Laktat dehidrogenaza

Predavanja iz Kliničke enzimologije Integrisane akademske studije: Farmacija-

medicinska biohemija Školska 2014/2015. godina

Laktat dehidrogenaza

• Enzim anaerobne faze glikolize • EC 1.1.1.127 • L-laktat: NAD+ oksidoreduktaza; LD ili LDH • Katalizuje reakciju oksidacije L-laktata u piruvat • NAD+ je akceptor vodonika

Uloga koenzima NAD u reakciji laktat dehidrogenaze

Katalitički ciklus laktat dehidrogenaze Vezivanje koenzima za enzim i pomak petlje 98-111

• Katalitička trijada:

arginin 171 histidin 195 i arginin 109

• Vezivanje supstrata za aktivni centar

• Redoks reakcija:

transfer vodonika sa NADH na piruvat

transfer protona

• Oslobađanje laktata

• Pomak petlje i oslobađanje NAD+

Izoenzimi LDH

• 5 izoenzima

• LD-1 (HHHH; H4);

• LD-2 (HHHM; H3M) ;

• LD-3 (HHMM; H2M2);

• LD-4 (HMMM; HM3) i

• LD-5 (MMMM; M4).

Obeležavanje prema elektroforetskoj pokretljivosti LD-1 najveća anodna pokretljivost

Struktura LD: H i M subjedinice Kinetičke karakteristike

• M-muscle mišićni – Sadrži više bazne aminokiseline

– Putuje sporije

– Tkiva sa visokom glikolitičkom aktivnošću

– Anaerobni uslovi

– LD M4 ima nisku Km za piruvat

– Favorizuje redukciju piruvata

– Visoka konc piruvata ne inhibira M4 izoenzim

• Genski lokus na hromozomu 11

• H-heart srčani – Sadrži više kisele ostatke aminokiselina

– Negativno naelektrisan

– Putuje brže anodno

– Tkiva sa povećanom potrošnjom kiseonika

– Aerobna tkiva (srčani mišić)

– LD H4 ima višu Km za piruvat

– Višak piruvata alosterno inhibira LDH4

– Više oksidacija laktata

• Genski lokus na hromozomu 12

Dva gena su specijalizovana za različita tkiva Razlike H i M subjedinica u afinitetu za supstrat, vrednostima Km i inhibiciji piruvatom

Distribucija LD i izoenzima LD

• LD aktivnost je prisutna u svim ćelijama organizma

• Citoplazmatični enzim

• Koncentracija enzima u svim tkivima je 1500 do 5000 puta veća nego u serumu

• Svako oštećenje ćelije pa i minimalno značajno povećava aktivnost LD u serumu

• Mala dijagnostička specifičnost ovog serumskog enzima

• Serumski izoenzimski profil:

• LD 2 >LD 1> LD 3 > LD 4 > LD 5

Distribucija LD i izoenzima LD

• Različita tkiva pokazuju različit izoenzimski profil

• Srčani mišić, bubrezi i eritrociti – Elektroforetski brži izoenzimi

– Anodni izoenzimi

– LD-1 i LD-2 dominiraju

• Jetra i skeletni mišići – Elektroforetski sporiji izoenzimi

– Katodni izoenzimi

– LD-4 i LD-5 dominiraju

– Mada u slučaju oštećenja mišića javljaju se i anodni izoenzimi

• Izoenzimi intermedijarne pokretljivosti se nalaze u mnogim tkivima: slezini, pluća, limfne žlezde, leukociti i trombociti

Distribucija izoenzima laktat dehidrogenaze u različitim organima

Distribucija izoenzima laktat dehidrogenaze u serumu

Serumski izoenzimski profil laktat dehidrogenaze: LD 2 >LD 1> LD 3 > LD 4 > LD 5

Distribucija izoenzima LD u testisima

• Neki genski lokusi mogu biti eksprimirani samo u jednom tkivu, kao rezultat određenog stupnja razvoja.

• Pored dva genska lokusa koji određuju dve uobičajene subjedinice laktat dehidrogenaze, treći lokus je aktivan samo u zrelim testisima.

• Treći tip subjedinica, X ili C, koji daje specifičan izoenzim, LD-X ili LD-C koji se nalazi u testisima

• Šesti izoenzim

• Sedmi izoenzim ili LD-6 je identifikovan u serumu teško obolelih.

Promene u distribuciji izoenzima kod fetusa i beba

Moj glavni izoenzim LD je HM3 ??

• Kod fetusa srce je u anaerobnim uslovima

• Dominira M4 izoenzim • Prelaz postepeni u HM3 • Bebe imaju na rođenju HM3 • Posle H2M2 • 1.godina H3M • 2.godina H4

Primeri razlika u distribuciji izoenzima laktat dehidrogenaze u srcu i jetri kod odraslih i fetusa

Kinetičke karakteristike LD

Specifičnost prema supstratima → HBD izoenzim Inhibicija LD 1. LD je inhibiran reagensima koji deluju na SH grupe

– Merkuri jon i p-hloromerkuribenzoat – Reverzibilna inhibicija – Dodatak cisteina ili glutationa

2. Kompetitivni inhibitori za supstrat ili produkt reakcije • Borat i oksalacetat

– Kompeticija sa laktatom za vezivanje za isto mesto na enzimu • Oksamat

– Kompeticija sa piruvatom za isto mesto vezivanja.

3. Inhibicija supstratima – Piruvat i laktat u višku inhibiraju enzimsku reakciju – Piruvat više inhibira – Inhibicija supstratom se smanjuje ako se poveća pH

4. EDTA inhibira enzim verovatno vezujući Zn.

Klinički značaj LD i izoenzima

• Obzirom na široku rasprostranjenost u svim tkivima, povećane vrednosti aktivnosti LD u serumu se javlja u raznim kliničkim stanjima: – infarktu miokarda

– hemolizi

– bolesti jetre, bubrega, pluća i mišića

• Određivanje aktivnosti serumske LD u dijagnostici: – infarkta miokarda, hemolitičke anemije, tumora ovarijuma i tumora

germinalnih ćelija testisa.

• Za praćenje bolesti LD je relevantna kao prediktor preživljavanja kod – Hodčkinsonove bolesti i non-Hodčkinovog limfoma i za praćenje

disgerminoma.

Klinički značaj LD

Akutni infarkt miokarda • Ukupna LD

• Izoenzimski profil

• Izoenzimi LD – LD-1 i LD-2 (α-HBD)

– Specifičnost prema supstratu α-hifroksibutirat

• Dinamika promena LD i izoenzima α-HBD u akutnom infarktu miokarda

• Porast enzima posle AIM u satima ili danima

• Poređenje sa ostalim srčanim markerima

18

Biohemijski markeri akutnog infarkta miokarda

Neenzimski • Mioglobin • Troponin I • Troponin T

Enzimski • CK • CK MB aktivnost • CK MB masa • AST • LD • HBD • Glikogen fosforilaza BB

Rani markeri Do 6 sati od simptoma

Kasni markeri 6 sati od simptoma i ostaju nekoliko dana

19

Biohemijski markeri akutnog infarkta miokarda

Specifični • cTnT • cTnI • CK-MB masena • CK-MB aktivnost

• Novi markeri • Glikogen fosforilaza bb • Laki lanci miozina LMC • LMC-myosin light chains

Nespecifični • Mioglobin • AST • LD • CK

20

Kriterijumi za kardijačne biomarkere

• Kardijačni biomarkeri su biološki analiti koji se mogu detektivati u cirkulaciji u toku KVB ili posle oštećenja miokarda

Idealni kardijačni marker se karakteriše • Visoko specifičan za tkivo srčanog mišića i odsutan u drugim ne-srčanim tkivima • Visoku dijagnostičku senzitivnost

– Biomarker da bude lako dostupan

• Biomarkeri rane dijagnoze – Mali solubilni molekuli sa bržom kinetikom oslobađanja i brzim klirensom iz oštećenog tkiva

se smatraju odgovarajućim biomarkerima rane dijagnoze

• Biomarkeri kasnije dijagnoze – Stabilan biomarker sa dugim poluživotom u plazmi

• Pik vrednosti (maksimalne vrednosti biomarkera) se moraju brzo dostići i da ostanu visoke vrednosti u cirkulaciji nekoliko sati

– Ovo je karakteristika cTnI i cTnT

• Brz klirens biomarkera je važan za povratna oštećenja – reinfarkt

Dinamika u promenama enzimske aktivnosti izoenzima LD i HBD u odnosu na druge enzime u

infarktu miokarda

LD

HBD

Rani markeri Kasni markeri

LD i izoenzim LD-1 u dijagnostici akutnog infarkta miokarda

Kasni markeri AIM

LD LD-1 Porast posle AIM 12-18 h 10-12 h Pik aktivnosti 48-72 h 72-144 h Pad na URL 6-10 dana 10 dana Dug poluživot izoenzima Doprinosi dijagnostičkoj osetljivosti posle 24 h → 90 % Pomak LD-1 u odnosu na LD-2 LD-1/LD-2 > 1 Specifičnost ovog koeficijenta je 75 % Izoenzimi LD-1 i LD-2 → HBD alfa-hidroksibutirat dehidrogenaza

22

Akutni infarkt miokarda

LD-2

LD-1

Normalan uzorak

LD i izoenzim LD-1 u dijagnostici akutnog infarkta miokarda Elektroforetsko razdvajanje izoenzima LD

Pomak LD-1 u odnosu na LD-2 LD-1/LD-2 > 1

Klinički značaj LD

Hemolizne anemije • Različiti uzroci:

– urođeni defekti membrane eritrocita, urođeni nedostaci enzima, talasemije, hemoglobinopatije, paroksizomalna noćna hemoglobinurija, antitela, splenomegalije, mehanička trauma i direktni toksični efekti

• Hemoliza, ukoliko je velika, produkuje izoenzimski profil koji je sličan kao kod infarkta miokarda

• Megaloblastna anemija – posledica nedostatka vitamina B12

– raspadanje prekurzora eritrocita u koštanoj srži (neefektivna eritropoeza)

– oslobađanje velikih količina LD-1 i LD-2 izoenzima

– LD se povećava u megaloblastnoj anemiji i do 50 X URL – Primena adekvatne terapije brzo snižava LD na normalu

Klinički značaj LD

Oboljenja jetre • LD je povećan u bolestima jetre

• Povećanja nisu tako velika kao povećanje aminotransferaza

• Velika povećanja kod toksičnog hepatitisa sa žuticom i do 10x

• Malo povećanje kod virusnog hepatitisa i infektivne mononukleoze gde je obično povećan LD 3

• Kod ciroze jetre i opstruktivne žutice LD je normalna ili dva puta uvećana u odnosu na URL

• Izoenzim LD-5 je značajno povećan kod pacijenata sa primarnim oboljenjem jetre ili kod hipoksije jetre sekundarno zbog snižene perfuzije kiseonikom

Klinički značaj LD

Maligniteti • LD je povećan kod 70 % pacijenata sa metastazama na jetri

• 20 do 60 % pacijenata sa drugim nehepatičnim metastazama imaju povećanu ukupnu LD

• LD-1 je povećan kod tumora germ ćelija (61% slučajeva)

• Kod pacijenata sa seminomima LD-1 je povećan u 63% slučajeva u odnosu na 60% koji nemaju ovaj tip tumora

• Broj pacijenata sa povećanim LD-1 zavisi od stupnja bolesti

• Pokazalo se da je LD-1 koristan prediktor ishoda kod pacijenata sa tumorom na germitivnim ćelijama testisa

• LD kao tumorski marker

• Mala specifičnost

Poređenje aktivnosti laktat dehidrogenaze u normalnoj ćeliji i u kanceroznoj ćeliji

LD i malignitet Aktivnost LD u kanceroznim ćelijama

Promene u distribuciji izoenzima LD u bolestima

Onkofetalni enzimi • Pojava fetalnih uzoraka distribucije izoenzima je pojava maligne

transformacije u mnogim tkivima. • Prvi enzim koji je izučavan je laktat dehidrogenaza • Maligni tumori u načelu pokazuju značajan pomak u ravnoteži

izoenzima ka elektroforetski više katodnim formama poput LD-4 i LD-5

• Pad aktivnosti izoenzima LD-1 i LD-2 rezultuje pojavom profila koji je reminiscencija enzimskog profila u embrionalnom tkivu

• Tumori prostate, cerviksa, dojki, mozga, želuca, kolona, rektuma, bronha i limfnih žlezdi pokazuju ove transformacije.

• Benigni gliomi pokazuju relativni porast u anjonskim izoenzimima.

Klinički značaj LD

LD u likvoru • Kod zdravih osoba LD u likvoru je mnogo niža od serumske LD

• Obično LD-4 i LD-5 se ne mogu detektovati

• Uzorak je teško protumačiti ako je prisutna i hemoragija ili oštećenje moždane barijere bolešću pri čemu LD iz cirkulacije prelazi u likvor

• Izoenzimi LD se mogu osloboditi iz ćelija koje su infiltrirane u likvor

• Bakterijski meningitis - granulocitoza dovodi do povišenja LD-4 i LD-5

• Virusni meningitis - limfocitoza dovodi do viših izoenzima od LD-1 do LD-3

• Malignitet – metastaze dovode do povišenja LD-5

Makro LD

• Stvaranje autoantitela - enzimski kompleks

• Povećava aktivnost enzima u cirkulaciji

• Učestalost 1: 10000

• Dodatna abnormalna traka na elferogramu

• Značaj određivanja makroenzima: – da se izbegnu dodatna ispitivanja

Reakcija je reverzibilna i reakciona ravnoteža favorizuje reversnu reakciju redukcije piruvata u laktat (P → L). Uslovi Reakcija L → P pH optimum 8,8 do 9,8 u optimiziranoj reakcionoj smesi za LD-1 temp 370 C. NAD+ 9 mmol/L L-laktat 80 mmol/L Reakcija P → L pH optimum 7,4 do 7,8; temperatura 370 C NADH 300 umol/l piruvat 0,85 mmol/L

Laktat dehidrogenaza: određivanje aktivnosti

Optimalan pH varira u zavisnosti od •dominantnog izoenzima u uzorku •temperature •koncentracije supstrata •pufera Specifičnost prema supstratu pojedinih izoenzima: Supstrati: laktat, 2-hidroksi kiseline ili 2-oksokiseline Katalitička oksidacija 2-hidroksibutirata, sledećeg višeg homologa laktata, u 2-oksobutirat odgovara izoenzimu 2-hidroksibutirat dehidrogenazi (HBDH ili α-HBDH). LD ne deluje na D-laktat NAD+ služi kao koenzim

Laktat dehidrogenaza: određivanje aktivnosti

Metode određivanja aktivnosti LD

Supstrati • Rutinske metode koriste i piruvat i laktat kao supstrat • Reakcija L→ P ili • Reversna reakcija P →L

Referentna metoda • Poslednjih godina više se koristi reakcija L → P kao kontinuirana

referentna metoda • Optimizirana za LD-1 • Preporučena od strane IFCC komiteta za enzime • Referentna metoda za određivanje ukupne LD je ova metoda na 370C

• Warburgov optički test • Merenje porasta apsorbancije NADH na 340 nm • 334 nm, 340 nm i 366 nm

Biološki materijal

• Prednost se daje serumu za određivanje aktivnosti LD

• Plazma može biti kontaminirana trombocitima koji sadrže puno LD

• Serum se mora odvojiti odmah od koaguluma

• Hemolizovan serum se ne može koristiti jer eritrociti sadrže čak 150 puta više LD (uglavnom LD-1 i LD-2)

Stabilnost enzima i izoenzima i čuvanje uzoraka

• Izoenzimi se međusobno razlikuju po osetljivosti na hladnoću, pri čemu LD-4 i LD-5 su posebno labilni i njihova se aktivnost gubi ukoliko se čuvaju na -200 C

• Najbolje je serum čuvati na 40C u toku 3 dana

Referentne vrednosti

• Zavise od direkcije reakcije tj od supstrata

• RV za IFCC metodu na 370C su 125 do 220 U/L

• RV su više kod dece 180-360 U/L i postepeni pad u toku detinjstva

Metode određivanja aktivnosti LD

Metode separacije i kvantifikacije izoenzima LD 1. Elektroforeza na agaroznom gelu i celuloza acetatu • Metoda koje se najčešće koristi za razdvajanje izoenzima LD • Nakon razdvajanja izoenzima LD elektroforezom reakciona smesa se preliva

preko potpornog medijuma • Reakciona smesa obično sadrži L-laktat 500 mmol/L, NAD+ 13 mmol/L obično

rastvoreno u puferu pH 8,0 • Oslobođeni NADH u zonama LD aktivnosti se detektuje: 1. fluorescencijom detektuje se UV 365 nm 2. redukcijom tetrazolijum soli u obojeni formazan

Bojenje tetrazolijum solima plavi formazan

Detekcija razdvojenih izoenzima LD

redukcijom tetrazolijum soli u obojeni formazan

Elektroforetsko razdvajanje izoenzima LD Denzitometrijska kvantifikacija izoenzima LD

Referentne vrednosti • LD-1 4-26% • LD-2 29-39% • LD-3 20-26% • LD-4 8-16% • LD-5 6-16 %

Normalan uzorak Akutni infarkt miokarda

LD-1 LD-2

Malignitet

LD-3 Kongestivno oštećenje srca sa povećanim LD-5 zbog kongestije jetre i hipoksije

LD-5

Metode separacije i kvantifikacije izoenzima LD

2. Selektivna inhibicija LD-2 do LD-5 i omogućavaju određivanje samo izoenzima LD-1 • Inhibitori su:

– 1,6-heksandiol, natrijum perhlorat, gvanidin tiocijanat

3. Imunoprecipitacija • Antiserum (kozji) na LD-5 se koristi za merenje LD-1 • Antiserum precipitira LD-2 do LD-5 • U supernatantu ostaje LD-1