n t h e a m p l i f i e d p r o d u c t o f p1 5w a s u s e d t o v e r i f y t h e s p e c i f i c a m p l i f i c a t i o n b y M S P ( F i g . 3 B ) .A m p l i f i e d p r o d u c t s u s i n g m e t h y l a t e d p r i m e r s e t s f r o m c e l ll i n e s H 1 6 1 8 a n d R a j i o r u n m o d i f i e d p r i m e r s e t s , w e r e com-p l e t e l y c l e a v e d b y B s t U I , w h i l e a m p l i f i e d p r o d u c t s f r o m t h eu n m e t h y l a t e d p r i m e r s e t d i d n o t c l e a v e . The s m a l l e r s i z e s o fp r o d u c t s o b s e r v e d i n t h e u n m o d i f i e d p r o d u c t r e f l e c t t h e 1 1 - b pd i f f e r e n c e i n s i z e o f t h e o r i g i n a l P C R p r o d u c t . P r i m a r y a c u t em y e l o g e n o u s l e u k e m i a s a m p l e s a l s o d e m o n s t r a t e d c l e a v a g eo n l y i n t h e m e th y l a t ed p r o d u c t b u t h a d l e s s c o m p l e t e c l e a v a g e .T h i s s u g g e s t s a h e t e r o g e n e i t y i n m e t h y l a t i o n , w h e r e m e t h y l -a t i o n i s e x t e n s i v e i n t h e r e g i o n u n d e r l y i n g t h e m e t h y l a t i o n -s p e c i f i c p r i m e r s , a l l o w i n g a m p l i f i c a t i o n b y M S P b u t i s n o ti n c l u s i v e o f a l l C pG s i t e s b e t w e e n t h e p r i m e r s f o r e a c h a l l e l e .A b e r r a n t C pG i s l a n d p r o m o t e r r e g i o n m e t h y l a t i o n i s asso-c i a t e d w i t h i n a c t i v a t i o n o f t h e vo n H i p p e l - L i n d a u ( V H L )tumor suppressor gene i n "20% o f c l e a r c e l l r e n a l c a r c i n o m a s( 9 ) . T h i s e v e n t , l i k e m u t a t i o n s f o r VH L ( 3 0 ) , i s r e s t r i c t e d t oc l e a r c e l l r e n a l cancers ( 9 ) . P r i m e r s d e s i g n e d f o r t h e VH Lsequence w e r e u s e d t o s t u d y DNA f r o m t h e r en a l c e l l cancerc e l l l i n e R F X 3 9 3 , w h i c h i s m e t h y l a t e d a t VE L b y S o u t h e r na n a l y s i s ( d a t a n o t s h o w n ) , a n d DNA f r o m t h e l u n g cancer c e l ll i n e U 1 7 5 2 , w h i c h i s u n m e t h y l a t e d a t t h i s l o c u s ( 9 ) . I n e a c hc a s e , t h e m e t h y l a t i o n s t a t u s o f VH L d e t e r m i n e d b y M S Pc o n f i r m e d t h a t f o u n d b y S o u t h e r n a n a l y s i s ( F i g . 3 C ) , a n dB s t U I r e s t r i c t i o n s i t e a n a l y s i s v a l i d a t e d t h e P C R p r o d u c ts p e c i f i c i t y ( F i g . 3 D ) .

1 D Obpl 4 7 b p

P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 9 3 ( 1 9 9 6 )

8/3/2019 Methyl at Ion Specific Pcr a Novel Pcr Assay for Methyl at Ion

5/6

P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 9 3 ( 1 9 9 6 ) 9 8 2 5p1 5 C

H1618 R a l i KG1A AML1 AML2 AML3 SW48 U 1 7 5 2U M U M U M U M U M U M U M U M

1 G O b p \1 4 7 b p /

p1 5U n i t r e a t e dSW48 U1752 H 16 18 R a l p DNA A M L 1

U U U U MMMMWWM AML2 A AU lV+ + 1 G O b p \

_ l 1 4 7 b p /

RFX3 9 3UM

E - c a d h e r i nMCF1 T47D MDA231 H s 5 7 8 t PC-3 l N CaP

** U M U M U M U M U M U MD u J P r o TSUPrIUM U M

F I G . 3 . M S P a n a l y s i s o f s e v e r a l genes. P r i m e r s e t s u s e d f o r a m p l i f i c a t i o n ar e d e s i g n a t e d as u n m e t h y l a t e d ( U ) , m et hy l a te d ( M ) , oru n m o d i f i e d / w i l d - t y p e ( W ) . * , M o l e c u l a r w e i g h t m a r k e r p B R 3 2 2 - M s p I d i g e s t ; a n d * * , 1 2 3 - b p m o l e c u l a r w e i g h t m a r k e r . A l l DNA s a m p l e s wereb i s u l f i t e - t r e a t e d e x c e p t t h o s e d e s i g n a t e d u n t r e a t e d . ( A ) M S P f o r p 1 5 . ( B ) The p15 p r o d u c t s w e r e r e s t r i c t e d w i t h B s t U I ( + ) o r w ere n o t r e s t r i c t e d( - ) . ( C ) M S P f o r VHL. ( D ) The VH L p r o d u c t s were r e s t r i c t e d w i t h B s t U I ( + ) o r were n o t r e s t r i c t e d ( - ) . The s m a l l e r m o l e c u l a r w e i g h t f r a g m en t sseen i n t h e U l a n e s r e p r e s e n t p r i m e r d i m e r s , w h i c h ar e p r e s e n t i n l a n e s w i t h o u t t e m p l a t e DNA a n d can b e f a i n t l y seen i n C . ( E ) M S P f o r E - c a d h e r i n .

The e x p r e s s i o n o f t h e i n v a s i o n / m e t a s t a s i s suppressor gene,E - c a d h e r i n , i s o f t e n s i l e n c e d b y a b e r r a n t m e t h y l a t i o n o f t h e 5 'p r o m o t e r i n b r e a s t , p r o s t a t e , a n d many o t h e r c a r c i n o m a s ( 1 2 ,3 1 ) . We d e s i gn e d p r i m e rs f o r t h e E - c a d h e r i n promoter r e g i o nt o t e s t t h e use o f M S P f o r t h i s gene. I n e a c h c a s e , M S P a n a l y s i sp a r a l l e l e d S o u t h e r n b l o t a n a l y s i s f o r t h e m e t h y l a t i o n s t a t u s o ft h e gene ( 1 2 ) . DNA from b r e a s t cancer c e l l l i n e s MDA-MB-2 3 1 , H S 5 7 8 t , a n d p r o s t a t e cancer c e l l l i n e s D u P r o , a n dT S U P r l , a l l h e a v i l y m e t h y l a t e d b y S o u t h e r n b l o t , d i s p l a y e dp r o m i n e n t m e t h y l a t i o n . DNA f r o m MCF7, T 4 7 D , P C - 3 , a n dLNCaP, a l l u n m e t h y l a t e d b y S o u t h e r n , s h o w e d no e v i d e n c e f o rm e t h y l a t i o n i n t h e s e n s i t i v e M S P assay ( F i g . 3 E ) . M S P a n a l y s i sr e v e a l e d t h e presence o f u n m e t h y l a t e d a l l e l e s i n H s 5 7 8 t ,T S U P r l , a n d D u P r o , c o n s i s t e n t w i t h a l o w p e r c e n t a g e o f un-m e t h y l a t e d a l l e l e s i n t h e s e c e l l l i n e s p r e v i o u s l y d e t e c t e d b yS o u t h e r n a n a l y s i s ( 1 2 ) . B s t U I r e s t r i c t i o n a n a l y s i s a g a i n c o n f i r m e dt h e s p e c i f i c i t y o f t h e PCR a m p l i f i c a t i o n ( d a t a n o t s h o w n ) .

DISCUSSIONWe h a v e d e s c r i b e d a n o v e l PCR a p p r o a c h , MSP, f o r r a p i da n a l y s i s o f t h e m e t h y l a t i o n s t a t u s o f C pG i s l a n d s . As i l l u s -t r a t e d , t h i s t e c h n i q u e p r o v i d e s s i g n i f i c a n t a d v a n t a g e s overp r e v i o u s P C R - b a s e d t e c h n i q u e s a n d o t h e r m e t h o d s u s e d f o ra s s a y i n g m e t h y l a t i o n . M S P i s m a r k e d l y more s e n s i t i v e t h a nS o u t h e r n a n a l y s i s , f a c i l i t a t i n g d e t e c t i o n o f l o w numbers o fm e t h y l a t e d a l l e l e s a n d t h e s t u d y o f DNA f r o m s m a l l s a m p l e s .MSP a l l o w s t h e s t u d y o f p a r a f f i n - e m b e d d e d m a t e r i a l s , w h i c h

c o u l d n o t p r e v i o u s l y b e a n a l y z e d b y S o u t h e r n a n a l y s i s . M S Pa l s o a l l o w s e x a m i n a t i o n o f a l l C pG s i t e s , n o t j u s t t h o s e w i t h i nsequences r e c o g n i z e d b y m e t h y l a t i o n - s e n s i t i v e r e s t r i c t i o n en -zymes. T h i s m a r k e d l y i n c r e a s e s t h e number o f s u c h s i t e s t h a tca n b e a s s e s s e d a n d w i l l a l l o w r a p i d , f i n e m a p p i n g o f m e t h y l -a t i o n p a t t e r n s t h r o u g h o u t C p G - r i c h r e g i o n s . T h i s l a t t e r p o i n twas d e m o n s t r a t e d f o r p 1 6 , w h e r e t h e d i s c r i m i n a t i o n b e t w e e nm e t h y l a t e d a n d u n m e t h y l a t e d a l l e l e s c o u l d b e a t t r i b u t e d t od i f f e r e n c e s i n m e t h y l a t i o n i n a n 8 - b p r e g i o n . M S P a l s o e l i m -i n a t e s t h e f r e q u e n t f a l s e p o s i t i v e r e s u l t s d u e t o p a r t i a l d i g e s t i o no f m e t h y l a t i o n - s e n s i t i v e enzymes i n h e r e n t i n p r e v i o u s P C Rm e t h o d s f o r d e t e c t i n g m e t h y l a t i o n . F u r t h e r m o r e , w i t h MSP,s i m u l t a n e o u s d e t e c t i o n o f u n m e t h y l a t e d a n d m e t h y l a t e d p r o d -u c t s i n a s i n g l e s a m p l e c o n f i r m s t h e i n t e g r i t y o f DNA as at e m p l a t e f o r PCR a n d a l l o w s a s e m i q u a n t i t a t i v e a s s e s s m e n t o fa l l e l e t y p e s t h a t a p p r o x i m a t e s t h e q u a n t i t a t i o n d e t e r m i n e d b yS o u t h e r n a n a l y s i s . F i n a l l y , t h e a b i l i t y t o v a l i d a t e t h e a m p l i f i e dp r o d u c t b y d i f f e r e n t i a l r e s t r i c t i o n p a t t e r n s i s a n a d d i t i o n a la d v a n t a g e .The o n l y t e c h n i q u e t h a t can p r o v i d e more d i r e c t a n a l y s i st h a n M S P f o r most C pG s i t e s w i t h i n a d e f i n e d r e g i o n i sg e n o m i c s e q u e n c i n g . H o w e v e r , MSP can p r o v i d e s i m i l a r i n -f o r m a t i o n a n d h a s t h e f o l l o w in g a d va n t a g es . F i r s t , MSP i smuch s i m p l e r a n d r e q u i r e s l e s s t i m e t h a n g e n o m i c s e q u e n c i n g ,w i t h a t y p i c a l P C R a n d g e l a n a l y s i s t a k i n g 4-6 h r . I n c o n t r a s t ,f o r g e n o m i c s e q u e n c i n g , a m p l i f i c a t i o n , c l o n i n g , a n d s u b s e -q u e n t s e q u e n c i n g may t a k e d a y s . S e c o n d , M S P a v o i d s t h e us eo f e x p e n s i v e s e q u e n c i n g r e a g e n t s a n d t h e use o f r a d i o a c t i v i t y .

A VHLU r n l r e a t e ( dU 1 7 5 2 DN AU M U M1 G O b p

1 4 7 b p ]

BB s t U l :

1 G O b P \1 4 7 b p '

E1 2 3 b p -

VH LD RFX393 U1752

M M U UB s t U 1 : * - + - +

M e d i c a l S c i e n c e s : Herman e t a l .

8/3/2019 Methyl at Ion Specific Pcr a Novel Pcr Assay for Methyl at Ion

6/6

9 8 2 6 M e d i c a l S c i e n c e s : Herman e t a l .B o t h o f t h e s e f a c t o r s m a k e M S P b e t t e r s u i t e d f o r t h e a n a l y s i so f l a r g e n u m b e r s o f s a m p l e s . T h i r d , t h e u s e o f P C R a s t h e s t e pt o d i s t i n g u i s h m e t h y l a t e d f r o m u n m e t h y l a t e d DNA i n M S Pa l l o w s f o r a s i g n i f i c a n t i n c r e a s e i n t h e s e n s i t i v i t y o f m e t h y l a t i o nd e t e c t i o n . F o r e x a m p l e , i f c l o n i n g i s n o t u s e d b e f o r e g e n o m i cs e q u e n c i n g o f t h e DNA,