8/8/2019 MBK 1 ders6

http://slidepdf.com/reader/full/mbk-1-ders6 1/29

MOLEKÜLER B YOLOJ DMOLEKÜLER B YOLOJ DKULLANILAN YÖNTEMLEKULLANILAN YÖNTEMLE

DERS 6DERS 6

Prof. Dr. ule ARIProf. Dr. ule ARIMoleküler Biyoloji ve GenetikMoleküler Biyoloji ve Genetik

BölümüBölümü20052005--20062006

8/8/2019 MBK 1 ders6

http://slidepdf.com/reader/full/mbk-1-ders6 2/29

DNA ÇO ALTILMASIDNA ÇO ALTILMASIIn vitroIn vitro DNA ço alt lmas ;DNA ço alt lmas ;

ilgilenilen bir DNA parças n n (genin) ilgilenilen bir DNA parças n n (genin) bol mikt arda elde si,bol mikt arda elde si,bu DNA n n analizibu DNA n n analizi

genetik mühendi sli i genetik mühendi sli i çal malar için gereklidirçal malar için gereklidir

8/8/2019 MBK 1 ders6

http://slidepdf.com/reader/full/mbk-1-ders6 3/29

Do al hücre ço almasDo al hücre ço almasREPL KASYONREPL KASYON

Hücre bölünmesi s ras nda DNA

Hücre bölünmesi s ras nda DNAmikt ar n n 2 kat na ç kmasmikt ar n n 2 kat na ç kmas

Jener asyonlar boyunca DNA mikt ar n n Jener asyonlar boyunca DNA mikt ar n n ba lang cagöre üssel art ba lang cagöre üssel art 30 jener asyon sonunda milyar kat art 30 jener asyon sonunda milyar kat art

8/8/2019 MBK 1 ders6

http://slidepdf.com/reader/full/mbk-1-ders6 4/29

REPL KASYONREPL KASYON

8/8/2019 MBK 1 ders6

http://slidepdf.com/reader/full/mbk-1-ders6 5/29

In vitroIn vitro DNA ço alt lmasDNA ço alt lmas

1. Rekombinant DNAtekn olojisiRekombinant DNAtekn olojisi70 li y llarda geli en tekn oloji70 li y llarda geli en tekn oloji

2.2. PCRPCR, , PPolymerase olymerase CChain hain RReaction, eaction, PZRPZR, , PPolimeraz olimeraz ZZincir incir RReaksiyonueaksiyonu

80 li y llarda geli en tekn oloji80 li y llarda geli en tekn oloji

8/8/2019 MBK 1 ders6

http://slidepdf.com/reader/full/mbk-1-ders6 6/29

In vitroIn vitro DNA ço alt lmasDNA ço alt lmasRekombi n ant Rekombi n ant

DNAt

ekno

lo

jisiDNAt

ekno

lo

jisi

gen klonlamasgen klonlamas

8/8/2019 MBK 1 ders6

http://slidepdf.com/reader/full/mbk-1-ders6 7/29

PCRPCRPCRPCR istenilen bir DNA parças n n istenilen bir DNA parças n n

replikasyon sürecinin t aklit edilmesiyle replikasyon sürecinin t aklit edilmesiyle birkaç saatte milyar kat n n birkaç saatte milyar kat n n kopyalanmas d rkopyalanmas d r

PCRPCR belli bir DNA parças n n primerlerin belli bir DNA parças n n primerlerin yönlendir mesiyle enzimatik olarak yönlendir mesiyle enzimatik olarak sentezlen mesini sa layan sentezlen mesini sa layan in v itroin v itro bir bir yönte mdiryönte mdir

8/8/2019 MBK 1 ders6

http://slidepdf.com/reader/full/mbk-1-ders6 8/29

PCRPCRPCR , 1986PCR , 1986 CetusCetus

PCR n muciti Kary Mullis, 1993 dePCR n muciti Kary Mullis, 1993 deNobel Ödülü nü al rken .Nobel Ödülü nü al rken .

8/8/2019 MBK 1 ders6

http://slidepdf.com/reader/full/mbk-1-ders6 9/29

PCRPCRKULLANIM ALANLARI:KULLANIM ALANLARI:1.1. Temel moleküler biyolojikTemel moleküler biyolojik

çal malarçal malarK lonlamaK lonlamaDizi analiziDizi analizi

DNA harit alamasDNA harit alamas

8/8/2019 MBK 1 ders6

http://slidepdf.com/reader/full/mbk-1-ders6 10/29

PCRPCRKULLANIM ALANLARI:KULLANIM ALANLARI:2.2. T pta hastal k tan sT pta hastal k tan s

genetik hast al klar (orak hücre ane misi, genetik hast al klar (orak hücre ane misi, kistik f ibroz, f ragile X , lösemi vb.)kistik f ibroz, f ragile X , lösemi vb.)inf ektif hast al klar (AIDS, t überküloz, vb.)inf ektif hast al klar (AIDS, t überküloz, vb.)pren at al t anpren at al t an

8/8/2019 MBK 1 ders6

http://slidepdf.com/reader/full/mbk-1-ders6 11/29

PCRPCRKULLANIM ALANLARI:KULLANIM ALANLARI:3.3. T pta allelik dizi varyasyonlar n nT pta allelik dizi varyasyonlar n nbelirlenmesibelirlenmesi

organ transplant asyonu için uygun doku tipinin organ transplant asyonu için uygun doku tipinin belirlenmesibelirlenmesiadli örneklerin genetik tiplendirilmesiadli örneklerin genetik tiplendirilmesi(anal k(anal k--babal k te sti)babal k te sti)hast al klar n genetik te melinin ara t r lmashast al klar n genetik te melinin ara t r lmasmut asyon t aramasmut asyon t aramas

8/8/2019 MBK 1 ders6

http://slidepdf.com/reader/full/mbk-1-ders6 12/29

PCRPCRKULLANIM ALANLARI:KULLANIM ALANLARI:4.4. Tar m & Hayvanc l kTar m & Hayvanc l k

Verim,dayan kl l k vb. t ar msal özelliklerce Verim,dayan kl l k vb. t ar msal özelliklerce elit tiplerin seçimi elit tiplerin seçimi

8/8/2019 MBK 1 ders6

http://slidepdf.com/reader/full/mbk-1-ders6 13/29

PCRPCRKULLANIM ALANLARI:KULLANIM ALANLARI:5.5. Sistematik & EvolusyonSistematik & Evolusyon

Tür t an s, t ürler aras akrabal k ili kilerinin Tür t an s, t ürler aras akrabal k ili kilerinin belirlenmesi, t ürlerin kökenlerinin belirlenmesi, t ürlerin kökenlerinin ara t r lmasara t r lmas

8/8/2019 MBK 1 ders6

http://slidepdf.com/reader/full/mbk-1-ders6 14/29

PCRPCRTANIMLAR:TANIMLAR:Replikasyonun Replikasyonun in v itroin v itro olarak olarak

ge r çekle t ir ilmesige r çekle t ir ilmesi

Özgün bir DNA par ças n n milyar larcaÖzgün bir DNA par ças n n milyar larcakopyas n n pr imer lerce yönlendi r iler ek kopyas n n pr imer lerce yönlendi r iler ek in in v itrov itro ko ulda enzimat ik sen t eziko ulda enzimat ik sen t ezi

8/8/2019 MBK 1 ders6

http://slidepdf.com/reader/full/mbk-1-ders6 15/29

PCRPCRBir dizi sentez reaksiyonu içerir, buBir dizi sentez reaksiyonu içerir, bunedenle nedenle ppolimeraz olimeraz zzincirincir (zincirleme)(zincirleme)rreaksiyonu ad n al r.eaksiyonu ad n al r.Reaksiyon iki primerin hede f DNAReaksiyon iki primerin hede f DNAbölgesinde ba land klar diziler aras ndabölgesinde ba land klar diziler aras ndav e ter most abil DNA polimeraz enzimi v e ter most abil DNA polimeraz enzimi t araf ndan kat alizleme esas na dayan rt araf ndan kat alizleme esas na dayan r

8/8/2019 MBK 1 ders6

http://slidepdf.com/reader/full/mbk-1-ders6 16/29

PCRPCR1 PCR DÖNGÜSÜ1 PCR DÖNGÜSÜ

11 -- Den at ürasyonDen at ürasyon22-- Primerin ba lanmas (anne aling)Primerin ba lanmas (anne aling)

33-- Uzama (sentez)Uzama (sentez)a amalar ndan olu ura amalar ndan olu ur

8/8/2019 MBK 1 ders6

http://slidepdf.com/reader/full/mbk-1-ders6 17/29

PCRPCR11 -- Den at ürasyon:Den at ürasyon:

Ço alt lacak DNA parças n n yüksek Ço alt lacak DNA parças n n yüksek s cakl kt a iki ipli inin birbirinden s cakl kt a iki ipli inin birbirinden ayr lmasayr lmasTek iplikli DNA lar n olu umuTek iplikli DNA lar n olu umu9292--9595ooCC

8/8/2019 MBK 1 ders6

http://slidepdf.com/reader/full/mbk-1-ders6 18/29

PCRPCR22-- Primerin ba lanmas (anne aling):Primerin ba lanmas (anne aling):

Den at ürasyondan sonra s cakl k Den at ürasyondan sonra s cakl k dü ürülür v e primerlerin tek iplikli dü ürülür v e primerlerin tek iplikli DNA da kendilerine özgün dizilere DNA da kendilerine özgün dizilere ba lanmas sa lan rba lanmas sa lan r

5555--6060ooCC

8/8/2019 MBK 1 ders6

http://slidepdf.com/reader/full/mbk-1-ders6 19/29

PCRPCR33-- Uzama (sentez) :Uzama (sentez) :

Termost abil DNA polimerez primerlere Termost abil DNA polimerez primerlere ba lan r v e 3 uçlar na kal ba uygun ba lan r v e 3 uçlar na kal ba uygun nükleotidleri ekleyerek DNA sentezi nükleotidleri ekleyerek DNA sentezi yaparyapar

7272ooCC

8/8/2019 MBK 1 ders6

http://slidepdf.com/reader/full/mbk-1-ders6 20/29

PCRPCRSentez üsseldir Sentez üsseldir 22nn

ÖR: 30döngü sonunda 2ÖR: 30döngü sonunda 23030 kat DNAkat DNAart olurart olur40 döngüden fazlas isten mez40 döngüden fazlas isten mez

30 döngüden sonra isten meyen ürün art 30 döngüden sonra isten meyen ürün art

olurolurEnzim mikt ar k stlan r Enzim mikt ar k stlan r H ede f dizi art ile primerler rekabet ederH ede f dizi art ile primerler rekabet eder

8/8/2019 MBK 1 ders6

http://slidepdf.com/reader/full/mbk-1-ders6 21/29

PCR B LE ENLERPCR B LE ENLER11-- Kal p DNA:Kal p DNA:ço alt lmak istenen diziyi içeren ço alt lmak istenen diziyi içeren

DNADNAH er çe it organizmaya ait kromozomal v e H er çe it organizmaya ait kromozomal v e ekstrakromozomal DNAekstrakromozomal DNAGen omik DNAkit apl klarGen omik DNAkit apl klarRNARNAcDNAcDNAH

erhangi bir biyolojik mater yale ait DNA örne i H

erhangi bir biyolojik mater yale ait DNA örne i

8/8/2019 MBK 1 ders6

http://slidepdf.com/reader/full/mbk-1-ders6 22/29

PCR B LE ENLERPCR B LE ENLER22-- Primer molekül:Primer molekül: ço alt lmak istenen ço alt lmak istenen

bölgenin s n r dizilerine t amamlay ctek bölgenin s n r dizilerine t amamlay ctek iplikli k sa DNA parçalariplikli k sa DNA parçalar

20 ya da daha aza nükleotidden olu urlar20 ya da daha aza nükleotidden olu urlarBilgisayarlar ile t asarlan rlarBilgisayarlar ile t asarlan rlar

Ticari olarak elde edilirlerTicari olarak elde edilirler

8/8/2019 MBK 1 ders6

http://slidepdf.com/reader/full/mbk-1-ders6 23/29

PCR B LE ENLERPCR B LE ENLER33-- DNA polimerazlar:DNA polimerazlar: Termost abil özellikteTermost abil özellikte

Önceleri Önceleri E.coliE .coli DNA polimaraz I K lenow DNA polimaraz I K lenow f ragmenti kullan ldf ragmenti kullan ldThermus aquaticusThermus aquaticus Taq DNA polimerazTaq DNA polimeraz7070--8080o o C da aktif , saniyede 37C da aktif , saniyede 37--1 00 nükleotid 1 00 nükleotid eklerekler

Günümüzde reko mbinant DNA polimerazlar Günümüzde reko mbinant DNA polimerazlar da (AmliT aq , Pfu polimeraz, Vent vb.) da (AmliT aq , Pfu polimeraz, Vent vb.) kullan lmakt akullan lmakt a

8/8/2019 MBK 1 ders6

http://slidepdf.com/reader/full/mbk-1-ders6 24/29

PCR B LE ENLERPCR B LE ENLER44-- Deoksinükleotid trifosfatlarDeoksinükleotid trifosfatlar

(dNTP ler) :DNA yapt a lar(dNTP ler) :DNA yapt a lar Yüksek saf l kt a v e ticari olarak elde edilirler Yüksek saf l kt a v e ticari olarak elde edilirler Ayr ayr yada kar m halinde bulunurlar Ayr ayr yada kar m halinde bulunurlar Genellikle 1 00Genellikle 1 00QQ l lik konsantr asyondal lik konsantr asyondakullan l rlarkullan l rlarKonsantr asyonlar döngü say sna, gen Konsantr asyonlar döngü say sna, gen boyut una, MgClboyut una, MgCl22 konsantr asyonuna v e konsantr asyonuna v e primer mikt ar na ba l d r.primer mikt ar na ba l d r.

8/8/2019 MBK 1 ders6

http://slidepdf.com/reader/full/mbk-1-ders6 25/29

PCR B LE ENLERPCR B LE ENLER55 -- MgClMgCl22 MgClMgCl22 v e t ampon:v e t ampon: Tamponda genellikle TrisTamponda genellikle Tris--

H Cl, KCl, MgClH Cl, KCl, MgCl22 bulunur. Kullan lan enzime göre bulunur. Kullan lan enzime göre t ampon içeri i de i ebilir.t ampon içeri i de i ebilir.

MgMg+ 2+ 2 iyonu dNTP lerle geri dönü ümlü kompleksler olu t urur, iyonu dNTP lerle geri dönü ümlü kompleksler olu t urur, koenzim olarak enzim aktivitesini uyar rkoenzim olarak enzim aktivitesini uyar rDNA n n Tm de erini art r rDNA n n Tm de erini art r rGenellikle 05Genellikle 05 --5 mMkullan l rlar; fazl l spesif ik olmayan ürün 5 mMkullan l rlar; fazl l spesif ik olmayan ürün art ile yeter sizli i verim dü üklü üne neden olurart ile yeter sizli i verim dü üklü üne neden olur

MgMg+ 2+ 2

konsantr asyonu optimize edilmelidirkonsantr asyonu optimize edilmelidir

8/8/2019 MBK 1 ders6

http://slidepdf.com/reader/full/mbk-1-ders6 26/29

8/8/2019 MBK 1 ders6

http://slidepdf.com/reader/full/mbk-1-ders6 27/29

8/8/2019 MBK 1 ders6

http://slidepdf.com/reader/full/mbk-1-ders6 28/29

8/8/2019 MBK 1 ders6

http://slidepdf.com/reader/full/mbk-1-ders6 29/29

PCR ÇE TLERPCR ÇE TLER Anchored (demirlenmi ) PCR: Anchored (demirlenmi ) PCR: ço alt lacak DNA n n sade ce ço alt lacak DNA n n sade ce bir bölgesinin dizi bilgisi oldu undabir bölgesinin dizi bilgisi oldu undaNested (yuvalanm ) PCR:Nested (yuvalanm ) PCR: özgün olmayan dizilerin özgün olmayan dizilerin ço alt lmas n engelle mek içinço alt lmas n engelle mek içinInverse (ters) PCR:Inverse (ters) PCR: bilinen bir diziden yararlanarak bu dizinin bilinen bir diziden yararlanarak bu dizinin iki ucundaki bilinmeyen bölgenin ço alt lmas ndaiki ucundaki bilinmeyen bölgenin ço alt lmas ndaIn situIn situ PCR:PCR: hücre,d oku organdaki DNA n n ço alt lmas ndahücre,d oku organdaki DNA n n ço alt lmas ndaMultiplex (çoklu) PCR:Multiplex (çoklu) PCR: birden fazla bölgenin ayn andabirden fazla bölgenin ayn andaço alt lmas ndaço alt lmas ndaRevers (geri) PCRRevers (geri) PCR RT PCR:RT PCR:RNA dan DNAço alt lmas ndaRNA dan DNAço alt lmas nda