Marcadores de inflamación bronquial en el diagnóstico … · 3 Inflamación bronquial en AO •...

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"Marcadores de inflamaciónbronquial en el diagnóstico y

control evolutivodel asma ocupacional".

Joaquín SastreServicio de Alergia

Madrid (España)

Mayo 2005

Clasificación de asma en el lugar de trabajo

Asma laboral u ocupacional con periodo de latencia-“forma clásica" de asma ocupacional con sensibilización a sustancias del alto

o bajo peso molecular

Asma ocupacional sin periodo de latencia (asma inducido por irritantes)

- Exposición a tóxicos única (RADS = reactive airway dysfunction syndrome- Exposición moderada-alta a tóxicos:

"Not-so-sudden onset irritant-induced asthma"

Asma pre-existente exacerbada en el trabajo por exposición a niveles bajos de irritantes

Síndromes variantes: bronqutis eosinofílica ocupacional, Asma-like disorders: exposición a endotoxinas vegetales, potroom asthma ( aluminio)

Eur Respir J, 2004

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FISIOPATOLOGÍA DEL ASMA OCUPACIONAL

Inflamación IgE-dependiente

• IgE específica a sustancias de alto peso molecular

• Alguna de bajo peso molecular se pueden unir a haptenos (proteínas o macromoléculas) para formar antígenos funcionales.

• Es el caso de sales de platino, anhídridos ácidos o sales de níquel y cromo, tintes,....

FISIOPATOLOGÍA DEL ASMA OCUPACIONAL

Inflamación linfocito T-dependiente

• En otros casos no se ha podido demostrar un mecanismo IgE, sin embargo, si parece existir una estimulación específica del sistema inmune, fundamentalmente de linfocitos.

• Clones de células T específicas se han demostradopara agentes de APM y para algunos de BPM en pacientes sensibilizados como isocianatos, ac.plicático, níquel, cobalto.

• Las células T pueden orquestar el procesoinflamatorio por sí solas.

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Inflamación bronquial en AO• Las biopsias bronquiales en los pacientes con AO

muestran signos de inflamación bronquial, unadescamación epitelial y una fibrosis subepitelial, con un engrosamiento aparente de la membrana basal y unahiperplasia del músculo liso bronquial.

• El recuento diferencial de las células inflamatoriasmuestra un aumento significativo en los recuentos de linfocitos, monocitos y macrófagos, eosinófilos, neutrófilos, mastocitos y células plasmáticas en lospacientes con AO respecto a los controles.

• No existen diferencias significativas en el número de células en las biopsias bronquiales al comparar lospacientes con AO causada por sustancias de peso molecular alto o bajo . (Am Rev Respir Dis 1992;145:160-168; 1995;151:340-344)

Agentes de APM o BPM producenun proceso inflamatorio muy similar.

El asma ocupacional sigue el “dogma” actual de inflamación en el asma

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Esputo en Asma ocupacional• Maestrelli y cols.realizaron un recuento celular en

las muestras de esputo de forma basal y a las 8, 24 y 48 horas tras la PPBE con isocianatos.

• Observan un incremento significativo del recuento de eosinófilos en los sujetos con asmaprofesional por isocianatos ( a las 8 y 24 horas trasla PPBE) con respecto a los sujetos control. También se observó un aumento en la poblaciónde neutrófilos pero no fue significativo respecto a la población control.

• No se apreciaron cambios significativos en otrostipos celulares, macrófagos o linfocitos,.

Clin Exp Allergy 1994; 24:29-34.

Esputo en Asma ocupacional

• Lemiere y cols. demuestran un incrementosignificativo del recuento de eosinófilos (tantoen porcentaje como en valor absoluto) y de neutrófilos (en números absolutos, pero no en porcentaje) en un grupo de 17 pacientes con asma profesional y PPBE positivas. No se apreciaron cambios en ninguna población celularen sujetos con asma no profesional expuestos a agentes frecuentes (cianoacrilatos, harinas,...).

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Esputo en Asma ocupacional• Pudieron definir que un aumento en el número de

eosinófilos mayor de 0.26x 106/mL y una disminución en en la PC20 de metacolina de al menos 1,8-veces, comparado con las basales, es capaz de predecir una caída en el VEMS del 20% en el 96% (95% CI, 70%-99%) de los pacientes. En aquellos en los que no hubo cambios en ninguno de los parámetros la posibilidad de una PPBE era del 4% (IC95%:0.5-26%) y en los que sóloaumentaban los eosinófilos pero sin cambio clínicamentesignificativo en la PC20 la posibilidad era del 66% (IC95%:12-74%).

• Por lo tanto, ambos parámetros que miden indirectamente inflamación bronquial pueden predecir una respuesta bronquial significativa.

J Allergy Clin Immunol. 2000;106:1163-70

Esputo en Asma ocupacional• Annes y cols. estudian 38 trabajadores con asma

ocupacional causado por sustancias de bajo peso molecular a los cuales se les realizó inducción de esputo y mediciones de función respiratoria (PEF) en condiciones de actividad laboral normal. Sólo14 de los 38 pacientes tenían eosinofilia en esputo (>2.2%).

• Ambos grupos, “eosinofílico” y “no eosinofílico”mostraban neutrofilia en esputo (19.6% y 18.8%, respectivamente).

(Thorax 2002; 57:231-236)

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• Park y cols. observan un incremento significativo en el recuento de neutrófilos y mastocitos y de IL-8 en el esputo inducido tras la PPBE con cereales. No apreciaron cambios en los niveles de eosinófilos activados ni de linfocitos. (Clin Exp Allergy 1998)

• Leigh R, Hargreave FE. Occupational neutrophilicasthma. Can Respir J 1999; 6:194-6.


• También hay algunos estudios en los que no se demuestra aumento variaciones en el recuento celular del esputo trasprovocaciones bronquiales en algunospacientes, aun a pesar de aumentar la hiperreactividad bronquial (Clin Exp Allergy 1998; 28:724-30. Eur Respir J. 1999; 13:482-488 )

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Neut %

Cambios en esputo inducido tras PBE

HMW (n=36) LMW (n=23)

0

5

10

15

20

25

30

35

Pre Post

Eos %

P<0.05

0

5

10

15

20

25

30

35

Pre Post

Eos %Neut %

P<0.05

RECEPCIÓN Y PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS

ESPUTO

ProcesamientoDTT 0,1%

PI

Contaje celular total

Viabilidad

% Escamosas

-

Se desecha

+

Citocentrifugación

Citometría de flujo

SANGRE(con EDTA)

Sangre completa

PBLs

Purificación de eosinófilos

Pellet de eosinófilos

Pellet de células

SANGRE(sin EDTA)

Suero

-80ºCBiología molecular

Sobrenadante

8

RESULTADOS

CITOMETRÍA

02468

1012141618

BronquitisEosinofílica (n=7)

AsmaOcupacional

(n=6)

Asma Extrínseco(n=6)

% E

osinóf

ilos

0

5

10

15

20

25

30

35


AsmaOcupacional

(n=5)


% E

osinóf

ilos

Valores de referenciaValores de referenciaEosinEosinóófilos: 1 filos: 1 -- 4 %4 %

SANGRESANGRE

ESPUTOESPUTO

Valores de referenciaValores de referenciaEosinEosinóófilos: 0,4 filos: 0,4 ±± 0,9 %0,9 %

0

10

20

30

40

50

60

Bronquitis Eosinofílica (n=7) Asma Ocupacional (n=5) Asma Extrínseco (n=5)

% N

eutr

ófilo

s Porcentaje de Neutrófilos en esputo

0

2

4

6

8

10

12

14

16

Bronquitis Eosinofílica (n=6) Asma Ocupacional (n=5) Asma Extrínseco (n=5)

% M

acró

fago

s

Porcentaje de Macrófagos en esputo

9

SANGRESANGRE

ESPUTOESPUTO0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

Bronquitis Eosinofílica(n=7)

Asma Ocupacional(n=5)

Asma Extrínseco (n=3)

% P

re.

Eosino

fílic

os

CD34+/CDw125+

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8




% P

re.

Eosino

fílic

os CD34+/CDw125+

CITOMETRÍA

SANGRESANGRE

ESPUTOESPUTO

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25




% B

asóf

ilos

Act

.

CD63+/CDw123+

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

Bronquitis Eosinofílica(n=6)

Asma Ocupacional (n=5) Asma Extrínseco (n=4)

% B

asóf

ilos

Act

.

CD63+/CDw123+

CITOMETRÍA

10

IL-5 IL-10 IL-13 VEGF

B. eosinofílica 0,58 + 0,29 (n=5) 1,04 + 0,48 (n=5) 0,51 + 0,31(n=5) 1,1 + 0,37(n=8)

A. ocupacional 0,53 + 0,22 (n=4) 0,95 + 0,42 (n=4) 0,54 + 0,15 (n=5) 1,43 + 0,5 (n=6)

A. extrínseco 0,99 + 0,75 (n=3) 1,61 + 1,57 (n=2) 0,49 + 0,28 (n=3) 1,23 + 0,67 (n=5)

RESULTADOS MUESTRAS EOSINÓFILOS DE SANGRE PERIFÉRICA

IL-5 IL-10 IL-13 VEGF

B. eosinofílica 0,51+ 0,25 (n=6) 1,02 + 0,56 (n=7) 0,7 + 0,27 (n=7) 1,46 + 0,7 (n=8)

A. ocupacional 0,43 + 0,22 (n=4) 0,83 + 0,67 (n=5) 0,74 + 0,81 (n=4) 1,3 + 0,76 (n=5)

A. extrínseco 0,84 + 0,6 (n=3) 1,52 + 0,77 (n=5) 0,65 + 0,4 (n=4) 1,54 + 0,53 (n=5)

RESULTADOS MUESTRAS ESPUTO

BIOLOGÍA MOLECULAR (resultados de pacientes positivos)

0

5

10

15

20

25

30

35

%

EOS NEU T CELLS MAC ACTIVATEDBAS

Células en esputo

BASALPOST-PROVOCATION -POS-PROVOCATION +

CASO CLÍNICO. PACIENTE POSITIVO A ESTIRENO

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Expresión de citoquinas por las células del esputo por RT-PCR

0

0,5

1

1,5

2

2,5

IL-5 IL-10 IL-13 VEGF IL-2 IL-4 TGF- IFN-

mR

NA

Fol

d In

duct

ion BASAL

POST-PROVOCATION +

Citoquinas solubles en sobrenadante de esputo

050

100150200250300350400450500

IL-8 IL-1 TNF-

pg/m

l

BASALPOST-PROVOCATION

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Esputo y Función pulmonar• Lemiere y cols. no hallan correlación entre el recuento de

eosinófilos y la caída de VEMS expresada como área bajo la curva o como caída máxima del VEMS, tras la respuesta asmática (J Allergy Clin Immunol. 2000;106:1163-70)

• Pero en otro trabajo estos mismos autores observaron unacorrelación significativa entre la caída del VEMS tras la PPBE y loscambios del esputo inducido en los recuentos de eosinófilos (r=0.5; p<0.001) y de neutrófilos (r=0.6;p<0.001). (J Allergy Clin Immunol2001; 107: 1063-8)

• Maestrelli y cols obtuvieron una correlación entre el recuento de eosinófilos en el esputo y la magnitud de la caída del VEMS durantela PPBE, expresada como área bajo la curva de la PPBE (r=0.71; p=0.014). En cambio, no encuentran correlación con la caídamáxima del VEMS. (Clin Exp Allergy 1994; 24:29-34)

Esputo y Función pulmonar• Obata y cols. (24) hallan correlación negativa entre el

porcentaje de caída del VEMS durante la PPBE y la variación en el recuento porcentual de eosinófilos en el esputo inducido a las 6 horas de la provocación con ácidoplicático (Eur Respir J 1999; 13:489-495)

• Annes y cols. relacionan la eosinofilia en esputo(>2.2%) con un grado de asma profesional más severoy una mayor reversibilidad tras el tratamientobroncodilatador. En cambio, no encuentran relaciónentre la eosinofilia en esputo y los valores de PEF durante la exposición a los agentes ocupacionales en sumedio laboral (Thorax 2002; 57:231-236)

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Esputo y Función pulmonar• Lemiére y cols (26) observan una relación inversa entre

los valores de PC20 de metacolina, el recuento de eosinófilos y el nivel de proteína catiónica del eosinófiloen el esputo inducido. Sin embargo, los datos aportadospor estos autores en cuanto a la correlación entre lasvariaciones de eosinófilos y neutrófilos y la hiperreactividad bronquial son bajos (r=-0.4; p=0.03 y r=-0.4; p=0.01; respectivamente)(J Allergy Clin Immunol2001; 107: 1063-8)

• Di Franco y cols (27) estudian 24 pacientes con asmaprofesional. Observan una relación inversa significativaentre el porcentaje de eosinófilos en las muestras de esputo y la respuesta a la inhalación de salinohipertónico. No obstante, no encuentran relación entreel porcentaje de eosinófilos y la PD20 metacolina (RespirMed 1998; 92: 550-7)

Esputo y Función pulmonar• Chan-Yeung y cols realizaron un estudio en 71 pacientes con asma

ocupacional por cedro rojo utilizando varios parámetros como funcionales (espirometría), test de metacolina, óxido nítrico exhalado y esputo inducido.

• El porcentaje de eosinófilos en el esputo inducido mostró una una correlación inversa significativa con el VEMS (r = -0.46, p < 0.001) y una correlación positiva significativa con los niveles de ONE (r = 0.42, p < 0.001) y con la clase de incapacidad (r = 0.52, p < 0.001).

• En este estudio se demuestra que el número de eosinófilos en esputo se correlaciona mejor que el ONE con el grado de incapacidad respiratoria medido fundamentalmente por parámetros funcionales, pero se observa también una clara tendencia al aumento de ONE según el grado de incapacidad. (Am J Respir Crit Care Med. 1999;159:1434-8)

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Esputo inducido en el seguimiento del asmaocupacional.

• Lemiere y cols estudian el comportamiento de loseosinófilos en el esputo en 10 pacientes con asmaocupacional y sin asma ocupacional en periodo de trabajoy sin trabajar.

• Los pacientes con asma ocupacional tuvieron un incremento significativo en la media (intercuartil) de eosinófilos en el esputo y ECP cuando estabantrabajando comparado con los peridos sin trabajar,10.0 (17.05) frente a 0.8 (1.6)% (p=0.007) y 3,840 (6,076) frente a 116 (180) microg x L(-1) (p=0.01). (Eur Respir J. 1999; 13:482-488)


• Girard y cols. estudian 49 pacientes con asmaocupacional y les realizan un seguimiento de pico-flujo y análisis de esputo inducido mientrasestaban trabajando y durante una baja laboral.

• Encuentran que el añadir el análisis de esputo a la monitorización del pico flujo aumenta la especificidad de la prueba en 18 (rango [r] 13.7-25.5) o 26.8% (r 24.8-30.4) dependiendo sise elige el punto de corte en el incremento en porcentaje de eosinófilos en mas del 1% o 2% cuando estaban trabajando. (Am J Respir CritCare Med. 2004;170:845-50)

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• Magnni y cols realizan un seguimiento de 133 pacientes con asma ocupacional durante una media de 8,7 años después de retirase de su puesto de trabajo.

• En 9/28 pacientes (32.1%) sin mejoría frente a 6/56 (10.7%) con mejoría parcial o curación tenían una eosinofilia en esputo igual o mayor del 2% y en 11/28 (39.3%) frente a 11/56 (19.6%) pacientespresentaban una neutrofilia en esputo mayor o igual del 61%.

• Los niveles en esputo de mieloperoxidasa ie IL-8 fueron significantemente mayores en el grupo que no mejoraron.

• Este estudio demuestra que los pacientes con asma ocupacional que no mejoran tras dejar la exposición tienen un claro componente de inflamación bronquial.(Am J Respir Crit Care Med. 2004;169:367-72)

Esputo en otro tipo de patologíarespiratoria ocupacional

• En trabajadores de granjas de cerdos con síntomas respiratorios.

• El análisis del esputo de los pacientes en comparación con controlesdemostró un aumento significativo del número de macrófagos, mientras que no hubo diferencias en el número de neutrófilos. No se encontraron eosinófilos.

• De forma paralela encontraron un ligero aumento en los niveles de óxido nitrico exhalado en los pacientes con respecto a los controles.

• Estos resultados apoyan que en este tipo de patología hay unainflamación en las vías respiratorias mas periféricas y que es distintaa la encontrada en el asma o en la bronquitis crónica. (J Toxicol ClinToxicol. 1998;36:557-65)

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Conclusiones• La proporción de eosinófilos en el esputo y de proteína

catiónica del eosinófilo estan aumentadas en muchospacientes con asma ocupacional inducido por sustancias de alto o bajo peso molecular, aunque en algún subgrupo de pacientes pueden predominar los neutrófilos.

• La monitorización de la celularidad del esputo puedesuplementar el resultado de otras técnicas diagnósticascomo el segumiento de pico flujo, la hiperreactividad bronquial a metacolina o la pruebas de provocaciónespecífica para establecer el diagnóstico de asmaocupacional

• La monitorización de los cambios celulares en esputo el también puede servir para monitorizar los cambiosinflamatorios bronquiales que ocurren en sujetos con asmaocupacional tras cesar su exposición.

BRONQUITIS EOSINOFÍLICA OCUPACIONAL

- Entidad caracterizada clínicamente por tos, ausencia de broncoespasmo, test de metacolina negativo e inflamación bronquial eosinofílica.

- Buena respuesta a esteroides inhalados - Se ha descrito por latex y lisozima (IgE

mediada) y acrilatos - Fisiologíapatología: ausencia de mastocitos en

la zona de musculo liso bronquial ¿? - Se considera como una variante de asma

ocupacional

17

bas 10 20 30 min 1h 2h 4h 6h 8h 10h 24h0

20

40

60

80

100

120

0

20

40

60

80

% Fall in FEV1 % eosinophils in sputum

PC20 methacholine > 16 mg/ml PC20 > 16 mg/ml

Latex-induced eosinophilic bronchitis

Latex 99 ng/m3 60 minutes

Allergen challenge

Quirce et al. JACI 2001

OXIDO NÍTRICO EXHALADO EN ASMA OCUPACIONAL

• Pilipari y cols (40) han valorado los niveles de ONE en 40 pacientes con sospecha de asmaocupacional antes y después de la provocaciónbronquial específica.

• Encontraron un un aumento significativo en losnivels de ONE sólo en los pacientes en los que la provocación bronquial fue positiva con respuestatardía y que además presentaban valores normalesbasales de ONE.

• En los pacientes con provocación positiva y con valores basales >14.5 ppb no encontró unaelevación significativa. (Eur Respir J. 2002 ;20:1532-7)

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• Allmers y cols valoraron los cambios en ONE trasprovocaciones bronquiales en pacientes son sospecha de asma ocupacional por isocianato de difenilmetano (MDI) y látex, así como trasprovocaciones con metacolina.

• En 3/9 pacientes en los que se produjo unarespuesta inmediata por MDI se produjo unaelevación > de 10 ppm de ONE a las 22 horas.


• Ocho de los 18 pacientes que fueron sometidos a la provocación con látex mostraron aumentos > 10 ppm de ONE tras la provocación.

• Pero en sólo 4 de estos 8 tuvieron una caída significativadel VEMS.

• En tres sujetos de los 19 en los que se realizó un test de metacolina y que además habían recibido un broncodilatador se observó una disminución de lasconcentraciones de ONE a las 16-18 horas.

(Int Arch Occup Environ Health. 2000 ;73:181-6)

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• Obata y colbs (24) no encontraron una relación entrelos cambios en eosinófilos en el esputo, inducidos por la provocación bronquial con el ácido plicático del cedrorojo y las modificaciones de las concentraciones de ENO originadas por la misma. (Eur Respir J 1999; 13:489-495)


• Adisesh y cols estudiaron los niveles de ONE y nasal en pacientes con sospecha de asmaocupacional relacionado con sensibilización a animales de laboratorio.

• Encontraron un aumento de ONE en aquellossujetos con alergia a animales y que estabansintomáticos ( media 17,97±1,24 ppb 1.24) comparado con los asintomáticos (6.08 ppb+/-1.15, P < 0.05).

• Los pacientes sintomáticos también presentabanun aumento del ONE nasal con respecto a losasintomáticos (diferencia media de 378 ppb, P < 0.05). (Clin Exp Allergy. 1998;28:876-80)

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• Baur y Barbinova han estudiado los valores de ONE trasprovocaciones bronquiales con látex en pacientessensibilizados y controles.

• El ENO aumentó una hora después de las provocacionesen pacientes y controles, pero sólo en los pacientessensibilizados se produjo un aumento del ENO a las 22 horas de la provocación positiva con látex.

• No encontraron diferencias en el ENO basal o a las 22 horas en sujetos alérgicos al látex con asma o sólo con rinitis.

• La especificidad y sensibilidad de un incremento del 50% en el ENO a las 22 horas de una respuesta positiva fue del 100 y 56% respectivamente.


• En este trabajo el aumento de ENO, aunque significativo, no presentaba grandes variaciones pasando de valoresbasales de 0,1 a 0,8 ppb de media basal a un máximo a las22 horas en los pacientes con provocaciones positivas de 6,8±1,7.

• Los pacientes fumadores tenían menor ENO basal, pero en los fumadores y no fumadores con provocación al látexpositiva se produce un aumento de ENO.

• Los corticoides inhalados hacen no aumentar el ENO durante las provocaciones pero no abolen la respuestaclínica a la provocación. (Eur Respir J. 2005;25:309-16)

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ONE en otro tipo de patologíarespiratoria ocupacional

• Se ha evaluado los niveles de ONE y nasal en trabajadores expuestos a cubas de electrolisis de aluminio( potroom asthma).

• En los trabajadores no fumadores y expuestos a las cubasde electrolisis se obtuvieron concentraciones de ONE mayores que en los sujetos no expuestos 9.3 (6.2-15.6) vs5.7 (4.6-8.3) ppb, p=0.001). Los dos grupos no diferíanen valores espirométricos y en síntomas asmáticos.

• Los trabajadores expuestos no fumadores con síntomasde asma tenían concentraciones de ONE mas altas quelos que no tenían síntomas ( media e intercuartil): 21.0 (19.3-41. 4) v 8.5 (5.9-12.8) ppb, p=0.001) pero teníanvalores espirométricos comparables.


• En los pacientes fumadores no se encontró diferenciaentre expustos y controles (media y rango intercuartil: 4.6 (3.3-8.0) v 4.0 (3.4-5.1) ppb.

• El ONE no se asoció de forma significativa con la duración del empleo o los niveles de fluoruros o polvoinhalado.

• El ONE podría ser un marcador temprano de afectación , en sujetos no fumadores, expuestos a cubas de electrolisisde aluminio.

(Occup Environ Med. 2000 ;57:274-8)

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• Olin y cols estudian los cambios en ONE en sujetos expuestos a ozono en varias factorías de blanqueado de pasta de madera.

• Los trabajadores expuestos a mas altas concentraciones de ozono mostraron un aumento en los síntomas respiratorios y tenían una media mas alta en ONE en comparación con el grupo de trabajadores menos expuesto al ozono (19.2 frente a 15.7 ppb).

(Eur Respir J. 2004;23:87-92)

Conclusiones• A la vista de los resultados de los diferentes

estudios analizados, no puede aventurarse unaopinión definitiva acerca de la relación entre lasconcentraciones de ENO y las provocacionesespecíficas con agentes ocupacionales, por lo queel valor diagnóstico de esta prueba, en la actualidad, es limitada.

• Tampoco hay experiencia en el seguimiento del asma ocupacional. Sin embargo, parece que el análisis de esputo inducido aporta una evidenciamas objetiva de inflamación bronquial y el gradode afectación respiratoria en estos pacientes.

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