8/8/2019 MBK 1 ders7

1/22

MOLEKLER BYOLOJDEMOLEKLER BYOLOJDEKULLANILAN YNTEMLER IKULLANILAN YNTEMLER I

DERS 7DERS 7

Prof. Dr. ule ARIProf. Dr. ule ARIMolekler Biyoloji ve GenetikMolekler Biyoloji ve Genetik

BlmBlm

20052005--20062006

8/8/2019 MBK 1 ders7

2/22

DNA POLMORFZMNNDNA POLMORFZMNNMOLEKLERMOLEKLER

MARKERLARLA ANALZMARKERLARLA ANALZ

8/8/2019 MBK 1 ders7

3/22

DNA PolimorfizmininDNA Polimorfizminin

tanmlanmastanmlanmasBireyler arasndaki genetik farkllklarnBireyler arasndaki genetik farkllklarn

belirlenmesini salarbelirlenmesini salarPolimorfizm saptanmasnda moleklerPolimorfizm saptanmasnda molekler

yntemlerinyntemlerinMORFOLOJKMORFOLOJKBYOKMASAL vb. yntemlere stnlkleri:BYOKMASAL vb. yntemlere stnlkleri:KESNKESN sonusonu (DNA dzeyinde)(DNA dzeyinde) vermeleridirvermeleridir

8/8/2019 MBK 1 ders7

4/22

Bireyler aras genetik tiplendirmeBireyler aras genetik tiplendirmeHastalk tansHastalk tans

Kiiye zg ila gelitirilmesiKiiye zg ila gelitirilmesiAdli tanAdli tanTarmsal nemli genlerin saptanmasTarmsal nemli genlerin saptanmas

Saf rklarn belirlenmesiSaf rklarn belirlenmesiMikroorganizma tiplerinin belirlenmesiMikroorganizma tiplerinin belirlenmesi--

biyoteknolojik rklarn saptanmasbiyoteknolojik rklarn saptanmas

8/8/2019 MBK 1 ders7

5/22

RAPDRAPDRasgele oaltlm Polimorfik DNAlarRasgele oaltlm Polimorfik DNAlar

((RRandomandomAAmplifiedmplified PPolymophicolymophic DDNAs)NAs)

Dizisi rasgeleDizisi rasgele olan primerlerle yaplanolan primerlerle yaplanPCR sonucu genomda rasgele blgelerinPCR sonucu genomda rasgele blgelerin

oaltlmasoaltlmas

8/8/2019 MBK 1 ders7

6/22

RAPDRAPDPRMERLERPRMERLER%GC oran %50den fazla%GC oran %50den fazla

Tek eitTek eitXXgen oaltmnda iki eitgen oaltmnda iki eit Ksa (yaklak 10 bazlk) primerlerKsa (yaklak 10 bazlk) primerlerANNEALING SICAKLIIANNEALING SICAKLII 35 gibi dk dereceler35 gibi dk dereceler XXgen oaltmndagen oaltmnda

daha yksekdaha yksekRNLERRNLER eitli tipte (RAPDLER=RAPD Markerlar)eitli tipte (RAPDLER=RAPD Markerlar) XX

gen oaltmnda genin kendisi (tek eit)gen oaltmnda genin kendisi (tek eit)

8/8/2019 MBK 1 ders7

7/22

RAPDRAPDRAPD markerlarRAPD markerlarharitalamaharitalamagenetik tiplendirmegenetik tiplendirmeamalar iin kullanlramalar iin kullanlr

8/8/2019 MBK 1 ders7

8/22

RAPDRAPDBakteriden insana kadar her eit organizmadaBakteriden insana kadar her eit organizmada 1010

nkleotidlik rasgele primerlerin balanaca birbirinenkleotidlik rasgele primerlerin balanaca birbirineters konumlu yeterince blgeters konumlu yeterince blge vardrvardr

Birka bin baz ifti mesafe ile balanan primerlerBirka bin baz ifti mesafe ile balanan primerlerarasnda amplifikasyon olurarasnda amplifikasyon olur

Bireylerin nkleotid dizilimleri farkl olduu iin oluanBireylerin nkleotid dizilimleri farkl olduu iin oluan

bantlarda fakl olurbantlarda fakl olur

Bantlar jel elektroforezi ile analiz edilirBantlar jel elektroforezi ile analiz edilir ((RFLPRFLPmarkerlarndaki radyoaktiviteye gereksinim yokturmarkerlarndaki radyoaktiviteye gereksinim yoktur))

8/8/2019 MBK 1 ders7

9/22

RAPD MarkerlarRAPD Markerlar

8/8/2019 MBK 1 ders7

10/22

Rasgele primerler kullanarakRasgele primerler kullanarak

iki genomun RAPD analiziiki genomun RAPD analizi

8/8/2019 MBK 1 ders7

11/22

DNA Parmakizi Analizinde PCRDNA Parmakizi Analizinde PCR

kullanmkullanm Dizisi bilinmeyen DNA paralar oaltlrDizisi bilinmeyen DNA paralar oaltlr Miktar 1ng olan DNA rnekler kullanlabilir, izoleMiktar 1ng olan DNA rnekler kullanlabilir, izole

edilebiliredilebilirR:R:Kan lekesi, sa teli, sperm kalnts vb.Kan lekesi, sa teli, sperm kalnts vb.

Ksa (10 nkl.) primerler insan genomunda dankKsa (10 nkl.) primerler insan genomunda dankolarak birka bin blgeye balanrolarak birka bin blgeye balanr(2000 nkl. uzaklkta balanan primerler aras oaltlr)(2000 nkl. uzaklkta balanan primerler aras oaltlr)

Minr dizi farkllklar nedeniyle oalan blgeler arasMinr dizi farkllklar nedeniyle oalan blgeler aras

farklar oluurfarklar oluur Elektroforezdeki bant motifleri (konum ve say)Elektroforezdeki bant motifleri (konum ve say)

DNA PARMAKZDNA PARMAKZ olarak adlandrlrolarak adlandrlrSONU:SONU: Populasyondaki bireylerin birbirlerinden ayrt edilmesiPopulasyondaki bireylerin birbirlerinden ayrt edilmesi

8/8/2019 MBK 1 ders7

12/22

DNA ParmakiziDNA ParmakiziADL TIPTAK UYGULAMALARADL TIPTAK UYGULAMALARMinisatellitler (Minisatellitler (VNTRVNTRVVariableariable NNumber ofumber ofTTandemandem

RRepeats) oaltlrepeats) oaltlr Tekrar saylar kiiden kiiye deiirTekrar saylar kiiden kiiye deiirArd arda tekrarlanrlarArd arda tekrarlanrlar nsan genomunda dank olarak bulunurlarnsan genomunda dank olarak bulunurlar Bir lokustaki tekrar saylar deiiktirBir lokustaki tekrar saylar deiiktir

Her bir varyasyon bir VNTR allelidirHer bir varyasyon bir VNTR allelidir polimorfizmpolimorfizm 22--100 nkleotid uzunlukta olabilirler100 nkleotid uzunlukta olabilirlerR:R: GGGAAGGGAAGGGAAGGGAAGGGAAGGGAAGGGAAGGGAA

ll ll ll

8/8/2019 MBK 1 ders7

13/22

DNA parmakizi ile akrabalk tayiniDNA parmakizi ile akrabalk tayini

M=markerM=marker

1,5=ebeveyn1,5=ebeveyn2,3,4,6= ocuklar2,3,4,6= ocuklar

8/8/2019 MBK 1 ders7

14/22

RFLPRFLPRFLPRFLPRestriksiyon Para Uzunluu PolimorfizmiRestriksiyon Para Uzunluu PolimorfizmiRRestrictionestriction FFragmentragmentLLenghtenght

PPolymorphismolymorphism

RESTRKSYON ENZMLERNNRESTRKSYON ENZMLERNN kullanm ilekullanm ileoluturulan DNA markerlaroluturulan DNA markerlar

8/8/2019 MBK 1 ders7

15/22

RRestriksiyonestriksiyon EEndonkleazlarndonkleazlar

((REREler)ler) ift iplikli DNAda zgn ve ksa dizileri tanyp, kesenift iplikli DNAda zgn ve ksa dizileri tanyp, kesen

enzimlerenzimler Mikroorganizma kkenliMikroorganizma kkenli yabancyabanc

DNAnn yok edilmesi iin retilirlerDNAnn yok edilmesi iin retilirler

KefedilmeleriKefedilmeleri Rekombinant DNARekombinant DNA almalarnalmalarnbalatmtrbalatmtr

Genellikle retildikleri mikroorganizmann isimleri ileGenellikle retildikleri mikroorganizmann isimleri ileanlrlaranlrlar

R:R: EE.coli.colinin rettiinin rettii EcoEcoR IR I Tanma blgesinde kesim yapanTanma blgesinde kesim yapan Tip IITip II enzimlerienzimleri

44--6b uzunluundaki blgeleri tanr6b uzunluundaki blgeleri tanr

8/8/2019 MBK 1 ders7

16/22

EcoEcoRI KesimiRI Kesimi

G

AATTCCTTAAG

GAATTCCTTAAG

G AATTC

G

C

CTTAACTTAA

AATTC

G

8/8/2019 MBK 1 ders7

17/22

RElerin Kesim FrekanslarRElerin Kesim Frekanslarr:r: 6 blik6 blik tanma blgesine sahip bir REtanma blgesine sahip bir REHerHer 4466=4096=4096bde bir kesim yapabilirbde bir kesim yapabilir Pratikte fragment boyutlar 1Pratikte fragment boyutlar 1--20.00020.000Ayn boyuttaki dizileri tanyan RElerin kesimAyn boyuttaki dizileri tanyan RElerin kesim

frekanslar farkl olabilirfrekanslar farkl olabilirr:r: DraDra I (TTTAAA) domates DNAsn,I (TTTAAA) domates DNAsn, SstSst II(GAGCTC)den daha sk keser(GAGCTC)den daha sk keser

RE kesimlerinden sonra ok sayda DNA fragmentiRE kesimlerinden sonra ok sayda DNA fragmentioluur (binlerce)oluur (binlerce)

Aranlan DNAAranlan DNAjel elektroforezijel elektroforezi veve SouthernSouthernhibridizasyonlahibridizasyonla bulunurbulunur

8/8/2019 MBK 1 ders7

18/22

RAPD/RFLPRAPD/RFLPRAPDRAPDPrimerin tanma blgelerininPrimerin tanma blgelerinin

toplam uzunluu 18toplam uzunluu 18--2020nkleotidnkleotid

5 bant5 bantoluumu ile sonulananoluumu ile sonulananbirbir PCRde 90PCRde 90--100 nkleotid100 nkleotidtaranrtaranr

Bantlarn analizi iinBantlarn analizi iinradyoaktivite (Southernradyoaktivite (SouthernBlotting) gerekmezBlotting) gerekmez

Uygulama basitUygulama basitGerekli DNA miktar azGerekli DNA miktar az

RFLPRFLPRElerin tand kesim blgeleriRElerin tand kesim blgeleri

toplam uzunluu 12toplam uzunluu 12nkleotidnkleotid

5 bant5 bantoluumu ile sonulananoluumu ile sonulananbir kesimdebir kesimde 60 nkleotid60 nkleotidtaranrtaranr

Bantlarn analizi iinBantlarn analizi iinradyoaktivite (Southernradyoaktivite (SouthernBlotting) gerekirBlotting) gerekir

Uygulama zorUygulama zorGerekli DNA miktar daha fazlaGerekli DNA miktar daha fazla

RAPD, polimorfizm taranmas iin daha kullanldr

8/8/2019 MBK 1 ders7

19/22

Molekler Markerlarn TptaMolekler Markerlarn Tpta

KullanmKullanmPolimorfizm saptanmasPolimorfizm saptanmasHastalk tansHastalk tansMutasyon taramasMutasyon taramasHastala eilim belirlenmesiHastala eilim belirlenmesi

Doum ncesi tanDoum ncesi tanAdli tpAdli tpKiiye zg ila tasarmKiiye zg ila tasarm

8/8/2019 MBK 1 ders7

20/22

Molekler markerlarla tansMolekler markerlarla tans

yaplabilen hastalklaryaplabilen hastalklar Kanser trleri (meme kanseri BRCA 1 ve 2 genleri, p53 tmorKanser trleri (meme kanseri BRCA 1 ve 2 genleri, p53 tmor

supressor geni)supressor geni) Tromboz (faktr V, protrombin mutasyonlar)Tromboz (faktr V, protrombin mutasyonlar) FF--tallasemitallasemi Orak hcre anemisi (Orak hcre anemisi (FF--globin geni)globin geni) Homosistein metabolizmas bozukluklarHomosistein metabolizmas bozukluklar AlzheimerAlzheimer Koroner kalp hastalklar (apolipoprotein E ve B genleri, hepatikKoroner kalp hastalklar (apolipoprotein E ve B genleri, hepatik

lipaz)lipaz)

Miyokard infarktsMiyokard infarkts nme (nme (FF--fibrinojen)fibrinojen) Kistik fibroz (CFTR)Kistik fibroz (CFTR)

8/8/2019 MBK 1 ders7

21/22

RFLP markeri ile hastalk tansRFLP markeri ile hastalk tans

8/8/2019 MBK 1 ders7

22/22

Orak hcre anemisinin moleklerOrak hcre anemisinin molekler

tanstans

S/S: mutant homozigot,ksa mr

A/S: tayc, ekstremkoullarda hastalk

Hemoglobin F zinciri