Mutazioni geniche

MUTAZIONE

Cambiamento ereditario, raro e casuale che provoca

un’alterazione qualitativa e/o quantitativa dell’informazione

genetica, non dovuto a segregazione o ricombinazione

di geni preesistenti

Individuo mutante

Gene normale -> il cambiamento mutazionalepuò essere valutato rispetto ad uno standard che chiamiamo “normale” rappresentato dal genotipo selvatico, che puo’ essere la forma genica piu’ diffusa in natura o presente in uno stock standard di laboratorio

Tipi di mutazioni

• Geniche -puntiformi- delezioni-inserzionisi verificano all’interno di un singolo gene creando varianti alleliche diverse o alleli ipoattivi, inattivi o iperattivi

• Cromosomichesi verificano nell’ambito di segmenti di cromosomi o di cromosomi interi e possono determinare disorganizzazione genica

• GenomicheAnomalie cariotipiche, si verificano quando un organismo presenta dei cromosomi in più o in meno rispetto al normale. Se sono presenti interi corredi cromosomici in più o in meno si parla di euploidia aberrante ; se invece è solo una parte del corredo in eccesso o in difetto l'anomalia è chiamata aneuploidia

La mutazione

1. Crea variabilità sulla quale agisce la selezione naturale nel processo evolutivo, promuovendo le mutazioni favorevoli dalle sfavorevoli o letali

2. Permette l’analisi genetica

3. È alla base del miglioramento genetico di piante ed animali di interesse agronomico

selvatico mutante

mutante selvatico

Reversione

Mutazione in avanti

Retromutazione

Mutazioni puntiformi

- Sostituzioni di basi

- Inserzioni di basi

- Delezioni di basi

Sostituzioni di basi

Sostituzioni di basi

Sostituzioni di basi

Frameshift -> spostamento dello schema di lettura; vengono persi completamente la struttura e la funzione

della proteina normale

Mutazioni nelle sequenze regolative

Il promotore non viene riconosciuto per la trascrizione

La mutazione nei siti accettori e donatori dello splicingcompromette il corretto splicing degli introni

Influenzano la quantita’ di prodotto proteico ma non la struttura della proteina

La mutazione è un cambiamento ereditabile del materiale genetico

SomaticaEreditata solo dai

discendenti di una cellula

Individuo/i mutati

Germinaletrasmessa attraverso

le generazioni

Mutazioni somatiche-Avvengono nelle cellule del tessuto somatico o mitotico o post-mitotico

- Non vengono trasmesse alla progenie

- La cellula in cui avviene la mutazione e’detta capostipite e può dare origine ad un CLONE di cellule mutate o SETTORE

- La mutazione si manifesta se dominante rispetto al WT

Cloni di cellule mutate

Proto-oncogeni e cancro

I proto-oncogeni codificano per una classe di proteine attive in modo selettivo, ovvero solo se opportunamente stimolate e che sono coinvolte nella regolazione della divisione cellulare. Se l’evento mutazionale disaccoppia la proteina dalla sua via

regolativa, la sua attivazione può diventare continua ed incontrollata

Proto-oncogene-> gene coinvolto nella regolazione della divisione cellulare

mutazione

Oncogene

-divisione incontrollata della cellula-diffusione di cellule tumorali

GRasV12 G->T

L’oncoproteina Ras

L’oncoproteinaRas e melanoma

Fenotipi delle mutazioni-Mutazioni morfologichedeterminano nuove caratteristiche fenotipiche visibili

-Mutazioni letalieffetto sulla sopravvivenza

-Mutazioni condizionalicomparsa del fenotipo solo in un ambiente particolare detto restrittivo

-Mutazioni auxotroficheincapacita’ di sintetizzare uno specifico nutriente

-Mutazioni con perdita di funzione (Loss of function)è recessiva se l’allele selvatico e’ sufficiente a sopperire alla mancanza dell’altro allele che è mutato; è dominante se l’alleleselvatico non è sufficiente a sopperire alla mancanza dell’allelemutato

-Mutazioni con acquisto di funzione (Gain of function)la mutazione conferisce acquisto di funzione per cui si comportada dominante

Loss of function

Gain of function

1.232,469,285Sh → sh

2.241,745,280Y → y

2.441,678,736Su → su

11.07647,102Pr → pr

106.028265,391I → i

492.0273554,786R → r

Average number of mutationsper million gametes

Number of mutations

Number of gametes tested

Gene

Frequenza delle mutazioni in alcuni loci del mais

Quanto sono frequenti le mutazioni?

Tasso di mutazione = numero delle mutazioni che si verificano in una certa unità di tempo (generazione di cellule o individui)

Frequenza di mutazione = frequenza con cui una mutazione compare in una popolazione di cellule o individui (la popolazione può essere costituta da gameti o qualsiasi altro tipo cellulare)

Tasso di mutazione = 1/7 divisioni cellulariFrequenza di mutazione= 2/8 cellule

Rilevazione delle mutazioniPoiché la mutazione è un evento “raro”, è necessario

disporre di un sistema di screening opportuno

Sistemi di screening di mutazioniReversione degli auxotrofi- retromutazione nello stesso gene- soppressione in un altro gene

Si fanno crescere i mutanti auxotrofi in terreno permissivo e poi si passano in terreno selettivo, su

cui cresceranno solo i prototrofi

Auxotrofo per l’adenina Su terreno

minimo cresceranno solo i prototrofi per l’adenina

Nella maggior parte delle reversioni si genera una mutazione in un locus genico diverso con funzione

di soppressore dell’auxotrofia

Mutazione soppressoreE’ una seconda mutazione nello stesso locus genico che sopprime l’effetto della prima, almeno in parte

esempio

Delezione della C

Inserzione della A

L’inserzione della A ripristina in parte lo schema di lettura corretto delle parole

Mutazione non senso

Codoni di stop della traduzioneUAG o codone amber, UAA o codone ochre, e UGA o codone opal

Mutazione soppressore intergenico amber

Mutazione nell’anticodone nel t-RNA

Arricchimento per filtrazione (selezione di mutanti auxotrofici)Neurospora, Aspergillus

Crescita di colonie isolate resistenti al fago T1

Cellule di E. Coli resistenti all’infezione da fago T1

La natura della mutazione

Nei cellule di E. Coli resistenti al fago T1 si genera una

mutazione o si determina un adattamento fisiologico alla

presenza del fago?

Teorie sulla resistenza ai fagi

Cambiamento o adattamento fisiologico costante per tutte le cellule

Evento raro di mutazione casuale variabile nel tempo

Test di fluttuazione

I batteri vengono piastrati su piastre che contengono i fagi T1

Bulk culture

individual culture

Le cellule resistenti, già presenti nella popolazione, vengono selezionate dall’agente ambientale (fago)

Esperimento di Replica-Plating(Lederberg, 1952)

Piastra master con terreno non selettivo

Repliche esatte della piastra master su terreno selettivoLe cellule che crescono su terreno

selettivo avevano la mutazione giàpresente prima della selezione

Se le mutazioni si fossero verificate dopo l’esposizione al fago ogni replica sarebbe stata

diversa quanto a distribuzione delle colonie resistenti

Piastre di selezione

Piastra madre

Ricerca di mutazioni letali associate al cromosoma X di Drosophila: il cromosoma ClB

(Muller)

Regione C invertita soppressore del

crossover

Allele recessivo letale, l

Allele B dominante per l’occhio Bar

Cromosoma bilanciatore: cromosoma marcato con allele dominante (B) e con

inversione (C)

X

ClB

Determinazione di mutazioni letali recessive X-linked

♀ 2 : ♂ 1

Solo ♀

x

x

Mutazione spontanea sull’X che produce un gene letale

La frequenza delle mutazioni spontanee è di circa 1.5 per

1000 cromosomi

Il trattamento con raggi X determina un aumento di oltre 10 volte nella frequenza di mutazioni letaliX-linked

I raggi X sono mutageni in tutti gli organismi

Mutazioni indotte per selezionare varietàvegetali con caratteri desiderati

Mutagenesi di polline o semi

Mutazioni spontanee -> si verificano naturalmente

Mutazioni indotte-> si formano in seguito ad esposizione di un organismo ad agenti mutageni

Mutazioni spontaneeSi verificano per:

- Errori nella replicazione del DNAMalappaiamento di basi a causa dell’oscillazione tautomerica

Fedeltà della replicazione: 1 errore/ ~ 109 nt copiati

Lesioni spontanee

-Depurinazione

-Deaminazione

Transizioni GC->AT

HOT SPOTS non riparti dall’Uracile-DNA glicosilasi

Riparato da parte dell’Uracile-DNA glicosilasi

Danni da ossidazione del DNAda parte di radicali superossidi (O2., da perossido di idrogeno (H2O2) e radicali ossidrili (OH.)

Si appaia erroneamente con A generando trasversione C->A

Mutazioni indotteMutageni-> chimici, radiazioni

-Incorporazione di analoghi delle basi

-5-Bromouracile (5-BU) analogo della timina ma può appaiare con la guanina

-2-Amminopurina (2-AP) analogo dell’adenina (può appaiare con la citosina)

-Agenti alchilanti

EMS (etilmetansulfonato)

NG (nitrosoguanidina)

-Agenti intercalanti

- Proflavina- Arancio di acridina- Bromuro d’etidio

Hanno strutture planari piatte che imitano la coppia di basi, per cui riescono ad inserirsi fra le basi azotate impilate del DNA, causando inserzioni o delezioni di singole coppie di basi

Bromuro d’etidio

Radiazioni UV Generano fotoprodotti

Dimero ciclobutilico di pirimidine

TEST DI AMESTest per valutare il potenziale mutagenico/cancerogeno

di un composto

Stimolazione a produrre enzimi epatici (il fegato di mammiferi può

convertire composti apparentemente non tossici in composti tossici)

La presenza di revertentiindica che il composto chimico èmutageno

Meccanismi di riparazione del DNASistemi enzimatici che riparano i danni subiti dal DNA

Se questi sistemi non funzionano adeguatamente insorgono mutazioni, quindi malattie, quindi cancro

Meccanismo SOSmeccanismo di emergenza attivato per impedire la morte della cellula procariotica in seguito al danno

FotodimeroTC

Le proteine UmuD/C riducono la fedeltà del processo di replicazione del DNA

Riparazione per escissione

Riparazione da DNA glicosilasi

Sito AP (apurinico/apirimidinico)

lasciato dalla glicosilasi

EndonucleasiAP

Riparazione postreplicativa

Il DNA neosintetizzatonon e’ metilato

Riparazione postreplicativa per ricombinazione

Xeroderma Pigmentoso

Difetto nel meccanismo di riparazione per escissione di nucleotidi. Le persone affette sviluppano tumori della pelle con estrema

facilità, indotti da radiazioni UV, in seguito all’esposizione alla luce solare