Lên Men Bề Sâu, Động Học Quá Trình Lên Men

MÔN: KĨ THUẬT THỰC PHẨM 3

ĐỀ TÀI:

LÊN MEN BỀ SÂU- ĐỘNG HỌC CỦA QUÁ TRÌNH LÊN MEN GIÁN ĐOẠN

TP. HCM, THÁNG 10 NĂM 2013

QUÁ TRÌNH LÊN MEN???

1

Lên men là một quá trình sinh học, mà ở đó phản ứng oxy hóa khử xảy ra trong tế bào vsv, trong điều kiện không có chất oxy hóa nào.

Một phần chất hữu cơ bị phân giải thành chất

khử, phần còn lại bị phân giải thành chất

oxy hóa

2

Nghiên cứu quá trình lên men là

NC đặc điểm sinh lý-hóa sinh và hoạt động sống của một chủng

VSV

3

Tùy thuộc vào đặc điểm sinh lý của VSV đối với oxy, ta coi quá trình đó là hiếu khí hay kỵ khí không bắt buộc

CÁC PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN

1Đối với lên men kỵ khí thực hiện theo phương

pháp nuôi cấy chìm

2Lên men hiếu khí được thực hiện nhờ hai phương pháp cơ bản: nuôi cấy bề mặt và nuôi cấy bề sâu (nuôi cấy chìm)

PHÂN LOẠI QUÁ TRÌNH LÊN MEN

1. Dựa vào kỹ thuật nuôi cấy: Dựa vào cách nạp liệu + thu sản phẩm ta có các loại lên men:

Gián đoạn Liên tục Bán liên tục

Dựa vào thành phần đồng nhất của môi trường ta có các loại lên men:

Bề mặt (nổi) Bề sâu (chìm) Bán rắn

PHÂN LOẠI QUÁ TRÌNH LÊN MEN

2. Dựa vào sản phẩm chính: Lên men etilic Lên men lactic Lên men propionic Lên men formic Lên men butiric và lên men axeton-butanol Lên men metan Lên men axetat Lên men xenlulozo

1

LÊN MEN BỀ SÂU TRONG MÔI TRƯỜNG LỎNG

Ưu điểm

Tốn ít mặt bằng trong xây dựng và lắp đặt dây chuyền

Chi phí điện năng, nhân lực và các khoản phụ

cho một đơn vị sản phẩm thấp.

Dễ tổ chức được xí nghiệp có sản

lượng lớn.

Các thiết bị lên men chìm dễ cơ khí hoá, tự động

hoá

LÊN MEN BỀ SÂU TRONG MÔI TRƯỜNG LỎNG

Nhược điểm

Đòi hỏi trang bị kĩ thuật cao, dễ bị

nhiễm trùng toàn bộ

Trong lên men chìm cần phải

khuấy và sục khí liên tục

Là quá trình nuôi cấy VSV mà môi trường dinh dưỡng chỉ được cho vào lúc đầu và không thêm chất dinh dưỡng cho đến khi kết thúc quá trình nuôi cấy

Sản phẩm của quá trình lên men được tích lũy dần dần và chỉ lấy ra khi quá trình lên men kết thúc

VSV sinh trưởng đến chừng nào một thành phần chủ yếu của môi trường dinh dưỡng bị giới hạn

LÊN MEN GIÁN ĐOẠN

ĐẶC ĐIỂM

LÊN MEN GIÁN ĐOẠN

GIAI ĐOẠN TIỀM PHÁT

GIAI ĐOẠN LOGARIT

GIAI ĐOẠN ỔN ĐỊNH

GIAI ĐOẠN TỬ VONG

Trong quá trình nuôi cấy, VSV

sinh trưởng và phát triển theo một quy

luật gồm 4 giai đoạn

ĐƯỜNG CONG SINH TRƯỞNG

Thể hiện sự sinh trưởng của quần thể vi sinh vật trong một môi trường nuôi cấy theo phương pháp nuôi cấy theo mẻ (batch culture) hoặc trong một hệ thống kín

GIAI ĐOẠN TIỀM PHÁT (Lag phase)

Trong giai đoạn này tế bào chưa có sự tăng lên về số lượng nhưng thể tích và khối lượng tăng lên rõ rệt do có sự tăng các thành phần mới của tế bào.

Do có sự thay đổi về môi trường sống nên tế bào cần một thời gian nhất định để tổng hợp các enzyme mới nhằm sử dụng được các chất dinh dưỡng mới.

Giai đoạn tiềm phát dài hay ngắn liên quan đến bản thân từng loại vi sinh vật và tính chất của môi trường. Nếu tính chất hóa học của môi trường mới sai khác nhiều với môi trường cũ thì giai đoạn tiềm phát sẽ kéo dài và ngược lại.

GIAI ĐOẠN TIỀM PHÁT (Lag phase)

CÁC YẾU TỐ

ẢNH HƯỞNG

Tuổi giống cấy. Ví dụ: pha lag sẽ không có nếu dùng ống cấy gồm các TB đang ở pha sinh

trưởng logarit

Lượng giống cấy: nói chung lượng giống cấy nhiều thì pha lag ngắn và ngược lại. Trong công

nghiệp lên men tỉ lệ cấy giống thường ở mức 1/10

Thành phần môi trường: môi trường có thành phần dinh dưỡng phong phú thì pha lag ngắn.

Trong giai đoạn này vi sinh vật sinh trưởng và phân cắt với nhịp độ tối đa nếu gặp môi trường và điều kiện nuôi cấy thích hợp.

Do các tế bào sinh ra chỉ khác nhau rất ít cho nên đường cong sinh trưởng là một đường trơn nhẵn chứ không gấp khúc

Quần thể tế bào trong giai đoạn này có trạng thái hóa học và sinh lý học cơ bản là như nhau => thường được sử dụng để nghiên cứu sinh hóa học và sinh lý học của vi sinh vật.

Giai đoạn logarit (Log Phase) hay Pha Chỉ số (Exponential Phase)


Sinh trưởng logarit là sinh trưởng đồng đều nếu các thành phần tế bào được tổng hợp với tốc độ tương đối ổn định. Mặt khác, nếu cân bằng dinh dưỡng hay điều kiện môi trường thay đổi sẽ dẫn đến sự sinh trưởng không đồng đều.

Sự sinh trưởng của vi sinh vật phụ thuộc nhiều vào nồng độ chất dinh dưỡng.


(a )- Ảnh hưởng của sự hạn chế chất dinh dưỡng đối với sản lượng chung của vi sinh vật. Lúc nồng độ đủ cao thì sản lượng chung sẽ đạt tới ổn định.

(b)- Ảnh hưởng của sự hạn chế chất dinh dưỡng tới tốc độ sinh trưởng.

Số lượng tế bào sinh ra bằng số tế bào chết đi3

GIAI ĐOẠN ỔN ĐỊNH(Stationary Phase)

1 Đường cong sinh trưởng đi ngang

2 Nồng độ vi khuẩn trong giai đoạn ổn định thường và khoảng 109/ml

ĐẶC ĐIỂM

Hạn chế chất dinh dưỡng.

Vsv hiếu khí thường bị hạn chế bởi nồng độ oxygen.

Tích lũy các sản phẩm trao đổi chất có hại.


NGUYÊN NHÂN


Những biến đổi

Thu nhỏ khích thước

Sinh ra

protein đói

Và những biến đổi

khác

GIAI ĐOẠN TỬ VONG(Death Phase)

Số lượng tế bào có khả năng sống giảm theo lũy thừa

Sự chết của tế bào có thể nhanh hay chậm, có liên quan đến sự tự phân hay không tự phân

NGUYÊN NHÂN

Điều kiện bất lợi của môi trường: nồng độ chất dinh dưỡng thấp dưới mức cần thiết cho hậu quả làm giảm trao đổi chất , phân hủy dần dần các chất dự trữ và cuối cùng dẫn đến sự chết hàng loạt của tế bào

Quá trình bảo quản các chủng VSV

TÍNH TOÁN QUÁ TRÌNH SINH TRƯỞNG

TÍNH TOÁN

NHỊP ĐỘ SINH

TRƯỞNG

Nghiên cứu về sinh lý học

Nghiên cứu về sinh thái học VSV

Giải quyết một số vấn đề ứng dụng trong sản xuất công nghiệp


• Số lượng tế bào vi khuẩn tăng theo phương thức 2n

• Ta hãy tưởng tượng trong một bình kín chứa một lượng lớn môi trường dinh dưỡng, ta cấy vào đó một tế bào vi khuẩn. Nếu thành phần môi trường hoàn toàn phù hợp với nhu cầu của tế bào, vi khuẩn sẽ sinh trưởng, tăng khối lượng và thể tích,…đến kích thước nhất định rồi phân chia cho 2 tế bào. Hai tế bào này tiếp tục sinh trưởng và phân chia để cho 4, 8, 16, 32,….


Thời gian

Số lần phân cắt

2n Số lượng(N0×2n )

lg10Nt

0 0 20 = 1 1 0,000

20 1 21 = 2 2 0,301

40 2 22 = 4 4 0,602

60 3 23 = 8 8 0,903

80 4 24 = 16 16 1,204

100 5 25 = 32 32 1,505

120 6 26 = 64 64 1,806


Sinh trưởng thế

hệ của VSV


Số lượng tế bào ở thời gian t:Nt = N0× 2n

Trong đó: Nt: số TB sau n lần phân chia trong thời gian t

N0: là số lượng tế bào ban đầu. n: là số thế hệ hay số lần phân chia.

Logarit 2 vế:

logNt = logN0 + nlog2

Số thế hệ n:


Trong nuôi cấy gián đoạn, ở giai đoạn logarit:

Tốc độ sinh trưởng

Tốc độ sinh trưởng bình quân k

=

k: số thế hệ sinh ra trong đơn vị thời gian

Căn cứ trực tiếp vào đồ thị bán logarit

Dựa vào hằng số tốc độ sinh trưởng

Xác định thời gian thế hệ g



☻Thời gian thế hệ g là thời gian tính từ khi một tế bào sinh ra đến khi tế bào đó phân chia hoặc số tế bào trong quần thể tăng gấp đôi.

☻Nếu thời gian t = thời gian thế hệ g(t=g) thì Nt = 2N0

Thay vào công thức tính k ta được:


Như vậy:Thời gian thế hệ là nghịch đảo của hằng số tốc

độ sinh trưởng bình quân

Thời gian thế hệ thay đổi theo chủng loại VSV


Xác định thời gian thế

hệ

PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT

Sự hiện diện của VSV có thể được định lượng bằng nhiều phương pháp như:

Đếm số lượng tế bào trực tiếp trên buồng đếm hồng cầu bằng kính hiển vi quang học hoặc bằng kính hiển vi huỳnh quang.

Đếm gián tiếp bằng số lượng khuẩn lạc mọc trên môi trường xác định hoặc đo độ đục ( mật độ quang) của tế bào…

GIỚI THIỆU CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬTGIỚI THIỆU CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT


ĐẾM TRỰC TIẾP BẰNG BUỒNG ĐẾM HỒNG CẦU

Vi sinh vật đơn bào có kích thước lớn như: nấm men, tảo… có thể được định lượng bằng cách đếm trực bằng buồng đếm trên kính hiển vi.

Ưu điểm: Xác định được ngay lượng tế bào trong mẫu.

Nhược điểm: Không xác định được tế bào còn sống hay đã

chết, dễ lầm tế bào VSV với các hạt vật thể khác có trong môi trường và dịch huyền phù VSV phải có mật độ tế bào phải lớn.

Đếm trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu

Pha loãng mẫu cần đếm sao cho trong mỗi ô nhỏ của buồng đếm có khoảng 5 - 10 tế bào VSV.

Sau đó nhỏ 1 giọt mẫu lên buồng kính và đậy lại bằng lá kính, quan sát dưới lính hiển vi.


Số tế bào có trong 1 ml mẫu ban đầu được tính theo công thức:

N = (Tế bào/ml)

Trong đó:

A - số tế bào trung bình trong 1 ô vuông lớn. 1000 - hệ số chuyển đổi từ mm3 sang ml (1 ml = 1 cm3 = 103 mm3) F - hệ số pha loãng của mẫu trước khi đếm V - Thể tích của 1 ô vuông lớn


ĐẾM TRỰC TIẾP BẰNG KÍNH HIỂN VI HUỲNH QUANG

Ưu điểm: Kết quả phản ánh đúng với sinh khối.

Nhuộm VSV bằng các chất phát huỳnh quang như: acridin cam (AODC), 4,6-dianidino-2-phenyl indol (DAPI), flourescent isothiocyanate (FITC).


PHƯƠNG PHÁP ĐẾM KHUẨN LẠC

Phương pháp đếm khuẩn lạc được thực hiện bằng kỹ thuật hộp đổ hay hộp trải với các thiết bị hỗ trợ (máy đếm khuẩn lạc, bút đếm khuẩn lạc) để đọc kết quả.

• Phương pháp: 1. Chuẩn bị dịch pha loãng mẫu2. Chuẩn bị các chuỗi pha loãng mẫu3. Cấy mẫu vào môi trường, ủ mẫu4. Đếm số khuẩn lạc hình thành.

• Ưu điểm:- Cho phép xác định số tế bào sống.- Định lượng chọn lọc vsv.


Máy đếm khuẩn lạc tự động

Có 2 phương pháp đếm khuẩn lạc

a. Phương pháp cấy bề mặt: Môi trường phải chuẩn bị trước 1-2 ngày để khô mặt.Ưu điểm: Định lượng được các vsv nhạy nhiệt Có thể nhận dạng được khuẩn lạc đặc trưng Dễ dàng làm thuần chủng vsv mục tiêuNhược điểm: Chỉ cấy được thể tích mẫu nhỏ Chỉ cho đếm số khuẩn lạc thấp


b. Phương pháp đổ đĩa:Ưu điểm: - Cấy được thể tích mẫu lớn, xác định được các vsv cần dinh dưỡng tiếp xúc từ nhiều phía- Cho phép đếm được mật độ vsv cao, khoảng 150-300

khuẩn lạcNhược điểm: - Không định lượng được những vsv quá nhạy- Không xác định được hình dạng khuẩn lạc nất định- Khó làm thuần một dòng vsv.


Phương pháp lọc màng để xác định số lượng vi sinh vật

PHƯƠNG PHÁP MÀNG LỌC Xác định số lượng vi sinh ở các độ pha loãng khác nhau.

Mẫu được lọc và màng lọc được đặt trực tiếp lên mặt môi trường thạch thích hợp.

=> Phương pháp này thường áp dụng với mẫu nước và nước thải Ưu điểm: Xác định được mật độ vsv cụ thể Nhược điểm: Không thích hợp phân tích mẫu thực phẩm rắn


Các loại khuẩn lạc mọc trên màng lọc.

Theo sách của Prescott,Harley và Klein (2005)(a)- Tổng số vi khuẩn mọc trên môi trường tiêu chuẩn, Dùng chỉ thị màu để nhuộm đỏ khuẩn lạc cho dễ điếm;(b)- Dùng môi trường thích hợp để kiểm tra nhóm vi khuẩn coliform có nguồn gốc từ phân (khuẩn lạc bắt màu xanh);(c)- Dùng môi trường thạch m-Endo để xác định vi khuẩn E.coli và các Coliform khác- khuẩn lạc có màu lục;(d)- Nắm sợi và nấm men mọc trên môi trường Thạch - Mạch nha.


XÁC ĐỊNH KHỐI LƯỢNG TẾ BÀO

Phương pháp trực tiếp là xác định trọng lượng khô của tế bào.

Phương pháp gián tiếp đo mật độ quang (OD).

XÁC ĐỊNH TRỌNG LƯỢNG KHÔ CỦA TẾ BÀO

Ly tâm thu sinh khối tế bào

rửa tế bào rồi làm khô

Cân trọng lượng khô

Thích hợp để xác định khối lượng của tế bào nấm, nhưng không thích hợp đối với vi khuẩn.

NHƯỢC ĐIỂM: PHƯƠNG PHÁP NÀY TỐN THỜI GIAN

Đo số lượng vi sinh vật bằng phương pháp đo độ đục.

ĐO ĐỘ ĐỤC• Độ đục của dịch tế bào có thể đếm

bằng quang phổ kế và được biểu diễn bằng đơn vị hấp thụ.

• Số lượng tế bào liên quan mật thiết với độ đục của dịch vi khuẩn.

• Tế bào phải được khuấy trộn kĩ trước khi đưa vào quang phổ kế

• Đo độ đục của dịch treo tế bào. Đây là pp rất thuận lợi. trong thực ta thường đo mật độ quang học của dịch treo (dịch huyền phù).

ĐO MẬT ĐỘ QUANG (OD)

Khi • Lượng tế bào tăng

Dẫn

đến

• Độ đục tăng

Làm

cho

• Mức độ tán xạ ánh sáng nhiều hơn

Đo được

• Trị số hấp thụ ánh sáng tăng

Thông qua việc đo độ hấp thụ ánh sáng có thể xác định được sinh khối vi sinh vật


Công thức:

Với:

Aλ : là mật độ quang tại bước sóng λ.

I0 : là cường độ sáng trước khi qua mẫu.

I : là cường độ sáng sau khi qua mẫu.

Aλ = ln (I0 / I)


XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ TẾ BÀO

Công thức:

C(mg/ml)= Aλ* k * n

Với:

C: nồng độ tế bào

n: hệ số pha loãng

k: hệ số chuyển đổi bằng 5x108

ƯU ĐIỂM: CÓ THỂ THỰC HIỆN TRONG THỜI GIAN NGẮN VÀ KHÔNG GÂY PHÁ HỦY TẾ BÀO

Lên Men Bề Sâu, Động Học Quá Trình Lên Men

Documents

Transcript of Lên Men Bề Sâu, Động Học Quá Trình Lên Men