Manual Descongelacion y Siembra

5/11/2018 Manual Descongelacion y Siembra - slidepdf.com

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MANUAL DE DESCONGELACIÓN Y SIEMBRA DE LA LÍNEA CELULAR 3T3-L1

GLOSARIO Cultivo celular: Conjunto de técnicas que permiten el mantenimiento de células in vitro,

conservando al máximo sus propiedades fisiológicas, bioquímicas y genéticas

Cultivo celular primario: Se establece a partir de células, tejidos u órganos y consiste en preservar

su viabilidad por un periodo limitado de tiempo.

Diferenciación celular: Es el proceso por el que las células adquieren una forma y una función

determinada durante el desarrollo embrionario o la vida de un organismo pluricelular,

especializándose en un tipo celular.

Línea celular: Se origina a partir de un cultivo de células u órganos primarios y posee lacaracterística de ser “inmortal”.

Línea celular 3T3-L1: Esta línea celular se origina a partir del cultivo primario de las células 3T3 del

ratón suizo albino. Tiene características morfológicas de fibroblastos que bajo ciertos estímulos de

tipo hormonal llegan a diferenciarse a adipocitos.

Suero de ternera: Suero que sirve para enriquecer los medios de cultivo y propiciar el crecimiento

celular. Proviene de bovino recién nacido



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ObjetivoEstablecer las condiciones experimentales necesarias para la descongelación y siembra de la línea

celular 3T3-L1.

AlcancePersonal involucrado en el crecimiento y diferenciación de la línea celular 3T3-L1

FrecuenciaCada vez que se tenga que descongelar células para su posterior diferenciación

Material y equipoPipetas, centrífuga, crioviales, baño maría, medio DMEM 1X (suero de ternera), tubo cónico de 15

mL, vaso de precipitado para desechos, vórtex, botella de cultivo de 75 cm2

o 175 cm2, colorante

azul de tripano, micropipetas, incubadora de CO2.

INSTRUCCIONES

1.- Colocar el frasco de DMEM 1X (suero de ternera) en baño María a 37°C (Ver ANEXO 1)

2.- Descongelar las células en baño María a una temperatura de 37°C

3.- Centrifugar el criovial, 3 min/4000 rpm a TA, para eliminar el DMSO y DMEM.

4.- Decantar el sobrenadante, resuspender las células en 1 mL de DMEM 1X suero de ternera

(previamente temperado a 37° C) y cuidadosamente homogenizar con pipeta.

5.- Contar las células (Ver ANEXO 2)

6.- Pasar las células a una botella de cultivo y agregar DMEM 1X (suero de ternera) necesario hasta

obtener el volumen adecuado (ver Tabla 1). Observar células al microscopio.

7.- Incubar las células a 37° C en incubadora al 5% de CO 2 y 95 % de humedad.

8.- Revisar las células a las 48 hrs, si no vira el pH del medio de cultivo, hacer el cambio a las 72 hrs

(pH óptimo: 7.4 ± 0.2).



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Tabla 1 DMEM 1X

25 cm2

5 mL

75 cm2 12 mL

FLUJOGRAMA DE DESCONGELACIÓN DE CÉLULAS Y SIEMBRA 3T3- L1

Colocar DMEM 1X (suero de ternera)a una temperatura de 37° C

Descongelar células a unatemperatura de 37° C

Centrifugar el criovial para eliminarel DMSO y DMEM

Verter el sobrenadante y resuspender células en 1mL de DMEM 1X (suero de ternera)

Contar las células

Pasar las células a una botella decultivo

Incubar las células a 37 ° C al 5% deCO2 y 95% humedad

Revisar las células a las 48 hrs



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BIBLIOGRAFÍA

Libro de cultivo celular y el inserto de líneas 3T3-L1

Bitácoras: Saray Quintero y Rocío López

http://difcelular08.blogspot.es/ accesado 15 de julio 2010

Freshneyr R. Ian. Culture of animal cells. A manual of Basic Technique; 3rd ed

Wiley-Liss New York USA 1994. ISBN 0-471-58966-7

http://difcelular08.blogspot.es/





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ANEXOS

Anexo 1Preparación de DMEM 1X

Para 1000 mL Para 500 mL Para 250 mL Para 100 mL

DMEM 850 mL 425 mL 212.5 mL 85 mL

Aminoácidos 10 mM 100X 10 mL 5 mL 2.5 mL 1 mL

Piruvato de Na 100 mM 100X 10 mL 5 mL 2.5 mL 1 mL

L-glutamina 200 mM, Penicilina 10,000

U/mL/Estreptomicina 10,000 µg/mL10 mL 5 mL 2.5 mL 1 mL

HEPES (1.25 M-Stock) 25 mM* 20 mL 10 mL 5 mL 2 mL

Suero de ternera (previamente

inactivado)**

100 mL 50 mL 25 mL 10 mL

*Ver anexo 3 **Ver anexo 4

NOTA: Colocar una pequeña porción en un tubo e incubar para observar si existe algún cambio de

coloración.

Anexo 2Conteo de células

1.- Resuspender las células y tomar una alícuota de 20 µL de células

2.- Colocarlas en un tubo eppendorf de PCR3.- Adicionar 20 µL de colorante azul tripano

4.- Homogenizar

5.- Colocar 10 µL de la mezcla anterior en la cámara de

Neubauer y contar

NOTA: Contar solo las células redondas y refringentes,

las células teñidas de azul son células muertas.

6.- Contar los cuatro cuadros con la letra L

Fórmula:

# células en la suspensión celular =



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Anexo 3Preparación de HEPES

1.- Sigma H-4034 100 mg PM 238.32.- Pesar 29.7875 g de HEPES para 1.25 M (solución stock)

3.- Aforar a 100 mL con agua destilada estéril (preparar en condiciones

de esterilidad)

4.- Almacenar a 4° C.

Anexo 4Preparación de HEPES

1.- Calentar previamente el baño maría a 60° C

2.- Monitorear la temperatura del baño con un termómetro, el cual debe

estar dentro de una botella y estar dentro del baño para observar que no

haya variación en la temperatura.

3.- Colocar el suero en el baño María durante 30 minutos

4.- Alicuotar el suero en volúmenes de 5 y 10 mL

5.- Etiquetar el suero de ternera (inactivado)

6.- Almacenar a -20° C.

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