Lovro Žiberna
description
Transcript of Lovro Žiberna
Lovro Žiberna
GENSKI DOPINGGENSKI DOPING
Fakulteta za farmacijo, Univerza v Ljubljani
OPREDELITEV DOPINGA
Definicija po MOK [2000]:• uporaba snovi ali metod, ki so
potencialno škodljive za športnikovo zdravje in/ali lahko izboljšajo dosežke, ali
• prisotnost prepovedanih snovi v organizmu ali če je iz prisotne snovi v organizmu razvidna uporaba prepovedane tehnike.
GENSKA TERAPIJA
Pričetek genske terapije leta 1990.
GENSKI DOPING
Definicija: Neterapevtska uporaba genov, genskih elementov, celic ali modulacije genske ekspresije, katere cilj je izboljšati sposobnost športnika.
Gre za gensko “terapijo” na zdravem človeku.
Na prepovedani listi [WADA] od leta 2003.
MOŽNOSTI UPORABE
Možnosti vgraditve umetnega gena v telesno celico:• direktna injekcija DNA v mišico (lokalna in vivo tehnika)• uporaba virusnega vektorja (sistemska ali lokalna in vivo tehnika)• vstavitev genetsko modificiranih celic (ex vivo tehnika)
VEKTORJIGenski prenos Vektor Lastnosti
NevirusniLiposomi Z DNA pokriti zlati delciDNA proteinski kompleksiGola DNA
manj efektivna transdukcijaprehodna ekspresijanizka imunogenostlažja priprava
Virusni
Adenovirus okuži mitotične / postmitotične celicenizka citotoksičnostpogost imunski odziv
Adeno-asociacijski virus nizka toksičnostnizka imunogenostvisoka perzistenca vstavljenega genanizka kapaciteta za genski insert
Retrovirusi nizka toksičnostnizka imunogenostokuži samo mitotično aktivne celicenizka kapaciteta za genski insert
Herpes simplex okuži mitotične / postmitotične celicevisoka kapacitetapogost imunski odzivperzistira v celicah v CŽS
30V, 10 krat po 20ms pulzi.Insercija pCAGGS-Lac-Z plazmidne DNA kot vektorja za vnos tarčnega gena.
ELE
KT
RO
PO
RA
CIJ
A
LIP
OS
OM
ILI
PO
SO
MI
VIRUSNI VEKTORJI
EX VIVO princip genske terapije/dopinga
ERITROPOETIN
1997:
• adenovirusni vektorji z genom za EPO i.m. v miške. Opazili so ↑c [Hb] in ↑ Ht iz 49% na 81%. Efekt je trajal >1 leto.
• Podobno v opice: ↑ Ht iz 40% na 70%. Stabilno 90 dni.
2004:• AAV in vivo prenos gena za
EPO• vbrizgali v skeletne mišice
8 opic• Rezultati:
4 opice: ↑ Ht do kritične meje
4 opice: naglo upadanje c[EPO] -> huda anemija
AVTOIMUNSKA REAKCIJA!
2004 (Nacionalni anti-doping laboratorij v Franciji):
• gen za EPO injicirali v opice i.m.• razlike v strukturi med nativnim in
novim eritropoetinom• post-translacijske modifikacije!
(imunski odziv)• zaznava genskega dopinga
IGF-1
• hiperplazija in hipertrofija miocitov skeletnih mišic
• genska terapija: degenerativne mišične bolezni in ↑mišične moči pri starostnikih
• s starostjo propadajo hitra mišična vlakna, podobno pri mišični distrofiji (hitreje, izraziteje)
Regeneracija miocitov:
1) intaktni distrofin
2) satelitne celice
• AAV – IGF-1 i.m. mladim miškam: 15-30% povečanje mišične mase in ↑hitrosti pridobivanja mišične mase
• enako na srednje starih miškah: ohranile povečano mišično moč v starosti. Enaka hitrost kontrakcije kot pri mladih miškah.
• Transgenske miši: ↑ IGF-1 v skeletnih mišicah -> 20-50% večja mišična moč.
SIMULACIJA GENSKEGA DOPINGA:
• V eno nogo i.m. vbrizgali AAV-IGF-1, drugo nogo pustili intaktno.
• intenzivni 8-tedenski trening
• Noga (AAV-IGF-1) je razvila 2x večjo mišično moč kot druga noga + izguba mišične moči počasneje po prenehanju treninga
MIOSTATIN
• miostatin = inhibirajoči rastni faktor (GDF-8) član družine TGF-
• omejuje prekomerno rast satelitnih celic -> mišičnih celic
• embrionalni razvoj in v odrasli dobi
• atrofija mišic ob zmanjšani funkcionalni potrebi
• vloga pri nalaganju maščob
• 1999: transgenske miši (“knock-out” za MSTN)• rezultati: hiperplazija in hipertrofija mišičnih
vlaken -> “Shwarzenegger” ali “Mighty mouse”• živali: “double muscled” govedo. 2 pasmi:
Belgian Blue, Piedmontese. Mutacija na MSTN: neefektivna oblika miostatina.
• 2001: miši z intaktnim MSTN, vendar naknadno povzročili mutacije na tem genu. Podobni rezultati.
• 2004: v Nemčiji diagnosticirali dečka z mutacijo MSTN. Mati imela mutacijo gena na enem kromosomu.
• 2005: uporaba topnega activin type IIB receptor – molekula normalno na celicah, kamor se veže miostatin. Rezultati: do 60% povečanje mišične mase.
Starost : 7 m
esecev
• v letu 2005: zaenkrat ni še nobenih inhibitorjev miostatina na trgu
• v fazi kliničnega testiranja: pripravek s protitelesi proti miostatinu
• cilj za prihodnost: ustvariti manjše verzije miostatina brez signalnega dela molekule (genski prenos genskega zapisa)
• uporaba: terapija mišične distrofije, genski doping
VEGF
Odgovoren za produkcijo novih žil - ANGIOGENEZA
LEPTIN
•Hormon, ki sodeluje pri regulaciji občutka lakote.
• OB gen, OB-R gen
•Za razliko od miši: pri debelih ljudi ponavadi ↑konc. leptina od normalne, v likvorju pa nižja
•Motnja: pri vstopu leptina v cerebrospinalno tekočino, verjetno zaradi zmanjšane ekspresije OB-R –> manj receptorjev za leptin na endotelijskih celicah v možganih
•Uravnavanje vnosa hrane in občutka za lakoto in sitost je izrazito kompleksno: NpY, CRH, monoaminski NT
1997: virusni vektor z genskim zapisom za leptin injicirali v miši -> upad telesne teže
ENDORFIN
•Endogeni opioidi. Normalno izločata hipofiza in hipotalamus.
•descendentne poti endogene analgezija
•genski doping, lajšanje bolečin pri bolnikih s terminalnimi boleznimi
PPAR delta
• ustvarili transgenske miši z PPAR delta s povečano aktivnostjo
• miši pričele izgubljati maščevje
• remodeliranje skeletnih mišic:
- ↑ št. počasnih vlaken
- št. hitrih vlaken
• več mitohondrijev, večja kapaciteta aerobnega metabolizma
• v miši aplicirali zdravilo GW501516, ki ga razvija GlaxoSmithKline. Je aktivator PPAR delta.
• ugotovili podobne spremembe kot pri transgenskih miših
• miši kljub dieti bogati z maščobami in nizki telesni aktivnosti niso pridobivale na telesni masi tako hitro kot kontrolna skupina
• te miši so poimenovali “maratonske” miši:
pretekle 1800m (kontrolna sk. : 900m), tek brez prekinitve 150 min (kontrolna sk. : 90 min)
• ostale spremembe: povečana prekrvavitev, zvečana motorična inervacija skeletnih mišic,spremembe na srčni mišici
• doping:
- z zdravili povečevanje aktivnosti PPAR delta
- prenos genskega zapisa za PPAR delta v telo z uporabo vektorjev (genski doping)
ŠPORTNE POŠKODBE
• rehabilitacijski programi, nove operativne tehnike
• omejitve pri celjenju poškodb muskuloskeletnega sistema: ligamenti, tetive, meniski, sklepni hrustanec, kostnina.
• biološki pristopi: terapija z rastnimi faktorji
• izločajo celice na mestu poškodbe: fibroblasti, endotelijske celice, mezenhimske zarodne celice
ali
• vnetne celice (makrofagi, monociti)
• delovanje: stimulacija celične proliferacije, migracije, diferenciacije in ↑sinteza ECM
Rekombinantna zdravila vs. genska terapija
• lokalna koncentracija pomembna• pri rekombinantnih proteinih: nizek razpolovni
čas in vivo -> visoke doze in pogosta aplikacija• visoke koncentracije v plazmi: rast tumorjev,
angiogeneza
Tkivno inženirstvo• razvoj bioloških substitutov za
popravilo, rekonstrukcijo, regeneracijo ali nadomestilo tkiv
• genska modifikacija tkiv• Uporaba mioblastov, katerim ex
vivo vgradimo zapise za rastne faktorje in jih nato injiciramo lokalno. Ohranjena sposobnost diferenciacije: v mišico, ligament, kostnino ali meniskus.
SKELETNE MIŠICE
• 10-55% vseh športnih poškodb
• večje poškodbe: tvorba fibroznih brazgotin – slabijo mišično funkcijo, nastanek kontraktur, kronične bolečine
• dobre rezultate: bFGF, BGF, IGF-1
• pristopi z npr. AAV-IGF-1• meja med terapijo in
dopingom?
KRIŽNA VEZ (lig.ant. cruciatum)• pretrganje sprednje križne
vezi – med najbolj pogoste poškodbe
• kirurški poseg: rekonstrukcija• vez, da doseže polno
stabilnost in moč potrebuje 3 leta
• športniki bi naj vsaj 6 mesecev bili odsotni od tekmovanj
• Lokalna ↑konc. PDGF-AB, EGF, bFGF – “ligamentizacija”
• Genska terapija: virusni vektorji in vgradnja zapisov za rastne faktorje in citokine
• Med operacijo ali predhodni odvzem tkiva (ex vivo)
NEVARNOSTI
Razdelitev:
1) tveganje odvisno od vektorja
2) tveganje odvisno od transgena
• kontrolirano okolje - laboratorij
• virus lahko pridobi patogenost v telesu
• imunogenost virusnih proteinov – vnetja
• naključna vgradnja genskega zapisa v genom -> prekinitev onkogena
Uspešnost genske terapije
• ozdravili okoli 3000 pacientov• tragični zapleti
1999 prostovoljec umrl pri genski terapiji deficience ornitin dekarboksilaze zaradi prekomernega imunskega odziva
• avtoimunski zapleti pri opicah (EPO)• X-vezana huda kombinirana imunska deficienca: pri
2 nastanek T-celične levkemije. Retrovirusni vektor je vgradil transgen blizu onkongena LMO-2.
• pomanjkljivo znanje o interakcijah med posameznimi geni
• terapevtski geni se vedno ne vgradijo na ustrezno (predvideno) mesto
• skoraj vedno prisotni simptomi podobni gripi: vročina, drgetanje, občutek mrzlice, občutek slabosti, neugodja, suh kašelj, izguba apetita, bolečine po telesu
• kontaminacija: kemična ali biološka• nevarnost za razvoj novih oblik virusa –
replikacijsko kompetentni virusi (RCV)• večkratno doziranje – imunski sistem
Nevarnosti - EPO• prekomerno izločanje eritropoetina:
↑eritrocitov (policitemija) in ↑viskoznost krvi –> TROMBOZA in obremenitev srčne mišice
• AMI, možganska kap,periferne ishemije
• Terapija: antikoagulativna +
1. kateter in kontrolirana krvavitev ob hkratni infuziji fiziološke raztopine
2. citofereza (izločijo se celice, ostale sestavine krvi nazaj)
• Kontrola genske ekspresije!
Nevarnosti – IGF-1,blok. miostatina
• povečanje mišične moči za 20-40% v kratkem času
• problem le pri starostnikih ali pri ljudeh z osteoporozo: lahko pride do zlomov na mestih, kjer se tetiva vrašča na kost
Nevarnosti – IGF-1 in VEGF• rastni faktorji v krvnem
obtoku potencial iniciacije tumorske rasti
Tveganje za okolje
• izločanje iz telesa genetsko modificiranih celic ali izločki, ki vsebuje vektorje z genskim insertom
• v protokolu: kontrola krvi, blata, urina, sperme in sline.
• genski doping izven kontroliranih razmer
DETEKCIJA
• problem: preneseni geni identični človeškim
• genetska “črtna koda”
• lokalno injiciranje vektorjev v skeletne mišice – iskanje ostankov
• preproste infekcije,npr. adenovirusi povzročajo 25% vseh prehladih obolenj
• potrebno natančno vedeti, kam so bili geni vnešeni – “iskanje šivanke v senu”
• 2004: strukturne razlike med proteini zaradi različnih post-translacijskih modifikacij
• iskanje določenih proteinskih označevalcev – “screening” več sto proteinov naenkrat
• PET in SPECT neinvazivne molekularne slikovne metode: detekcija specifične mRNA v tkivih, kjer je normalno ni. Hibridizacija s primerni antisense oligonukleotidnimi probami, ki so označene.
RNAze H -> zato razvijajo peptidne nukleinske kisline
HVALA ZA POZORNOST!