Univerzitet u Nišu

Prirodno-matematički fakultet

Departman za hemiju

Kinetika ekstrakcije fenolnih jedinjenja iz biljnog

materijala

Master rad

Mentor

Prof. dr Snežana Mitić

Kandidat

Sonja Janković

Niš, 2017. god

1

ПРИРОДНO - MАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ

НИШ

КЉУЧНА ДОКУМЕНТАЦИЈСКА ИНФОРМАЦИЈА

Редни број, РБР: /

Идентификациони број, ИБР: /

Тип документације, ТД: Монографска

Тип записа, ТЗ: текстуални / графички

Врста рада, ВР: мастер рад

Аутор, АУ: Соња Јанковић

Ментор, МН: Снежана Митић

Наслов рада, НР: Кинетика екстракције фенолних једињења из биљног материјала

Језик публикације, ЈП: Српски

Језик извода, ЈИ: Енглески

Земља публиковања, ЗП: Р. Србија

Уже географско подручје, УГП: Р. Србија

Година, ГО: 2016.

Издавач, ИЗ: ауторски репринт

Место и адреса, МА: Ниш, Вишеградска 33

Физички опис рада, ФО: (поглавља/страна/ цитата/табела/слика/графика/прилога)

62 стр., 6 поглавља, 30 слика, 11 табеле, 40 референце

Научна област, НО: Хемија

Научна дисциплина, НД: Аналитичка хемија

Предметна одредница/Кључне речи, ПО: UV/Vis спектрофотометрија, феноли, флавоноиди, екстракција, липа

УДК 66.061.3 : (581.1 + 547.56)

Чува се, ЧУ: Библиотека

Важна напомена, ВН: /

Извод, ИЗ: Испитивани су оптимални услови екстракције фенолних једињења из цвета

липе поступком мацерације при различитим оперативним условима

(концентрације воденог раствора етанола, хидромодула, времена и температуре

екстракције). За моделовање кинетике екстракције фенолних једињења

коришћена су три модела: модел заснован на теорији нестационарне дифузије

кроз чврст материјал, емпиријски модел Пономарјева и модел заснован на

теорији филма. Најпогоднији модел за описивање кинетике екстракције је

модел заснован на теорији филма.

Датум прихватања теме, ДП: 15. 01. 2015.

Датум одбране, ДО:

др Снежана Митић

Чланови комисије, КО: Председник:

Члан:

Члан, ментор:

Образац Q4.09.13 - Издање 1

2

ПРИРОДНО - МАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ

НИШ

KEY WORDS DOCUMENTATION

Accession number, ANO: /

Identification number, INO: /

Document type, DT: Monograph

Type of record, TR: textual / graphic

Contents code, CC: university degree thesis

Author, AU: Sonja Janković

Mentor, MN: Snežana Mitić

Title, TI: The kinetics of the extraction of phenolic compounds from plant materials

Language of text, LT: Serbian

Language of abstract, LA: English

Country of publication, CP: Republic of Serbia

Locality of publication, LP: Serbia

Publication year, PY: 2016.

Publisher, PB: author’s reprint

Publication place, PP: Niš, Višegradska 33

Physical description, PD: (chapters/pages/ref./tables/pictures/graphs/appendixes)

62 p., 30 figures, 11 tables, 6 chapters, 40 references

Scientific field, SF: Chemistry

Scientific discipline, SD: Analytical Chemistry

Subject/Key words, S/KW: UV/Vis spectrophotometry, phenols, flavonoids, extracion, tillia

UC 66.061.3 : (581.1 + 547.56)

Holding data, HD: Library

Note, N: /

Abstract, AB: The extraction and the efficiency of extraction of phenolic compounds of flower

Tillia L. by maceration at various operating conditions (concentration of the aqueous

solution of ethanol, hydromoduls, time and temperature of extraction) were

examined. For modeling the kinetic of the extraction phenolic compounds three

models were used: the model based on the theory of non-stationary diffusion through

solids material, the empirical model of Ponomarev and yje model based on the film

theory. The most suitable model for describing the kinetics of the extraction was the

one based on the film theory.

Accepted by the Scientific Board on, ASB: 15. 01. 2015.

Defended on, DE:

Defended Board, DB: President:

Member:

Member, Mentor: dr Snežana Mitić

Образац Q4.09.13 - Издање 1

3

Eksperimentalni deo ovog master rada rađen je u Laboratoriji za analitičku i fizičku

hemiju (Departman za hemiju, Prirodno-matematički fakultet, Univerzitet u Nišu).

Izradom ovog master rada rukovodila je dr Snežana Mitić, redovni professor PMF-a u

Nišu, kojoj se srdačno zahvaljujem na uloženom trudu, stručnoj pomoći, strpljenju i podršci

tokom izrade i pisanja rada.

Zahvalnost dugujem i dr Dušanu Paunoviću na ukazanoj pomoći i korisnim savetima pri

izradi eksperimentalnog dela rada.

Na kraju, veliku zahvalnost dugujem svojoj majci i prijateljima na pruženoj ljubavi,

podršci i motivaciji tokom studiranja.

4

Sadržaj

1. UVOD ...................................................................................................................................... 6

2. TEORIJSKI DEO .................................................................................................................... 9

2.1. Lipa................................................................................................................................. 10

2.1.1. Lekoviti deo biljke ............................................................................................................... 11

2.1.2. Droga ................................................................................................................................... 11

2.1.3. Hemijski sastav .................................................................................................................... 12

2.2. Fenoli i fenolna jedinjenja .............................................................................................. 12

2.2.1. Flavonoidi ............................................................................................................................ 16

2.2.2. Flavoni ................................................................................................................................. 18

2.2.3. Flavanoni ............................................................................................................................. 18

2.2.4. Antocijani ............................................................................................................................ 19

2.2.5. Flavonoli .............................................................................................................................. 20

2.2.6. Katehini ............................................................................................................................... 21

2.2.7. Fenolne kiseline .................................................................................................................. 21

2.3. Ekstrakcija ...................................................................................................................... 23

2.3.1. Ekstrakcija čvrsto-tečno ...................................................................................................... 23

2.3.2. Matematički modeli procesa ekstrakcije ............................................................................ 26

2.3.2.1. Model zasnovan na nestacionarnoj difuziji kroz biljni materijal ................................ 27

2.3.2.2. Model zasnovan na teoriji filma .................................................................................. 28

2.3.2.3. Empirijski model Ponomarjeva ................................................................................... 29

2.4. UV/VIS spektrofotometrija ............................................................................................ 29

2.4.1. Snimanje UV/VIS spektara .................................................................................................. 32

3. EKSPERIMENTALNI DEO ................................................................................................. 35

3.1. Biljna sirovina ................................................................................................................ 36

3.2. Reagensi ......................................................................................................................... 36

3.3. Ekstrakcija iz biljne sirovine .......................................................................................... 36

3.3.1. Inicijalni sadržaj polifenolnih jedinjenja u cvetu lipe (q0) ................................................... 36

3.3.2. Sadržaj polifenolnih jedinjenja u zasićenim tečnim ekstraktima cveta lipe (CS) ................. 37

5

3.4. Aparati ............................................................................................................................ 37

3.5. Metode ............................................................................................................................ 38

3.5.1. Određivanje sadržaja ukupnih fenola ................................................................................. 38

3.5.2. Određivanje sadržaja ukupnih flavonoida .......................................................................... 39

3.6. Statistička obrada podataka ............................................................................................ 41

4. REZULTATI I DISKUSIJA .................................................................................................. 42

4.1. Optimizacija procesa ekstrakcije .................................................................................... 43

4.1.1. Uticaj koncentracije rastvarača na sadržaj ukupnih fenola i flavonoida iz cveta lipe ......... 44

4.1.2. Uticaj solvomodula na sadržaj ukupnih fenola i flavonoida iz cveta lipe............................ 45

4.1.3. Uticaj temperature i vremena ekstrakcija na sadržaj ukupnih fenola i flavonoida iz cveta

lipe……………… ...................................................................................................................................... 46

4.2. Modelovanje kinetika ekstrakcije ukupnih fenola i flavonoida iz cveta lipe ................. 49

4.2.1. Model zasnovan na nestacionarnoj difuziji ......................................................................... 49

4.2.2. Model zasnovan na teoriji filma .......................................................................................... 51

4.2.3. Empirijski model Ponomarjeva ........................................................................................... 52

4.2.4. Poređenje modela ............................................................................................................... 54

5. ZAKLJUČAK ........................................................................................................................ 56

6. LITERATURA ...................................................................................................................... 58

6

1. UVOD

7

Povezanost čoveka i biljaka datira još od davnina. Čovek je biljke prvenstveno koristio u

ishrani, a kasnije i u lečenju. Kroz istoriju čovečanstva, biljke su dobijale sve veći značaj kao

izvor biološki aktivnih supstanci i lekova. Broj cvetnica koje su do danas hemijski ispitane čini

samo 10%, od ukupno 250.000 vrsta na planeti, zbog čega se može zaključiti da biljni svet i dalje

predstavlja nepresušan i još nedovoljno istražen resurs biološki i farmakološki aktivnih

jedinjenja.

Lipa (Tilia sp.) je višegodišnje listopadno drvo koje raste u severnoj umerenoj zoni.

Raste pojedinačno po planinama, a ljudi je sade veoma često uz puteve i u parkovima. Lipa je

sveto drvo Starih Slovena za koje su oni verovali da ih čuva od zla, uroka, gromova i požara.

Ovo drvo, poznato je i kao lipac i lipolist. Oduvek se koristila za čaj u narodnoj medicini za

brojne tegobe i bolesti. Cvet ima dosta polena i bitan je izvor za ishranu pčela.

Lipov cvet obiluje vitaminom C, mineralima, sadrži sluz, tanin, etarska ulja, heterozide,

šećer, gumu, vosak, manitol i tartarat, dok je lišće izuzetno bogato kalcijumom. Zato se opalo

lišće brzo razlaže i popravlja plodnosti zemljišta.

Fenolna jedinjenja su velika i raznovrsna grupa molekula koji postoje kao sekundarni

metaboliti sa aromatičnim prstenom u biljkama. Poznato je više od 8000 fenolnih jedinjenja, koja

se po svojoj strukturi veoma razlikuju, od jednostavnih molekula, kao što su fenolne kiseline do

visoko kondenzovanih jedinjenja kao što su tanini. Mogu se klasifikovati u grupu nerastvornih

(tanini, lignini, kiseline vezane za ćelijsku membranu biljaka) i rastvornih (fenolne kiseline,

fenilpropanoidi, flavonoidi i hinoni) jedinjenja.

Flavonoidi sadrže podgrupe kao što su flavoni, izoflavoni, flavanoni, antocijani, halkoni i

kondenzovani tanini. Ova jedinjenja sastoje se od tri aromatična prstena. Većina aglikona

flavonoida pronađena je u glikozilovanom obliku u biljnim ćelijama, i predpostavlja se štite

ćelije od degradacije, smanjuju njihovu toksičnost i omogućavaju međućelijski transport.

Ekstrakcija predstavlja izdvajanje i koncentrovanje određenih sastojaka iz biljnih i

životinjskih tkiva pomoću selektivnih rastvarača. Ekstrakti se po konzistenciji klasifikuju kao

tečni, čvrsti i polučvrsti. Metode ekstrakcije koje se najčešće primenjuju su: maceracija,

dvostruka maceracija, digestija, turboekstrakcija, perkolacija, reperkolacija, ultrazvučna,

protivstrujna ekstrakcija i cirkulatorna ekstrakcija.

Iako je cvet lipe veoma atraktivna lekovita biljka za savremenu medicinu i farmaciju,

kinetika ekstrakcije fenolnih jedinjenja iz cveta lipe nije podvrgnuta sistematskom proučavanju.

U ovom radu je ispitavana kinetika i efikasnost ekstrakcije ukupnih fenola i flavonoida

postupkom maceracije pri različitim operativnim uslovima (koncentracija vodenog rastvora

etanola, hidromodul, vreme i temperatura). Kao rastvarač, korišćeni su vodeni rastvori etanola

koncentracije 0, 30, 50 70 i 100 % vol., pri hidromodulu 1:30 i 1:40 1:50 i 1:60 i na

8

temperaturama 25, 35 i 45 oC. Za modelovanje kinetike ekstrakcije čvrsto-tečno korišćeni su:

model zasnovan na teoriji filma, model zasnovan na teoriji nestacionarne difuzije kroz čvrst

materijal i empirijski model Ponomarjeva.

Osnovni cilj ovog rada je da se, na primeru ekstrakcije ukupnih fenola i flavonoida iz

cveta lipe postupkom maceracije, izvrši analiza mehanizma, modela kinetike i efikasnosti

ekstrakcije čvrsto-tečno, koja će za rezultat imati izbor optimalnog modela kinetike i optimalnih

uslova ekstrakcije čvrsto-tečno. Sadržaj ukupnih fenola i flavonoida određen je apsorpcionom

UV/VIS spektrofotometrijom po metodi Folin-Ciocalteu za fenole, tj primenom AlCl3 reagensa

za određivanje flavonoida.

9

2. TEORIJSKI DEO

10

2.1. Lipa

Lipa je veliko drvo čije stablo doseže visinu od 25 do 30 metara, a starost do nekoliko

stotina godina. Krošnja je gusto zatvorena, a listovi zagasito-zeleni, koso srcasti, zašiljeni, a s

lica dlakavi. Cvetovi su na dugačkoj dršci koja je, otprilike, do polovine srasla sa pricvetnim

listom, a složeni su u paštitaste cvatove. Pricvetni listovi su duguljasti, bledozelene boje, dugački

i mrežasto isprepleteni žilicama. Plodovi su mali oraščići. Lipov cvet je blagog i prijatnog mirisa,

a ukusa je sluzastog, sladunjavog i pomalo oporog (slika 1). Raste po celoj Evropi po brdskim

šumama. Lipa voli plodnu i duboku zemlju. Lipu treba brati čim počne cvetati, kad su se dve

trećine cvetova u cvasti rascvetale. Precvetala lipa nema nikakve vrednosti.

Slika 1. Cvet lipe

Tabela 1. Sistematika lipe

Carstvo Plantae – Biljke

Divizija Magnoliophyta

Razred Magnoliopsida

Red Malvales

Porodica Tiliaceae

Rod Tilia

11

U našim krajevima rastu bela ili srebrna lipa (Tilia tomentosa), krupnolisna lipa (Tilia

platyphyllos) i sitnolisna lipa (Tilia cordata). Lipa raste pojedinačno po planinama, a ljudi je

sade veoma često uz puteve ili kao dekorativnu vrstu po parkovima.

2.1.1. Lekoviti deo biljke

Za lek se bere cvet sa pricvetnim listovima (ako je lepe zelene boje, bez rđe). Inače se

beru samo cvetovi u vreme kada su se otvorili i pre nego što ostare i promene boju. Suše se u

hladu, na prozračnom mestu. Sabrani cvetovi sušenjem moraju zadržati svoju prirodnu boju i

ugodan miris.

Lipovi cvetovi koriste se za lečenje prehlade i bolesti disajnih organa. Lipov cvet se

upotrebljava najčešće u obliku čaja, infuza, za znojenje, protiv grčeva i za umirivanje bolova kao

vrlo blago sredstvo. Koristi se i protiv hroničnog kašlja i proliva, kao i za zaceljivanje opekotina

i rana. Preporučuje se u lečenju bolova kod mokrenja, umora i preuzbuđenosti živaca. Čisti krv.

Koristi se i drvo lipe (Tiliae lugnum) kod problema sa lučenjem žuči, ali i spolja u kozmetičkim

preparatima za otklanjanje celulita.

2.1.2. Droga

Koristi se osušena cvast lipe sa priperkom. Cvast treba brati zajedno s priperkom (Flos

Tlliae cum bractes), jer se vrlo retko traži bez priperka. Treba brati po suvom i lepom vremenu.

Suši se pažljivo na promajnom mestu ili u blago zagrejanim sušarama. Cvetovi su petočlani,

svetložute krunice. 2-5 cvetova je sraslo u cvast, koja je do pola srasla sa priperkom. Priperak je

jezičast, kožast, mrežaste nervature, zelenožute boje (slika 2). Droga je sluzavog i slatkog ukusa,

veoma prijatnog, intenzivnog mirisa.

12

Slika 2. Cvet osušene lipe

2.1.3. Hemijski sastav

Cvet lipe sadrži 1 % kompleksa flavonoidnih heterozida u kome dominiraju heterozidi

kvercetina i kemferola (rutin, kvercitin, hiperozid, astragalin, tilirozid je estar sa p-kumarnom

kiselinom). Preko 3 % heterozida kafene, p-kumarne i hlorogenske kiseline, 10 % služi

(arabinogalaktani). Prijatan miris potiče od male količine etarskog ulja (0,02 %); monoterpeni i

alkani su osnovni sastojci etarskog ulja.

2.2. Fenoli i fenolna jedinjenja

Fenolna jedinjenja su veoma rasprostranjeni proizvodi sekundarnog metabolizma biljaka

i antioksidativno delovanje biljnih ekstrakata uglavnom se vezuje za njihovo prisustvo. Poznato

je više od 8000 fenolnih jedinjenja, koja se po svojoj strukturi veoma razlikuju, od jednostavnih

molekula kao što su fenolne kiseline do visoko polikondenzovanih jedinjenja kao što su tanini.

Fenolna jedinjenja ili polifenoli, u svojoj strukturi sadrže aromatični prsten sa jednom ili više

hidroksilnih grupa (slika 3).

13

Slika 3. Fenol

U literaturi postoje različite klasifikacije fenolnih jedinjenja, po jednoj ova jedinjenja se

svrstavaju u sledeće grupe:

1. Prosti fenoli

- fenolne kiseline

- kumarini

2. Polifenoli

- flavonoidi

- tanini

Najčešća klasifikacija se zasniva na broju ugljenikovih atoma vezanih za osnovni skelet fenola,

(Robards i sar., 1999), što je prikazano u tabeli 2.

14

Tabela 2. Klasifikacija fenolnih jedinjenja

Osnovni Klasa Primer Skelet

C6 Jednostavni fenoli Katehol, hidrohinon, resorcinol Benzohinoni

C6-C1 Fenolne kiseline p-Hidroksibenzoeva kiselina, salicilna

Kiselina C6-C2 Fenilsirćetne p-Hidroksifenilsirćetna kiselina

Kiseline

C6-C3 Fenilpropeni Eugenol, mirsticin Kumarini Umbeliferon, eskuletin, skopolin Hromoni Eugenin

C6-C4 Naftohinoni Juglon C6-C1-C6 Ksantoni Mangostin, mangiferin C6-C2-C6 Stilbeni Razveratrol

Antrahinoni Emodin, hrizofanol, rein C6-C3-C6 Flavonoidi

Flavoni Sinensetin, nobiletin, izosinensitin, tangeretin,diosmin

Flavonoli Kvercetin, kempferol Flavonol glikozidi Rutin Flavanoli Dihidroksikvercetin i dihidroksikempferol glikoizdi

Flavanoni Hesperidin, naringenin Flavanon glikozidi Neohesperidin, narirutin, naringin,eriocitrin

Antocijanini Glikozidi pelargonidina, peonidina, delifinidina, petunidina, cijanidina Flavanoli (katehini) (+)-Katehin, (-)-epikatehin, (+)- galokatehin, (-)-epigalokatehin Halkoni Floridžin, arbutin, halkonaringenin

(C6-C3)2 Lignini Pinorezinol (C6-C3-C6)2 Biflavonoidi Agatisflavon

Antioksidativna aktivnost fenola se prepisuje njihovoj sposobnosti da budu donori

vodonikovih atoma i da kao takvi uklanjaju slobodne radikale uz formiranje manje reaktivnih

fenoksil radikala:

Ph-OH + ROO∙ → Ph-O

∙ + ROOH

Ar-OH + ·OH → H2O + ArO

∙

15

Fenoli imaju kiseo karakter. Pokazuju veću kiselost od alkohola, ali manju od

karboksilnih kiselina. Usled disocijacije hidroksilne grupe, nastaje fenoksidni jon, gde je

negativna šarža na kiseoniku stabilizovana solvatacijom i delokalizacijom unutar prstena

(slika 4).

Slika 4. Nastajanje fenoksidnog jona

Elektronska delokalizacija u fenoksidnom jonu se može predstaviti sledećim rezonantnim

strukturama (slika 5):

Slika 5. Rezonantne struktrure fenoksidnog jona

Negativna šarža je raspoređena između kiseonika i ugljenika unutar prstena u orto- i para-

položaju, što znatno stabilizuje fenoksidni jon.

Fenoli su slični alkoholima, ali grade jače vodonične veze. Zbog toga, rastvorljiviji su u

vodi i imaju veće tačke ključanja nego alkoholi.

Fenoli podležu reakcijama elektrofilne aromatične supstitucije, halogenovanju,

nitrovanju, Friedel-Crafts-ovom alkilovanju i acilovanju. Komercijalno su ekstrahovani iz

katrana u vodi kao rastvaraču, u vidu fenolatnog jona. Fenol i krezol se mogu koristiti kao

16

antibakterijsko sredstvo u prostorijama gde pare fenola nisu štetne. Fenol je toksičan, u toj meri

da se letalne doze fenola mogu apsorbovati kožom (Manahan, 2003).

Fenoli su prisutni u biljnoj hrani i odgovorni za organoleptičke karakteristike biljaka.

Antioksidativna aktivnost fenolnih jedinjenja je od velikog značaja u cilju prevencije bolesti kod

ljudi. Fenolna jedinjenja sa manjom molekulskom masom (timol) mogu se koristiti kao

antiseptici.

Fenoli su slabo reaktivna jedinjenja i obično grade vodonične veze. Druga njihova važna

osobina je da mogu da grade komplekse sa teškim metalima. Mogu se lako oksidovati i mogu

graditi polimere tamne boje. Tamnjenje biljnih delova je posledica ovih reakcija kojima podležu

fenolna jedinjenja.

Fenolna jedinjenja se veoma retko nalaze slobodna u biljnim ćelijama. Najčešće se

kupluju sa drugim molekulima, kao što su ostaci šećera (glikozidi), ostaci sumporne kiseline i

sirćetne kiseline.

Polifenolna jedinjenja u odnosu na antioksidativno delovanje su multifunkcionalna, što znači

da deluju kao redukujući agensi, skvenčeri singelton kiseonika, antioksidansi donori vodonika, a

imaju i osobine heliranja metala (Rice i sar., 1995). Da bi se polifenolna jedinjenja definisala kao

antioksidansi moraju da zadovoljavaju dva osnovna uslova: 1. Prvi uslov je da prisutni u malim

koncentracijama u substratu mogu da odlože, uspore ili spreče delovanje slobodnih radikala

(Halliwell i Gutteridge, 1990); 2. Drugi uslov je da novonastali radikal (radikal nastao nakon

delovanja antioksidansa) mora da bude stabilan (Shahidi i Wanasudara, 1992).

2.2.1. Flavonoidi

Flavonoidi su najzastupljenija grupa fenolnih jedinjenja u biljkama sa 15 atoma ugljenika u

osnovnoj C6-C3-C6 strukturi, od kojih devet pripada benzopiranskom prstenu (benzenski prsten A

kondenzovan sa piranskim prstenom C) a ostalih šest ugljenikovih atoma čine benzenski prsten

B povezan sa benzopiranskim prstenom na poziciji dva. Osnovni skelet flavonoida sa

obeležavanjem atoma dat je na slici 6.

Slika 6. Skelet flavonoida se može predstaviti kao C6-C3-C6 sistem

17

U prirodi se najčešće sreću jedinjenja sa hidroksilnim grupama u C-3’ i C-4’ položaju i

nešto manje sa jednom hidroksilnom grupom u položaju C-4’. Šećerna komponenta flavonoida je

najčešće vezana u položaju C-3 i ređe u položaju C-7. Kao šećerna komponenta najčešće se

javlja glukoza, a ređe galaktoza, ramnoza i ksiloza (Hermann, 1989).

Flavonoidi se u prirodi najčešće nalaze u u obliku monoglikozida, a ređe u obliku di i tri

glikozida. Flavonoidna jedinjenja su veoma značajni biljni pigmenti. Flavonoida i njihovi

glikozidi se znatno razlikuju po nijansama boja. Nalaze se u svim delovima biljaka. Ovako

nastali slobodni radikali su rezonantno stabilizovani i nemaju dovoljno energije da pokrenu

lančanu reakciju sa supstratom:

ROO∙ + Flavonoid-OH → ROOH + Flavonoid-O

∙

OH∙ + Flavonoid-OH → H2O + Flavonoid-O

∙

Kapacitet za “hvatanje” slobodnih radikala prvenstveno se prepisuje velikoj reaktivnosti

OH grupa u reakciji. Hidroksilne grupe predaju vodonikov atom radikalima, a flavonoidi prelaze

u slobodne radikale.

Flavonoidi učestvuju i u regulaciji i zaštiti antioksidativnih odbrana, a njihovo prisustvo

dovodi i do prekidanja slobodno radikalskih reakcija. Antioksidativna aktivnost flavonoida i

njihovih metabolita in vitro uslovljena je vrstom, brojem i raspodelom funkcionalnih grupa u

strukturi.

Flavonoidi se na osnovu oksidacionog stanja prstena C mogu podeliti na pet većih grupa:

flavoni, flavanoni, antocijani, flavonoli i katehini (slika 7).

Slika 7. Najzastupljenije klase flavonoida

18

2.2.2. Flavoni

Flavoni su najrasprostranjeniji žuti biljni pigmenti (žute boje tamnije nijanse potiču od

karotenoida). Flavoni koji se najčešće sreću u biljnom svetu su apigenin, luteolin i hrizin (slika

8).

Flavoni se razlikuju od flavonola po tome što nemaju OH-grupu u položaju 3. Retko se

nalaze kao slobodni, a češće u obliku glikozida. Do danas postoji oko 100 aglikona flavona.

Slika 8. Struktura najznačajnijih flavona

2.2.3. Flavanoni

Flavanoni su bezbojna ili slabo žuto obojena jedinjenja. Najpoznatiji su naringenin i

hesperetin (slika 9):

Slika 9. Struktura najznačajnijih flavanona

19

2.2.4. Antocijani

Antocijani (anthos-cveće, kyanos-plav) su klasa flavonoidnih jedinjenja koja

predstavljaju prave biljne pigmente. Prvi put su izolovani još 1835. godine. Mogu se naći u svim

delovima biljke, od cveta do korena, a osim što biljci daju obojenost, štite je i od prekomerne UV

svetlosti i od štetnog dejstva slobodnih radikala.

Svi antocijanidini imaju hidroksilnu grupu na položaju 3 C prstena, a većina antocijana su

penta- ili heksa-supstituisani, pri čemu se supstituenti (hidroksilna ili metoksi grupa) nalaze u

položajima 5 i 7 A prstena, i 3’, 4’ i 5’ B prstena. Na osnovu broja i položaja hidroksilnih grupa

u B prstenu razlikuju se tri osnovna jedinjenja antocijana: pelargonidin, cijanidin i delfinidin, a

metilovanjem ovih hidroksilnih grupa nastaju: peonidin, petunidin i malvidin. Sve je veći interes

za izolovanje i upotrebu antocijana, ne samo zbog toga što su oni netoksični prirodni pigmenti,

rastvorni u vodi i mogu zameniti sintetičke boje, već i zbog njihovih bioaktivnih osobina

(Tumbas, 2010). Ekstrakti bogati antocijanima su se koristili za lečenje hipertenzije, pireksije,

oboljenja jetre, dezenterije, dijareje, infekcija urinarnog trakta i kamena u bubregu (Wu, 2011).

Antocijani se najčešće javljaju u prirodi u obliku glikozida. Posle hlorofila, antocijani su

glavna grupa biljnih pigmenata koji su vidljivi za oko čoveka.

Najznačajniji antocijanidini su pelargonidin, cijanidin, peonidin, delfinidin, pelunidin i

malvidin. Njihove strukture su prikazane na slici 10.

Povećanje broja hidroksilnih grupa u molekulu void više ka plavoj boji

(pelargonidin→cijanidin→delfinidin), dok formiranje glikozida i metilovanje rezultira pojavom

crvene boje (pelargonidin→pelargonidin – 3 – glikozid, cijanidin→peonidin).

Jedna od karakteristika antocijana je što kiseonik u heterocikličnom prstenu može da ima

pozitivno naelektrisanje. Zahvaljujući ovoj osobini antocijani se u kiseloj sredini ponašaju kao

katjoni i grade soli sa kiselinama, a u alkalnoj sredini kao anjoni i grade soli sa bazama. Mnogi

činioci kao što je pH sredine, kompleksiranje s metalima, prisustvo tanina i dr. utiču na boju

antocijana.

20

Slika 10. Najrasprostranjeniji antocijani

2.2.5. Flavonoli

Flavonoli su veoma rasprostranjeni u biljkama i javljaju se najčešće kao glikozidi, a

mogu da budu i kopigmenti antocijana u cvetnim laticama i lišću viših biljaka. Nalaze se u svim

delovima biljaka. Poznato je preko 100 flavonolnih aglikona, a najrasprostranjeniji su kempferol,

kvercetin i miricetin (slika 11).

Slika 11. Struktura najznačajnijih flavonola

21

2.2.6. Katehini

Flavan-3-oli su gradivne jedinice tanina. Tanini (proantocijanidoli ili proantocijanidini)

su polimeri koji se sastoje iz dve ili više različito vezane jedinice flavan-3-ola ili flavan-3,4-

diola, pri čemu stereohemija supstituenata na C2 i C3 atomu pojedinih jedinica, kao i

stereohemija međusobno povezanih jedinica ima važnu ulogu. Najčešće jedinice

proantocijanidola su: (-)-epikatehin sa 2,3 cis i (+)-katehin sa 2,3 trans položajem supstituenata,

kao i galokatehin i epigalokatehin i njihova jedinjenja sa galnom kiselinom (slika 12.).

Slika 12. Strukture katehina, epikatehina i galokatehina i epigalokatehina

2.2.7. Fenolne kiseline

Fenolne kiseline su velika grupa fenolnih jedinjenja, koja se nalaze u hrani biljnog porekla.

Fenolne kiseline imaju različite funkcije u biljkama uključujući asimilaciju hranljivih materija,

sintezu proteina, aktivnost enzima i fotosintezu. Dele se na derivate cimetne i hidroksibenzoeve

kiseline.

Najzastupljeniji hidroksi derivati benzoeve kiseline su: p- hidroksibenzoeva, vanilinska,

galna, protokatehinska i siringinska (slika 13).

Benoeva kiselina 4-hidroksibenzoeva kiselina Vanilinska kiselina

22

Galna kiselina Protokatehinska kiselina Siringinska kiselina

Slika 13. Benzoeva kiselina i njeni derivati

Fenolne kiseline su poznati antioksidansi zbog sposobnosti da predaju vodonik ili elektron

kao i zato što njihovi stabilni interemedijeri radikali sprečavaju oksidaciju različitih komponenti,

naročito masnih kiselina i ulja.

Antioksidativna aktivnost raste sa povedanjem broja hidroksilnih grupa, pa derivati

dihidroksibenzoeve kiseline imaju vedu antioksidativnu aktivnost u odnosu na derivate

hidroksibenzoeve kiseline. Galna kiselina, kao 3,4,5-trihidroksi benzoeva kiselina, ima jače

antioksidativno delovanje od derivata dihidroksibenzoeve kiseline, što je u skladu sa prethodnom

tvrdnjom, i smatra se benzoevom kiselinom sa najjačim antioksidativnim delovanjem.

Monohidroksibenzoeve kiseline sa hidroksilnom grupom u orto i para položaju ne pokazuju

antioksidativnu aktivnost, odnosno nemaju osobinu H-donora. Za razliku od njih m-

hidroksibenzoeva kiselina poseduje antioksidativnu aktivnost. Inkorporacija metilenske grupe

između aromatičnog prstena i karboksilne grupe smanjuje uticaj karboksilne grupe, čime se

gotovo udvostručuje antioksidativna aktivnost (Rice i sar., 1995).

Hidroksicimetne kiseline (p-kumarna, kafena, ferulna i sinapinska kiselina) (slika 14) su više

zastupljene od hidroksibenzoevih kiselina. Kafena i kininska kiselina formiraju hlorogensku

kiselinu, koja se nalazi u mnogim vrstama voća. Cimetna kiselina je pronađena u svim delovima

voća, a najveći sadržaj je utvrđen u spoljašnjem omotaču zrelog ploda. Kafena kiselina je

izolovana iz kafe. U slobodnomi esterifikovanom obliku je najviše zastupljna fenolna kiselina i

čini od 75 do 100% ukupnog sadržaja derivata cimetne kiseline u voću. Najvažniji izvor ferulne

kiseline su zrna žitarica u kojima je dominanta fenolna kiselina.

Cimetna kiselina p-Kumarna kiselina Kafena kiselina

23

Ferulna kiselina Sinapinska kiselina

Slika 14. Cimetna kiselina i njeni derivati

2.3. Ekstrakcija

Ekstrakcija je tehnološka operacija kojom se iz droga biljnog i životinjskog porekla

ekstrahuju, odnosno izdvajaju aktivni principi pomoću određenog rastvarača, ekstragensa.

Operacija ekstrakcije ima veliki značaj u savremenoj tehnologiji i farmaciji, široko se primenjuje

za proizvodnju galenskih preparata i hemijski čistih farmakološki aktivnih supstanci (Lepojević,

2000). Aktivni principi ekstrahuju se iz droga različitim metodama (maceracijom, perkolacijom i

dr.) i pod različitim uslovima (usitnjenost droge, odnos droge i rastvarača, temperatura i pritiskak

ekstrakcije, ekstragens(i) i dr.), što zavisi od vrste farmaceutskog oblika koji se želi dobiti,

prirode lekovite supstance, stanja droge i drugih faktora (Vićentijević, 2001).

Ekstrakti su tečni, praškasti, odnosno granulisani preparati, dobijeni ekstrakcijom droge

propisanim rastvaračem. Upotrebljeni rastvarač se posle ekstrakcije delimično, odnosno potpuno

odstrani. Jugoslovenska farmakopeja (Ph. Jug. IV) propisuje tečne i suve ekstrakte. U zavisnosti

od karaktera rastvarača koji je korišćen za dobijanje ekstrakta, razlikuju se: vodeni ekstrakti,

alkoholni ekstrakti i etarski ekstrakti. Za uparavanje, odnosno ugušćivanje tečnog ekstrakta i

dobijanje suvih ekstrakata, najčešće se koristi, u laboratorijskim uslovima, rotacioni vakuum

uparivač. Pomoću ovog uređaja ekstrakt se uparava pod sniženim pritiskom, a sam proces se

može prekinuti kada se postigne željena gustina ekstrakta ili se uparavanje izvodi do potpunog

uklanjanja rastvarača. Za sušenje ugušćenog ekstrakta najčešde se primenjuje vakuum sušnica i

to na temperaturi 65-70 °C. Sušenje se izvodi dok se masa suvog ekstrakta ne ustali, odnosno do

konstantne mase (Lepojević, 2000).

2.3.1. Ekstrakcija čvrsto-tečno

Ekstrakcija čvrsto-tečno je operacija prenosa mase kojom se jedan ili više sastojaka

izdvaja iz čvrstog materijala pomoću pogodnog rastvarača (Coulson i sar., 1991). Jedan deo

čvrstog materijala, koji po pravilu sadrži željenu supstancu, rastvara se u rastvaraču, a zatim se

rastvor odvaja od iscrpljenog, nerastvornog dela čvrstog materijala. Čvrst materijal je najčešće

biljna ili mineralna sirovina, dok se voda, organski rastvarači i rastvori kiselina, baza ili soli

24

koriste kao rastvarač. Deo čvrstog materijala koji se rastvara predstavlja ekstraktivne supstance,

dok se dobijeni rastvor naziva ekstrakt.

Kako se za ekstrakciju najčešće koriste droge, a ređe sveži biljni delovi, izdvajanje

aktivnih materija iz droga uslovljeno je anatomskom građom samih droga. Za ekstrakciju glavni

uslov je odgovarajuća usitnjenost polaznog materijala. Usitnjavanjem se povećava specifična

površina materijala, a time i mogućnost kontakta pojedinih čestica sa rastvaračem za ekstrakciju.

U slučaju prevelike usitnjenosti ekstrakcija je otežana, jer se od jako usitnjene droge ekstrakt

teško odvaja, a jako usitnjena droga može naknadno adsorbovati već ekstrahovanu aktivnu

materiju. Droga koja se ekstrahuje mora biti usitnjena do određenog stepena koji varira u

relativno uskim granicama (1-5 mm). Najčešće se postavlja ograničenje da udeo sitnih čestica,

čiji je prečnik manji od 0,5 mm, ne bude veći od 10 %.

Tip rastvarača igra bitnu ulogu u procesu ekstrakcije. Prema stepenu hidrofilnosti,

supstance koje se ekstrahuju iz biljne sirovine mogu se podeliti na:

- rastvorne u polarnim rastvaračima (hidrofilne supstance),

- rastvorne u slabo polarnim rastvaračima i

- rastvorne u nepolarnim rastvaračima (hidrofobne supstance).

Izbor rastvarača za ekstrakciju zavisi od stepena hidrofilnosti supstanci. Koristi se

poznato pravilo: slično se rastvara u sličnom. Polarne supstance, sa visokim vrednostima

dielektrične konstante, dobro se rastvaraju u polarnim rastvaračima i obratno.

Dve glavne tehnike ekstrakcije čvrsto-tečno, koje se najčešće koriste, jesu maceracija i

perkolacija.

Klasična ekstrakcija ili maceracija se najčešće primenjuje za dobijanje preparata

prirodnih jedinjenja. Ona se izvodi šaržno tako što se biljni materijal potapa u rastvarač pri

određenoj temperaturi. Iscrpljenom biljnom materijalu, može se dodati sveži rastvarač, što

predstavlja remaceraciju, odnosno dvostruku maceraciju. Perkolacija se izvodi polušaržno, tako

što rastvarač protiče kontinualno kroz nepokretan sloj čvrstog materijala odozgo naniže. Fino

usitnjen materijal, koji se može lako držati suspendovan u rastvaraču podvrgava se maceraciji,

dok se ekstrakcija krupnijeg, komadnom materijala vrši perkolacijom (Ponomarev, 1976.).

Pored dobrih prinosa, klasične tehnike ekstrakcije imaju nedostatke kao što su: dugo

vreme trajanja, velika potrošnja rastvarača, pojava degradacije bioaktivnih materija, zahtevi za

dodatnim koracima u obradi ekstrakata (filtriranje, koncentrisanje) koji povećavaju cenu i

umanjuju ekonomičnost čitavog procesa.

25

Prilikom izbora tehnike i uslova ekstrakcije čvrsto-tečno posebnu pažnju treba obratiti na:

veličinu čestica, rastvarač, radnu temperaturu i mešanje. Ukoliko su čestice manje, veća je

kontaktna površina čvrsto-tečno, pa je veća brzina prenosa mase, a rastojanje koje rastvorak

treba da pređe difuzijom unutar čvrstog materijala je kraće (Nađanin, 2013). Rastvarač mora da

bude visoko selektivan i sa malom viskoznošću. Rastvarač je čist samo na početku, kasnije

koncentracija rastvorka u rastvaraču raste, dok se brzina prenosa mase smanjuje, zbog toga što se

smanjuje gradijent koncentracije i povećava viskoznost rastvora. Sa povećanjem temperature,

rastvorljivost supstanci koje se ekstrahuju i koeficijent difuzije se povećavaju, što povećava

brzinu prenosa mase. Mešanje je bitno u slučaju maceracije, jer doprinosi povećanju brzine

prenosa mase u rastvoru.

Nezavisno od primenjene tehnike, postupak ekstrakcije čvrsto–tečno uključuje:

rastvaranje rastvorka u rastvaraču, odvajanje ekstrakta od nerastvornog ostatka čvrstog materijala

(iscrpljen ostatak) i ispiranje čvrstog ostatka rastvaračem. Po završenoj ekstrakciji, ekstrakt se

odvaja od iscrpljenog materijala ceđenjem ili presovanjem.

Čvrsto-tečnu ekstrakciju definišu opšti zakoni prenosa mase, zatim fizičko-hemijska

sličnost rastvarača i ekstrahovanih supstanci, kao i osobine polaznog materijala (Lepojević,

2000). U opštem slučaju proces prenosa mase predstavlja prenos materije u smeru uspostavljanja

ravnoteže (Pekić, 1980). Proces difuzije je odgovoran za proces prenosa mase, tj. molekulska

difuzija se ostvaruje usled koncentracionog gradijenta rastvorenih materija u fazama koje su u

kontaktu, kao i usled haotičnog kretanja molekula materije određene kinetičke energije (Tolić,

1996). Porastom temperature raste i kinetička energija molekula, te će i brzina kretanja biti veća,

a samim tim kao rezultat se javlja pozitivan uticaj na brzinu difuzije. Kako sistem ima težnju da

uspostavi termodinamičku ravnotežu, molekuli materije koja difunduje kretaće se haotično sa

mesta veće na mesto manje koncentracije.

Pri ekstrakciji supstanci iz biljnog materijala, prisutni su sledeći koeficijenti prenosa

mase: koeficijent unutrašnje difuzije, koeficijent slobodne difuzije i koeficijent turbulentne

difuzije. Koeficijent unutrašnje difuzije karakteriše brzinu prenosa mase unutar čestica biljnog

materijala. Koeficijent slobodne difuzije karakteriše brzinu prenosa mase u ćelijskom sloju i

difuzionom sloju. Koeficijent turbulentne difuzije, odnosno koeficijent konvektivne difuzije

karakteriše brzinu prenosa mase u pokretnom sloju ekstragensa.

Operacija čvrsto-tečne ekstrakcije ima dva perioda, brzu i sporu ekstrakciju. Neposredno

pre ekstrakcije vrši se usitnjavanje osušenog biljnog materijala. Pri ekstrakciji usitnjenog biljnog

materijala dolazi do kvašenja, rastvaranja i brzog prenosa mase iz razorenih ćelija (brza

ekstrakcija) i period spore difuzije rastvorenih supstancija iz nerazorenih ćelija. Prva faza

ekstrakcije teče nekoliko puta brže od druge i zavisi od hidrodinamičkih uslova, kao i od stepena

26

usitnjenosti biljnog materijala. Druga faza ekstrakcije zavisi od koeficijenta prenosa mase unutar

biljnog materijala.

Bilo koja od faza ekstrakcije može limitirati brzinu ukupnog procesa. Obično je

rastvaranje ekstraktivnih supstanci u rastvaraču brz proces koji ne utiče na brzinu celokupnog

procesa, dok je po pravilu, difuzija ekstraktivnih supstanci kroz unutrašnjost čestica biljne

sirovine najsporija faza.

2.3.2. Matematički modeli procesa ekstrakcije

Matematički opis procesa ekstrakcije čvrsto-tečno je veoma složen zbog složenosti

samog procesa prenosa mase iz unutrašnjosti čestica do glavnine rastvora. Matematički opis i

analiza ekstrakcije čvrsto-tečno se značajno pojednostavljuje primenom uprošćenih fizičkih

modela, od kojih su u ovom radu korišćeni:

- model zasnovan na nestacionarnoj difuziji kroz biljni materijal,

- empirijska jednačina Ponomarjeva, koja predstavlja matematički opis promene

količine ekstraktivnih supstanci u biljnoj sirovini u periodu spore ekstrakcije, a dobija

se uprošćavanjem modela nestacionarne difuzije kroz biljni materijal i

- model zasnovan na teoriji filma.

Ovi modeli su bazirani na uprošćenim opisima difuzije ekstraktivnih materija iz biljnog

materijala u rastvor. Zbog fizičke zasnovanosti, relativne jednostavnosti i dobrog slaganja sa

eksterimentalnim podacima model zasnovan na nestacionarnoj difuziji kroz biljni materijal i

model zasnovan na teoriji filma su uspešno korišćeni za opisivanje procesa klasične i ultrazvučne

ekstrakcije više različitih biljnih materijala (Veljković i Milenović, 2002; Kitanović i sar., 2008).

Empirijske jednačine se takođe primenjuju za modelovanje procesa ekstrakcije iako nemaju

fizičku osnovu i predstavljaju samo matematički opis promene količine ekstraktivnih materija u

biljnoj sirovini ili tečnom ekstraktu tokom ekstrakcije.

27

2.3.2.1. Model zasnovan na nestacionarnoj difuziji kroz biljni materijal

Prenos mase kroz biljni materijal pri ekstrakciji čvrsto-tečno odigrava se mehanizmom

difuzije, gde se brzina prenosa mase ekstrahovanih supstanci može opisati Fikovim zakonima.

Uslovi pri ekstrakciji čvrsto-tečno su, po pravilu, nestacionarni pa se promene koncentracije

rastvora u uslovima kada ne dolazi do hemijske reakcije opisuje jednačinom II Fikovog zakona

čiji diferencijalni oblik, kada se prenos mase odigrava u jednom pravcu, ima sledeći oblik:

(10)

gde je: - koncentracija ekstrahovanih supstanci, - vreme, - dužina u pravcu prenosa mase i

- koeficijent difuzije ekstrahovanih supstanci.

Jednačinu (10) je moguće analitički rešiti u slučaju prostijih geometrijskih oblika čvrstih

čestica (ravna ploča, cilindar i sfera), integrisanjem uz primenu odgovarajućih početnih i

graničnih uslova (Veljković i Milenović, 2002). Pri tome se uvode sledeće predpostavke:

- čestice biljnog materijala su izotropne i jednake po veličini;

- mešanje suspenzije je intenzivno;

- koeficijent difuzije ekstrahovanih supstanci kroz česticu je konstantan;

- koncentracija ekstrahovanih supstanci u čestici na početku (co) je ravnomerna;

- koncentracija ekstrahovanih supstanci na spoljašnjoj površini čestice ( ) je stalna;

- srednja koncentracija ekstrahovanih supstanci u čestici ( ) menja se sa vremenom,

saglasno promeni prostorne raspodele koncentracije ekstrahovanih supstanci; i

- u svakom trenutku u osi čestice je .

Kao rezultat se dobija zavisnost relativne promene sadržaja ekstrahovanih supstanci u biljnoj

sirovini , i posle nekog određenog vremena ekstrakcije, od vremena:

(11)

Za jednostavnije izračunavanje parametara jednačine (11) koristi se njen linearizovan oblik:

28

(12)

gde je koeficijent ispiranja, a koeficijent spore ekstrakcije.

Parametri jednačine (12) se mogu analitički izračunati, pri čemu se odsečak i nagib pravolinijske

zavisnosti izračunavaju metodom najmanjih kvadrata.

2.3.2.2. Model zasnovan na teoriji filma

Definisanja brzine prenosa mase ekstrahovanih materija iz biljnog materijala u rastvor,

prema modelu koji se zasniva na teoriji filma predviđa da se oko čestica obrazuje tanak difuzioni

sloj. Ovaj model pretpostavlja još i sledeće:

- zapremina i spoljašnja površina čestice se ne menjaju u toku ekstrakcije;

- suspenzija biljne sirovine je homogena, a rastvor idealno izmešan;

- rastvorljivost ekstrahovanih supstanci u rastvaraču i na temperaturi na kojoj se izvodi

ekstrakcija je poznata;

- ispiranje ekstrahovanih supstanci iz razorenih biljnih ćelija na spoljašnjoj površini

čestica odigrava se trenutno;

- otpor prenosu mase je skoncentrisan u difuznom sloju oko čestice, čija se debljina ne

menja tokom ekstrakcije;

- brzina ukupnog procesa (unutrašnja difuzija i difuzija od spoljašnje površine čestice

prema rastvoru) proporcionalna je tzv. efektivnom koeficijentu difuzije (približno

jednak koeficijentu difuzije ekstrahovanih supstanci u rastvaraču), koji se ne menja u

toku ekstrakcije (Veljković i Milenović., 2002).

U ovom slučaju uzimajući u obzir da je aktuelna koncentracija rastvora a

koncentracija zasićenog rastvora važi:

(13)

29

Saglasno jednačini (13), kada , onda , tj. koncentracija rastvora tokom

ekstrakcije približava se eksponencijalno koncentraciji zasićenog rastvora. Ako je , onda

nema ispiranja, a ako je , onda je ispiranje potpuno; realno je .

Vrednosti koeficijenta ispiranja koeficijenta spore ekstrakcije mogu se izračunati iz

odsečka i koeficijenta pravca linearizovanog oblika jednačine (13):

(14)

2.3.2.3. Empirijski model Ponomarjeva

Ovaj model predpostavlja da u periodu spore ekstrakcije postoji linearna zavisnost

između / q0 i vremena, tako da je:

(15)

I u ovom slučaju je koeficijent ispiranja, a je koeficijent pravca linearne zavisnosti.

Koeficijent ispiranja je mera mase ekstrahovanih supstanci koja se rastvori pošto se biljni

materijal potopi u rastvarač, tj. . Parametar je, u stvari, brzina

rastvaranja ekstrahovanih supstanci u odnosu na njihovu početnu masu u periodu spore

ekstrakcije.

2.4. UV/VIS spektrofotometrija

Ultraljubičasta/vidljiva (UV/VIS) spektrofotometrija je spektroskopska metoda koja

obuhvata proučavanje apsorpcije elektromagnetnog zračenja u oblasti između 190 i 1000 nm.

Apsorbovano zračenje izaziva energetske promene u molekulu, a od ukupne količine zračenja

supstanca apsorbuje samo one frekvencije, odnosno onu energiju zračenja koja može da izazove

energetske promene stanja u atomu ili molekulu date supstance.

Kako veliki broj organskih jedinjenja ne apsorbuje u ovom delu spektra, to UV/VIS

spektrofotometrija, u poređenju sa drugim strukturnim metodama (IC, NMR, MS), ima daleko

manju primenu za strukturna određivanja i uglavnom se koristi kao komplementarna metoda za

identifikaciju delova molekula koji apsorbuju u navedenoj oblasti, takozvanih hromofora.

UV/VIS spektri dobijeni na ovaj način, pružaju veoma korisne informacije o strukturi ispitivanog

jedinjenja. Na primer, ona je nezamenljiva pomoćna (a često i glavna) metoda za identifikaciju

prirodnih konjugovanih jedinjenja, kao što su: biljni pigmenti (karotenoidi), poliacetileni,

30

porfirini, flavonoidi, itd. Pored primene za identifikaciju organskih jedinjenja, UV/VIS

spektrofotometrija se danas dosta primenjuje u kvantitativnoj analizi. Njene prednosti nad

ostalim metodama su u izuzetno velikoj osetljivosti i jednostavnom rukovanju instrumentom.

UV/VIS spektrofotometrija je kvalitativna i kvantitativna metoda. Kvalitativna analiza

zasniva se na činjenici da apsorcioni spektar supstance zavisi od njenog sastava i strukture.

Kvantitativna analiza zasnovana je na Beer-ovom zakonu.

Ako se poznato elektromagnetno zračenje poređa po talasnim dužinama dobija se spektar

elektromagnetnog zračenja (slika 15):

Slika 15. Spektar elektromagnetnog zračenja

Prilikom interakcije elektromagnetnog zračenja sa materijom mogući su mnogi procesi

(refleksija, rasipanje, apsorpcija, fluorescencija/fosforescencija, fotohemijske reakcije).

Uopšteno, pri merenju UV-VIS spektara poželjno je da svi procesi osim apsorpcije budu

zanemarljivi.

Kada svetlost prolazi kroz kivetu (slika 16) u kojoj se nalazi uzorak, količina

apsorbovane svetlosti predstavlja razliku između intenziteta upadne svetlosti (I0) i propuštene

svetlosti (Ip) i izražava se transparencom ili apsorbancom.

31

Slika 16. Prolazak zraka svetlosti kroz kivetu

Transparenca predstavlja odnos propuštene i upadne svetlosti:

T = I0/Ip (16)

dok je apsorbancija jednaka:

A = - log T = - log (I0/Ip) = abc (17)

gde je:

a – molarna apsorptivnost

b – debljina kivete

c – koncentracija

Poslednji izraz predstavlja Lambert-Beer-ov zakon koji kaže da je apsorbancija rastvora

direktno proporcionalna koncentraciji apsorbujuće vrste i debljini sloja kroz koje zračenje

prolazi. Lambert-Beer-ov zakon je osnova kvantitativne spektrofotometrijske analize. Za

kvantitativnu analizu bitno je da se merenje vrši sa najvećom mogućom tačnošću i osetljivošću.

Molarni koeficijent apsorpcije (molarna apsorptivnost) zavisi od prirode apsorbujućeg molekula,

ali i od talasne dužine upadnog zračenja, pa zato Lambert-Beer-ov zakon važi samo za

monohromatsku svetlost. Vrednost molarnog apsorpcionog koeficijenta je maksimalna za onu

talasnu dužinu koja se najintenzivnije apsorbuje.

U rastvoru koji sadrži više komponenti koje apsorbuju elektromagnetno zračenje, a koje

međusobno ne reaguju, apsorbanca ratvora jednaka je zbiru pojedinačnih apsorbanci svih

komponenti. Drugim rečima, apsorbancija rastvora je aditivna veličina, pa se Lambert-Beer-ov

zakon za uzorak koji sadrži više apsorbujućih supstanci, može napisati kao:

(18)

32

Za kvantitativnu analizu je bitno da se merenja apsorbance vrše sa najvećom mogućom

tačnošću i osetljivošću. Da bi se to postiglo bitan je izbor talasne dužine na kojoj se merenje vrši.

Ona mora da ispuni nekoliko uslova:

merenjem mora da se postigne maksimalna osetljivost,

mala promena talasne dužine ne sme da utiče na reproduktivnost,

mora da važi Beerov zakon.

U zavisnosti od uslova, merenje apsorbance se može vršiti na:

talasnoj dužini gde je maksimalna apsorpcija, λmax

talasnoj dužini optimalne apsorbance, λopt

talasnoj dužini izobestičke tačke, λizob

Lambert-Beer-ov zakon ne važi kada :

rastvorak postoji u više oblika koji su u međusobnoj ravnoteži;

rastvorak i rastvarač grade asocijat;

postoji termička ravnoteža između osnovnog i pobuđenog stanja;

jedinjenja fluoresciraju ili se hemijski menjaju prilikom apsorpcije zračenja (Todorović i

sar., 1997).

2.4.1. Snimanje UV/VIS spektara

Za snimanje apsorpcionih spektara koriste se spektrofotometri (slika 17). Osnovni delovi

spektrofotometra su:

izvor svetlosti,

držač uzorka – kiveta,

difrakciona rešetka u monohromatoru ili prizmi za razdvajanje svetlosti različitih talasnih dužina,

detektor.

33

Slika 17. Šema spektrofotometra

Spektrofotometri se dele na jednozračne i dvozračne. Jednozračni spektrofotometri imaju

jedan svetlostni put i jedan uzorak. Referentni uzorak (slepa proba) se mora analizirati posebno.

Dvozračni spektrofotometri imaju dva svetlostna puta i istovremeno mogu primiti dva

uzorka: mereni uzorak i referentni uzorak (slepu probu). Spektri se automatski oduzimaju jedan

od drugoga, pa naknadna obrada spektra nije potrebna. Dvozračni spektrofotometri u prostornom

domenu koriste dva odvojena detektora zračenja, za dva svetlosna puta. Dvozračni

spektrofotometar u vremenskom domenu koristi jedan detektor zračenja, koji naizmenično

detektuje intenzitet zračenja dva svetlosna puta - na taj način se eliminišu eventualne sporedne

greške koje se mogu javiti usled promene napona u mreži, promene temperature lampe i sl.

Idealni izvor zračenja treba da daje svetlost konstantnog intenziteta u celom opsegu

talasnih dužina, sa malim šumom i velikom stabilnosti. Na žalost, takav izvor ne postoji. Dva

izvora zračenja se najčešće upotrebljavaju u UV-VIS spektrofotometriji. Prvi izvor,

deuterijumova lučna lampa daje kontinuum dobrog intenziteta u UV i u jednom delu VIS oblasti.

Takođe, savremene deuterijumske lampe daju mali šum. U toku vremena intenzitet zračenja koji

daje ova lampa lagano opada. Drugi izvor zračenja je volframova lampa. Ona daje spektar

dobrog intenziteta u delu UV i celoj VIS oblasti. Karakteristika ovih lampi je takođe mala

količina šuma. Mnogi spektrofotometri koriste kombinaciju deuterijumske i volframove lampe

pri čemu one pokrivaju kompletnu oblast talasnih dužina od 200 do 1000 nm. Alternativa ovim

dvema lampama je ksenonska lampa koja daje dobar kontinuum talasnih dužina u celoj oblasti

UV-VIS spektra. Međutim, ona daje značajno više šuma od prethodne dve pa najčešće nije

pogodna za kvantitativna određivanja.

34

Disperzioni element ima funkciju da snop polihromatskog zračenja razloži na pojedine

talasne dužine (odnosno, uske oblasti talasnih dužina). U spektrofotometriji se najčešće koriste

prizma i difrakciona rešetka. Prizme su proste i jeftine ali disperzija svetlosti je ugaono zavisna,

takođe, ugaona disperzija je temperaturno zavisna. Zbog toga se u modernim spektrofotometrima

uglavnom koriste difrakcione rešetke umesto prizmi. One se prave tako što se na staklenoj

pločici mehanički nanese niz veoma malih ureza. Dimenzije ureza su reda veličine talasne dužine

svetlosti koja treba da se difraktuje. U novije vreme, difrakcione rešetke se prave koristeći

poseban hologramski proces koji podrazumeva iscrtavanje difrakcione mreže laserom a zatim

nanošenje sloja aluminijuma. Rešetke dobijene na ovaj način nazivaju hologramske difrakcione

rešetke i njihova cena je znatno niža nego cena rešetki dobijenih tradicionalnim postupkom.

Hologramske difrakcione rešetke imaju linearnu ugaonu disperziju koja nije zavisna od talasne

dužine i temperature.

Detektori pretvaraju svetlosni signal u električni signal. Idealni detektor poseduje

linearnu osetljivost u širokom rangu talasnih dužina i intenziteta svetlosti, sa malim šumom i

velikom osetljivošću. Moderni spektrofotometri sadrže fotomultiplikator ili fotodiodni niz.

Fotomultiplikator ima dobru osetljivost u celom UV-VIS regionu pri malom intenzitetu svetlosti.

U kvantitativnoj analizi to znači da se sa većom sigurnošću mogu detektovati male razlike

između slepe probe i uzorka za analizu. Samim tim, mogu se određivati male količine supstance.

Fotodiodni niz kao detektor ima široki opseg detekcije talasnih dužina što ga čini idealnim za

snimanje celog UV-VIS spektra u kratkom vremenskom intervalu. Sastoji se od serije fotodioda

poređanih jedna do druge na silikonskom kristalu. Svaka fotodioda se ponaša kao minijaturni

kondenzator koji se razelektriše kad svetlost padne na nju. Količina naelektrisanja potrebna da se

kondenzator do kraja razelektriše je obrnuto proporcionalna broju fotona detektovanih na svakoj

fotodiodi, koji su pak proporcionalni intenzitetu svetlosti.

35

3. EKSPERIMENTALNI DEO

36

3.1. Biljna sirovina

Cvet lipe, ubran na području Sokobanje, sušen je na sobnoj temperaturi i neposredno pre

eksperimenta samleven na mlinu. Delovi cveta su odvojeni ručno od delova lista i stabljike.

3.2. Reagensi

U radu su korišćeni sledeći reagensi: etanol, Folin-Ciocalteu reagens (FC), Na2CO3,

NaNO2, NaOH i AlCl3, galna kiselina i katehin.

Svi rastvori, koji se nisu mogli pripremiti kao primarni standardni rastvori,

standardizovani su poznatim metodama u cilju određivanja tačne koncentracije.

Sudovi koji su korišćeni prani su etanolnim rastvorom KOH, zatim rastvorom HCl (1:1),

isprani česmenskom, destilovanom i dejonizovanom vodom. Vodeni rastvori su pripremani

dejonizovanom vodom specifične provodljivosti 0,05 μS/cm.

3.3. Ekstrakcija iz biljne sirovine

Ekstrakcija iz biljne sirovine je vršena vodom, etanolom i vodenim rastvorima etanola

koncentracije 30, 50 i 70 % (v/v), pri solvomodulu 1:30, 1:40, 1:50 i 1:60 (g/V), na

temperaturama 25, 35 i 45 oC. Biljna sirovina (1 g) se prelije određenom zapreminom rastvarača

i ostavi na konstantnoj temperaturi. Posle određenog vremena, ekstrakt se odvaja od ostatka

biljne sirovine vakuum filtracijom.

3.3.1. Inicijalni sadržaj polifenolnih jedinjenja u cvetu lipe (q0)

Biljni materijal (1 g) se u erlenmajeru od 250 ml prelije sa 100 ml ekstrakcionog

rastvarača (50 % etanol). Ekstrakcija je vršena postupkom maceracije u toku 120 minuta.

Ekstrakti su odvojeni od ostatka filtriranjem kroz Whatman No. 1 filter papir. Nakon filtriranja,

iscrpljena biljna sirovina se prelije sa istom zapreminom istog rastvarača, i macerira još 30

minuta, a zatim se filtrira i ispire sa 20 ml rastvarača. Ekstrakti se spoje i uparavaju, a zatim i

suše pod vakumom na 45 °C do konstantne mase.

Osušeni, suvi i koncentrovani ekstrakti su rastvoreni u ekstrakcionom rastavaraču

neposredno pre analize. Osušeni ekstrakti su pripremljeni tri puta, a rezultat je izražen kao

srednja vrednost.

37

3.3.2. Sadržaj polifenolnih jedinjenja u zasićenim tečnim ekstraktima

cveta lipe (CS)

Biljni materijal (1 g) je u erlenmajeru od 250 ml preliven sa 100 ml ekstrakcionog

rastvarača. Ekstrakcija je vršena postupkom maceracije u toku 120 minuta. Tečni ekstrakt je

odvojen kao ranije i korišćen za ekstrakciju fenolnih jedinjenja iz nove količine (1 g) biljnog

materijala. Postupak se ponavlja dok se ne dobije zasićen rastvor, tj. kada nema više izvlačenja

fenolnih jedinjenja iz biljne sirovine. Rastvarač je uklonjem na rotacionom uparivaču na 45 °C.

Osušeni, suvi i koncentrovani ekstrakti su rastvoreni u ekstrakcionom rastavaraču neposredno

pre analize. Osušeni ekstrakti su pripremljeni tri puta, a rezultat je izražen kao srednja vrednost.

3.4. Aparati

Za ispitivanje sadržaja fenolnih komponenti u uzorcima korišćena je sledeća aparatura:

Analitička vaga Mettler Toledo AB-204-S za odmeravanje uzoraka i čvrstih supstanci;

MicroMed high purity water system, TKAWasseraufbereitungsszsteGmbH za dobijanje

demineralizovane vode;

UV/VIS spektrofotometar Agilent 8453 sa kivetom dužine optičkog puta 1 cm za

odredivanje sadržaja i ispitivanje kinetike fenolnih jedinjenja (slika 18).

Slika 18. UV-VIS spektrofotometar (laboratorija Katedre za analitičku i fizičku hemiju Prirodno-

matematičkog fakulteta Univerziteta u Nišu)

38

3.5. Metode

3.5.1. Određivanje sadržaja ukupnih fenola

Za određivanje sadržaja ukupnih fenola u ispitivanim uzorcima lipe korišćena je metoda

po Folin-Ciocalteu (Singleton i Rossi, 1965; Stratil i sar.,2006). Metoda se zasniva na oksidaciji

fenolnih jedinjenja pomoću Folin-Ciocalteu reagensa. Sam reagens predstavlja smešu

fosfomolibdenske i fosfovolframove kiseline i može se predstaviti formulama:

3H2O × P2O5 × 13WO3 × 5MoO3 × 10H2O i

3H2O × P2O5 × 14WO3 × 4MoO3 × 10H2O

Ovaj reagens oksidiše fenolna jedinjenja, a sam se redukuje u smešu volfram-oksida i

molibden-oksida. Rastvor postaje intenzivno plave boje, čiji je intenzitet srazmeran količini

fenolnih jedinjenja. Plava boja oksida je stabilna. Intenzitet boje se meri spektrofotometrijski, na

talasnoj dužini λ = 760 nm.

Na2WO4/Na2MoO4 + Fenol → (fenol-MoW11O40)4-

Mo(VI) (žuto obojen) + e- → Mo(V) (plavo obojen)

Rastvori i reagensi:

20 % Na2CO3,

Folin-Ciocalteu reagens

Standardni rastvor galne kiseline

Postupak:

U normalni sud od 10 ml prenet je 1 ml uzorka. Nakon toga, dodaje se 2,5 ml

dejonizovane vode, 0,5 ml rastvora Folin-Ciocalteu i 2 ml rastvora natrijum karbonata (20 %).

Sud je dopunjen do crte dejonizovanom vodom. Nakon 2 h merena je apsorbanca na talasnoj

dužini λ = 760 nm, u odnosu na vodu kao slepu probu.

39

0 1 2 3 4 5

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

Ap

so

rba

nca

na

76

0 n

m

Koncentracija galne kiseline, g/ml

Slika 19. Kalibraciona prava za određivanje sadržaja ukupnih fenola

Odmeravanjem određene zapremine standardnog rastvora galne kiseline dobijena je

kalibraciona prava (slika 19).

Na osnovu izmerenih apsorbanci, sa kalibracione krive standardnog rastvora galne

kiseline određuje se masena koncentracija (μg/cm3) polifenolnih jedinjenja korišćenjem

jednačine prave (A = 0,0855cGA + 0.0065, n = 5, r2

= 0,9998), a ukupan sadržaj fenola u

analiziranim uzorcima izražen je kao mg ekvivalenta galne kiseline na 100 g suve mase cveta

lipe ± standardna devijacija (mg GAE/100 g s.m. ± SD).

3.5.2. Određivanje sadržaja ukupnih flavonoida

Flavonoidi imaju osobinu da sa metalima grade odgovarajuće metalne komplekse

(Markham, K.R. (1989). Naročito je važan kompleks sa Al3+

(slika 20). Sadržaj ukupnih

flavonoida određivan je korišćenjem spektrofotometrijske metode koja je zasnovana na

formiranju komlepksa između flavonoida i aluminijuma.

40

Slika 20. Građenje helata flavonoida sa jonom

Rastvori i reagensi:

5 % NaNO2

2 % AlCl3

1 mol/L NaOH

Standardni rastvor katehina

Postupak:

Reakciona smeša je pripremljena mešanjem zapremine uzorka od 2 ml, 3 ml

dejonizovane vode i 0,3 ml 5 % NaNO2. Nakon 5 min stajanja na sobnoj temperaturi dodato je 3

ml 1 % AlCl3, nakon 5 minuta još 2 ml 1 mol/L NaOH i dejonizovana voda do 10 ml.

Apsorbanca je merena na λ = 510 nm (katehin), u odnosu na dejonizovanu vodu kao slepu probu.

Odmeravanjem određene zapremine standardnog rastvora katehina dobijena je

kalibraciona prava (slika 21).

41

0 2 4 6 8 10

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

Ap

so

rba

nca

na

51

0 n

m

koncentracija katehina u g/ml

Slika 21. Kalibraciona prava za određivanje sadržaja ukupnih flavonoida

Na osnovu izmerenih apsorbanci, sa kalibracione krive standardnog rastvora katehina

određena je koncentracija (μg/ml) flavonoida korišćenjem jednačina: (A = 0,02486cC - 0,00507,

n = 7, r2 = 0,9994) a zatim se sadržaj ukupnih flavonoida u polaznom uzorku izražava kao mg

ekvivalenta katehina na g biljnog materijala ± standardna devijacija (mg CE/g ± SD).

3.6. Statistička obrada podataka

Sva merenja su izvršena u najmanje dva ponavljanja, a rezultati predstavljeni kao srednja

vrednost dva ponavljanja (csr± SD). Interval poverenja iznosio je 95 % (Miller i Miller, 2005).

42

4. REZULTATI I DISKUSIJA

43

4.1. Optimizacija procesa ekstrakcije

Ekstrakcija biološki aktivnih jedinjenja najčešće se vrši korišćenjem tri ekstrakciona

postupka: ekstrakcija pogodnim rastvaračima, ekstrakcija na čvrstoj fazi (solid-phase extraction)

i superkritična ekstrakcija. Prinos jedinjenja u ekstraktu, odnosno prinos ekstrakcije, kao i sam

sastav ekstrakta, u velikoj meri zavisi od načina ekstrakcije, kao i tipa i polarnosti rastvarača

(Moller i sar. 1999).

Za ekstrakciju polifenolnih jedinjenja koriste se rastvarači kao što su aceton, etanol,

metanol i njihove kombinacije, najčešće u različitim odnosima sa vodom. U literaturi najčešće

korišćeni rastvarači su etanol i metanol (Nuutila i sar., 2003; Wu i sar., 2005; Garcia-Salas i

sar., 2010). Etanol kao ekstragens, prema literaturnim podacima, korišćen je u ekstrakciji

različitih vrsta biljnog materijala, pri čemu su dobijeni ekstrakti imali povoljne karakteristike u

pogledu sastava i sadržaja farmakološki značajnih jedinjenja (Turkoglu i sar., 2007; Turkoglu i

sar., 2007). Prednost etanola u odnosu na druge ekstragense je njegova netoksičnost i moguća

dalja primena ovako dobijenih ekstrakata u farmaciji i prehrambenoj industriji. Prinos ekstrakcije

nekih komponenata kao što su antioksidansi, koji su uglavnom polarnog karaktera, povećava se

sa povećanjem polarnosti upotrebljenog ekstragensa. Povećanjem udela vode u ekstragensu

povećava se i njegova polarnost, pa se različite koncentracije etanola kao ekstragensa mogu

smatrati pogodnim za ekstrakciju jedinjenja ovog tipa.

Radi utvrđivanja najpogodnijih uslova ekstrakcije izvršena je optimizacija procesa

ekstrakcije primenom metode jednofaktornog eksperimenta.Veličine obuhvaćene optimizacijom

su ukupan sadržaj fenola i ukupan sadržaj flavonoida. U tabeli 3 je dat pregled uslova

ekstrakcije.

Tabela 3. Ispitivani parametri i njihovi intervali vrednosti za ekstrakciju ukupnih fenola i

flavonoida iz cveta lipe

Parametar Interval

Koncentracija etanola, % 0, 30, 50, 70, 100

Solvomodul, V/m 30, 40, 50, 60

Vreme ekstrakcije, min 5, 10, 20, 40, 60, 80, 120

Temperatura ekstrakcije, oC 25, 35, 45

Primenom Folin-Ciocalteu-ove spektrofotometrijske metode određen je sadržaj ukupnih

fenolnih jedinjenja, dok je primenom reagensa određen sadržaj ukupnih flavonoida.

44

4.1.1. Uticaj koncentracije rastvarača na sadržaj ukupnih fenola i

flavonoida iz cveta lipe

Za ispitivanje je korišćen cvet lipe koji je neposredno pre eksperimenta samleven na

mlinu. Mlevenjem cveta lipe je dobijen materijal sa srednjim prečnikom usitnjenosti manjim od

0,6 mm.

Sadržaji ukupnih fenola i flavonoida u ekstraktima različitih koncentracija etanola

predstavljeni su tabelarno i grafički (tabela 4, slika 22).

Rezultati pokazuju da se veći sadržaji ukupnih fenola i flavonoida postižu primenom

binarnog sistema rastvarača tj. vodenih rastvora etanola. Prisustvo vode povećava polarnost

ekstrakcionog sredstva (dielektrična konsatanta vode je 78,3 dok je etanola 25,2) i utiče na

bubrenje biljnog materijala, što povećava kontaktnu površinu između biljnog matriksa i

rastvarača (Hemwimon i sar., 2007). Može se videti da je najveći sadržaj ukupnih fenola i

flavonoida u ekstraktu koncentracije etanola 50 % (v/v). Međutim, sa porastom udela organskog

rastvarača u vodenim rastvorima sadržaji se smanjuju. Ovo se može objasniti da pored polarnosti

rastvarača treba uzeti u obzir i druge njihove osobine kao što su viskoznost i površinski napon.

Povećanje viskoznosti proprcionalno smanjuje koeficijent difuzije, dok se smanjenje površinskog

napona povoljno odražava na brzinu ekstrakcije. Ove karakteristike su znatno povoljnije kod

organskih rastvrača nego kod vode. Koncentracija etanola od 50 % (v/v) je odabrana za dalja

ispitivanja.

Tabela 4. Uticaj koncentracije etanola na sadržaj ukupnih fenola (mgGAE/g ) i flavonoida

(mgCE/g) iz cveta lipe (vreme ekstrakcije: 120 minuta; solvomodul: V/m=20; t=25 °C)

Koncentracija etanola (%, v/v) TP (mgGAE/g) TF (mgCE/g)

0 1,266 1,022

30 3,663 2,298

50 4,877 2,847

70 3,097 1,536

100 0,556 0,309

45

Slika 22. Uticaj koncentracije etanola na sadržaj ukupnih fenola (mgGAE/g ) i flavonoida

(mgCE/g) iz cveta lipe (vreme ekstrakcije: 120 minuta; solvomodul: V/m=20; t=25 °C)

4.1.2. Uticaj solvomodula na sadržaj ukupnih fenola i flavonoida iz

cveta lipe

Sadržaji ukupnih fenola i flavonoida u ekstraktima različitih solvomodula predstavljeni

su tabelarno i grafički (tabela 5, slika 23).

Može se videti da se najveća vrednost ukupnih fenola i flavonoida dobija pri

solvomodulu 60 (V/m), te je zbog toga u daljem radu upotrebljavana ova vrednost. Veći

solvomodul tj. veće zapremine rastvarača za ekstrakciju povećavaju efikasnost ekstrakcije.

Tabela 5. Uticaj solvomodula na ekstrakciju ukupnih fenola (mgGAE/g) i flavonoida (mgCE/g)

iz cveta lipe (vreme ekstrakcije: 120 minuta; koncentracija etanola: 50 %; t=25 °C)

Solvomodul TP (mgGAE/g) TF (mgCE/g)

30 3,207 2,437

40 4,232 2,489

50 4,877 2,847

60 5,601 3,982

46

Slika 23. Uticaj solvomodula na ekstrakciju ukupnih fenola (mgGAE/g) i flavonoida (mgCE/g) iz

cveta lipe (vreme ekstrakcije: 120 minuta; koncentracija etanola: 50 %; t=25 °C)

4.1.3. Uticaj temperature i vremena ekstrakcija na sadržaj ukupnih

fenola i flavonoida iz cveta lipe

Uticaj temperature na ekstrakciju fenolnih jedinjenja ispitivan je na tri različite

temperature: 25, 35 i 45 °C. Rezultati pokazuju da postoji povećanje sadržaja ukupnih fenola i

flavonoida u svim ekstraktima sa povećanjem temperature. Sa povećanjem temperature smanjuje

se viskoznost rastvarača, povećava koeficijent difuzije bioaktivnih materija kroz rastvarač,

skraćuje vreme bubrenja i prodiranja rastvarača u ćelije biljnog materijala, što sve pozitivno utiče

na process ekstrakcije. Ekstrakcija se može ubrzati prethodnim zamrzavanjem biljne sirovine što

dovodi do razaranja strukture ćelija (Ponomarev, 1976).

Vreme trajanja ekstrakcije takođe je bitan parametar od koga zavisi prinos i koncentracija

ekstrahovanih fenolnih jedinjenja. Produženom ekstrakcijom može doći do degradacije fenolnih

komponenata, zbog toga su za praćenje prinosa ekstrakcije i fenolnog sadržaja prikazani rezultati

ekstrakcija u trajanju od 5 do 120 minuta (tabele 6 i 7 i slike 23 i 24).

Kod svih ekstrakata primećuje se znatno povećanje prinosa ekstrakcije sa povećanjem

vremena ekstrahovanja do 120 minuta.

47

Tabela 6. Promena sadržaja ukupnih fenola sa vremenom ekstrakcije pri optimalnim

uslovima ekstrakcije iz cveta lipe (koncentracija etanola: 50 %; solvmodul: V/m=60) na

temperaturama: 25±0.1 °C; 35±0.1 °C i 45±0.1 °C

t (min) mgGAE/g (25 °C) mgGAE/g (35 °C) mgGAE/g (45 °C)

5 1,839 2,314 3,182

10 2,197 2,939 4,257

20 3,107 4,405 5,362

40 4,787 7,008 9,155

60 5,601 8,112 10,860

80 6,503 9,789 12,895

120 8,363 12,175 15,771

Slika 23. Promena sadržaja ukupnih fenola sa vremenom ekstrakcije pri optimalnim

uslovima ekstrakcije iz cveta lipe (koncentracija etanola: 50 %; solvmodul: V/m=60) na

temperaturama: (●) 25±0.1 °C; (■) 35±0.1 °C i (▲) 45±0.1 °C

48

Tabela 7. Promena sadržaja ukupnih flavonoida sa vremenom ekstrakcije pri optimalnim

uslovima ekstrakcije cveta lipe (koncentracija etanola: 50 %; solvmodul: V/m=60) na

temperaturama: 25±0.1 °C; 35±0.1 °C i 45±0.1 °C.

t (min) mgCE/g (25 °C) mgCE/g (35 °C) mgCE//g (45 °C)

5 1,142 1,301 1,888

10 1,384 1,896 2,727

20 2,138 3,432 5,029

40 3,225 5,259 7,060

60 3,982 6,439 8,712

80 4,696 7,785 10,707

120 6,649 9,319 12,054

Slika 24. Promena sadržaja ukupnih flavonoida sa vremenom ekstrakcije pri optimalnim

uslovima ekstrakcije cveta lipe (koncentracija etanola: 50 %; solvmodul: V/m=60) na

temperaturama: (●) 25±0.1 °C; (■) 35±0.1 °C i (▲) 45±0.1 °C.

Sa slika se može videti da se ekstrakcija fenolnih jedinjenja odigrava u dve faze. Na

početku, fenolne komponente koje se nalaze na površini čestica cveta lipe rastvaraju se u

kratkom vremenskom periodu (za dvadesetak minuta). U ovoj fazi, poznatoj kao ispiranje ili brza

ekstrakcija, rastvara se veći deo ekstrahovanih fenolnih jedinjenja. Kasnije, sadržaj fenolnih

jedinjenja sve sporije raste, kao rezultat difuzije ekstrahovanih jedinjenja iz unutrašnjosti čestica.

U ovoj fazi spore ekstrakcije sadržaj fenolnih jedinjenja u ekstraktima dostiže najveću vrednost.

49

4.2. Modelovanje kinetika ekstrakcije ukupnih fenola i

flavonoida iz cveta lipe

Za modelovanje kinetike ekstrakcije ukupnih fenola i flavonoida 50 % (v/v) etanolom,

primenjena su tri kinetička modela: model zasnovan na nestacionarnoj difuziji kroz biljni

materijal, empirijski model Ponomarjeva i model zasnovan na teoriji filma. U tabeli 8 dat je

prikaz korišćenih kinetičkih modela ekstrakcije.

Tabela 8. Kinetički modeli ekstrakcije ekstraktivnih materija iz biljnog materijala

Kinetička jednačina Linearna transformacija

Model zasnovan na

nestacionarnoj difuziji

Model zasnovan na teoriji

filma

Empirijski model

Ponomarjeva

4.2.1. Model zasnovan na nestacionarnoj difuziji

Početna vrednost sadržaja ukupnih fenola i flavonoida (qo), za slučaj maceracije 50 %

etanolom iznosi 17,011 mgGAE/g i 12,562 mgCE/g.

Kinetički parametri ekstrakcije ukupnih fenola i flavonoida iz cveta lipe mogu se odrediti

korišćenjem jednacine (3), koja predstavlja rešenje jednačine nestacionarne difuzije. Na Slikama

25 i 26 prikazane su zavisnosti log (q/qo) od vremena pri optimalnim uslovima ekstrakcije, da bi

se procenila valjanost modela zasnovanog na nestacionarnoj difuziji kroz biljni materijal. Može

se videti da linearna zavisnost log (q/qo) od vremena postoji u kasnijem periodu ekstrakcije

(posle 20-40 minuta), ali ne i u početnom periodu gde se uočava odstupanje eksperimentalnih

tačaka od prave linije. Prema tome, model zasnovan na nestacionarnoj difuziji kroz biljni

materijal važi samo u oblasti spore ekstrakcije. Vrednosti kinetičkih parametara su izračunate i

za proces ekstrakcije ukupnih fenola i za proces ekstrakcije ukupnih flavonoida primenom

metode najmanjih kvadrata i date u tabelama 9 i 10. Pri optimalnim uslovima ekstrakcije na

temperaturi od 45 oC postižu se najveće vrednosti koeficijenta ispiranja i koeficijenta spore

ekstrakcije.

50

Slika 25. Zavisnost log(q/qo) od vremena pri optimalnim uslovima ekstrakcije ukupnih fenola

iz cveta lipe (koncentracija etanola: 50%; solvmodul: V/m=60) na

temperaturama: (■) 25±0.1 °C; (●) 35±0.1 °C i (▲) 45±0.1 °C

Slika 26. Zavisnost log(q/qo) od vremena pri optimalnim uslovima ekstrakcije ukupnih

flavonoida iz cveta lipe (koncentracija etanola: 50 %; solvmodul: V/m=60) na

temperaturama: (■) 25±0.1 °C; (●) 35±0.1 °C i (▲) 45±0.1 °C

51

4.2.2. Model zasnovan na teoriji filma

Sadržaj ukupnih fenola i ukupnih flavonoida u zasićenom 50 % etanolu (cS), iznosi

18,453 mgGAE/g i 13,755 mgCE/g.

Slike 27 i 28 na kojima je prikazana zavisnost ln(1-c/cs) od vremena, potvrđuju da je

jednačina modela zasnovanog na teoriji filma (5) linearna i da "fituje" eksperimentalne podatke u

čitavom periodu ekstrakcije. Linearna zavisnost ln(1-c/cs) od vremena potvrđuju da model

zasnovan na teoriji filma važi u čitavom toku ekstrakcije, tj. i u periodu ispiranja i u periodu

spore ekstrakcije. Ovo je bitna prednost modela zasnovanog na teoriji filma u odnosu na model

zasnovan na teoriji nestacionarne difuzije kroz čvrst materijal i empirijski model Ponomarjeva,

koji važe samo u periodu spore ekstrakcije. Koeficijenti ispiranja ( ) i spore ekstrakcije (

izračunati su iz odsečka i nagiba pravolinijske zavisnosti ln(1-c/cs) od vremena, a u

izračunavanju su korišćeni eksperimentalni podaci iz čitavog perioda ekstrakcije. Vrednosti

koeficijenti su izračunate i za proces ekstrakcije ukupnih fenola i za proces ekstrakcije ukupnih

flavonoida primenom metode najmanjih kvadrata i date u tabelama 9 i 10.

Slika 27. Zavisnost ln(1-c/cs) od vremena pri optimalnim uslovima ekstrakcije ukupnih fenola

iz cveta lipe (koncentracija etanola: 50 %; solvmodul: V/m=60) na

temperaturama: (●) 25±0.1 °C; (■) 35±0.1 °C i (▲) 45±0.1 °C

52

Slika 28. Zavisnost log(1-c/cs) od vremena pri optimalnim uslovima ekstrakcije ukupnih

flavonoida iz cveta lipe (koncentracija etanola: 50 %; solvmodul: V/m=60) na

temperaturama: (●) 25±0.1 °C; (■) 35±0.1 °C i (▲) 45±0.1 °C

4.2.3. Empirijski model Ponomarjeva

Na slici 29 i slici 30 su prikazane zavisnosti 1-(q/qo) od vremena na osnovu empirijskog

modela Ponomarjeva, pri optimalnim uslovima ekstrakcije ukupnih fenola i flavonoida iz cveta

lipe. Kao i u slučaju jednačine modela zasnovanog na teoriji nestacionarne difuzije kroz biljni

materijal, empirijska jednačna Ponomarjeva važi samo u oblasti spore ekstrakcije, gde je

zavisnost 1-(qi/qo) od vremena linearna. Vrednosti koeficijenta ispiranja i koeficijenta pravca

jednačine (6) izračunate su metodom najmanjih kvadrata, uzimajući u obzir samo tačke u oblasti

spore ekstrakcije. Najveće vrednosti koeficijenata su postignute pri ekstrakciji na temperaturi od

45 oC (tabele 9 i 10).

53

Slika 29. Zavisnost 1-(q/qo) od vremena pri optimalnim uslovima ekstrakcije ukupnih fenola

iz cveta lipe (koncentracija etanola: 50 %; solvmodul: V/m=60) na

temperaturama: (●) 25±0.1 °C; (■) 35±0.1 °C i (▲) 45±0.1 °C

Slika 30. Zavisnost 1-(q/qo) od vremena pri optimalnim uslovima ekstrakcije ukupnih flavonoida

iz cveta lipe (koncentracija etanola: 50 %; solvmodul: V/m=60) na

temperaturama: (●) 25±0.1 °C; (■) 35±0.1 °C i (▲) 45±0.1 °C

54

4.2.4. Poređenje modela

U tabeli su prikazane vrednosti koeficijenata ispiranja i koeficijenata spore ekstrakcije na

različitim temperaturama, koje su određene korišćenjem različitih modela. U svim slučajevima

koeficijenti rastu sa povećanjem temperature zbog bolje rastvorljivosti ekstraktivnih supstanci i

povećanja koeficijenta difuzije.

Tabela 9. Vrednosti koeficijenta ispiranja i koeficijenta spore ekstrakcije za proces

ekstrakcije ukupnih fenola iz cveta lipe.

Temperatura, K Koeficijent ispiranja Koeficijent spore

ekstrakcije

Model zasnovan na

nestacionarnoj

difuziji, b, k

298

308

318

0,525

0,658

0,732

3,21·10-3

3,63·10-3

3,84·10-3

Empirijski model

Ponomarjeva,

b', k'

298

308

318

0,172

0,256

0,349

2,64·10-3

3,83·10-3

4,89·10-3

Model zasnovan na

teoriji filma,

b'', k''

298

308

318

0,094

0,092

0,105

4,36·10-3

8,12·10-3

13,27·10-3

Tabela 10. Vrednosti koeficijenta ispiranja i koeficijenta spore ekstrakcije za proces

ekstrakcije ukupnih flavonoida iz cveta lipe.

Temperatura, K Koeficijent ispiranja Koeficijent spore

ekstrakcije

Model zasnovan na

nestacionarnoj

difuziji, b, k

298

308

318

0,437

0,647

0,729

4,07·10-3

4,25·10-3

4,55·10-3

Empirijski model

Ponomarjeva,

b', k'

298

308

318

0,138

0,236

0,270

2,95·10-3

5,00·10-3

7,20·10-3

Model zasnovan na

teoriji filma,

b'', k''

298

308

318

0,074

0,076

0,236

4,37·10-3

9,47·10-3

17,30·10-3

Kao što se može videti koeficijenti ispiranja prema modelu zasnovanom na teoriji filma

(b'') imaju, generalno, manju vrednost od koeficijenata ispiranja izračunatih prema modelu

zasnovanom na teoriji nestacionarne difuzije (b) i empirijskom modelu Ponomarjeva (b'), dok

55

koeficijenti spore ekstrakcije izračunati prema modelu zasnovanom na teoriji filma (k'') imaju

veću vrednost od koeficijenata spore ekstrakcije izračunatih prema modelu zasnovanom na teotiji

nestacionarne difuzije (k) i empirijskom modelu Ponomarjeva (k').

Tabela 11. Koeficijenti korelacije koeficijenata ispiranja izračunatih primenom različitih modela

b b' b

''

B 1 0,9604 0,7569

b' 1 0,6889

b'' 1

Postoji velika korelacija između koeficijenata ispiranja izračunatih različitim modelima

(tabela 11). Najveća korelacija je zapažena između koeficijenta ispiranja izračunatih po modelu

zasnovanom na teoriji nestacionarne difuzije (b) i empirijskom modelu Ponomarjeva (b').

56

5. ZAKLJUČAK

57

Na osnovu rezultata određivanja optimalnih uslova ekstrakcije kao i rezultata ispitivanja

kinetike ekstrakcije ukupnih fenola i flavonoida iz cveta lipe, mogu se izvesti sledeći zaključci:

- Kao rastvarač za ekstrakciju ukupnih fenola i flavonoida iz cveta lipe korišćeni su

vodeni rastvori etanola sa 0, 30, 50, 70 i 100 %, pri odnosu rastvarač – biljna sirovina

30, 40, 50 i 60 V/m. Ekstrakcija je vršena na tri temperature: 25, 35 i 45 oC i sa

različitim vremenima: 5, 10, 20, 40, 60, 80 i 120 min. Optimalni uslovi ekstrakcije

ukupnih fenola i flavonoida iz cveta lipe su: 50 % etanol, 60 V/m, 120 min i 45 oC.

- Čvrsto-tečna ekstrakcija se odigrava u dve faze: ispiranje (brza ekstrakcija) i difuzija

(spora ekstrakcija).

- Za modelovanje kinetike ekstrakcije ukupnih fenola i flavonoida iz cveta lipe

korišćena su tri modela: model zasnovan na teoriji nestacionarne difuzije kroz čvrst

materijal, model zasnovan na teoriji filma i empirijski model Ponomarjeva. Model

zasnovan na teoriji nestacionarne difuzije kroz čvrst materijal i empirijski model

Ponomarjeva se dobro slažu sa eksperimentelnim podacima u periodu spore

ekstrakcije, dok model zasnovan na teoriji filma sa podacima i u periodu ispiranja i u

periodu spore ekstrakcije.

- Kinetički parametri fizičkih modela su koeficijent ispiranja i koeficijent spore

ekstrakcije. Vrednosti kinetičkih parametara zavise od primenjenog modela.

58

6. LITERATURA

59

Coulson J. M., Richardson J. F., Backhurts J. R., Harker J.H., Chemical engineering, Vol. 2, 2th

ed.: Particle technology and separation processes, Pergamon Press, Oxford, (1991).

Garcia-Salas P., Morales-Soto A., Segura-Carretero A., Fernández-Gutiérrez A. (2010).

Phenolic-Compound-Extraction Systems for Fruit and Vegetable Samples. Molecules, 15, 8813-

8826.

Halliwell B., Gutteridge J.M.C. (1990). The antioxidants of human extracellular fluids, Archives of

Biochemistry and Biophysics, 280, 1-8

Hemwimon S., Pavasant P., Shotipruk, A. (2007). Microwave-assisted extraction of

antioxidative anthraquinones from roots of Morinda citrifolia. Separation and Purification

Technology. 54: 44-50.

Herrmann K. (1989). Occurrence and content of hydroxycinnamic and hydroxybenzoic acid

compounds in foods. Critical Review in Food Science Nutrition, 28, 315−347.

Kovačević N., Osnovi farmakognozije, Farmaceutski fakultet, Beograd, 2004

Lepojević Ž. (2000). Praktikum hemije i tehnologije farmaceutskih proizvoda. Novi Sad:

Tehnološki fakultet.

Markham, K.R. (1989). Flavones, flavonols and their glycosides. U: Harborne, J.B., Dey, P.M.

(Eds.), Methods in Plant Biochemistry, Academic Press, London, pp. 193-237.

Miller J.N., Miller J.C., Statistics and Chemometrics for Analytical Chemistry, Pearson

Education Limited, London, England, 2005.

Moller J. K. S., Madsen H. L., Altonen T., Skibsted L. H. (1999) Dittany (Origanum dictamnus)

as a source of water-extractable antioxidants. Food Chemistry, 64, 215–219.

Nađanin V., Ispitivanje ekstrakcije i ekstrakata gajene lavande (Lavandula officinalis L.),

Doktorska disertacija, Novi Sad, Tehnološki fakultet, (2013).

Nuutila A.M., Puupponen-Pimia R., Aarni M., Oksman-Caldentey K.M. (2003). Comparison of

antioxidant activities of onion and garlic extracts by inhibition of lipid peroxidation and radical

scavenging activity. Food Chemistry, 81, 485-493.

Pekić B., Miljković D., Hemija i tehnologija kardiotoničnih glikozida, Univerzitet u Novom

Sadu, Tehnološki fakultet, Novi Sad, (1980).

60

Ponomarev V. D. 1976. Ekstragirovanje lekarstvennogo syr’ya. Medicina. Moscow.

Robards K, Prenzer PD, Tucker G, Swatsitang P, Glover W, Phenolic compounds and their role

in oxidative process in fruits, Food Chemistry, 1999, 66, 401-436.

Rice Evans, C., Miller, N., Paganga, G. (1995). Structure-antioxidant activity, relationships of

flavonoids and phenolic acids. Free Radical Biology and Medicine, 7, 933-956.

Savić J., Savić M., Osnovi analitičke hemije, Svjetlost, Sarajevo, 1990.

Singleton V.L., Rossi J. (1965). Colorimetry of Total Phenolics with Phosphomolybdic-

Phosphotungstic Acid Reagents, American Journal of Enology and Viticulture 16, 144-158.

Shahidi F., Wanasundara P.K.J. (1992). Phenolic antioxidants. Critical Reviews on Food Science and

Nutrition, 32, 67-103.

Stratil P., Klejdus B., Kuban V. (2006). Determination of phenolic compounds and their

antioxidant activity in fruits and cereals, Talanta 71, 1741-1751.

Tolić A., Operacija ekstrakcije tečno-tečno, Novi Sad , Tehnološki fakultet, (1996).

Vićentijevid Lj. (2001). Farmaceutska tehnologija I. Osmo izdanje. Zavod za udžbenike i

nastavna sredstva, Beograd.

Todorović M., Đurđević P., Antonijević V., Optičke metode instrumentalne analize, Hemijski

fakultet, Beograd, 1997.

Tumbas V. (2010). Antiradikalska i antiproliferativna aktivnost ekstrakata odabranih biljaka iz

familija Rosaceae i Ericaceae. Doktorska disertacija. Tehnološki fakultet, Univerzitet u Novom Sadu,

Novi Sad.

Turkoglu A., Duru M.E., Mercan N. (2007). Antioxidant and antimicrobial Activity of Russula

delica Fr: An Edible Wild Mushroom. Euroasian Journal of Analytical Chemistry, 1, 54-67.

Turkoglu A., Duru M.E., Mercan N., Kivrak I., Gezer K. (2007). Antioxidant and antimicrobial

activities of Laetiporus sulphureus (Bill.) Murrill. Food Chemistry, 101, 267-273.

Veljković V.B., Milenović D.M. (2002). Analiza ekstrakcije rezinoida kantariona (Hypericum

perforatum L.) II. Poređenje modela kinetike ekstrakcije, Hemijska industrija, 56, 60-67.

Wu X., Prior R.L. (2005). Identification and characterization of anthocyanins by high-

performance liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry in

61

common foods in the United States: vegetables, nuts, and grains. Journal of Agriculturyl and

Food Chemistry, 53, 3101-3113.

Wu X., Liang L., Zou Y., Zhao T., Zhao J., Li F., Yang L. (2011). Aqueus two-phase extraction,

identification and antioxidant activity of anthocyanins from mulberry (Morus atropurpurea Roxb.).

Food Chemistry, 129, 443-453.