Master rad - pmf.ni.ac.rs · Eksperimentalni deo ovog master rada rađen je u Laboratoriji za...

Univerzitet u Nišu

Prirodno-matematički fakultet

Departman za hemiju

Master rad

Konformaciona analiza odabranih fenhil-estara

Mentor

Prof. dr Polina Blagojević

Kandidat

Marko Pešić

Niš, 2015. god.

Eksperimentalni deo ovog master rada rađen je u Laboratoriji za organsku

analizu i sintezu (Departman za hemiju, Prirodno-matematički Fakultet,

Univerzitet u Nišu).

Zahvaljujem se svom mentoru dr Polini Blagojević na interesovanju i strpljenju

koje je pokazala, na vremenu koje je posvetila, kao i na ukazanoj pomoći.

Zahvaljujem se svim istraživačima iz Laboratorije za organsku analizu i sintezu

na njihovim sugestijama prilikom izrade ovog rada.

Na kraju, veliku zahvalnost dugujem i svojim prijateljima i porodici koji su bili

podrška, oslonac i motivacija svih ovih godina.

Sadržaj

1. Uvod 1

2. Opšti deo 4

2.1. endo-Fenhol i srodna jedinjenja .................................................................................................................. 5

2.2. Šteglihova (Steglich) esterifikacija .............................................................................................................. 8

2.3. 1H iterativna potpuna spinska analiza (HiFSA) i molekulsko modelovanje ................................................ 9

3. Eksperimentalni deo 11

3.1. Hemikalije ................................................................................................................................................. 12

3.2. Metode analize .......................................................................................................................................... 12

3.2.1. Nuklearno-magnetna rezonantna (NMR) spektroskopija ................................................................... 12

3.2.2. Gasna hromatografija – masena spektrometrija (GC/MS) ................................................................. 13

3.2.3. Dry flash hromatografija .................................................................................................................... 13

3.2.4. Hromatografija na tankom sloju (TLC) ............................................................................................. 13

3.3. Sinteza (Šteglihova esterifikacija) i prečišćavanje endo-fenhil-estara ...................................................... 14

3.4. Molekulsko modelovanje .......................................................................................................................... 15

3.5. 1H NMR iterativna potpuna spinska analiza (HiFSA) ............................................................................... 16

4. Rezultati i diskusija 17

4.1. Sinteza estara endo-fenhola i njihova GC/MS analiza .............................................................................. 18

4.2. Molekulsko modelovanje .......................................................................................................................... 23

4.3. NMR analiza .............................................................................................................................................. 27

4.3.1. Potpuna spinska analiza 1H NMR spektara (HiFSA) jedinjenja 1-3 ..................................................... 31

5. Zaključak 38

6. Literatura 40

Skraćenice

Nomenklatura

CH3 ili Me Metil-grupa

CH2 Metilenska grupa

CH Metinska grupa

COOH Karboksilna funkcionalna grupa

Et Etil-grupa

OCOR Estarska funkcionalna grupa

R Alkil-grupa

Reagensi i rastvarači

CDCl3 Deuterohloroform

CH2Cl2 Dihlormetan

DCC N,N’-dicikloheksilkarbodiimid

DCU Dicikloheksilurea

DMAP 4-(dimetilamino)piridin

Et2O Dietil-etar

EtOAc Etil-acetat

EtOH Etanol

Instrumenti i metode razdvajanja

1D Jednodimenzionalni

2D Dvodimenzionalni

1H NMR Protonic Nuclear Magnetic Resonance

(Protonska Nuklearna Magnetna Rezonanca)

13C NMR C-13 Nuclear Magnetic Resonance (Nuklearna

Magnetna Rezonanca ugljenika 13C)

δ Hemijsko pomeranje u NMR spektrima

bs Široki singlet

COSY Correlation Spectroscopy

d Dublet

dd Dublet dubleta

ddd Dublet dubleta dubleta

ddt Dublet dubleta tripleta

FID Free Induction Decay

GC/MS Gas Chromatography/Mass Spectrometry

gDQCOSY Gradient-enhanced Double Quantum Filtered

Correlation Spectroscopy

gHMQC Gradient-enhanced Heteronuclear Multiple-

bond Correlation Spectroscopy

HMBC Heteronuclear Multiple-bond Correlation

Spectroscopy

HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence

J Konstanta kuplovanja

m Multiplet

NOESY Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy

pdq Pseudo dublet kvarteta

ptt Pseudo triplet tripleta

q Kvartet

qq Kvartet kvarteta

RI Retention Index (retencioni indeks)

Rt Retention Time (retenciono vreme)

s Singlet

t Triplet

td Triplet dubleta

tdd Triplet dubleta dubleta

TIC Total Ion Current

TLC Thin Layer Chromatography (tankoslojna

hromatografija)

TMS Tetrametilsilan

UV UltraViolet (Ultraljubičasto)

Ostalo

°C Celzijusov stepen

Å Angstrem

aq. Aqueous solution (vodeni rastvor)

CAS Chemical Abstract Service

DFT Density functional theory

et al. et alia (i drugi, i saradnici)

eq. equivalent (ekvivalent)

FEMA Flavor and Extract Manufacturers’ Association

g Gram

GIAO Gauge invariant atomic orbitals

GRAS Generally recognized as safe

h Čas

HiFSA 1H NMR Iterative Full Spin Analysis

Hz Herc

mg Miligram

MHz Megaherc

min Minut

mL Mililitar

mmol Milimol

ppm Parts per milion (milioniti deo)

R, S stereodeskriptori

1. Uvod

2

endo-Fenhol (rel-(1R,2R,4S)-1,3,3-trimetilbiciklo[2.2.1]heptan-2-ol, -fenhol, -

fenhil-alkohol) je monoterpenski alkohol kojeg biosintetiše veliki broj biljnih vrsta različitih

biljnih rodova/familija (npr. Alpinia (Zingiberaceae), Lavandula, Foeniculum, Sideratis

(Lamiaceae), Chaerophyllum (Apiaceae), Helichrysum (Asteraceae), Eucalyptus (Myrtaceae)

i dr.) (Benabdelkader, 2015; Croteau et al, 1988; Kumari et al., 2014). Ovo jedinjenje se zbog

svog prijatnog mirisa koristi u kozmetičkoj industriji (sastojak je šampona, krema, toaletnih

sapuna, sredstava za čišćenje). Procenjeno je da je njegova godišnja potrošnja u pomenute

svrhe od 10 do 100 tona (Bhatia, 2008). endo-Fenhol je od strane FEMA-e (Flavor and Extract

Manufacturers’ Association) uvršćen na listu takozvanih GRAS supstanci (GRAS–generally

recognized as safe), koje se smatraju bezbednim za humanu upotrebu. Iznenađujuće je što u

literaturi ima malo podataka vezanih za estre ovog alkohola, uprkos tome što i neki od njih (na

primer endo-fenhil-acetat) imaju sličnu primenu kao sam endo-fenhol. Na primer, SciFinder

pretraga CAS (Chemical Abstract Service) baze podataka (pretraga je vršena 13.10.2015.

godine) pokazala je da bi čak i estri endo-fenhola i nekih nižih karboksilnih kiselina (npr.

heksanske, tiglinske i senecio-kiseline) bili nova jedinjenja. Interesantno je da su estri

pomenutih kiselina i/ili nekih srodnih monoterpenola (npr. fragranil- i sabinil-estri i bornil-4-

metoksibenzoat) biološki aktivni, čak toksični (Radulović et al., 2015; Radulović et al., 2012;

Radulović et al., 2013). U tom smislu, utvrđivanje prisustva ovakvih jedinjenja u nekom

biljnom materijalu, pogotovo ukoliko se on koristi u medicinske svrhe, može biti od izuzetne

važnosti.

endo-Fenhol spada u red isparljivih biljnih metabolita i sastojak je etarskih ulja (iz

biljne droge se izoluje destilacijom pomoću vodene pare; tačka ključanja na atmosferskom

pritisku je 209,98 °C). Tako, gasna hromatografija sa masenom detekcijom (GC/MS)

predstavlja najpogodniju metodu za utvrđivanje prisustva endo-fenhola i njemu srodnih

jedinjenja u ekstraktima biljnog porekla. Nažalost, za mnoge estre endo-fenhola nema ni

literaturnih podataka za retencione indekse (RI), niti masenih spektara (MS). Slično je i sa

NMR podacima. endo-Fenhol i srodna jedinjenja su svakako prethodno bila proučavana

pomoću NMR spektroskopije. Međutim, većina studija je rađena sredinom prošlog veka, dakle

u vreme kada je NMR analiza bila još u povoju (Liu, 1975; Bohlmann et al., 1975; Baker i

Davis, 1968). Nije ni čudo što najčešće složeni 1H NMR spektri jedinjenja sa supstituisanim

biciklo[2.2.1]heptanskim skeletom nisu mogli biti u potpunosti interpretirani. Ovde poseban

problem predstavljaju spinski sistemi sa kuplovanjem višeg reda i preklopljeni signali. Pored

toga, za ovakve rigidne sisteme su karakteristična i daljinska kuplovanja (npr. W-kuplovanje),

koja dodatno usložnjavaju oblik signala. Na osnovu detaljne pretrage literature, čini se da

protonski spektar endo-fenhola i njegovih do sada poznatih estara nije u potpunosti asigniran i

nisu određene konstante kuplovanja.

Detaljna interpretacija 1H NMR spektara, kao i informacije koje se mogu dobiti iz 2D

NMR eksperimenata (npr. 1H-1H COSY, HMBC, HSQC, NOESY) mogli bi da daju uvid u to

koji od mogućih konformera endo-fenhil-estara dominira u rastvoru. Ovo bi, dalje, moglo biti

povezano sa njihovim (potencijalnim) organoleptičkim osobinama (npr. interakcija sa

olfaktornim receptorima) i moglo bi biti od koristi kod dizajna novih molekula sa željenim

svojstvima. Detaljna interpretacija 1H NMR spektara bi mogla biti ostvarena 1H NMR

iterativnom potpunom spinskom analizom (1H NMR Iterative Full Spin Analysis, HiFSA). Ovo

je novorazvijena metoda pomoću koje se iz kompleksnih i/ili preklopljenih 1H NMR signala

3

mogu "očitati" vrednosti za hemijska pomeranja i konstante kuplovanja (Napolitano, et al.,

2015; Napolitano et al., 2013; Napolitano et al., 2012a; Napolitano et al., 2012b; Dong et al.,

2012; Riihinen et al., 2013). DFT (density functional theory) molekulsko modelovanje (npr.

optimizacija geometrije, pretraga konformacionog prostora i predviđanje odgovarajućih

hemijskih pomeranja i konstanti kuplovanja) moglo bi značajno olakšati interpretaciju NMR

podataka i HiFSA analizu.

Šema 1-1. Ciljevi rada: sinteza odabranih endo-fenhil-estara, određivanje njihovih retencionih indeksa (RI),

snimanje masenih spektara (MS), kao i kompletna asignacija NMR podataka i konformaciona analiza,

i to pomoću 1D i 2D NMR analiza, DFT molekulskog modelovanja i HiFSA analize.

Imajući sve gore pomenuto na umu, za ciljeve ovog master rada postavljeno je sledeće

(šema 1-1):

a) sinteza endo-fenhil-estara odabranih karboksilnih kiselina (mravlje, sirćetne,

propanske, butanske, izobutanske, pentanske, 2-metilbutanske, heksanske, heptanske,

oktanske, tiglinske i benzoeve) primenom Steglich-ove procedure,

b) određivanje retencionih indeksa i snimanje masenih spektara sintetisanih jedinjenja

(GC/MS analiza),

c) DFT molekulsko modelovanje (optimizacija geometrije i pretraga konformacionog

prostora sintetisanih jedinjenja i predviđanje odgovarajućih hemijskih pomeranja i

konstanti kuplovanja za odabrane predstavnike),

d) 1D i 2D NMR karakterizacija sintetisanih jedinjenja,

e) potpuna iterativna spinska analiza (HiFSA) 1H NMR spektara endo-fenhola, endo-

fenhil-formijata i endo-fenhil-acetata,

f) poređenje rezultata eksperimentalnih i izračunatih vrednosti 1H NMR hemijskih

pomeranja i konstanti kuplovanja za endo-fenhol, endo-fenhil-formijat i endo-fenhil-

acetat, ne bi li se utvrdilo koji od mogućih konformera endo-fenhil-estara je

zastupljeniji u (hloroformskom) rastvoru.

4

2. Opšti deo

5

2.1. endo-Fenhol i srodna jedinjenja

Kao što je već pomenuto, endo-fenhol (1, šema 2-1) je relativno široko rasprostranjeni

biljni sekundarni metabolit koji ima primenu u kozmetičkoj industriji (Benabdelkader, 2015;

Croteau et al, 1988; Kumari et al., 2014; Bhatia, 2008). Rezultati Krotoa (Croteau) i saradnika

(1988), koji su se bavili biosintezom ovog jedinjenja kod biljne vrste Foeniculum vulgare Mill.,

pokazali su da je njegov prekursor geranil-pirofosfat, koji najpre izomerizuje u (3R)-linalil-

pirofosfat, iz kojeg nakon ciklizacije nastaje (4R)-α-terpinil-katjon; isti se dalje premešta u

(1R,5R)-pinil-katjon. Preuređivanjem (1R,5R)-pinil-katjona, praćenim vezivanjem molekula

vode, stereospecifično nastaje (1S,4R)-endo-fenhol (šema 2-2).

Šema 2-1. Sintetska šema sinteze endo-fenhil-estara (2-formijat, 3-acetat, 4-propanoat, 5-butanoat, 6-pentanoat,

7-heksanoat, 8-heptanoat, 9-oktanoat, 10-izobutanoat, 11-2-metilbutanoat, 12-tiglat i 13-benzoat) iz

endo-fenhola (1) Šteglihovom (Steglich) metodom (DCC = N,N'-dicikloheksilkarbodiimid, DMAP =

4-(dimetilamino)piridin) i strukture exo-fenhola (1a) i fenhona (14)

Pored endo-fenhola, u prirodi se javlja i njegov dijastereomer, exo-fenhol (1a; drugačija

stereohemija u položaju 3), ali je on izgleda daleko manje zastupljen. Naime, SciFinder

pretragom CAS baze podataka je nađeno 673 referenci za endo-fenhol i više nego duplo manje

za exo-fenhol (tabela 2-1). Pretraga je vršena korišćenjem opcije za hemijsku strukturu, i

razmatrani su samo rezultati sa odgovarajućom relativnom stereohemijom (chemical structre /

exact search / relative stereochemistry; pretraga vršena 13.10.2015. godine). Svakako, moguće

je da pretraga nije uključila neke od referenci u kojima se pominju ova jedinjenja, međutim,

njeni rezultati daju dobru sliku o tome koliko su dati podaci literaturno lako dostupni: ako i ima

radova koji nisu nađeni korišćenjem zadatih kriterijuma, koliko god da sadrže korisnih

podataka, najverovatnije bi promakli istraživaču. Pored toga, podaci sumirani u tabeli 2-1

ukazuju i na to koliko puta su ova jedinjenja (uspešno) identifikovana u nekom uzorku biljnog

porekla. Oni su i neka vrsta pokazatelja koliko su fenhil-alkoholi zastupljeni u biljnom svetu.

6

Šema 2-2. Pretpostavljeni stereohemijski model (Croteau et al, 1988) enzimski katalizovane ciklizacije geranil-

pirofosfata do (1S,4R)-endo-fenhola, preko (3R)-linalil-pirofosfata i (4R)-α-terpinil- i (1R, 5R)-pinil-

katjona (OPP = pirofosfat)

Tabela 2-1. Rezultati SciFinder pretrage CAS baze podataka za fenhol i odabrane fenhil-estrea

Jedinjenje Broj referenci Jedinjenje Broj referenci

endo-Fenhol 673 endo-Fenhil-pentanoat 2*

exo-Fenhol 317 exo-Fenhil-pentanoat 0

endo-Fenhil-formijat 3* endo-Fenhil-heksanoat 0

exo-Fenhil-formijat 0 exo-Fenhil-heksanoat 0

endo-Fenhil-acetat 292 endo-Fenhil-heptanoat 1

exo-Fenhil-acetat 17 exo-Fenhil-heptanoat 1

endo-Fenhil-propanoat 3* endo-Fenhil-oktanoat 1*

exo-Fenhil-propanoat 0 exo-Fenhil-oktanoat 0

endo-Fenhil-izobutanoat 3* endo-Fenhil-benzoat 6

exo-Fenhil-izobutanoat 0 exo-Fenhil-benzoat 0

endo-Fenhil-butanoat 3 endo-Fenhil-tiglat 0

exo-Fenhil-butanoat 1 exo-Fenhil-tiglat 0

endo-Fenhil-2-metilbutanoat 0 endo-Fenhil-angelat 0

exo-Fenhil-2-metilbutanoat 0 exo-Fenhil-angelat 0

endo-Fenhil-3-metilbutanoat 3* endo-Fenhil-senecioat 0

exo-Fenhil-3-metilbutanoat 0 exo-Fenhil-senecioat 0 aPretraga vršena 13.10.2015. god.; *Uzete su u obzir i strukture sa nedefnisanom stereohemijom

Sličnom pretragom je ustanovljeno da su estri fenhil-alkohola (izuzev endo-fenhil-

acetata) takođe veoma malo prethodno proučavani. Na primer, nađeno je samo 17 referenci

koje se tiču estara fenhil-alkohola (oba izomera) i C3-C8 zasićenih alifatičnih kiselina

normalnog ili račvastog niza; neke od ovih referenci su stare gotovo 100 godina (Kenyon i

Priston, 1925), a gotovo da nema onih koje se tiču sastava nekog uzorka biljnog porekla.

Pritom, ima veoma malo informacija koje se tiču retencionih indeksa ili masenih spektara za

ova jedinjenja.

7

Slika 2-1. Dva konformera endo-fenhil-acetata (zelena boja: konformer kod koga je C=O syn sa metilenskom

grupom mosta; crvena boja: konformer kod koga je C=O anti u odnosu na metilensku grupu mosta) dokovana u

model humanog OR1G1 olfaktornog receptora. Homologi model zasnovan je na eksperimentalnim 3D

strukturama nekoliko G-protein-kuplovanih receptora (Launay et al., 2012); molekulsko dokovanje (strukture

receptora i liganada nisu tretirane kao fleksibilne; u oba slučaja je korišćen isti random seed) je vršeno pomoću

programskog paketa AutoDock Vina (Trott i Olson, 2010), a vizualizacija rezultata pomoću PMV softvera

(Sanner, 1999). Iako su dokovana dva konformera istog molekula, nađeno je da su različite orijentacije energetski

najpovoljnije.

Kako je već pomenuto, ovi podaci su od velike važnosti za identifikaciju jedinjenja

ovog tipa. Na primer, pojedini estri uobičajenih monoterpenskih alkohola, trans-sabinola i

borneola, otkriveni su tek nedavno (Radulović et al., 2015; Radulović et al., 2013). Slično je i

sa estrima fragranola (monoterpenol retkog skeleta) (Radulović et al., 2012). Jedan od razloga

što ova biološki aktivna jedinjenja nisu ranije detektovana svakako je povezan sa činjenicom

da nije bilo prethodnh literaturnih podataka koji se tiču RI i MS, ili su oni bili pogrešni

(Radulović et al., 2012). U sva tri slučaja, tek je nakon sinteze estara i GC-koinjekcije sa

uzorcima odgovarajućih etarskih ulja mogao biti nedvosmisleno potvrđen njihov identitet.

Slično, postoji mogućnost da estri fenhola nisu toliko retki koliko deluje na osnovu pretraga

literatre. Oni jednostavno možda ranije nisu uspešno identifikovani. Ovo je bila glavna

motivacija za proučavanje estara fenhola, konkretno, estara endo-fenhola koji je zastupljeniji

izomer.

8

Fenhil-alkoholi sadrže rigidni trimetil-supstituisani biciklo[2.2.1]heptanski skelet.

Njihovom esterifikacijom uvodi se izvesna konformaciona sloboda u molekul, koja zavisi od

strukture kiselinskog dela (npr. rotacija oko C-O ili C-C veza). Interakcija olfaktornih receptora

i mirisnih molekula je specifična u pogledu stereohemije molekula koji nosi aromu, pa se može

očekivati da dva stereoizomera, ili čak konformera, formiraju potpuno drugačiji nadražaj (de

March, Golebiowski, 2014). Na slici 2-1 su prikazane dve energetski povoljne konformacije

endo-fenhil-acetata (konformeri kod koga je C=O syn, tj. anti sa metilenskom grupom mosta)

dokovane u model humanog OR1G1 olfaktornog receptora (Launay et al., 2012). In silico

eksperiment je izveden na isti način kako je prethodno opisano (Radulović et al., 2015). U oba

slučaja je izračunata vezivna energija bila jednaka (-5,7 kcal/mol), ali je, uprkos tome što je

dokovanje vršeno pod identičnim uslovima (isti random seed), orijentacija konformera bila je

drugačija (estarske grupe usmerene ka različitim amino-kiselinskim ostacima). Ovo ukazuje na

to da bi u zavisnosti od toga koji konformer je dominantan, dva analogna estra mogla imati

značajno različite organoleptičke osobine. Konformaciona analiza endo-fenhil-estara bi tako

mogla biti od koristi kod dizajna derivata/analoga endo-fenhola sa željenim svojstvima.

2.2. Šteglihova (Steglich) esterifikacija

Šteglihova esterifikacija je metoda koja se bazira na primeni N,N’-

dicikloheksilkarbodiimida (DCC) kao reagensa za kuplovanje, i (4-dimetilamino)piridina kao

katalizatora. Prvi put ju je opisao Volfgang Šteglih (Wolfgang Steglich) 1978. godine (Neises

i Steglich, 1978). Ova metoda je adaptacija starijeg postupka za dobijanje amida pomoću DCC-

a i 1-hidroksibenzotriazola. Postupak se najčešće vodi na sobnoj temperaturi, u dihlormetanu

kao rastvaraču. Pošto se reakcija odvija pod blagim uslovima, može se koristiti i za

esterifikaciju osetljivih supstrata, koji mogu lako podleći sporednim reakcija. Mehanizam

Šteglihove reakcije dat je na šemi 2-3.

Šema 2-3 . Mehanizam Šteglihove esterifikacije (DCU = dicikloheksilurea)

9

2.3. 1H iterativna potpuna spinska analiza (HiFSA) i molekulsko

modelovanje

HiFSA je novorazvijena NMR metodologija koja omogućava interpretaciju složenih

rezonanci (multipleta) koje su najčešće prisutne u protonskim spektrima organskih molekula,

a posebno prirodnih proizvoda (Napolitano, et al., 2012a, 2012b, 2013, 2015; Riihinen et al.,

2013). Pomoću ove metode se mogu odrediti hemijska pomeranja (, ppm) i skalarne konstante

kuplovanja (J, Hz) molekula čak i onda kada su složeni multipleti (višeg reda) delimično ili

potpuno preklopljeni. Vrednosti pomenutih parametara pružaju dodatne informacije o

(trodimenzionalnoj) strukturi molekula. U principu, u toku HiFSA-e se vrednosti za hemijska

pomeranja i skalarne konstante kuplovanja sistematično menjaju sve dok ishod kompjuterske

simulacije protonskog spektra ne bude u saglasnosti sa eksperimentalnim spektrom. U nekim

složenijim slučajevima neopodno je manuelno podešavanje vrednosti za i J, kako bi se

obezbedio uspešan ishod simulacije. HiFSA je do sada primenjivana za razlikovanje regio- i

dijastereoizomera složenih prirodnih proizvoda (npr. flavonoidi, flavonolignani, steroidi,

glikozidi i sl.) sa vrlo sličnim NMR spektrima (Napolitano et al., 2012a, 2012b, 2013, 2015;

Riihinen et al., 2013).

Bilo koji 1D 1H NMR spektar se može analizirati korišćenjem HiFSA-e, pod uslovom

da je odgovarajućeg kvaliteta (rezolucija) i da je dostupan odgovarajući softver za simulaciju

spektara. Profesor Pauli i saradnici sa IUC (University of Illinois, Chicago), Čikago, Ilinois,

koji su razvili ovaj postupak, za HiFSA-u koriste PERCH softver (PERCH Solutions Ltd.). On

omogućava automatizovanu iterativnu analizu i interpretaciju spektara. Čak i bez ovog softvera

je moguće vršiti potpunu spinsku analizu. Na primer, za simulaciju 1H spektra se može

iskoristiti WinDNMR (Reich, 1996) ili MestReNova softer. Problem sa njima je što postupak

onda nije automatizovan i svaka iteracija se mora vršiti manuelno. Iz tog razloga je u ovakvim

slučajevima važno otpočeti simulaciju sa vrednostima koje su što je moguće bliže

eksperimentalnim. Približne vrednosti hemijskih pomeranja se svakako mogu očitati iz

eksperimentalnog spektra čak i kod preklopljenih signala višeg reda. Veći problem

predstavljaju skalarne konstante kuplovanja. Kod preklopljenih signala koji potiču od

multipleta višeg reda vrlo je teško, ili nemoguće, odrediti vrednosti za J. Rešenje ovog

problema bi se moglo naći u predviđanju vrednosti za i J, koji bi dalje služili kao polazna

tačka za HiFSA-u. Džejn (Jain) i saradnici (2009) su nedavno pokazali da se vrednosti 1H i 13C

hemijskih pomeranja mogu prilično precizno predvideti korišćenjem GIAO (gauge invariant

atomic orbitals) metode, uz specijalno parametrizovani WP04 funkcional (DFT nivo teorije) i

aug-cc-pVDZ basis set. Procena hemijskih pomeranja zahteva odvojeno računanje izotopskih

konstanti zasenjenja svih protona strukture i TMS-a (ukoliko je on korišćen kao referentno

jedinjenje); hemijsko pomeranje predstavlja razliku između ove dve verdnosti. Hemijska

pomeranja vrlo zavise i od hemijskog okruženja samog molekula. Stoga je često neophodno

proračunom uzeti u obzir efekte rastvarača (CDCl3) kao polarizabilnog medijuma (Napolitano

et al, 2009; Jain et al., 2009). Nažalost, ovo čini proračun vremenski zahtevnijim.

DFT metoda se može iskoristiti i za računanje skalarnih konstanti kuplovanja. I ovde

se mogu dobiti prilično dobri rezultati sa relativno nezahtevnim basis setovima (npr. 6-

10

311G**), međutim sam proračun je značajno zahtevniji od onog za hemijska pomeranja (San

Fabian et al., 2014).

Da bi se mogle predvideti i J, najpre je neophodno optimizovati geometriju molekula.

Najjednostavniji je slučaj kada postoji jedan dominanatan konformer proučavanog jedinjenja

(npr. endo-fenhol). Kada se na osnovu strukture može očekivati postojanje više konformera

uporedive stabilnosti, neophodno je izvršiti pretragu konformacionog prostora molekula, naći

sve moguće konformere, predvideti i J za svaki od njih, a zatim izračunati srednje vrednosti

ovih parametara tako da odgovaraju nekom “usrednjenom” konformeru (hipotetička struktura

koja oslikava konformacionu raspodelu). Sa porastom molekulske složenosti rešavanje ovog

problema se veoma komplikuje. Ponekad se pretraga konformacionog prostora može ubrzati

korišćenjem neke manje zahtevne metode (npr. molekulska mehanika, MMFF94 metod) kojom

bi se grubo locirali energetski minimumi. Geometrije koje odgovaraju ovim minimumima se

nakon toga mogu optimizovati na nekom višem nivou teorije (npr. DFT). Čak i relativno

skromni basis setovi mogu dati geometrije (dužine veza i uglove) koje su u odličnoj saglasnosti

sa eksperimentalnim podacima (npr. kristalne strukture).

11

3. Eksperimentalni deo

12

3.1. Hemikalije

Sve hemikalije koje su korišćene u radu su p.a. čistoće: endo-fenhol, organske kiseline:

mravlja, sirćetna, propanska, butanska, izobutanska, pentanska, 2-metilbutanska, heksanska,

heptanska, oktanska, benzoeva, tiglinska ((E)-2-metil-but-2-enska),

i magnezijum-sulfat, natrijum-hlorid, N,N’-dicikloheksilkarbodiimid (DCC),

4-(dimetilamino)piridin (DMAP), kao i rastvarači: dietil-etar (Et2O), dihlormetan (CH2Cl2),

pentan, heksan, etil-acetat (EtOAc), deuterohloroform (CDCl3) nabavljeni su od sledećih

kompanija: Sigma-Aldrich (Sent Luis, Misuri, SAD), Acros Organics (Morris Plains, Nju

Džersi, SAD), Merck (Darmštat, Nemačka), J. T. Baker (Deventer, Holandija), Supelco

(Bellefonte, Pennsilvanija, SAD), Tokyo Chemical Industry Co. (Tokio, Japan), Centrohem

(Stara Pazova, Srbija), Zorka (Šabac, Srbija) i Zdravlje (Leskovac, Srbija). Rastvarači su

neposredno pre korišćenja predestilovani, dok su ostale hemikalije upotrebljavane bez

prethodnog prečišćavanja.

3.2. Metode analize

3.2.1. Nuklearno-magnetna rezonantna (NMR) spektroskopija

Odgovarajuća masa uzorka je rastvorena u 1 ml CDCl3, a 0,7 ml tog rastvora je

prebačeno u 5 mm Wilmad 528-TR-7 NMR kivetu. 1H i 13C NMR spektri snimljeni su na

Bruker Avance III 400 MHz spektrometru (1H na 400 MHz, a 13C na 101 MHz) na Prirodno-

matematičkom fakultetu u Nišu, opremljenim sa 1H/13C radnom glavom (probe head). 1H NMR

spektri su snimljeni sa 16 ponavljanja, relaksacionim vremenom od 1 s, vremenom prikupljanja

signala od 4 s, 0,125 Hz digitalnom FID rezolucijom, 51 280 FID veličinom, sa spektralnom

širinom od 6410 Hz i rezolucijom tačaka od 0,0003 ppm. 13C NMR spektri su snimljeni uz

Waltz16 1H širokopojasno dekuplovanje, 12000 ponavljanja, relaksacionim vremenom od 0,5

s, vremenom akumulacije signala od 1 s, digitalnom FID rezolucijom od 0,5 Hz, 65536 FID

veličinom, spektralnom širinom od 31850 Hz i rezolucijom tačaka od 0,005 ppm. Za snimanje

2D spektara korišćene su standardne pulsne sekvence iz softvera instumenta. 1H – 1H

gDQCOSY i NOESY spektri su snimljeni sa spektralnim širinama od 5 kHz i u F2 i u F1

oblasti. Snimanje je vršeno sa 1024 × 512 tačaka sa 32 ponavljanja i vremenom relaksacije od

2,0 s. Vreme mešanja prilikom snimanja NOESY spektara je bilo 1 s. Obrada podataka vršena

je na matrici sa 1024 podataka. Inverzno-detektovani 2D spektri heteronuklearne korelacije su

mereni u 512 kompleksnih tačaka u F2 i 256 uzastopnih tačaka u F1, pri čemu je prikupljeno

128 (gHMQC) ili 256 (1H – 13C gHMBC) ponavljanja po tački sa relaksacionim vremenom od

1,0 s. Spektralna širina za F2 dimenziju je bila 5 kHz, a za F1 27 kHz. gHMQC eksperimenti

su bili optimizovani za C-H kuplovanje od 125 Hz. 1H – 13C gHMBC eksperimenti su bili

optimizovani za kuplovanje od 10 Hz. Furijeova transformacija je bila izvršena na matrici od

512 podataka. Za sve 2D spektre korišćene su kvadratne sinusne funkcije pomerene za π/2 duž

F1 i F2 ose.

Vrednosti hemijskih pomeranja su date u δ (ppm) jedinicama, a konstante kuplovanja

u Hz. Unutrašnji standard za 1H NMR bio je tetrametilsilan (TMS) (δH = 0,00 ppm), a za 13C

13

NMR deuterohloroform CDCl3 (δC = 77,16 ppm). NMR spektri su snimani na 298 ili 300 K.

2D NMR spektri (1H – 1H COSY, NOESY, HSQC i HMBC) snimani su uz primenu

uobičajenih pulsnih sekvenci koje su sastavni deo softvera instrumenta. Dobijeni podaci su

obrađeni u programu MestReNova (ver. 6.0.2-5475, Mestrelab Research, Santiago de

Compostela, Španija).

3.2.2. Gasna hromatografija – masena spektrometrija (GC/MS)

GC/MS analiza sintetisanih estara izvršena je na aparatu HP 6890N, opremljenim sa

HP-5MS (5% fenilmetilsiloksan, 30 m × 0,25 mm, debljina filma 0,25 mm, Agilent

Technologies, Santa Klara, SAD), ili DB-1 (100% dimetilpolisiloksan, 30 m × 0,25 mm,

debljina filma 0,25 mm, Agilent Technologies, Santa Klara, SAD) kapilarnim kolonama, koji

je bio direktno kuplovan sa 5975B masenim detektorom iste kompanije. Kao noseći gas,

korišćen je helijum, sa konstantnim protokom od 1 ml/min. Temperaturni uslovi: radna

temperatura injektora i detektora 250 °C, odnosno 320 °C; linearni temperaturni program

zagrevanja kolone u opsegu od 70 do 315 °C, sa brzinom rasta temperature od 5 °C/min, a

zatim izotermalni period u trajanju od 10 minuta. Injektirano je 1 µl rastvora uzorka u etru (1

mg u 1 ml dietil-etra) (1:100, w/v), u pulsnom split modu (40:1), pri protoku od 1,5 ml/min u

prvih 30 sekundi, a zatim 1,0 ml/min do kraja analize. Jonizacija je vršena elektronima energije

70 eV, sa akvizicijom u m/z opsegu 35‒650 i dužinom trajanja jednog skena od

0,32 s.

Obrada TIC hromatograma (TIC = Total Ion Current) i masenih spektara vršena je u

programu AMDIS (Automated Mass Spectral Deconvolution and Identification System, ver.

2.68) sa NIST MS Search programskim paketom (ver. 2.0d, Nacionalni institut za standarde i

tehnologiju (NIST), SAD).

3.2.3. Dry flash hromatografija

Za preparativno razdvajanje pomoću dry flash hromatografije korišćena je jednostavna

aparatura koja se sastojala od kolone silika-gela 60 (40-63 m, Merck, Darmštat, Nemačka; ili

20-45 m, Carl Roth GmbH + Co.KG, Karlsrue, Nemačka), napakovane na sinterovanom

staklenom levku srednje poroznosti i veličine, i standardne boce za vakuum filtraciju. Eluiranje

je vršeno pod gradijentnim uslovima smešom heksan / dietil-etar.

3.2.4. Hromatografija na tankom sloju (TLC)

TLC je vršena na aluminijumskim pločama sa prethodno nanešenim slojem silika-gela

60 UV254 (Merck, Darmštat, Nemačka). Kao eluent je korišćena smeša heksana i dietil-etra u

odnosu 99:1 (v/v). Mrlje na TLC-u su vizuelizovane pomoću UV lampe (254 i 365 nm) i

izazivane 50%-tnom H2SO4 (aq.) ili rastvorom fosfomolibdenske kiseline (12 g) u EtOH (250

ml), nakon čega su ploče zagrevane u sušnici na 80 °C.

14

3.3. Sinteza (Šteglihova esterifikacija) i prečišćavanje endo-fenhil-estara

endo-Fenhil-estri su sintetisani modifikovanom Šteglihovom (Steglich) metodom.

endo-Fenhol (1 eq., 200 mg, 1,3 mmol), organska kiselina (1,1 eq., 1,4 mmol), N,N’-

dicikloheksilkarbodiimid (DCC, 1,2 eq., 300 mg 1,5 mmol), 4-(dimetilamino)piridin (DMAP,

0,3 eq., 50 mg, 0,4 mmol) i 20 ml anhidrovanog CH2Cl2 mešani su preko noći na sobnoj

temperaturi zaštićeni od uticaja spoljašnje atmosfere kalcijum-hloridnom cevčicom. Korišćene

kiseline su: mravlja (64,4 mg), sirćetna (84 mg), propanska (103,6 mg), butanska (123,2 mg),

izobutanska (123,2 mg), pentanska (142,8 mg), 2-metil-butanska (142,8 mg), heksanska (164,2

mg), heptanska (182 mg), oktanska (202 mg), benzoeva (170,8 mg), tiglinska ((E)-2-metil-but-

2-enska, 140 mg). Nakon hlađenja reakcione smeše na ledenom kupatilu, izdvojeni talog

dicikloheksiluree je odvojen filtracijom. Zatim je dodato 10 ml pentana i smeša ponovo

filtrirana. Rastvarač je uklonjen destilacijom na rotacionom-vakuum uparivaču.

Sirovi proizvod reakcije je prečišćen dry flash hromatografijom. Celokupna masa

proizvoda je dispergovana mešanjem sa dietil-etrom i silika-gelom u balonu od 100 ml, nakon

čega je dietil-etar uparen na rotacionom vakuum uparivaču. Na stakleni sinterovani levak je

nanet silika-gel do 3/4 njegove zapremine. Pakovanje kolone je obavljeno lupkanjem iste i

propuštanjem 100 ml čistog heksana. Nakon propuštanja heksana, na kolonu je fino raspoređen

i proizvod reakcije koji je prethodno nanet na silika-gelu. Eluiranje je vršeno smešom

heksan/dietil-etar u odnosu 98:2 (v/v), a dobijeno je šest frakcija. Tok dry flash hromatografije

praćen je hromatografijom na tankom sloju (TLC) i gasnom hromatografijom – masenom

spektrometrijom (GC/MS). Prinosi prečišćenih estara su bili u opsegu od 60-80% u odnosu na

polaznu masu alkohola.

Rezultati GC/MS analize endo-fenhola i njegovih estara dati su u tabeli 4-1 i na slikama

4-1 – 4-6. Rezultati NMR analize sumirani su u tabeli 4-3 i slikama 4-10 – 4-15, ili su dati u

nastavku (d – dublet, m – multiplet, dd – dublet dubleta, pdq – pseudo dublet kvarteta, bs –

široki singlet, q-kvartet):

endo-Fenhil-propanoat (3)

1H NMR (ppm, 400 MHz, CDCl3): 4,36 (1H, d, J = 1,9 Hz, H-2); 2,36 (2H, q, J = 7,6 Hz, H-

2’); 1,65 – 1,81 (3H, m); 1,58 (1H, ddd, J = 10,3; 4,0; 2,2 Hz, H-7syn); 1,44 (1H, m, H-5exo);

1,18 (1H, dd, J = 10,3; 1,6 Hz, H-7anti); 1,16 (3H, t, J = 7,6 Hz, H-3’); 1,10 (3H, s, H-8);

1,03 – 1,09 (1H, m, H-6exo); 1,04 (3H, s, H-10); 0,77 (3H, s, H-9). 13C NMR (ppm, 101 MHz,

CDCl3): 174,9; 85,9; 48,3; 48,2; 41,3; 39,4; 29,7; 27,8; 26,6; 25,8; 20,1; 19,4; 9,4.

endo-Fenhil-pentanoat (5)

1H NMR (ppm, 400 MHz, CDCl3): 4,36 (1H, d, J = 1,9 Hz, H-2); 2,35 (2H, td, J = 11,1; 4,4

Hz, H-2’); 1,55 – 1,81 (5H, m); 1,45 (1H, m, H-5exo); 1,35 (2H, m, H-4’); 1,18 (1H, dd,

J = 10,3; 1,5 Hz, H-7anti); 1,10 (3H, s, H-8); 1,02 – 1,09 (1H, m, H-6exo); 1,03 (3H, s,

H-10); 0,93 (3H, t, J = 7,3 Hz, H-5’); 0,77 (3H, s, H-9). 13C NMR (ppm, 101 MHz, CDCl3):

174,3; 85,9; 48,4; 48,3; 41,4; 39,4; 34,3; 29,7; 27,3; 26,6; 25,8; 22,4; 20,2; 19,4; 13,7.

endo-Fenhil-heksanoat (6)

15

1H NMR (ppm, 400 MHz, CDCl3): 4,36 (1H, d, J = 1,9 Hz, H-2); 2,34 (2H, td, J = 7,5; 1,0 Hz,

H-2’); 1,61 – 1,78 (5H, m); 1,58 (1H, ddd, J = 10,3; 4,0; 2,3 Hz, H-7syn); 1,44 (1H, m, H-

5exo); 1,26 – 1,36 (4H, m); 1,18 (1H, dd, J = 10,3; 1,5 Hz, H-7anti); 1,10 (3H, s, H-8); 1,03 –

1,09 (1H, m, H-6exo); 1,03 (3H, s, H-10); 0,90 (3H, s, H-6’); 0,77 (3H, s, H-9). 13C NMR (ppm,

101 MHz, CDCl3): 174,3; 85,9; 48,4; 48,2; 41,4; 39,4; 34,5; 31,4; 29,7; 26,6; 25,8; 24,8; 22,4;

20,2; 19,4; 13,9.

endo-Fenhil-izobutanoat (9)

1H NMR (ppm, 400 MHz, CDCl3): 4,34 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-2); 2,59 (1H, m, H-2’);

1,65 – 1,81 (3H, m); 1,58 (1H, ddd, J = 10,3; 4,0; 2,3 Hz, H-7syn); 1,45 (1H, m, H-5exo); 1,19

(6H, dd, J = 7,0; 2,2 Hz, H-3’ i H-4’); 1,18 (1H, dd, J = 10,3; 1,6 Hz, H-7anti); 1,11 (3H, s, H-

8); 1,03 – 1,09 (1H, m, H-6exo); 1,03 (3H, s, H-10); 0,77 (3H, s, H-9). 13C NMR (ppm, 101

MHz, CDCl3): 177,4; 85,6; 48,3; 48,1; 41,2; 39,2; 34,3; 29,6; 26,5; 25,8; 20,0; 19,3; 19,2; 19,1.

endo-Fenhil-2-metilbutanoat (10)

1H NMR (ppm, 400 MHz, CDCl3): 4,34 – 4,36 (dupliran, 1H, d, J = 2,1 Hz, H-2); 2,4 (dupliran,

1H, m, H-2’); 1,65 – 1,82 (4H, m); 1,58 (1H, m, H-7syn); 1,40 – 1,53 (2H, m); 1,18 (1H, dd, J

= 10,3; 1,6 Hz, H-7anti); 1,15 – 1,18 (dupliran, 3H, d, J = 7 Hz, H-5’); 1,11 (3H, s, H-8); 1,05

– 1,09 (1H, m, H-6exo); 1,04 (3H, s, H-10); 0,89 – 0,96 (dupliran, 3H, t,

J = 7,4 Hz, H-4’); 0,78 (3H, s, H-9). 13C NMR (ppm, 101 MHz, CDCl3): 177,1 (dupliran); 85,8

(dupliran); 48,4 (dupliran); 48,3; 41,8 (dupliran); 41,3 (dupliran); 39,4 (dupliran); 29,7; 29,6

(dupliran); 26,7; 25,9 (dupliran); 20,3 (dupliran); 19,4 (dupliran); 17,0 (dupliran); 11,8

(dupliran).

endo-Fenhil-tiglat (11)

1H NMR (ppm, 400 MHz, CDCl3): 6,87 (1H, qq, J = 7,0; 1,4 Hz, H-3’); 4,42 (1H, d,

J = 1,9 Hz, H-2); 1,86 (3H, m, H-5’); 1,80 (3H, ddd, J = 7,5; 2,1; 1,0 Hz, H-4’); 1,65 – 1,82

(3H, m); 1,61 (1H, ddd, J = 10,3; 4,0; 2,2 Hz, H-7syn); 1,47 (1H, ddt, J = 12,5; 5,6; 3,9 Hz, H-

5exo); 1,19 (1H, dd, J = 10,3; 1,5 Hz, H-7anti); 1,12 (3H, s, H-8); 1,07 – 1,16 (1H, m, H-6exo);

1,05 (3H, s, H-10); 0,78 (3H, s, H-9). 13C NMR (ppm, 101 MHz, CDCl3): 168,5; 136,6; 129,0;

86,0; 48,5; 48,4; 41,4; 39,7; 29,7; 26,9; 25,9; 20,2; 19,5; 14,3; 12,1.

endo-Fenhil-benzoat (12)

1H NMR (ppm, 400 MHz, CDCl3): 8,08 (2H, m, H-3’); 7,56 (1H, ptt, J = 6,7; 1,3 Hz, H-5’);

7,46 (2H, m, H-4’); 4,62 (1H, d, J = 1,9 Hz, H-2); 1,95 (1H, m); 1,75 – 1,83 (2H, m); 1,67 (1H,

ddd, J = 10,3; 4,0; 2,3 Hz, H-7syn); 1,52 (1H, tdd, J = 12,6; 5,8; 4,1 Hz, H-5exo); 1,25 (1H,

dd, J = 10,3; 1,5 Hz, H-7anti); 1,19 (3H, s, H-8); 1,15 – 1,24 (1H, m, H-6exo); 1,11 (3H, s, H-

10); 0,85 (3H, s, H-9). 13C NMR (ppm, 101 MHz, CDCl3): 166,9; 132,8; 130,7; 129,5; 128,4;

86,7; 48,6; 48,4; 41,4; 39,8; 29,8; 26,9; 25,9; 20,3; 19,5.

3.4. Molekulsko modelovanje

16

Preliminarna pretraga konformacionog prostora endo-fenhil-formijata (2) i endo-

fenhil-acetata (3) je vršena pomoću softverskog paketa Chem3D, opcija dehidral driver.

Nekoliko odabranih geometrija (energetski minimumi dobijeni nakon MMFF94 optimizacije)

su dalje optimizovane na DFT nivou teorije (B3LYP funkcional i 6-31G basis set).

Vibracionom analizom je potvrđeno da optimizovane geometrije predstavljaju energetske

minimume. Svi DFT proračuni su vršeni pomoću softverskog paketa Gaussian 09 (Frisch et

al., 2013). Za svaku od optimizovanih geometrija su korišćenjem GIAO metode

(specijalizovani WP04 funkcional (DFT nivo teorije) i aug-cc-pVDZ basis set) izračunata 1H i 13C NMR hemijska pomeranja u odnosu na TMS, kao i skalarne konstante kuplovanja (Jane et

al., 2009).

3.5. 1H NMR iterativna potpuna spinska analiza (HiFSA)

Hemijska pomeranja () i skalarne konstante kuplovanja (J) za endo-fenhol (1), endo-

fenhil-formijat (2) i endo-fenhil-acetat (3) predviđeni su korišćenjem GIAO metode (poglavlje

3.4.). Nakon toga su, polazeći od odgovarajućih procenjenih eksperimentalnih vrednosti,

izračunate vrednosti H i J manuelno korigovane. Korigovane H/J vrednosti su poslužile kao

početna tačka za dalju optimizaciju koja je vršena pomoću WinDNMR softvera za simulaciju 1H spektara (Reich, 1996). Podešavanje H i J vrednosti je vršeno sve dok ishod simulacije

nije bio u saglasnosti sa eksperimentalnim spektrima za 1-3.

17

4. Rezultati i diskusija

18

4.1. Sinteza estara endo-fenhola i njihova GC/MS analiza

Sinteza 12 estara endo-fenhola (šema 2-1) izvršena je modifikovanom Šteglihovom

metodom (Neises, Steglich, 1978). Dicikloheksilurea (DCU) je taložena hlađenjem reakcione

smeše na ledenom kupatilu. Nakon završene reakcije, zaostala DCU je istaložena dodavanjem

pentana i ponovnim hlađenjem rastvora. Sirovi estri, onečišćeni neizreagovanim alkoholom,

kiselinom, DMAP-om, fenhonom (zaprljanje iz endo-fenhola) i tragovima DCU, prečišćeni su

dry flash hromatografijom, čiji je tok praćen hromatografijom na tankom sloju (TLC). Kao

eluent je korišćena smeša rastvarača heksan / dietil-etar u odnosu 98:2 (v/v). Prečišćeni estri su

izolovani u prinosu od 60-80 % (u odnosu na početnu masu endo-fenhola). Čistoća je potvrđena

TLC i GC/MS analizama.

Svi estri su nakon prečišćavanja analizani NMR spektroskopijom (1D i 2D

eksperimenti). Rezultati ovih analiza su sumirani u eksperimentalnom delu i tabeli 4-2. Kako

je za sintezu korišćena racemska 2-metilbutanska kiselina, dobijena je smeša 2 dijastereomera

koji se na osnovu GC/MS i TLC analiza nisu mogli razlikovati (koeluirali su pod uslovima

pomenutih analiza). Međutim, NMR analiza odgovarajućeg uzorka je pokazala da se radi o

ekvimolarnoj smeši dva dijastereomera. Hemijska pomeranja i oblik signala su u skladu sa

očekivanim za ova jedinjenja (videti naredno poglavlje).

Pretraga literature dostupne u CAS bazi podataka je pokaza da su endo-fenhil-2-

metilbutanoat i endo-fenhil-tiglat nova jedinjenja, a da su, izuzev endo-fenhil-acetata, ostali

sintetisani estri malo proučavani (tabela 2-1). U tom smislu, uopšteno govoreći, podaci vezani

za retencione indekse i masene spekre ovih jedinjenja nisu dostupni u literaturi. Retencioni

indeksi (HP-5MS kolona) za jedinjenja 1-14 (šema 2-1), sumirani su u tabeli 4-1. Kako je i

očekivano, retencioni indeksi endo-fenhil-estara zasićenih kiselina normalnog niza korelišu sa

brojem ugljenikovih atoma u kiselinskom delu molekula (koeficijent korelacije

R2 = 1; slika 4-1). Retencioni indeksi homologa razlikuju se za po 99 retencionih jedinica.

Vrednost RI za estar mravlje kiseline blago otstupa, međutim ovakav trend je već ranije uočen

(Radulović et al., 2015). Retencioni indeksi estara kiselina sa račvastim nizom su oko 50

jedinica niži od od retencionih indeksa odgovarajućih kiselina sa normalnim nizom (npr.

jedinjenja 5 i 10 ili 6 i 11), što je u saglasnosti sa literaturnim podacima za slična jedinjenja

(Radulović et al., 2015).

Tabela 4-1. Retencioni indeksi (HP-5MS kolona) endo-fenhola (1), endo-fenhil-estara (2-13) i fenhona (14)

Naziv jedinjenja RI Naziv jedinjenja RI

endo-Fenhol (1) 1121 endo-Fenhil-2-metilbutanoat (8) 1439

endo-Fenhil-formijat (2) 1184 endo-Fenhil-heksanoat (9) 1605

endo-Fenhil-acetat (3) 1207 endo-Fenhil-heptanoat (10) 1702

endo-Fenhil-propanoat (4) 1313 endo-Fenhil-oktanoat (11) 1800

endo-Fenhil-butanoat (5) 1403 endo-Fenhil-benzoat (12) 1795

endo-Fenhil-izobutanoat (6) 1355 endo-Fenhil-tiglat (13) 1530

endo-Fenhil-pentanoat (7) 1500 Fenhon (14) 1081

19

Slika 4-1. Korelacija retencionih indeksa endo-fenhil-estara (3-9) sa brojem C-atoma u kiselinskom delu

molekula (y – retencioni indeks, x – broj C-atoma u kiselinskom delu molekula, R-koeficijent

korelacije)

Maseni spektri jedinjenja 1-14 su sumirani na slikama 4-3 do 4-6 i jako su slični. U

većini slučajeva, sem kod tiglata (12) i benzoata (13), osnovni jon se javlja na m/z 81. U estrima

svih kiselina se javlja i intenzivan jon na m/z 136 (fragmentacioni put c/c’, slika 4-2). Kako je

i očekivano (Radulović et al., 2015), u masenim spekrima 3-13 su intenzivni još i joni koji

ukazuju na identitet kiselinskog dela molekula (fragmentacioni putevi a/a’ i b/b’, slika 4-2).

Tako, u spektrima estara buterne i izobuterne kiseline mogu se uočiti intenzivni joni na m/z 43

(C3H7+; fragmentacioni put a/a’) i 71 (C3H7CO+; fragmentacioni put b/b’). U masenim

spektrima tiglata (12) i benzoata (13) su joni koji potiču od fragmentacionog puta b/b’

najintenzivniji u molekulu (m/z 83 i 105). Intenziteti jona koji potiču od fragmentacionog puta

a/a’ (m/z 55 i 77) su približno istog intenziteta kao oni na m/z 136 (fragmentacioni put c/c’) i

81 (dijagnostički pik za fenhensko jezgro). Kako su maseni spektri snimani u m/z opsegu 35 –

650, u slučaju MS-a formijata (2), jon koji odgovara fragmentacionom putu b/b’ (m/z 29) nije

mogao biti detektovan.

Slika 4-2. Mogući MS fragmentacioni putevi kod endo-fenhil-estara

y = 99x + 1012R² = 1

1000

1200

1400

1600

1800

2000

2 3 4 5 6 7 8

20

Slika 4-3. Maseni spektri endo-fenhil-formijata (A), endo-fenhil-acetata (B), endo-fenhil-propanoata (C) i endo-fenhil-butanoata (D)

21

Slika 4-4. Maseni spektri endo-fenhil-izobutanoata (E), endo-fenhil-pentanoata (F), endo-2-metilbutanoata (G) i endo-fenhil-heksanoata (H)

22

Slika 4-5. Maseni spektri endo-fenhil-heptanoata (I), endo-fenhil-oktanoata (J), endo-fenhil-tiglata (K) i endo-fenhil-benzoata (L)

23

Slika 4-6. Maseni spektri endo-fenhola (M) i fenhona (N)

4.2. Molekulsko modelovanje

Preliminarna pretraga konformacionog prostora sintetisanih endo-fenhil-estara (2-12)

vršena je na MM2 nivou teorije, korišćenjem opcije dihedral driver implementirane u Chem3D

softver. U toku pretrage, sistematski su menjane vrednosti O – C-1’ – O – C-2 i C-1’ – O – C-

2 – C-3 torzionih uglova za po 1o, čime je simulirana rotacija oko O – C-2 i O – C-1’ veza za

po 360o. Za svaku kombinaciju torzionih uglova je beležena relativna energija. Rezultati

ovakve pretrage za endo-fenhil-acetat (3) dati su na slici 4-7. Bela polja se odnose na geometrije

sa relativnom energijom ∆E = 0, a potpuno crna na konformacije za koje je ∆E minimalno 30

kcal/mol; različitim nijansama sive boje su obeležene kombinacije torzionih uglova kojima

odgovara relativna energija u opsegu of 0 do 30 kcal/mol.

24

Slika 4-7. A. Razlike u konformacionoj energiji (bela polja se odnose na geometrije sa relativnom energijom

∆E = 0, a potpuno crna na konformacije za koje je ∆E minimalno 30 kcal/mol; različitim nijansama

sive boje su obeležene kombinacije torzionih uglova kojima odgovara relativna energija u opsegu of

0 do 30 kcal/mol) različitih geometrija endo-fenhil-acetata dobijenih rotacijom oko O – C-2 i O – C-

1’ veza za po 360o (odgovarajući torzioni uglovi su sukcesivno menjani za po 1o; pretraga

konformacionog prostora je vršena korišćenjem Chem3D softvera, opcija dihedral driver); B.

numeraciona šema endo-fenhola i endo-fenhil-estara.

Slika 4-8. Konformeri K1 (levo) i K2 (desno) endo-fenhil-formijata

Odabrane energetski povoljne konformacije (više različitih kombinacija pomenutih torzionih

uglova) dobijene ovakvom pretragom dalje su iskorišćene kao polazne geometrije za

optimizaciju struktura estara 2-6, 10 i 11 na višem nivou teorije (DFT: B3LYP funkcional,

6-31G basis set).

25

Slika 4-9. Konformeri K1 (levo) i K2 (desno) endo-fenhil-acetata

Tabela 4-2: Razlike u relativnim energijama između optimizovanih geometrija K1 i K2 (slike 4-8 i 4-9) estara 2-

6, 10 i 11

Jedinjenje ∆Ea = EK2 – EK1 (kcal/mol)

endo-Fenhil-formijat (2) 3,80

endo-Fenhil-acetat (3) 7,90

endo-Fenhil-propanoat (4) 7,92

endo-Fenhil-butanoat (5) 7,98

endo-Fenhil-izobutanoat (10) 8,98b

endo-Fenhil-pentanoat (6) 7,97

endo-Fenhil-2-metilbutanoat (11a)c,d,e 7,81

endo-Fenhil-2-metilbutanoat (11b)c,e,f 9,32 a Relativna energija konformera K1 je EK1, a konformera K2 je EK2; b razlika u energijama K1 i K2 za 10 i 5 je -0,04 i +0,97 kcal/mol; c različiti dijastereoizmeri (različita

konfiguracija na C-2’, slika 4-7); d razlika u energijama K1 i K2 za 11a i 6 je +1,46 i +1,30 kcal/mol; e razlika u energijama K1 i K2 za 11a i 11b je +1,13 i -0,38 kcal/mol; f razlika u energijama K1 i K2

za 11b i 6 je +0,33 i +1,68 kcal/mol.

Bez obzira što je optimizacija vršena sa nekoliko različitih polaznih geometrija,

rezultati su ukazali da postoje po dva konformera (K1 i K2) za estre 2-6, 10 i 11. Ovi

konformeri su za endo-fenhil-formijat (2) i endo-fenhil-acetat (3) dati na slikama 4-8 i 4-9, a

analogni su i za estre 4-6, 10 i 11 (iz ovog razloga proračun za 7-9 nije vršen). U ovom radu

geometrije jedinjenja 12 i 13 nisu razmatrane. Konformeri K1 i K2 estara 2-6, 10 i 11 se

međusobno razlikuju po orijentaciji C=O grupe u odnosu na metilensku grupu mosta (slike

4-8 i 4-9). Razlike u relativnim energijama između K1 i K2 za jedinjenja 2-6, 10 i 11 sumirane

su u tabeli 4-2 (uzeta je u obzir korekcija vezana za energiju nulte tačke, zero point energy).

Vrednosti date u tabeli 4-2 ukazuju na to da će u slučaju svih razmatranih estara ravnoteža

skoro u potpunosti biti pomerena ka konformeru K1. Na primer, pod pretpostavkom da važi

Bolcmanova (Boltzmann) raspodela i da su K1 i K2 u ravnoteži samo jedan sa drugim, u slučaju

estara 3-6, 10 i 11 u ravnotežnoj smeši bi bilo više od 99,999% K1 (proračun vršen za

temperaturu od 298 K). U slučaju endo-fenhil-formijata bi bilo nešto manje od 0,2% K2 u

ravnoteži. Manje izražena razlika u relativnim energijama K1 i K2 u slučaju formijata mogla

26

bi biti posledica odsustva alkil-supstituenta vezanog za C-1’. Ovako izražena razlika u

stabilnosti K1 i K2 za 2-6, 10 i 11 nije iznenađujuća. Naime, konformer K1 je povoljniji za

delokalizaciju neveznog elektronskog para sa kiseonika u * C=O estarske grupe (Jones i Oven,

1973). Vredi naglasiti da iako je proračun vršen uz relativno mali basis set (6-31G), dobijeni

rezultati za razlike u stabilnostima K1 i K2 za endo-fenhil-formijat su u saglasnosti sa

eksperimentalnim vrednostima za druge estre mravlje kiseline (Jones i Oven, 1973).

Tabela 4-3: Hemijska pomeranja i konstante kuplovanja u 1H i 13C NMR spektrima (CDCl3) endo-fenhola (1),

endo-fenhil-formijata (2) i endo-fenhil-acetata (3)

H endo-Fenhol endo-Fenhil-formijat endo-Fenhil-acetat

H-2 3,26a (db, J = 1,8 Hz,

ABCKLPRXc) 4,47 (bs, ABCGJMPTX)

4,36 (d, J = 2,1 Hz,

ABCHKPSX)

H-4 1,68 (m, J = 4,0, 1,8, 1,6 Hz,

ABCKLPRX)

1,75 (m, J = 3,8, 2,1, 1,6 Hz,

ABCGJMPTX)

1,71 (m, J = 3,6, 2,3,

1,8 Hz, ABCHKPSX)

H-5endo 1,65 (m, J = 12,8, 9,0, 3,5,

2,5 Hz, ABCKLPRX)

1,70 (m, J = 12,6, 9,4, 3,5,

2,5 Hz, ABCGJMPTX)

1,69 (m, J = 12,4, 9,0, 3,5,

2,5 Hz, ABCHKPSX)

H-5exo 1,41 (m, J = 12,8, 12,2, 6,2,

4,0 Hz, ABCKLPRX)

1,47 (m, J = 12,6, 12,6, 5,8,

3,8 Hz, ABCGJMPTX)

1,45 (m, J = 12,4, 12,4, 5,8,

3,6 Hz, ABCHKPSX)

H-6exo 1,02 (m, J = 12,8, 12,2, 3,5,

1,8 Hz, ABCKLPRX)

1,11 (m, J = 12,6, 12,4,

3,6 Hz, ABCGJMPTX)

1,08 (m, J = 12,4, 12,3, 3,5,

2,1 Hz, ABCHKPSX)

H-6endo 1,61 (m, J = 12,8, 9,0, 6,2,

2,1 Hz, ABCKLPRX)

1,74 (m, J = 12,4, 9,4, 5,8,

2,3 Hz, ABCGJMPTX)

1,74 (m, J = 12,3, 9,0, 5,8,

2,1 Hz, ABCHKPSX)

H-7syn 1,46 (pdq, J = 10,2, 2,5, 2,1,

1,8 Hz, ABCKLPRX)

1,60 (pdq, J = 10,2, 2,5, 2,3,

1,6 Hz, ABCGJMPTX)

1,57 (pdq, J = 10,3, 2,5, 2,3,

2,1 Hz, ABCHKPSX)

H-7anti 1,12 (dd, J = 10,1, 1,6 Hz,

ABCKLPRX)

1,22 (dd, J = 10,2, 1,6 Hz,

ABCGJMPTX)

1,18 (dd, J = 10,3, 1,8 Hz,

ABCHKPSX)

H-8 (exo Me) 0,99 (s) 1,11 (s) 1,10 (s)

H-9 (endo Me) 0,86 (s) 0,80 (s) 0,78 (s)

H-10 1,09 (s) 1,06 (s) 1,04 (s)

H-1’ - 8,17 (d, J = 1,0 Hz,

ABCGJMPTX) -

H-2’ - - 2,08 (s)

C-1 49,1 48,4 48,2

C-2 85,1 86,5 86,2

C-3 39,1 39,3 39,4

C-4 47,9 48,3 48,3

C-5 26,1 26,6 25,8

C-6 25,1 25,9 26,6

C-7 41,0 41,5 41,4

C-8 30,7 29,8 29,7

C-9 20,2 20,4 20,0

C-10 19,5 19,4 19,4

C-1’ - 161,7 171,6

C-2’ - - 21,0

a Vrednosti hemijskih pomeranja i konstanti kuplovanja su dobijne pomoću HiFSA-e (videti nastavak

teksta); b d – dublet, m – multiplet, dd – dublet dubleta, pdq – pseudo dublet kvarteta, bs – široki singlet; c Pople-

ova nomenklatura spinskih sistema višeg reda: blizina slova u abecednom nizu odgovara blizini pomeranja

protona (δ; slovo koje označava proton na zadatom pomeranju je podvučeno).

27

Na osnovu podataka sumiranih u tabeli 4-2 sledi da u većini slučajeva uvođenje račve

u položaj 2 kiselinskog dela molekula (izobutanoat, 2-metilbutanoat) destabilizuje molekul. Na

primer, konformacija K1 pentanoata je stabilnija od K1 oba 2-metilbutanoata. Međutim, čini

se da je K1 izobutanoata nešto stabilniji od odgovarajućeg konformera butanoata. Ovo bi dalje

moglo da znači da bi u zavisnosti od tipa supstituenta u kiselinskom delu molekula moglo doći

do promene u odgovarajućoj konformacionoj raspodeli.

4.3. NMR analiza

endo-Fenhol i sintetisani estri su spektralno okarakterisani pomoću 1D i 2D NMR

analiza. Rezultati su sumirani u tabeli 4-3, slikama 4-10 – 4-15 (1-3), kao i u eksperimentalnom

delu (poglavlje 3.3.). Dvodimenzionalni HMBC, HSQC i NOESY eksperimenti omogućili su

potpunu asignacija signala iz 1H i 13C NMR spektara. Na osnovu HSQC spektara (direktno 13C-1H kuplovanje; za jedinjenja 1-3 prikazani su na slikama 4-10 – 4-12) nedvosmisleno je

potvrđeno koji vodonici su međusobno geminalni, kao i to za koje C-atome su vezani.

Najvažnije HMBC interakcije za 1-3 su date na slikama 4-13 i 4-14. Na osnovu njih su

asignirani kvaternerni ugljenikovi atomi i potvrđena konektivnost. U HMBC spektrima

(daljinsko 13C-1H kuplovanje) 1-3 uočen je veliki broj interakcija za jezgra udaljena preko 3, a

u nekim slučajevima i preko 4 veze; odgovarajući signali su u mnogim slučajevima bili bar

delimično preklopljeni. U HMBC spektrima formijata i acetata su bile prisutne analogne

interakcije kao u odgovarajućem spektru alkohola. Iz tog razloga one nisu eksplicitno prikazane

već su na slici 4-14 date samo HMBC interakcije koje se tiču kiselinskog dela molekula.

Slika 4-10. Odabrane HSQC interakcije endo-fenhola (1)

28

Slika 4-11. Odabrane HSQC interakcije endo-fenhil-formijata

Slika 4-12. Odabrane HSQC interakcije endo-fenhil-acetata

29

Slika 4-13. Važne HMBC interakcije endo-fenhola (1). Zarad jednostavnosti, korišćene su strelice različitih boja.

Slika 4-14. Odabrane HMBC interakcije endo-fenhil-formijata (2) i endo-fenhil-acetata (3). Zarad jednostavnosti,

korišćene su strelice različitih boja.

30

Slika 4-15. Odabrane NOESY interakcije endo-fenhil-formijata (levo) i acetata (desno). Zelenom bojom su

obeležene interakcije koje su detektovane u spektru, a crvennom one koje nisu uočene.

Nedvosmislena asignacija pojedinih signala (npr. rezonance koje potiču od vicinalnih

metil-grupa) bila je moguća zahvaljujući informacijama iz 2D NOESY spektara (slika 4-15).

Na primer, u NOESY spektru endo-fenhil-formijata (1) uočena je interakcija između H-2 i

H-8 (exo metil-grupa) protona, ali ne i između H-2 i H-9 (endo metil-grupa) protona. Ovo je u

skladu sa optimizovanom geometrijom za K1 kod koje je rastojanje između H-2 i C-8 (2,5 Å)

značajno niže od rastojanja između H-2 i C-9 (3,3 Å), slika 4-16. Slično važi i za alkohol i

acetat.

Podaci iz NOESY spektara potvrđuju da je konformacija K1 dominantna u slučaju

estara 2 i 3 (isto važi i za druge sintetisane estre čiji spektralni podaci ovde neće biti detaljno

razmatrani). Naime, u datim spektrima nisu uočene interakcije između H-1’ i H-2 (formijat),

odnosno između H-2’ i H-2 (acetat). U slučaju konformera K2 za 2 i 3, rastojanja između

pomenutih parova protona su manja nego rastojanja između nekih protona za koje jeste uočena

međusobna nOe interakcija. Na primer, u slučaju acetata, postoji nOe interakcija između H-

7syn i H-2. U K2 konformeru ovih protoni su udaljeniji od H-2’ i H-2 (2,6 i 2,4Å; slika 4-16).

Slika 4-16. Levo: rastojanja C-8 (exo metil-grupa) i C-9 (endo metil-grupa) od H-2 atoma u konformeru K1 endo-

fenhil-formijata; desno: rastojanja H-2’ i H-7syn od H-2 u konformeru K1 endo-fenhil-acetata

Prevođenjem alkoholne grupe endo-fenhola u estarsku došlo je do relativno velike

promene u vrednostima hemijskih pomeranja za pojedina jezgra. Kako je očekivano, najveća

promena u pomeraju (Δδ) uočena je za protone koji su (prostorno) bliži alkoholnoj

funkcionalnoj grupi. Na primer, rezonanca za H-2 proton je pomerena ka nižem polju

31

(downfield shift) za otprilike 1 ppm. Navedena pojava je posledica zamene alkoholne estarskom

grupom, ali i anizotropije karbonilne grupe.

Slika 4-17. A. Simulirani (gore) i eksperimentalni (dole) 1H NMR spektar endo-fenhola (1); B. Uvećanja

pojedinih opsega simuliranog (gore) i eksperimentalnog (dole) 1H NMR spectra. Za simulirani spektar, podešeni

su sledeći parametri: hemijska pomeranja (δ, ppm, 400 MHz) – 3.2619 (H-2), 1.6828 (H-4), 1.646 (H-5endo),

1.6007 (H-6endo), 1,54 (O-H), 1.4553 (H-7syn), 1.4095 (H-5exo), 1.257 (H-7anti), 1.0878 (H-10), 1.0164 (H-

6exo), 0.989 (H-8 (exo Me)), 0.86 (H-9 (endo Me)) i skalarne konstante kuplovanja (J, Hz) – 4J H-2, H-6exo = 1,8; 3J H-4, H-5exo = 4,0; 3JH-4,H-7syn = 1,8; 3J H-4, H-7anti = 1,6; 2J H-5endo, H-5exo = -12,8; 3J H-5endo, H-6endo = 9; 3J H-5endo, H-6exo =

3,5; 4J H-5endo, H-7syn = 2,5; 3J H-5exo, H-6exo = 12,2; 3J H-5exo, H-6endo = 6,2; 2JH-6endo, H-6exo = -12,8; 4J H-6endo, H-7syn = 2,1; 2J

H-7syn, H-7anti = -10,1. Strelica ukazuje na signal koji potiče od nečistoće prisutne u uzorku.

4.3.1. Potpuna spinska analiza 1H NMR spektara (HiFSA) jedinjenja 1-3

Protonski NMR spektri jedinjenja 1-3 sastoje se od složenih, delimično preklopljenih

multipleta jezgara koja se međusobno jako sprežu. Zbog specifične strukture fenhil-grupe

(premošćeni rigidni sistem), praktično svi protoni čine jedinstveni spinski sistem sa

kuplovanjem višeg reda. Iz tog razloga, hemijska pomeranja i konstante kuplovanja ne mogu

biti direktno “očitani” iz samog spektra. Informacije vezane za i J u ovakvim slučajevima se

mogu “ekstrahovati” iz samog spektra primenom HiFSA metode (Napolitano, et al., 2012a,

2012b, 2013, 2015; Riihinen et al., 2013). Ovde je u date svrhe primenjena delimično

modifikovana metoda gde su, iz razloga navedenih u poglavlju 2.3., najpre izračunate vrednosti

za i J (Jain et al., 2009) za K1 i K2 jedinjenja 1-3 korišćenjem GIAO (gauge invariant atomic

orbitals) metode, uz specijalno parametrizovani WP04 funkcional (DFT nivo teorije) i aug-cc-

pVDZ basis set (Jain et al., 2009). Prethodno je pokazano da se nešto bolji rezultati dobijaju

ukuliko proračun uzima u obzir efekte rastvarača. Iz tog razloga su ovde vrednosti računate

na oba načina (u gasnoj fazi i u hloroformu) (Jain et al., 2009). Međutim, kako će nešto kasnije

32

biti pokazano, za konkretne slučajeve koji su ovde razmatrani oba pristupa su dala uporedive

rezultate. Iz tog razloga je računanje skalarnih konstanti kuplovanja (NMR = spin-spin naredba

u Gaussian-u ) vršeno samo u gasnoj fazi. Rezultati proračuna su sumirani u tabelama 4-4 i 4-

5 i na slikama 4-20–4-22. Ovako dobijene vrednosti za i J su najpre manuelno korigovane i

usklađene sa eksperimentalnim vrednostima koje su mogle biti direktno očitane iz

eksperimentalnih 1H NMR spektara. Nakon toga je vršeno njihovo utačnjavanje korišćenjem

WinDNMR softvera (Reich, 1996) i to tako što su vršene male izmene u njihovim vrednostima

kao i u odgovarajućoj spektralnoj širini. Ovde vredi naglasiti da čak i na prvi pogled neznatne

promene u hemijskom pomeranju od npr. 0,01 ppm (ovo odgovara razlici od 4 Hz za aparat na

kome su protonski spektri snimani) mogu dovesti do značajnih promena u obliku signala. Iz

tog razloga, u toku simulacije bilo je neophodno vršiti izmene vrednosti koje su bile reda

veličine 10-3 - 10-4 ppm. Slično, vrednosti za konstante kuplovanja (J) su izražavane na dve

decimale, uz vođenje računa o znaku konstante (npr. sve geminalne, 2J, konstante kuplovanja

bile su negativne, a vicinalne, 3J, pozitivne). Podešavanjem svih navedenih parametara (, J i

spektralna širina) dobijeni su simulirani spektri endo-fenhola, endo-fenhil-formijata i endo-

fenhil-acetata koji su u odličnoj saglasnosti sa eksperimentalnim spektrima (slike 4-17–4-19).

Slika 4-18. A. Simulirani (gore) i eksperimentalni (dole) 1H NMR spektra endo-fenhil-formijata (2); B. Uvećanja


su sledeći parametri: hemijska pomeranja (δ, ppm, 400 MHz) – 8.1738 (H-1’), 4.468 (H-2), 1.745 (H-4), 1.7445

(H-6endo), 1.7025 (H-5endo), 1.595 (H-7syn), 1.4662 (H-5exo), 1.216 (H-7anti), 1.1135 (H-8 (exo Me)), 1.1072

(H-6exo), 1.0584 (H-10), 0.804 (H-9 (endo Me)) i skalarne konstante kuplovanja (J, Hz) – 4J H-2, H-6exo = 2,1; 4J

H-2, H-1’ = -1,0; 4J H-4, H-6exo = -0,3; 3J H-4, H-5exo = 3,8; 3J H-4, H-7syn = 1,6; 3J H-4, H-7anti = 1,6; 2J H-5endo, H-5exo = -12,6; 3J

H-5endo, H-6endo = 9,4; 3J H-5endo, H-6exo = 3,55; 4J H-5endo, H-7syn = 2,5; 3J H-5exo, H-6exo = 12,6; 3J H-5exo, H-6endo = 5,8; 2J H-6endo,

H-6exo = -12,4; 4J H-6endo, H-7syn = 2,3; 2J H-7syn, H-7anti = -10,2.

33

Slika 4-19. A. Simulirani (gore) i eksperimentalni (dole) 1H NMR spektra endo-fenhil-acetata (3); B. Uvećanja


su sledeći parametri: hemijska pomeranja (δ, ppm, 400 MHz) – 4.359 (H-2), 2.0762 (H/2’), 1.7393 (H-6endo),

1.71 (H-4), 1.686 (H-5endo), 1.5744 (H-7syn), 1.4475 (H-5exo), 1.182 (H-7anti), 1.0987 (H-8 (exo Me)), 1.08

(H-6exo), 1.0382 (H-10), 0.7762 (H-9 (endo Me)) i skalarne konstante kuplovanja (J, Hz) – 4J H-2, H-6exo = 2,1; 3J

H-4, H-5exo = 3,7; 3J H-4, H-7syn = 2,3; 3J H-4, H-7anti = 1,8; 2J H-5endo, H-5exo = -13,0; 3J H-5endo, H-6endo = 8,7; 3J H-5endo, H-6exo =

3,5; 4J H-5endo, H-7syn = 2,1; 3J H-5exo, H-6exo = 13,0; 3J H-5exo, H-6endo = 5,8; 2J H-6endo, H-6exo = -12,5; 4J H-6endo, H-7syn = 1,8; 2J

H-7syn, H-7anti = -10,3.

Jedan od ciljeva ovog rada je bio da se testira da li se kombinacijom HiFSA-e sa

predviđenim (DFT nivo teorije) vrednostima za i J za različite konformere nekog jedinjenja

(u ovom slučaju estara endo-fenhola) mogu dobiti informacije vezane za dominantnu

konformaciju datog jedinjenja. U ovom konkretnom slučaju, ideja je bila da se utvrdi u kojoj

meri izračunate vrednosti za i J korelišu sa onim koje su eksperimentalno nađene (i određene

korišćenjem HiFSA metode), te da li postoji značajna razlika u korelaciji za različite

konformere (K1 i K2). Na slikama 4-20 – 4-22 navedeni su korelacioni dijagrami za izračunata

i eksperimentalno određena 1H i 13C hemijska pomeranja za estre 1-3. Na osnovu njih se može

zaključiti da pomenute vrednosti odlično korelišu: koeficijenti korelacije su u većini slučajeva

viši od 0,95. Ipak,bez obzira na visoki koeficijent korelacije, izračunate vrednosti za hemijska

pomeranja je potrebno skalirati kako bi standardna greška (RMSE) bila niža (za svaku od

korelacija, vrednost RMSE izračunata nakon skaliranja data je na samom grafiku). Vrednosti

za RMSE su relativno niske (uglavnom su niže od 0,1 ppm za 1H, i oko 4 ppm za 13C

pomeranja). Interesantno je da su u slučaju protonskih pomeranja bolji rezultati dobijeni onda

kada su uzimani u obzir efekti rastvarača. Suprotno važi za pomeranja 13C.

Čini se da se i nivo slaganja između izračunatih (konformeri K1 i K2) i

eksperimentalnih vrednosti za hemijska pomeranja može iskoristiti kao dodatna potvrda da je

konformer K1 dominantna geometrija za 2 i 3. Za oba estra je vrednost koeficijenta korelacije

34

viša, a vrednost RMSE niža za K1 nego za K2. Na primer, u slučaju formijata standardna greška

je oko dva puta veća za K2 (slika 4-21), bez obzira na to da li su efekti rastvarača uzeti u obzir.

1,13C NMR 1-R,13C NMR

1,13H NMR 1-R,13H NMR

Slika 4-20. Linearna korelacija između eksperimentalnih (y; određene pomoću HiFSA analize) i proračunatih (x;

PW04 funkcional, aug-cc-pVDZ basis set) vrednosti za pomeranja u 1H i 13C NMR spektrima endo-fenhola

(1); slučajevi kada je uticaj rastvarača uključen u proračun obeleženi su sa R (1-R);

RMSE = standardna greška, R2 = koeficijent korelacije

Tabela 4-4. Vrednosti H-H homonuklearnih skalarnih konstanti kuplovanja (Hz) za endo-fenhol (1)

J (Hz) Eksperimentalna

vrednosta

Proračunata

vrednostb 2J H-5endo, H-5exo -12,8 -13,9 2J H-6exo, H-6endo -12,8 -13,7 2J H-7syn, H-7anti -10,1 -11,4 3J H-4, H-5exo 4,0 3,4 3J H-4, H-7syn 1,8 1,3 3J H-4, H-7anti 1,6 1,4 3J H-5endo, H-6endo 9,4 6,5 3J H-5endo, H-6exo 3,6 2,2 3J H-5exo, H-6exo 12,2 8,6 3J H-5exo, H-6endo 6,2 3,9 4JH-2, H-6exo

c 1,8 0,6 4J H-5endo, H-7syn

c 2,5 1,3 4J H-6endo, H-7syn

c 2,1 1,0 a Eksperimentalne vrednosti konstanti kuplovanja određene su pomoću HiFSA analize; b Homonuklearne H-H skalarne konstante kuplovanja (J) su proračunate korišćenjem WP04

funkcionala i aug-cc-pVDZ basis seta; c W-konstante kuplovanja.

y = 0,892x - 1,701R² = 0,973

RMSE = 3,02

0

20

40

60

80

100

0 20 40 60 80 100

y = 0,878x - 1,113R² = 0,955

RMSE = 3,92

0

20

40

60

80

100

0 20 40 60 80 100

y = 0,831x + 0,043R² = 0,898

RMSE = 0,19

0

1

2

3

4

0 1 2 3 4

y = 0,865x - 0,065R² = 0,975

RMSE = 0,09

0

1

2

3

4

0 1 2 3 4

35

2-K1,13C NMR 2-K1-R,13C NMR

2-K1,1H NMR 2-K1-R,1H NMR




PW04 funkcional, aug-cc-pVDZ basis set) vrednosti za pomeranja u 1H i 13C NMR spektrima endo-fenhil-

formijata (2; konformeri K1 i K2); slučajevi kada je uticaj rastvarača uključen u proračun obeleženi su sa

R (npr. 2-K1-R); RMSE = standardna greška, R2 = koeficijent korelacije

Naporedo sa korelacijom između izračunatih i eksperimentalnih vrednosti hemijskih

pomeranja razmatrano je da li se i odgovarajuće vrednosti za konstante kuplovanja mogu

iskoristiti za određivanje dominantnog konformera u rastvoru za jedinjenja 2 i 3. Izračunate i

eksperimentalne vrednosti H-H homonuklearnih skalarnih konstanti kuplovanja za endo-

fenhol, endo-fenhil-formijat i endo-fenhil-acetat sumirane su u tabelama 4-4 i 4-5. I u ovom

y = 0,957x - 4,411R² = 0,991

RMSE = 3,62

0

50

100

150

200

0 50 100 150 200

y = 0,941x - 4,014R² = 0,988

RMSE = 4,21

0

50

100

150

200

0 50 100 150 200

y = 0,955x - 0,231R² = 0,998

RMSE = 0,08

0

2

4

6

8

10

0 2 4 6 8 10

y = 0,947x - 0,241R² = 0,998

RMSE = 0,08

0

2

4

6

8

10

0 2 4 6 8 10

y = 0,952x - 4,550R² = 0,989

RMSE = 4,00

0

50

100

150

200

0 50 100 150 200

y = 0,923x - 3,723R² = 0,986

RMSE = 4,66

0

50

100

150

200

0 50 100 150 200

y = 1,012x - 0,290R² = 0,989

RMSE = 0,20

0

2

4

6

8

10

0 2 4 6 8 10

y = 0,999x - 0,309R² = 0,994

RMSE = 0,15

0

2

4

6

8

10

0 2 4 6 8 10

36

slučaju postoji odlično slaganje između proračuna i eksperimenta. Odgovarajući koeficijenti

korelacije su bili sledeći: 0,9878 (1), 0,981 (2, K1), 0,968 (2, K2), 0,982 (3, K1), i 0,983 (3,

K2).






PW04 funkcional, aug-cc-pVDZ basis set) vrednosti za pomeranja u 1H i 13C NMR spektrima endo-fenhil-

acetata (3; konformeri K1 i K2); slučajevi kada je uticaj rastvarača uključen u proračun obeleženi su sa R

(npr. 3-K1-R); RMSE = standardna greška, R2 = koeficijent korelacije

y = 0,945x - 3,647R² = 0,993

RMSE = 3,39

0

50

100

150

200

0 50 100 150 200

y = 0,929x - 3,122R² = 0,991

RMSE = 3,89

0

50

100

150

200

0 50 100 150 200

y = 0,914x - 0,177R² = 0,987

RMSE = 0,10

0

1

2

3

4

5

0 2 4 6

y = 0,925x - 0,207R² = 0,995

RMSE = 0,06

0

1

2

3

4

5

0 2 4 6

y = 0,954x - 4,447R² = 0,990

RMSE = 4,07

0

50

100

150

200

0 50 100 150 200

y = 0,925x - 3,780R² = 0,986

RMSE = 4,82

0

50

100

150

200

0 50 100 150 200

y = 1,119x - 0,511R² = 0,970

RMSE = 0,15

0

1

2

3

4

5

0 1 2 3 4 5

y = 1,082x - 0,499R² = 0,990

RMSE = 0,08

0

1

2

3

4

5

0 1 2 3 4 5

37

Tabela 4-5.Vrednosti H-H homonuklearnih skalarnih konstanti kuplovanja (Hz) za endo-fenhil-formijat (2) i

endo-fenhil-acetat (3)

J (Hz) Eksperimentalna

vrednosta

Proračunata

vrednost

(K1)b,c

Proračunata

vrednost

(K2)b,c

endo-Fenhil-formijat

2J H-5endo, H-5exo -12,6 -14,0 -14,1 2J H-6exo, H-6endo -12,4 -14,0 -14,1 2J H-7syn, H-7anti -10,2 -11,5 -11,5 3J H-2, H-1' -1,0 -1,6 0,8 3J H-4, H-5exo 3,8 3,4 3,4 3J H-4, H-7syn 1,6 1,3 1,3 3J H-4, H-7anti 1,6 1,4 1,4 3J H-5exo, H-6exo 12,6 8,7 8,7 3J H-5exo, H-6endo 5,8 3,9 3,9 3J H-5endo, H-6exo 3,6 2,2 2,2 3J H-5endo, H-6endo 9,4 6,5 6,5 4J H-2, H-6exo

d 2,1 0,9 0,9 4J H-4, H-6exo

d -0,3 -0,3 -0,3 4J H-5endo, H-7syn

d 2,5 1,3 1,3 4J H-6endo, H-7syn

d 2,3 1,1 1,1

endo-Fenhil-acetat 2J H-5endo, H-5exo -13,0 -14,0 -14,0 2J H-6exo, H-6endo -12,5 -13,9 -14,0 2J H-7syn, H-7anti -10,3 -11,4 -11,4 3J H-4, H-5exo 3,7 3,4 3,4 3J H-4, H-7syn 2,3 1,3 1,3 3J H-4, H-7anti 1,8 1,4 1,4 3J H-5exo, H-6exo 13,0 8,7 8,8 3J H-5exo, H-6endo 5,8 3,8 3,9 3J H-5endo, H-6exo 3,5 2,3 2,3 3J H-5endo, H-6endo 8,7 6,5 6,5 4J H-2, H-6exo

d 2,1 0,9 0,7 4J H-4, H-6exo

d -0,3 -0,3 -0,3 4J H-5endo, H-7syn

d 2,1 1,3 1,3 4J H-6endo, H-7syn

d 1,8 1,1 1,1 a Eksperimentalne vrednosti konstanti kuplovanja određene su pomoću HiPSA analize; b Konstante

kuplovanja su proračunate korišćenjem WP04 funkcionala i aug-cc-pVDZ basis seta; c Konformeri K1 i

K2 se odnose na geometrije (energetski minimumi) optimizovane korišćenjem B3LYP funkcionala i

6-31G basis seta i date na slikama 4-8 i 4-9; d W-konstante kuplovanja

Na osnovu vrednosti J ne može se napraviti razlika između dva konformera endo-

fenhil-acetata (izračunate vrednosti su gotovo jednake i jednako odstupaju od eksperimentalno

određenih). Nasuprot tome, čini se da rezultati dobijeni za endo-fenhil-formijat mogu da se

iskoriste kao potvrda da je dominantan konformer ovog jedinjenja K1. Konkretno, vrednosti

za 3J H-2, H-1' (vicinalna konstanta kuplovanja između H-2 i H-1’) za K1 i K2 su -1,6 i +0,8 Hz;

eksperimentalna vrednost je -1,0 Hz (ne čudi onda što je i odgovarajući koeficijent korelacije

za K2 nešto manji od onog za K1).

38

5. Zaključak

39

U ovom radu je opisana sinteza (Šteglihova esterifikacija) biblioteke od 12 endo-fenhil-

estara sledećih karboksilnih kiselina: mravlje, sirćetne, propanske, butanske,

izobutanske, pentanske, 2-metilbutanske, heksanske, heptanske, oktanske, tiglinske i

benzoeve (neka od njih su nova jedinjenja).

Dobijeni estri su analizirani pomoću GC/MS i 1D i 2D NMR metoda, zahvaljujući

čemu su upotpunjeni šturi literaturni podaci vezani za derivate industijski važnog endo-

fenhola (kozmetička industrija).

DFT molekulsko modelovanje, u kombinaciji sa 2D NMR eksperimentima i potpunom

spinskom analizom 1H NMR spektara (modifikovana HiFSA metoda) dalo je uvid u

konformacioni prostor endo-fenhil-estara.

Za svako jedinjenje, nađena su po dva energetska minimuma sa različitim

orijentacijama C=O u odnosu na metilensku grupu mosta i potvrđeno je da je i u slučaju

estara sterno zahtevnog endo-fenhola stabilnija ona konformacija kod koje je povoljnija

interakcija nevezivnog elektronskog para sa kiseonika i * orbitale C=O.

Po prvi put je pokazano da bi kombinovani HiFSA – GIAO pristup mogao da se

primenjuje i u konformacionoj analizi.

40

6. Literatura

41

Baker, K. M., Davis, B. R., Tetrahedron (1968), 24, No. 4, 1663.

Belsito, D., Bickers, D., Bruze, M., Calow, P., Greim, H., Hanifin, J. M., Rogers, A. E.,

Saurat, J. H., Sipes, I. G., Tagami, H., Food Chem. Toxicol. (2008), 46, S1.

Benabdelkader, T., Guitton, Y., Pasquier, B., Magnard, J. L., Jullien, F., Kameli, A.,

Legendre, L., Physiol. Plantarum (2015), 153, 43.

Bhatia, S. P., McGinty, D., Letizia, C. S., Api, A. M., Food Chem. Toxicol. (2008), 46,

S157.

Bohlmann F., Zeisberg R., Klein E., Org. magn. resonance (1975), 7, 426.

Callehon, R. M., Ubeda, C., Rios-Reina, R., Moarles, M. L., Troncoso, A. M., J.

Chromatogr. A (2015, in press).

Croteau, R., Satterwhite, D. M., Wheeler, C. J., Felton, N. M., J. Biol. Chem. (1988), 263,

No. 30, 15449.

De March, C. A., Ryu, S. E., Sicard, G., Moon, C., Golebiowski, J., Flavour Fragr. J.

(2015), 30, 342.

De March, C.A., Golebiowski, J., Biochimie (2014), 107, 1.

Dong, S.-H., Nikolić, D., Simmler, C., Qui, F., van Breemen, R. B., Soejarto, D. D.,

Pauli, G. F., Chen, S.-N., J. Nat. Prod. (2012), 75, 2168.

Gaussian 09, Revision D.01, Frisch, M. J., Trucks, G. W., Schlegel, H. B., Scuseria,

G. E., Robb, M. A., Cheeseman, J. R., Scalmani, G., Barone, V., Mennucci, B.,

Petersson, G. A., Nakatsuji, H., Caricato, M., Li X., Hratchian, H. P., Izmaylov, A. F.,

Bloino, J., Zheng, G., Sonnenberg, J. L., Hada, M., Ehara, M., Toyota, K., Fukuda, R.,

Hasegawa, J., Ishida, M., Nakajima, T., Honda, Y., Kitao, O., Nakai, H., Vreven, T.,

Montgomery, Jr. J. A., Peralta, J. E., Ogliaro, F., Bearpark, M., Heyd, J. J., Brothers,

E., Kudin, K. N., Staroverov, V. N., Keith, T., Kobayashi, R., Normand, J.,

Raghavachari, K., Rendell, A., Burant, J. C., Iyengar, S. S., Tomasi, J., Cossi, M.,

Rega, N., Millam, J. M., Klene, M., Knox, J. E., Cross, J. B., Bakken, V., Adamo, C.,

Jaramillo, J., Gomperts, R., Stratmann, R. E., Yazyev, O., Austin, A. J., Cammi, R.,

Pomelli, C., Ochterski, J. W., Martin, R. L., Morokuma, K., Zakrzewski, V. G., Voth,

G. A., Salvador, P., Dannenberg, J. J., Dapprich, S., Daniels, A. D., Farkas, O.,

Foresman, J. B., Ortiz, J. V., Cioslowski, J., Fox, D. J., Gaussian, Inc., Wallingford

CT, (2013).

Jain, R., Bally, T., Rablen, P. R., J. Org. Chem. (2009), 74, 4017.

Jones, G. I. L., Owen, N. L., J. Mol. Struct. (1973), 18, 1.

Kenyon, J., Priston, H. W. M., J. Chem. Soc. (1925), 127, 1472.

Kumari, S., Pundhir, S., Priya, P., Jeena, G., Punetha, A., Chawla, K., Jafaree, Z., Mondal,

S., Yaldav, G., EssOilDB (2014).

42

Launay G., Teletchea S. Wade F., Pajot-Augy E., Gibrat J. F., Sanz G., Protein Eng. Des.

Sel. (2012), 8, 377.

Liu, K.-T., Jnl. Chinese Chemical Soc. (1976), 23, 1.

Napolitano, J. G., Godecke, T., Rodriguez-Brasco, M. F., Jaki, B. U., Chen, S.-N.,

Lankin, D. C., Pauli, G. F., J. Nat. Prod. (2012), 75, 238.

Napolitano, J. G., Lankin, D. C., Chen, S.-N., Pauli, G. F., Magn. Reson. Chem. (2012),

50, 569.

Napolitano, J. G., Lankin, D. C., Graf, T. N., Friesen, B. J., Chen, S.-N., McAlpine, J.

B., Oberlies, N. H., Pauli, G. F., J. Org. Chem. (2013), 78, 2827.

Napolitano, J. G., Lankin, D. C., McAlpine, J. B., Niemitz, M., Korhonen, S.-P., Chen, S.-

N., Pauli, G. F., J. Org. Chem. (2013), 78, 9963.

Napolitano, J. G., Simmler, C., McAlpine, J. B., Lankin, D. C., Chen, S.-N., Pauli, G.

F., J. Nat. Prod. (2015), 78, 658.

Neises, B., Steglich, W., Angew. Chem. Int. Ed. (1978), 17, 522.

Pauli, G. F., Chen, S.-N., Lankin, D. C., Bisson, J., Case, R. J., Chadwick, L. R., Goodecke,

T., Inui, T., Krunić, A., Jaki, B. U., McAlpine, J. B., Mo, S., Napolitano, J. G., Orjala, J.,

Lehtivarjo, J., Korhonen, S.-P., Niemitz, M., J. Nat. Prod. (2014), 77, 1473−1487.

Radulović, N., Dekić, M., Ranđelović, P., Stojanović, N., Zarubica, A., Stojanović-Radić,

Z., Food Chem. Toxicol. (2012), 50, 2016.

Radulović, N., Mladenović, M., Ranđelović, P., Stojanović, N., Dekić, M., Blagojević, P.,

Food Chem. Toxicol. (2015), 80, 114.

Radulović, N., Zlatković, D., Ranđelović, P., Stojanović, N., Novaković, S., Akhlaghi, H.,

Food Funct. (2013), 4, 1751.

Reich, H. J., J. Chem. Ed. Software (1996), 3D, 2.

Riihinen, K. R., Mihaleva, V. V., Godecke, T., Soininen, P., Laatikainen, R., Vervoort,

J. M., Lankin, D. C., Pauli, G. F., Phytochem. Anal. (2013), 24, 476.

San Fabian, J., García de la Vega, J. M., San Fabian, E., J. Chem. Theory Comput. (2014),

10, 4938.

Sanner, M. F., J. Mol. Graphics Mod. (1999), 17, 57.

Trott, O., Olson, A. J., J. Comput. Chem., (2010), 31, 455.

Yildirim, E., Emsen, B., Kordali, S., J. Appl. Bot. Food Qual. (2013), 86, 198.

www.organic-chemistry.org (2002-2015).

43

www.sigmaaldrich.com.

Master rad - pmf.ni.ac.rs · Eksperimentalni deo ovog master rada rađen je u Laboratoriji za...

Documents

Transcript of Master rad - pmf.ni.ac.rs · Eksperimentalni deo ovog master rada rađen je u Laboratoriji za...