LAIKA-FĀZES VARIĒJOŠA MAGNĒTISKĀ LAUKA IETEKME UZ ... · 3 ANNOTATION Of the Thesis...

Dace Avotiņa

LAIKA-FĀZES VARIĒJOŠA

MAGNĒTISKĀ LAUKA IETEKME

UZ NUKLEĪNSKĀBJU PIEGĀDES

EFEKTIVITĀTI VĒŽA ŠŪNĀS

Promocijas darbs

medicīnas doktora zinātniskā grāda iegūšanai

Specialitāte teorētiskā medicīna

Darba zinātniskie vadītāji:

Dr. biol. Mihails Bariševs

Dr. biol. Svetlana Kozireva

Promocijas darbs izstrādāts ar ESF projekta “Atbalsts doktorantiem studiju programmas

apguvei un zinātniskā grāda ieguvei Rīgas Stradiņa universitātē” atbalstu

Rīga, 2016

2

ANOTĀCIJA

Gēnu piegāde ir viens no problemātiskākajiem posmiem gēnu terapijā, jo ietver ne tikai

terapeitiskā gēna aizvadīšanu līdz šūnām, bet arī efektīvu piesaisti šūnas membrānai ar sekojošu

ieslēgšanu šūnā un migrāciju šūnas iekšējā vidē līdz kodolam. Magnetofekcija ir viena no

efektīvākajām fizikālajām gēnu piegādes metodēm, kuras pamatā ir ar superparamagnētiskajām

nanodaļiņām (SPION) saistītu nukleīnskābju paātrināta koncentrēšana uz šūnu virsmas un

piegāde šūnās, izmantojot spēcīgu ārējo magnētisko lauku.

Permanentu magnētu radītā statiskajā magnētiskajā laukā SPION kustība šķīdumā

virzienā pret magnētu ir aksiāla. Laika-fāzes variējoša magnētiskā lauka, kas tiek ģenerēts ar

magnetofekcijas iekārtas DynaFECTOR palīdzību, pamatā ir permanentu magnētu plates

orbitāla rotācija šūnu kultūras platei paralēlā plaknē.

Datormodelēšanas rezultātā tika noskaidrots, ka laika-fāzes variējoša magnētiskā lauka

ietekmē notiek SPION aksiāli laterāla kustība magnētam paralēlā un perpendikulārā plaknē.

Tas veicina SPION vienmērīgāku sedimentāciju uz virsmas un varētu būt par iemeslu

paaugstinātai SPION-nukleīnskābju kompleksu ieslēgšanai šūnās.

Šajā pētījumā eksperimentāli tika pārbaudīta laika-fāzes variējoša magnētiskā lauka

ietekme uz SPION-nukleīnskābju-liposomālās komponentes kompleksu piegādes efektivitāti

vēža šūnās.

Iegūtie rezultāti parādīja, ka laika-fāzes variējošā magnētiskajā laukā, salīdzinot ar

statisko magnētisko lauku notiek vienmērīgāka SPION sedimentācija uz virsmas un

paaugstinās šūnās ieslēgto SPION daudzums. Laika-fāzes variējoša magnētiskā lauka ietekmē

paaugstinās arī SPION-nukleīnskābju-liposomālās komponentes kompleksu piegāde šūnās, par

ko liecina būtiski paaugstināts gan transficēto šūnu skaits, gan arī kopējais ekspresētā proteīna

līmenis transficētajās šūnās, salīdzinot ar citām gēnu piegādes metodēm. Savukārt

vienmērīgāka sedimentācija uz virsmas laika-fāzes variējoša magnētiskā lauka ietekmē

nodrošina SPION-nukleīnskābju-liposomālās komponentes kompleksu piegādi šūnās ar

samazinātu citotoksisko efektu.

Šajā pētījumā aprakstīta uzlabota efektīva gēnu piegādes metode – liposomālā

magnetofekcija laika-fāzes variējošā magnētiskajā laukā, kuru varētu izmantot mutēto gēnu

aizstāšanai un jaunu terapeitisku siRNS inhibējošā efekta pētījumiem in vitro šūnu līnijās.

Metode perspektīvā varētu tikt pielietota arī terapeitisko gēnu pārnesē vēža šūnās in vivo.

3

ANNOTATION

Of the Thesis “Influence of the time-phase varied magnetic field on the nucleic acids

delivery into the cancer cells”

Gene delivery is one of the critical steps in gene therapy, including both efficient

delivery of the therapeutic gene to the target cells and attachment to the cell membrane with

following internalization and transfer to the nucleus.

Magnetofection is one of the most effective physical gene delivery methods based on

the increased delivery and concentration of nucleic acids coupling superparamagnetic iron

oxide particles (SPION) onto the cell surface by the influence of an external magnetic field.

In the static magnetic field generated by permanent magnets the movement of SPION

in solution is axial towards the magnet. The time-phase varied magnetic field which is generated

with the magnetofection device DynaFECTOR is based on the orbital rotation of the permanent

magnets plate in the parallel plane of the cell culture plate.

In the result of computer modelling it was shown that the orbital rotation of magnets

causes the axial-lateral movement of SPION in parallel and perpendicular plane against the

magnet. This led to the more uniform distribution of SPION onto the surface and could be

a cause of the enhanced SPION-nucleic acids complexes internalization.

In this study the influence of the time-phase varied magnetic field on the delivery

efficiency of SPION-nucleic acids-liposomal component complexes into the cancer cells was

experimentally investigated.

Obtained results showed that in the time-phase varied magnetic field the SPION

sedimentation onto the surface is more uniform and the amount of internalized SPION increases

when compared to static magnetic field. Under the influence of the time-phase varied magnetic

field, the delivery of SPION-nucleic acids-liposomal component complexes also increases, as

evidenced by the significant increase in both the number of transfected cells and the total

amount of an expressed protein in transfected cells in comparison with other gene delivery

methods. While SPION-nucleic acids-liposomal component complexes delivery into the cells

with less cytotoxic effect in provided by more uniform sedimentation onto the surface.

In this study enhanced effective gene delivery method – the liposomal magnetofection

in the time-phase varied magnetic field is reported. The method could be used for the

replacement of mutated genes and for the investigation of the inhibition effect of novel

therapeutic siRNAs in vitro cell lines. The method could potentially used also for the

therapeutic gene delivery into the cancer cells in vivo.

4

SATURS

ANOTĀCIJA .............................................................................................................................. 2

ANNOTATION .......................................................................................................................... 3

DARBĀ LIETOTIE SAĪSINĀJUMI ......................................................................................... 5

IEVADS .................................................................................................................................... 8

1. LITERATŪRAS APSKATS ............................................................................................... 12

1.1. Gēnu terapijas attīstība un pielietojums vēža terapijā .................................................. 12

1.2. Gēnu terapijas stratēģijas, terapeitisko gēnu veidi ....................................................... 13

1.3. Terapeitisko gēnu piegādes metodes ............................................................................ 13

1.3.1. Vīrusu gēnu piegādes metodes.......................................................................... 14 1.3.2. Bezvīrusu gēnu piegādes metodes .................................................................... 15

1.3.2.1. Ķīmiskās gēnu piegādes metodes. .......................................................16

1.3.2.2. Fizikālās gēnu piegādes metodes ........................................................ 17

2. MATERIĀLS UN METODES ............................................................................................ 36

2.1. Materiāls ....................................................................................................................... 36

2.1.1. Šūnu līnijas........................................................................................................ 36

2.2. Metodes ......................................................................................................................... 36

2.2.1. SPION sedimentācijas profila noteikšana ......................................................... 38

2.2.2. Plazmīdu DNS iegūšana ................................................................................... 38

2.2.3. Transfekcija ar plazmīdu DNS un siRNS ......................................................... 39

2.2.4. Transgēna ekspresijas detekcija un analīze....................................................... 43

2.2.5. Citotoksicitātes noteikšana ................................................................................ 45

2.2.6. Dzelzs satura noteikšana šūnās ......................................................................... 46

2.2.7. Datu statistiskā analīze ...................................................................................... 47

3. REZULTĀTI ....................................................................................................................... 48

3.1. Laika-fāzes variējoša magnētiskā lauka ietekme uz SPION sedimentāciju ................. 48

3.2. Laika-fāzes variējoša magnētiskā lauka ietekme uz gēnu piegādi vēža šūnās ............. 48

3.2.1. LM LFV – reakcijas optimālie apstākļi ............................................................ 48 3.2.2. Laika-fāzes variējoša magnētiskā lauka ietekme uz nukleīnskābju piegādes

efektivitāti šūnās ............................................................................................... 55

3.2.3. Laika-fāzes variējoša magnētiskā lauka pielietojuma citotoksiskais efekts ..... 62 3.3. Laika-fāzes variējoša magnētiskā lauka ietekme uz SPION piegādes efektivitāti

vēža šūnās ..................................................................................................................... 63

DISKUSIJA .............................................................................................................................. 66

SECINĀJUMI .......................................................................................................................... 72

IZMANTOTĀ LITERATŪRA ................................................................................................ 73

PUBLIKĀCIJAS UN ZIŅOJUMI PAR PĒTĪJUMA TĒMU ................................................. 81

PATEICĪBAS ........................................................................................................................... 83

PIELIKUMI .............................................................................................................................. 84

5

DARBĀ LIETOTIE SAĪSINĀJUMI

SAĪSINĀJUMS SKAIDROJUMS ANGĻU

VALODĀ

SKAIDROJUMS

LATVIEŠU VALODĀ

9L Rattus norvegicus brain glioma

cell line

Rattus norvegicus smadzeņu

gliomas šūnu līnija

A549 human lung adenocarcinoma

cell line

cilvēka plaušu

adenokarcinomas šūnu līnija

AAV adeno asociated virus adenoasociētais vīruss

ADA-SCID adenosine deaminase severe

combined immunodeficiency

iedzimts adenozīna deamināzes

trūkums, kas izraisa

imūndeficītu

Ag silver sudrabs

AO/EB Acridine Orange/Ethidium

Bromide staining

atkrāsošana ar etīdija

bromīda/akridīna oranža

maisījumu

ASV United States of America Amerikas Savienotās Valstis

Au gold zelts

BCL2 apoptosis regulator BCL-2 apoptozes regulators BCL-2

BIRC5 baculoviral inhibitor of

apoptosis repeat-containing 5

bakulovīrusa apoptozo

atkārtojumu motīva inhibitors

5

BT-20 human breast adenocarcinoma

cell line

cilvēka krūts adenokarcinomas

šūnu līnija

C6 Rattus norvegicus brain glioma

cell line

Rattus norvegicus smadzeņu

gliomas šūnu līnija

Caco-2 human colorectal

adenocarcinoma

cilvēka kolorektālās


CAPAN-2 human pancreas

adenocarcinoma cell line

cilvēka aizkuņģa dziedzera


CM CombiMAG magnetic

nanoparticles

CombiMAG magnētiskās

nanodaļiņas

CoO cobalt oxide kobalta oksīds

Cos7 African green monkey kidney

fibroblast-like cell line

Āfrikas zaļā pērtiķa nieru

fibroblastu šūnu līnija

DEAE-DEXTRAN diethylaminoethyl dextrane dietilaminoetildekstrāns

DNS deoxyribonucleic acid dezoksiribonukleīnskābe

DPBS Dulbecco’s phosphate buffered

saline

Dulbeko fosfātbuferis

E. Coli Escherichia coli Escherichia coli (zarnu nūjiņa)

ECFP-ERp29pDNS plasmid DNA containing

ECFP-ERp29 gene

ECFP-ERp29 gēnu saturošas

plazmīdas DNS

EDTA ethylenediaminetetraacetic

acid

etilēndiamīntetraetiķskābe

EPR enhanced permeability and

retention effect

pastiprinātas caurlaidības un

aiztures efekts

ES European Union Eiropas Savienība

FBS fetal bovine serum teļa embrionālais serums

FDA Food and Drug administration Pārtikas uz zāļu pārvalde

Fe2+ ferrum (II) ion dzelzs (II) jons

Fe3+ ferrum (III) ion dzelzs (III) jons

6

Fe3O4 magnetite magnetīts

FIX fixative fiksatīvs

GM-CSF granulocyte-macrophage

colony-stimulating factor

granulocītu-makrofāgu

koloniju stimulējošais faktors

HeLa human cervix adenocarcinoma

cell line

cilvēka dzemdes kakla


HEPG2 human hepatocellular


cilvēka hepatocelulārās


HER-2/neu human epidermal growth factor

receptor 2

cilvēka epidermālā augšanas

faktora receptors 2

HPRT hypoxanthine-guanine

phosphoribosyltransferase

hipoksantīna-guanīna-

fosforiboziltransferāze

Il-12 interleukin-12 interleikīns-12

Jurkat human acute T cell lymphoma

cell line

cilvēka akūtas T šūnu

limfomas šūnu līnija

L lipofection lipofekcija

L siRNS co-lipofection with siRNA ko-lipofekcija ar siRNS

LacZpDNS plasmid DNA containing LacZ

gene

LacZ gēnu saturošas plazmīdas

DNS

LB Luria Bertrani medium Luria Bertrani barotne

LIP Lipofectamine2000 transfection

reagent

Lipofectamine2000

transfekcijas reaģents

LM liposomal magnetofection liposomālā magnetofekcija

LM LFV liposomal magnetofection in

time-varied magnetic field

liposomālā magnetofekcija

laika-fāzes variējošā

magnētiskajā laukā

LM LFV siRNS co-liposomal magnetofection in

time-varied magnetic field with

siRNA

ko-liposomālā magnetofekcija

laika-fāzes variējošā

magnētiskajā laukā ar siRNS

LM siRNS co-liposomal magnetofection

with siRNA

ko-liposomālā magnetofekcija

ar siRNS

LS-174T human colorectal


cilvēka kolorektālās


miRNS micro ribonucleic acid mikro ribonukleīnskābe

mRNS messenger ribonucleic acid matricas ribonukleīnskābe

NCI-H441 human lung adenocarcinoma

cell line

cilvēka plaušu


NCTC 1469 mouse hepatoma cell line peļu hepatomas šūnu līnija

NdFeB neodymium-iron-boron neodīms-dzelzs-bors

NM23-H1 tumor metastasis suppresor

NM23-H1

audzēja metastāžu supresors

NM23-H1

OTD ornithine transcarbamylase

deficiency

ornitīna transkarbamilāzes

trūkums

p53 tumor suppressor prorein p53 audzēja supresorproteīns p53

PAMAM

DENDRIMERS

polyamidoamine dendrimers poliamidoamīna dendrimēri

PB Prussian blue staining prūšu zilā atkrāsošanas metode

PBS phosphate buffered saline fosfātbuferis

PC3 human prostate


cilvēka prostatas karcinomas

šūnu līnija

7

pcDNA3.1™/His/LacZ mammalian expression vector

containing LacZ gene coding

for enzyme β-galactosidase

Β-galaktozidāzes ekspresiju

kodējošs LacZ gēnu saturošs

vektors ekspresijai zīdītāju

šūnās

pDNS plasmid DNA plazmīdas DNS

pECFP-ERp29 mammalian expression vector

containing ECFP-ERp29 gene

coding for fusion enhanced

cyan fluorescent protein-

endoplasmatic reticulum

protein 29

sapludinātā zaļi fluorescējošā

proteīna-endoplazmatiskā tīkla

proteīna 29 ekspresiju kodējošs

ECFP-ERp29 gēnu saturošs

vektors ekspresijai zīdītāju

šūnās

PEG polyethylene glycol polietilēnglikols

PEI polyethylenimine polietilēnimīns

PLL poly-L-lysine polilizīns

PSMA prostate specific membrane

antigen

prostatas specifiskais

membrānas antigēns

PVA polyvinyl alcohol polivinilspirts

RNS ribonucleic acid ribonukleīnskābe

SDS-PAGE sodium dodecyl sulphate-

polyacrylamide gel

electrophoresis

nātrija dodecilsulfāta

poliakrilamīda gela

elektroforēze

SiO2 silicon dioxide silīcija dioksīds

siRNS small interference ribonucleic

acid

mazā interferences

ribonukleīnskābe

SKOV-3 human ovary adenocarcinoma

cell line

cilvēka olnīcas


SN standard deviation standartnovirze

SPION superparamagnetic iron oxide

nanoparticle

superparamagnētiskā dzelzs

oksīda nanodaļiņa

TNF tumor necrosis factor tumora nekrozes faktors

X-SCID X-linked severe combined

immunodeficiency

ar X hromosomu saistīts smags

kombinēts imūndeficīts

α-Fe3O4 hematite hematīts

γ-Fe2O3 maghemite maghemīts

8

IEVADS

Tēmas aktualitāte un problēmas nostādne

Vēzis ir nekontrolēta šūnu augšana, kas rodas vairāku gēnu somatisku mutāciju un

epiģenētisku izmaiņu rezultātā.

Gēnu terapija ir terapijas veids, kas balstīts uz viena vai vairāku gēnu, kas kodē

normālus, funkcionālus proteīnus ievadīšanu pacienta šūnu ģenētiskajā materiālā ar mērķi

aizstāt mutēto gēnu (-us) (Mehier-Humbert and Guy, 2005; Dick et al., 2015).

Mūsdienās zināmi vairāki simti dažādu gēnu (> 1% no cilvēka genoma), kuru mutācijas

ir saistītas ar vēža veidošanos (Futreal et al., 2004; Wishhart, 2015), taču gēnu terapija lielā

mērā ir eksperimentāla ārstēšanas metode un tikai nedaudzi gēnu terapijas līdzekļi tiek pielietoti

klīnikā.



internalizāciju un migrāciju šūnas iekšējā vidē līdz kodolam.Turklāt šo procesu apgrūtina pašu

terapeitisko līdzekļu – nukleīnskābju īpašības – sliktā difundētspēja caur šūnas membrānu to

izmēru, negatīvā lādiņa un hidrofilitātes dēļ (Jafari et al., 2012). Gēnu piegādes iznākums ir

tieši atkarīgs no izvēlētās vektorsistēmas – tai ir jābūt efektīvai, specifiskai un drošai, bet ideālu

gēnu piegādes vektoru raksturo virkne īpašību (Somia and Verma, 2000; Ibraheem et al., 2014):

efektīvā veidā piesaistās terapeitiskajam gēnam neatkarīgi no tā lieluma un formas;

aizsargā terapeitisko gēnu no seruma, ekstracelulāro un intracelulāro endonukleāžu

degradējošās iedarbības;

nodrošina terapeitisko gēnu piegādi noteiktās dalošās un nedalošās mērķšūnās

neatkarīgi no to lokalizācijas vietas un integrētības apkārtējos audos;

ir neimunogēna;

ir netoksiska.

Gēnu piegāde šūnās, izmantojot vīrusu vektorsistēmas, ir visbiežāk pielietotais gēnu

piegādes veids. Vīrusiem piemītošās dabiskās īpašības – spēja viegli pārvarēt šūnas membrānas

barjeru, stimulējot endocitozes procesus, un ekspresēt vīrusa gēnus, izmantojot saimniekšūnas

biosintēzes mehānismu, padara tos par efektīviem gēnu piegādes līdzekļiem (Mulligan, 1993).

Neskatoties uz to, tiem piemīt vairāki būtiski trūkumi – vīrusa proteīnu imunogenitāte, kas var

izraisīt spēcīgu organisma imūno atbildi un augsta citotoksicitāte pie lielām vīrusa devām

(Teramato et al., 2000; Anson, 2004). Pastāv arī zināms inserciju mutaģenēzes risks, kas var

9

novest pie onkogēnu aktivācijas, kā arī nejauša infekciozu vīrusa daļiņu veidošanās (Lachmann

and Davies, 1997; Thrasher et al., 2006; Bushman, 2007). Bezvīrusu – ķīmiskajiem un

fizikālajiem vektoriem ir vairākas priekšrocības, salīdzinot ar vīrusu vektoriem. Tie ir viegli

sintezējami un ekspluatējami, spēj pārnest neierobežota garuma un daudzuma kodējošās

sekvences un tiem ir zema imunogenitāte (Ruβ and Wagner, 2007). Liela daļa ķīmisko vektoru

ir katjoniski savienojumi. Tādējādi tie spēj efektīvi piesaistīties gan negatīvi lādētajiem

fosfātiem, kas ir nukleīnskābju ķēdes skeleta pamatā, veidojot stabilu kompleksu, gan arī

negatīvi lādētajai šūnas membrānai. Piemēram, katjoniski lipīdi veido sfēriskas, hidrofobas

struktūras – liposomas, kur terapeitiskais gēns ir iekapsulēts lipīdu dubultslānī (Fraley et al.,

1980). Liposomu formēšanās procesā lipīda pozitīvi lādētā hidrofilā daļa piesaistās

nukleīnskābes ķēdes skeleta garumā, bet hidrofobās daļas, savstarpēji mijiedarbojoties, aizkavē

hidrofilās daļas atdalīšanos un vienlaicīgi kalpo kā pārklājums, nodrošinot nukleīnskābes

aizsardzību (Kennedy et al., 2000; Oberle et al., 2000). Šis mehānisms padara liposomu mediētu

gēnu piegādi jeb lipofekciju par vienu no efektīvākajām un visplašāk pielietotajām metodēm

visu veidu nukleīnskābju transficēšanai dažādās šūnu līnijās. Ķīmisko gēnu piegādes vektoru

galvenais trūkums ir augstā citotoksicitāte

(Moghimi et al., 2005; Hunter; Lv et al., 2006), tie ir ļoti jutīgi pat pret nelielām izmaiņām vides

pH, temperatūrā un sāļu koncentrācijā, tāpēc ir problemātisks to pielietojums in vivo pētījumos.

Fizikālas gēnu piegādes galvenā priekšrocība ir spēja pārvarēt vairākas ekstracelulārās un

intracelulārās barjeras, apejot vienu vai vairākus pasīvās gēnu piegādes posmus (Brunner et al.,

2002). Tādējādi tiek nodrošināta tieša piekļuve šūnas citoplazmai vai pat kodolam, kas nozīmē,

ka teorētiski šūnās iespējams piegādāt jebkuru membrānu necaurlaidīgu molekulu, un šāda

pieeja vienlaicīgi paaugstina gan gēnu piegādes kinētiku, gan arī efektivitāti. Magnetofekcija ir

viena no efektīvākajām fizikālajām gēnu piegādes metodēm. Tās pamatā ir ar

superparamagnētiskajām nanodaļiņām (SPION) saistītu nukleīnskābju paātrināta

koncentrēšana uz šūnu virsmas un piegāde šūnās, izmantojot spēcīgu ārējo magnētisko lauku.

Salīdzinot ar citām fizikālajām gēnu piegādes metodēm, magnetofekcijai ir vairākas

priekšrocības. Tās gadījumā tiek izmantoti dabiski piesaistes un internalizācijas mehānismi,

tādējādi netiek bojāta šūnas membrāna un rezultātā būtiski samazinās metodes citotoksicitāte

(Laurent et al., 2011; Sapet et al., 2011). Magnētiskā lauka iedarbība audos sniedzas 10–15 cm

dziļumā, līdz ar to magnētiskās nanodaļiņas vienmērīgi akumulējas ne tikai virsējos, bet arī

dziļākajos audu slāņos (Goudy et al., 2008). Magnetofekcijas efektivitāte ir atkarīga gan no

SPION fizikāli ķīmiskajām īpašībām, gan arī magnētiskā lauka parametriem – magnētiskās

intensitātes un magnētiskā lauka gradienta.

10

Permanenti magnēti rada savu patstāvīgu statisku magnētisko lauku, kur magnētiskā

lauka gradienta virziens ir vertikāls pa Z asi (Hofmann-Amtenbrink et al., 2009). Tādējādi

statiskā magnētiskā laukā SPION kustība šķīdumā virzienā pret magnētu ir aksiāla. Vairākās

publikācijās aprakstīts alternatīvu magnētisko lauku pielietojums, kas ietver kompleksu

magnētiskā spēka iedarbību uz SPION pa X-Y-Z asi. Šādu magnētisko lauku ietekmes rezultātā

tiek izmainīta SPION kustība šķīdumā – tā ir ne tikai aksiāla, bet var būt arī laterāla, oscilējoša

un rotējoša. Pastāv uzskats, ka izmainītas SPION kustības rezultātā tiek stimulēta to pārnese

caur šūnas membrānu, taču precīzs šīs parādības mehānisms līdz galam nav noskaidrots. Laika-

fāzes variējoša magnētiskā lauka, kas tiek ģenerēts ar magnetofekcijas iekārtas DynaFECTOR

palīdzību, pamatā ir permanentu magnētu plates orbitāla rotācija šūnu kultūrai paralēlā plaknē.

Datormodelēšanas rezultātā tika noskaidrots, ka laika-fāzes variējoša magnētiskā lauka ietekmē

notiek SPION aksiāli laterāla kustība. Tā rezultātā sedimentācijas procesā SPION izvietojas

gan magnēta centrālajā daļā, gan pie ārējās robežas, kas veicina to vienmērīgāku sedimentāciju

arī uz virsmas. Laika-fāzes variējoša magnētiskā lauka ietekme uz SPION-nukleīnskābju

kompleksu piegādes efektivitāti šūnās nav noskaidrota.

Darba mērķis

Izpētīt laika-fāzes variējoša magnētiskā lauka ietekmi uz nukleīnskābju piegādes

efektivitāti vēža šūnās.

Darba uzdevumi

1. Salīdzināt superparamagnētisku dzelzs oksīda nanodaļiņu sedimentāciju šķīdumā

statiskajā un laika-fāzes variējošā magnētiskajā laukā, izmantojot iekārtu DynaFECTOR.

2. Veikt eksperimentālu reakcijas apstākļu optimizāciju statiskajā un laika-fāzes

variējošā magnētiskajā laukā, izmantojot iekārtu DynaFECTOR, lai sasniegtu maksimālu

nukleīnskābju piegādes efektivitāti vēža šūnās.

3. Salīdzināt nukleīnskābju piegādes efektivitāti vēža šūnās starp dažādām gēnu

piegādes metodēm.

4. Salīdzināt dažādu gēnu piegādes metožu pielietošanas citotoksisko efektu vēža

šūnās.

5. Salīdzināt superparamagnētisku dzelzs oksīda nanodaļiņu internalizācijas efektivitāti

statiskajā un laika-fāzes variējošā magnētiskajā laukā, izmantojot iekārtu DynaFECTOR.

11

Darba hipotēze

Laika-fāzes magnētiskā lauka ietekmē notiek superparamagnētisku dzelzs oksīda

nanodaļiņu pārvietošanās aksiāli laterālā virzienā, kas stimulē to iekļūšanu šūnās, tā paaugstinot

arī ar to saistīto nukleīnskābju piegādes efektivitāti.

Promocijas darba zinātniskā novitāte

Šajā pētījumā eksperimentāli tiks novērtēta laika-fāzes magnētiskā lauka ietekme uz

nukleīnskābju piegādes efektivitāti vēža šūnās in vitro un līdz ar to raksturota uzlabota gēnu

piegādes metode – liposomālā magnetofekcija laika-fāzes variējošā magnētiskajā laukā.

Metode varētu tikt pielietota efektīvākai gēnu piegādei dažādu veidu monoslāņa šūnu līnijās un

perspektīvā arī terapeitisko gēnu pārnesē vēža šūnās in vivo.

Promocijas darba struktūra un autora personīgais ieguldījums

Promocijas darbs uzrakstīts latviešu valodā uz 86 lpp. un sastāv no šādām sadaļām:

ievads, literatūras apskats, metodes, rezultāti, diskusija, secinājumi, publikāciju saraksts,

pateicības, izmantotā literatūra un pielikums. Promocijas darbs satur 29 attēlus un 14 tabulas.

Autore patstāvīgi veikusi visu eksperimentālo darbu, kā arī patstāvīgi apkopojusi un

analizējusi rezultātus un veikusi datu statistisko analīzi.

Pētījums izstrādāts Rīgas Stradiņa universitātes Augusta Kirhenšteina Mikrobioloģijas

un virusoloģijas institūtā laikā no 2010.–2013. gadam.

Pētījuma finansējuma avoti

1. ESF projekts “Jaunas starpnozaru zinātniskās grupas izveide uz nanotehnoloģijām

bāzētu pieeju izstrādei šūnu bioloģijā ar pielietojumu medicīnā”, vienošanās

Nr. 2009/0221/1DP/1.1.1.2.0/09/APIA/VIAA/074.

2. ESF projekts “Atbalsts doktorantiem studiju programmas apguvei un zinātniskā grāda

ieguvei Rīgas Stradiņa universitātē”, vienošanās

Nr. 2009/0147/1DP/1.1.2.1.2/09/IPIA/VIAA/009.

12

1. LITERATŪRAS APSKATS

1.1. Gēnu terapijas attīstība un pielietojums vēža terapijā

Vēzis ir nekontrolēta šūnu augšana, kas rodas vairāku gēnu somatisku mutāciju un

epiģenētisku izmaiņu rezultātā.

Gēnu terapija ir terapijas veids, kas balstīts uz viena vai vairāku gēnu vai gēnu

fragmentu, kas kodē normālus, funkcionālus proteīnus ievadīšanu pacienta šūnu ģenētiskajā

materiālā ar mērķi modificēt mutēto gēnu (-us) (Mehier-Humbert and Guy, 2005; Dick et al.,

2015).

Mūsdienās zināmi vairāki simti dažādu gēnu (> 1% no cilvēka genoma), kuru mutācijas

ir saistītas ar vēža veidošanos (Futreal et al., 2004; Wishhart, 2015).

Praktiskās gēnu terapijas pirmsākumi datējami ar 20.gs. 40.gadiem, kad Avery, McLeod

un McCarty eksperimentāli demonstrēja baktēriju Pneumococcus transformāciju ar DNS.

Pirmo reizi DNS ievadīšana eikariotu šūnās tika aprakstīta 1962. gadā, kad Szybalska un

Szybalski publicēja rezultātus par HPRT kodējoša gēna pārnesi cilvēka kaulu smadzeņu šūnu

mutantos, kas zaudējuši HPRT aktivitāti. Līdz ar šiem pētījumiem sākās strauja gēnu terapijas

virziena attīstība un 60.gados oficiāli tika formulēta “gēnu terapijas”, tolaik “gēnu ķirurģijas”

koncepcija tādu slimību ārstēšanai, kuras izraisa bojājumi gēnos (Tatum, 1966). 1990. gadā

ASV FDA apstiprināja pirmo gēnu terapijas izmēģinājumu pacientei ar

ADA-SCID – iedzimtu adenozīna deamināzes trūkumu, kas izraisa imūndeficītu

(Blaese et al., 1995). Drīz pēc tam 1992. gadā Rosenberg ar līdzautoriem ziņoja par pirmo gēnu

terapijas izmēģinājumu vēža slimniekiem. Terapijas ietvaros metastātiskas melanomas

slimniekiem tika injicēti ex vivo modificēti TNF ekspresējoši, tumoru infiltrējoši limfocīti.

Veicot ādas paraugu analīzi injekciju vietās pēc trim nedēļām, tajās netika atrastas audzēja

šūnas. Pēc 10 gadiem tika apstiprināts pirmais gēnu terapijas līdzeklis Gendicine™

(Ķīna, 2003. gads), kas bāzēts uz adenovīrusu saturošu, p53 ekspresējošu gēnu un aprobēts

galvas un kakla plakanšūnu vēža slimnieku terapijai (Pearson et al., 2004). Pēc gada tika

apstiprināts arī pirmais gēnu terapijas līdzeklis ES – Cerepro™, kas bāzēts uz adenovīrusu

saturošu, timīna kināzi ekspresējošu gēnu un aprobēts gliomas slimnieku terapijai

(Osborne, 2008).

Pēdējos gados gēnu terapijas pielietojums vēža ārstēšanā arvien pieaug un turpinās

jaunu pretvēža preparātu izstrāde. Pēc jaunākajiem datiem, vairāk kā 60% no visiem

uzsāktajiem klīniskajiem gēnu terapijas izmēģinājumiem ir saistīti tieši ar vēža terapiju

(Wirth and Ylä-Herttuala, 2014).

13

Gēnu terapija pieder pie t.s. mērķterapijas. Mērķterapijas pamatā ir iedarbība uz

specifiskiem, ar vēža šūnām asociētiem molekulāriem mehānismiem (pamatā receptori),

tādējādi samazinot iedarbību uz veselajām šūnām un attiecīgi arī terapijas blakusefektus

(Cassidy and Schätzlein, 2004). Turklāt, pateicoties spēcīgai amplifikācijas kaskādei

(no dažām nukleīnskābju molekulām gēnu ekspresijas rezultātā iespējams iegūt ievērojamu

daudzumu terapeitisko proteīnu), iespējams panākt augstu terapeitisko efektu.

1.2. Gēnu terapijas stratēģijas, terapeitisko gēnu veidi

Izšķir vairākas gēnu terapijas stratēģijas. Tā var būt tieša terapeitisko gēnu ietekme,

inhibējot vēža šūnu augšanu, apgrūtinot vēža vaskularizāciju un veicinot vēža šūnu bojāeju, vai

arī netieša ietekme, kas izpaužas kā imūnsistēmas stimulācija, iedarboties uz konkrētām mērķa

šūnām (Palmer et al., 2003; Tangney et al., 2006). Mutēto gēnu var atjaunot, pievienojot tam

funkcionāla gēna kopiju, aizstāt ar normālu gēnu vai inhibēt tā ekspresiju. Vēža terapijai

vispiemērotākie ir gēnu ekspresijas inhibitori. Tā ir plaša terapeitisko gēnu grupa, kuras

funkcija ir mutētā gēna transkripcijas inhibēšana, iedarbojoties uz mRNS

(Zhang et al., 2012). Pie tiem pieder antisena oligonukleotīdi, kas inaktivē mutēto gēnu,

hibridizējoties ar mutētā gēna mRNS; siRNS un miRNS, kas nomāc mutēto gēnu ekspresiju

(klusināšana), izraisot mRNS sadalīšanos, un ribozīmi – katalītiskas RNS, kas šķeļ mērķa

mRNS sekvences specifiskā veidā. Terapeitisko gēnu piegāde mērķa šūnās notiek ar nesēju jeb

vektoru palīdzību. Pamatā gēnu piegādes vektori ir rekombinantas plazmīdas DNS (pDNS)

formā. Rekombinantu pDNS sastāv no divām komponentēm: prokariotiskas, kas satur

antibiotiku rezistenci un plazmīdas replikāciju regulējošus gēnus un eikariotiskas, kas satur

transgēnu/-s un tā ekspresiju regulējošas sekvences. Jaunākajos pētījumos aprakstīta gēnu

piegāde izmantojot DNS minisfēras un lineārus, kovalenti slēgtus DNS minivektorus –

struktūras, kas nesatur prokariotiskās sekvences. Šāda vektora struktūra paaugstina gan

ekstracelulāro, gan intracelulāro biopieejamību un tas savukārt rezultējas paaugstinātā gēnu

pārneses efektivitātē (Mayrhofer et al., 2009; Sum et al., 2014).

1.3. Terapeitisko gēnu piegādes metodes



endocitozi un migrāciju šūnas iekšējā vidē līdz kodolam. Turklāt šo procesu apgrūtina pašu

14

terapeitisko līdzekļu – nukleīnskābju īpašības – sliktā difundētspēja caur šūnas membrānu to

izmēru, negatīvā lādiņa un hidrofilitātes dēļ (Jafari et al., 2012).

Gēnu piegādes iznākums ir tieši atkarīgs no izvēlētās vektorsistēmas – tai ir jābūt

efektīvai, specifiskai un drošai, bet ideālu gēnu piegādes vektoru raksturo virkne īpašību (Somia

and Verma, 2000; Ibraheem et al., 2014):

efektīvā veidā piesaistās terapeitiskajam gēnam neatkarīgi no tā lieluma un formas;

aizsargā terapeitisko gēnu no seruma, ekstracelulāro un intracelulāro endonukleāžu

degradējošās iedarbības;

nodrošina terapeitisko gēnu piegādi noteiktās dalošās un nedalošās mērķšūnās

neatkarīgi no to lokalizācijas vietas un integrētības apkārtējos audos;

ir neimunogēna;

ir netoksiska.

Pateicoties specifiskai un lokalizētai pieejai, ko iespējams panākt pielietojot atbilstošas

vektorsistēmas – gēnu piegādes metodes, var samazināt gan nepieciešamo terapeitiskā gēna

daudzumu, gan arī tā sistēmisku izplatību, tā samazinot terapijas blakusefektus. Gēnu piegādes

metodes klasiski iedala vīrusu (bioloģiskās) un bezvīrusu metodēs

(Cevher et al., 2012).

1.3.1. Vīrusu gēnu piegādes metodes

Gēnu piegāde šūnās, izmantojot vīrusu vektorsistēmas, ir visbiežāk pielietotais un

attīstītākais gēnu piegādes veids. Pēc Temin atklājuma 1961. gadā, ka vīrusu infekcijas var

ierosināt ģenētiskas mutācijas saimniekšūnās, Rogers un Pfuderer 1968. gadā pirmo reizi veica

gēnu pārnesi šūnās, izmantojot Tabakas mozaīkas vīrusa vektoru. 1984. gadā tika izstrādāta

pirmā retrovīrusu vektorsistēma gēnu piegādei zīdītāju šūnās (Cepko et al., 1984) un pēc

vairākiem gadiem veikti arī pirmie gēnu terapijas klīniskie izmēģinājumi, izmantojot

retrovīrusu vektorus. Vīrusiem piemītošās dabiskās īpašības – spēja viegli pārvarēt šūnas

membrānas barjeru, stimulējot endocitozes procesus, un ekspresēt vīrusa gēnus, izmantojot

saimniekšūnas biosintēzes mehānismu, padara tos par efektīviem gēnu piegādes instrumentiem

(Mulligan, 1993). Literatūrā plaši aprakstīts adenovīrusu (Palmer et al., 2002), AAV

(Hareendran et al., 2013), retrovīrusu (Tai and Kasahara, 2008), lentivīrusu

(Durand and Cimarelli, 2011), Herpes simplex vīrusa (Glorioso, 2014), Vaccinia ģints vīrusu

(Puhlmann et al., 2000), bakulovīrusu (Makkonen et al., 2015) un Epšteina Barra vīrusa

(Hellebrand et al., 2006) kā gēnu piegādes vektoru pielietojums. Uz adenovīrusu bāzes

konstruētie ir vieni no efektīvākajiem un visbiežāk pielietotajiem vīrusu vektoriem gēnu

15

piegādē, galvenokārt pateicoties to tropismam pret dažādu veidu šūnām un spējai pārnest

relatīvi lielus ģenētiskā materiāla fragmentus. Neskatoties uz to, tiem tāpat kā citiem vīrusu

vektoriem piemīt vairāki būtiski trūkumi – vīrusa proteīnu imunogenitāte, kas var izraisīt

spēcīgu organisma imūno atbildi un augsta citotoksicitāte pie lielām vīrusa devām

(Teramato et al., 2000; Anson, 2004). Pastāv arī zināms inserciju mutaģenēzes risks, kas var

novest pie onkogēnu aktivācijas, kā arī nejauša infekciozu vīrusa daļiņu veidošanās (Lachmann

and Davies, 1997; Thrasher et al., 2006; Bushman, 2007). Ir aprakstīti gadījumi, kad pēc

retrovīrusu gēnu terapijas, kas tika pielietota X-SCID slimniekiem attīstījās leikēmija

(Kohn et al., 2003; Marshall 2003). 1999. gadā pēc adenovīrusu saturoša vektora gēnu terapijas

uzsākšanas OTD sindroma ārstēšanai iestājās pacienta nāve, ko izraisīja masīva imūnās atbildes

reakcija uz adenovīrusu (Hollon, 2000). Pēc šī gadījuma tika apstādināta vairāku desmitu uz

vīrusiem bāzētu gēnu terapijas līdzekļu klīnisko pētījumu darbība un būtiski pieauga jaunu gēnu

piegādes metožu attīstība.

1.3.2. Bezvīrusu gēnu piegādes metodes

Vienkāršākais bezvīrusu gēnu piegādes veids ir nukleīnskābju piegāde šūnās bez

vektora. Taču šāda nukleīnskābe ir neaizsargāta un pakļauta mononukleāro fagocītu ietekmei

pirms nonākšanas mērķa šūnās un endonukleāžu ietekmei mērķa šūnu iekšējā vidē

(Zhang et al., 2012). Atkarībā no tā, kādā veidā tiek nodrošināta nukleīnskābju aizsardzība un

veicināta efektīvāka gēnu pārnese mērķa šūnās, bezvīrusu gēnu piegādes metodes klasiski

iedala ķīmiskās un fizikālās metodēs (Nayerossadat et al., 2012). Ķīmisku pieeju pamatā ir

vektori, kas nodrošina nukleīnskābju aizsardzību un piegādi enzimātisku procesu rezultātā, bet

fizikāli vektori ir balstīti uz mehānisku pieeju un to pielietošanā parasti nepieciešams specifisks

aprīkojums (Villemejane and Mir, 2009). Jāpiezīmē, ka, lai sasniegtu augstāku gēnu piegādes

efektivitāti un novērstu monometožu trūkumus, arvien biežāk gēnu piegādei izmanto

kombinētu pieeju, kas ietver gan ķīmiskus, gan fizikālus un dažos gadījumos arī vīrusu

vektorus.

Bezvīrusu vektoriem ir vairākas priekšrocības, salīdzinot ar vīrusu vektoriem. Tie ir

viegli sintezējami un ekspluatējami, spēj pārnest neierobežota garuma un daudzuma kodējošās

sekvences un tiem ir zema imunogenitāte (Ruβ and Wagner, 2007). Taču gēnu pārneses

efektivitāte, vērtējot pēc dažādiem ekspresijas rādītājiem, visām šobrīd zināmajām bezvīrusu

metodēm ir būtiski zemāka salīdzinot ar vīrusiem (He et al., 2010). Kamēr vīrusi šūnā iekļūst

izmantojot dabiskus mehānismus, ķīmiskajiem un fizikālajiem vektoriem ir specifiski

jāiedarbojas uz plazmatisko membrānu un/vai iekšējām vezikulārajām membrānām

16

(Luo and Saltzman, 2000). Šis trūkums kavē bezvīrusu metožu aktīvu pielietošanu klīniskajos

pētījumos.

1.3.2.1. Ķīmiskās gēnu piegādes metodes

Ķīmiskie gēnu piegādes vektori veido visplašāko bezvīrusu gēnu piegādes grupu un

pirmais literatūrā aprakstītais gadījums datējams jau ar 1965. gadu, kad Vaheri un Pagano

demonstrēja mūsdienās šīm mērķim plaši pielietotā polimēra atvasinājuma DEAE-dekstrāna

asistētu nukleīnskābju piegādi peļu un žurku fibroblastos. Pie ķīmiskiem gēnu piegādes

vektoriem pieder gan atsevišķi savienojumi kā DEAE-dekstrāns (Onishi et al., 2007), kalcija

fosfāts (Renzing and Lane, 1995), gan arī dažādu savienojumu grupas, kā katjoniski polimēri

(Magin-Lachmann et al., 2004, Luten et al., 2008), kas ietver PEI, PEG, PLL, čitosānu,

dendrimērus u.c. Plaši pielieto arī katjoniskus lipīdus (Wasungu and Hoekstra 2006), kā arī

proteīnus un peptīdus (Bolhassani, 2011; Ahmed et al., 2012).

Liela daļa ķīmisko vektoru ir katjoniski savienojumi. Tādējādi tie spēj efektīvi

piesaistīties gan negatīvi lādētajiem fosfātiem, kas ir nukleīnskābju ķēdes skeleta pamatā,

veidojot stabilu kompleksu, gan arī negatīvi lādētajai šūnas membrānai.

Svarīgs ir veids, kā terapeitiskā nukleīnskābe tiek sasaistīta ar vektoru, lai nodrošinātu

tās aizsardzību pret endonukleāžu degradatīvo ietekmi. Piemēram, katjoniski lipīdi veido

sfēriskas, hidrofobas struktūras – liposomas, kur terapeitiskais gēns ir iekapsulēts lipīdu

dubultslānī (Fraley et al., 1980). Liposomu formēšanās procesā lipīda pozitīvi lādētā hidrofilā

daļa piesaistās nukleīnskābes ķēdes skeleta garumā, bet hidrofobās daļas, savstarpēji

mijiedarbojoties, aizkavē hidrofilās daļas atdalīšanos un vienlaicīgi kalpo kā pārklājums,

nodrošinot nukleīnskābes aizsardzību (Kennedy et al., 2000; Oberle et al., 2000).

Šis mehānisms padara liposomu mediētu gēnu piegādi jeb lipofekciju par vienu no

efektīvākajām un visplašāk pielietotajām metodēm visu veidu nukleīnskābju transficēšanai

dažādās šūnu līnijās.

Vairāku ķīmisko vektoru (katjoniski polimēri) struktūra pieļauj to modifikācijas,

piemēram, dažādu funkcionālu biomolekulu piesaisti, kas paaugstina to difundētspēju caur

šūnas membrānu. Savukārt transdukcijas peptīdi ir dažādu proteīnu saimju īssekvenču

(< 30 aminoskābes) peptīdi, kas spēj pastāvīgi iekļūt šūnās, iespiežoties šūnu membrānās

(Lehner et al., 2013).

Būtisks vektora efektivitāti raksturojošs rādītājs ir tā intracelulārā aktivitāte. PEI satur

lielu skaitu protonējamo aminogrupu, kas nodrošina augstu buferizācijas kapacitāti pie jebkura

vides pH un izraisa t.s. “protonu sūkņa efektu” (Bousiff et al., 1995). Nonākot endosomās, PEI

17

ierosina pastiprinātu hlorīda jonu ieplūšanu tajās, kas savukārt ierosina ūdens ieplūšanu, lai

normalizētu jonu koncentrāciju endosomu iekšējā vidē. Osmotiskā spiediena rezultātā

endosomas membrāna plīst un terapeitiskais materiāls nonāk citoplazmā.

Ķīmisko gēnu piegādes vektoru, īpaši DEAE-dekstrāna, PEI un PAMAM dendrimēru

galvenais trūkums ir augstā citotoksicitāte (Moghimi et al., 2005; Hunter; Lv et al., 2006).

Savukārt citi vektori, kā kalcija fosfāts, ir ļoti jutīgi pat pret nelielām izmaiņām vides pH,

temperatūrā un sāļu koncentrācijā, tāpēc ir problemātisks to pielietojums in vivo pētījumos.

1.3.2.2. Fizikālās gēnu piegādes metodes

Fizikālas gēnu piegādes galvenā priekšrocība ir spēja pārvarēt vairākas ekstracelulārās

un intracelulārās barjeras, apejot vienu vai vairākus pasīvās gēnu piegādes posmus

(Brunner et al., 2002). Mehānisma pamatā lielākoties ir mākslīga pagaidu poru izveidošana

šūnas membrānā, kas kalpo kā dominējošais gēnu pārneses ceļš šūnas iekšējā vidē

(Alsaggar and Liu, 2015). Tādējādi tiek nodrošināta tieša piekļuve šūnas citoplazmai vai pat

kodolam, kas nozīmē, ka teorētiski šūnās iespējams piegādāt jebkuru membrānu necaurlaidīgu

molekulu, un šāda pieeja vienlaicīgi paaugstina gan gēnu piegādes ātrumu, gan arī efektivitāti.

Mikroinjekcija

Metodes pamatā ir nukleīnskābju tieša ievadīšana mērķa šūnu kodolā ar smalkas

> 0,2 µm diametra adatas palīdzību (Dean, 2014). Mikroinjekcija ir visefektīvākā fizikālās gēnu

piegādes metode, un transfekcijas efektivitāte ir pielīdzināma vīrusu gēnu piegādes iznākumam,

sasniedzot 100%. Metode ir laikietilpīga un tās kapacitāte aprobežojas ar nelielu šūnu

populāciju (> 500 šūnu) transficēšanu vienā pielietojuma reizē, tādēļ tā vairāk piemērota

laboratoriskiem eksperimentiem vai nelielu, lokālu šūnu populāciju (piemēram, limfmezglu

robežās) transficēšanai in vivo (Klinghoffer et al., 2015).

Ballistiskā gēnu piegāde jeb “gēnu pistole”

Metodes pamatā ir 1 µm lielu metāla (zelta, volframa, sudraba) mikrodaļiņu, uz kuru

virsmas adsorbētas nukleīnskābes ievadīšana mērķa šūnās ar elektrostatiska spēka vai gāzes

spiediena palīdzību. Ballistiskā gēnu piegāde ir piemērota dažādu, tai skaitā grūti transficējamu

šūnu transficēšanai. Metodei ir potenciāls pielietojumam pretvēža vakcīnu terapijā, ko apliecina

vairāku pētījumu rezultāti. Pelēm ar Her2/neu gēnu pārekspresējošu metastātisku melanomu

18

pēc Her2/neu saturošas DNS vakcīnas ievadīšanas novēroja strauju audzēja masas

samazināšanos un palielinātu dzīvildzi (Sun et al., 2006). Ballistiskās gēnu piegādes

vektorsistēma nodrošina neierobežota izmēra un daudzuma nukleīnskābju pārnesi šūnās, taču

jārēķinās, ka tādējādi tiek izraisīti lieli mehāniska rakstura šūnu bojājumi un līdz ar to pieaug

metodes citotoksiskais efekts (Uchida et al., 2009).

Sonoporācija

Sonoporācijas pamatā ir ultraskaņas radītas ar gāzi pildītu daļiņu jeb mikropūslīšu

oscilācijas, kas izraisa pagaidu poru veidošanos šūnas membrānā. Šādi, paaugstinot šūnas

membrānas caurlaidību, tiek veicināta nukleīnskābju pārnese šūnā (Miller et al., 2002;

Delalande et al., 2013). Metodes efektivitāte pamatā ir atkarīga no uzstādītajiem ultraskaņas

parametriem, taču ne mazāk svarīgs ir mikropūslīšu sastāvs, īpaši apvalks, no kura atkarīga

mikropūslīšu stabilitāte un izturība pret ultraskaņas radīto spiedienu. Mikropūslīši sastāv no

gāzu, piemēram, oglekļa dioksīda, sēra heksafluroīda u.c. kodola un lipīdu, polimēru vai

proteīnu apvalka, kas var tikt papildināts ar virsmaktīvo vielu papildslāni (Fan et al., 2014).

Jaunākajos pētījumos ir aprakstīta modificēta sonoporācijas metode, mikropūslīšu vietā

izmantojot nanopūslīšus, kas vairāk piemēroti terapeitiskiem mērķiem. Atšķirībā no

mikropūslīšiem, kuriem raksturīgs īss cirkulēšanas laiks un to izmēri nepieļauj ekstravazāciju

no asinsrites, nanopūslīšus iespējams akumulēt vēža šūnās, jo to nelielais izmērs ļauj migrēt

caur audzēja asinsvadu porām (Yin et al., 2012).

Šī metode ir neinvazīva un līdz ar to ar zemu citotoksicitāti, taču ir grūti reproducējama

– jāņem vērā vairāki būtiski parametri, kas katrā individuālajā pētījumā ir atšķirīgi.

Elektroporācija

Elektroporācija ir nukleīnskābju piegāde šūnās ar elektrisku impulsu palīdzību.

Elektriskie impulsi destabilizē šūnas membrānu un tajā veidojas īslaicīgas nanoizmēra poras,

kā rezultātā nukleīnskābes brīvi iekļūst citoplazmā, apejot endocitozes ceļu (Wells, 2004).

Elektroporācijas tehniku biomedicīnas pētījumos sāka izmantot pirms vairāk kā 30 gadiem,

(Neumann et al., 1982) un mūsdienās ir iespējams transficēt visu veidu šūnas. Pielietojot

elektroporācijas metodi, iespējams panākt pat 1000-kārtīgu gēnu piegādes efektivitātes

uzlabojumu (Sardesai and Weiner, 2011). Šīs īpašības ir priekšnosacījums elektroporācijas

veiksmīgam pielietojumam vēža terapijas klīniskajos pētījumos. Ir dati par efektīvu DNS

vakcīnu pielietojumu un gēnu terapijas stimulētu imunoterapiju metastātiskas melanomas

19

slimniekiem un prostatas vēža slimniekiem. Pastāvīga antivielu atbildes reakcija tika novērota

rekurenta prostatas vēža pacientiem 18 mēnešus pēc vakcinācijas ar DNS vakcīnu, kas kodē ar

PSMA epitopu saistītu tetanus toksīna C fragmenta domēnu (Low et al., 2009). Terapijas gaitā

netika novērotas ne bioķīmiskas, ne hematoloģiskas izmaiņas asins rādītājos. Metastātiskas

melanomas un rekurentas metastātiskās melanomas slimniekiem tika ievadīta citokīna IL-12

ekspresiju kodējoša pDNS. Biopsiju materiālā, kas tika ņemts no injekciju vietām tika

konstatēts paaugstināts IL-12 proteīna līmenis, audzēja šūnu nekroze un limfocītu infiltrācija

(Cha and Daud, 2012).

Elektroporācijas efektivitāti būtiski ietekmē elektriskā lauka parametri – elektriskā

sprieguma svārstības un impulsu garums, kuriem jābūt sabalansētiem, lai neizraisītu

neatgriezeniskus šūnas membrānas bojājumus (de Baere and Deschamps, 2014).

Magnetofekcija

Magnetofekcijas pamatā ir ar magnētiskajām nanodaļiņām saistītu nukleīnskābju

koncentrēšana uz šūnu virsmas un piegāde šūnās, izmantojot spēcīgu ārējo magnētisko lauku

(1.1. att.).

1.1. attēls. Magnetofekcijas mehānisms: (1) SPION struktūra, (2) SPION-nukleīnskābju

kompleksu veidošanās, (3) SPION kompleksu piegāde uz šūnu virsmas, (4) SPION kompleksu ieslēgšana šūnās un terapeitiskā gēna ekspresija

(Adaptēts no Fouriki et al., 2010)

20

Magnetofekcijai parasti izmanto superparamagnētiskās dzelzs oksīda nanodaļiņas

(SPION). Tās ir pozitīvi lādētas struktūras, kas sastāv no metālu oksīdu – magnetītu Fe3O4,

mehemītu γ-Fe2O3 vai hematītu α-Fe3O4 saturoša kodola un magnētiski inerta pārklājuma

(Mahmoudi et al., 2011). SPION kodola izmērs variē no dažiem līdz vairākiem desmitiem

nanometru (dažādos literatūras avotos no ≤ 20 līdz ≤ 50). Kamēr kodola uzbūve nosaka daļiņu

magnētiskās īpašības un ļauj manipulēt ar tām, izmantojot ārējo magnētisko lauku, no

pārklājuma ir atkarīgi tādi SPION parametri kā izmērs, šķīdība, dispersijas un magnetizācijas

pakāpe, koloidālā stabilitāte (Wilhelm et al., 2003; Yin and Feng, 2005, Easo and Mohanan,

2013). Atbilstošs pārklājums palīdz aizkavēt daļiņu agregāciju, nodrošināt vienmērīgu izkliedi

un saderību ar negatīvi lādēto šūnas virsmu, tā sekmējot internalizācijas efektivitāti mērķa šūnās

un samazinot citotoksicitāti (Santhosh and Ulrih; Singh and Sahoo, 2013). Konstatēts, ka

visefektīvākais pārklājuma veids ir hidrofili katjoniski elementi. Literatūrā ir dati par

organiskas izcelsmes savienojumu (dekstrāns, PEI, PEG, PVA, čitosāns u.c.), tā arī

neorganiskas izcelsmes (ogleklis, dārgmetāli (Au, Ag) un to sakausējumu, oksīdi

(γ-Fe2O3, SiO2, CoO)) elementu pielietojumu SPION pārklāšanai, kā rezultātā iespējams

uzlabot magnetofekcijas efektivitāti (Lam et al., 2013).

Superparamagnētiskas nanodaļiņas magnetizējas tikai magnētiskā lauka iedarbībā un

zaudē magnetizācijas spēju, kad magnētiskā lauka iedarbība beidzas (Silva et al., 2007).

Superparamagnētisms ir būtisks SPION pielietošanai pētījumos in vivo. Šādām SPION ir daudz

mazāka tendence agregēties magnētisko dipolu savstarpējās mijiedarbības dēļ un tas savukārt

samazina embolizācijas risku organisma iekšējā vidē, kā arī palīdz izvairīties no strauja renālā

klīrensa un deponēšanas imūnās sistēmas orgānos (Gupta and Gupta 2005; Shubayev et al.,

2009).

Visbiežāk pielietotā SPION sintēzes tehnika ir ko-precipitācija, bet izmanto arī citas

metodes, kā, piemēram, termiskā sadalīšana, mikroemulsijas, hidrotermālā sintēze u.c.

Ko-precipitācijas metodes pamatā ir SPION sintēze no Fe3+/Fe2+ sāļu ūdens šķīdumiem

sārmainā vidē pH 8–14 (Massart, 1981). Sintēze notiek istabas, retāk paaugstinātā temperatūrā

bezskābekļa apstākļos, lai kavētu Fe3O4 oksidēšanos par γFe2O3. Lai gan sintezētās daļiņas ir

ar plašu izmēru amplitūdu un augstu tendenci agregēties

(Teja and Koh, 2009) metode ir ātra, ekonomiska un ar augstu produktīvo iznākumu (Laurent

et al., 2008, Stephen et al., 2011).

Ar negatīvi lādētajām nukleīnskābēm SPION saistās elektrostatiskas mijiedarbības

rezultātā, veidojot stabilus kompleksus (1.2. att.).

21

1.2. attēls. SPION-nukleīnskābes kompleksa veidošanās princips

(Adaptēts no Dennig and Duncan, 2002)

Pielietojot magnētisko lauku, iespējams vieglāk pārvarēt šķīduma difūzijas barjeru un

paātrināti koncentrēt jaunizveidotos kompleksus uz šūnu virsmas (Mykhaylyk et al., 2009b;

2010), kur tie šūnās tiek ieslēgti endocitozes vai makropinocitozes ceļā. Tā pie identiskas

koncentrācijas šķīdumā noteiktā laika intervālā uz šūnu virsmas un pēc tam arī šūnā nonāk

vairāk kompleksu, kas rezultējas paaugstinātā transfekcijas efektivitātē (Gersting et al., 2004;

Plank et al., 2011). Šī īpatnība ir būtiska pielietojumam šūnās, kas ir jutīgas pret transficēšanu,

jo ļauj sasniegt augstu transgēnu ekspresijas līmeni, pielietojot samazinātu terapeitiskā līdzekļa

devu un saīsinot ekspozīcijas periodu (Krötz et al., 2003).

Magnetofekcija ir salīdzinoši jauna metode, kas pirmo reizi aprakstīta 2002. gadā

(Scherer et al., 2002), lai gan pētījumi par terapeitisko līdzekļu piegādi šūnās, izmantojot

magnētisko lauku, aizsākās jau vairāk kā 40 gadus atpakaļ, kad Widder publicēja rezultātus par

magnētisku mikrosfēru sintēzi pretvēža terapeitisko līdzekļu piegādei.

Magnetofekcija ir viena no šobrīd perspektīvākajām gēnu piegādes metodēm un tās

efektivitāte pēc atsevišķu transgēnu ekspresijas rādītājiem var sasniegt vairākus tūkstošus reižu

(Scherer et al., 2002). Tā ir efektīvāka gēnu piegādes metode dažādās vēža šūnu līnijās,

salīdzinot ar ķīmiskajām gēnu piegādes metodēm (Li et al., 2008; Liu et al., 2012), īpaši

lipofekciju (Xiang et al. 2003; Xenariou et al., 2006; Yang et al., 2007; Kievit et al., 2010) un

fizikālajām gēnu piegādes metodēm, piemēram, elektroporāciju (Prosen et al., 2014).

Salīdzinot ar citām fizikālajām gēnu piegādes metodēm, magnetofekcijai ir vairākas

priekšrocības. Tās gadījumā tiek izmantoti dabiski piesaistes un internalizācijas mehānismi,

tādējādi netiek bojāta šūnas membrāna un rezultātā būtiski samazinās metodes citotoksicitāte

(Laurent et al., 2011; Sapet et al., 2011). Magnētiskā lauka iedarbība audos sniedzas

10–15 cm dziļumā, līdz ar to magnētiskās nanodaļiņas vienmērīgi akumulējas ne tikai virsējos,

22

bet arī dziļākajos audu slāņos atšķirībā no ballistiskās gēnu piegādes, kas skar tikai virsējos

šūnu slāņus (Goudy et al., 2008).

Magnetofekcijas efektivitāte ir atkarīga gan no SPION fizikāli ķīmiskajām īpašībām,

gan arī magnētiskā lauka parametriem – magnētiskās intensitātes un magnētiskā lauka

gradienta. Optimizējot šos parametrus, iespējams paaugstināt magnetofekcijas efektivitāti.

Ņemot vērā SPION uzbūves īpatnības, kuru pamatā ir liela virsmas laukuma attiecība

pret tilpumu, kā arī pozitīvi lādēto kompleksu potenciālo mijiedarbību ne tikai ar negatīvi lādēto

šūnas membrānu, bet arī ar negatīvi lādētajiem ekstracelulārā matriksa proteīniem, viena no

stratēģijām ir SPION funkcionalizācija (1.3. att.).

1.3. attēls. Multifunkcionāla SPION

(Adaptēts no Fang and Zhang, 2009)

Lai uzlabotu SPION-terapeitisko gēnu piegādi vēža šūnās, tām var piesaistīt mērķēšanas

ligandus. Antivielas, aptamēri u.c. biomolekulas nodrošina SPION atpazīstamību mērķa šūnās

un līdz ar to efektīvāku mijiedarbību ar tām (Mahmoudi et al., 2014).

Lai nodrošinātu SPION-terapeitisko gēnu optisku detektējamību, bieži vien tiek

pielietota kombinēta pieeja, kompleksiem pievienojot fluorohromus (Bumb et al., 2010).

Literatūrā plaši aprakstīta SPION-ķīmijterapijas līdzekļu piegāde audzēju šūnās (Wilson

et al., 2004, Gautier et al., 2012).

SPION kā nanoizmēra vektorus ūdens vai organiskos ne-magnetizētos nesējos

(ferrošķīdumos) būtiski ietekmē dažādi vides fizikāli procesi – difūzija, šķidruma plūsma un

permeācija (Luo and Saltzman 2000; Plank et al., 2003). Pierādīts, ka vides pretestības spēks

korelē ar SPION nosēdināšanas ātrumu (Babincova and Babinec, 2009). Turklāt šajā pētījumā

tika konstatēts, ka 50 nm lielu SPION pārvietošanās ātrumu var palielināt, paaugstinot

23

magnētiskā lauka intensitāti, kā arī izmainot magnētu konfigurāciju, proti, permanentus

magnētus aizvietojot ar elektromagnētiem, kas ģenerē pulsējošo magnētisko lauku. Līdzīgu

pētījumu izstrādājis Krafcik ar līdzautoriem, modelējot magnētisku aerosolu piegādi plaušās ar

kvadripolāru permanentu magnētu sistēmas Hallbach palīdzību. Rezultātā tika konstatēts, ka

magnētiskais spēks būtiski prevalē pār citiem faktoriem, veicinot ātru SPION sedimentāciju,

pie kam SPION sedimentācijas trajektorijā netika konstatētas nozīmīgas izmaiņas

aerodinamisko un gravitācijas spēku ietekmē, kas radās elpošanas simulācijas rezultātā. Citā

pētījumā, palielinot magnētiskā lauka intensitāti no 150 mT līdz 350 mT, tika samazināta

SPION agregācija un pieauga akumulācija gliomas šūnās (Chertok et al., 2011).

Zināms, ka magnētiskā lauka indukcijas vērtību būtiski ietekmē attālums no magnēta.

Modelējot magnētiskā lauka amplitūdu un gradientu tipiskam cilindriskas formas permanentam

NdFeSm magnētam (d = 2 cm, h = 1 cm), tika konstatēts, ka magnētiskā lauka indukcija un līdz

ar to arī magnētiskā spēka vērtība krītas par 25% no maksimālās vērtības jau 1 cm attālumā no

magnēta virsmas, (Schwerdt et al., 2012).

Permanenti magnēti rada savu patstāvīgu statisku magnētisko lauku, kur magnētiskā

lauka gradienta virziens ir vertikāls pa Z asi (Hofmann-Amtenbrink et al., 2009). Tādējādi

statiskā magnētiskā laukā SPION kustība šķīdumā virzienā pret magnētu ir aksiāla

(1.4. att. (a)). Vairākās publikācijās aprakstīts alternatīvu magnētisko lauku pielietojums, kas

ietver kompleksu magnētiskā spēka iedarbību uz SPION pa X-Y-Z asi. Šādu magnētisko lauku

ietekmes rezultātā tiek izmainīta SPION kustība šķīdumā – tā ir ne tikai aksiāla, bet var būt arī

laterāla, oscilējoša un rotējoša (1.4. attēls (b)).

1.4. attēls. SPION kustība šķīdumā virzienā pret magnētu statiskā magnētiskajā laukā (a) un cita

veida ne statiskos magnētiskajos laukos (b)

24

Pulsējošs magnētiskais lauks, kura pamatā ir pastāvīga sinusveida viļņa iedarbība uz

šūnām perpendikulārā plaknē, kas izraisa SPION svārstības paralēli un perpendikulāri virsmai

ar atšķirīgu svārstību amplitūdu, pirmo reizi aprakstīts Kamau grupas pētījumā. Pielietojot vēža

šūnu līnijās, visaugstākā reportējošā gēna ekspresija tika sasniegta, secīgi kombinējot statisko

un pulsējošo magnētisko lauku. Autori pieļauj, ka SPION pārvietošanos caur šūnas membrānu

sekmē statiskā un pulsējošā magnētiskā lauka radītās aksiālas, laterālas un papildus oscilējošas

daļiņu kustības. Iedarbojoties uz adherentajām šūnu kultūrām ar pulsējošu magnētisko lauku,

kura pamatā ir īsu (milisekundes), atkārtotu impulsu ģenerēšana, iespējams panākt divkārtīgu

transgēna ekspresijas paaugstināšanos; novērotas transfekcijas efektivitātes izmaiņas atkarībā

no magnētiskā lauka stiprums un pulsu skaita

(Chen et al., 2009). McBain ar līdzautoriem izstrādājuši oscilējošās magnetofekcijas metodi,

kuras pamatā ir SPION kustība ne tikai aksiālā, bet arī laterālā virzienā, ko nodrošina zemas

frekvences svārstību ģenerēšana x-y plaknē (McBain et al., 2008). Ar metodes palīdzību

iespējams ievērojami paaugstināt reportējošo gēnu ekspresijas rādītājus dažādās grūti

transficējamās šūnu līnijās, piemēram, elpceļu epiteliālajās šūnās, primārajos astrocītos

(Pickard and Chari, 2010; Tickle et al., 2015), žurku oligodendrocītu prekursoru šūnās (Jenkins

et al., 2011), neirālajās cilmes šūnās (Adams et al., 2013), salīdzinot ar konvencionālajām

metodēm. Būtiski, ka oscilējošā magnētiskā lauka pielietojums neietekmē šūnu dzīvotspēju un

proliferāciju (Jenkins et al., 2011). Autoru novērojums, ka neirosfēru kultūrās, kuras tika

pakļautas oscilējošajām svārstībām, šūnu plazmatiskās membrānas ir ar izteiktāku

“krokojumu”, salīdzinot ar neapstrādātām kultūrām noveda pie hipotēzes, ka oscilējošā

magnētiskā lauka iedarbība izraisa lielāku šūnas membrānas kairinājumu tā, iespējams,

stimulējot endocitozi.

Dahmani grupa aprakstījusi magnētu sistēmu, kas sastāv no diviem permanentiem

magnētiem, starp kuriem ievietota šūnu kultūra. Šo magnētu rotācijas kustības ietekmē pie

noteiktas magnētiskās indukcijas tika ģenerēti impulsi līdz pat 400 apgr./min. Rezultātā

reportējošā gēna ekspresija suspensiju šūnu līnijā šī magnētiskā lauka ietekmē, salīdzinot ar

konvenciālajām metodēm, paaugstinājās 1,7–1,9 reizes, kas ir būtisks rādītājs, jo vairums

suspensiju šūnu līniju ir praktiski netransficējamas. Autori pieļauj, ka rotējošo magnētu radītie

spēki, kas uz SPION iedarbojas x-y plaknē izraisa to laterālu kustību, tā palielinot saskari ar

šūnām. Hajiani un Larachi pētījumā aprakstītas SPION molekulārā transporta īpatnības

statiskā, oscilējošā un rotējošā magnētiskā lauka ietekmē. Pētot daļiņu izkliedi šķīdumā vidēja

stipruma zemu frekvenču magnētisko lauku iedarbībā, autori konstatējuši, ka permanentais un

rotējošais magnētiskais lauks ietekmē to laterālo difūziju, atšķirībā no oscilējošā magnētiskā

lauka, kam netika konstatēta ietekme uz SPION laterālo difūziju. Interesanti rezultāti iegūti

25

analizējot SPION strukturālo izvietojumu šķīdumā dažādu magnētisko lauku ietekmē.

Konstatēts, ka rotējošā magnētiskā lauka iedarbībā SPION veido apaļas formas virpuļveida

struktūras, kamēr oscilējošā un statiskā magnētiskā lauka iedarbībā – lineāras, kvazistatiskas

struktūras (Gravel et al., 2015).

SPION kompleksu internalizācijas efektivitāti šūnās galvenokārt ietekmē to izmērs,

ņemot vērā to, ka tipisks endosomu izmērs klatrīnmediētas endocitozes gadījumā ir 100 nm un

attiecīgi kaveolu mediētas endocitozes gadījumā 50–80 nm (Bareford and Swaan, 2007).

Ir pierādīts, ka SPION, kuru izmēri nepārsniedz 200 nm ieslēgšana šūnās notiek klatrīna vai

kaveolu mediētas endocitozes ceļā, savukārt makropinocitoze ir dominējošais ceļs > 500 nm

lielām SPION (Rejman et al., 2004; Prijic et al., 2010). Jāpiezīmē, ka bieži SPION kompleksu

ieslēgšanas procesā vienlaicīgi iesaistīti vairāki endocitotiskie mehānismi (Hillaireau and

Couvreur, 2009) un endocitozes ceļš ir tieši atkarīgs no mērķa šūnu veida (Huth et al., 2004).

Endocitozes iznākumu magnetofekcijas rezultātā ietekmē arī tādi faktori kā SPION forma un

zeta potenciāls – lādiņš. Piemēram, šūnās tiek efektīvāk ieslēgtas sfēriskas formas SPION,

salīdzinot ar stienīšveida vai diskveida SPION (Chithrani et al., 2006; Muro et al., 2008).

Pozitīvi lādētas SPION parasti tiek labāk ieslēgtas, salīdzinot ar neitrāli lādētām SPION, tāpat

kā katjoniskas SPION salīdzinot ar anjoniskām

(Huang et al., 2010).

Audzēju šūnu membrānu īpatnības ir būtisks faktors SPION transporta nodrošināšanā,

ņemot vērā to, ka malignizācijas procesa rezultātā tiek izmainīta membrānu veidojošā lipīdu

slāņa struktūra, lai pielāgotos hipoksijas un pastiprināta metabolisma apstākļiem

(Sincai et al., 2005; Yameen et al., 2014). Tāpēc ļaundabīgām šūnām piemīt augstāks

endocitozes potenciāls salīdzinājumā ar normālām šūnām.

Magnetofekcija ir aprobēta pielietojumam in vitro dažādās, tai skaitā ļoti grūti

transficējamās šūnu līnijās, ex vivo (Svingen et al., 2009) un in vivo pētījumos.

Nozīmīgi ir RNS interferences pētījumi, ņemot vērā siRNS potenciālu audzēju ģenēzes

procesos iesaistīto gēnu ekspresijas inhibēšanai pat viena oligonukleotīda mutācijas robežās.

Plank grupa ir publicējuši visaptverošus pārskatus un protokolus siRNS

magnetofekcijai tai skaitā cilvēka vēža šūnu līnijās HeLa, NCI-H441 un Jurkat, Caco-2

(Mykhaylyk et al., 2007–2010, 2015). Namiki grupa demonstrējuši efektīvu SPION-siRNS

piegādi pēc reportējošā gēna ekspresijas 10 dažādās kuņģa vēža šūnu līnijās un HeLa šūnu

līnijā.

Vairākos pētījumos pārbaudīts arī potenciāli terapeitisku siRNS efekts. Birc5 gēna, kas

saistīts ar ķīmijterapijas rezistenci, paaugstinātu audzēja rekurenci un mazāku dzīvildzi

pārekspresiju konstatē lielai daļai audzēju. Būtisks siRNS inhibējošais efekts uz birc5 gēna

26

ekspresiju, izmantojot magnetofekciju, tika panākts BT-20, CAPAN-2 un LS-174T šūnu līnijās

(Kumar et al., 2010). BCL2 gēna pārekspresija inhibē apoptozes procesus. Pielietojot

kompleksus SPION-siRNS savienojumus, tika būtiski inhibēta BCL2 gēna ekspresija A549 un

SKOV-3 šūnās (Taratula et al., 2008).

Magnetītu saturošas SPION pagaidām ir vienīgais magnētisko nanodaļiņu veids, kas

aprobēts pielietošanai klīniskos pētījumos (pēc ASV FDA datiem) (Rudolf et al., 2014). Tās ir

fizioloģiski inertas ar zemu toksicitāti (Breimer, 1998; Torchilin, 2000) un noārdīšanās līdz

dzelzij un skābeklim organismā notiek dabiskos metabolisma ceļos (Weissleder et al., 1995).

Magnētiskiem šķīdumiem piemīt laba kardiovaskulārā panesamība (Lübbe et al., 2001).

SPION ir piemērotas pielietošanai vēža ārstēšanā. Savu izmēru un struktūras dēļ tās spēj

izvairīties no mononukleāro fagocītu iedarbības asinsritē un migrēt audzēja mikrovidē

(ekstravazācija no asinsrites) un uzkrājas tur pastiprinātas caurlaidības un aiztures (enhanced

permeability and retention effect – EPR) efekta ietekmē. EPR efekts izskaidro audzēju

angioģenēzes īpatnības – audzēju asinsvadi ir deformēti un tajos veidojas poras, jo endoteliālās

šūnas neveido normālu monoslāni (McDonald and Foss, 2000), savukārt vājā limfas attece no

audzēja audiem dēļ paaugstināta intersticiālā spiediena audzēja centrā kavē nanodaļiņu

aizplūšanu (1.5. att.). Pētījumos apstiprināts, ka SPION labāk akumulējas audzēja, nekā

normālos audos (Byrne et al., 2008).

1.5. attēls. Nanonesēju akumulācija audzēja audos EPR efekta ietekmē

(Adaptēts no Jhaveri and Torchilin, 2014)

Ārējā magnētiskā lauka pielietojums nodrošina SPION kompleksu piegādi un

koncentrēšanos mērķa vietā bez specifiskas SPION funkcionalizācijas, kas savukārt paaugstina

27

SPION internalizācijas iznākumu audzēja audos. Šis efekts plaši demonstrēts pētījumos ar

dzīvniekiem, pielietojot gan sistēmisku, gan lokālu terapeitisko gēnu ievadīšanas pieeju.

Schillinger grupas pētījumā SPION-reportējošā gēna kompleksi tika ievadīti kāmja

krūts audzēja šūnās un virs ievades vietas uz 1 stundu fiksēts permanents magnēts. Pēc 40

stundām audzēja audos tika konstatēta reportējošā gēna ekspresija, kamēr dažādos orgānos –

sirdī, plaušās, aknās, liesā un ādā virs audzēja gēnu ekspresiju nekonstatēja. Scherer ar

līdzautoriem veica SPION-reportējošā gēna kompleksu injekcijas cūku labās un kreisās auss

vēnās, bet permanents magnēts tika fokusēts virs labās auss injekciju vietā. Rezultātā gēnu

ekspresija visos paraugos tika konstatēta vietās, kas pakļautas tiešai magnētiskā lauka ietekmei,

bet kontroles paraugos (kreisās auss vēnas), kā arī attālās vietās labās auss vēnās reportējošo

gēnu ekspresija netika novērota. Būtiski, ka reportējošā gēna signāli netika novēroti citos

orgānos.

Viens no svarīgākajiem aspektiem ir novērtēt SPION kompleksu sistēmiskas

ievadīšanas efektivitāti, jo tas parāda gēnu piegādes vektorsistēmas spēju pārvarēt vairākas

organisma iekšējās vides barjeras un atspoguļo terapijai pietuvinātus apstākļus. Reportējošo

gēnu saturoši SPION kompleksi tika injicēti pelēm caur astes vēnu un ar permanentu magnētu

radīta ārējā magnētiskā lauka palīdzību virzīti uz sirdi un nierēm 6 stundu periodā. Pēc

inkubācijas SPION kompleksu klātbūtne pēc reportējošā gēna ekspresijas tika konstatēta mērķa

vietās – plaušās, sirdī un nierēs, taču SPION zudumi sasniedza 30%

(Kumar et al., 2010). Sistēmiska piegāde uzrādīja lielāku SPION akumulāciju aknās nekā

audzējā, lai gan, veicot SPION virsmas modifikāciju, iespējams paaugstināt to akumulāciju

audzējā (Prabha et al., 2012).

Magnetofekcijas pielietojums neizraisa būtiskus blakusefektus (Schillinger et al., 2005;

Hüttinger et al., 2008; Sharma et al., 2011).

Vairākos pētījumos pierādīts, ka magnetofekcijas pielietojumam ir ietekme arī uz

terapeitisko efektu – izraisa audzēja samazināšanos, samazina recidīvus/vēli recidīvi, kā arī

paaugstina dzīvildzi. Piemēram, pēc kaķu fibrosarkomas audu magnetofekcijas ar cilvēka GM-

CSF gēnu tika novērots būtisks stabilas remisijas gadījumu pieaugums 1 gada periodā.

Identiskus novērojumus attiecībā uz remisijas gadījumiem publicējuši arī citi autori

(Jahnke et al., 2007; Hüttinger et al., 2008) imunostimulējošas gēnu terapijas pētījumos.

Sharma grupas pētījumā tika konstatēts, ka intratumorālas SPION-p53 gēna kompleksu

injekcijas inhibē audzēja augšanu pelēm, kurās pārnestas PC3 p53 neekspresējošas šūnas.

Veicot audzēja audu analīzi, lielāks skaits p53 pozitīvu šūnu tika konstatēts gadījumos, kad tika

pielietota SPION-p53 terapija, salīdzinot ar p53DNS terapiju bez SPION. Pielietojot SPION-

p53 terapiju, tika novērota audzēja samazināšanās par 41%, kamēr p53DNS pielietojums

28

izraisīja audzēja samazināšanos par 20%, salīdzinot ar kontroles grupu. Interesanti rezultāti tika

iegūti veicot reālā laika novērošanu pēc SPION-fluorohroma intravenozas ievadīšanas.

Sākotnēji augsts signāls tika novērots aknās, bet pēc vairākām stundām signāla intensitāte

paaugstinājās audzējā un signālu bija iespējams detektēt vēl

4 dienas. SPION-p53 terapijas gadījumā būtiski palielinājās dzīvildze – vidēji 39 dienas,

salīdzinot ar vidēji 27 dienām pēc p53DNS terapijas. Pēc SPION-p53 terapijas autori konstatēja

būtisku asinsvadu blīvuma samazināšanos audzēja audos, tāpat tika novērots augstāks

apoptozes indekss, salīdzinot ar kontroles grupu. Lielākajai daļai dzīvnieku (6 no 8) pēc

p53DNS terapijas attiecīgā laika posmā tika konstatētas metastāzes limfmezglos un

peritoneālajā dobumā, kamēr SPION-p53 gadījumā metastātisks process tika konstatēts 1 no 7

dzīvniekiem, kas liek domāt, ka SPION-p53 ietekmē ne tikai audzēja augšanu, bet arī

metastātiska procesa attīstību.

Audzēja angioģenēzes samazināšanos un attiecīgi būtisku audzēja masas samazinājumu

par 48% kā rezultātā palielinājās dzīvildze sistēmiskas SPION-p53 terapijas ietekmē pelēm

novēroja arī Prabha ar līdzautoriem.

Magnetofekcija veiksmīgi pielietota melanomas metastāžu inhibēšanai – pētījuma

ietvaros pelēm tika injicēti metastāžu supresorgēnu NM23-H1 saturoši SPION kompleksi un

tika novērtēta gan magnetofekcijas, gan kombinētas (magnetofekcija/ķīmijterapija) pieejas

efektivitāte salīdzinājumā ar ķīmijterapiju. Tika konstatēts, ka gēnu terapija ar SPION dod

līdzvērtīgu rezultātu kā ķīmijterapija, bet visaugstāko efektivitāti iespējams sasniegt, pielietojot

kombinētu pieeju. Tika novērota ne tikai metastāžu samazināšanās līdz pilnīgai izzušanai, bet

arī būtiski palielinājās dzīvildze (Li et al., 2009).

Ir vairāki sekundāri aspekti, kas parāda magnetofekcijas kā vektorsistēmas potenciālu

ne tikai gēnu pārnesei un perspektīvā varētu tikt pielietoti kombinētas terapijas izstrādei.

Magnetofekcija nodrošina efektīvāku ķīmijterapijas līdzekļu piegādi šūnās. Alexiou

grupas pētījumā pelēm ar plakanšūnu karcinomu cirkšņa artērijā vai auss vēnā tika ievadīti

SPION-mitoksantrona kompleksi, kamēr ārējais magnētiskais lauks tika fokusēts uz ādas virs

audzēja. Visaugstākā SPION-mitoksantrona akumulācija tika konstatēta audzēja audos un

nelielos daudzumos arī aknās, plaušās un liesā. Taču, salīdzinot ar kontroli bez magnētiskā

lauka iedarbības, audzējā un apkārtējos audos dzelzs rādītāji bija vairākus simtus reižu augstāki.

Intraarteriāla ievadīšana rezultējās pilnīgā un stabilā remisijā, salīdzinot ar bez terapijas un

intravenozo terapiju. Būtiski, ka šis efekts tika sasniegts pielietojot samazinātu devu – 20 līdz

50% no sistēmiskās devas, pie kuras mitoksantrona koncentrācija audzēja šūnās un apkārtējos

audos pieauga 44 reizes. Piemērotā terapija neizraisīja blakusefektus un novērošanas periodā

netika novērota metastāžu attīstība. Vēlāk šī pati grupa konstatēja, ka magnētiskā lauka

29

iedarbība izraisa ne tikai terapeitisko kompleksu pastiprinātu koncentrēšanos uz audzēja šūnu

virsmas, bet arī stimulē SPION iekļūšanu tā šūnās. Citā pētījumā ar pelēm, kurās pārnestas krūts

audzēja šūnas pēc intravenozas ievadīšanas parādīta efektīva SPION-liposomu-paklitaksela

akumulācija audzēja šūnās ārēja magnētiskā lauka ietekmē (Zhang et al., 2005).

Liela daļa magnetofekcijas pētījumu ir veltīti smadzeņu audzēju terapijai, jo smadzeņu

audzēji bieži vien ir neoperējami izmēru un sarežģītas lokalizācijas vietas dēļ un slikti reaģē uz

ķīmijterapiju hematoencefalītiskās barjeras dēļ (Juratli et al., 2013). Ir pierādīts, ka SPION spēj

šķērsot hematoencefalītisko barjeru un to būtiski ietekmē SPION izmērs

(Pulfer and Gallo, 1998). Kievit grupa pētījumā ar pelēm ar C6 žurku gliomas audzējiem tika

pierādīta SPION kompleksu akumulācija gliomas šūnās pēc sistēmiskas ievadīšanas astes vēnā.

Citā pētījumā SPION akumulācija 9L-gliomas šūnās žurkām pēc intravaskulāras ievadīšanas

palielinājās pieckārt fokusēta ārējā magnētiskā lauka ietekmē, salīdzinot ar kontroles grupu bez

ārējā magnētiskā lauka pievadīšanas ar SPION pasīvu akumulāciju gliomas šūnās (Chertok et

al., 2008).

Vēl viens interesants magnetofekcijas pielietojuma virziens ir šūnu pielāde ar SPION ar

mērķi tās padarīt magnetovadāmas, jo magnētiskā lauka iedarbība izraisa ne tikai SPION

kustību, bet arī ar SPION pielādētu šūnu kustību. Muthana grupas pētījumā reportējošo gēnu

ekspresējoši monocīti tika pielādēti ar SPION. Veicot intravenozas injekcijas nude pelēm, tika

novērots, ka būtiski vairāk SPION saturošu monocītu tiek koncentrēti uz audzēja audiem pēc

magnētiskā lauka pievadīšanas, respektīvi, magnētiskā lauka iedarbība izraisīja monocītu

virzību uz audzēja audiem. Būtiski, ka liels daudzums SPION saturošu monocītu tika konstatēti

slikti apasiņotās audzēja zonās.

Neskatoties uz daudzsološajiem rezultātiem pētījumos in vivo izmantojot dzīvniekus,

šobrīd nav neviena uz magnētiskiem vektoriem bāzēta sistēma, kas būtu izgājusi visas klīnisko

pētījumu fāzes un aktīvi pielietota terapeitiskiem mērķiem. Pirmie ziņojumi par magnētisku

nesēju pielietojumu klīniskajos pētījumos tika publicēti 90. gados

(Lübbe et al., 1996). Pētījumā tika iekļauti 14 slimnieki pēc neefektīvas ķīmijterapijas, kuriem

1–3 kursu veidā tika veiktas intravenozas SPION-epirubicīna infūzijas ar sekojošu ārējā

magnētiskā lauka iedarbību audzēju lokalizācijas vietās 60–120 min garumā. Tika konstatēts,

ka ārējā magnētiskā lauka iedarbība nodrošina SPION kompleksu piegādi audzēja šūnās 50%

no pētījumā iesaistītajiem pacientiem un SPION izraisīta paaugstināta orgānu toksicitāte netika

novērota. Wilson ar līdzautoriem ziņojuši par I/II fāzes hepatocelulārās karcinomas slimnieku

terapijas efektivitāti. Pētījumā tika iekļauti 4 pacienti, kuriem netālu no audzēja esošajā artērijā

injicēja SPION-doksorubicīna hidrohlorīda savienojumus ar sekojošu spēcīga magnētiskā lauka

iedarbību audzēja lokalizācijas vietā. Rezultātā magnētiskā lauka iedarbība izraisīja SPION

30

kompleksu nokļūšanu audzējā un, tā kā kopējais administrēto terapeitisko līdzekļu apjoms bija

ļoti zems, netika novēroti praktiski nekādi blakusefekti.

Laika-fāzes variējošs magnētiskais lauks

Mūsu starpdisciplinārā grupa ir aprakstījusi laika-fāzes variējošu magnētisko lauku,

kuru rada permanentu magnētu orbitāla rotācija šūnu kultūrai paralēlā plaknē. Pastāv uzskats,

ka magnētu orbitāla rotācija ietekmē SPION kustību šķīdumā, tā sekmējot to sedimentāciju uz

(šūnu) virsmas.

Laika-fāzes variējošs magnētiskais lauks tiek ģenerēts ar iekārtas DynaFECTOR

palīdzību, kas ir paredzēta šūnu transficēšanai 24 iedaļu šūnu kultūru platē (1.6. att.).

1.6. attēls. Magnetofekcijas iekārta DynaFECTOR: 1 – 24 iedaļu plates vieta, 2 – strāvas padeves

slēdzis, 3 – vadības panelis, 4 – ekspozīcijas ilgums laika-fāzes variējošā magnētiskajā laukā, 5 –

ekspozīcijas ilgums statiskajā magnētiskajā laukā, 6 – magnētu apgriezienu frekvence

DynaFECTOR raksturojošie parametri:

programmējama magnētiskās sistēmas rotācija orbītā ar ātrumu 1–150 apgr./min;

fiksēts rotācijas laiks 1–999 min;

papildus ieprogrammēta rotācijas virziena maiņa ik pēc 30 sekundēm visā SPION

nosēdināšanas procesā;

termostatiskā temperatūra 36 ± 1°C.

Iekārta DynaFECTOR konstruēta maisītāja platformas vietā iemontējot magnētisko

sistēmu, kas sastāv no 12 permanentiem, vienpolāri orientētiem cilindriskas formas retzemju

neodīma-dzelzs-bora (NdFeB) permanentajiem magnētiem (d = 19 mm). Magnēti uz

magnētiskās sistēmas izvietoti šahveida kārtībā (1.7. att.) tā, ka ņemot vērā magnētu sistēmas

31

kustības amplitūdu, katra magnēta rotācijas orbīta ietver divas iedaļas 24 iedaļu platē. Saskaņā

ar magnētiskā vektora spēku datormodeli, magnēti uz virsmas izkārtoti tā, lai atkarībā no to

kustības būtu iespējams sasniegt magnētiskā lauka indukciju 0,35 T un aksiālās un radiālās

komponentes gradienta līmeni 3 ×107 a/m2.

1.7. attēls. Magnētu izvietojums DynaFECTOR magnētiskajā sistēmā

(Adaptēts no Vainauska et al., 2012)

Virs magnētu sistēmas nostiprināta ne-magnetizējoša metāla plāksne, uz kuras

paredzēta vieta 24 iedaļu šūnu kultūru platei; fiksētais attālums no šūnu kultūru plates

apakšmalas līdz magnētu virsmai ir 3,5 mm (1.8. att.).

1.8. attēls. Magnētu sistēmas rotācijas plakne

attiecībā pret 24 iedaļu šūnu kultūru plates plakni

Magnētu sistēmas, kas rotē zem šūnu kultūru plates orbitālās rotācijas rādiuss ir 2 cm

neatkarīgi no rotācijas virziena.

Rotējošā magnētu sistēmā specifisku magnētisko spēku iedarbību uz SPION raksturo

magnētu pozīcijas orbītā, respektīvi, 1., 2., 3. fāze (1.9. att. (a)). Pirmās fāzes gadījumā magnēts

neatrodas zem iedaļas un šajā gadījumā magnētiskā spēka iedarbība ir līdzvērtīga nullei. Otrajā

fāzē notiek SPION laterāla kustība, jo dominanta kļūst radiālā komponente, bet trešajā fāzē

SPION kustība notiek aksiālā virzienā, jo magnēts atrodas tieši zem iedaļas.

32

1.9. attēls. Rotējošas magnētiskās sistēmas princips: (a) shematiska magnētu sistēmas ilustrācija

vienam magnētam un divām šūnu kultūru plates iedaļām; 1., 2., 3. fāze – magnētu pozīcijas zem

iedaļām orbitālās rotācijas procesā, (b) shematisks attēlojums magnētiskā lauka darbībai

dažādos laika posmos; 1., 2., 3. – relatīvais magnētiskā lauka darbības ilgums; sarkanās bultiņas

norāda magnētiskā lauka virzienu un relatīvo lielumu (pēc bultiņu garuma)

(Adaptēts no Karpov et al., 2014)

Novērtējot magnēta atrašanās relatīvo ilgumu katrā no fāzēm (1.9. att. (b)), tika

konstatēts, ka pirmajā fāzē kad magnētiskais spēks uz SPION neiedarbojas, to izkliede ir

vienmērīga visā telpā (skat. krāsojumu 1.9. att. (b)). Savukārt otrajā fāzē, magnētiskā spēka

radiālā komponente, īslaicīgi iedarbojoties uz SPION, izraisa to laterālu kustību dažādos

virzienos, jo orbitālā perioda laikā iedarbojas uz SPION divas reizes. Trešajā fāzē magnētiskā

spēka aksiālā komponente virza SPION lejup pretim plates iedaļas (šūnas) virsmai.

Sākotnējie datormodelēšanas rezultāti (Comsol), novērtējot magnētiskā spēka iedarbību

uz SPION laika-fāzes variējošā magnētiskajā laukā1, parādīja, ka sedimentācijas procesā

SPION izvietosies gan magnēta centrālajā daļā, gan pie ārējās robežas, jo magnētiskā lauka

aksiālā komponente dominē Z ass virzienā un virza SPION uz leju pret magnētu, savukārt

radiālā komponente, kas dominē pie magnēta malas veicina SPION laterālu kustību (1.10. att.).

1 Attālums no NdFeB magnēta (350 mT virsmas centrā, r = 9 mm, h = 7 mm) 3,5 mm

33

1.10. attēls. Aksiālā (zils krāsojums) un radiālā (zaļš krāsojums) magnētiskā spēka

komponentes (a), taisnleņķa un cilindriskā koordinātu sistēma attiecībā pret magnētu (b)


To uzskatāmi apstiprina datormodelēšanas rezultāti (Matlab), novērtējot magnētiskā

lauka radiālās komponentes virzienu grafisku momentu izplatību diviem gadījumiem2

1.11. att. ((a) un (b)). Izrietošais spēks tiek vērsts magnēta orbītas centra virzienā

(1.11. att. (c)); trešajā fāzē, magnētiskā spēka aksiālā komponente virza SPION aksiālā virzienā

pretim virsmai. Tā kā magnētiskās sistēmas orbitālās kustības rezultātā magnētiskā lauka

iedarbība ir laika-fāzes variējoša, SPION pārvietošanās mainīsies atkarībā no magnētu

apgriezienu frekvences.

Aprēķināts, ka SPION pārvietojuma amplitūda var sasniegt līdz pat 0,5 µm saskaņā ar

magnēta robežas lineāro ātrumu 𝑣 60 mm/s, un magnētiskā lauka gradientu 50 T/m.

2 𝑅0 = 10 𝑚𝑚, 𝑟0 = 9 𝑚𝑚

34

1.11. attēls. Radiālā spēka virzienu izkliede: (a) un (b) – magnētam otrajā fāzē (attiecīgi kreisā

un labā pozīcija kā attēlots 1.9. attēlā), (c) – izrietošais spēks; magnētiskais spēks (a) un (b)

parāda magnētisko momentu (apvilkti ar apļiem) izkliedi


Datormodelēšanas rezultāti (FORTRAN3), novērtējot sedimentēto SPION izkliedes

profilu atkarībā no rotējošas platformas apgriezienu frekvences , vienpolāri orientētu magnētu

gadījumā uzrādīja būtiskas atšķirības (1.12. att.).

1.12. attēls. Uz kivetes pamatnes virsmas daļas (kvadrātveida laukums 2 × 2 cm2

) nosēdināto

SPION izkliede pie dažādām maisītāja platformas apgriezienu frekvencēm ω, apgr./min

(Adaptēts no Kozlov et al., 2015)

3 1,3 mm biezs SPION suspensijas slānis tika sadalīts kubiskas formas 1 × 1 × 1 mm3 izmēra elementos un SPION

trajektoriju sākumpunkti atradās šo elementu centrā.

35

Gadījumā, kad magnēti bija nekustīgi (ω = 0) SPION sedimentācija bija ļoti

nevienmērīga (1.12. att. (a)), un ievērojama daļa kivetes pamatnes virsmas (~ 40%) palika

nenoklāta.

Uzsākot rotāciju, SPION sedimentācija uz pamatnes notika vienmērīgāk

(1.12. att. (b un c)). Sasniedzot rotējošas platformas magnētu apgriezienu frekvenci

= 40 apgr./min, SPION izkliede kļuva vienmērīgāka, nenosedzot tikai ~ 10% virsmas

laukuma (1.12. att. (d)). Tika konstatēts, ka SPION izkliede paliek nemainīga, palielinot

platformas apgriezienu frekvenci. Šāds SPION izvietojums uz pamatnes virsmas liecina, ka

SPION, kas pakļautas kustībā esošu magnētu magnētisko lauku iedarbībai, tiek nosēdinātas

praktiski vertikāli kivetes pamatnei pa asi Z ar relatīvi nelielu pārvietojumu šķērsām.

Projekcija no vienas no aprēķinātajām SPION trajektorijām plaknē XZ attēlota

1.13. attēlā. Uzskatāmi redzams, ka magnētu riņķveida kustība atspoguļojas raksturīgās SPION

trajektorijas svārstībās – gan aksiālā, gan laterālā virzienā.

1.13. attēls. SPION trajektorijas projekcija XZ plaknē: a – magnēti rotē ar apgriezienu frekvenci

40 apgr./min, b – magnēti ir nekustīgi

(Adaptēts no Kozlov et al., 2015)

Magnetofekcija ir viena no šobrīd perspektīvākajām gēnu piegādes metodēm, kuras

pamatā ir ar magnētiskajām nanodaļiņām saistītu nukleīnskābju koncentrēšana uz šūnu virsmas

un piegāde šūnās, izmantojot spēcīgu ārējo magnētisko lauku. Laika-fāzes variējoša magnētiskā

lauka, kas tiek ģenerēts ar magnetofekcijas iekārtas DynaFECTOR palīdzību, pamatā ir

permanentu magnētu plates orbitāla rotācija šūnu kultūrai paralēlā plaknē. Datormodelēšanas

rezultātā tika noskaidrots, ka laika-fāzes variējoša magnētiskā lauka ietekmē notiek SPION

aksiāli laterāla kustība. Tā rezultātā sedimentācijas procesā SPION izvietojas gan magnēta

centrālajā daļā, gan pie ārējās robežas, kas veicina to vienmērīgāku sedimentāciju arī uz

virsmas. Laika-fāzes variējoša magnētiskā lauka ietekme uz

SPION-nukleīnskābju kompleksu piegādes efektivitāti šūnās nav noskaidrota.

36

2. MATERIĀLS UN METODES

2.1. Materiāls

2.1.1. Šūnu līnijas

Darbā kā modelis tika izmantota cilvēka prostatas karcinomas šūnu līnija (PC3)

(ScienCell, ASV) un cilvēka aknu hepatocelulārās karcinomas šūnu līnija (HEPG2) (ScienCell,

ASV). Izvēlētās šūnu līnijas pieder pie grūti transficējamām šūnu līnijām, tāpēc ir piemērotas

transgēna efektivitātes novērtēšanai. Šūnu kultivēšanai tika izmantoti sertificēti šūnu kultūru

reaģenti (Life Technologies, ASV), un šūnu kultivēšana tika veikta atbilstoši ražotāju

rekomendācijām. PC3 šūnas tika audzētas RPMI-1640/F-12 barotnē, papildinātā ar 10% FBS,

penicilīnu (100 U/ml) un streptomicīnu (100 μg/ml). HEPG2 šūnas tika audzētas DMEM

barotnē, papildinātā ar 10% FBS, penicilīnu (100 U/ml) un streptomicīnu

(100 μg/ml). Šūnas tika kultivētas inkubatorā (Sanyo MCO-175) 37°C ar 5% CO2 padevi.

Subkultivēšana tika veikta 2–3 reizes nedēļā, šūnas tripsinizējot ar 0,025% tripsīna šķīdumu

PBS (Life Technologies, ASV).

2.2. Metodes

Pētījumā tika pielietota kompleksa metodoloģiskā pieeja. Metodes un to izmantošanas

kārtība apkopota zemāk.

CM sedimentācijas profila noteikšana:

• CM sedimentācija šūnu kultūru barotnē statiskajā un laika-fāzes variējošā

magnētiskajā laukā;

• mikroskopēšana ar fotoattēlu iegūšanu.

LacZ un ECFP-ERp29 pDNS iegūšana:

• pDNS transformēšana E. Coli un transformēto baktēriju kultivēšana;

• pDNS izdalīšana no E. Coli kultūras, izmantojot Plasmid Midi Kit;

• izdalītās pDNS koncentrācijas noteikšana.

Optimizācija

Optimālās pDNS:LIP un pDNS:LIP:CM attiecības noteikšana:

• PC3 un HEPG2 šūnu transfekcija statiskajā un laika-fāzes variējošā magnētiskajā

laukā, izmantojot dažādu LacZpDNS:LIP un LacZpDNS:LIP:CM

daudzumu/savstarpējo attiecību;

• transficēto šūnu krāsošana, izmantojot β-Gal Staining Kit;

• mikroskopēšana ar fotoattēlu iegūšanu;

• transfekcijas efektivitātes/citotoksiskā efekta novērtēšana.

37

Optimālā ekspozīcijas ilguma noteikšana:

• PC3 un HEPG2 šūnu transfekcija ar 2,5; 5; 10; 20 min ekspozīciju statiskajā un laika-

fāzes variējošā magnētiskajā laukā, izmantojot optimālu LacZpDNS:LIP:CM;



• šūnu skaitīšana ImageJ programmā, transfekcijas efektivitātes aprēķini.

Optimālās magnētu apgriezienu frekvences noteikšana:

• PC3 un HEPG2 šūnu transfekcija laika-fāzes variējošā magnētiskajā laukā ar 5; 25;

50; 100 apgr./min frekvenci, izmantojot optimālu LacZpDNS:LIP:CM;




Optimālās magnētiskā lauka intensitātes noteikšana:

• PC3 šūnu transfekcija statiskajā un laika-fāzes variējošā magnētiskajā laukā ar

optimālu magnetofekcijas ilgumu un magnētu apgriezienu frekvenci, izmantojot

optimālu LacZpDNS:LIP:CM;




Dažādu transfekcijas metožu efektivitātes noteikšana

LacZpDNS:LIP:CM piegādes efektivitātes noteikšana:

• PC3 un HEPG2 šūnu transfekcija ar L, LM un LM LFV metodēm;




ECFP-ERp29pDNS:LIP:CM piegādes efektivitātes noteikšana:

• PC3 un HEPG2 šūnu transfekcija ar L, LM un LM LFV metodēm;

• transficēto šūnu analīze ar Western blota metodi;

•densitometrijas analīze programmā Image Reader LAS-1000.

LacZpDNS:LIP:CM:siRNS piegādes efektivitātes noteikšana:

• PC3 šūnu transfekcija ar L/L siRNS, LM/LM siRNS un LM LFV/LM LFV siRNS

metodēm;




Citotoksiskā efekta noteikšana

LacZpDNS:LIP:CM piegādes izraisītās citotoksicitātes noteikšana:

• PC3 šūnu transfekcija ar L, LM un LM LFV metodēm;

• transficēto šūnu krāsošana, izmantojot AO/EB metodi;


• šūnu skaitīšana ImageJ programmā, nedzīvo šūnu īpatsvara aprēķini.

38

Dzelzs satura noteikšana šūnās

Internalizētās Fe2+ noteikšana pēc šūnu skaita:

• PC3 šūnu magnētiskā iezīmēšana ar CM statiskajā un laika-fāzes variējošā


• iezīmēto šūnu krāsošana, izmantojot PB metodi;


• šūnu skaitīšana ImageJ programmā.

Internalizētās Fe2+ noteikšana pēc daudzuma/šūnā:

• PC3 šūnu magnētiskā iezīmēšana ar CM statiskajā un laika-fāzes variējošā


• iezīmēto šūnu spektrofotometriska analīze;

• dzelzs daudzuma aprēķini.

2.2.1. SPION sedimentācijas profila noteikšana

Lai analizētu magnētisko nanodaļiņu sedimentāciju šķīdumā, dažādu magnētisko lauku

ietekmē, 30 μg CombiMag (CM) magnētisko nanodaļiņu (Chemicell, Vācija) tika samaisīti ar

470 μl Opti-MEM šūnu kultūru barotni. Iegūtais maisījums pa pilienam tika pārnests 24 iedaļu

šūnu kultūru platē un inkubēts uz MagnetoFACTOR (Chemicell, Vācija) magnētu sistēmas

(statiskais magnētiskais lauks, 0,35 T) vai uz DynaFECTOR rotējošās magnētu sistēmas

platformas 5 min. Pēc inkubācijas CM izkliede tika analizēta, izmantojot gaismas

mikroskopijas metodi (Nikon Eclipse 80i) 400X kopējā palielinājumā, un iegūti digitāli

fotoattēli ar Nikon kameru.

2.2.2. Plazmīdu DNS iegūšana

Lai novērtētu nukleīnskābju piegādes efektivitāti vēža šūnās gan pēc transficēto šūnu

skaita, gan kopējā proteīnu līmeņa, tika izmantotas divas dažādas plazmīdas –

pcDNA3.1™/His/LacZ (Life Technologies, ASV) un pECFP-ERp29 (Karolinska institūts,

Zviedrija). LacZ gēns kodē enzīmu β-galaktozidāzi, kas piedalās laktozes hidrolīzē līdz glikozei

un galaktozei. β-galaktozidāzes tests ir viena no efektīvākajām un biežāk pielietotajām

metodēm transficēto šūnu skaita noteikšanai, jo bioķīmiskas reakcijas rezultātā transficētās

šūnas dod raksturīgu zilu krāsojumu. pECFP-ERp29 tika izmantota, lai novērtētu transfekcijas

efektivitāti pēc kopējā proteīnu ekspresijas līmeņa.

Nukleīnskābju transformēšanai baktērijās tika izmantots kompetento E. Coli

bakteriālais celms XL1Blue (Promega, ASV), un baktēriju transformācija tika veikta pēc

aprobēta darba protokola. Kompetentās E. Coli šūnas (50 µl alikvota) tika atkausētas, ievietojot

39

ledū, un pēc atkausēšanas tām pievienoja 10 ng pDNS. Iegūtais maisījums tika inkubēts ledū 5

min, tad nekavējoties pārnests ūdens termostatā (LKB Bromma 2209 Multitemp) 42°C, kur

inkubēts vēl 1,5 min, pēc tam pārnests uz ledus un inkubēts 2 min. Pēc inkubācijas, transformēto

baktēriju maisījumam pievienoja 500 µl šķidrās LB barotnes un inkubēja Enviromental shaker

incubator ES-20/60 termostatā (40 min; 200 apgr./min). Pēc inkubācijas, 50 µl transformēto

baktēriju maisījuma pārnesa uz Petri plates ar agarizētu LB barotni ar 100 µg/ml ampicilīna

(LacZpDNS) vai 25µg/ml kanamicīna (ECFP-ERp29pDNS) un inkubēja termostatā 37°C

naktskultūrā. Nākamajā dienā transformētās šūnas tika izsētas šķidrajā LB barotnē ar

ampicilīnu (100 µg/ml) (LacZpDNS) vai kanamicīnu (25µg/ml) (ECFP-ERp29pDNS) un

kultivētas optimālos apstākļos (37ºC, 200 apgr./min) Enviromental shaker incubator ES-20/60

termostatā naktskultūrā. pDNS tika izdalīta, izmantojot Plasmid Midi Kit (Qiagen, Vācija), pēc

ražotāja izstrādāta protokola. Izdalītās pDNS koncentrācija (pie 260 nm) un kvalitāte (260/280

≤ 1,8) tika noteikta, izmantojot NanoDrop 1000 spektrofotometru, pēc ražotāja

rekomendācijām.

2.2.3. Transfekcija ar plazmīdu DNS un siRNS

Šūnu transficēšana statiskajā magnētiskajā laukā un laika-fāzes variējošā magnētiskajā

laukā tika veikta, izmantojot kompleksu liposomālās magnetofekcijas metodi. Liposomālā

komponente nodrošina papildus pDNS aizsardzību un labāku piesaisti šūnas membrānai

(2.1. att.).

2.1. attēls. SPION-nukleīnskābes-liposomālās komponentes savienojumu veidošanās princips

(Adaptēts no Tiwari et al., 2015)

Salīdzinājumam tika veikti eksperimenti izmantojot arī lipofekcijas metodi (L), lai

pārliecinātos par magnētiskā lauka efektu. Eksperimentālajā darbā tika izmantoti sertificēti

40

transfekcijas reaģenti. Lipofectamine2000 (LIP) transfekcijas reaģents (Life Technologies,

ASV) ir aprobēts pielietošanai dažādās adherentās un atsevišķās suspensiju šūnu līnijās, t.sk.

RNS interferences pētījumos. CM superparamagnētiskās nanodaļiņas ir piemērotas

transficēšanai, izmantojot lipīdus, un ir aprobētas pielietošanai PC3 un HEPG2 šūnu līnijās.

Ko-transfekcijai ar siRNS tika izmantota siRNS pret β-galaktozidāzi Stealth™ RNAi LacZ

Reporter Control (Life Technologies, ASV).

Optimālu reakcijas apstākļu noteikšana ir būtisks faktors augstāku transfekcijas

efektivitātes rādītāju sasniegšanai. Tāpēc vispirms eksperimentāli pēc titrēšanas principa tika

veikta reakcijas apstākļu optimizācija, un noteikta pDNS-LIP un pēc tam attiecīgi pDNS-LIP-

CM savstarpējā optimālā attiecība, ņemot vērā ražotāju rekomendācijas (2.1. tabula).

2.1. tabula

pDNS-LIP un pDNS-LIP-CM savstarpējā attiecība optimizācijas eksperimentos

pDNS (µg) LIP (µl) pDNS (µg): LIP (µl) CM (µl)

0,5 0,5 1:1 0,5

1 1 1:2 0,5

2 2 1:3 0,5

3 3 1: 1 1

4 4 1:2 1

0,5 1 1: 3 1

1 2 1:1 2

2 4 1:2 2

3 6 1:3 2

0,5 1,5

1 3

2 6

pDNS-LIP-CM savstarpējā optimālā attiecība tika noteikta, izmantojot 10 min

ekspozīciju magnētiskajā laukā (ražotāja rekomendācija: 10–20 min).

Testējot 5 nM, 20 nM, 50 nM un 100 nM siRNS, tika noteikta arī siRNS koncentrācija,

pie kuras tiek panākts visaugstākais inhibējošais efekts.

Dienu pirms transfekcijas ar pDNS šūnas tika izsētas 24 iedaļu platēs: 1,8 × 105

šūnas/iedaļā PC3 šūnas un 1,5 × 105 šūnas/iedaļā HEPG2 šūnas, lai transfekcijas dienā

sasniegtu ~ 80% konfluenci.

Ko-transfekcijas eksperimentiem ar siRNS PC3 šūnas tika izsētas tāpat kā aprakstā

transfekcijai ar pDNS.

Visiem eksperimentiem paraugi tika sagatavoti triplikātā atbilstoši vadlīnijām.

41

Lipofekcija ar pDNS

Pirms transfekcijas šūnu kultūru barotne tika nomainīta ar 400 µl Opti-MEM barotnes

bez piedevām. Tika sagatavots pDNS šķīdums Opti-MEM ar kopējo daudzumu 50 µl. Tika

sagatavots LIP reaģenta šķīdums Opti-MEM ar kopējo daudzumu 50 µl šķīduma un, pirms

sajaukšanas ar citām komponentēm, inkubēts istabas t° 5 min. Sagatavotais pDNS šķīdums tika

pievienots LIP reaģenta šķīdumam un viegli samaisīts 2–3 reizes, lēni pipetējot. Maisījumu

inkubēja istabas t° 25 min un pēc tam pa pilienam pārnesa uz šūnām platē. Kontrolei tika

izmantots LIP reaģenta šķīdums Opti-MEM ar kopējo daudzumu 50 µl šķīduma. Šūnas kultivēja

CO2 inkubatorā 24 stundas.

Ko-lipofekcija ar siRNS

Pirms transfekcijas šūnu kultūru barotne tika nomainīta ar 400 µl Opti-MEM barotnes

bez piedevām. Tika sagatavots pDNS šķīdums Opti-MEM ar kopējo daudzumu 50 µl. Tika

sagatavots siRNS šķīdums Opti-MEM ar kopējo daudzumu 50 µl. Tika sagatavots LIP reaģenta

šķīdums Opti-MEM ar kopējo daudzumu 50 µl šķīduma un, pirms sajaukšanas ar citām

komponentēm, inkubēts istabas t° 5 min. Sagatavotais siRNS šķīdums tika pievienots pDNS

šķīdumam, pēc tam LIP reaģenta šķīdumam un viegli samaisīts 2–3 reizes, lēni pipetējot.

Maisījumu inkubēja istabas t° 25 min un pēc tam pa pilienam pārnesa uz šūnām platē. Kontrolei

tika izmantots LIP reaģenta šķīdums Opti-MEM ar kopējo daudzumu 50 µl šķīduma un siRNS

šķīdums Opti-MEM ar kopējo daudzumu 50 µl. Šūnas kultivēja CO2 inkubatorā 48 stundas.

Liposomālā magnetofekcija ar pDNS

Pirms transfekcijas šūnu kultūru barotne tika nomainīta ar 350 Opti-MEM barotnes bez

piedevām. Tika sagatavots pDNS šķīdums Opti-MEM ar kopējo daudzumu 50 µl. Tika

sagatavots LIP reaģenta šķīdums Opti-MEM ar kopējo daudzumu 50 µl šķīduma un, pirms

sajaukšanas ar citām komponentēm, inkubēts istabas t° 5 min. CM pirms lietošanas tika

vorteksētas 2–3 sekundes, un sagatavots magnētisko nanodaļiņu šķīdums Opti-MEM ar kopējo

daudzumu 50 µl šķīduma. Sagatavotais pDNS šķīdums tika pievienots LIP reaģenta šķīdumam

un viegli samaisīts 2–3 reizes, lēni pipetējot. pDNS-LIP šķīdumam pievienoja CM šķīdumu, 2–

3 reizes lēni pipetējot, un inkubēja istabas t° 25 min. Maisījums pa pilienam tika pārnests uz

šūnām platē. Šūnas tika inkubētas uz MagnetoFACTOR (Chemicell, Vācija) magnētu sistēmas

(statiskais magnētiskais lauks) un uz DynaFECTOR rotējošu magnētu sistēmas platformas.

42

Kontrolei tika izmantots CM reaģenta šķīdums Opti-MEM ar kopējo daudzumu 50 µl šķīduma.

Pēc inkubācijas šūnas kultivēja CO2 inkubatorā 24 stundas.

Liposomālās magnetofekcijas optimizācija

Lai noteiktu optimālo ekspozīcijas laiku magnētiskajā laukā, tika veikta liposomālā

magnetofekcija statiskajā magnētiskajā laukā (LM) un liposomālā magnetofekcija laika-fāzes

variējošā magnētiskajā laukā (LM LFV) ar ekspozīciju 2,5, 5, 10 un 20 min. Izvēloties

ekspozīcijas ilgumu, pirmkārt tika ņemtas vērā ražotāja rekomendācijas attiecībā uz ieteicamo

magnetofekcijas laiku, izmantojot CM reaģentu: 5–20 min. Ekspozīcijas ilgums 2,5 min tika

izvēlēts, lai pārliecinātos vai nepastāv atšķirības reakcijas kinētikā starp LM un LM LFV.

Lai noteiktu optimālo magnētu apgriezienu frekvenci, tika veikta LM LFV ar magnētu

apgriezienu frekvenci 5, 25, 50 un 100 apgr./min optimālajā ekspozīcijas laikā.

Lai noteiktu optimālo magnētiskā lauka intensitāti, tika veikta LM un LM LFV

optimālos ekspozīcijas ilguma un attiecīgi magnētu apgriezienu frekvences apstākļos, variējot

magnētiskā lauka intensitāti 0,1 T, 0,2 T un 0,35 T robežās. Tas tika nodrošināts palielinot

attālumu starp magnētiem un šūnu kultūras plati, starp tām novietojot magnētiski inertas

plāksnītes (6 un 9 mm).

Liposomālā ko-magnetofekcija ar siRNS

Lai sasniegtu visaugstāko inhibējošo efektu tika testēts 5 nM, 20 nM, 50 nM un

100 nM siRNS. Pirms transfekcijas šūnu kultūru barotne tika nomainīta ar 300 µl Opti-MEM

barotnes bez piedevām. Tika sagatavots pDNS šķīdums Opti-MEM ar kopējo daudzumu

50 µl. Tika sagatavots siRNS šķīdums Opti-MEM ar kopējo daudzumu 50 µl. Tika sagatavots

LIP reaģenta šķīdums Opti-MEM ar kopējo daudzumu 50 µl šķīduma un, pirms sajaukšanas ar

citām komponentēm, inkubēts istabas t° 5 min. CM pirms lietošanas tika vorteksētas

2–3 sekundes un sagatavots magnētisko nanodaļiņu šķīdums Opti-MEM ar kopējo daudzumu

50 µl šķīduma. Sagatavotais siRNS šķīdums tika pievienots pDNS šķīdumam, pēc tam LIP

reaģenta šķīdumam un viegli samaisīts 2–3 reizes lēni pipetējot. pDNS-siRNS-LIP šķīdumam

pievienoja CM šķīdumu, lēni pipetējot 2–3 reizes, un inkubēja istabas t° 25 min. Maisījums pa

pilienam tika pārnests uz šūnām platē. Šūnas tika inkubētas uz MagnetoFACTOR (Chemicell,

Vācija) magnētu sistēmas (statiskais magnētiskais lauks) un uz DynaFECTOR rotējošās

magnētu sistēmas. Kontrolei tika izmantots CM reaģenta šķīdums Opti-MEM ar kopējo

43

daudzumu 50 µl šķīduma un siRNS šķīdums Opti-MEM ar kopējo daudzumu 50 µl. Pēc

inkubācijas šūnas kultivēja CO2 inkubatorā 48 stundas.

2.2.4. Transgēna ekspresijas detekcija un analīze

LacZ gēna ekspresija tika noteikta, izmantojot β-Gal Staining Kit (Life Technologies,

ASV) reaktīvu komplektu, pēc ražotāja protokola. Atkrāsotās šūnas tika analizētas gaismas

mikroskopā (Leitz Labovert FS) 200X kopējā palielinājumā un iegūti to digitāli fotoattēli no 5–

10 nejauši izvēlētiem laukumiem, izmantojot fotokameru Sony DSC W-115. Šūnu skaitīšana,

izmantojot fotoattēlus, tika veikta datorprogrammā Image J (NIH, ASV). Transfekcijas

efektivitāte tika aprēķināta pēc sekojošas formulas:

Transfekcijas efektivitāte % = (kopējais zili iekrāsoto šūnu skaits/visu šūnu skaits)

× 100

ECFP-ERp29 detekcijai tika izmantota Western (imuno) blota metode, pēc aprobēta

darba protokola. Transficētās šūnas tika mazgātas ar 1 ml PBS 3 reizes un lizētas ar 200 µl 1%

Triton X-100 šķīdumu PBS, inkubējot ledū uz kratītāja (Elmi Shaker DOS-20L) 15 min. Pēc

inkubācijas lizētās šūnas tika savāktas, centrifugētas (+4°C, 15 min, ≥ 15 000 g) un supernatants

tika izmantots proteīnu koncentrācijas noteikšanai.

Proteīnu koncentrācijas noteikšana

Proteīnu koncentrācija tika noteikta pēc Lowry metodes ar spektrofotometru (Eppendorf

BioPhotometer). Tika sagatavots Lowry A [20 g Na2CO3, 4 g NaOH, destilēts H2O līdz 1 litram]

un Lowry B šķīdums [1,63 g CuSO4 x 5H2O, 7,68 g K-Na tartrāts, destilēts H2O līdz 250 ml,

250 ml 0.2 M NaOH] attiecībā 50:1. Viena parauga apstrādei tika izmantots 1,9 ml gatavā

šķīduma, kas sajaukts ar 100 µl supernatanta, un iegūtais maisījums tika inkubēts istabas t° 20

min. Pēc inkubācijas maisījumam pievienoja 100 µl Folin reaģenta [Folin Ciocalteaus Reagent

un destilēts H2O attiecībā 1:1] un inkubēja istabas t° vēl 10 min. Maisījumu centrifugēja (5 min,

5000 g) un 1 ml supernatanta izmantoja proteīnu koncentrācijas noteikšanai spektrofotometrā,

aktivizējot mērījumu programmu “Lowry”.

44

Paraugu sagatavošana proteīnu elektroforēzei

Vienai reakcijai tika izmantots 20µg proteīna un katrs paraugs tika sagatavots 30 µl

daudzumā: proteīnu šķīdums tika atšķaidīts ar destilētu ūdeni līdz kopējam daudzumam 15 µl,

tad sajaukts ar 15 µl 2X Loading buffer [100 mM Tris-HCI (pH 6,8), 200 mM DTT, 4% SDS,

0,2% BPB, 20% glicerīnsC3H8O3]. Iegūto maisījumu denaturēja termostatā (Biokom Termo 24–

15) 90ºC 10 min.

Proteīnu sadalīšana gelā

Proteīnu sadalīšanai tika izmantota SDS PAGE elektroforēzes metode 10%

poliakrilamīda gelā, kura sastāvs norādīts 2.2. tabulā.

2.2. tabula

Poliakrilamīda gela sastāvs

Sadalošais gels Koncentrējošais gels

H2O destilēts 3,15 ml H2O destilēts 4,2 ml

30% C3H5NO šķīdums 2,5 ml 30% C3H5NO šķīdums 650 µl

4X Tris – SDS šķīdums, pH 8.8 1,87 ml 4X Tris – SDS šķīdums, pH 6,8 1,6 ml

10% (NH4)2S2O8 75 µl 10% (NH4)2S2O8 67 µl

TEMED 7,5 µl TEMED 6,7 µl

Elektroforēzes kamera tika pildīta ar 1X Run Buffer [0,192 mM C2H5NO2, 0,25 mM

Tris-HCI (pH 8,3) un 0,1% SDS] un aktivizēts režīms 200 V, 1 stunda.

Proteīnu pārnese

Pēc elektroforēzes proteīni no gela tika pārnesti uz PVDF membrānu, izmantojot iekārtu

proteīnu pārnesei no gela. Kamera tika piepildīta ar 1X Transfer Buffer [0,192 mM C2H5NO2,

0,25 mM Tris-HCI un 10% metanola] un aktivizēts režīms 100 V, 1 stunda.

Bloķēšana un imunodetekcija

Pēc pārneses membrāna tika inkubēta 5% piena šķīdumā TBS-TWEEN Buffer

[50 mM Tris-HCI pH 7,5, 150 mM NaCI un 0,1% Tween 20] uz kratītāja (65 apgr./min,

1 stunda), pēc inkubācijas izžāvēta uz filtrpapīra. Imunodetekcijai tika izmantotas antiERP

Rabbit primārās un anti Rabbit sekundārās antivielas. β aktīna ekspresija tika izmantota kā

ielādes kontrole un attiecīgi β aktīna imunodetekcijai tika izmantotas antiβactin Mouse

45

primārās un anti Mouse sekundārās antivielas. Membrāna tika inkubēta 3 ml primāro antivielu

5% piena šķīdumā (1 : 1000) rotējošā maisītājā (Elmi Intelli-Mixer RM-2M) 1 stundu. Pēc

inkubācijas membrānu atmazgāja 3 reizes ar 5 ml 1X TBS-TWEEN Buffer, inkubējot uz rotējošā

maisītāja 5 min. Pēc tam atmazgāto membrānu inkubēja 3 ml sekundāro antivielu

5% piena šķīdumā (1 : 1000) rotējošā maisītājā 1 stundu. Pēc inkubācijas membrānu atmazgāja

3 reizes ar 5 ml 1X TBS-TWEEN Buffer, inkubējot uz rotējošā maisītāja 5 min.

Vizualizācija un analīze

Membrāna tika pilnībā izžāvēta uz filtrpapīra un attīstīta uz Kodak Bio Max filmas

(Carestream Health, ASV), izmantojot ECL Prime Western Blotting Detection Reagent

detekcijas reaģentu (GE Healthcare, Lielbritānija), atbilstoši ražotāja rekomendācijām. Iegūtie

attēli tika skanēti (Canon PIXMA MG2550) un proteīnu ekspresijas līmenis tika noteikts ar

densitometrijas metodi, izmantojot Fujifilm Luminescent Image Analyzer LAS 1000 attēlu

apstrādes programmatūru Image Reader LAS-1000.

2.2.5. Citotoksicitātes noteikšana

Citotoksicitāte tika noteikta, izmantojot akridīna oranža/etīdija bromīda (AO/EB)

atkrāsošanas metodi, pēc Ribble un līdzautoru apraksta. Šī metode tika izvēlēta, jo ir minimāli

invazīva – nav nepieciešams atdalīt šūnas no virsmas, centrifugēt vai fiksēt, kas būtiski

samazina bojājumu risku un līdz ar to iespējams iegūt precīzāku rezultātu. Pielietojot AO/EB

metodi, iespējams vienlaicīgi diferencēt dzīvas un nekrotiskas šūnas pēc raksturīga un labi

izšķirama krāsojuma.

Citotoksicitātes noteikšanai dienu pirms transfekcijas šūnas tika izsētas uz segstikliņiem

24 iedaļu platē 1,8 x 105 šūnas/iedaļā, lai nākamajā dienā sasniegtu ~ 80% konfluenci. Tika

veikta LM LFV, LM un LIP optimālos reakcijas apstākļos, izmantojot LacZpDNS un šūnas

kultivētas CO2 inkubatorā 24 stundas. Pēc tam šūnas tika atmazgātas ar 1 ml ledusauksta PBS

un tām pievienoja 30 µl PBS ar EB/AO maisījumu (10 µg/ml katra krāsa). Atkrāsotās šūnas

(zaļš krāsojums – dzīvas; dzeltens/oranžs/sarkans – apoptotiskas vai mirušas) tika analizētas ar

fluorescences mikroskopu Nikon Eclipse 80i 200X kopējā palielinājumā, izmantojot Nikon B2-

A emisijas filtru. Ar Nikon kameru tika iegūti digitāli fotoattēli no 5–10 nejauši izvēlētiem

laukumiem. Šūnu skaitīšana, izmantojot iegūtos fotoattēlus, tika veikta datorprogrammā Image

J (NIH, ASV), katrā paraugā uzskaitot vismaz 100 šūnas.

46

2.2.6. Dzelzs satura noteikšana šūnās

Lai pārliecinātos, ka gēnu ekspresijas izmaiņas izraisa šūnās ieslēgto magnētisko

kompleksu daudzums, tika veikta šūnu magnētiskā iezīmēšana ar CM un noteikts dzelzs saturs

šūnās. Dienu pirms magnētiskās iezīmēšanas PC3 šūnas tika izsētas 24 iedaļu platēs

1,8 × 105 šūnas/iedaļā, lai nākamajā dienā sasniegtu ~ 80% konfluenci.

Šūnu magnētiskā iezīmēšana

Šūnu kultūru barotne tika nomainīta ar 400 µl Opti-MEM barotnes bez piedevām. CM

tika vorteksētas 30 s un 10 µg izšķīdināja Opti-MEM barotnē līdz kopējam daudzumam

100 µl. Maisījums pa pilienam tika pārnests uz šūnām platē un šūnas inkubētas optimālos

apstākļos uz MagnetoFACTOR magnētu sistēmas vai uz DynaFECTOR platformas. Pēc

inkubācijas šūnas tika kultivētas CO2 inkubatorā 24 stundas. Dzelzi saturošu šūnu skaits tika

noteikts, izmantojot Prussian blue (PB) krāsošanas metodi, bet dzelzs daudzums šūnās tika

noteikts spektrofotometriski.

Krāsošana pēc Prussian blue metodes

Šūnas tika mazgātas ar 1 ml PBS 3 reizes un fiksētas ar 1 ml FIX reaktīvu [0,05%

glutaraldehīda šķīdums PBS] istabas t° 15 min. Fiksētās šūnas tika mazgātas ar 1 ml PBS

3 reizes. Tika sagatavots 500 µl 2,3% HCl un 2% K3Fe(CN)6 šķīdums attiecībā 1:1, kuru

pievienoja šūnām un inkubēja istabas t° 30 min. Pēc inkubācijas šūnas tika mazgātas ar 1 ml

destilētu ūdeni 3 reizes. Dzelzi saturošas atkrāsotās šūnas (gaiši zils krāsojums) tika analizētas

gaismas mikroskopā (Leitz Labovert FS) ar kopējo palielinājumu 200X un, izmantojot

fotokameru Sony DSC W-115, tika iegūti to digitāli fotoattēli no 5–10 nejauši izvēlētiem

laukumiem. Šūnu skaitīšana, izmantojot fotoattēlus, tika veikta datorprogrammā Image J (NIH,

ASV).

Spektrofotometriskā analīze

Magnētiski iezīmēto šūnu spektrofotometriskai analīzei tika izmantota uz

1,10–fenontralīna (1,10–C12H8N2) bāzēta metode. 1,10–C12H8N2 saistās ar Fe2+, veidojot

kompleksu jonu oranžsarkanā krāsā ar raksturīgu UV absorbciju pie 510 nm.

47

Šūnas tika mazgātas ar 1 ml PBS 1 reizi un atdalītas no virsmas ar 200 µl DPBS ar

1 mM EDTA. Atdalītās šūnas tika savāktas stobriņos, centrifugētas (5 min; 1000 apgr./min) un

mazgātas ar 1 ml PBS, procedūru atkārtojot 2 reizes. No katra parauga tika paņemta 20 µl

alikvota šūnu skaita noteikšanai ar hemocitometru. Iegūtā šūnu nogulsne tika šķīdināta 200 µl

skābju šķīduma [3M HCl un 0,6M C2HCl3O2] un inkubēta uz nakti 65°C, lai no CM izdalītu

Fe2+ un Fe3+ jonus. Nākamajā dienā 100 µl no sagatavotā šķīduma tika pievienots 40 μl

10% ONH3·HCl šķīduma (reducē Fe3+ uz Fe2+), 200 μl C2H7NO2 buferšķīduma

[25g C2H7NO2 un 70 ml ledus etiķskābes maisījums uzpildīts ar dejonizētu ūdeni līdz 100 ml

tilpumam] un 100 μl 0.2% 1,10–C12H8N2 šķīduma. Maisījums tika inkubēts istabas t° 10 min.

Absorbcija tika mērīta pie 510 nm, izmantojot Evolution 60S spektrofotometru. Iekššūnu dzelzs

saturs tika kvantificēts attiecībā pret standartlīkni (standartlīknei izmantoti dzelzs hlorīda

paraugi ar dzelzs saturu 1,25–10 μg/ml). Dzelzs daudzums šūnās tika izteikts kā vidējais

daudzums pg /šūnā, aprēķinot pret kopējo šūnu skaitu plates iedaļā.

1.2.7. Datu statistiskā analīze

Katram eksperimentam tika veikti vismaz trīs secīgi atkārtojumi atbilstoši vadlīnijām.

Dati tika izteikti kā vidējās vērtības ± SN (standartnovirze). Datu statistiskā analīze tika veikta

programmā SPSS 15.0 for Windows (SPSS Inc., ASV). Vispirms tika noteikta paraugkopu

atbilstība normālsadalījumam, izmantojot Shapiro-Wilk testu, pēc kura rezultātiem tika

izvēlētas datu analīzes metodes. Kvantitatīvo datu atšķirība starp divām grupām tika noteikta,

izmantojot Stjūdenta t-testu, bet starp trim un vairāk grupām – vienfaktora dispersiju analīzi

(One-way ANOVA) ar sekojošu Tukey testu, kas paredzēts vienāda lieluma paraugkopu

salīdzināšanai. P vērtība < 0,05 tika uzskatīta par statistiski nozīmīgu.

48

3. REZULTĀTI

3.1. Laika-fāzes variējoša magnētiskā lauka ietekme uz SPION sedimentāciju

Datormodelēšanas rezultāti parādīja, ka rotējošas magnētu sistēmas ģenerēta

magnētiskā lauka ietekmē notiek SPION kustība kā aksiālā tā laterālā virzienā, tā veicinot

SPION vienmērīgāku izkliedi un veidojot raksturīgu sedimentēto SPION ainu uz virsmas. Lai

eksperimentāli pārliecinātos vai pastāv atšķirības SPION sedimentācijā statiskajā magnētiskajā

laukā un laika-fāzes variējošā magnētiskajā laukā, tika veikta CM sedimentācija uz šūnu

kultūras plates iedaļas virsmas reālajiem transfekcijas apstākļiem raksturīgā vidē, respektīvi,

Opti-MEM šūnu kultūru barotnē. Iegūtie rezultāti parāda krasas atšķirības SPION

sedimentācijas profilā statiskajā un laika-fāzes variējošā magnētiskajā laukā (3.1. att.).

3.1. attēls. SPION sedimentācijas profila salīdzinošā analīze; SPION dispersijas raksturīgā aina

statiskajā magnētiskajā laukā (a) un laika-fāzes variējošā magnētiskajā laukā (b), × 400

Gadījumā, kad sedimentācija tika veikta statiskajā magnētiskajā laukā, SPION veidoja

izteiktu svītrveida rakstu (3.1. att. (a)). Laika-fāzes variējošā magnētiskajā laukā SPION

izvietojās vienmērīgāk (3.1. att. (b)), izteiktas formas struktūru veidošanās netika novērota.

Iegūtie rezultāti apstiprina pieņēmumu, ka aksiāli laterāla SPION kustība šķīdumā, ko izraisa

laika-fāzes variējoša magnētiskā lauka iedarbība, noved pie vienmērīgāka SPION izvietojuma

uz šūnu kultūras plates iedaļas virsmas.

3.2. Laika-fāzes variējoša magnētiskā lauka ietekme uz gēnu piegādi vēža šūnās

3.2.1. LM LFV – reakcijas optimālie apstākļi

Optimizācijas rezultātā tika konstatēts, ka visaugstākos transfekcijas efektivitātes

rādītājus ar minimālu citotoksisku efektu iespējams iegūt pie LacZpDNS:LIP:CM savstarpējās

49

attiecības 1:2:1 (3.2. att.). Liposomālā magnetofekcija ar LacZpDNS:LIP:CM savstarpējo

attiecību 1:1:0,5; 1:2:0,5; 1:1:1; 1:1:2 noved pie zemākas efektivitātes. Savukārt pie

LacZpDNS:LIP:CM attiecības 1:3:0,5; 1:3:1; 1:2:2; 1:3:2 tika konstatēts spēcīgs citotoksiskais

efekts (liels daudzums bojātu šūnu).

3.2. attēls. Transfekcijas efektivitātes izmaiņas un citotoksiskais efekts atkarībā no

LacZpDNS:LIP:CM savstarpējās attiecības (pēc β-galaktozidāzes ekspresijas PC3 šūnās laika-

fāzes variējošā magnētiskajā laukā), × 200

Visvairāk β-galaktozidāzi ekspresējošu šūnu, vienlaicīgi nenovērojot citotoksisku

efektu, statiskajā magnētiskajā laukā gan PC3, gan HEPG2 šūnās, iespējams iegūt pie

LacZpDNS:LIP:CM savstarpējās attiecības 1:2:1. Tāda pati LacZpDNS:LIP:CM savstarpējā

attiecība, attiecīgi 1:2:1 ļauj sasniegt maksimālo β-galaktozidāzi ekspresējošo šūnu skaitu,

vienlaicīgi nenovērojot citotoksisku efektu, arī laika-fāzes variējošā laukā gan PC3, gan HEPG2

šūnās.

Visvairāk β-galaktozidāzi ekspresējošu šūnu, vienlaicīgi nenovērojot citotoksisku

efektu gan PC3, gan HEPG2 šūnās, iespējams iegūt pie LacZpDNS:LIP savstarpējās attiecības

1:2.

Maksimālais siRNS inhibējošais efekts pēc β-galaktozidāzi ekspresējošo šūnu skaita

tika sasniegts izmantojot 50 nM siRNS pret β-galaktozidāzi.

Iegūtie dati tālāk tika izmantoti, lai noteiktu optimālos magnētiskā lauka parametrus –

ekspozīcijas ilgumu, magnētu apgriezienu frekvenci un magnētiskā lauka intensitāti.

Transfekcijas efektivitātes aprēķinu rezultātā iegūtie rādītāji ar LacZpDNS transficētās

PC3 un HEPG2 šūnās ar variablu ekspozīcijas ilgumu statiskajā un laika-fāzes variējošā

magnētiskajā laukā apkopoti 3.1. un 3.2. tabulā.

50

3.1. tabula

Transfekcijas efektivitāte (%) PC3 šūnu paraugos pēc 2,5; 5; 10 un 20 min ekspozīcijas


Eksp.

Nr.

Statiskais magn. lauks Laika-fāzes magn. lauks

2,5 min 5 min 10 min 20 min 2,5 min 5 min 10 min 20 min

1. 28,4 53,2 43,8 35,3 41,8 74,6 53,7 40,0

2. 33,5 59,0 51,2 42,9 43,6 77,3 57,9 45,8

3. 28,5 56,0 44,1 43,6 44,3 78,6 54,4 41,2

3.2. tabula

Transfekcijas efektivitāte (%) HEPG2 šūnu paraugos pēc 2,5; 5; 10 un 20 min ekspozīcijas


Eksp.

Nr.

Statiskais magn. lauks Laika-fāzes magn. lauks

2,5 min 5 min 10 min 20 min 2,5 min 5 min 10 min 20 min

1. 17,3 36,1 29,5 19,8 65,0 79,0 72,1 54,8

2. 17,3 35,2 31,0 18,2 59,9 84,7 68,2 51,1

3. 14,8 31,2 26,4 16,4 57,0 74,6 63,7 48,1

Visvairāk β-galaktozidāzi ekspresējošo PC3 un HEPG2 šūnu tika konstatēts pie 5 min

ekspozīcijas statiskajā magnētiskajā laukā (3.3. att.). Palielinot ekspozīcijas ilgumu

magnētiskajā laukā, β-galaktozidāzi ekspresējošo PC3 un HEPG2 šūnu skaits samazinājās, lai

gan 5 min un 10 min ekspozīcijas rezultāti ir līdzvērtīgi, īpaši HEPG2 šūnās (3.3. att. (b)).

Optimālais ekspozīcijas ilgums statiskajā magnētiskajā laukā – 5 min tika izmantots

turpmākajos eksperimentos.

51

3.3. attēls. Transfekcijas efektivitāte PC3 šūnās (a) un HEPG2 šūnās (b) pēc β-galaktozidāzi

ekspresējošo šūnu skaita ar variablu ekspozīcijas ilgumu statiskajā magnētiskajā laukā (n = 3)

3.4. attēls. Transfekcijas efektivitāte PC3 šūnās (a) un HEPG2 šūnās (b) pēc β-galaktozidāzi

ekspresējošo šūnu skaita ar variablu ekspozīcijas ilgumu laika-fāzes variējošā magnētiskajā

laukā (n = 3)

Analogs rezultāts tika iegūts nosakot optimālo ekspozīcijas ilgumu laika-fāzes variējošā

magnētiskajā laukā. Visvairāk β-galaktozidāzi ekspresējošo PC3 un HEPG2 šūnu tika

konstatēts pie 5 min ekspozīcijas magnētiskajā laukā (3.4. att.). Līdzīgi kā statiskā magnētiskā

lauka gadījumā, palielinot ekspozīcijas ilgumu > 5 min, tika novērota stabila transfekcijas

efektivitātes samazināšanās gan PC3, gan HEPG2 šūnās.

Turpmākajos eksperimentos tika pārbaudīta laika-fāzes variējoša magnētiskā lauka

30,1 ±

2,9

56,1 ±

2,946,4 ±

4,2 40,6 ±

4,6

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

2.5 5 10 20

Tr

an

sfe

kc

ija

s e

fek

tiv

itā

te (

%)

Laiks (min)

16,5 ±

1,4

34,2 ±

2,6 29,0 ±

2,318,1 ±

1,7

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

2.5 5 10 20

Tr

an

sfe

kc

ija

s e

fek

tiv

itā

te (

%)

Laiks (min)

43,2 ±

1,3

76,8 ±

2,0

55,3 ±

2,342,3 ±

3,1

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

2.5 5 10 20

Tr

an

sfe

kc

ija

se

fek

tiv

itā

te(%

)

Laiks (min)

60,6 ±

4,1

79,4 ±

5,168,0 ±

4,2

51,3 ±

3,4

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

2.5 5 10 20

Tr

an

sfe

kc

ija

s e

fek

tiv

itā

te (

%)

Laiks (min)

b a

b a

52

raksturojošo parametru – magnētu apgriezienu frekvences un magnētiskā lauka gradienta

ietekme uz LacZ gēna ekspresiju.


PC3 šūnās pie variablas magnētu apgriezienu frekvences laika-fāzes variējošā magnētiskajā

laukā apkopoti 3.3. tabulā.

3.3. tabula

Transfekcijas efektivitāte (%) PC3 šūnu paraugos pie 5; 25; 50 un 100 apgr./min magnētu

apgriezienu frekvences

Eksp. Nr. 5 apgr./min 25 apgr./min 50 apgr./min 100 apgr./min

1. 70,9 42,8 36,9 47,6

2. 72,4 44,0 39,9 50,8

3. 78,6 46,0 37,6 53,2

Analizējot transfekcijas efektivitāti pēc β-galaktozidāzi ekspresējošo šūnu skaita PC3

šūnās, pie dažādām rotējošas magnētu sistēmas magnētu apgriezienu frekvencēm, tika

konstatēts, ka visefektīvākā iedarbība ir 5 min ekspozīcijai laika-fāzes variējošā magnētiskajā

laukā ar 5 apgr./min frekvenci (3.5. att.). Palielinot magnētu apgriezienu frekvenci

(25 un 50 apgr./min), vērojams straujš transfekcijas efektivitātes kritums, bet pie

100 apgr./min transfekcijas efektivitāte atkal paaugstinās.

3.5. attēls. Transfekcijas efektivitāte PC3 šūnās pēc β-galaktozidāzi ekspresējošo šūnu skaita ar

variablu magnētu apgriezienu frekvenci pie 5 min ekspozīcijas laika-fāzes variējošā

magnētiskajā laukā (n = 3)


74,0 ± 4,1

44,3 ±1,638,1 ± 1,6

50,5 ± 2,8

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

5 25 50 100

Tr

an

sfe

kc

ija

s e

fek

tiv

itā

te (

%)

Frekvence (apgr./min)

53

HEPG2 šūnās ar variablu magnētu apgriezienu frekvenci laika-fāzes variējošā magnētiskajā

laukā parādīti 3.4. tabulā.

3.4. tabula

Transfekcijas efektivitāte (%) HEPG2 šūnu paraugos pie 5; 25; 50 un 100 apgr./min magnētu

apgriezienu frekvences

Eksp. Nr. 5 apgr./min 25 apgr./min 50 apgr./min 100 apgr./min

1. 41,1 52,0 77,4 74,4

2. 36,8 50,6 77,5 67,9

3. 35,3 45,5 69,4 66,0

HEPG2 šūnās augstākie LacZ piegādes efektivitātes rādītāji pēc β-galaktozidāzi

ekspresējošo šūnu skaita tika novēroti pie 50 apgr./min magnētu apgriezienu frekvences ar

5 min ekspozīciju magnētiskajā laukā (3.6. att.). Taču augsta transfekcijas efektivitāte

saglabājas arī pie magnētu apgriezienu frekvences 100 apgr./min.

3.6. attēls. Transfekcijas efektivitāte HEPG2 šūnās pēc β-galaktozidāzi ekspresējošo šūnu skaita

ar variablu magnētu apgriezienu frekvenci pie 5 min ekspozīcijas laika-fāzes variējošā

magnētiskajā laukā (n = 3)

Transfekcijas efektivitātes aprēķinu rezultātā iegūtie rādītāji ar LacZpDNS

transficētajās PC3 šūnās ar variablu magnētu magnētiskā lauka intensitāti statiskajā un

laika-fāzes variējošā magnētiskajā laukā apkopoti 3.5. tabulā.

37,6 ± 3,0

49,4 ± 3,4

74,8 ± 4,669,4 ± 4,4

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

5 25 50 100

Tra

nsf

ekci

jas

efek

tivit

āte

(%

)

Frekvence (apgr./min)

54

3.5. tabula

Transfekcijas efektivitāte (%) PC3 šūnu paraugos pie 0,35; 0,2 un 0,1 T magnētiskā lauka

intensitātes

Eksp. Nr. Statiskais magn. lauks Laika-fāzes magn. lauks

0,35 T 0,2 T 0,1 T 0,35 T 0,2 T 0,1 T

1. 49,3 25,8 8,8 72,9 54,0 42,6

2. 52,6 27,6 9,3 76,1 56,9 44,6

3. 50,5 31,7 12,4 78,2 58,4 39,2

Analizējot transfekcijas efektivitātes izmaiņas atkarībā magnētiskā lauka intensitātes,

visaugstākā LacZ ekspresija PC3 šūnās gan statiskajā, gan laika-fāzes variējošā magnētiskajā

laukā tika novērota pie maksimālās pielietotās magnētiskā lauka intensitātes 0,35 T (3.7. att.).

3.7. attēls. Transfekcijas efektivitāte PC3 šūnās pēc β-galaktozidāzi ekspresējošo šūnu skaita ar

optimālu magnētiskā lauka ekspozīcijas ilgumu/frekvenci un variablu magnētiskā lauka

intensitāti statiskajā magnētiskajā laukā (a) un laika-fāzes variējošā magnētiskajā laukā (b)

(n = 3)

Samazinot magnētiskā lauka intensitāti, abos gadījumos tika novērots stabils

transfekcijas efektivitātes kritums, taču redzams, ka statiskajā magnētiskajā laukā transfekcijas

efektivitātes samazinājums ir straujāks (3.7. att. (a)) nekā laika-fāzes variējošā magnētiskajā

laukā (3.7. att. (b)).

Iegūtie optimālos reakcijas apstākļus atspoguļojošie rādītāji pēc β-galaktozidāzi

ekspresējošo šūnu skaita tika izmantoti, lai novērtētu laika-fāzes variējoša magnētiskā lauka

ietekmi uz LacZ un ECFP-ERp29 ekspresiju PC3 un HEPG2 šūnās salīdzinājumā ar divām

50,8 ±

1,7

28,4 ±

3,0

10,2 ±

2,0

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0.35 0.2 0.1

Tr

an

sfe

kc

ija

s e

fek

tiv

itā

te (

%)

Intensitāte (T)

75,7 ±

2,7

56,4 ±

2,2

42,1 ±

2,7

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0.35 0.2 0.1

Tr

an

sfe

kc

ija

s e

fek

tiv

itā

te (

%)

Intensitāte (T)

b a

55

plaši pielietotām konvencionālajām gēnu piegādes metodēm – liposomālo magnetofekciju un

lipofekciju.

3.2.2. Laika-fāzes variējoša magnētiskā lauka ietekme uz nukleīnskābju piegādes

efektivitāti šūnās

Rezultāti, kas iegūti pēc PC3 šūnu transfekcijas ar LacZ saturoša gēna pDNS,

izmantojot dažādas gēnu piegādes metodes – lipofekciju, kad šūnas nav pakļautas magnētiskā

lauka iedarbībai, liposomālo magnetofekciju statiskajā magnētiskajā laukā un laika-fāzes

variējošā magnētiskajā laukā optimālos reakcijas apstākļos, apkopoti 3.6. tabulā.

3.6. tabula

Transfekcijas efektivitāte (%) ar dažādām metodēm transficētu PC3 šūnu paraugos

Eksp. Nr. L LM LM LFV

1. 33,9 50,9 74,9

2. 35,0 59,5 73,9

3. 35,4 58, 2 69,8

4. 40,0 58,0 78,3

5. 41,7 60,1 79,6

6. 41,2 60,8 79,0

7. 43,2 62,2 77,7

8. 44,4 61,0 78,6

9. 39,0 61,0 79,2

Tika konstatēts, ka LM LFV ietekmē būtiski paaugstinās LacZ gēna ekspresija

PC3 šūnās (p < 0,001) salīdzinājumā ar abām pārējām metodēm – L un LM. Pielietojot

LM LFV, iespējams sasniegt visaugstāko transfekcijas efektivitāti pēc β-galaktozidāzi

ekspresējošo šūnu skaita – 79,6% transficēto šūnu, kas ir par 21% vairāk, salīdzinot ar LM un

par 42% vairāk, salīdzinot ar L.

Turklāt tika novērots, ka ar LM LFV metodi transficētajās, atkrāsotajās PC3 šūnās

raksturīgā krāsojuma intensitāte ir augstāka, salīdzinot gan ar LM, gan L (3.8. att. (a)).

Tas netieši norāda, ka, pielietojot LM LFV, ne tikai paaugstinās β-galaktozidāzi ekspresējošo

šūnu skaits, bet arī pieaug β-galaktozidāzes ekspresijas līmenis transficētajās šūnās.

56

3.8. attēls. LacZ gēna piegāde PC3 šūnās, izmantojot trīs dažādas gēnu piegādes metodes:

(a) β-galaktozidāzes ekspresija PC3 šūnās (× 200), (b) transfekcijas efektivitāte pēc

β-galaktozidāzi ekspresējošo šūnu skaita (n = 9; * p 0,05, salīdzinot ar L un LM,

Tukey tests)

Līdzīgi rezultāti tika iegūti nosakot laika-fāzes variējoša magnētiskā lauka ietekmi uz

ECFP-ERp29pDNS piegādi PC3 šūnās. Relatīvā proteīnu daudzuma (densitometriskajās

vienībās), kas atspoguļo ECFP-ERp29 proteīnu ekspresijas līmeni novērtējuma rezultāti

apkopoti 3.7. tabulā.

3.7. tabula

Relatīvais proteīnu daudzums ar dažādām metodēm transficētu PC3 šūnu paraugos


1. 19864,8 30656,5 33907,7

2. 19616,5 30582,1 33873,7

3. 19328,5 29764,4 33930,4

4. 20443,0 29707,9 34264,0

5. 20056,3 30530,5 33496,0

6. 19971,7 30116,2 34066,8

7. 20251,3 30217,6 33823,9

39,3 ± 3,8

59,1 ± 3,4

76,8 ± 3,3*

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

L LM LM LFV

Tr

an

sfe

kc

ija

s e

fek

tiv

itā

te (

%)

Transficēšanas metode

b

a

57

3.7. tabulas turpinājums

Eksp.Nr. L LM LM LFV

8. 19809,9 30011,2 33609,2

9. 19649,5 30324,6 34395,0

Tika konstatēts, ka LM LFV pielietojums būtiski paaugstina arī ECFP-ERp29 piegādes

efektivitāti PC3 šūnās (p < 0,001) salīdzinājumā ar abām pārējām gēnu piegādes metodēm – L

un LM (3.9. att. (a)). LM LFV gadījumā kopējais ECFP-ERp29 ekspresijas līmenis ir par 6%

augstāks, salīdzinot ar LM un par 22% augstāks, salīdzinot ar L

(3.9. att. (b)).

3.9. attēls. ECFP-ERp29 gēna piegāde PC3 šūnās, izmantojot trīs dažādas gēnu piegādes

metodes: (a) ECFP-ERp29 ekspresija PC3 šūnās (Western blota analīze), (b) transfekcijas

efektivitāte pēc ECFP-ERp29 ekspresijas līmeņa (n = 9; * p 0,05, salīdzinot ar L un LM,

Tukey tests)

Rezultāti, kas iegūti transficējot HEPG2 šūnas ar LacZ saturoša gēna pDNS, izmantojot

dažādas gēnu piegādes metodes – lipofekciju, kad šūnas nav pakļautas magnētiskā lauka

19887,9 ±

340,1

28055,1 ±

345,1

31425,3 ±

285,6*

0

10000

20000

30000

40000

L LM LM LFV

De

nsit

om

etr

isk

ās v

ien

ība

s


b

a

58

iedarbībai, liposomālo magnetofekciju statiskajā magnētiskajā laukā un laika-fāzes variējošā

magnētiskajā laukā optimālos apstākļos, apkopoti 3.8. tabulā.

3.8. tabula

Transfekcijas efektivitāte (%) ar dažādām metodēm transficētu HEPG2 šūnu paraugos


1. 32,3 37,0 87,2

2. 30,0 37,2 86,1

3. 30,2 35,2 87,7

4. 28,7 33,9 79,6

5. 26,1 35,6 79,1

6. 24,5 34,1 75,4

7. 26,9 31,0 83,3

8. 26,1 30,3 80,0

9. 24,0 33,6 76,4

3.10. attēls. LacZ gēna piegāde HEPG2 šūnās, izmantojot trīs dažādas gēnu piegādes metodes:

(a) β-galaktozidāzes ekspresija HEPG2 šūnās (× 200), (b) transfekcijas efektivitāte pēc

β-galaktozidāzi ekspresējošo šūnu skaita (n = 9; * p 0,05, salīdzinot ar L un LM, Tukey tests)

27,6 ± 2,7

34,2 ± 2,3

81,6 ± 4,6*

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

L LM LM LFV

Tr

an

sfe

kc

ija

s e

fek

tiv

itā

te (

%)


b

a

59

Tika konstatēts, ka LM LFV ietekmē būtiski paaugstinās transfekcijas efektivitāte arī

HEPG2 šūnās (p < 0,001) salīdzinājumā ar abām pārējām metodēm – L un LM. Pielietojot LM

LFV, iespējams sasniegt visaugstāko transfekcijas efektivitāti pēc β-galaktozidāzi ekspresējošo

šūnu skaita – 87,7% transficētu šūnu, kas ir par 51% vairāk, salīdzinot ar LM un par 56% vairāk,

salīdzinot ar L. Kā redzams 3.10. attēlā (a), arī HEPG2 šūnās tika novērots, ka ar LM LFV

metodi transficētajās atkrāsotajās šūnās raksturīgā krāsojuma intensitāte ir ievērojami augstāka,

salīdzinot ar LM un L.

Relatīvā proteīnu daudzuma (densitometriskajās vienībās), kas norāda uz

ECFP-ERp29 proteīnu ekspresijas līmeni novērtējuma rezultāti apkopoti 3.9. tabulā.

3.9. tabula

Relatīvais proteīna daudzums ar dažādām metodēm transficētu HEPG2 šūnu paraugos


1. 22721,1 24645,4 30427,4

2. 22641,3 25117,6 31459,2

3. 22548,7 24926,8 30545,6

4. 23085,6 25310,5 30979,6

5. 22639,7 25024,2 30647,2

6. 22465,3 25204,5 30514,2

7. 22756,9 25204,6 30223,4

8. 22725,1 24918,0 30871,8

9. 22207,9 24629,6 30865,8

ECFP-ERp29 ekspresijas rādītāji HEPG2 šūnās atspoguļoti 3.11. attēlā.

Tika konstatēts, ka LM LFV pielietojums būtiski paaugstina ECFP-ERp29 gēna piegādi

HEPG2 šūnās (p < 0,001) salīdzinājumā ar abām pārējām gēnu piegādes metodēm. Kopējais

ECFP-ERp29 ekspresijas līmenis LM LFV ietekmē pieaug par 9%, salīdzinot ar LM un par

15%, salīdzinot ar L.

Iegūtie rezultāti parāda, ka, salīdzinot trīs dažādas gēnu piegādes metodes, LM LFV

pielietojums noved pie gan pie visaugstākā reportējošo gēnu ekspresējošo šūnu skaita, gan pie

visaugstākā kopējā proteīnu līmeņa transficētajās šūnās.

60

3.11. attēls. ECFP-Erp29 gēna piegāde HEPG2 šūnās, izmantojot trīs dažādas gēnu piegādes

metodes: (a) ECFP-ERp29 ekspresija HEPG2 šūnās (Western blota analīze), (b) transfekcijas

efektivitāte pēc ECFP-ERp29 ekspresijas līmeņa (n = 9; * p 0,05, salīdzinot ar L un LM,

Tukey tests)

Ko-transfekcijas eksperimentos tika pārbaudīts siRNS inhibējošais efekts uz

β-galaktozidāzes ekspresiju PC3 šūnās, izmantojot dažādas gēnu piegādes metodes.

Iegūtie rezultāti atspoguļoti 3.10. tabulā.

3.10. tabula

Transfekcijas efektivitāte (%) ar dažādām metodēm transficētu un ko-transficētu PC3 šūnu

paraugos

Eksp. Nr. L L siRNS LM LM siRNS LM LVF LM LFV siRNS

1. 43,1 9,8 59,8 9,1 78,0 6,2

2. 44,8 10,0 60,0 9,0 75,3 6,0

3. 43,8 9,9 60,0 8,9 79,0 6,0

4. 39,5 9,6 54,2 9,2 70,1 6,0

5. 38,2 9,6 55,1 8,8 71,2 5,9

22286,0 ±

237,6

24997,9 ±

242,2

30141,7 ±

365,4*

0

10000

20000

30000

40000

L LM LM LFV

De

nsit

om

etr

isk

ās v

ien

ība

s


b

a

61

3.10. tabulas turpinājums

Eksp. Nr. L siRNS LM LM siRNS LM LFV LM LFV si RNS

6. 34,7 10,1 51,1 9,0 69,9 6,1

7. 42,2 9,9 56,8 9,2 77,5 6,2

8. 43,1 9,7 56,0 8,9 73,4 6,1

9. 44,1 10,0 58,1 9,2 76,4 6,0

Tika panākta būtiska siRNS inhibējoša ietekme uz β-galaktozidāzes ekspresiju PC3

šūnās (p < 0,001), pielietojot visas trīs gēnu piegādes metodes (3.12. att. (a)).

3.12. attēls. LacZ gēna un siRNS pret β-galaktozidāzi piegāde PC3 šūnās, izmantojot trīs dažādas

gēnu piegādes metodes: (a) LacZ gēna ekspresija PC3 šūnās (× 200), (b) transfekcija ar LacZ

(balts) un ko-transfekcija ar LacZ un siRNS pret β-galaktozidāzi (pelēks) (n = 9; * p 0,05,

salīdzinot ar L/L siRNS un LM/LM siRNS, Tukey tests)

*

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

L/ L siRNS LM/ LM siRNS LM LFV/ LM

LFV siRNS

siR

NS

in

hib

ējo

ša

is e

fek

ts

Transf icēšanas metode

a

b

62

Tomēr, novērtējot siRNS inhibējošo efektu attiecībā pret transfekciju bez siRNS,

respektīvi, L, LM un LM LFV, tika konstatēts, ka LM LFV ietekmē tiek panākts visaugstākais

β-galaktozidāzes ekspresiju inhibējošais efekts – 92,4% β-galaktozidāzi neekspresējošu šūnu,

kas ir būtiski vairāk, salīdzinot ar LM (86,3%) un L (80,9%) (p < 0,001) (3.12. att. (b)).

3.2.3. Laika-fāzes variējoša magnētiskā lauka pielietojuma citotoksiskais efekts

Ar LacZpDNS transficētu PC3 šūnu dzīvo/nedzīvo šūnu attiecības aprēķinu rezultātā

iegūtie rādītāji apkopoti 3.11. tabulā.

3.11. tabula

Nedzīvo šūnu īpatsvars (%) ar dažādām metodēm transficētu PC3 šūnu paraugos


1. 13 16 6

2. 9 17 7

3. 10 17 6

4. 10 20 7

5. 9 21 6

6. 11 18 5

7. 11 16 7

8. 10 17 7

9. 9 19 8

Vizuāli visaugstākais citotoksiskais efekts tika novērots ar LM transficētu PC3 šūnu

paraugos (3.13. att. (a)). Aprēķinu rezultātā tika konstatēts, ka LM LFV ietekmē būtiski

samazinās apoptotisko un mirušo šūnu īpatsvars paraugos, salīdzinot abām pārējām gēnu

piegādes metodēm – LM un L (3.13. att. (b)). Dzīvo PC3 šūnu īpatsvars LM LFV ietekmē

sasniedza 94%, kamēr LM gadījumā 82% un L gadījumā 90% (p < 0,001).

63

3.13. attēls. Dažādu gēnu piegādes metožu pielietojuma citotoksiskais efekts: (a) ar trim

dažādām gēnu piegādes metodēm transficētas un pēc AO/EB metodes atkrāsotās PC3 šūnas

(× 200), (b) citotoksicitāte (n = 9; * p 0,05, salīdzinot ar L un LM, Tukey tests)

3.3. Laika-fāzes variējoša magnētiskā lauka ietekme uz SPION piegādes efektivitāti vēža

šūnās

Lai netieši apstiprinātu iepriekšējās eksperimentu sērijās konstatēto, ka β-galaktozidāzi

ekspresējošo šūnu skaita pieaugumu un ECFP-ERp29 kopējā ekspresijas līmeņa

paaugstināšanos laika-fāzes variējoša magnētiskā lauka ietekmē izraisa lielāks sedimentēto un

attiecīgi PC3 šūnās iekļauto SPION-nukleīnskābju-liposomālās komponentes kompleksu

daudzums, tika veikta SPION internalizācijas kvalitatīva analīze. Veicot šūnu magnētisko

iezīmēšanu ar 10 µg SPION/šūnu kultūras plates iedaļu, un pielietojot PB krāsošanas metodi,

tika skaidri parādīta SPION klātbūtne magnētiski iezīmētu šūnu citoplazmā.

10 ± 1,3

18 ± 1,8

7 ± 0,9*

0

5

10

15

20

25

L LM LM LFV

Ne

dz

īvo

šū

nu

īp

ats

va

rs (

%)

Transf icēšanas metode

b

a

64

3.14. attēls. Pēc PB metodes atkrāsotās magnētiski iezīmētās PC3 šūnas (× 200): (a) – magnētiskā

iezīmēšana veikta statiskajā magnētiskajā laukā, (b) – magnētiskā iezīmēšana veikta laika-fāzes

variējošā magnētiskajā laukā; zilais krāsojums norāda uz šūnās internalizēto SPION klātbūtni

Kā redzams 3.14. attēlā, PC3 šūnu magnētiskās iezīmēšanas efektivitāte pēc

ekspozīcijas kā statiskajā magnētiskajā laukā (3.14. att. (a)), tā laika-fāzes variējošā

magnētiskajā laukā (3.14. att. (b)) bija tuvu 100%. Vizuāli starp abām pielietotajām metodēm

tika novērota atšķirība krāsojuma intensitātē, kas netieši norāda par atšķirībām internalizētās

dzelzs daudzumā.

Lai apstiprinātu iegūtos rezultātus pēc PB krāsojuma, tika kvantitatīvi novērtēts šūnās

ieslēgto SPION daudzums, veicot dzelzs satura spektrofotometrisku analīzi ar SPION

magnētiski iezīmētās šūnās. Aprēķinu rezultāti apkopoti 3.12. tabulā.

3.12. tabula

PC3 šūnās internalizētās dzelzs daudzums (pg) dažādu magnētisko lauku ietekmē

Eksp.Nr. Statiskais magn. lauks Laika-fāzes magn. lauks

1. 30,0 59,0

2. 30,5 58,8

3. 29,5 59,1

4. 27,7 57,4

5. 28,4 57,9

6. 28,5 56,0

7. 22,9 55,1

8. 25,2 52,4

9. 23,4 50,2

65

3.15. attēls. Dzelzs daudzums magnētiski iezīmētās PC3 šūnās: (a) – magnētiskā iezīmēšana

veikta statiskajā magnētiskajā laukā, (b) – magnētiskā iezīmēšana veikta laika-fāzes variējošā

magnētiskajā laukā (n = 9; * p 0,05, salīdzinot ar a, t-tests)

Tika konstatēts, ka laika-fāzes variējoša magnētiskā lauka ietekmē būtiski – 2 reizes

paaugstinās internalizētās dzelzs daudzums PC3 šūnās, salīdzinot ar statiskā magnētiskā lauka

ietekmē šūnās internalizētās dzelzs daudzumu (3.15. att.). Iegūtie rezultāti apstiprina šūnās

internalizēto SPION un attiecīgi SPION-nukleīnskābju-liposomālās komponentes kompleksu

saistību ar paaugstinātu gēnu ekspresiju laika-fāzes variējoša magnētiskā lauka ietekmē.

Pētījumā eksperimentāli tika parādīts, ka laika-fāzes variējoša magnētiskā lauka ietekmē

tiek panākta vienmērīgāka SPION izkliede uz šūnu kultūras plates iedaļas virsmas, salīdzinot

ar SPION izkliedi uz virsmas statiskajā magnētiskajā laukā. Laika-fāzes magnētiskā lauka

ietekmē paaugstinās šūnās internalizēto SPION daudzums, kā arī palielinās gan transficēto šūnu

skaits, gan kopējais ekspresētā proteīna līmenis transficētajās šūnās.

Laika-fāzes variējošā magnētiskā lauka ietekmē samazinās gēnu piegādes izraisītais

citotoksiskais efekts.

27,3 ± 2,8

56,2 ± 3,1*

0

10

20

30

40

50

60

70

a b

Fe2

+/u

z šū

nu

(p

g)

66

DISKUSIJA

Gēnu terapijas efektivitāti raksturo atbilstošas devas terapeitiskā gēna piegāde mērķa

šūnās, neizraisot būtisku citotoksisko efektu. Magnetofekcija ir viena no efektīvākajām gēnu

piegādes metodēm, kuras pamatā ir ar SPION saistītu nukleīnskābju piegāde šūnās ar ārēja

statiska magnētiskā lauka palīdzību. Magnētiskais lauks ļauj īsā laikā koncentrēt nukleīnskābes

uz šūnu virsmas, tā paaugstinot arī šūnās piegādāto nukleīnskābju daudzumu.

Literatūras datu analīzē tika noskaidrots, ka dažādu alternatīvu (ne statisku) magnētisko

lauku pielietojums uzlabo magnetofekcijas efektivitāti. Pastāv uzskats, ka kompleksa

magnētiskā lauka iedarbība izraisa SPION-nukleīnskābju svārstības dažādos virzienos, tā

stimulējot to pārnesi caur šūnas membrānu, taču šīs parādības mehānisms līdz galam nav

noskaidrots. Mūsu starpdisciplinārā grupa aprakstījusi jaunu – laika-fāzes variējošu magnētisko

lauku, kura pamatā ir permanentu magnētu orbitāla rotācija šūnu kultūrai paralēlā plaknē.

Datormodelēšanas rezultāti parādīja, ka laika-fāzes variējoša magnētiskā lauka ietekmē, SPION

sedimentācija notiek tās pārmaiņus pārvietojot aksiālā un laterālā virzienā, kā rezultātā tiek

panākta vienmērīga SPION izkliede uz virsmas.

Promocijas darbā ir praktiski pierādīts, ka pielietojot laika-fāzes variējošu magnētisko

lauku, iespējams būtiski paaugstināt nukleīnskābju piegādes efektivitāti vēža šūnās.

Lai apstiprinātu datormodelēšanas rezultātus, pirmkārt tika savstarpēji salīdzināta

sedimentēto SPION izkliede statiska un laika-fāzes variējoša magnētiskā lauka ietekmē. Iegūtie

rezultāti uzrādīja krasu atšķirību SPION izvietojumā uz šūnu kultūras plates iedaļas virsmas –

statiskajā magnētiskajā laukā SPION veidoja izteiktu svītrveida rakstu ar salīdzinoši lieliem bez

SPION laukumiem starp svītrveida struktūrām, kamēr LM LFV gadījumā SPION izvietojās

vienmērīgāk un bez SPION laukumi praktiski novēroti netika. Šāds SPION sedimentācijas

profils varētu būt izskaidrojams ar specifisko magnetofekcijas iekārtas DynaFECTOR magnētu

rotācijas programmu, kas nodrošina magnētiskā lauka spēku nepārtrauktu mainību, kas saistīta

ar trim dažādām fāzēm (magnētu pozīcija zem iedaļas) magnētu rotācijas procesā. Iegūtie

rezultāti varētu norādīt uz to, ka magnētu orbitālās kustības laikā notiek nepārtraukta SPION

pārvietošana aksiāli laterālā virzienā, nodrošinot to pakāpenisku sedimentāciju “soli pa solim”

tā, iespējams, kavējot lineāru ķēžveida struktūru veidošanos. Dažādu magnētisko lauku

atšķirīgā ietekme uz magnētisko nanodaļiņu kustību šķīdumā novērota arī citos pētījumos.

Gravel grupas pētījumā tika novērotas būtiskas atšķirības magnētisko nanodaļiņu izvietojumā

tubulāra divpolu trīsfāžu elektromagnēta ģenerētu magnētisko lauku iedarbības rezultātā.

Rotējošā magnētiskajā laukā magnētiskās nanodaļiņas veidoja apaļas formas virpuļveida

67

struktūras, bet oscilējoša un statiska magnētiskā lauka gadījumā – lineāras struktūras, kas sakrīt

ar šajā pētījumā novēroto attiecībā uz statisko magnētisko lauku.

Ja SPION sedimentācijas procesa laikā laika-fāzes variējošā magnētiskajā laukā daļiņu

pārvietošanās notiek gan aksiālā, gan laterālā virzienā, tad sagaidāms, ka arī SPION-

nukleīnskābju-liposomālās komponentes kompleksu kustība notiks ne tikai aksiālā, bet arī

laterālā virzienā. Tas, iespējams, varētu sekmēt šo kompleksu iekļūšanu šūnās, kas attiecīgi

rezultēsies paaugstinātā transfekcijas efektivitātē.

Optimālā pDNS-LIP-SPION savstarpējā attiecība gan magnetofekcijai statiskajā un

laika-fāzes variējošā magnētiskajā laukā abām šūnu līnijām bija identiska: 1:2:1. Pie

x pDNS-LIP-SPION savstarpējās attiecības tika novērota nukleīnskābju piegādes

efektivitātes samazināšanās, savukārt pie x pDNS-LIP-SPION savstarpējās attiecības

paaugstinājās citotoksiskais efekts. Neskatoties uz identisku pDNS-LIP-SPION savstarpējo

attiecību, kas tika pielietota magnetofekcijai statiskajā un laika-fāzes variējošā magnētiskajā

laukā, transfekcijas efektivitāte laika-fāzes variējošā magnētiskā lauka gadījumā bija augstāka,

nekā statiskajā magnētiskajā laukā. Tas varētu norādīt uz to, ka laika-fāzes variējoša lauka

ietekmē paaugstinās internalizēto nukleīnskābju daudzums un tam ir saistība ar

SPION-nukleīnskābju-liposomālās komponentes kompleksu laterālu kustību rotācijas ietekmē,

jo visi citi parametri (magnētiskā lauka intensitāte, darbības ilgums), salīdzinot ar statisko

magnētisko lauku, ir identiski.

Magnetofekcijas efektivitāte variē atkarībā no ekspozīcijas ilguma magnētiskajā laukā.

Tika novērots, ka visefektīvākā LacZ gēna piegāde PC3 un HEPG2 šūnās

(pēc β-galaktozidāzi ekspresējošo šūnu skaita) notiek pie 5 min ekspozīcijas gan statiskajā, gan

laika-fāzes variējošā magnētiskajā laukā. Īsāka ekspozīcija noved pie samazinātas gēnu

piegādes efektivitātes, kas liecina par to, ka ekspozīcijas ilgums < 5 min ir nepietiekams

SPION-nukleīnskābju-liposomālās komponentes kompleksu koncentrēšanai uz šūnas virsmas.

Iegūtie rezultāti sakrīt ar Huth grupas konstatēto – pētījumos ar HeLa šūnu līniju tika novērota

SPION koncentrēšanās apkārt šūnas membrānai jau pēc 5 min ekspozīcijas magnētiskajā laukā.

Arī mūsu iepriekšējos pētījumos transgēna ekspresija vēža šūnās, transficējot ar

magnetofekcijas metodi, tika konstatēta jau pēc 4 stundām salīdzinājumā ar lipofekcijas metodi

– 8 stundām, kas apstiprina citu autoru pētījumos konstatēto attiecībā uz magnetofekcijas

kinētiku salīdzinājumā ar citām metodēm, piemēram, lipofekciju

(Mykhaylyk et al., 2009b, 2010).

Magnetofekcijas efektivitātes izmaiņas, atkarībā no ekspozīcijas ilguma magnētiskajā

laukā, iepriekš novērojusi Kamau ar līdzautoriem. Savstarpēji salīdzinot reportējošā gēna

ekspresiju vairākās sūnu līnijās, pēc 5 un 20 min ekspozīcijas kombinētā statiskā/oscilējošā

68

magnētiskajā laukā, izmantojot divu veidu SPION, tika konstatēts, ka efektīvāka ir 20 min

ekspozīcija magnētiskajā laukā. Pretēji mūsu grupas iegūtie rezultāti liecina, ka, izmantojot

tikai 5 min ekspozīciju gan statiskajā, gan laika-fāzes variējošā magnētiskajā laukā, ir iespējams

sasniegt augstu transfekcijas efektivitāti, bet jāatzīmē atšķirības pētījuma dizainā. Kamau

grupas pētījumā gēnu piegāde HeLa un Cos7 šūnās tika nodrošināta ar magnetofekcijas metodi,

izmantojot komerciālās polyMAG un autoru sintezētās ar PEI pārklātās SPION. Jebkurš no šiem

faktoriem – gan SPION, gan reportējošo gēnu kodējoša plazmīdas DNS, gan izvēlētā šūnu līnija

un visbeidzot transfekcijas metode var ietekmēt gēnu piegādes efektivitāti.

Maksimāli īss ekspozīcijas ilgums varētu būt kritisks faktors klīniskajos pētījumos, kur,

lai panāktu vēlamo efektu, nepieciešams pielietot augstas intensitātes magnētisko lauku.

Pierādīts, ka mērenas intensitātes (0,5–2 T) magnētiskā lauka iedarbība neizraisa blakusefektus

(Leszczynski, 2005), bet ekspozīcija augstas intensitātes (200 T) magnētiskajā laukā var izraisīt

DNS degradāciju (Li and Chow, 2001). Šajā pētījumā magnētu specifiskā izvietojuma rezultātā

tiek radīts mērens (0,35 T) magnētiskais lauks, taču tas ir pietiekams efektīvam pielietojumam

arī in vivo (Chertok et al., 2011).

Interesanti rezultāti tika iegūti novērtējot magnetofekcijas efektivitātes izmaiņas

atkarībā no magnētu apgriezienu frekvences – nozīmīgākā laika-fāzes variējoša magnētiskā

lauka raksturojošā rādītāja. Datorsimulācijās tika parādīts, ka SPION sedimentācija uz virsmas

ir atkarīga no magnētu apgriezienu frekvences – palielinot magnētu apgriezienu frekvenci

līdz noteiktai robežai ( = 40), SPION sedimentācija uz virsmas kļūst vienmērīgāka un būtiski

nemainās pie tālāka frekvences pieauguma. Eksperimentāli tika konstatēts, ka magnetofekcijas

efektivitāte variē atkarībā no magnētu apgriezienu frekvences, bet atšķirīgi dažādās šūnu līnijās.

Vislielākais β-galaktozidāzi ekspresējošo PC3 šūnu skaits tika iegūts pie 5 apgr./min ar 5 min

ekspozīciju magnētiskajā laukā, savukārt vislielākais

β-galaktozidāzi ekspresējošo HEPG2 šūnu skaits – ar 5 min ekspozīciju magnētiskajā laukā pie

magnētu apgriezienu frekvences 50 apgr./min. Atšķirības starp datorsimulācijās un

eksperimentāli iegūtajiem rezultātiem varētu norādīt uz šūnu membrānas lomu internalizācijas

iznākumā, bet lai to precīzi noteiktu ir nepieciešami papildu pētījumi. Eksperimentāli iegūtie

rezultāti varētu būt skaidrojami pirmkārt ar PC3 un HEPG2 šūnu atšķirīgajām membrānas

īpašībām, jo, zināms, ka SPION internalizācijas sekmes ir tieši atkarīgas no šūnu veida (Kamau

et al., 2006; Cromer Berman et al.; Schwarz et al., 2012). PC3 šūnas (d = 23 µm) ir vairāk kā

divas reizes lielākas par HEPG2 šūnām (d = 10 µm). Palielinot magnētu rotācijas ātrumu,

paātrinās arī SPION-nukleīnskābju-liposomālās komponentes kompleksu kustība laterālā

virzienā pa šūnas virsmu tā, iespējams, papildus stimulējot endocitozes procesus, kas varētu būt

izšķirošs faktors neliela izmēra šūnām. Iegūtie rezultāti arī norāda uz to, ka rotējošā magnētu

69

sistēmā iespējams pielāgot magnetofekcijas protokolu dažādu šūnu veidu transfekcijai, attiecīgi

pielāgojot magnētu apgriezienu frekvenci.

Dati, kas tika iegūti novērtējot magnētiskā lauka intensitātes izmaiņu ietekmi uz

β-galaktozidāzes ekspresiju, ir likumsakarīgi, jo, zināms, ka, palielinoties attālumam no

magnēta, samazinās magnētiskā lauka intensitāte, un tas savukārt ietekmē efektivitāti. Fouriki

pētījumā netika novērotas statistiski ticamas atšķirības transgēna ekspresijas rādītājos atkarībā

no attāluma no magnēta – 3 mm (0,1 T), 4 (0,08 T) un 5 mm (0,06 T). Mūsu pētījumā attāluma

izmaiņas ir daudz lielākas – 9 un 6 mm attiecībā pret kontroles attālumu 0 mm, kas attiecīgi

nozīmē lielāku atšķirību magnētiskās intensitātes rādītājos – 0,1 T un 0,2 T attiecībā pret 0,35

T.

Magnetofekcijas efektivitāte pie 5 min ekspozīcijas magnētiskajā laukā ar magnētu

apgriezienu frekvenci 5 apgr./min PC3 un 50 apgr./min HEPG2 šūnās pēc β-galaktozidāzi

ekspresējošo šūnu skaita sasniedz 79,6% un 87,7%. Šie ir ļoti augsti magnetofekcijas

efektivitātes rādītāji, ņemot vērā to, ka gan PC3, gan HEPG2 šūnu līnijas pieder pie grūti

transficējamām šūnu līnijām ar raksturīgu transfekcijas efektivitāti 30–40% robežās.

Analizējot gēnu piegādes efektivitāti, ir būtiski noskaidrot, gan cik šūnās, gan cik daudz

vienā/visās šūnās ir notikusi rezultatīva gēna piegāde. Pēc literatūras datiem šāda veida

pētījumos, lai atspoguļotu gēnu piegādes efektivitāti pamatā izmanto luciferāzes aktivitātes

kvantitatīvu detekciju, taču pēc šīs analīzes nevar spriest par transficēto šūnu skaitu. Šajā

pētījumā ir analizēti abi indicējošie parametri.

Salīdzinošie dati, kas iegūti transficējot vēža šūnas ar trim dažādām metodēm, parādīja,

ka laika-fāzes variējoša magnētiskā lauka ietekmē statistiski būtiski paaugstinās nukleīnskābju

piegādes efektivitāte:

a) gan pēc reportējošo gēnu ekspresējošo šūnu skaita – par 21%, salīdzinot ar LM un

par 42%, salīdzinot ar L PC3 šūnās, un par 51%, salīdzinot ar LM un 56%, salīdzinot ar

L HEPG2 šūnās;

b) gan pēc kopējā proteīnu daudzuma – par 6%, salīdzinot ar LM un par 22%,

salīdzinot ar L PC3 šūnās, un par 9%, salīdzinot ar LM un 15%, salīdzinot ar L HEPG2 šūnās.

Būtiski, ka uzlabota gēnu piegādes efektivitāte LM LFV gadījumā salīdzinājumā ar LM

un L tika novērota arī gadījumos kad reportējošā gēna ekspresija nepārsniedza 50%, kas

apstiprina laika-fāzes magnētiskā lauka prevalējošo iedarbību pār citiem transfekcijas

efektivitāti ietekmējošiem faktoriem.

Pārliecinoši rezultāti tika iegūti pārbaudot siRNS inhibējošo efektu uz

β-galaktozidāzes ekspresiju ar ko-transfekcijas metodi. Nosakot siRNS inhibējošo efektu

attiecībā pret magnetofekcijas efektivitāti (bez siRNS), tika konstatēts statistiski nozīmīgs LM

70

LFV (92,4%) pārākums, salīdzinot gan ar LM (86,3%), gan L (80,9%), kas norāda uz metodes

potenciālu pielietošanai terapeitisko siRNS piegādei vēža šūnās.

Salīdzinot ar abām plaši pielietotajām konvencionālajām gēnu piegādes metodēm

(L un LM), uzlabotā gēnu piegādes metode (LM LFV) ir mazāk citotoksiska, kas tika uzskatāmi

parādīts, izmantojot PC3 šūnu līniju. Novērotais attiecībā uz SPION kustību sedimentācijas

laikā laika-fāzes variējošā magnētiskajā laukā liecina, ka magnētu rotācijas rezultātā SPION

izkliedējas vienmērīgi un tiek kavēta liela izmēra struktūru veidošanās šķīdumā un attiecīgi arī

uz šūnu membrānām. Tas samazina šūnu bojājumus un tādā veidā ir saistīts ar mazāku

citotoksisko efektu, salīdzinot ar LM. Savukārt novērojumi attiecībā uz specifisko SPION

izkliedi statiskā magnētiskā lauka ietekmē izskaidro augstos LM citotoksicitātes rādītājus.

SPION citotoksiskais efekts statiskā magnētiskā lauka ietekmē plaši analizēts Bae un līdzautoru

pētījumā. Autori pierādījuši, ka mērena statiskā magnētiskā lauka ietekmē (vidēji 0,4 T) SPION

veido agregātus, kas tiek koncentrēti uz NCTC 1469

(normālas peļu hepatocītu šūnas) šūnu virsmas. Tieši šādu agregātu koncentrēšanās uz šūnu

virsmas, ne internalizācija šūnās būtiski ietekmē šūnu dzīvotspēju atkarībā gan no SPION

sākotnējās koncentrācijas, gan ekspozīcijas ilguma magnētiskajā laukā.

SPION izkliede, iespējams, ir prevalējošais faktors attiecībā uz citotoksicitātes

rādītājiem šajā pētījumā, ņemot vērā arī to, ka SPION ir salīdzinoši netoksiskas un to

pielietojums dažādos savienojumos pēc literatūras datiem var pat samazināt kopējo

citotoksicitāti (Leung et al., 2013).

Magnētiskā iezīmēšana ar SPION un sekojoša Fe2+ daudzuma noteikšana magnētiski

iezīmētās šūnās apstiprināja, ka laika-fāzes variējoša magnētiskā lauka ietekmē šūnās iekļūst

vairāk SPION. Tādējādi ir pamats uzskatīt, ka laika-fāzes variējoša magnētiskā lauka ietekmē

šūnās vairāk iekļūst arī ar SPION saistītu nukleīnskābju.

Līdz šim šāda veida pētījumos, kur tikusi analizēta dažādu ne statisku magnētisko lauku

ietekme, paaugstināta nukleīnskābju piegāde šūnās tiek saistīta tikai ar laterālas SPION kustības

kā endocitozi stimulējoša faktora ietekmi. Dobson grupa (Fouriki et al., 2010) izstrādājusi

oscilējošu magnētu sistēmu magnefect-nano™. Tās pamatā ir NdFeB magnētu sistēmas

izraisītas 2 Hz laterālas oscilācijas 200µm amplitūdā. Ar šīs sistēmas palīdzību tiek nodrošināta

SPION-kompleksu sedimentācija uz šūnu virsmas, kam seko kustība sānu virzienā pa šūnas

virsmu, tā stimulējot SPION-kompleksu internalizāciju. Kamau ar līdzautoriem aprakstījusi

dinamiskā lauka ģeneratora Dynamic Marker pielietojumu gēnu piegādei šūnās. Šīs sistēmas

pamatā ir elektromagnētu radīts 50 Hz magnētiskais lauks, kas darbojas Z ass virzienā un

papildus 0,75 Hz magnētiskais lauks, kas darbojas X ass virzienā ar 1,5 cm amplitūdu, tādējādi

izraisot SPION-kompleksu svārstības šūnu kultūras plaknei perpendikulārā un paralēlā

71

virzienā, ar attiecīgu svārstību amplitūdu 50 un 0,75 Hz. Šīs laterālās svārstības kopā ar

iespējamu rotējošu kustību uz šūnas virsmas stimulē SPION-kompleksu pārvietošanos caur

šūnas membrānu.

Šajā pētījumā iegūtie rezultāti parāda, ka ticamāk paaugstināta SPION-nukleīnskābju-

liposomālās komponentes kompleksu internalizācija šūnās varētu notikt multiplu faktoru

iedarbības rezultātā. Viens no būtiskākajiem faktoriem, kas tika pierādīts arī praktiski ir SPION

vienmērīgā izkliede uz šūnu kultūras plates iedaļas virsmas laika-fāzes variējošā magnētiskajā

laukā laterālas SPION kustības ietekmē. Statiskajā magnētiskajā laukā īsā laikā uz šūnu virsmas

koncentrējas ļoti daudz SPION-nukleīnskābju-liposomālās komponentes kompleksu, kas

vienlaicīgi nevar tikt iekļauti šūnās. Tas var novest ķēžveida struktūru veidošanās.

Sedimentācija “soli pa solim” aksiāli laterālā virzienā laika-fāzes variējošā laukā kavē

vienlaicīgu SPION-nukleīnskābju-liposomālās komponentes kompleksu sedimentāciju uz šūnu

virsmas un attiecīgi ķēžveida struktūru veidošanos kā rezultātā netiek traucēta to internalizācija.

Nevar izslēgt, ka arī laterāla SPION-nukleīnskābju-liposomālās komponentes

kompleksu kustība pa šūnas virsmu veicina to ieslēgšanu šūnās – kustības rezultātā ar šūnas

virsmu saskaras vairāk kompleksu – vairāk mehāniski tiek stimulēta šūnas membrāna. Jenkins

ar līdzautoriem novērojuši, ka neirosfēru kultūrās, kuras tika pakļautas oscilējošām laterālām

svārstībām, šūnu plazmatiskās membrānas ir ar izteiktāku reljefu. Citos pētījumos ir pierādīts,

ka ārēja mehāniska spēka inducēta membrānas stimulācija sekmē gan endocitozes, gan

eksocitozes procesus (Apodaca, 2002) un SPION-nukleīnskābju kompleksu pastiprinātu

iekļūšanu šūnā primāri izraisa mehāniski stimulēti endocitozes procesi (Fouriki et al., 2010).

Savukārt šo mehānisko stimulāciju var izraisīt gan svārstīga SPION-nukleīnskābju kompleksu

kustība pa šūnas membrānas virsmu mainīga magnētiskā lauka ietekmē (Lim et al., 2012) gan

arī pagaidu poru veidošanās šūnas membrānā mainīga magnētiskā lauka izraisītu vibrāciju

ietekmē (Dahmani et al., 2013).

72

SECINĀJUMI

1. Atšķirības uz virsmas sedimentēto SPION izvietojumā statiskajā un laika-fāzes

magnētiskajā laukā liecina par atšķirīgu SPION kustību šķīdumā šo magnētisko lauku ietekmē.

Iespējams, tā ir aksiāli laterāla SPION kustība, kas rodas laika-fāzes magnētiskā lauka ietekmē.

2. Magnētu apgriezienu frekvence (apgr./min) ir viens no būtiskākajiem laika-fāzes

variējoša magnētiskā lauka raksturlielumiem. Atšķirīga optimālā magnētu apgriezienu

frekvence pie identiska ekspozīcijas ilguma magnētiskajā laukā PC3 šūnās (5 apgr./min) un

HEPG2 šūnās (50 apgr./min) norāda uz to, ka magnētu apgriezienu frekvencei ir būtiska loma

gēnu piegādes efektivitātes paaugstināšanā.

3. Būtisks transficēto PC3 un HEPG2 šūnu skaita pieaugums līdz ar kopējā ekspresēto

proteīnu līmeņa pieaugumu transficētajās PC3 un HEPG2 šūnās, kā arī būtisks gēnu piegādi

inhibējoša efekta pieaugums un citotoksiskā efekta samazināšanās PC3 šūnās liecina par laika-

fāzes variējoša magnētiskā lauka pozitīvu ietekmi uz SPION-nukleīnskābju-liposomālās

komponentes kompleksu piegādes efektivitāti vēža šūnās. Liposomālā magnetofekcija

laika-fāzes variējošā magnētiskajā laukā ir efektīvāka nukleīnskābju piegādes metode vēža

šūnās, salīdzinot ar lipofekciju un liposomālo magnetofekciju.

4. Kopumā, analizējot iegūtos rezultātus, var secināt, ka laika-fāzes magnētiskā lauka

ietekmē notiek SPION-nukleīnskābju–liposomālās komponentes kompleksu aksiāli laterāla

kustība šķīdumā. Tā rezultātā notiek vienmērīgāka SPION sedimentācija uz šūnu virsmas

paaugstinās šūnās ieslēgto SPION daudzums paaugstinās arī šūnās ieslēgto

SPION-nukleīnskābju-liposomālās komponentes kompleksu daudzums palielinās ne tikai

magnetificēto šūnu skaits, bet arī paaugstinās piegādāto gēnu ekspresijas līmenis magnetificētās

šūnās samazinās citotoksicitāte.

73

IZMANTOTĀ LITERATŪRA

1. Adams C.F., Pickard M.R., Chari D.M. Magnetic nanoparticle mediated transfection of neural stem

cell suspension cultures is enhanced by applied oscillating magnetic fields // Nanomed, 2013; 9 (6):

737–741.

2. Ahmed N., Fessi H., Elaissari A. Theranostic applications of nanoparticles in cancer // Drug Discov

Today, 2012; 17 (17-18): 928–934.

3. Alexiou C., Jurgons R., Schmid R.J., et al. Magnetic drug targeting-biodistribution of the magnetic

carrier and the chemotherapeutic agent mitoxantrone after locoregional cancer treatment // J Drug

Target, 2003; 11 (3): 139–149.

4. Alsaggar M., Liu D. Physical methods for gene transfer // Adv Genet, 2015; 89: 1–24.

5. Anson D.S. The use of retroviral vectors for gene therapy-what are the risks? A review of retroviral

pathogenesis and its relevance to retroviral vector-mediated gene delivery // Genet Vaccines Ther,

2004; 2 (1): 9.

6. Apodaca G. Modulation of membrane traffic by mechanical stimuli // Am J Physiol Ren Physiol,

2002; 282 (2): F179–F190.

7. Avery O.T., MacLeod C.M., McCarty M. Studies on the chemical nature of the substance inducing

transformation of pneumococcal types: induction of transformation by a deoxyribonucleic acid

fraction isolated from pneumococcus type III // J Exp Med, 1944; 79 (2): 137–158.

8. Babincova M., Babinec P. Magnetic drug delivery and targeting: principles and applications //

Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub, 2009; 153 (4): 243–250.

9. Bae J.E., Huh M.I., Ryu B.K., et al. The effect of static magnetic fields on the aggregation and

cytotoxicity of magnetic nanoparticles // Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol, 2011; 3

(4): 343–355.

10. Bareford L.M., Swaan P.W. Endocytic mechanisms for targeted drug delivery // Adv Drug Deliv

Rev, 2007; 59 (8): 748–758.

11. Blaese R.M., Culver K.W., Miller A.D., et al. T lymphocyte-directed gene therapy for ADA- SCID:

initial trial results after 4 years // Science, 1995; 270 (5235): 475–480.

12. Bolhassani A. Potential efficacy of cell-penetrating peptides for nucleic acid and drug delivery in

cancer // Biochim Biophys Acta, 2011; 1816 (2): 232–246.

13. Boussif O., Lezoualc'h F., Zanta M.A., et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer

into cells in culture and in vivo: polyethylenimine // Proc Natl Acad Sci USA, 1995; 92 (16): 7297–

7301.

14. Breimer D.D. Future challenges for drug delivery research // Adv Drug Deliv Rev, 1998; 33 (3):

265–268.

15. Bumb A., Regino C.A.S, Perkins M.R., et al. Preparation and characterization of a magnetic and

optical dual-modality molecular probe // Nanotechnol, 2010; 21 (17): 175704.

16. Bushman F.D. Retroviral integration and human gene therapy // J Clin Invest, 2007; 117 (8): 2083–

2086.

17. Byrne J.D., Betancourt T., Brannon-Peppas L. Active targeting schemes for nanoparticle systems

in cancer therapeutics // Adv Drug Deliv Rev, 2008; 60 (15): 1615–1626.

18. Cassidy J., Schätzlein A.G. Tumour-targeted drug and gene delivery: principles and concepts //

Expert Rev Mol Med, 2004; 6 (19): 1–17.

19. Cepko C.L., Roberts B.E., Mulligan R.C. Construction and applications of a highly transmissible

murine retrovirus shuttle vector // Cell, 1984; 37 (3): 1053–1062.

20. Cevher E., Sezer A.D., E.S. Gene Delivery Systems: Recent Progress in Viral and Non-Viral

Therapy // Recent Advances in Novel Drug Carrier Systems / Ed. by Sezer A.D., 2012. – ISBN:

978-51-0810-8.

21. Cha E., Daud A. Plasmid IL-12 electroporation in melanoma // Hum Vaccin Immunother, 2012; 8

(11): 1734–1738.

22. Chen C.B., Chen J.Y., Lee W.C. Fast transfection of mammalian cells using superparamagnetic

nanoparticles under strong magnetic field // J Nanosci Nanotechnol, 2009; 9 (4): 2651–2659.

23. Chertok B., David A.E., Yang V.C. Brain tumor targeting of magnetic nanoparticles for potential

drug delivery: effect of administration route and magnetic field topography // J Control Release,

2011; 155 (3): 393–399.

74

24. Chertok B., Moffat B., David A., et al. Iron oxide nanoparticles as a drug delivery vehicle for MRI

monitored magnetic targeting of brain tumors // Biomaterials, 2008; 29 (4): 487–496.

25. Chithrani B.D., Ghazani A., Chan W. Determining the size and shape dependence of gold

nanoparticle uptake into mammalian cells // Nano Lett, 2006; 6 (4): 662–668.

26. Cromer Berman S.M., Walczak P., Bulte J.W. Tracking stem cells using magnetic nanoparticles //

Biomaterials, 2011; 32 (35): 9401–9414.

27. Dahmani C., Mykhaylyk O., Helling F., et al. Rotational magnetic pulses enhance the

magnetofection efficiency in vitro in adherent and suspension cells // J Mag Mag Mater, 2013; 332:

163–171.

28. de Baere T., Deschamps F. New tumor ablation techniques for cancer treatment (microwave,

electroporation) // Diagn Interv Imaging, 2014; 95 (7-8): 677–682.

29. Dean D.A. Microinjection // Reference Module in Biomedical Sciences, 2013; 409–410.

30. Delalande A., Kotopoulis S., Postema M., et al. Sonoporation: Mechanistic insights and ongoing

challenges for gene transfer // Gene, 2013; 525 (2): 191–199.

31. Dennig J., Duncan E. Gene transfer into eukaryotic cells using activated polyamidoamine

dendrimers // J Biotechnol, 2002; 90 (3-4): 339–347.

32. Dick T., Hengst J., Yun J. Gene Therapy // Reference Module in Biomedical Sciences, 2015.

33. Durand S., Cimarelli A. The inside out of lentiviral vectors // Viruses, 2011; 3 (2): 132–159.

34. Easo S.L., Mohanan P.V. Dextran stabilized iron oxide nanoparticles: Synthesis, characterization

and in vitro studies // Carb Polym, 2013; 92 (1): 726–732.

35. Fan Z., Kumon R.E., Deng C.X. Mechanisms of microbubble-facilitated sonoporation for drug and

gene delivery // Ther Deliv, 2014; 5 (4): 467–486.

36. Fang C., Zhang M. Multifunctional magnetic nanoparticles for medical imaging applications // J

Mater Chem, 2009; 19: 6258–6266.

37. Fouriki A., Farrow N., Clements M.A., Dobson J. Evaluation of the magnetic field requirements

for nanomagnetic gene transfection // Nano Rev, 2010; 1: 5167.

38. Fraley R., Subramani S,, Berg P., Papahadjopoulos D. Introduction of liposome-encapsulated SV40

DNA into cells // J Biol Chem, 1980; 255 (21): 10431–10435.

39. Futreal P.A., Coin L., Marshall M., et al. A census of human cancer genes // Nat Rev Cancer, 2004;

4 (3): 177–183.

40. Gautier J., Munnier E., Paillard A., et al. A pharmaceutical study of doxorubicin-loaded PEGylated

nanoparticles for magnetic drug targeting // Int J Pharm, 2012; 423 (1): 16–25.

41. Gersting S.W., Schillinger U., Lausier J., et al. Gene delivery to respiratory epithelial cells by

magnetofection // J Gene Med, 2004; 6 (8): 913–922.

42. Glorioso J.C. Herpes simplex viral vectors: late bloomers with big potential // Hum Gene Ther,

2014; 25 (2): 83–91.

43. Goudy K.S., Wang B., Tisch R. Gene gun-mediated DNA vaccination enhances antigen-specific

immunotherapy at a late preclinical stage of type 1 diabetes in nonobese diabetic mice // Clin

Immunol, 2008; 129 (1): 49–57.

44. Gravel O., Lauzon-Gauthier J., Duchesne C., Larachi F. Inception of vortical coherent structures

from spinning magnetic nanoparticles in rotating magnetic fields–New nanofluid microscale

mixing tool // Chem Eng J, 2015; 260: 338–346.

45. Gupta A.K., Gupta M. Synthesis and surface engineering of iron oxide nanoparticles for biomedical

applications // Biomaterials, 2005; 26 (18): 3995–4021.

46. Hajiani P., Larachi F. Controlling lateral nanomixing and velocity profile of dilute ferrofluid

capillary flows in uniform stationary, oscillating and rotating magnetic fields // Chem Eng J, 2013;

223: 454–466.

47. Hareendran S., Balakrishnan B., Sen D., et al. Adeno-associated virus (AAV) vectors in gene

therapy: immune challenges and strategies to circumvent them // Rev Med Virol, 2013; 23 (6):

399–413.

48. He C.H., Tabata Y., Gao J.Q. Non-viral gene delivery carrier and its three-dimensional transfection

system // Int J Pharm, 2010; 386 (1-2): 232–242.

49. Hellebrand E., Mautner J., Reisbach G., et al. Epstein-Barr virus vector-mediated gene transfer into

human B cells: potential for antitumor vaccination // Gene Ther, 2006; 13 (2): 150–162.

50. Hillaireau H., Couvreur P. Nanocarriers' entry into the cell: relevance to drug delivery // Cell Mol

Life Sci, 2009; 66 (17): 2873–2896.

75

51. Hofmann-Amtenbrink M., von Rechenberg B., Hofmann H. Superparamagnetic nanoparticles for

biomedical applications // Nanostructured Materials for Biomedical Applications / Ed. by Tan

M.C., 2009. – ISBN: 978-81-7895-397-7.

52. Hollon T. Researchers and regulators reflect on first gene therapy death // Nat Med, 2000; 6 (1): 6.

53. Huang R.B., Mocherla S., Heslinga M.J., et al. Dynamic and cellular interactions of nanoparticles

in vascular-targeted drug delivery // Mol Membr Biol, 2010; 27 (4-6): 190–205.

54. Hunter A.C. Molecular hurdles in polyfectin design and mechanistic background to polycation

induced cytotoxicity // Adv Drug Deliv Rev, 2006; 58 (14): 1523–1531.

55. Huth S., Lausier J., Gersting S.W., et al. Insights into the mechanism of magnetofection using PEI-

based magnetofectins for gene transfer // J Gene Med, 2004; 6 (8): 923–936.

56. Huttinger C., Hirschberger J., Jahnke A., et al. Neoadjuvant gene delivery of feline granulocyte-

macrophage colony-stimulating factor using magnetofection for the treatment of feline

fibrosarcomas: A phase I trial // J Gene Med, 2008; 10 (6): 655–667.

57. Ibraheem D., Elaissari A., Fessi H. Gene therapy and DNA delivery systems // Int J Pharm, 2014;

459 (1-2): 70–83.

58. Jafari M., Soltani M., Naahidi S., et al. Nonviral approach for targeted nucleic acid delivery // Curr

Med Chem, 2012; 19 (2): 197–208.

59. Jahnke A., Hirschberger J., Fischer C., et al. Intra-tumoral gene delivery of feIL-2, feIFN-c and

feGM-CSF using magnetofection as a neoadjuvant treatment option for feline fibrosarcomas: A

phase-I study // J Vet Med, 2007; A54: 599–606.

60. Jenkins S.I., Pickard M.R., Granger N., Chari D.M. Magnetic nanoparticle-mediated gene transfer

to oligodendrocyte precursor cell transplant populations is enhanced by magnetofection strategies

// ACS Nano, 2011; 5 (8): 6527–6538.

61. Jhaveri A.M., Torchilin V.P. Multifunctional polymeric micelles for delivery of drugs and siRNA

// Front Pharmacol, 2014; 5: 77.

62. Juratli T.A., Schackert G., Krex D. Current status of local therapy in malignant gliomas — A

clinical review of three selected approaches // Pharm Ther, 2013; 139 (3): 341–358.

63. Kamau S.W., Hassa P.O., Steitz B., et al. Enhancement of the efficiency of non-viral gene delivery

by application of pulsed magnetic field // Nucleic Acids Res, 2006; 34 (5): e40.

64. Karpov A., Kozireva S., Avotiņa D., et al. Investigation of nanoparticle distribution formed by the

rotation of the magnetic system // J Magn Magn Mater, 2014; 369: 86–91.

65. Kennedy M.T., Pozharski E.V., Rakhmanova V.A., MacDonald R.C. Factors governing the

assembly of cationic phospholipid–DNA complexes // Biophys J, 2000; 78 (3): 1620–1633.

66. Kievit F.M., Veiseh O., Fang C., et al. Chlorotoxin labeled magnetic nanovectors for targeted gene

delivery to glioma // ACS Nano, 2010; 4 (8): 4587–4594.

67. Klinghoffer R.A., Bahrami S.B., Hatton B.A., et al. A technology platform to assess multiple cancer

agents simultaneously within a patient's tumor // Sci Transl Med, 2015; 7 (284): 284–258.

68. Kohn D.B., Sadelain M., Glorioso J.C. Occurrence of leukaemia following gene therapy of X-

linked SCID // Nat Rev Cancer, 2003; 3 (7): 477–488.

69. Kozlov V., Avotina D., Kasyanov V., Baryshev M. The Effect of Cyclic Movement of Magnets on

the Sedimentation of Magnetic Nanoparticles in Magnetofection Devices: Computer Simulation //

Separat Sci Technol, 2015; 50 (5): 767–771.

70. Krafcik A., Babinec P., Frollo I. Computational analysis of magnetic field induced deposition of

magnetic particles in lung alveolus in comparison to deposition produced with viscous drag and

gravitational force // J Mag Mag Mater, 2015; 380: 46–53.

71. Krötz F., Sohn H.Y., Gloe T., et al. Magnetofection potentiates gene delivery to cultured endothelial

cells // J Vasc Res, 2003; 40 (5): 425–434.

72. Kumar A., Jena P.K., Behera S., et al. Multifunctional magnetic nanoparticles for targeted delivery

// Nanomed, 2010; 6 (1): 64–69.

73. Kumar M., Yigit M., Dai G., et al. Image-guided breast tumor therapy using a small interfering

RNA nanodrug // Cancer Res, 2010; 70 (19): 7553–7561.

74. Lachmann P.J., Davies A. Complement and immunity to viruses // Immunol Rev, 1997; 159 (1):

69–77.

75. Lam T., Pouliot P., Avti P.K., et al. Superparamagnetic iron oxide based nanoprobes for imaging

and theranostics // Adv Coll Int Sci, 2013; 199-200: 95–113.

76. Laurent N., Sapet C., le Gourrierec L., et al. Nucleic acid delivery using magnetic nanoparticles:

The magnetofection technology // Ther Deliv, 2011; 2 (4): 471–482.

76

77. Laurent S., Forge D., Port M., et al. Magnetic iron oxide nanoparticles: synthesis, stabilization,

vectorization, physicochemical characterizations, and biological applications // Chem Rev, 2008;

108 (6): 2064–2110.

78. Lehner R., Wang X., Marsch S., Hunziker P. Intelligent nanomaterials for medicine: carrier

platforms and targeting strategies in the context of clinical application // Nanomed, 2013; 9 (6):

742–757.

79. Leszczynski, D. Rapporteur report: cellular, animal and epidemiological studies of the effects of

static magnetic fields relevant to human health // Prog Biophys Mol Biol, 2005; 87: 247–253.

80. Leung K.C., Wong C.H., Zhu X.M., et al. Ternary hybrid nanocomposites for gene delivery and

magnetic resonance imaging of hepatocellular carcinoma cells // Quant Imaging Med Surg, 2013;

3 (6): 302–307.

81. Li S.H., Chow K.C. Magnetic field exposure induces DNA degradation // Biochem Biophys Res

Commun, 2001; 280 (5): 1385–1388.

82. Li W., Ma N., Ong L.L., et al. Enhanced thoracic gene delivery by magnetic nanobead-mediated

vector // J Gene Med, 2008; 10 (8): 897–909.

83. Li Z., Xiang J., Zhang W., et al. Nanoparticle delivery of anti-metastatic NM23-H1 gene improves

chemotherapy in a mouse tumor model // Cancer Gene Ther, 2009; 16: 423–429.

84. Lim J., Clements M.A., Dobson J. Delivery of Short Interfering Ribonucleic Acid-Complexed

Magnetic Nanoparticles in an Oscillating Field Occurs via Caveolae-Mediated Endocytosis // Plos

One, 2012; 7 (12): e51350.

85. Liu Q., Zhang J., Xia W., Gu H. Magnetic field enhanced cell uptake efficiency of magnetic silica

mesoporous nanoparticles // Nanoscale, 2012; 4 (11): 3415–3421.

86. Liu W.M., Xue Y.N., He W.T., et al. Dendrimer modified magnetic iron oxide

nanoparticle/DNA/PEI ternary complexes: a novel strategy for magnetofection // J Control Release,

2011; 152 (1): e159–160.

87. Low L., Mander A., McCann K., et al. DNA vaccination with electroporation induces increased

antibody responses in patients with prostate cancer // Hum Gene Ther, 2009; 20 (11): 1269–1278.

88. Lübbe A.S., Alexiou C., Bergemann C. Clinical applications of magnetic drug targeting // J Surg

Res, 2001; 95 (2): 200–206.

89. Lübbe A.S., Bergemann C., Riess H., et al. Clinical experiences with magnetic drug targeting: A

phase I study with 4'-epidoxorubicin in 14 patients with advanced solid tumors // Cancer Res, 1996;

56 (20): 4686–4693.

90. Luo D., Saltzman W.M. Enhancement of transfection by physical concentration of DNA at the cell

surface // Nat Biotechnol, 2000; 18 (8): 893–895.

91. Luten J., van Nostrum C.F., De Smedt S.C., Hennink W.E. Biodegradable polymers as non-viral

carriers for plasmid DNA deliver // J Control Release, 2008; 126 (2): 97–110.

92. Lv H., Zhang S., Wang B., et al. Toxicity of cationic lipids and cationic polymers in gene delivery

// J Control Release, 2006; 114 (1): 100–109.

93. Magin-Lachmann C., Kotzamanis G., D´Aiuto L., et al. In vitro and in vivo delivery of intact BAC

DNA-comparison of different methods // J Gene Med, 2004; 6 (2): 195–209.

94. Mahmoudi M., Meng J., Xue X., et al. Interaction of stable colloidal nanoparticles with cellular

membranes // Biotechnol Adv, 2014; 32: 679–692.

95. Mahmoudi M., Sant S., Wang B., et al. Superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPIONs):

development, surface modification and applications in chemotherapy // Adv Drug Deliv Rev, 2011;

63 (1-2): 24–46.

96. Makkonen K.E., Airenne K., Ylä-Herttulala S. Baculovirus-mediated gene delivery and RNAi

applications // Viruses, 2015; 7 (4): 2099–2125.

97. Marshall E. Gene therapy. Second child in French trial is found to have leukemia // Science, 2003;

299 (5605): 320.

98. Massart R., Preparation of aqueous magnetic liquids in alkaline and acidic media // EEE

Transactions on Magnetics, 1981; 17 (2): 1247–1248.

99. Mayrhofer P., Schleef M., Jechlinger W. Use of minicircle plasmids for gene therapy // Methods

Mol. Biol, 2009; 542: 87–104.

100. McBain S.C., Griesenbach U., Xenariou S., et al. Magnetic nanoparticles as gene delivery agents:

enhanced transfection in the presence of oscillating magnet arrays // Nanotechnology, 2008; 19

(40): 405102.

77

101. McDonald D.M., Foss A.J. Endothelial cells of tumor vessels: abnormal but not absent // Cancer

Metastasis Rev, 2000; 19 (1-2): 109–120.

102. Mehier-Humbert S., Guy R.H. Physical methods for gene transfer: improving the kinetics of gene

delivery into cells // Adv Drug Deliv Rev, 2005; 57 (5): 733–753.

103. Miller D.L., Pislaru S.V., Greenleaf J.E. Sonoporation: mechanical DNA delivery by ultrasonic

cavitation // Somat Cell Mol Genet, 2002; 27 (1-6): 115-134.

104. Moghimi S.M., Symonds P., Murray J.C., et al. A two-stage poly(ethylenimine)-mediated

cytotoxicity: implications for gene transfer/therapy // Mol Ther, 2005; 11 (6); 990–995.

105. Mulligan R.C. The basic science of gene therapy // Science, 1993; 260 (5110): 926–932.

106. Muro S., Garnacho C., Champion J.A., et al. Control of endothelial targeting and intracellular

delivery of therapeutic enzymes by modulating the size and shape of ICAM-1-targeted carriers //

Mol Ther, 2008; 16 (8): 1450–1458.

107. Muthana M., Scott S.D., Farrow N., et al. A novel magnetic approach to enhance the efficacy of

cell-based gene therapies // Gene Ther, 2008; 15: 902–910.

108. Mykhaylyk O., Antequera Y.S., Vlaskou D., Plank C. Generation of magnetic nonviral gene

transfer agents and magnetofection in vitro // Nat Protoc, 2007; 2 (10): 2391–2411.

109. Mykhaylyk O., Sanchez-Antequera Y., Vlaskou D., et al. Liposomal magnetofection // Meth Mol

Biol, 2010; 605: 487–525.

110. Mykhaylyk O., Steingotter A., Perea H., et al. Nucleic acid delivery to magnetically-labeled cells

in a 2D array and at the luminal surface of cell culture tube and their detection by MRI // J Biomed

Nanotechnol, 2009 (a); 5 (6): 692–706.

111. Mykhaylyk O., Zelphati O., Hammerschmid E., et al. Recent advances in magnetofection and its

potential to deliver siRNAs in vitro // Methods Mol Biol, 2009 (b); 487: 111–146.

112. Mykhaylyk O., Zelphati O., Rosenecker J., Plank C. siRNA delivery by magnetofection // Curr

Opin Mol Ther, 2008; 10 (5): 493–505.

113. Namiki Y., Namiki T., Yoshida H., et al. A novel magnetic crystal–lipid nanostructure for

magnetically guided in vivo gene delivery // Nat Nanotech, 2009; 4: 598–606.

114. Nayerossadat N., Maedeh T., Ali P.A. Viral and nonviral delivery systems for gene delivery // Adv

Biomed Res, 2012; 1: 27.

115. Neumann E., Schaefer-Ridder M., Wang Y., Hofschneider P.H. Gene transfer into mouse lyoma

cells by electroporation in high electric fields // EMBO J, 1982; 1 (7): 841–845.

116. Oberle V., Bakowsky U., Zuhorn I.S., Hoekstra D. Lipoplex formation under equilibrium

conditions reveals a three-step mechanism // Biophys J, 2000; 79 (3): 1447–1454.

117. Onishi Y., Eshita Y., Murashita A., et al. Characteristics of DEAE-dextran-MMA graft copolymer

as a nonviral gene carrier // Nanomed Nanotechnol Biol Med, 2007; 3 (3): 184–191.

118. Osborne R. Ark floats gene therapy's boat, for now // Nat Biotechnol, 2008; 26: 1057–1059.

119. Palmer D.H., Chen M.J., Kerr D.J. Taking gene therapy into the clinic // J Biomed Biotechnol,

2003; 2003 (1): 71–77.

120. Palmer D.H., Mautner V., Kerr D.J. Clinical experience with adenovirus in cancer therapy // Curr

Opin Mol Ther, 2002; 4 (5): 423–434.

121. Pearson S., Hepeng Jia H., Kandachi K. China approves first gene therapy // Nat Biotechnol, 2004;

22 (1): 3–4.

122. Pickard M., Chari D. Enhancement of magnetic nanoparticle-mediated gene transfer to astrocytes

by ‘magnetofection’: effects of static and oscillating fields // Nanomed (Lond), 2010; 5 (2): 217–

232.

123. Plank C., Schillinger U., Scherer F., et al. The magnetofection method: using magnetic force to

enhance gene delivery // Biol Chem, 2003; 384 (5): 737–747.

124. Plank C., Zelphati O., Mykhaylyk O. Magnetically enhanced nucleic acid delivery. Ten years of

magnetofection-progress and prospects // Adv Drug Deliv Rev, 2011; 63 (14-15): 1300–1331.

125. Prabha S., Sharma B., Labhasetwar V. Inhibition of tumor angiogenesis and growth by

nanoparticle-mediated p53 gene therapy in mice // Cancer Gene Ther, 2012; 19 (8): 530–537.

126. Prijic S., Scancar J., Romih R., et al. Increased cellular uptake of biocompatible superparamagnetic

iron oxide nanoparticles into malignant cells by an external magnetic field // J Membr Biol, 2010;

236 (1): 167–179.

127. Prosen L., Markelc B., Dolinsek T., et al. Mcam silencing with RNA interference using

magnetofection has antitumor effect in murine melanoma // Mol Ther Nucleic Acids, 2014; 3 (10):

e205.

78

128. Puhlmann M., Brown C.K., Gnant M., et al. Vaccinia as a vector for tumor-directed gene therapy:

biodistribution of a thymidine kinase-deleted mutant // Cancer Gene Ther, 2000; 7 (1): 66–73.

129. Pulfer S.K., Gallo J.M. Enhanced brain tumor selectivity of cationic magnetic polysaccharide

microspheres // J Drug Target, 1998; 6 (3): 215–227.

130. Rejman J., Oberle V., Zuhorn I.S., Hoekstra D. Size-dependent internalization of particles via the

pathways of clathrinand caveolae-mediated endocytosis // Biochem J, 2004; 377 (Pt1): 159–169.

131. Renzing J., Lane D.P. p53-dependent growth arrest following calcium phosphate-mediated

transfection of murine fibroblasts // Oncogene, 1995; 10 (9): 1865–1868.

132. Ribble D., Goldstein N.B., Norris D.A., Shellman Y.G. A simple technique for quantifying

apoptosis in 96-well plates // BMC Biotechnol, 2005; 5: 12.

133. Rogers S., Pfuderer P. Use of viruses as carriers of added genetic information // Nature, 1968; 219

(5155): 749–751.

134. Rosenberg S.A., Aebersold P., Cornetta K., et al. Gene transfer into humans–immunotherapy of

patientswith advancedmelanoma, using tumor-infiltrating lymphocytes modified by retroviral gene

transduction // N Engl J Med, 1990; 323: 570–578.

135. Rotariu O., Strachan N.J.C. Modelling magnetic carrier particle targeting in the tumor

microvasculature for cancer treatment // J Magn Magn Mater, 2005; 293 (1): 639–646.

136. Rudolf B., Salmainb M., Wilczewskad A.Z., et al. Fabrication of multifunctional magnetic

nanoparticles bearing metallocarbonyl probes and antibodies // Coll Surf, 2014; 457: 142–151.

137. Ruß V., Wagner E. Cell and tissue targeting of nucleic acids for cancer gene therapy // Pharm Res,

2007; 24 (6): 1047–1057.

138. Santhosh P.B., Ulrih N.P. Multifunctional superparamagnetic iron oxide nanoparticles: Promising

tools in cancer theranostics // Cancer Letters, 2013; 336 (1): 8–17.

139. Sapet C., Laurent N., de Chevigny A., et al. High transfection efficiency of neural stem cells with

magnetofection // Biotechniques, 2011; 50 (3): 187–189.

140. Sardesai N.Y., Weiner D.B. Electroporation delivery of DNA vaccines: Prospects for success //

Curr Opin Immunol, 2011; 23 (3): 421–429.

141. Scherer F., Anton M., Schillinger U., et al. Magnetofection: enhancing and targeting gene delivery

by magnetic force in vitro and in vivo // Gene Ther, 2002; 9 (2): 102–109.

142. Schillinger U., Brill T., Rudolph C., et al. Advances in magnetofection–magnetically guided

nucleic acid delivery // J Magn Magn Mater, 2005; 293 (1): 501–508.

143. Schwarz S., Wong J.E., Bornemann J. Polyelectrolyte coating of iron oxide nanoparticles for MRI-

based cell tracking // Nanomed, 2012; 8 (5): 682–691.

144. Schwerdt J.U., Goya G.F., Calatayund M.P., et al. Magnetic field-assisted gene delivery:

achievements and therapeutic potential // Curr Gene Ther, 2012; 12 (2): 116–126.

145. Sharma B., Ma W., Adjei I.M., et al. Nanoparticle-mediated p53 gene therapy for tumor inhibition

// Drug Deliv Trans Res, 2011; 1 (1): 43–52.

146. Shubayev V.I., Pisanic T.R. 2nd, Jin S. Magnetic nanoparticles for theragnostics // Adv Drug Deliv

Rev, 2009; 61 (6): 467–477.

147. Silva A.K.A., Silva É.L., Carriço A.S., Egito E.S.T. Magnetic Carriers: A Promising Device for

Targeting Drugs Into the Human Body // Curr Pharm Des, 2007; 13 (11): 1179–1185.

148. Sincai M., Ganga D., Ganga M., et al. Antitumor effect of magnetite nanoparticles in cat mammary

adenocarcinoma // J Magn Magn Mater, 2005; 293: 438–441.

149. Singh A., Sahoo S.K. Magnetic nanoparticles: a novel platform for cancer theranostics // Drug

Discov Today, 2014; 19 (4): 474–481.

150. Somia N., Verma I.M. Gene therapy: trials and tribulations // Nat Rev Genet, 2000; 1: 91–99.

151. Stephen Z.R., Kievit F.M, Zhang M. Magnetite Nanoparticles for Medical MR Imaging // Mater

Today, 2012; 14 (7-8): 330–338.

152. Sum C.H., Wettig S., Slavcev R.A. Impact of DNA vector topology on non-viral gene therapeutic

safety and efficacy // Curr Gene Ther, 2014; 14 (4): 309–329.

153. Sun W., Qian H., Zhang X., et al. Induction of protective and therapeutic antitumour immunity

using a novel tumour-associated antigen-specific DNA vaccine // Immunol Cell Biol, 2006; 84 (5):

440–447.

154. Svingen T., Wilhelm D., Combes A.N., et al. Ex vivo magnetofection: a novel strategy for the study

of gene function in mouse organogenesis // Dev Dyn, 2009; 238 (4): 956–964.

155. Szybalska E.H., Szybalski W. Genetics of human cess line. IV. DNA-mediated heritable

transformation of a biochemical trait // Proc Natl Acad Sci USA, 1962; 48: 2026–2034.

79

156. Tai C.K., Kasahara N. Replication-competent retrovirus vectors for cancer gene therapy // Front

Biosci, 2008; 13: 3083–3095.

157. Tangney M., Casey G., Larkin J.O., et al. Non-viral in vivo immune gene therapy of cancer:

combined strategies for treatment of systemic disease // Cancer Immunol Immunother, 2006; 55

(11): 1443–1450.

158. Taratula O., Salva R., Pandya I., et al. Multifunctional siRNA delivery system for cancer therapy

// Nanotech, 2008; 2 (1): 49–52.

159. Tatum E.L. Molecular biology, nucleic acids, and the future of medicine // Perspect Biol Med,

1966; 10 (1): 19–32.

160. Teja A.S., Koh P-Y. Synthesis, properties, and applications of magnetic iron oxide nanoparticles //

Prog Crystal Growth Charact Mater, 2009; 55 (1-2): 22–45.

161. Temin H.M. Mixed infection with two types of Rous sarcoma virus // Virology, 1961; 13: 158–

163.

162. Teramato S., Ishii T., Matsuse T. Crisis of adenoviruses in human gene therapy // Lancet, 2000;

355 (9218): 1911–1912.

163. Thrasher A.J., Gaspar H.B., Baum C., et al. Gene therapy: X-SCID transgene leukaemogenicity //

Nature, 2006; 443 (7109): E5–7.

164. Tickle J.A., Jenkins S.I., Pickard M.R., Chari D.M. Influence of amplitude of oscillating magnetic

fields on magnetic nanoparticle-mediated gene transfer to astrocytes // Nano LIFE, 2015; 5 (1):

1450006.

165. Tiwari A.P., Ghosh S.J., Pawar S.H. Biomedical applications based on magnetic nanoparticles:

DNA interactions // Anal Methods, 2015; 7: 10109–10120.

166. Torchilin V.P. Drug targeting // Eur J Pharm Sci, 2000; 11 (Suppl 2): S81–S91.

167. Uchida M., Li X.W., Mertens P., Alpar H.O. Transfection by particle bombardment: Delivery of

plasmid DNA into mammalian cells using gene gun // Biochim Biophys Acta, 2009; 1790 (8): 754–

764.

168. Vaheri A., Pagano J.S. Infectious poliovirus RNA: a sensitive method of assay // Virology, 1965;

27 (3): 434–436.

169. Vainauska D., Kozireva S., Karpovs A., et al. A Novel Approach for Nucleic Acid Delivery Into

Cancer Cells // MEDICINA (Kaunas), 2012; 48 (6): 324–329.

170. Villemejane J., Mir L.M. Physical methods of nucleic acid transfer: general concepts and

applications // Br J Pharmacol, 2009; 157: 207–219.

171. Wasungu L., Hoekstra D. Cationic lipids, lipoplexes and intracellular delivery of genes // J Control

Release, 2006; 116 (2): 255–264.

172. Weissleder R., Bogdanov A., Neuwelt E.A., Papisov M. Longcirculating iron-oxides for Mr-

imaging // Adv Drug Deliv Rev, 1995; 16 (2-3): 321–334.

173. Wells D.J. Gene therapy progress and prospects: electroporation and other physical methods //

Gene Ther, 2004; 11 (18): 1363–1369.

174. Widder K.J., Senyei A.E., Scarpelli D.G. Magnetic microspheres: a model system for site specific

drug delivery in vivo // Proc Soc Exp Biol Med, 1978; 58 (2): 141–146.

175. Wilhelm C., Billotey C., Roger J., et al. Intracellular uptake of anionic superparamagnetic

nanoparticles as a function of their surface coating // Biomaterials, 2003; 24 (6): 1001–1011.

176. Wilson M.W., Kerlan R.K., Jr, Fidelman N.A., et al. Hepatocellular carncinoma: Regional therapy

with a magnetic targeted carrier bound to doxorubicin in a dual MR imaging/conventional

angiography suite-initial experience with 4 patients // Radiology, 2004; 230 (1): 287–293.

177. Wirth T., Ylä-Herttuala S. Gene Therapy Used in Cancer Treatment // Biomedicines, 2014; 2 (2):

149–162.

178. Wishart D.S. Is cancer a genetic disease or a metabolic disease? // EbioMedicine, 2015; 2 (6): 478–

479.

179. Xenariou S., Griesenbach U., Ferrari S., et al. Using magnetic forces to enhance non-viral gene

transfer to airway epithelium in vivo // Gene Ther, 2006; 13 (21): 1545–1552.

180. Xiang J.J., Tang J.Q., Zhu S.G., et al. IONP-PLL: a novel non-viral vector for efficient gene

delivery // J Gene Med, 2003; 5 (9): 803–817.

181. Yameen B., Choi W.I., Vilos C., et al. Insight into nanoparticle cellular uptake and intracellular

targeting // J Control Release, 2014; 190: 485–499.

182. Yang S.Y., Sun J.S., Liu C.H., et al. Ex vivo magnetofection with magnetic nanoparticles: a novel

platform for nonviral tissue engineering // Artif Organs, 2007; 32 (3): 195–204.

80

183. Yin T., Wang P., Zheng R., et al. Nanobubbles for enhanced ultrasound imaging of tumors // Int J

Nanomed, 2012; 7: 895–904.

184. Yin W.K., Feng S.S. Effects of particle size and surface coating on cellular uptake of Polymeric

nanoparticles for oral delivery of anticancer drugs // Biomaterials, 2005; 26 (15): 2713–2722.

185. Zhang J.Q., Zhang Z.R., Yang H., et al. Lyophilized paclitaxel magnetoliposomes as a potential

drug delivery system for breast carcinoma via parenteral administration: In vitro and in vivo studies

// Pharm Res, 2005; 22 (4): 573–583.

186. Zhang Y., Satterlee A., Huang L. In vivo gene delivery by nonviral vectors: overcoming hurdles?

// Mol Ther, 2012; 20 (7): 1298–1304.

81

PUBLIKĀCIJAS UN ZIŅOJUMI PAR PĒTĪJUMA TĒMU

ZINĀTNISKIE RAKSTI PAR PĒTĪJUMA TĒMU

1. Kozlov V., Avotina D., Kasyanov V., Baryshev M. The Effect of Cyclic Movement of

Magnets on the Sedimentation of Magnetic Nanoparticles in Magnetofection Devices:

Computer Simulation // Separat Sci Technol, 2015; 50 (5): 767–771.

2. Karpov A., Kozireva S., Avotiņa D., Chernobayeva L., Baryshev M. Investigation of

nanoparticle distribution formed by the rotation of the magnetic system // J Magn Magn

Mater, 2014; 369: 86–91.

3. Avotina D., Kozireva S., Karpovs A., Chistyakovs M., Baryshev M. Dynamic magnetic

field increases intracellular magnetic labelling of prostate carcinoma and Burkitt’s

lymphoma cells // Collection of Scientific Papers 2012 RSU, 2013; (2): 65–70.

4. Vainauska D., Kozireva S., Karpovs A., Čistjakovs M., Bariševs M. A Novel Approach for

Nucleic Acid Delivery Into Cancer Cells // MEDICINA (Kaunas), 2012; 48 (6): 324–329.

PMID: 22885367.

KONFERENČU TĒZES

1. Kozireva S., Avotiņa D., Karpovs A., Cistjakovs M., Baryshev M. “Dynamic magnetic field

increases transduction efficacy of GFP-modTAT into prostate carcinoma PC3 cells” RSU

2013. gada Zinātniskā konference, Rīga, 21.–22. marts, 2013.

2. Baryshev M., Avotina D., Kozireva S. Use of Transducible Modified TAT Peptide for

Simultaneous Protein and DNA Delivery into PC3 Cells. 1st International Conference on

BioNano Innovation, Brisbena, Austrālija, 18.–20. jūlijs, 2012.

3. Kozireva S., Avotina D., Baryshev M. Transduction of GFP-Tus-NLS and GFP-modTat

Fusion Proteins into Prostate carcinoma and Burkitt’s Lymphoma Cells. 1st International

Conference on BioNano Innovation, Brisbena, Austrālija, 18.–20. jūlijs, 2012.

4. Avotiņa D., Kozireva S., Karpovs A., Chistyakovs M., Baryshev M. Enhanced Magnetic

Cell Labeling Efficiency Using Dynafector. RSU 2012. gada Zinātniskā konference, Rīga,

29.–30. marts, 2012. (stenda referāts)

5. Vainauska D., Kozireva S., Karpovs A., Chistyakovs M., Baryshev M. Imroved Technique

of Nucleic Acid Delivery into Cancer cells. RSU 2011. gada Zinātniskā konference, Rīga,

14.–15. aprīlis, 2011. (mutisks referāts)

6. Karpovs A., Vainauska D., Kozireva S., Chistyakovs M., Baryshev M. Dynafector Is a New

Device for the Enhancement of Liposomal Magnetofection. Efficiency of Cancer Cells under

82

Dynamic Gradient Magnetic Field. RSU 2011. gada Zinātniskā konference, Rīga, 14.–15.

aprīlis, 2011.

PATENTS

Kozlovs V., Karpovs A., Priedīte V., Avotiņa D., Stradiņš P., Kalējs M., Kasjanovs V.,

Mironovs V. Telpiski sakārtotas šūnu struktūras izveidošanas paņēmiens no dzīvotspējīgām

pieauguša cilvēka šūnām. LV-14595B, 20.02.2013.

83

PATEICĪBAS

Šis pētījums ir komandas darbs, tāpēc vislielākais PALDIES maniem ESF projekta 2.

aktivitātes kolēģiem – Dr. biol. Mihailam Bariševam, Dr. biol. Svetlanai Kozirevai un

Maksimam Čistjakovam, bez kuriem šī promocijas darba izstrāde nebūtu iespējama. Pateicos

ESF projekta fiziķiem Vladimiram Kozlovam un Andrejam Karpovam par ieguldījumu šī darba

fizikas sadaļas tapšanā.

Vēlos pateikties visam RSU A. Kirhenšteina Mikrobioloģijas un virusoloģijas institūta

kolektīvam un institūta vadītājai Dr. med. asociētajai profesorei Modrai Murovskai par iespēju

te strādāt triju gadu garumā, par iegūto neatsveramo zinātnisko pieredzi. Īpašs paldies Alīnai

un Zaigai par vērtīgajiem padomiem un uz personīgo pieredzi balstītu atbalstu promocijas

procesā.

PALDIES visai manai otrā plāna komandai – Gunai, Andrejam, Artūram, Dmitrijam,

Dainai, Inārai, Renātei, Benitai, Aļonai, Lanai, Sergejam, Sintijai, Lāsmai, Ērikai, Nikolai,

Jānim, Ģirtam, Ancei, Gitai, Zanei un meitenei no Valsts policijas par nesavtīgi veltīto laiku,

lai palīdzētu man šī promocijas darba tapšanā. PALDIES!

Pateicos Dr. habil. med. profesoran Jānim Vētram, Dr. habil. phys. profesoram Jurijam

Dehtjaram un Dr. biol. asociētajai profesorei Elenai Kashubai par promocijas darba recenzēšanu.

84

PIELIKUMI

85

1. pielikums

Liposomālā magnetofekcija laika-fāzes variējošā magnētiskajā laukā

PC3 un HEPG2 šūnu līnijām

PROTOKOLS

CM – CombiMAG magnētiskās nanodaļiņas

LIP – Lipofectamine2000 transfekcijas reaģents

Komponentu attiecība vienai reakcijai: 1 µg pDNS:2 µl LIP:1 µl CM uz vienu 24 iedaļu

plates iedaļu.

1. No katras plates iedaļas ar šūnu kultūru atsūc esošo barotni un aizvieto to ar 350 µl Opti-

MEM barotnes.

2. Sagatavo pDNS šķīdumu Opti-MEM ar kopējo daudzumu 50 µl šķīduma.

3. Sagatavo LIP reaģenta šķīdumu Opti-MEM ar kopējo daudzumu 50 µl šķīduma, inkubē

istabas temperatūrā 5 minūtes.

4. Magnētiskās nanodaļiņas CombiMAG vorteksē 2–3 sekundes. Sagatavo CM šķīdumu Opti-

MEM ar kopējo daudzumu 50 µl šķīduma.

5. Sagatavoto pDNS šķīdumu pievieno LIP reaģenta šķīdumam un viegli samaisa

2–3 reizes pipetējot. pDNS-LIP šķīdumam pievieno CM šķīdumu, viegli samaisa, 2–3

reizes lēni pipetējot, un inkubē istabas temperatūrā 25 minūtes.

6. Maisījumu pa pilienam pārnes uz iedaļām šūnu kultūras platē.

7. Plati pašūpo no labās uz kreiso pusi un no augšas uz apakšu, lai nodrošinātu vienmērīgu

pDNS-LIP-CM kompleksu izkliedi iedaļā.

8. Plati novieto uz DynaFECTOR platformas un inkubē nepieciešamajā režīmā – 5 min/5

apgr./min (PC3 šūnas) vai 5 min/50 apgr./min (HEPG2 šūnas).

9. Pēc inkubācijas plati liek CO2 inkubatorā uz 24 stundām.

86

2. pielikums

Liposomālā ko-magnetofekcija laika-fāzes variējošā magnētiskajā laukā

PC3 šūnu līnijai

PROTOKOLS

CM – CombiMAG magnētiskās nanodaļiņas

LIP – Lipofectamine2000 transfekcijas reaģents

Komponentu attiecība vienai reakcijai: 1 µg pDNS:50 nM siRNS:2 µl LIP:1 µl CM uz vienu

24 iedaļu plates iedaļu.

1. No katras plates iedaļas ar šūnu kultūru atsūc esošo barotni un aizvieto to ar 300 µl Opti-

MEM barotnes.

2. Sagatavo pDNS šķīdumu Opti-MEM ar kopējo daudzumu 50 µl šķīduma.

3. Sagatavo siRNS šķīdumu Opti-MEM ar kopējo daudzumu 50 µl šķīduma.

4. Sagatavo LIP reaģenta šķīdumu Opti-MEM ar kopējo daudzumu 50 µl šķīduma, inkubē

istabas temperatūrā 5 minūtes.

5. Magnētiskās nanodaļiņas CombiMAG vorteksē 2–3 sekundes. Sagatavo CM šķīdumu Opti-

MEM ar kopējo daudzumu 50 µl šķīduma.

6. Sagatavoto siRNS šķīdumu pievieno pDNS šķīdumam, pēc tam LIP reaģenta šķīdumam

un viegli samaisa, 2–3 reizes pipetējot. pDNS-siRNS-LIP šķīdumam pievieno CM

šķīdumu, viegli samaisa, 2–3 reizes lēni pipetējot, un inkubē istabas temperatūrā 25

minūtes.

7. Maisījumu pa pilienam pārnes uz iedaļām šūnu kultūras platē.

8. Plati pašūpo no labās uz kreiso pusi un no augšas uz apakšu, lai nodrošinātu vienmērīgu

pDNS-siRNS-LIP-CM kompleksu izkliedi iedaļā.

9. Plati novieto uz DynaFECTOR platformas un inkubē nepieciešamajā režīmā – 5 min/5

apgr./min.

10. Pēc inkubācijas plati liek CO2 inkubatorā uz 48 stundām.

LAIKA-FĀZES VARIĒJOŠA MAGNĒTISKĀ LAUKA IETEKME UZ ... · 3 ANNOTATION Of the Thesis...

Documents

Transcript of LAIKA-FĀZES VARIĒJOŠA MAGNĒTISKĀ LAUKA IETEKME UZ ... · 3 ANNOTATION Of the Thesis...