VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V BRNĚBRNO UNIVERSITY OF TECHNOLOGY

FAKULTA CHEMICKÁÚSTAV CHEMIE A TECHNOLOGIE OCHRANY ŽIVOTNÍHOPROSTŘEDÍ

FACULTY OF CHEMISTRYINSTITUTE OF CHEMISTRY AND TECHNOLOGY OF ENVIRONMENTAL PROTECTION

VYUŽITÍ PLYNOVÉ CHROMATOGRAFIE S HMOTNOSTNĚ

SPEKTROMETRICKOU DETEKCÍ PRO POSOUZENÍ KONTAMINACE

ODPADNÍCH A POVRCHOVÝCH VOD REZIDUI LÉČIV

DIZERTAČNÍ PRÁCEDOCTORAL THESIS

AUTOR PRÁCE Ing. PETR LACINAAUTHOR

BRNO 2012

VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V BRNĚBRNO UNIVERSITY OF TECHNOLOGY

FAKULTA CHEMICKÁ

ÚSTAV CHEMIE A TECHNOLOGIE OCHRANYŽIVOTNÍHO PROSTŘEDÍ

FACULTY OF CHEMISTRY

INSTITUTE OF CHEMISTRY AND TECHNOLOGY OFENVIRONMENTAL PROTECTION

VYUŽITÍ PLYNOVÉ CHROMATOGRAFIE SHMOTNOSTNĚ SPEKTROMETRICKOU DETEKCÍPRO POSOUZENÍ KONTAMINACE ODPADNÍCH APOVRCHOVÝCH VOD REZIDUI LÉČIV

APPLICATION OF GAS CHROMATOGRAPHY WITH MASS SPECTROMETRIC DETECTION FOR

THE ASSESSMENT OF DRUG-RESIDUE CONTAMINATION OF WASTEWATERS AND SURFACE

WATERS

DIZERTAČNÍ PRÁCEDOCTORAL THESIS

AUTOR PRÁCE Ing. PETR LACINAAUTHOR

VEDOUCÍ PRÁCE prof. RNDr. MILADA VÁVROVÁ, CSc.SUPERVISOR

BRNO 2012

Vysoké učení technické v BrněFakulta chemická

Purkyňova 464/118, 61200 Brno 12

Zadání dizertační práce

Číslo dizertační práce: FCH-DIZ0060/2011 Akademický rok: 2011/2012

Ústav: Ústav chemie a technologie ochrany životního prostředí

Student(ka): Ing. Petr Lacina

Studijní program: Chemie a technologie ochrany životního prostředí (P2805)

Studijní obor: Chemie životního prostředí (2805V003)

Vedoucí práce prof. RNDr. Milada Vávrová, CSc.

Konzultanti:

Název dizertační práce:

Využití plynové chromatografie s hmotnostně spektrometrickou detekcí pro posouzení kontaminace

odpadních a povrchových vod rezidui léčiv

Zadání dizertační práce:

Výběr vhodných léčiv pro analýzu s využitím GCxGC-TOF MS

Výběr odběrových lokalit

Vypracování vhodné techniky pro separaci, zakoncentrování a derivatizaci vybraných analytů

Optimalizace metody

Provádění odběrů vzorků

Stanovení analytů v modelových a reálných vzorcích vod

Zhodnocení získaných výsledků

Vypracování dizertační práce

Termín odevzdání dizertační práce: 24.4.2012

Dizertační práce se odevzdává ve třech exemplářích na sekretariát ústavu a v elektronické formě

vedoucímu dizertační práce. Toto zadání je přílohou dizertační práce.

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -Ing. Petr Lacina prof. RNDr. Milada Vávrová, CSc. doc. Ing. Josef Čáslavský, CSc.

Student(ka) Vedoucí práce Ředitel ústavu

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -V Brně, dne 1.9.2011 prof. Ing. Jaromír Havlica, DrSc.

Děkan fakulty

3

ABSTRAKT Předkládaná dizertační práce vychází z aktuální problematiky nárůstu přítomnosti reziduí léčiv v různých složkách životního prostředí. Jedná se o tzv. „nový“ druh environmentálních kontaminantů, které do těchto složek kontinuálně vstupují. Nejvíce zatíženou složkou životního prostředí z pohledu kontaminace rezidui léčiv je vodní prostředí. Tato práce je zaměřena na vývoj a optimalizaci metody, která spolehlivě a s dostatečnou přesností a správností dokáže kvalitativně i kvantitativně stanovit vybraná léčiva ve vodném prostředí (odpadní a povrchové vody). Cílové sloučeniny byly vybrány převážně ze skupiny nesteroidních protizánětlivých látek: kyselina salicylová, kyselina acetylsalicylová, kyselina klofibrová, ibuprofen, paracetamol, kofein, naproxen, kyselina mefenamová, ketoprofen a diklofenak. Léčiva patřící do této skupiny jsou jedny z nejvíce užívaných v České republice. Pro finální analýzu byla využita komplexní dvojrozměrná plynová chromatografie s hmotnostně spektrometrickou detekcí Time-of-Fligt (GCxGC-TOF MS) jako velice citlivá a účinná analytická metoda vhodná pro stopovou a ultrastopovou analýzu. V práci je současně uvedena optimalizace extrakční metody a především optimalizaci derivatizace, která je nezbytná pro úspěšné stanovení uvedených látek pomocí plynové chromatografie. Výsledná optimalizovaná analytická metoda, zahrnující extrakci tuhou fází (SPE), derivatizaci pomocí MSTFA (N-methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamid) a finální analýzu s použitím GCxGC-TOF MS, byla úspěšně aplikována na reálných vzorcích odpadní a povrchové vody. Vzorky odpadní vody byly odebírány z velkokapacitní čistírny odpadních vod v Brně Modřících, vzorky povrchové vody z moravských řek Svratky a Svitavy. V odpadní vodě byly zjištěny koncentrace většiny sledovaných látek v rozmezí jednotek až desítek µg.l-1 a v povrchové vodě u některých analytů v rozmezí desítek až stovek ng.l-1. Závěrem práce je posouzena míra kontaminace jak odpadních, tak i povrchových vod rezidui vybraných léčiv, samovolná degradace vybraných léčiv ve vodném prostředí a účinnost odstraňování těchto látek v čistírně odpadních vod. Navržená metoda popsaná v této práci je použitelná pro monitoring a environmentální analýzu matric pocházejících z vodních ekosystémů. Je využitelná nejen pro analýzu vybraných léčiv, ale také ostatních organických sloučenin podobných vlastností jako mají vybraná léčiva.

KLÍ ČOVÁ SLOVA léčiva, rezidua léčiv, životní prostředí, vodní ekosystémy, nesteroidní protizánětlivé látky, analgetika, plynová chromatografie, dvojrozměrná plynová chromatografie, derivatizace, extrakce tuhou fází, odpadní voda, povrchová voda

4

ABSTRACT This work is based on the current issue of increasing concentrations of pharmaceutical residues in various components of the environment. These new environmental contaminants continuously enter the environment. The most affected environmental component is the aquatic environment. This study is focused on the development and optimization of reliable analytical method, which can determine selected drugs in the aquatic environment (waste waters and surface waters) qualitatively and quantitatively. The target compounds were selected mainly from the group of non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAID): salicylic acid, acetylsalicylic acid, clofibric acid, ibuprofen, acetaminophen, caffeine, naproxen, mefenamic acid, ketoprofen and diclofenac. NSAIDs are one of the most used drugs in Czech Republic. For the final analysis of this study was used the comprehensive two-dimensional gas chromatography with mass spectrometric detection Time-of-Flight (GCxGC-TOF MS). It is a very sensitive and reliable analytical method for trace and ultra-trace analysis. Simultaneously, solid phase extraction (SPE) and derivatization are optimized in this work. Optimized analytical method including SPE, derivatization with MSTFA (N-methyl-N-(trimethylsilyl) trifluoroacetamide) and final analysis by GCxGC-TOF MS were applied successfully for the analysis of real samples. Samples of waste water were collected from the waste water treatment plant in Brno – Modřice and samples of surface water were collected from two river streams Svratka and Svitava in Moravian region. The range of concentrations of selected drug residues varied from one to tens of µg.L-1 in wastewater and from tens to hundreds of ng.L-1 in surface waters. The degree of wastewater and surface waters contamination by drug residues is assessed in conclusions of the work. Simultaneously, spontaneous degradation of selected drugs in water and removal efficiency of the wastewater treatment plant is assessed in conclusions of the work. The developed method is usable for monitoring and environmental analysis of water ecosystems. It is usable not only for selected drugs, but even for other organic compounds with similar properties.

KEYWORDS pharmaceuticals, drug residues, environment, aquatic environment, non-steroidal anti inflammatory drugs, analgesics, gas chromatography, two-dimensional gas chromatography, derivatization, solid phase extraction, wastewater, surface water

5

LACINA, P.: Využití plynové chromatografie s hmotnostně spektrometrickou detekcí pro posouzení kontaminace odpadních a povrchových vod rezidui léčiv. Brno: Vysoké učení technické v Brně, Fakulta chemická, 2012. 134 s. Vedoucí dizertační práce prof. RNDr. Milada Vávrová, CSc.

PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem dizertační práci vypracoval samostatně a že všechny použité literární zdroje jsem správně a úplně citoval. Dizertační práce je z hlediska obsahu majetkem Fakulty chemické VUT v Brně a může být využita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího práce a děkana FCH VUT.

…………………………. podpis studenta

Poděkování: Velmi rád bych na tomto místě poděkoval své školitelce prof. RNDr. Miladě Vávrové, CSc. za odborné vedení dizertační práce, cené rady, pomoc a akademické zázemí během celého doktorského studia. Velké díky patří také Ing. Ludmile Mravcové, Ph.D. za její ochotu, neustálou pomoc a rady během mých prací v laboratoři. V neposlední řadě chci také poděkovat všem svým kolegům, zaměstnancům a doktorandům UCHTOŽP za pomoc a podporu. Poděkování si velkou měrou zaslouží i všichni moji přátelé a především rodina, která stála neustále za mnou a podporovala mě během celého mého studia.

6

OBSAH

1. ÚVOD .................................................................................................................................... 9

2. TEORETICKÁ ČÁST ....................................................................................................... 10

2.1. Historie léčiv .................................................................................................................... 10

2.2. Léčiva – základní pojmy ................................................................................................. 11 2.2.1. Skupiny léčiv.............................................................................................................. 12

2.3. Analgetika ........................................................................................................................ 14 2.3.1. Historie léčby bolesti.................................................................................................. 15 2.3.2. Rozdělení analgetik .................................................................................................... 15

2.3.2.1. Analgetika-anodyna............................................................................................. 15 2.3.2.2. Analgetika-antipyretika....................................................................................... 15

2.3.3. Mechanismy účinku ................................................................................................... 19 2.3.3.1. Mechanismus účinku analgetik-anodyn .............................................................. 19 2.3.3.2. Mechanismus účinku analgetik-antipyretik ........................................................ 19

2.3.4. Vlastnosti vybraných léčiv ......................................................................................... 19

2.4. Spotřeba léčiv v ČR v posledních letech........................................................................ 26 2.4.1. Vývoj spotřeby vybraných léčiv v letech 2006 – 2010.............................................. 26 2.4.2. Spotřeba léčiv za rok 2009 a 2010 ............................................................................. 27

2.5. Biotransformace léčiv ..................................................................................................... 29

2.6. Léčiva v životním prostředí ............................................................................................ 30 2.6.1. Osud a cyklus léčiv v životním prostředí ................................................................... 32 2.6.2. Léčiva v ČOV a ve vodním prostředí......................................................................... 33 2.6.3. Ekotoxické účinky léčiv ............................................................................................. 35

2.7. Stanovení léčiv ve vodách ............................................................................................... 36 2.7.1. Aktivní (konvenční) vzorkování ................................................................................ 39

2.7.1.1. Odběry vzorků..................................................................................................... 39 2.7.1.2. Konzervace, doprava a skladování vzorků.......................................................... 42 2.7.1.3. Úprava vzorků před extrakcí ............................................................................... 42 2.7.1.4. Normy pro odběry vzorků odpadních a povrchových vod.................................. 43

2.7.2. Extrakce...................................................................................................................... 43 2.7.2.1. Extrakce tuhou fází – SPE................................................................................... 44

2.7.3. Chromatografické metody při stanovení reziduí léčiv ............................................... 48 2.7.3.1. Plynová chromatografie ...................................................................................... 49 2.7.3.2. Orthogonální komplexní dvojrozměrná plynová chromatografie s hmotnostně

spektrometrickou detekcí Time-of-Flight (GCxGC-TOF MS).......................... 52 2.7.4. Derivatizace................................................................................................................ 55

7

3. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST ............................................................................................. 58

3.1. Nastavení přístroje .......................................................................................................... 58

3.2. Optimalizace derivatizace vybraných analgetik pro GCxGC analýzu ...................... 59 3.2.1. Přístroje a zařízení ...................................................................................................... 59 3.2.2. Chemikálie a standardy .............................................................................................. 59 3.2.3. Retenční časy, charakteristické m/z a hmotnostní spektra......................................... 60 3.2.4. Výběr vhodnějšího derivatizačního činidla................................................................ 60 3.2.5. Optimalizace množství derivatizačního činidla ......................................................... 60 3.2.6. Optimalizace času a teplota derivatizace ................................................................... 60

3.3. Optimalizace účinnosti SPE ...........................................................................................61 3.3.1. Přístroje a zařízení ...................................................................................................... 61 3.3.2. Chemikálie a standardy .............................................................................................. 61 3.3.3. Účinnost SPE a její ovlivnění úpravou pH aplikovaného vzorku.............................. 61 3.3.4. Vliv množství aplikovaného vzorku na účinnost SPE ............................................... 62 3.3.5. Ověření účinnosti vybrané SPE metody na reálných vzorcích, vliv matrice ............. 62

3.4. Studium degradace vybraných léčiv ve vodném prostředí.......................................... 63

3.5. Stanovení vybraných léčiv v reálných vzorcích vod..................................................... 63 3.5.1. Velkokapacitní ČOV Brno – Modřice (technický popis)........................................... 63 3.5.2. Přístroje a zařízení ...................................................................................................... 64 3.5.3. Chemikálie a standardy .............................................................................................. 64 3.5.4. Použité postupy a metody .......................................................................................... 65

3.5.4.1. Odběr vzorků....................................................................................................... 65 3.5.4.2. Příprava vzorků a SPE......................................................................................... 66 3.5.4.3. Derivatizace......................................................................................................... 66 3.5.4.4. Analýza vzorků ................................................................................................... 66

4. VÝSLEDKY A DISKUZE................................................................................................. 67

4.1. Optimalizace derivatizace vybraných analgetik........................................................... 67 4.1.1. Retenční časy, charakteristické m/z a hmotnostní spektra......................................... 67 4.1.2. Zjištění vhodnějšího derivatizačního činidla.............................................................. 69 4.1.3. Optimalizace množství derivatizačního činidla ......................................................... 70 4.1.4. Optimalizace času a teploty derivatizace ................................................................... 71

4.2. Optimalizace účinnosti SPE ...........................................................................................73 4.2.1. Účinnost SPE a její ovlivnění úpravou pH................................................................. 73 4.2.2. Vliv množství aplikovaného vzorku na účinnost SPE ............................................... 74 4.2.3. Účinnost navržené metody ......................................................................................... 75 4.2.4. Ověření účinnosti vybrané SPE metody na reálných vzorcích, vliv matrice ............. 75

4.3. Studium degradace vybraných léčiv ve vodném prostředí.......................................... 76

4.4. Stanovení vybraných léčiv v reálných vzorcích vod..................................................... 78

8

4.4.1. Účinnost metody ........................................................................................................ 78 4.4.2. Opakovatelnost metody.............................................................................................. 78 4.4.3. Linearita, limity detekce a kvantifikace ..................................................................... 80 4.4.4. Koncentrace vybraných léčiv v reálných vzorcích..................................................... 81

4.4.4.1. Koncentrace vybraných léčiv v odpadní vodě .................................................... 81 4.4.4.2. Koncentrace vybraných léčiv v povrchové vodě ................................................ 86 4.4.4.3. Zhodnocení výskytu vybraných léčiv ve vodném prostředí................................ 91

4.4.5. Porovnání aplikované metody a získaných dat s jinými publikovanými údaji .......... 94

5. ZÁVĚR................................................................................................................................ 98

6. POUŽITÁ LITERATURA................................................................................................ 99

7. SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK............................................................................. 113

8. PŘÍLOHY ......................................................................................................................... 115

ŽIVOTOPIS.......................................................................................................................... 130

PUBLIKA ČNÍ ČINNOST ................................................................................................... 133

9

1. ÚVOD V posledních letech vzrostl zájem o léčiva i v souvislosti s možným negativním dopadem na životní prostředí. K tomu přispívá nejen vysoká produkce a spotřeba těchto látek ve světovém měřítku, ale také jejich nedostatečná likvidace systémy a technologiemi zpracovávajícími odpad a odpadní vody. Dochází tak k neustálému vylučování těchto látek do životního prostředí. Takto uvolněná léčiva nebo jejich metabolity mohou představovat ekotoxikologické riziko pro mnohé organismy [1]. Nejvíce zatíženou složkou životního prostředí z pohledu kontaminace rezidui léčiv je vodní prostředí. Důvodem je skutečnost, že lidský nebo zvířecí organismus dokáže využít pouze malou část účinných látek obsažených ve zkonzumovaných lécích. Zbylá nevyužitá část účinných látek je z organismu vyloučena spolu s výkaly a dostává se tak do odpadních vod a kanalizačního systému. Touto cestou se dostávají na čistírny odpadních vod (ČOV), kde dochází během čistících procesů pouze k částečnému odstranění těchto látek a spolu s vyčištěnou vodou tak vstupují do povrchových vod. Zde pak může dojít k jejich kumulaci a k nepříznivým vlivům na vodní organismy, protože se v mnoha případech jedná o látky biologicky aktivní. Mezi celosvětově nejvíce používané skupiny léčiv patří analgetika, především podskupina nesteroidních protizánětlivých látek (NSAID). V České republice se v roce 2009 pohybovala jejich spotřeba okolo 50 milionů balení a v roce 2010 okolo 46 milionů balení. Ačkoliv zatím nebylo prokázáno, že by tyto látky nesly pro životní prostředí takové riziko a zátěž, jako například hormonální léčiva nebo antibiotika, je zapotřebí jejich kontrole v různých složkách životního prostředí věnovat pozornost právě z důvodu jejich vysoké spotřeby, kterou prakticky nelze regulovat ani kontrolovat, a která rok od roku narůstá. Jedná se tedy o látky s kontinuálním vstupem do životního prostředí. Z těchto důvodů narůstá i potřeba aplikovat nové analytické metody, které s dostatečnou citlivostí dokáží kvalitativně i kvantitativně stanovit tyto látky i ve velmi nízkých koncentracích. Aplikace moderních analytických metod je nezbytná také pro zavádění nových čistících technologií na čistírnách odpadních vod, které jsou prakticky jedinou možností, jak zabránit nebo alespoň omezit vstup těchto látek do životního prostředí. Tato studie je zaměřena na vývoj a optimalizaci metody vhodné pro stanovení reziduí vybraných léčiv a jim chemicky podobných látek v odpadních a povrchových vodách. Jako cílové analyty byly vybrány látky kyselé povahy, a to převážně ze skupiny nesteroidních protizánětlivých látek (kyselina salicylová, kyselina acetylsalicylová, kyselina klofibrová, ibuprofen, paracetamol, kofein, naproxen, kyselina mefenamová, ketoprofen, diklofenak). Práce zahrnuje optimalizaci extrakce tuhou fází (SPE), optimalizaci derivatizace pomocí silylačních činidel a využití ortogonální dvojrozměrné plynové chromatografie s hmotnostně spektrometrickou detekcí Time-of-Flight (GCxGC-TOF MS) pro finální analýzu. Navzdory nutnosti derivatizovat vybraná léčiva nabízí tato technika, oproti LC primárně využívané při analýze reziduí léčiv, některé výhody, jakými jsou vysoká separační účinnost díky kapilárním kolonám, vysoká citlivost ve spojení s TOF MS a snadná identifikace látek pomocí rozsáhlých knihoven spekter. Analytická metoda navržená a optimalizovaná v této práci byla následně aplikována a ověřena na reálných vzorcích odpadních a povrchových vod.

10

2. TEORETICKÁ ČÁST

2.1. Historie léčiv [2] Používání různých látek k léčebným účelům doprovází lidstvo snad po celou jeho existenci. Nejstarší písemné záznamy pocházejí z Egypta a Číny a zachycují léčivé látky mnoha typů. V průběhu historie léčení prodělal způsob získávání léčiv a jejich aplikace rozsáhlý vývoj. Zatímco na jeho počátku byla léčiva a léčivé látky připravovány výhradně z přírodních zdrojů, na jeho konci, v současné době, jsou průmyslově vyráběna chemoterapeutika definovaného složení a účinku. Moderní chemoterapeutika, která v současné době představující většinu z používaných léčiv, jsou výsledkem racionálního výběru prováděného v rámci cíleného farmaceutického výzkumu. V historii léčiv lze rozlišit několik vývojových etap. První etapa se dá označit za etapu přírodních léčiv, kdy v průběhu několika tisíciletí bylo empiricky nashromážděno velké množství poznatků o účincích různých přírodních látek na lidský organismus. Jednalo se nejen o poznatky léčivé, ale také psychotropní, omamné, psychostimulační, toxikologické apod. Tato etapa, charakterizovaná výhradním používáním přírodních materiálů k přípravě léků, trvala v Evropě zhruba do 16. století. Počátky používání chemických léčiv jsou spojeny s rozvojem alchymie v období renesance. Z alchymie vyšel i Paracelsus, který předpokládal, že látky chemického původu jsou jako léčiva rovnocenné přírodním. Zdůrazňoval význam pozorování a experimentu, formuloval vztah mezi dávkou a toxicitou, a svým učením tak položil základy iatrochemie, předchůdkyně farmaceutické chemie. Iatrochemici zavedli do léčebné praxe používání anorganických látek, především kovů (rtuť) a jejich jednoduchých sloučenin (oxidů, sulfidů, solí). Na přelomu 18. a 19. století došlo k dalšímu pokroku v experimentální chemii, který umožnil izolaci řady organických látek obsažených v přírodním materiálu. Velkým přínosem pro rozvoj farmaceutické chemie byla izolace alkaloidu morfinu z opia, kterou provedl roku 1803 Sertürner. Mohutný a rychlý rozvoj chemie v průběhu 19. století dal vzniknout specializovnému farmaceutickému průmyslu. Průmyslově se začalo izolovat antimalarikum a antipyretikum chinin z kůry chininovníku. Objevila se první organická léčiva, pro jejichž struktury neexistuje v přírodě obdoba – inhalační anestetika diethylether a chloroform, sedativum a hypnotikum chloralhydrát, antipyretikum a analgetikum acetanilid antifebrin a mnohé další. V roce 1874 vypracovali Kolbe a Schmidt průmyslově schůdnou syntézu salicylové kyseliny, látky s antipyretickými účinky, která byla poprvé izolována již v roce 1838 z glykosidu salicinu obsaženého ve vrbové kůře. Za významný mezník ve vývoji chemických léčiv je považována Kmotrova syntéza antipyretika fenazonu. Jednalo se o zjednodušený analog chininu s antipyretickým účinkem. Tato představa, že stejnou či podobnou biologickou účinnost mohou mít i analoga matečné sloučeniny, znamenala počátek skutečného farmaceutického výzkumu. Snaha o zjednodušení struktury léčiv a jejich obměny vedla v řadě případů k rozpoznání tzv. nepostradatelného či esenciálního strukturního fragmentu molekuly, který určuje biologickou aktivitu látek. Ve 20. století dochází k rozvoji biochemie, která také významně ovlivnila vývoj léčiv. Umožnila vysvětlit podstatu transportu, distribuce a metabolismu léčiv v organismu a mechanismy jejich vylučování. Vznikl tak nový vědní obor zvaný farmakologie, který se zabývá vzájemnými interakcemi léčiva a organismu.

11

V 60. letech 20. století se objevily pokusy o korelaci biologické aktivity látek s jejich strukturou, označované jako QSAR (Quantitative Structure-Activity Relationships). Průkopníky byli C. Hansch, S. M. Free a J. W. Wilson. Předpoklad spočíval v tom, že v sériích strukturně podobných látek lze korelovat biologickou aktivitu těchto sloučenin s některými jejich kvantifikovatelnými fyzikálně-chemickými charakteristikami. Ačkoliv metody QSAR významně přispěly k vývoji mnoha biologicky aktivních látek, rozhodně nenaplnily původní naděje do nich vkládané. V 80. letech minulého století dochází k mohutnému nástupu výpočetní techniky, která umožňuje studovat prostorové integrace mezi ligandem (potenciálním léčivem) a receptorem. Tyto korelace jsou nazývané jako 3D-QSAR a mají lepší predikční schopnosti než klasické metody QSAR. V posledních letech se objevil zcela nový přístup k vyhledávání látek s biologickou aktivitou. Jde o kombinatoriální chemii, kterou se připravují tzv. chemické knihovny. Tato metodika umožňuje provést, neobyčejně rychle a s relativně nízkými náklady, syntézu a základní screening biologické aktivity stovek až desetitisíců sloučenin. Další z moderních trendů v medicinální chemii představují takové modifikace struktur známých léčiv, které vedou k podstatnému zlepšení farmakokinetických vlastností těchto látek. Může jít buď o přípravu vhodných poléčiv nebo o přípravu složitějších systémů „konstruovaných“ tak, aby se účinná látka uvolňovala převážně v cílové tkáni. V posledních desetiletích vývoj významně ovlivnil i farmaceutickou výrobu. V zájmu ochrany spotřebitele uzákonily všechny vyspělé státy závazná pravidla pro farmaceutickou výrobu, která nese název správná výrobní praxe. Cílem těchto opatření je minimalizovat riziko, že by se v důsledku selhání lidského faktoru, případně jinou nešťastnou souhrou okolností ve farmaceutické výrobě, dostal na trh lék nevyhovující kvality.

2.2. Léčiva – základní pojmy Jako léčivo (farmakum) může být definována kterákoliv substance, která svými fyzikálními nebo chemickými účinky vyvolává příznivé změny biologických funkcí organismu. Za tímto účelem jsou pak podávány a aplikovány v humánní i veterinární medicíně. Tento pojem rovněž zahrnuje léčivé látky a jejich směsi, léčivé přípravky, farmaceutické suroviny, meziprodukty a přísady používané k výrobě léků (pomocné látky) [3, 4, 5]. Léčivá látka Léčivá látka je látka nebo soustava látek, která má schopnost interagovat s lidským nebo živočišným organismem a výsledkem této interakce je poznání chorob, ochrana před nimi, mírnění příznaků onemocnění a jejich léčení. Tyto látky mohou být původu lidského, živočišného, rostlinného nebo chemického [6, 7]. Léčivými látkami jsou nejčastěji chemické substance s přesně definovanou strukturou (chemická individua), ale mohou jimi být i složité směsi různých látek, jejichž struktura nemusí být zcela přesně vymezena. To mohou být například předepsaným způsobem upravené suroviny přírodního původu, např. sušené části rostlin, silice, výtažky apod. [2, 8, 9]. Léčivá látka je součástí léčivého přípravku a způsobuje jeho léčivý účinek. Tento účinek je zpravidla farmakologický, imunologický nebo spočívá v ovlivnění metabolismu [10]. Léčivý přípravek Léčivým přípravkem je látka nebo kombinace látek, která má léčebné nebo preventivní vlastnosti v případě onemocnění lidí nebo zvířat, látka nebo kombinace látek, kterou lze

12

použít u lidí nebo zvířat, případně podat lidem či zvířatům, a to za účelem obnovy, úpravy nebo ovlivnění fyziologických funkcí prostřednictvím farmakologického, imunologického nebo metabolického účinku nebo za účelem stanovení lékařské diagnózy. Za léčivý přípravek se rovněž považuje látka nebo kombinace látek prezentovaná tak, že má léčebné nebo preventivní vlastnosti v případě onemocnění lidí nebo zvířat [7, 10]. Léková forma Vzhledem k tomu, že léčivou látku obvykle nelze z praktických důvodů pacientovi podávat, je třeba ji zpracovat do léčebného přípravku. To se děje přidáním různého množství pomocných látek a následným technologickým procesem, z něhož vyjde hotový výrobek, který je nakonec naplněn do obalu a připraven k podání pacientovi. V tomto případě se jedná už o konkrétní a konečnou podobu léčivého přípravku (např. tablety, kapky, čípky, injekce atd.), která vychází z toho, jakým způsobem bude přípravek užíván [2, 9]. Pomocné látky Pomocné látky jsou složky léčivých přípravků bez vlastního léčebného účinku. Mohou však příznivě ovlivňovat vlastnosti léčivých látek, umožňují nebo usnadňují výrobu, přípravu a uchovávání léčivých přípravků [2, 11]. Lék a zákon vzniku léku Všechna léčiva jsou potenciálními léky, kterými se stávají až v okamžiku, kdy jsou správným způsobem podány pacientovi. Tento proces je vyjádřen tzv. zákonem o vzniku léku, který uvádí, že léčivé látky jsou za pomoci vhodného technologického procesu a po smíchání s vhodnými pomocnými látkami upraveny na léčivý přípravek. Ve vhodném obalu a ve vhodný okamžik podání pacientovi se pak léčivý přípravek stává lékem schopným ovlivnit zdravotní stav pacienta [12].

Léčivá látka + pomocná látka → léčivý přípravek → lék 2.2.1. Skupiny léčiv [2] V současném lékařství se používá mnoho léčiv a farmaceutický průmysl denně produkuje značné množství těchto léčiv. Tento průmysl také přichází na trh s neustále novými výrobky, které se třídí do mnoha skupin podle jejich účinku. V následující části je uveden stručný přehled a charakteristika nejběžnějších skupin léčiv: • Analgetika

Analgetika jsou látky používané ke snížení až potlačení bolesti (řec. Analgetos = bezbolestný).

• Látky ovliv ňující CNS Centrální nervový systém (CNS) je část nervové soustavy zahrnující mozek a část

míchy a slouží jako centrum smyslového vnímání. Léčiva, která ovlivňují CNS, lze z hlediska účinku rozdělit do několika skupin:

� celková anestetika – potlačují šíření nervového vzruchu a navozují analgézii (stav bez bolesti), ztrátu vědomí, oslabení nebo ztrátu paměti, inhibici senzorických a autonomních reflexů,

� sedativa a hypnotika – způsobují zklidnění CNS, většinou doprovázenou i zmírněním stavů úzkosti,

� psychofarmaka – ovlivňují lidskou psychiku a používají se při léčení duševních poruch – psychóz,

� antiepileptika – používají se k léčbě epilepsie,

13

� aniparkinsonika – potlačují příznaky Parkinsonovy choroby, � antimigrenika – používají se pro potlačení silných záchvatů migrény.

• Léčiva ovlivňující vegetativní nervový systém Nervový systém spolu se systémem endokrinním kontrolují a integrují veškeré tělesné funkce. Vegetativní nervový systém je část nervového systému, která nepodléhá přímé kontrole. Léčiva vegetativního nervového systému lze rozdělit do čtyř základních skupin podle místa zásahu a způsobu účinku:

� adrenergika – vyvolávají v organismu stejnou odezvu jako katecholaminy (noradrenalin, adrenalin a dopamin),

� antiadrenergika – působí proti účinkům katecholaminů, � cholinergika – vyvolávají v organismu stejnou odezvu jako acetylcholin, � anticholinergika – působí proti účinkům acetylcholinu.

• Lokální anestetika a myorelaxancia Účinkem těchto léčiv je dočasné potlačení nebo úplná blokáda šíření nervového vzruchu reverzibilním zablokováním receptorů sodíkových kanálů v neuronálních membránách.

• Antialergika a antihistaminika Skupina léčiv, která potlačují alergické příznaky nebo přímo alergie.

• Léčiva oběhové soustavy Jedná se o léčiva, která upravují činnost oběhové soustavy např. při nedostatečném výkonu srdce, nepravidelné srdeční činnosti, arteroskleróze, trombóze apod. Patří mezi ně:

� hypolipidemika – léčiva, která svým působením snižují hladinu lipoproteidů v plazmě a používají se především při léčbě aterosklerózy,

� perorální antidiabetika – tyto látky různými mechanismy normalizují nebo redukují hladinu glukosy v krvi,

� léčiva ovlivňující srážlivost krve � vasodilatancia – způsobují dilataci koronárních i periferních tepen a tím

zlepšují prokrvení tkání a snižují krevní tlak bez významnějších změn průtoku krve,

� antihypertenziva – používají se ke snížení krevního tlaku, � léčiva ovlivňující činnost srdečního svalu

• Léčiva trávicí a vylučovací soustavy � antacida – látky neutralizující kyselinu chlorovodíkovou v žaludečních

šťávách; antiulceróza – látky používané při léčbě peptických vředů; cytoprotektiva – látky chránící buňky epitelu žaludeční sliznice,

� léčiva používaná k terapii jaterních poruch – tato skupina farmak se člení na látky stimulující tvorbu a vylučování žluče (cholagoga) a látky, které příznivě ovlivňují regeneraci jaterního parenchymu a používají se při hepatitidách nebo při poškození jater vyvolaných různými typy intoxikací (hepatoprotektiva),

� léčiva ovlivňující vylučování • Antitusika a expektorancia

Antitusika a expektorancia jsou léčiva ovlivňující funkce dýchacího traktu. � antitusika – látky tlumící kašlací reflex, � expektorancia jsou látky, které zlepšují vykašlávání a napomáhají tak

odstranit nadbytečný sekret z dýchacích cest,

14

• Látky používané k prevenci a terapii infekčních a parazitárních chorob Rozsáhlá a velmi používaná skupina léčiv, která působí jak preventivně proti infekcím, tak také potlačuje různé typy již vzniklých infekcí.

� dezinfekční látky a antiseptika – látky působící v závislosti na použité koncentraci buď bakteriostaticky nebo baktericidně,

� antibakteriální chemoterapeutika – léčiva používaná k léčení bakteriálních infekcí. K nejvýznamnějším patří sulfonamidy a chinolony.

� antimykotika – léčiva užívaná pro léčení různých typů onemocnění způsobených patogenními houbami,

� antimykobakteriální léčiva – léčiva užívaná pro léčbu mykobakterií způsobující závažná onemocnění jako např. tuberkulózu,

� antiprotozoární léčiva – léčiva působící proti prvokům, jednobuněčným organismům, které parazitují na teplokrevných živočiších a způsobují různá onemocnění,

� antibiotika – obvykle definovány jako látky produkované mikroorganismy, zasahující do růstu jiných mikroorganismů, tedy látky používané k léčbě onemocnění bakteriálního původu,

� antivirotika – látky používané k léčbě onemocnění virového původu, • Cytostatika

Jedná se o látky, které zpomalují nebo zastavují růst buněk, případně způsobují jejich destrukci a jsou proto používány k léčbě zhoubných nádorů. Léčba se označuje jako chemoterapie.

• Vitamíny Tyto látky se vyskytují v potravě jen v malých množstvích, avšak jsou nezbytné pro růst a zachování funkcí živočišného těla. Mají funkci biokatalyzátorů a jejich nedostatek v potravě má za následek různé funkční choroby. Vitamíny se často dělí do dvou základních skupin, na vitamíny rozpustné ve vodě a vitamíny rozpustné v tucích.

• Hormony Hormony jsou látky produkované žlázami s vnitřní sekrecí a vylučované do krevního oběhu. Žlázy s vnitřní sekrecí a jimi produkované hormony tvoří endokrinní systém, který řídí a ovlivňuje periferní tkáně a dále řadu funkcí v organismu (metabolismus, růst, reprodukci apod.). Hormony se dělí na následující tři skupiny:

� hormony – aminokyseliny � peptidové hormony � steroidní hormony

2.3. Analgetika Analgetika jsou léčiva, která s dostatečnou selektivitou snižují až potlačují pocit bolesti aniž by však výrazně ovlivňovaly smyslové vnímání, vědomí, motoriku apod. Mnohá analgetika vykazují též protizánětlivý a antipyretický účinek [2, 3]. Bolest je nepříjemný subjektivní vjem, který je nejčastěji pociťován jako reakce na děje spojené s poškozením orgánů a tkání. Méně často je důsledkem poškození nervu (bolest neuropatická) [5]. Přestože analgetika neléčí příčinu onemocnění způsobujícího bolest, jejich podání může významně napomáhat vlastnímu léčení tím, že snižují zátěž a stres organismu způsobené bolestí, zánětem a zvýšenou teplotou. Vzhledem k těmto vlastnostem jsou ve zdravotnictví hojně používána. Mnohé z nich často nebývají ani na lékařský předpis, což jejich používání

15

zvyšuje [2]. Stejně jako ostatní používaná léčiva se v nezměněné nebo metabolizované podobě mohou dostávat do životního prostředí.

2.3.1. Historie léčby bolesti [13] Historie léčby bolesti je stejně stará jako lidstvo samo. Lidstvo se odjakživa snažilo bránit bolesti všemi možnými způsoby. Nejstarším způsobem tlumení bolesti byla stimulace akupunkturních bodů. Z některých nálezů a kreseb pocházejících z doby kamenné se usuzuje, že člověk již v této době používal rybí kosti právě ke stimulaci některých míst na těle a tím tišil bolest. Tuto techniku tlumení bolesti přivedli k dokonalosti staří Číňané v 3. a 2. tisíciletí před naším letopočtem. Staří Řekové zase používali elektroléčbu bolesti, kdy revmatické bolesti kloubů léčili opakovanými elektrickými výboji úhoře Scriborinus longum. Základ léčby bolesti však tvořila již dlouho před naším letopočtem „farmakoterapie“. Prvními léky proti bolesti byly rostlinné výtažky a alkoholické nápoje. Prvním používaným lékem byla maková šťáva rozšířená normandskými obchodníky ze Sýrie. Znalost účinků opia měli i Řekové a Římané. Osobní lékař císaře Nerona vymyslel lék theriak, který se používal jak při nespavosti, tak při léčbě silné bolesti; jeho základní složkou bylo právě opium. Do Evropy se opium dostalo v období renesance. Na rozvoji jeho používání se významně podílel švýcarský lékař Paracelsus, který vynalezl opiovou tinkturu. V 18. a 19. století bylo opium dodáváno lékárníkům a lékařům jako lék proti bolesti a sedativum. V roce 1805 německý lékárník Serturner izoloval z opia bílý prášek, morfin, který se začal hojně používat k tišení bolestí. Díky těmto poznatkům a neustále se rozvíjející farmakologii pak následoval vývoj mnoha dalších léků tišících bolest.

2.3.2. Rozdělení analgetik Analgetika se dělí podle mechanismu účinku na silně účinná tzv. analgetika opioidní (anodyna) a na analgetika-antipyretika s mírnějšími účinky [2, 3, 14].

2.3.2.1. Analgetika-anodyna Tato skupina látek, často také označována jako opioidní či narkotická analgetika, tlumí bolest středně silné až silné intenzity. Kromě potlačení bolesti však tyto látky mohou ve vyšších koncentracích způsobovat také ospalost nebo ztrátu vědomí, a proto jejich označení narkotická. Jedná se o agonisty opioidních receptorů v mozku. Nejstaršími a nejznámějšími analgetiky tohoto druhu jsou přírodní morfiny izolované z opia. Hlavními nevýhodami všech narkotických analgetik je možnost vzniku závislosti na těchto látkách. S ohledem na možné zneužívání je výroba, distribuce a podávání prakticky všech těchto analgetik pod přísnou kontrolou [2, 5, 15]. Mezi přírodní látky této skupiny se řadí na prvém místě morfin a kodein. Jsou poměrně stále významnými prostředky pro tišení silných bolestí. Kodein má kromě analgetických účinků také schopnost potlačovat kašlací reflex. Hlavním zdrojem uvedených látek jsou suché prázdné makovice, ze kterých se izolují extrakcí [2].

2.3.2.2. Analgetika-antipyretika Léčiva této skupiny látek, označována též jako nenarkotická analgetika, se používají nejen k potlačení mírnějších bolestí a horečky, ale také jako prevence nebo k potlačení různých zánětů. Vykazují tedy kromě analgetického účinku rovněž i účinek antipyretický a protizánětlivý [2, 14].

16

Velkou část této skupiny farmak tvoří nesteroidní protizánětlivé látky (NSAID – Non-Steroidial Anti-Inflammatory Drugs). Jedná se o jedny z nejvíce aplikovaných látek. Jejich dalším poměrně frekventovaným synonymem je nesteroidní antirevmatika; důvodem je to, že častou indikací NSAID bývá revmatismus. V současnosti existuje několik desítek těchto látek, z nichž asi dvacet tvoří hlavní komponenty stovek hromadně vyráběných léčivých přípravků tlumících bolest; řada z nich se používá k léčbě revmatických onemocnění i k tlumení bolesti u dny. Existuje i mnoho kombinovaných přípravků, kde i adjuvantní lék může nejen příznivě ovlivnit terapeutický účinek, ale i zesílit nežádoucí účinky [2, 14, 16]. Z hlediska chemické struktury lze nenarkotická analgetika rozdělit na deriváty anilinu, deriváty kyseliny salicylové, deriváty kyseliny anthranilové, deriváty 2-arylalkanových kyselin, různé typy neolizujících oxoheterocyklických sloučenin (deriváty pyrazolonu a pyrazolidindionu či novější oxikamy) a další [2].

Tabulka 1: Přehled nesteroidních protizánětlivých látek [3] paracetamol anilinové deriváty

propacetamol celekoxib

nabumeton nimesulid

alkalony, koxiby, sulfoanilidy

rofekoxib bromfenak diklofenak

indometacin lonazolak sulindak tolmetin

deriváty kyseliny octové

tropensin dexibrufen flurbiprofen fenoprofen ibuprofen

ketoprofen kys. niflumová

deriváty kyseliny propionové

kys. tiaprofenová diflunisal

cholinsalicylát kys. acetylsalicylová

deriváty kyseliny salicylové

lysinsalicylát etofenamát

kys. flufenamová kys. mefenamová

fenamáty

kys. tolfenamová meloxikam lornoxikam piroxikam

oxikamy

tenoxikam azapropazon

dipyron kebuzon klofezon

nest

eroi

dní p

rotiz

áně

tlivé

látk

y

pyrazolidiny

propyfenazon

17

2.3.2.2.1. Deriváty anilinu Prvním terapeuticky využívaným derivátem anilinu byl acetanilid (N-fenylacetamid), jehož léčivý přípravek je známý pod názvem ANIFEBRIN. Tento preparát však byl z praxe vyřazen pro řadu vedlejších účinků, jako jsou methemoglobinémie a poškozování ledvin. Později se ukázalo, že lepší antipyretické účinky a současně i nižší toxicitu má N-(4-hydroxyfenyl)acetamid, na který je acetanilid v organismu metabolizován. Pod názvem paracetamol (PARALEN, PANADOL) se stal v současnosti jedním z nejpoužívanějších analgetik a antipyretik [2]. 2.3.2.2.2. Deriváty kyseliny salicylové [2] Kyselina salicylová (2-hydroxybenzoová kyselina) a její deriváty jsou účinná antipyretika s mírnými analgetickými a protizánětlivými účinky. Salicylová kyselina je ve formě glykosidu salicinu obsažena ve vrbové kůře. Odvary z ní se používaly v lidovém léčitelství k potlačování horečky. Kyselina salicylová se v dnešní době aplikuje v omezené míře, většinou ve formě solí. Nejrozšířenějším derivátem kyseliny salicylové je kyselina acetylsalicylová (2-acetoxybenzoová kyselina), známá především pod názvem ASPIRIN, ACYLPYRIN. Jedná se o antipyretikum a analgetikum první volby, volně dostupné na trhu. Ve vyšších dávkách vykazuje rovněž protizánětlivé účinky. Má však také nežádoucí vedlejší účinky projevující se např. drážděním GIT, snížením srážlivosti krve a zvýšenou krvácivostí. Nežádoucí účinky na GIT se proto potlačují podáváním acetylsalicylové kyseliny v tlumivé (pufrové) formě, např. ve směsi s uhličitanem vápenatým (ANOPYRIN) nebo ve formě hlinité soli jako aloxipirin (SUPERPYRIN). Dalším významným derivátem karboxylové kyseliny je diflunisal (2’,4’-difluor-4-hydroxy-(1,1’-bifenyl)-3-karboxylová kyselina), který je obsažen v léčivu s názvem DOLBID. Má vyšší protizánětlivé a analgetické účinky než kyselina acetylsalicylová, avšak nemá obvyklou antipyretickou účinnost. 2.3.2.2.3. Deriváty kyseliny anthranilové (fenamáty) Analgetické a protizánětlivé účinky převažují především u N-fenylderivátů anthranilové kyseliny (fenamátů). Vykazují však nežádoucí vedlejší účinky na GIT, což brání jejich většímu rozšíření. Mezi nejznámější deriváty patří kyselina mefenamová (N-(2,3-dimethylfenyl)anthranilová kyselina; MEFENACID, PARKEMED), kyselina meklofenamová (N-(2,6-dichlor-3-methylfenyl)anthranilová kyselina, MECLOMEN) a kyselina flufenamová (N-(3-trifluormethylfenyl)anthranilová kyselina, ANSATIN, MERALEN) [2]. 2.3.2.2.4. Arylalkanové kyseliny [2] Jedním z prvních zástupců arylalkanových kyselin byl indomethacin ([1-(4-chlorbenzoyl)-5-methoxy-2-methylindol-3-yl]octová kyselina), aplikovaný do přípravků INDREN, INDOMET, METINDOL. Do klinické praxe byl zaveden v r. 1963 a v současnosti patří k nejrozšířenějším protizánětlivým látkám. Především bývá používán jako účinná látka v celé řadě přípravků pro zevní aplikace (masti a gely) používaných při bolestech pohybového aparátu (ELMETACIN, INDOBENE). Mezi nejvýznamnější antiflogistikum typu aryloctové kyseliny patří diklofenak (2-[(2,6-dichlorfenyl)amino]benzenoctová kyselina) se silnými protizánětlivými

18

a analgetickými účinky. Známé přípravky obsahující diklofenak jako účinnou látku jsou VOLTAREN nebo DOLMINA. V průběhu posledních 30 až 40 let se nejvíce používanými analgetiky a antiflogistiky staly látky strukturního typu 2-arylpropanové kyseliny. Z těchto farmak je nejvíce používaný ibuprofen ((±)-2-(4-isobuthylfenyl)propanová kyselina), na trhu uváděný také jako BRUFEN, BRUFALGIN, DOLGIT, IBALGIN nebo NUROFEN. Díky své nízké toxicitě a minimálním nežádoucím vedlejším účinkům na GIT je volně prodejným léčivem. Analogické využití jako ibuprofen má i naproxen ((+)-(S)-2-(6-methoxynaftalen-2-yl)propanová kyselina). Z přípravků obsahujících naproxen lze uvést např. NAPROSYN nebo NAXEN. Z dalších arilpropanových kyselin uvedených do klinické praxe lze uvést např. ketoprofen ((±)-2-(3-benzoylfenyl)propanová kyselina), známý také jako KETOFEN, MEPROFEN, ORUDIS, piprofen ((±)-2-[(3-chlor-4-(2,5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl)fenyl]propanová kyselina; RENGASIL), suprofen ((±)-2-(5-benzoylthien-2-yl)propanová kyselina; SUFENIDE, SUPROL) a tiaprofenovou kyselinu ((±)-2-(5-benzoylthien-2-yl)propanová kyselina; SARGAM, SURGAM). 2.3.2.2.5. Deriváty pyrazolonu a pyrazolidindionu Prvním léčivem z této řady byl fenazon (2-fenyl-1,2-dihydro-1,5-dimethyl-pyrazon-3(3H)-on; ANTIPYRIN), který byl po celá desetiletí hojně používaným a oblíbeným antipyretikem a analgetikem. Od fenazonu byla odvozena i celá řada dalších analgetik a antipyretik, od jejichž používání se však již většinou upouští, z důvodu jejich potvrzené toxicity. Dosud se ještě aolikuje metamizol (monohydrát sodné soli [N-(2-fenyl-2,3-dihydro-1,5-dimethyl-3-oxo-1H-pyrazol-4-yl)-N-methylamino]methansulfonové kyseliny; NOVALGIN, NOVAMISULFON) [2]. 2.3.2.2.6. Oxikamy Jedná se o poměrně novou skupinu nesteroidních protizánětlivých látek zavedenou do klinické praxe koncem 70. let minulého století. Nejvýznamnějšími představiteli jsou piroxikam (4-hydroxy-2-methyl-N-(pyridin-2-yl)-2H-benzothiazin-3karboxamid-1,1-dioxid; ARTHREMIN, FELDEN, REUMADOR), isoxikam (4-hydroxy-2-methyl-N-(5-methylisoxazol-3-yl)-2H-benzothiazin-3-karboxamid-1,1-dioxid; MOXIKAM) a tenoxikam (4-hydroxy-2-methyl-N-(pyridin-2-yl)-2H-thieno-[2,3-e]-1,2-thiazin-3-karboxamid-1,1-dioxid; DOLMEN, LIMAN, MOBIFLEX, TILCOTIL) [2]. 2.3.2.2.7. Inhibitory cyklooxygenázy-2 [2] Tato skupina představuje poslední generaci protizánětlivých látek s účinkem lokalizovaným pouze v místě zánětu. Klasickou účinnou látkou této skupiny je nimesulid (N-(4-nitro-2-fenoxyfenyl)methansulfonamid), známý také pod názvy GOLIDE, COXTRAL, EUDOLENE, FOLID, MESULID, NIMESIL. Velmi populární se staly i modernější látky selektivně inhibující cyklooxygenázu-2 (COX-2), označované jako cosiny. První účinnou látkou z této skupiny byl celecoxib (4-[5-(4-methylfenyl)-3-trifluormethyl-1H-pyrazol-1-yl]benzensulfonamid; CELEBREX). Nejnovějším selektivním inhibitorem COX-2 je lumiracoxib (2-[(2-chlor-6-fluorfenyl)amino]-5-methylbenzenoctová kyselina; PREXIGE).

19

2.3.3. Mechanismy účinku 2.3.3.1. Mechanismus účinku analgetik-anodyn Analgetika-anodyna ovlivňují specifické µ-opioidní receptory pro v těle přirozeně se vyskytující peptidy, tzv. vnitřní opiáty (endorfiny, enkefaliny a dynorfiny), které jsou umístěny roztroušeně v míše a v různých částech mozku. Analgetika-anodyna napodobují účinek těchto přirozených vnitřních opiátů a tím stimulují zmíněné opioidní receptory. Výsledkem vazby analgetik-anodyn na opioidní receptory je účinné blokování převodu bolestivých impulsů a navození psychického stavu, charakterizovaného jako blažený klid. Na rozdíl od jiných toxikomanicky zneužívaných látek mají tyto opiáty sedativní, tlumivé účinky, naopak podráždění a agresivní projevy se po jejich aplikaci vyskytují vzácně [17, 18]. 2.3.3.2. Mechanismus účinku analgetik-antipyretik Podstatou účinku je inhibice enzymu cyklooxygenázy, která je součástí většího enzymového komplexu nazývaného prostaglandin-syntetáza. Tento enzymový komplex katalyzuje syntézu prostaglandinů z výchozího substrátu – kyseliny arachidonové. Tato nenasycená mastná kyselina tvoří přirozenou součást lipidů buněčných membrán a je výchozím zdrojem pro syntézu prostaglandinů i leukotrienů, které společně tvoří skupinu ikosnaoidů, což jsou tkáňové hormony důležité pro přenos zánětlivých a imunitních reakcí. Prostaglandiny jsou vytvářeny v ohnisku zánětu a jsou zdrojem lokálních projevů zánětu, jako je hypermie, otok, zvýšená teplota, bolestivost apod. Účinné látky těchto NSAID fungují jako inhibitory syntézy prostaglandinů a mohou tak mírnit převod bolestivých impulzů na úrovni CNS. Centrální mechanismus účinku těchto látek se však uplatňuje hlavně při potlačení horečky a je dán jejím zásahem do termoregulační zóny umístěné v hypotalamu [2, 17]. 2.3.4. Vlastnosti vybraných léčiv

Kyselina salicylová

� 2-hydroxybenzoová kyselina � C7H6O3 � Mr = 138,12 � CAS 69-72-7

Bílý, téměř krystalický prášek nebo bílé případně bezbarvé jehlicovité krystalky. Těžce rozpustná ve vodě, snadno rozpustná v 96% ethanolu, mírně rozpustná v dichlormethanu [15].

20

CHARAKTERISTIKA: Kyselina salicylová je jedním z metabolických produktů kyseliny acetylsalicylové (aspirin viz. dále). Tělo si ji však dokáže vyrobit i samo, pokud konzumujeme velké množství ovoce a zeleniny, a to pravděpodobně z kyseliny benzoové, která je bohatě zastoupena právě v ovoci a zelenině. V ovoci a zelenině jsou přítomny i methylsalicyláty, ze kterých může v průběhu metabolických procesů vzniknout kyselina salicylová. Dále jsou v přírodě salicyláty obsaženy např. ve vrbových kůrách (vrba bílá) nebo kůrách břízy. Některé studie tvrdí, že salicyláty mohou vznikat i z huminových kyselin, kdy některé z nich mohou být prekurzory právě pro salicyláty nebo přímo kyselinu salicylovou. PŘÍPRAVKY (k dostání v ČR): ALPICORT, BELOSALIC, BETACORTON S, DIPROSALIC, DUOFILM, HERBADENT, KERASAL, MOBILAT, MOMESALIC, ONDŘEJOVA MAST, PYRALVEX, SALOXYL, SOPHTAL-POS N, SPOFAPLAST, TRAMCINOLON, URGOCOR, VERRUCA REMOVAL, VERRUMAL [19].

Kyselina acetylsalicylová

� 2-acetoxybenzoová kyselina � C9H8O4 � Mr = 180,16 � CAS 50-78-2

Bílý nebo téměř bílý krystalický prášek nebo bezbarvé krystaly. Těžce rozpustná ve vodě, snadno rozpustná v 96% ethanolu [15]. CHARAKTERISTIKA: Kyselina acetylsalicylová (zkratka ASA, synonymum aspirin) byla po mnoho desetiletí hojně používána jako protizánětlivá látka. Patří k nejstarším, ale stále velmi široce používaným NSAID. Je považována za klasický standard, s nímž je obvykle porovnávána analgetická, antipyretická i protizánětlivá účinnost ostatních NSAID [3]. V denních dávkách do 3 g mírné až středně silné analgetikum, s antipyretickými účinky, ve vyšších dávkách (nad 4–6 g denně) působí jako nesteroidní protizánětlivý lék (antirevmatikum). Vedle toho brání shlukování krevních destiček, čímž na jedné straně zvyšuje riziko krvácení, na druhé straně brání vzniku krevních sraženin v tepnách [20]. POUŽITÍ: Používá se k tlumení bolestí různého původu a ke snížení zvýšené teploty. Na doporučení lékaře ji lze použít jako prevenci vzniku krevních sraženin v cévách (snižuje riziko vzniku infarktu myokardu) [20].

21

PŘÍPRAVKY (k dostání v ČR): ACIFEIN, ACYLCOFFIN, ACYLPYRIN, AGGRENOX, ALKA-SELTZER, ALNAGON, ANOPYRIN, ASPIRIN, EXCEDRINIL, GODSAL, NEO-CEPHYL, TOMAPYRIN, UPSARIN C [19]. Kyselina klofibrová

� 2-(4-Chlorofenoxy)-2-methylpropanová kyselina � C10H11ClO3 � Mr = 214,65 � CAS 882-09-7

CHARAKTERISTIKA: Jedná se o biologicky aktivní metabolit klofibrátu, který byl součástí skupiny fibrátů. Tyto látky snižují hladinu tuků a cholesterolu v krvi. Protože bylo zjištěno, že klofibrát zvyšoval celkovou mortalitu dlouhodobě léčených pacientů, bylo od jeho používání upuštěno [16]. V současné době se u nás už nepoužívá, ale je součástí ještě některých zahraničních přípravků. V této práci je však zahrnut z důvodu svého značného používání v minulosti a také vzhledem k poměrně velkému poločasu rozpadu v přírodě, který se uvádí až 21 let. PŘÍPRAVKY (zahraniční): NORMALIT, ATROMID S, ATROMIDIN Ibuprofen

� (2RS)-2-(4-isobuthylfenyl)propanová kyselina � C13H18O2 � Mr = 206,28 � CAS 15687-27-1

Bílý nebo téměř bílý krystalický prášek nebo bezbarvé krystaly. Prakticky nerozpustný ve vodě, snadno rozpustný v acetonu, v methanolu a v dichlormethanu. Rozpustný ve zředěných roztocích alkalických hydroxidů a uhličitanů [15].

22

CHARAKTERISTIKA: Jednoduchý derivát fenylpropionové kyseliny. Vzhledem ke svým dobrým antipyretickým účinkům je vhodný při léčbě horečnaté onemocnění různé etiologie a to nejen u dospělých, ale také u dětí [3]. Ve vyšších dávkách (okolo 2400 mg denně) má protizánětlivý účinek odpovídající 4g kyseliny acetylsalicylové. Při nižších dávkách má pouze analgetický účinek. V těchto dávkách je volně prodejný pod různými názvy [9]. POUŽITÍ: Používá se u bolestí různého původu a lokalizace (bolesti zubů, hlavy, svalů, bolesti v zádech, bolesti při menstruaci, bolesti doprovázející zánětlivá onemocnění, bolesti vzniklé v souvislosti s úrazem). Lze jej použít (často v kombinaci s pseudoefedrinem) i u bolestí doprovázejících chřipku a nachlazení, protože vedle analgetického účinku současně snižuje zvýšenou tělesnou teplotu, pseudoefedrin zlepšuje příznaky rýmy a ucpaného nosu [20]. PŘÍPRAVKY (k dostání v ČR): ADVIL FORTE, APO-IBUPROFEN, BRUFEN, DOLGIT, IBALGIN, IBUBERAL, IBUDOLOR, IBU-HEPA, IBUMAX, IBUPROFEN, IBURION, MODAFEN, NUROFEN, PANAFEN, PEDEA [19]. Paracetamol (acetaminofen)

� N-(4-hydroxyfenyl)acetamid � C8H9NO2 � Mr = 151,16 � CAS 103-90-2

Bílý nebo téměř bílý krystalický prášek. Mírně rozpustný ve vodě, snadno rozpustný v 96% ethanolu, velmi těžce rozpustný v dichlormethanu. CHARAKTERISTIKA: Spolu se svým biologickým prekurzorem propacetamolem je v současnosti jediným používaným anilinovým derivátem [19]. Představuje účinné analgetikum–antipyretikum, působící proti bolestem malé až střední intenzity, snižuje horečku. Je srovnatelný s účinností kyseliny acetylsalicylové, avšak postrádá účinek protizánětlivý. Nepoškozuje žaludeční sliznici a neovlivňuje krevní srážlivost. Nevyvolává obávaný Reyeův syndrom [20]. POUŽITÍ: Používá se k tlumení bolestí různého původu (bolesti hlavy, zubů, kloubů, svalů, bolesti doprovázející revmatická onemocnění, neuralgie, bolesti páteře, menstruační bolesti) a ke snížení zvýšené teploty [20]. PŘÍPRAVKY (k dostání v ČR): ACIFEIN, ATARALGIN, BEN-U-RON, COLDEREX, DALERON, DORETA, EFFERALGAN, EXCEDRINIL, FEBRISAN, FERVEX, GRIPPOSTAD, HUMEN COLD, KORYLAN, MEDIPYRIN, MEXALEN, PANADOL, PARALEN, PARAMAX,

23

PARAMEGAL, PERFALGAN, SARIDON, SOLPADEINE, SPASMOPAN, TALVOSILEN, TOMAPYRIN, TRIGRIP, ULTRACOD, VALETOL, ZALDIAR [19].

Kofein

� 1,3,7-trimethyl-3,7-dihydro-2H-purin-2,6,(1H)-dion � C8H10N4O2 � Mr = 194,19 � CAS 58-08-2

Bílý nebo téměř bílý krystalický prášek nebo hedvábné bílé nebo téměř bílé krystaly. Mírně rozpustný ve vodě, snadno rozpustný ve vroucí vodě, těžce rozpustný v 96% ethanolu. Rozpouští se v koncentrovaných roztocích alkalických benzoanů a salicylanů. Snadno sublimuje [15]. CHARAKTERISTIKA: Kofein je velice rozšířený alkaloid především díky tomu, že příznivě stimuluje CNS. Z farmaceutického hlediska je řazený do skupiny metylxantianů (methylových derivátů xanthianu); v mnoha případech se používá jako adjuvantní (pomocná) látka do mnoha analgeticko-antipyretických a jiných směsí obsažených v léčivech, protože napomáhá rychlejšímu nástupu účinků [3]. Je součástí PŘÍPRAVKŮ (k dostání v ČR): ACIFEIN, ACYLCOFFIN, ALNAGON, ATARALGIN, COLDREX TABLETY, EXCEDRINIL, GRIPPOSTAD, KINEDRYL, NEO-CEPHYL, PANADOL EXTRA, PANADOL ULTRA, PARALEN EXTRA PROTI BOLESTI, SARIDON, SOLPADEINE, TOMAPYRIN, TRIGRIP, VALETOL [19].

Naproxen

� (2S)-2-(6-metoxynaftalen-2-yl)propanová kyselina � C14H14O3 � Mr = 230,26 � CAS 22204-53-1

24

Bílý nebo téměř bílý krystalický prášek. Prakticky nerozpustný ve vodě, dobře rozpustný v 96% ethanolu a v methanolu [15].

Derivát propionové kyseliny. Velmi používaný především v USA, Skandinávii a Velké Británii. Používá se především při léčbě chronických zánětlivých revmatických chorob [21]. CHARAKTERISTIKA: Nnesteroidní antiflogistikum používané pro omezení střední až silné bolesti, horečky a zánětu, způsobených celou řadou nemocí včetně osteoartrózy, revmatoidní artritidy, a dny. POUŽITÍ: Používá se jak celkově, tak lokálně u bolestí různého původu a lokalizace (bolesti zubů, hlavy, svalů, bolesti v zádech, bolesti při menstruaci – dysmenorea, bolesti doprovázející zánětlivá onemocnění, bolesti vzniklé v souvislosti s úrazem). Lze jej použít i u bolestí doprovázejících chřipku a nachlazení, protože současně snižuje zvýšenou tělesnou teplotu [20]. PŘÍPRAVKY (k dostání v ČR): ALEVE, EMOXEN, NALGESIN [19]. Kyselina mefenamová

� 2-[(2,3-dimethylfenyl)amino]benzoová kyselina � C15H15NO2 � Mr = 241,28 � CAS 61-68-7

Bílý nebo téměř bílý mikrokrystalický prášek. Prakticky nerozpustná ve vodě, těžce rozpustná v 96% ethanolu a v dichlormethanu. Rozpouští se ve zředěných roztocích alkalických hydroxidů. Je polymorfní [15]. CHARAKTERISTIKA: Jedná se o derivát kyseliny N-fenylanthranilové. Léčiva patřící do této skupiny jsou účinná analgetika a antiflogistika, ale jejich nevýhodou je relativně častější výskyt i závažnějších nežádoucích účinků, které byly pozorovány právě u kyseliny mefenamové. Proto se spíše doporučuje používat fenamáty, než samotnou kyselinu mefenamovou, a to pouze ke zvládnutí akutních bolestivých stavů. V ČR se kyselina mefenamová již víceméně nepoužívá a byla nahrazena kyselinou tolfenamovou. PŘÍPRAVKY (zahraniční): MECLOMEN, PONSTEL

25

Ketoprofen

� (2RS)-2-(3-benzoylfenyl)propanová kyselina � C16H14O3 � Mr = 254,28 � CAS 22071-154

Bílý nebo téměř bílý krystalický prášek. Prakticky nerozpustný ve vodě, snadno rozpustný v acetonu, v 96% ethanolu a v dichlormethanu [15]. CHARAKTERISTIKA: Derivát kyseliny propionové. Je vhodný zejména u zánětlivých revmatických chorob, které nejsou příliš aktivní nebo u mimokloubních forem revmatických chorob. Používá se jak celkově, tak lokálně [3, 21]. PŘÍPRAVKY: FASTUM, KETONAL, PROFENID, PRONTOFLEX [19]. Diklofenak, sodná sůl

� Natrium-{2-[(2,6-dichlorfenyl)amino]fenyl}acetát � C14H10Cl2NNaO2 � Mr = 318,13 � CAS 15307-79-6

Bílý nebo slabě nažloutlý, krystalický, slabě hygroskopický prášek. Mírně rozpustný ve vodě, snadno rozpustný v methanolu, dobře rozpustný v 96% ethanolu, těžce rozpustný v acetonu. Taje při asi 280 °C za rozkladu [15]. CHARAKTERISTIKA: Derivát fenyloctové kyseliny. Spolu s ibuprofenem patří mezi nejrozšířenější analgetikům v Evropě [21]. Má středně silné protizánětlivé, dobré analgetické a mírné antipyretické účinky. Terapeuticky je vhodný při akutních svalových bolestech a lze jej rovněž použít jako

26

běžné analgetikum [3]. Používá se jak perorálně, tak ve značné míře i jako lokální protizánětlivá látka. PŘÍPRAVKY (k dostání v ČR): ALMIRAL, APO-DICLO, DICLOFEN, DICLOFENAC, DICLOREUM, DOLMINA, DOROSAN, MONOFLAM, MYOGIT, NEODPOLASSE, OLFEN, UNO, VERAL, VOLTAREN [19].

2.4. Spotřeba léčiv v ČR v posledních letech Veškerá data použitá pro zpracování následujících grafů týkajících se spotřeby léčiv v posledních letech byla čerpána z webových stránek Státního úřadu pro kontrolu léčiv, sekce Dodávky a jiná hodnocení [22]. Zpracované údaje jsou zaměřeny především na skupinu analgetik a nesteroidních protizánětlivých látek. Všechna uvedená hodnocení obsahují informace vyplývající z hlášení dodávek léčivých přípravků do lékáren a dalších zdravotnických zařízení. Informace tedy obsahují výhradně údaje z hlášení distributorů. Nejedná se o reálnou spotřebu léků pacienty, ani zde nejsou uvedena data, která by popisovala konkrétní výdeje pacientům. 2.4.1. Vývoj spotřeby vybraných léčiv v letech 2006 – 2010 V následujících grafech (obr. 1) je uveden průběh spotřeby léčiv v letech 2006 – 2010. Grafy znázorňují spotřebu v počtu balení za jednotlivé roky.

K. salicylová

28 000

30 000

32 000

34 000

36 000

38 000

40 000

2006 2007 2008 2009 2010

rok

poče

t bal

ení

K. acetylsalicylová

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

14,0

2006 2007 2008 2009 2010

rok

poče

t bal

ení

(mil)

Ibuprofen

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

14,0

16,0

2006 2007 2008 2009 2010

rok

poče

t bal

ení

(mil)

Paracetamol

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

2006 2007 2008 2009 2010

rok

poče

t bal

ení

(mil)

Naproxen

0

100 000

200 000

300 000400 000

500 000

600 000

700 000

800 000

2006 2007 2008 2009 2010

rok

poče

t bal

ení

Ketoprofen

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2006 2007 2008 2009 2010

rok

poč

et b

alen

í (m

il)

27

Diklofenak

2,02,53,03,54,04,55,05,56,0

2006 2007 2008 2009 2010

rok

poč

et b

alen

í (m

il)

Obrázek 1: Grafy znázorňující průběh spotřeby jednotlivých léčiv (počet balení) v letech 2006 – 2010 2.4.2. Spotřeba léčiv za rok 2009 a 2010

Spotřeba léčiv za rok 2009 V následující dvojici grafů jsou uvedeny spotřeby léčiv v počtu balení za rok 2009. První graf (obr. 2) znázorňuje spotřebu 20 nejvíce užívaných skupin léčiv v ČR, z nichž analgetika a nesteroidní protizánětlivé látky jsou spojeny do jedné skupiny. Hodnoty jsou uvedeny v milionech balení za rok. Druhý graf (obr. 3) znázorňuje spotřebu vybraných účinných látek ze skupiny analgetik a NSAID.

19 5,88

18 5,9117

6,4516 6,54

15 6,92

14 6,93

13 7,01

12 7,13

11 7,62

10 7,68

9 7,70

8 8,37 7

9,07 6 10,44

5 11,48

4 12,01

3 15,21

216,47

1 50,01

Obrázek 2: Spotřeba (počet balení v mil) 19 nejpoužívanějších skupin léčiv v ČR za rok 2009. 1 – analgetika a NSAID, 2 – léčiva ovlivňující renin-angiotenzinový systém, 3 – krevní náhrady, infuzní a perfuzní roztoky, 4 – antibakteriální léčiva pro systémovou aplikaci, 5 – psycholeptika, 6 – léčiva proti nachlazení a kašli, 7 - β-blokátory, 8 – vazoprotektiva, venofarmaka, 9 – léčiva ovlivňující hladinu lipidů, 10 – nosní léčiva, 11 – léčiva k terapii diabetu, 12 – blokátory kalciových kanálů, 13 – diuretika, 14 – léčiva k terapii onemocnění spojených s poruchou acidity, 15 – psychoanaleptika, 16 – antikoagulancia, antitrombotika, 17 – oftalmologika, 18 – léčiva k terapii onemocnění spojených s obstrukcí dýchacích cest, 19 – fytofarmaka a živočišné produkty

28

K. acetylsalicylová 8,76

Paracetamol20,76

Ibuprofen12,06

Diklofenak4,11

Naproxen0,52

Ketoprofen1,00

Ostatní2,78

K. salicylová0,04

Obrázek 3: Spotřeba vybraných léčiv (počet balení v mil) ze skupin analgetik a NSAID za rok 2009.

Spotřeba léčiv za rok 2010 V následující dvojici grafů jsou uvedeny spotřeby léčiv v počtu balení za rok 2010. První graf (obr. 4) znázorňuje spotřebu 20 nejvíce užívaných skupin léčiv v ČR, z nichž analgetika a nesteroidní protizánětlivé látky jsou spojeny do jedné skupiny. Hodnoty jsou opět uvedeny v milionech balení za rok. Druhý graf (obr. 5) znázorňuje spotřebu vybraných účinných látek ze skupin analgetik a NSAID.

1 46,45

217,74

3 11,51

411,435

11,376

9,87

79,24

88,28

98,04

107,95

11 7,90

12 7,29

137,18

14 7,09

15 6,94

16 6,60

176,50

18 6,24

195,48

Obrázek 4: Spotřeba (počet balení v mil) 19 nejpoužívanějších skupin léčiv v ČR za rok 2010. 1 – analgetika a NSAID, 2 - léčiva ovlivňující renin-angiotenzinový systém, 3 – antibakteriální léčiva pro systémovou aplikaci, 4 – krevní náhrady, infuzní a perfuzní roztoky, 5 – psycholeptika, 6 – léčiva proti nachlazení a kašli, 7 - β-blokátory, 8 – léčiva k terapii diabetu, 9 – vazoprotektiva, venofarmaka, 10 – léčiva ovlivňující hladinu lipidů, 11 – nosní léčiva, 12 – psychoanaleptika, 13 – léčiva k terapii onemocnění spojených s poruchou acidity, 14 – diuretika, 15 – blokátory kalciových kanálů, 16 – oftalmologika, 17 – antikoagulancia, antitrombotika, 18 – léčiva k terapii onemocnění spojených s obstrukcí dýchacích cest, 19 – pohlavní hormony a modulátory genitálního systému

29

K. acetylsalicylová 7,96

Paracetamol 19,20

Ibuprofen 10,81

Diklofenak 4,09

Naproxen0,46

Ketoprofen 0,91

Ostatní 2,98

K. salicylová 0,04

Obrázek 5: Spotřeba vybraných léčiv (počet balení v mil) ze skupin analgetik a NSAID za rok 2010.

2.5. Biotransformace léčiv Biotransformací léčiv se rozumí biochemické přeměny léčiv, při kterých dochází ke vzniku biotransformačních produktů, tj. metabolitů těchto látek. U většiny léčiv přitom dochází k více či méně rozsáhlým chemickým změnám. Většina léčiv je biotransformována pomocí enzymů přítomných v hladkém endoplazmatickém retikulu (mikrozomy), především hepatocytů, buněk střevní sliznice, dále v plicích, ledvinách aj. Výsledkem biotransformace je obvykle snížená až úplná ztráta účinnosti léčiva, jedná se o tzv. biodegradaci. Jsou však i případy, kdy se léčiva na základě metabolické přeměny stávají farmakologicky aktivnější, tzv. bioaktivace (kyselina acetylsalicylová → kyselina salicylová). U některých léčiv však k metabolizaci nedochází a jsou vylučována v metabolicky nezměněné podobě [11, 23, 24]. Nejdůležitějším biotransformujícím orgánem jsou játra, u některých léčiv ledviny. Méně často se účastní metabolismu i další tkáně, např. krevní plazma a střevní stěny, kde jsou přítomny enzymy účastnící se hydrolýzy [11]. Průběh biotransformace a její intenzita jsou určovány jak vlastnostmi léčiva (struktura), tak také organismem, do kterého bylo léčivo vpraveno (biologický druh, věk, pohlaví, individuální enzymová aktivita aj.). Léčivo může být do organismu vpraveno různými způsoby. Aby však mohlo dojít k biotransformačním procesům, musí nejdříve dojít k přestupu přes buněčné membrány [25, 26]. Biotransformační děje je možno rozdělit na čtyři fáze (obr. 6), z nichž nejvýznamnější jsou první dvě fáze. Fáze I zahrnuje děje, kterými se léčiva (X) přeměňují na metabolity více rozpustné ve vodě (XOH). Představují oxidaci, redukci a hydrolýzu aj. a molekula látky se zmenšuje. Tyto metabolity mohou podléhat konjugačním dějům na konjugáty (XOR) ve fázi II . V této fázi vznikají polární metabolity. Metabolity XOH i XOR se dále transportují z buňky do extracelulárního prostoru prostřednictvím určitých přenašečových systémů. Tyto transportní děje se zařazují do fáze III. Metabolity jsou poté vylučovány buď žlučí nebo močí. Pokud metabolity podléhají další metabolické transformaci, pak se tyto procesy zahrnují do fáze IV. Také látky, které nebyly biotransformovány (X), se vyloučí z buňky prostřednictvím transportních mechanismů [11, 26]. (ROH = aktivované konjugační činidlo)

30

Obrázek 6: Schéma biotransformace a exkrece látek [11] Po biotransformaci jsou metabolity i původní formy léčiv vyloučeny z organismu. Nejdůležitějším orgánem vylučujícím léčiva do zevního prostředí jsou ledviny, a proto jsou z organismu nejčastěji vylučovány močí. Další důležitou formou exkrece je vylučování stolicí, popř. plícemi. Ostatní způsoby exkrece, tj. potem, slinami, slzami apod., nejsou z kvantitativního hlediska významné [25, 24].

2.6. Léčiva v životním prostředí Přítomnost léčiv v životním prostředí je pozorována již několik desítek let. Rezidua některých léčiv byla zjištěna již v 80. letech minulého století a to nejen v ČOV (na jejich přítoku i odtoku), ale také v povrchových vodách. Jednalo se však vesměs o stopová množství, a proto jejich přítomnosti nebylo věnováno tolik pozornosti jako jiným environmentálním polutantům (PCB, PCDD, PCDF, PAH apod.) [27, 28]. V posledních letech se však této problematice věnuje stále větší pozornost, především z důvodu neustále se zvyšujících koncentrací těchto látek v různých složkách životního prostředí a také z důvodu následných efektů, které může přítomnost léčiv v přírodních ekosystémech způsobovat. To vše je důsledkem hlavně zvyšující se produkce a spotřeby léčiv a zavádění nových léčiv a léčivých přípravků nejen v humánní, ale i ve veterinární medicíně. Je prokázáno, že tyto látky nebývají vždy kompletně eliminovány v lidském ani zvířecím organismu a dostávají se tak do životního prostředí buď v nezměněné formě nebo v podobě biotransformovaných metabolitů [26, 29, 30, 31, 32]. Uvádí se, že až 80 % [33], někdy i více (až 95 % [34]) zkonzumovaných léčiv se vylučuje v nezměněné podobě. Biotransformací léčiv v organismu vznikají metabolity, které často bývají více bioaktivní než původní léčiva [33]. Často mají tyto metabolity podobné fyzikálně-chemické vlastnosti jako ostatní škodlivá xenobiotika, která jsou perzistentní nebo vyvolávají nepříznivé účinky u necílových organismů [26, 29, 30, 31, 35]. Proto vzrůstající koncentrace i těchto látek v životním prostředí je alarmující stejně jako u jiných polutantů a je zapotřebí jejich monitoringu věnovat

31

stále větší pozornost. Následující graf (obr. 7) znázorňuje relativní zastoupení terapeutických skupin nejčastěji detekovaných v životním prostředí.

veterinární léčiva3%

antacida3%

radioaktivní kontrastní látky3%

β2-sympathomimetika3%

antineoplastika4%

antihypersensitiva4%

antidepresiva4%

anxyolitika4%

betablokátory8%

antiepileptika8% hormonální léky

9%

látky snižující obsah tuků v krvi

12%

antibiotika15%

NSAID16%

antipsychotika1%

perorální antidiabetika 3%

Obrázek 7: Relativní zastoupení farmaceutických látek detekovaných v životním prostředí; data sesbírána ze 134 článků publikovaných v letech 1997 – 2009 [36]

Léčiva, která jsou v posledních letech nejvíce sledována z důvodu jejich možných toxických efektů na životní prostředí, mohou být rozdělena do následujících skupin:

• antibiotika, • hormony, • analgetika a NSAID, • chemické látky používané pro desinfekci a čištění, • endokrinní disruptory [37].

Analgetika jsou v dnešní době důležitou skupinou léčiv moderní medicíny. Jejich spotřeba neustále narůstá. Hojně se používají především pro zmírnění bolestí nebo snížení horečky a velká část vykazuje i protizánětlivé účinky (NSAID). Mnoho z nich často nebývá na lékařský předpis. Důsledkem uvedených vlastností je to, že v současnosti představují tyto látky jednu z nejvíce používaných skupin léčiv. Vzhledem k tomu, že ani tyto látky, stejně jako většina jiných léčiv, nebývají vždy kompletně eliminovány v lidském ani zvířecím organismu, se dostávají do životního prostředí, kde může docházet k ovlivnění přírodních ekosystémů. Ačkoliv rezidua analgetik v životním prostředí nevykazují akutní účinky na necílové organismy, jako je tomu například u hormonálních nebo antibakteriálních přípravků, jejich stále častější přítomnost v různých evironmentálních složkách životního prostředí by měla být alarmující, protože se také jedná v mnoha případech o xenobiotika. Léčiva i produkty jejich transformace představují potenciální polutanty, a proto je třeba i těmto látkám věnovat pozornost, především kvůli jejich možným chronickým účinkům.

32

Humánní a veterinární léčiva se do životního prostředí dostávají především jako důsledek průmyslových procesů, dále nevhodným a neúčinným používáním nebo metabolickým vylučováním [31]. Vylučováním z organismu (lidského i zvířecího), nejčastěji močí nebo stolicí, se do životního prostředí dostávají jako směs metabolitů nebo nezměněných látek. Cesty a množství vstupu léčiv do životního prostředí mohou být různé. Záleží na druhu léčiv, na množství a způsobu používání, na schopnostech organismu odbourat tyto látky, na účinnosti vylučování apod. V životním prostředí pak může docházet k jejich různým transportům, přeměnám nebo kumulaci [38-40]. 2.6.1. Osud a cyklus léčiv v životním prostředí Osud reziduí léčiv v životním prostředí závisí zejména na jejich fyzikálně-chemických vlastnostech, biochemických vlastnostech, množství obsaženém v environmentálních matricích, okolním prostředí a mnoha dalších faktorech. Proto je obtížné dopředu určit osud konkrétních léčiv, avšak lze obecně popsat jejich možný osud a cyklus v životním prostředí. Obrázek 8 znázorňuje a přehledně shrnuje možné expoziční cesty, osud a cyklus různých typů léčiv v životním prostředí. K určení expozičních cest je nezbytné rozdělit léčiva na léčiva humánní (F1) a léčiva veterinární (F2). Veterinární léčiva lze pak dále rozdělit na léčiva podporující růst hospodářských zvířat, kokcidiostatika pro drůbež (F3), léčiva pro léčbu hospodářských zvířat prováděnou přímo na polích (F4) a léčiva, která se přidávají do krmiv pro ryby (F5). Humánní léčiva vyloučená z organismu močí nebo stolicí se dostávají do kanalizace (F6) a následně pak do čistírny odpadních vod (F7) [38, 39, 41]. Možný osud léčiv a jejich metabolitů v ČOV může být principielně rozdělen, stejně jako v případě ostatních xenobiotik, do tří skupin. (1) Látka nebo její metabolit je v konečné fázi mineralizována mikroorganismy na CO2 a vodu (např. aspirin). (2) Látka je lipofilní a současně dochází neochotně k její degradaci, což může být způsobeno různými vazbami, funkčními skupinami, iontovými vazbami apod. To znamená, že bude spíše zůstávat v aktivovaném kalu (F8). (3) Původní hydrofobní látka je metabolizována do hydrofilnější formy, avšak stále je poměrně perzistentní a odolná vůči mikrobiální degradaci. To má za následek, že látka zůstává spíše rozpuštěná ve vodě a v konečné fázi se tak dostává s „vyčištěnou“ odpadní vodou (F9) až do povrchových vod (F10). Zde, pokud se jedná o metabolity biologicky aktivní, může působit na vodní organismy (F11). Látky, které mají schopnost zůstávat v aktivovaném kalu, se mohou při používání tohoto kalu na polích dostat do půdy a ovlivňovat zde přítomné mikroorganismy a jiné prospěšné organismy a procesy (F12). Veterinární léčiva použitá u hospodářských zvířat se většinou dostávají do hnoje (F13). Při hnojení se tak mohou dostávat do půdy a ovlivňovat půdní organismy (F14). Veterinární léčiva aplikovaná zvířatům na polích bývají vylučována močí nebo výkaly přímo do půdy (F16), kde opět může dojít k ovlivnění mikroorganismů a jiných prospěšných organismů nebo procesů (F17). Osud léčiv v půdě opět záleží na velkém množství faktorů jakými jsou lipofilita, vazebné schopnosti v půdě vycházející z velkého množství různých funkčních skupin, pH půdy apod. Může zde rovněž docházet k dalšímu rozkladu těchto látek, případně se mohou dostat do podzemních vod. Během dešťů může docházet ke splachu zemědělských půd a látky se tak mohou dostat do vodního prostředí (F15) [38, 39, 41]. Léčiva použitá při chovu ryb se dostávají přímo dostávat do povrchových vod, protože mnoho metod léčby ryb je založeno na přídavku léčiv do potravy. Značná část této potravy pak může klesnout až na dno, kde dochází k akumulaci v sedimentech a následnému ovlivnění vodních organismů [38, 39, 41].

33

Část humánních léčiv se do kanalizace dostává také přímou cestou jako odpad z domácností, např. léky s prošlou expirační dobou (F19) [38-41].

Obrázek 8: Osud a efekty léčiv v životním prostředí [38] 2.6.2. Léčiva v ČOV a ve vodním prostředí Z předchozí kapitoly je zřejmé, že humánní a veterinární léčiva se do životního prostředí mohou dostat různými cestami. Nejvíce zatížené prostředí z pohledu léčiv je však prostředí vodní. Obrázky 9 a 10 znázorňují jak možné cesty, kterými se humánní i veterinární léčiva mohou do vodního prostředí dostat, tak také jejich koloběh.

34

Obrázek 9: Možné cesty vstupu humánních a veterinárních léčiv do vodního prostředí [42]

Obrázek 10: Koloběh humánních a veterinárních léčiv ve vodním prostředí a jejich možný vstup do pitné vody [43]

35

Jednoznačně nejvýznamnější cestou vstupu léčiv do vodního prostředí je jejich konzumace a následné vyloučení z organismu. Takto se dostávají především do odpadních vod a spolu s nimi do ČOV. Odtud pak mohou přecházet až do povrchových vod, protože většina léčiv není během čistících procesů zcela odstraněna a zůstává v odtokové vodě [31, 32, 42, 44]. Předchozí studie prokázaly, že biologické čistící procesy v ČOV vykazují jen velmi malou efektivitu při odstraňování většiny léčiv [45]. Odstraněné množství během čisticích procesů se obecně uvádí v rozmezí 60 – 90 % pro středně polární léčiva. Polární léčiva bývají eliminována poměrně neúčinně, a to vzhledem ke svým hydrofilním interakcím. Velká část látek v odpadních vodách bývá totiž odstraněna absorpcí na aktivovaný kal, která je částečně zprostředkována právě hydrofobními interakcemi [29]. Vyšší polarita léčiv má za následek to, že určité množství těchto látek, ať už původních nebo metabolizovaných, zůstává v odtokové vodě z ČOV, a následně se tak dostává přímo do povrchových vod. Detekovány byly ve vodních systémech jako jsou malé potoky, velké řeky, jezera, podzemní vody nebo moře [29, 31, 32, 46]. Některé studie uvádí i jejich nálezy v pitné vodě [47, 48]. Koncentrace léčiv naměřené v povrchových vodách jsou velmi nízké (ng.l-1 – µg.l-1) [45, 49] na to, aby mohly způsobit akutní toxicitu u vodních organismů. Avšak vzhledem k tomu, že se jedná o polutanty kontinuálně vstupující do životního prostředí, může mít trvalá expozice těchto látek za následek mnoho mírných účinků na necílových organismech, jako jsou např. metabolické nebo reproduktivní změny. Mohou způsobovat rezistenci virulentních bakterií, které jsou příčinou různých onemocnění. Jsou také nebezpečné pro prospěšné sladkovodní nebo mořské mikrobiální bakterie zodpovědné za denitrifikaci, fixaci dusíku a organické rozklady [46]. Rezidua léčiv nacházející se ve vodním prostředí se mnohem častěji vyskytují jako směs různých farmaceutických látek, nikoliv jako samostatné kontaminanty. Je proto nutné při hodnocení efektů na vodní organismy a odhadu možných rizik počítat s touto skutečností [50]. Testy toxicity prokázaly, že směs reziduí léčiv v malých koncentracích má často silnější účinky, než kdyby tyto látky působily samostatně. Účinky směsí byly také pozorovány u koncentrací, při kterých by rezidua samostatně nezpůsobovala žádné nebo jen velmi malé účinky [46]. Kombinacemi různých léčiv ve vodném prostředí tedy dochází velmi často k synergickým účinkům a na vodní a další necílové organismy. Více je uvedeno v následující kapitole. 2.6.3. Ekotoxické účinky léčiv Ekotoxické účinky na vodní a suchozemské organismy a jejich okolí nejsou zatím dostatečně prozkoumány. Zejména chybí jejich komplexní zhodnocení. Vzhledem k tomu, že se rezidua léčiv nacházejí především ve vodném prostředí, jsou důležitou skupinou cílových organismů právě vodní organismy. Ty bývají vystaveny po celý svůj životní cyklus reziduím v odpadních, ale v podstatě i v povrchových vodách. Současné znalosti a průzkumy naznačují, že léčiva v životním prostředí představují pouze malé riziko akutní toxicity. Z hlediska chronických účinků může být situace naprosto odlišná, avšak výzkum vlivů na multigenerační životní cyklus nebo na různá životní stádia je také prozatím nedostatečný. Je to dáno především tím, že se jedná o poměrně nové kontaminanty životního prostředí, resp. jejich monitoring a zkoumání jejich vlivu je, ve srovnání s pozorováním ostatních kontaminatů životního prostředí, mladou záležitostí. Nicméně skutečnost, že do životního prostředí denně pronikne značné množství reziduí léčiv a že v tomto množství může docházet k určitému ovlivnění organismů, je nezpochybnitelné. Navzdory těmto značným množstvím uvolněných

36

do životního prostředí chybí prozatím příslušné regulace a předpisy pro komplexní zhodnocení ekotoxikologických rizik. Regulační instituce vydaly detailní metodické pokyny o tom, jak by léčiva měla být hodnocena z hlediska možných nežádoucích dopadů na životní prostředí pouze v několika málo případech. Evropská léková agentura (EMA), která v Evropě uděluje licence pro cytotoxické látky, navrhla jako hraniční hodnotu (tj. předpokládanou koncentraci v prostředí) pro další stanovení nebezpečí pro životní prostředí koncentraci 10 ng.l-1 pro jednotlivá léčiva. První doporučení pro testování ekotoxicity, jako nezbytného předpokladu pro registraci léčiv, bylo ustanoveno v roce 1995 Směrnicí Evropské unie 92/18 EEC a také odpovídající „Note for Guidance“ pro veterinární léčiva. Evropská komise pak vydala specifikující směrnici (direktiva 2001/83/EC), která nařizuje, že povolení pro léčivé přípravky pro humánní použití musí být doprovázeno zhodnocením rizikovosti pro životní prostředí [1]. K riziku pro životní prostředí nepřispívá pouze samotná vysoká produkce léčiv, ale spíše jejich perzistence v prostředí a kritická biologická aktivita (např. vysoká toxicita, vysoký potenciál ovlivňovat klíčové biologické funkce, jako je reprodukce apod.). Příkladem jsou syntetické steroidní hormony v antikoncepčních přípravcích, např. 17α-ethynylestradiol. Roční produkce v EU činí několik stovek kilogramů. 17 α -ethynylestradiol je vysoce účinná látka, poměrně perzistentní v životním prostředí, a vykazuje estrogenní účinky u ryb již v koncentraci 1 – 4 ng.l-1 [1]. U léčiv ovlivňujících životní prostředí se převážně kombinuje vysoký objem produkce se stálostí v prostředí a biologickou aktivitou, zejména po dlouhodobé expozici [1]. Cleuvers M. [51] vypracoval studii, v rámci které byla zjišťována toxicita vybraných NSAID (diklofenak, ibuprofen, naproxen a kyselina acetylsalicylová) na vodních organismech. Byly použity dva testy: testy akutní imobilizace na dafniích (D. magna) a test růstové inhibice na zelených řasách (D. subspicatus). Tabulky 2 a 3 uvádí výsledky efektivních koncentrací získaných pomocí příslušných testů. Tabulka 2: Efektivní koncentrace léčiv testovaných na řasách [51]

Léčivo EC 5 (mg.l -1) EC10 (mg.l -1) EC20 (mg.l -1) EC50 (mg.l -1) EC80 (mg.l -1) diklofenak 44,2 49,2 56,1 71,9 92,2 ibuprofen 72,9 102,7 155,5 342,2 753,2 naproxen 266,0 321,5 404,3 625,5 967,5 k. salicylová 86,4 90,6 95,8 106,7 118,9

Tabulka 3: Efektivní koncentrace léčiv testovaných na dafniích [51]

Léčivo EC 5 (mg.l -1) EC10 (mg.l -1) EC20 (mg.l -1) EC50 (mg.l -1) EC80 (mg.l -1) diklofenak 10,0 15,2 25,5 68,0 181,3 ibuprofen 58,4 66,0 76,4 101,2 134,1 naproxen 26,2 39,5 64,8 166,3 426,6 k. salicylová 38,1 45,9 57,4 88,1 135,2

2.7. Stanovení léčiv ve vodách Analytický postup stanovení léčiv ve vodním prostředí se dá obecně rozdělit do několika částí: vzorkování (odběr, zakonzervování, transport, uchování), úprava, extrakce a analýza vzorku. Každá část má v celém procesu svoji důležitou úlohu a nesprávné provedení může mít

37

za následek značné zkreslení finálních výsledků. Celkové stanovení léčiv ve vodách je poměrně složitý a někdy značně časově náročný proces. Ve všech oblastech environmentální analýzy je však snaha jednotlivé části co nejvíce usnadnit a urychlit, aby celkové stanovení bylo co nejrychlejší a zároveň aby bylo co nejpřesnější a mělo reálné vypovídající hodnoty. Proto dochází k zavádění a aplikaci stále propracovanějších a modernějších metod. Obrázek 11 znázorňuje souhrnné schéma postupu při stanovení různých kategorií léčiv.

Obrázek 11: Typický postup uváděný pro stanovení léčiv ve vodném prostředí [52] Základní část celého stanovení začíná u vzorkování. To by se mělo řídit hlavně účelem stanovení, tj. jakých výsledků má být dosaženo a co má být konkrétně zjištěno. Vzorkování se dá rozdělit do dvou kategorií na aktivní (konvenční) a pasivní. Stále více studií se začíná zaměřovat při vzorkování reziduí léčiv na využití pasivních vzorkovačů, nicméně více je zatím stále využíváno vzorkování aktivní. Vzhledem k charakteru léčiv a poměrně komplikovanému složení přírodních a odpadních vod obsahujících značné množství rozpuštěných látek, je velice důležitá extrakční část a koncová analytická metoda. V současné době jsou analytické metody pro stanovení léčiv z vodného prostředí založeny především na extrakci pevnou fází (SPE – Solid Phase Extraction) v kombinaci se separačními instrumentálními metodami [36, 52, 53]. Z nich se nejvíce používají chromatografické metody, a to kapalinová chromatografie (LC), speciálně vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC), dále rychlá kapalinová chromatografie s vysokým rozlišením (UHPLC), a plynová chromatografie (GC). Tyto metody se pak ve většině případů používají ve spojení s hmotnostním spektrometrem (LC-MS nebo LC-MS2 resp. HPLC-MS nebo HPLC-MS2, UHPLC-MS nebo UHPLC-MS2, GC-MS nebo GC-MS2), který v těchto spojeních plní funkci velmi citlivého detektoru [36, 53]. Obrázek 12 přehledně

38

znázorňuje skupiny léčiv, které je možné těmito technikami stanovit. Hmotnostní spektrometr jako detektor je sice nejvíce používán, avšak publikováno bylo i použití jiných detektorů. V kapalinové chromatografii jsou to např. UV detektory, speciálně detektor diodového pole (HPLC-DAD) [54, 55], a fluorescenční detektory [56, 57]; v plynové chromatografii pak např. atomový emisní detektor (GC-AED) [58]. Elektromigrační metody, jako další aplikované separační metody, se pro stanovení léčiv používají pouze v některých speciálních případech. Jedná se především o kapilární zónovou elektroforézu (CZE) [47, 59, 60, 61]. Pro stanovení NSAID se v naprosté většině případů používá metoda založená na SPE a chromatografických metodách spojených s hmotnostním spektrometrem [36, 62].

Obrázek 12: Chromatografické analytické metody používané pro stanovení nejběžnějších léčiv v povrchových a odpadních vodách [52]

39

2.7.1. Aktivní (konvenční) vzorkování Vzorkování je samostatná činnost, která je součástí procesu získávání dat o životním prostředí. Na rozdíl od ostatních částí stanovení (zpracování, analýza) je neopakovatelné a jeho provedení a dokumentace jsou proto zásadní [63]. Aktivní vzorkování sestává z několika částí prováděných přímo osobou, která vzorkování provádí. To může vnášet do celého stanovení určité chyby, a proto je zapotřebí dbát na správné a pečlivé provedení jednotlivých částí. Všechny části se odvíjí především od účelu vzorkování. Každému vzorkování by měly předcházet úvahy, na jejichž základě by měl být sestaven plán odběru a vzorkování provedeno.

Obrázek 13: Schéma počátečních úvah pro plánování a provádění vzorkování [64] 2.7.1.1. Odběry vzorků Jedná se o zásadní část aktivního vzorkování. Správný způsob odběru vzorku je základní podmínkou pro úspěšné provedení všech potřebných zkoušek (analýz), kterým má být tento materiál podroben, a také k získání správných výsledků. Špatně provedený odběr vzorku může být příčinou zkreslení nebo úplného znehodnocení konečného výsledku analýzy [65, 66]. Základním požadavkem je, aby byl vzorek reprezentativní (průměrný), to znamená, že musí obsahovat všechny složky ve stejném hmotnostním nebo objemovém poměru, v jakém jsou zastoupené ve zkoušeném materiálu a musí mít průměrné i další charakteristické znaky.

Stanovení cílů a požadovaná přesnost

Stanovení odběrového místa

Stanovení doby a frekvence odběru

Výběr analytické metody, množství vzorku

Výběr vzorkovací metody

Určení stabilizace vzorku a přeprava

Stanovení analytické metody

Interpretace na základě: - hodnocení přesnosti - vzorkovacího plánu

40

Každý vzorek tak musí přinášet vypovídající hodnoty o lokalitě, ve které byl odebrán. Množství vzorku musí být dostatečné pro příslušnou analýzu a v období mezi odběrem a analýzou se nesmějí změnit vlastnosti vzorku, tj. koncentrace příslušných (analyzovaných) látek, jejich vzájemné poměry apod. Vzorek dopravený do laboratoře se pak postupně zpracovává až vznikne analytický vzorek, což je část sledovaného materiálu upravená tak, aby bylo možno provést měření analytického signálu vedoucího k výsledku [63, 65, 66]. Odběry vzorků se řídí standardními operačními postupy (SOP). Program odběru vzorků, tzv. vzorkovací plán, musí být zpracován před odběrem vzorků a osoby pověřené odebíráním vzorků s ním musí být seznámeni. V programu musí být určeny cíle, ke kterým mají být výsledky rozboru vzorků použity. Na základě určení cílů je stanoveno přesné místo odběru, četnost, časové údaje, způsob vzorkování, následná úprava vzorků i analytické požadavky. Zároveň je třeba určit způsob dokumentování odběru, zejména s přihlédnutím k možnému požadavku opakovaného odběru ze stejného bodu. Dokumentace musí být zřetelná a přesná [67]. 2.7.1.1.1. Odběry vzorků povrchových vod V základním rozdělení povrchových vod můžeme uvést čtyři základní druhy: tekoucí vody (řeky, potoky), stojaté vody (jezera, přehrady, rybníky), moře a oceány a ledovce [68, 69]. V případě analýzy a monitoringu reziduí léčiv v přírodních vodních ekosystémech ČR a střední Evropy připadají v úvahu pouze tekoucí a stojaté vody. Při vzorkování povrchových vod je třeba brát v úvahu několik následujících bodů. Program vzorkování (vzorkovací plán) je podřízen účelu vzorkování. Celková strategie vzorkování musí vycházet ze záměrů a strategie projektu, tj. určení cílů. Určuje četnost odběru, místo odběru, typ odběru a technické vybavení. Dále se v programu definují záznamy, které se o vzorku provedou, použité prvky systému jakosti a opatření bezpečnosti práce [68]. Četnost odběru rozhoduje o reprezentativnosti vzorku v čase. Rozsah četnosti vzorkování může být od jednorázového odběru až po automatickou stanici s kontinuálním měřením a odběrem vzorků. Při určení četnosti a případně doby odběru povrchových vod je nutno vycházet z vlastností systému a přihlížet ke kolísání složení, které se může měnit v důsledku různých vlivů [68, 69]. Místo odběru. U tekoucích vod se zpravidla požaduje, aby místo odběru reprezentovalo celý průtočný profil. Pro odběr jsou proto vhodná místa s turbulentním prouděním. Vzorek se odebírá v proudnici v místě, kde protéká nejvíce vody. Zpravidla se odebírá jako hladinový. Bod odběru musí být zvolen tak, aby odpovídal účelu prací. Jako nejvhodnější místa pro odběr tekoucích vod se uvádějí mosty. Při vzorkování stojatých vod (nádrží) rozhoduje kromě velikosti nádrže i účel vzorkování. Pro hodnocení jakosti vody v nádrži se používá odběr z lodě v podélném příčném profilu, buďto jako řada prostých vzorků, nebo se vytváří směsné vzorky. U hlubších nádrží se kromě hladinového vzorku odebírají i hlubinné vzorky [68, 69]. Typ odběru se volí podle účelu vzorkování, požadovaných stanovení a místních podmínek. U toků se zpravidla odebírá hladinový vzorek – jedná se o vzorek od hladiny do hloubky cca 30 cm. U nádrží se kromě hladinového provádí i hlubinný odběr [68]. Množství vzorku se řídí rozsahem rozboru a určí se z množství vzorku požadovaného pro stanovení jednotlivých složek prováděného rozboru. Je nutné vždy počítat s rezervou vzorku pro případné opakování některého stanovení [70]. Technické vybavení. Požadavky na technické vybavení vychází z požadovaného typu odběru, rozsahu analýzy a požadavků laboratoře na objem vzorku [68]. Vzorek je možno

41

odebírat buď přímo do vzorkovnice nebo s použitím vzorkovačů. Vzorkovače jsou přístroje a zařízení, která umožňují jednorázový nebo opakovaný odběr vzorku. Vzorkovnice jsou skleněné nebo plastové láhve [68, 70]. Pro odběr vzorků vod za účelem stanovení reziduí léčiv se používají výhradně vzorkovnice z tmavého skla [37, 44, 45, 48, 71, 72, 73], které mohou být vyrobené z běžného sodno-vápenato-křemičitého obalového skla nebo pro speciální případy ze skla borokřemičitého. Tyto vzorkovnice je nutné vždy před každým odběrem důkladně vyčistit [63, 70,]. Speciální postupy předběžné přípravy a čištění vzorkovnic se odvíjí od konkrétních stanovovaných látek a uvádějí se vždy v předpise nebo v normě stanovení sledovaného ukazatele [70]. Při analýze reziduí léčiv se nejčastěji uvádí postupy, v nichž se vzorkovnice vymývají postupně detergentem, kyselinou (chlorovodíková, chromsírová), vodovodní vodou a milli-Q vodou, případně se doporučuje zahřátí na vysokou teplotu po dobu několika hodin [74]. V některých případech se při vymývání používají různá rozpouštědla nebo jejich směs (methanol, isopropylalkohol, aceton) [29, 73, 75, 76]. Odběr hladinového vzorku je možný buď přímo do vzorkovnice nebo se používají různá jednoduchá komerčně vyráběná nebo v laboratoři připravená zařízení. Příkladem může být vědro na laně, nádoba na tyči apod. Při odběru vzorků tekoucích vod je vhodnější odebrat vzorek do větší nádoby a po rozmíchání rozlít do vzorkovnic, než vzorek postupně odebírat přímo do jednotlivých vzorkovnic [68]. 2.7.1.1.2. Odběry vzorků odpadních vod Odběr reprezentativního vzorku odpadní vody je ve srovnání s přírodními vodami nebo pitnou vodou poměrně obtížný proces. Problém je zejména v nehomogenitě a neustálé změně složení, jež kolísá v čase a prostoru [77]. Tento problém lze do určité míry vyřešit vytvořením směsného vzorku složeného z dílčích vzorků odebíraných během celého dne v pravidelných intervalech. Nezbytnou podmínkou při sestavování programu vzorkování je vždy nutno definovat, co mají vzorky reprezentovat. Typická místa odběru vzorků odpadní vody jsou přítok a odtok z ČOV. Často dochází k odběru vzorků i v průběhu procesu čištění, případně na kanalizační síti [78]. Pro stanovení reziduí léčiv v odpadních vodách se ve většině případů provádí odběry pouze na přítoku a odtoku a to za účelem zjištění účinnosti odstranění těchto látek během čistících procesů. Vzorkování na přítoku ČOV Odpadní voda na přítoku je značně nehomogenní médium. Zejména, je-li více přítoků různé kvality, musí se věnovat více pozornosti výběru vhodného místa pro odběr vzorků. Toto platí, ať už dochází k odběru ručně nebo automatickým vzorkovačem. Automatické vzorkovače jsou v současné době využívány stále větším množstvím provozů. Jejich výhoda spočívá především v opakovatelnosti a také v možnosti odebírat nepřetržitě a v přesně stanovených intervalech [78]. Vzorky z automatických vzorkovačů tak mohou udávat průměrné sledované hodnoty během celého dne. Vzorkování během procesu čištění odpadních vod Často je využíván směsný vzorek, jehož rozborem však získáme pouze údaje o průměrných hodnotách parametrů v daném dni. Pro potřeby řízení procesu čištění je lepší odebírat vzorky dělené, na kterých je dobře vidět vývoj jednotlivých hodnot v různých denních a nočních teplotách [78]. Pro stanovení reziduí léčiv se však vzorkování během čistících procesů téměř neprovádí.

42

Vzorkování odtoku z ČOV Voda na odtoku z ČOV už je prakticky čistá a proto je odběr vzorků totožný s odběrem vzorků z tekoucích povrchových vod [78]. V mnoha případech se však již i na odtoku z ČOV používají automatické vzorkovače. Technické vybavení Stejně jako u odběru vzorků povrchových vod se také u odběru vzorků vod odpadních používají nejčastěji předem vyčištěné skleněné vzorkovnice, u kterých dochází k nejmenším ztrátám léčiv adsorpcí na jejich stěny [45, 71, 72, 79]. Metody pro čištění vzorkovnic jsou podobné jako při odběru vzorků povrchových vod. Čištění je však potřeba provádět mnohem důkladněji vzhledem ke složení odpadních vod. Pro odběr je možné opět použít různá odběrová zařízení (nádoby na tyči, laně apod.), ale vzhledem k charakteru odpadních vod je nejvhodnější využít již zmíněných automatických vzorkovačů. 2.7.1.2. Konzervace, doprava a skladování vzorků Doba, která uplyne mezi odběrem a rozborem vzorku, by obecně měla být obecně co nejkratší. Nejlepší vypovídající hodnoty, tedy shodu výsledků rozboru a jakosti odebrané vody, můžeme očekávat u vzorků vod analyzovaných bezprostředně po odběru. Ideální by bylo odebrat vzorek, ihned jej odvézt do laboratoře a ihned začít zpracovávat. To však není vždy úplně možné a proto je často nezbytné provést takové kroky, aby nedocházelo ke změně sledovaných ukazatelů, případně aby jejich změna byla minimální. I přes všechny tyto kroky je však nutné zajistit, aby časový interval mezi odběrem a rozborem, a to i u konzervovaného vzorku, byl co možná nejkratší [68, 70]. Konzervací vzorku se rozumí uchování stejných hodnot ukazatelů vzorku vody od doby odběru až do začátku rozboru. Úkolem konzervace vzorku je tedy zabránit změnám hodnot ukazatelů vody v odebraném vzorku. Nejjednodušší konzervace, která se používá téměř vždy, je ochlazení vzorku. Pokud ochlazení nestačí, přidávají se různé chemikálie [68, 70]. V případě konzervace vzorků vod pro stanovení reziduí léčiv se výhradně používá ochlazení vzorku na teplotu 4 °C a skladování v temnu [79-83]. V některých studiích se uvádí i zamražení vzorku [75, 84]. Při přepravě se štítkem označené vzorkovnice ukládají do transportních beden nebo do speciálních brašen, opatřených přihrádkami. Je třeba také zajistit, aby při přepravě nedošlo ke kontaminaci vzorků. Přeprava by měla být co možná nejrychlejší [70].

2.7.1.3. Úprava vzorků před extrakcí Cílem této části stanovení je upravit vzorek do takové podoby, aby jeho fyzikální a chemické vlastnosti byly vhodné pro následnou extrakci a analýzu. Vzorky přírodních a odpadních vod obsahují ve větší či menší míře drobné částice a nečistoty, které mohou narušovat a znesnadňovat extrakci, případně vlastní analýzu. Z tohoto důvodu se vzorky před extrakcí upravují, čímž se zbavují především hrubých nečistot. Tuhé nečistoty se nejčastěji odstraňují filtrací. V případech, kdy je obtížné získat potřebný objem vzorku filtrací vzhledem k velkému množství nerozpuštěných látek, se používá centrifugace. Při větší koncentraci suspendovaných látek ve vzorku lze k odstranění velkého podílu těchto látek volit, jako předúpravu vzorku před filtrací nebo centrifugací, sedimentaci [70, 77]. U vzorků povrchových i odpadních vod odebraných pro stanovení reziduí léčiv se ve většině případů ihned po přinesení do laboratoře provádí filtrace. Nejčastěji se používají filtry ze skleněných mikrovláken o průměru pórů 0,2 - 0,77 µm [30, 74, 75, 79, 81, 82, 85].

43

Účelem filtrace je odstranění suspendovaných látek, které by narušovaly případně znesnadňovaly extrakci (např. zanášení kolonek). Pokud ihned po filtraci nemůže dojít k extrakci, ochladí se filtrát na teplotu 4 °C a ponechá v temnu [73, 79, 80, 81, 82]. Analýza by však měla proběhnout nejpozději do 3 dnů. Těsně před extrakcí se v některých případech, v závislosti na typu léčiva, upravuje pH za účelem potlačení disociace. U kyselých léčiv se upravuje pH na hodnotu 2 - 3 přídavkem kyseliny (3,5 M HCl [33], 40% H2SO4 [84, 85], 0,1 M kyselina citrónová [80]) a u neutrálních léčiv se pH upravuje na hodnotu 9 (přídavkem 1 M KOH [33]). Někdy se ještě, a to především u odpadních vod, přidává do vzorku malé množství Na2EDTA k zakomplexování kovů, které by mohly rušit stanovení [30, 82, 85]. 2.7.1.4. Normy pro odběry vzorků odpadních a povrchových vod Závěrem je třeba zdůraznit, že by se všechny plány vzorkování, včetně vypracovaných SOP pro odběr vzorků povrchových a odpadních vod, měly řídit účelem vzorkování a měly by vycházet z příslušných státních norem. V následující části je uveden aktuální výčet norem pro odběr vzorků povrchových i odpadních vod nezbytných pro správné vzorkování: Normy pro odběr vzorků povrchových vod

• ČSN EN ISO 5667-1 ODBĚR VZORKŮ část 1: Návod pro návrh programu odběru vzorků a pro způsoby odběru vzorků

• ČSN EN ISO 5667-3 ODBĚR VZORKŮ část 3: Návod pro konzervaci vzorků a manipulaci s nimi

• ČSN ISO 5667-4 ODBĚR VZORKŮ část 4: Pokyny pro odběr vzorků z vodních nádrží

• ČSN ISO 5667-6 ODBĚR VZORKŮ část 6: Pokyny pro odběr vzorků z řek a potoků

• ČSN ISO 5667-14 ODBĚR VZORKŮ část 14: Pokyny k zabezpečování jakosti odběru vzorků vod a manipulace s nimi

Normy pro odběr vzorků odpadních vod • ČSN EN ISO 5667-1 ODBĚR VZORKŮ část 1: Návod pro návrh programu odběru

vzorků a pro způsoby odběru vzorků

• ČSN EN ISO 5667-3 ODBĚR VZORKŮ část 3: Návod pro konzervaci vzorků a manipulaci s nimi

• ČSN ISO 5667-4 ODBĚR VZORKŮ část 4: Pokyny pro odběr vzorků z vodních nádrží

• ČSN ISO 5667-6 ODBĚR VZORKŮ část 6: Pokyny pro odběr vzorků z řek a potoků

• ČSN ISO 5667-14 ODBĚR VZORKŮ část 14: Pokyny k zabezpečování jakosti odběru vzorků vod a manipulace s nimi

2.7.2. Extrakce Jedná se o separační metodu, při které přechází složka ze směsi látek v kapalné či tuhé fázi do jiné kapalné fáze (rozpouštědla). Z hlediska fyzikální chemie lze chápat proces extrakce jako přechod složky fázovým rozhraním mezi dvěmi vzájemně nemísitelnými fázemi. Extrakce se provádí, protože stanovení jedné složky ve složitějším vzorku obvykle není možné provést přímo po převedení vzorku do roztoku. Většinou je nutné před finální

44

analýzou izolovat stanovovanou složku z matrice. Stanovované složky se separují od nežádoucích příměsí, které by jinak rušily následné stanovení [86, 87]. V podstatě jde o čistící krok, při kterém získáváme pouze ty látky, které potřebujeme stanovit a látky jim chemicky podobné. Extrakcí se tak vytvoří analytický vzorek [66]. V případě stanovení reziduí léčiv volíme podle jejich povahy taková rozpouštědla, aby došlo k jejich přechodu z původního kapalného (vodného) vzorku do zvoleného rozpouštědla. Extrakce reziduí léčiv z vody může být provedena několika různými technikami, z nichž nejčastěji se uvádí extrakce kapalina-kapalina (LLE) [88, 89], která však byla v posledních letech nahrazena extrakcí tuhou fází (SPE) [90]. SPE je v současnosti nejvíce používanou a nejčastěji uváděnou extrakční metodou při stanovení reziduí léčiv z vodního prostředí [36, 73, 89, 90].

2.7.2.1. Extrakce tuhou fází – SPE SPE je v současné době nejvíce používaná a publikovaná metoda pro extrakci reziduí léčiv z vodných vzorků [36, 89]. Jedná se o metodu pro rychlou a selektivní úpravu vzorku. Používá se pro selektivní extrakci, zakoncentrování a přečišťování cílových analytů před finální analýzou. Typické pro tuto metodu je uložení stacionární fáze v trubičkách z polypropylenu nebo ze skla podobných injekční stříkačce (obr. 14) [87].

Obrázek 14: SPE kolony

V průběhu posledních dvaceti let se tato extrakční metoda stala jednou z nejvíce používaných a postupně nahradila tradiční LLE. Pro svou efektivitu a úspornost našla široké uplatnění v mnoha oblastech chemie, biochemie, farmacie apod. Oproti klasické LLE má mnoho výhod, z nichž hlavní je snížení spotřeby organických rozpouštědel. SPE je nejčastěji používána při zpracování kapalných vzorků, především pro extrakci středně těkavých a netěkavých látek, jejich zakoncentrování a odstranění nežádoucích látek, rušících následná analytická stanovení [87, 90, 91]. Jedná se o poměrně jednoduchou techniku, jejíž podstatou je zachycení molekul látky na tuhém sorbentu, přes který protéká vzorek. Používají se nepříliš drahé extrakční kolonky na jedno použití obsahující sorbenty s různými chemickými vlastnostmi a o různých objemech. Při extrakci se využívá chemických vlastností molekul, které v důsledku mezimolekulových interakcí ulpívají na sorbentu [91, 92]. Sorbenty jsou v kolonkách uzavřeny fritami z polyethylenu, případně oceli nebo polytetrafluorethylenu. Mají obvykle výšku 10 – 20 mm, vnitřní průměr 2 – 4,6 mm a jsou tvořeny částicemi o velikosti průměru cca 20 – 50 µm. Vzhledem k velkému množství

45

a poměrně malému průměru těchto částic kladou odpor protékající kapalině, a proto se často průtok kapaliny přes kolonku urychluje vakuem na výstupu z kolonky nebo tlakem na vstupu do kolonky. Ačkoliv kolonky mohou plnit současně několik funkcí, jejich dva hlavní úkoly jsou oddělení vybraných analytů od matrice a jejich zakoncentrování [69]. Výběr vhodného sorbentu je základním předpokladem úspěšné extrakce. Používají se nejen různé chemicky vázané fáze na bázi silikagelu obrácené, normální a iontově výměnné, ale také adsorbenty jako jsou silikagel, alumina a syntetické pryskyřice [87]. Nejčastěji se při stanovení různých typů léčiv používají univerzální sorbenty na bázi modifikovaného silikagelu – oktadecylové (C18) a oktylové (C8). Retenční mechanismus je řízen zejména hydrofobními interakcemi mezi analytem a navázanými uhlíkatými řetězci. Pro extrakci látek obsahujících disociující skupiny (např. –COOH, -OH, NH2) je často nutná úprava pH vzorku, kterou dosáhneme toho, že molekula zůstane v nedisociované formě a tím bude lépe interagovat s nepolárním sorbentem [93]. Proces extrakce tuhou fází se skládá z následujících kroků:

� Kondicionace (předúprava, aktivace sorbentu) – solvatace fáze vázané na povrchu sorbentu, aktivace měniče iontů apod. s následným vymytím přebytku činidla. Tento krok je nezbytný, protože aktivovaný sorbent umožňuje mnohem účinnější interakce s cílovými analyty (obr. 15). Typ solvatačního činidla se volí podle typu sorbentu a jeho množství se pohybuje v rozmezí 1 – 2 objemů kolonky. Následuje vymytí přebytku činidla roztokem, který je stejný jako matrice, z níž chceme analyty získat, tj. ve většině případů vodou, případně upravenou vodou. Objem na promytí je často uváděn jako jeden objem kolonky.

� Aplikace vzorku – během průtoku vzorku přes kolonu je analyt z větší části oddělen od matrice vzorku.

� Promytí sorbentu – slouží k odstranění nežádoucích látek rušících následné stanovení, aniž by byl eluován analyt. Promývá se nejčastěji stejným rozpouštědlem jako byla matrice v množství zhruba jednoho objemu SPE [87].

� Sušení sorbentu – provádí se prosáváním plynu přes kolonky. V některých případech je tento krok vynechán.

� Vymytí (eluce) – analyty se vymývají rozpouštědlem (elučním činidlem). Objem a eluční sílu eluentu je třeba volit s ohledem na to, že je třeba vymýt analyty s dostatečnou výtěžností, ale zároveň je třeba, aby nežádoucí nečistoty zůstaly zachyceny na sorbentu [87].

� Regenerace sorbentu – v řadě případů se nevyžaduje; kolonky jsou konstruovány na jedno použití.

Obrázek 15: SPE sorbent (a) neaktivovaný, (b) aktivovaný [95]

(a) (b)

46

Pro přehlednost jsou jednotlivé kroky SPE znázorněny na následujícím obrázku 16. Postup a zapojení SPE do celkového stanovení reziduí léčiv z vodného prostředí je pak uvedeno na schématu (obr. 17). Sestavená SPE souprava, použitá při extrakci a zakoncentrování vybraných analytů v této studii, je uvedena v příloze č. 7.

Obrázek 16: Proces extrakce tuhou fází

Obrázek 17: Postup SPE při stanovení léčiv z vodného prostředí [90]

47

V následujících tabulkách 4 a 5 je uvedeno několik nejčastěji používaných postupů při SPE vzorků obsahujících rezidua léčiv, konkrétně vybraná analgetika: Tabulka 4: Přehled publikovaných SPE metod pro extrakci NSAID z povrchových vod

NSAID Typ kolonky solvata ční činidlo(a) / elu ční činidlo(a) zdroj

diklofenak RP-C18 aceton / aceton 94 ibuprofen ketoprofen indometacin naproxen fenoprofen k. klofibrová k. klofibrová LiChrolut EN 138 diklofenak

methanol, ethylacetát / methanol, ethylacetat

ibupofen ketoprofen indometacin fenoprofen ibuprofen Oasis HLB, LiChrolut EN 96 k. klofibrová

aceton, ethylacetát, hexan, methanol, toluen / methanol

diklofenak paracetamol LiChrolut ENV+ methanol, hexan / methanol 97 ibuprofen k. mefenamová ibuprofen Oasis HLB 98 aspirin

dichlormethan, acetonitril / acetonitril, dichlormethan

kodein ibuprofen 48 naproxen

Oasis HLB, Supelclean ENVI-18, LiChrolut EN

ketoprofen

methano, aceton, ethylacetát / methanol, aceton-ethylacetát,

aceton-methanol diklofenak k. klofibrová ibuprofen 99 paracetamol

LiChrolut EN, LiChrolut-RP-C

hexan, aceton, methanol / aceton, methanol

ibuprofen k. salicylová Oasis HLB 100 paracetamol

ethylacetát, aceton, milli-Q voda (pH2) / ethylacetát-aceton

naproxen diklofenak

48

Tabulka 5: Přehled publikovaných SPE metod pro extrakci NSAID z odpadních vod

NSAID Typ kolonky solvata ční činidlo(a) / elu ční činidlo(a) zdroj

ibuprofen Oasis HLB 101 naproxen

methanol, ethylacetát, hexan / ethylacetát

ketoprofen k. tolfenamová diklofenak diklofenak Oasis HLB hexan, ethylacetát / ethylacetát 102 ibuprofen naproxen k. salicylová Oasis MAXSPE 103 naproxen

methanol, hexan, dichlormethan / methanol

ketoprofen diklofenak indometacin k. klofibrová ENVI-18 104 ibuprofen

methanol, diethylether, toluen / methanol

ketoprofen k. mefenamová diklofenak diklofenak Oasis HLB 55 ibuprofen

acetonitril, methanol, hexan, ethylacetat / ethylacetát

ketoprofen naproxen kofein k. mefenamová Oasis HLB 105 indometacin

ethylacetát, acetonitril, methanol / methanol

ibuprofen naproxen diklofenak paracetamol kodein

2.7.3. Chromatografické metody při stanovení reziduí léčiv Jak už bylo zmíněno v úvodu kapitoly 2.7., chromatografické separační metody patří mezi nejvíce využívané instrumentální analytické metody pro stanovení reziduí léčiv z vodního prostředí. Umožňují separovat značné množství látek, což je velikým přínosem především při analýze tak složitých vzorků, jako jsou právě vzorky přírodních a odpadních vod. Nejčastěji se chromatografické metody používají ve spojení s hmotnostním spektrometrem, který v tomto spojení plní funkci citlivého a velice účinného detektoru a v případě hmotnostních spektrometrů s elektronovou ionizací současně i funkci „identifikátoru“ sloučenin. Z chromatografických metod je pak pro stanovení rozsáhlých skupin léčiv nejvíce používána kapalinová chromatografie, resp. HPLC s různými typy detektorů, kterými jsou zejména UV detektory, fluorescenční detektory (FLD) a hmotnostní spektrometr (MS). V posledních letech se při analýze přírodních vzorků vod začíná stále více aplikovat kapalinová chromatografie spojená s tandemovou hmotnostní spektrometrií (LC-MS/MS),

49

především díky vysoké selektivitě a citlivosti [73]. Hlavním důvodem nejčastějšího použití kapalinové chromatografie pro stanovení reziduí léčiv je především to, že při analýze touto metodou lze pracovat i za laboratorní teploty a není nutná přeměna kapalného vzorku na plyn. Tato metoda je proto vhodná pro separaci netěkavých nebo málo těkavých sloučenin, mezi které se řadí i léčiva. Není tedy potřeba provádět, na rozdíl od plynové chromatografie, derivatizaci analytů, která jednak zvyšuje celkový čas analýzy a jednak může způsobit určité chyby při stanovení [37, 52, 54, 91]. 2.7.3.1. Plynová chromatografie Plynová chromatografie se při zjišťování přítomnosti reziduí léčiv ve vodném prostředí využívá méně v porovnání s kapalinovou chromatografií. Důvodem je již zmíněná skutečnost, že léčiva se řadí mezi netěkavé nebo jen málo těkavé látky, a proto je nutné do analýzy zařadit derivatizační krok, který může přinášet určité nevýhody a chyby. Nicméně i navzdory této skutečnosti nabízí plynová chromatografie, v porovnání s kapalinovou chromatografií, mnohem vyšší separační účinnost díky vysoko účinným kapilárním kolonám. To umožňuje velice účinnou separaci i tak složitých systémů, jako jsou právě vzorky odpadních a přírodních vod, které obsahující velké množství různých organických látek. Plynová chromatografie se při stanovení léčiv využívá v současnosti téměř výhradně ve spojení s hmotnostní spektrometrií (GC-MS) [52]. Některé studie uvádí i použití jiných detektorů např. detektoru elektronového záchytu (ECD) [106], atomového emisního detektoru (AED) [58, 107] nebo plamenového ionizačního detektoru (FID) [108], ale jejich použití je spíše výjimečné. Vzhledem k tomu, že separované látky opouštějící kapilární kolonu plynového chromatografu jsou v plynném stavu, může být konec kolony zaveden přímo do ionizační komory hmotnostního spektrometru. To umožňuje, narozdíl od kapalinové chromatografie, kdy jsou eluované složky přítomny v kapalné fázi, použití tvrdých ionizačních technik (konkrétně elektronovou ionizaci), které způsobují charakteristické fragmentace, a v důsledku toho i snadnou identifikaci složek na základě porovnávání spekter analyzovaných složek se spektery uvedených v softwarové knihovně. V tomto případě tedy MS zastává i funkci určitého „identifikátoru“, což uživateli značně usnadňuje práci při identifikaci sloučenin. Spojení GC-MS a její využití při stopových a ultrastopových analýzách organických látek, jako jsou rezidua léčiv ve vodách, tedy umožňuje nejen velice účinnou separaci látek, ale rovněž jejich snadnou a spolehlivou identifikaci. Z těchto důvodů je uvedená metoda velice vhodná jak pro snadnou kvalitativní, tak i kvantitativní analýzu organických látek. 2.7.5.1.1. Plynový chromatograf Následující kapitola obsahuje obecný popis plynového chromatografu zaměřený na analýzu reziduí léčiv. Hlavními částmi plynového chromatografu jsou: čistící zařízení, regulátor průtoku nosného plynu, nástřikový port, separační kolona, termostat a detektor. V základním uspořádání je plynový chromatograf připojen ke zdroji nosného plynu a k počítači, který zpracovává signály z detektoru na výsledný chromatogram (obr. 18). [86, 91].

50

Obrázek 18: Schematický nákres plynového chromatografu [109]

Nosný plyn – volba nosného plynu není, v porovnání s LC, tak důležitá. Vesměs se používají inertní plyny (helium, argon, dusík), které se na rozdíl od ostatních separačních metod neúčastní slabých interakcí s analytem. Mnohem důležitější je určit optimální průtok nosného plynu tak, aby účinnost a rychlost separace byla optimální. Nejčastěji se při analýze reziduí léčiv uvádí jako nosný plyn helium [110-113]. Čistící zařízení – Hlavním problémem nosných plynů v plynové chromatografii je přítomnost nečistot, které mohou reagovat jak s analytem tak se stacionární fází a zkreslovat tak výsledky analýzy. Vzhledem k tomu je před regulátor průtoku umístěno čistící zařízení, které je schopno zachycovat nežádoucí příměsi v nosném plynu, především kyslík a vlhkost. Kromě toho zachycuje různé nečistoty a příměsi pocházející např. z použití konstrukčně a profesionálně chybných spojení a těsnění [86, 91, 113, 114]. Regulátor průtoku - slouží k udržení konstantní průtokové rychlosti nebo tlaku nosného plynu v separační koloně během analýzy [86, 91, 114]. Průtoková rychlost se odvíjí vždy od potřeby konkrétní analýzy. V případě analýzy reziduí léčiv se uvádí v rozmezí 0,7 ml.min-1 [115] až 0,6 ml.s-1 [110]; nejčastěji pak konstantní průtok 1 – 1,5 ml.min-1 [33, 103, 115]. Nástřikový port (injektor) – jeho vnitřní vyměnitelnou součástí je liner, ve kterém dochází k zavedení vzorku do proudu nosného plynu. Vzorek je do proudu nosného plynu dávkován stříkačkou (0,1 – 10 µl) přes pryžové septum. Při analýze reziduí léči se množství nastříknutého vzorku uvádí nejčastěji v rozmezí 1 – 4 µl [100, 101, 112]. Nastříknutý vzorek bývá většinou kapalný, proto musí mít liner dostatečně vysokou teplotu, aby došlo k okamžitému převedení vzorku do plynného stavu. Liner má vlastní regulovatelný termostat a jeho teplota bývá zpravidla o 50 °C vyšší než teplota kolony [113, 116]. Teplota nástřiku vychází z konkrétní analýzy. Při analýze reziduí léčiv izolovaných z vodného prostředí se nejčastěji uvádí okolo 300 °C [58, 110, 111]. Metoda nástřiku (split, splitless) vychází z optimalizace podmínek a předpokládaných koncentrací v reálných vzorcích. Vzhledem však k tomu, že se u léčiv jedná víceméně o stopová množství, je nejčastější uváděnou metodou nástřiku splitless metoda [101, 103, 115]. Separační kolona – je nejdůležitější součástí plynového chromatografu. Současná GC používá zpravidla tzv. kapilární kolony tvořené kapilárou z taveného křemene, která je z venku potažena filmem polymeru (polyimidu), který jí dodává pružnost a chrání tak před zlomením nebo jiným mechanickým poškozením. Délka kapiláry bývá zpravidla v rozmezí

51

10-100 m. Podle způsobu uložení stacionární fáze v kapilární koloně se rozlišují dva typy kapilárních kolon: WCOT a PLOT [116]. WCOT (Wall Coated Open Tubular) obsahuje tenký film stacionární fáze nanesený přímo na vnitřní stěně kolony. Tloušťka filmu u těchto kolon bývá 0,1 až 1 µm. Vnitřní průměr i tloušťka stěny kapilární kolony se pohybují ve stovkách mikrometrů [116]. PLOT (Porus Layer Open Tubular) je kolona, kde na vnitřní stěně kapiláry je nanesena, popř. z materiálu stěny chemicky vytvořená, pórovitá vrstva o tloušťce kolem 10 µm. Je-li tato vrstvička smočena stacionární fází, je tloušťka tohoto filmu větší než 1 µm [116]. Vedle mechanicky nanesených fází, které byly právě uvedeny, existují ještě kolony s vázanou stacionární fází. Ty mají stacionární fázi chemicky vázanou na vnitřní povrch kapiláry [116]. Kapilára je vždy umístěna na kruhovém držáku o průměru kolem 15 cm, na kterém je stočena dokola a tento držák s kolonou je upevněn uvnitř chromatografu. Vlastnosti chemické látky tvořící stacionární fázi zcela zásadně rozhodují o tom, jaké směsi je možno na dané koloně rozdělovat. Ta se volí podle charakteru vzorku a podle rozsahu teplot varu. Existuje mnoho typů stacionárních fází. V současnosti se však používá jen několik typů, většinou založených na bázi polysiloxanů. Polysiloxany obsahují ve svých řetězcích v různé míře navázané substituenty, které ovlivňují polaritu stacionární fáze [91, 116]. Při stanovení reziduí léčiv mohou být použité různé typy vázané stacionární fáze. Vše záleží na charakteru stanovovaných sloučenin. V následující části je uveden výčet kolon, nejčastěji publikovaných při stanovení reziduí léčiv pomocí plynové chromatografie. Nejčastěji se uvádí např. kolona HP5 MS (délka: 30 m, vnitřní průměr: 0,25 mm, stacionární fáze: 5 % difenyl, 95 % dimethylsiloxan, tloušťka 0,25 µm) [33, 96, 110, 117, 118, 119], HP Ultra 2 (délka: 12,5 m, vnitřní průměr: 0,22 mm, stacionární fáze tvořená filmem 5% fenylmethylsilikonem o tloušťce 0,33 µm) [58], HP-1 (délka 12 m, vnitřní průměr: 0,20 mm, tloušťka filmu stacionární fáze: 0,33 µm) [111], BP5 (délka 30 m, vnitřní průměr: 0,25 mm, tloušťka filmu stacionární fáze: 0,25 µm) [101], Rtx-5Sil MS (délka 30 m, vnitřní průměr: 0,25 mm, tloušťka filmu stacionární fáze: 0,25 µm) [103, 120] nebo DB-5MS (délka 30 (60) m, vnitřní průměr: 0,25 mm, tloušťka filmu stacionární fáze: 0,25 (0,32) µm) [48, 115, 121]. Termostat – udržuje konstantní teplotu separační kolony během analýzy nebo teplotu plynule mění podle nastaveného programu, tzv. teplotního programu. Obecně platí, že se vzrůstající teplotou klesá podíl disperzních interakcí a vzrůstá podíl polárních interakcí. Proto teplotní program např. při dělení isomerů nevede ke zlepšení rozlišení, zatímco u polárních látek ano. V obou případech však vede ke zkrácení elučních časů. Nastavení a průběh teplot opět závisí na konkrétních analytech a je třeba ho předem vyzkoušet a optimalizovat [113]. Detektor – slouží k detekci látek unášených nosným plynem. Jeho úkolem je poskytnout rozdílné signály při průchodu samotného nosného plynu a při průchodu nosného plynu obsahujícího eluovanou složku [113]. Přítomnost složky je indikována měřením určité vlastnosti plynu přicházejícího z kolony, která závisí na druhu a koncentraci složek. Musí mít dostatečnou citlivost a jeho odezva by měla být lineární funkcí obsahu analytu. Důležitým požadavkem je i vysoká selektivita pro stanovované analyty [86, 91]. Jak již bylo uvedeno, pro stanovení léčiv byly použity různé druhy detektorů, avšak nejvíce se v současné době aplikuje k detekci eluovaných složek hmotnostní spektrometr. Důvodem je jeho vysoká citlivost a selektivita. Princip plynové chromatografie, u které je mobilní fází plyn, navíc umožňuje přímé spojení GC a MS, kdy výstup z kolony je zaveden přímo do ionizačního zdroje. Vyhodnocovací zařízení – výsledný proudový signál se převádí na napěťovou odezvu. Chromatogram se potom získá jako grafický záznam závislosti napěťové odezvy na čase.

52

Vyhodnocovací zařízení zpracovává signál z detektoru, zakresluje chromatografickou křivku (chromatogram) a provádí její vyhodnocení [86, 91]. V současnosti se výhradně používají softwarové programy dodávané firmou spolu s přístrojem. Tyto programy obsahují jednoduché uživatelské rozhraní umožňující snadné a rychlé vyhodnocení. 2.7.3.2. Orthogonální komplexní dvojrozměrná plynová chromatografie s hmotnostně spektrometrickou detekcí Time-of-Flight (GCxGC-TOF MS)

GCxGC metoda byla poprvé navržena a popsána profesorem Johnem Phillipsem z univerzity v jižní Illinois v roce 1991 [122]. Jejím spojením s hmotnostním spektrometrem s analyzátorem doby letu (TOF) vznikla jedna z nejvýkonnějších analytických separačních technik současné doby. GCxGC-TOF MS je skvělou technikou pro analýzu komplexních směsí, jako jsou např. vzorky z petrochemického průmyslu, PCB, směsi pesticidů apod. [123]. Mnoho výhod přináší i při analýze environmentálních vzorků, jakými jsou právě přírodní a odpadní vody obsahující velké množství látek. V GCxGC jsou látky separovány na dvou bezprostředně po sobě následujících kolonách s rozdílnými stacionárními fázemi (např. nepolární x polární). Kolony jsou vzájemně spojeny modulačním zařízením (obr. 19), které slouží k frakcionaci eluentu z primární kolony (první dimenze) na velké množství krátkých úseků. Každý z nich je poté opětovně nastříknut na sekundární kolonu (druhá dimenze), kde dochází k další separaci látek, avšak s využitím odlišného mechanismu separace, než jakého je využito na primární koloně. Na sekundární, úzké a krátké koloně, probíhá velmi rychlá separace v řádech několika sekund. Je vedena za izotermních podmínek a je dokončena dříve, než je provedena další modulace. Každý pík eluující se z primární kolony je modulován několikrát, čímž je zachováno chromatografické rozlišení z první dimenze (obr. 20 a 21). Dochází tak ke komplexní separaci vzorku dvěma odlišnými mechanismy, tj. ve dvou dimenzích [124-126]. Důsledkem tohoto uspořádání je to, že složky směsi, které se od sebe nepodařilo oddělit v první dimenzi, je možné od sebe oddělit v druhé dimenzi, kde je využíváno k separaci zcela jiných vlastností sloučenin. Výstupem ze systému GCxGC je velké množství vysokorychlostních chromatogramů z druhé kolony; ty jsou skládány jeden vedle druhého a vytvářejí dvourozměrný chromatogram, kde je každá dimenze reprezentována retenčními časy z jednotlivých kolon [123] (obr. 21). Nejčastější způsob vizualizace takového chromatogramu je obrysový (vrstevnicový) diagram tzv. contour plot, tedy jistý druh mapy, ve které se píky jeví jako skvrny a s použitím barev a stínů je vyznačena jejich intenzita [123] (obr. 22). Výše uvedené možnosti přináší, v porovnání s LC nebo klasickou GC, mnoho výhod při stopové a ultrastopové analýze organických látek, mezi které patří i rezidua léčiv. Hlavními výhodami této techniky jsou zejména vysoký stupeň separace látek a vysoká citlivost daná zvýšeným poměrem signálu a šumu. Díky vysokému stupni separace je navíc do značné míry potlačen i vliv matričních efektů, které by mohly jinak rušit vlastní stanovení. GCxGC systém je napojen na hmotnostní spektrometr s velice citlivým vysokorychlostním analyzátorem doby letu (Time-of-Flight). Tento typ analyzátoru se řadí k tzv. neskenovacím analyzátorům, tzn., že nedochází ke snímání iontů v určitých časových cyklech, ale v každém okamžiku jsou zaznamenány všechny ionty, které dosáhnou detektoru. To přináší mnoho výhod především při jejich identifikaci (obr. 23). Vysokorychlostní TOF je detekční systém schopný vyvinout vysokou akviziční rychlost, tedy schopnost sejmout dostatečný počet bodů přes chromatografický pík [123, 127]. Spojení tohoto analyzátoru s GCxGC je proto velice vhodné, protože systém GCxGC generuje velmi úzké píky ve stovkách milisekund až několika sekund, což vyžaduje velice rychlý a výkonný detekční systém, kterým je právě vysokorychlostní TOF. Software dodávaný firmou LECO má k dispozici několik různých knihoven spekter, která obsahují hmotnostní spektra velkého

53

množství různých organických látek. Porovnáním těchto spekter se spektry sledovaných analytů usnadňuje velkou měrou jejich identifikaci.

Obrázek 19: Znázornění spojení primární a sekundární kolony modulačním zařízením [128]

Obrázek 20: Výsledek modulace v grafickém znázornění [128]. Při modulaci dochází k rozdělení eluátu z primární kolony na několik frakcí, které jsou následně nastříknuty na sekundární kolonu. V grafickém znázornění se to projeví tím, že dojde k „rozseknutí“ 1D píku (jak by byl znázorněn při jednokolonové separaci) na několik „parciálních“ 2D píků, které se vyznačují různým časem v první dimenzi (stejný časový postup jako u 1D píku), ale stejným retenčním časem v druhé dimenzi. Počet „parciálních“ píků závisí na koncentraci látky a modulační periodě; ve spodní části obrázku je modulační perioda = 2 s.

1st time

2nd time

54

Obrázek 21: Tvorba GCxGC chromatogramu [128]

Obrázek 22: Ukázka typického GCxGC chromatogramu, tzv. contour plot

55

Obrázek 23: Výhoda systému při identifikaci sloučenin – zobrazení detekce na charakteristických hmotách (m/z) [124]. Díky vysoké akviziční rychlosti TOF MS analyzátoru a schopnosti zaznamenat všechny ionty, které dosáhnou detektoru, je možné analyzovat jednotlivé složky směsi na jejich charakteristických hmotách (Unique Mass). Výběrem vhodné hmoty (resp. iontu) charakteristické pro danou sloučeninu je docíleno jejího odfiltrování od pozadí TIC, který zobrazuje detekci všech iontů bez rozdílu. Tím je odstraněn problém s koelucí látek patrný ze zobrazení v TIC.

Obrázek 24: Přístrojové uspořádání GCxGC-TOF MS [124] 2.7.4. Derivatizace Specifickým problémem v plynové chromatografii je analýza málo těkavých a málo termicky stabilních látek. Aby mohl být vzorek transportován a došlo tak k úspěšné analýze,

56

je nezbytnou podmínkou jeho okamžitá přeměna na plyn ihned po nástřiku. Pokud je však původní vzorek netěkavý nebo jen velmi málo těkavý, nastává problém s jeho odpařením. Při nástřiku vzorku je poměrně vysokou teplotou (okolo 300 °C) docíleno rychlého odpaření, a proto další nezbytnou podmínkou je to, aby analyty byly termicky stabilní a nedocházelo při těchto teplotách k jejich termickému rozkladu [129]. Léčiva se však vyznačují velmi nízkou těkavostí [88]. Proto se v těchto případech provádí tzv. derivatizace, což je převedení analytu chemickou reakcí na deriváty již dobře analyzovatelné plynovou chromatografií. Jedná se tedy o metodu, při které se mění chemické složení původního vzorku. Derivatizované jsou především funkční skupiny jako OH, COOH, NH a SH. Chemickou modifikací látek obsahující tyto skupiny se tak zajišťuje nižší polarita a vyšší těkavost, vyšší tepelná stabilita, zlepšení selektivity a zvýšená odezva v detektoru [86, 91, 130]. Činidlo, reagující se vzorkem za účelem vzniku požadovaných derivátů, se nazývá derivatizační činidlo. Vhodné derivatizační činidlo musí splňovat několik požadavků: reakce s analytem musí probíhat rychle, kvantitativně a s definovanou stechiometrií a reakční produkt musí mít výše zmíněné vlastnosti požadované pro úspěšné stanovení plynovou chromatografií [93]. Nízká těkavost léčiv je způsobená silnými mezimolekulovými interakcemi mezi polárními skupinami, jako jsou právě OH, COOH, NH a SH. Účelem derivatizace je v těchto případech snížit polaritu molekul odstraněním, resp. náhradou, aktivního vodíku ve funkční skupině jinou charakteristickou skupinou, čímž dojde k omezení možnosti tvorby vodíkových můstků, což má za následek zvýšení těkavosti sledovaných analytů. Pro tyto účely se nejčastěji používají následující derivatizační metody: silylace, acylace a alkylace. Při alkylaci dochází ke snížení polarity molekuly náhradou aktivního vodíku alkylem (nejčastěji methylem), při silylaci různě methylovanou silyl skupinou (zpravidla trimethylsilyl skupinou) a při acylaci acyl skupinou. Při derivatizaci léčiv obsahujících karboxylové skupiny, což je právě většina léčiv ze skupiny NSAID, se používá především silylace [119, 131, 132, 133], a to vzhledem ke své nenáročnosti a ke snadnému pořízení specifických derivatizačních činidel. Nejpoužívanějšími silylačními činidly jsou (obr. 25): N-methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamid (MSTFA) N,O-bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamid (BSTFA) N-methyl-N-terc-buthyldimethylsilyl-trifluoroacetamid (MTBSTFA) Dalšími činidly mohou být trimethylchlorsilan (TMCS), N-trimethylsilylimidazole (TMSI), případně jejich různé směsi apod.

Obrázek 25: Chemické struktury MSTFA, BSTFA a MTBSTFA Obecná silylační reakce s použitím MSTFA je znázorněna na následujícím schématu (obr. 26). Alkylsilyl skupina nahrazuje aktivní vodíkový atom v molekule analytu a vodíkový atom přechází na původní molekulu derivatizačního činidla. Silylační činidla jsou velice reaktivní a zejména jsou citlivé na vlhkost. Aby se zamezilo možným problémům, které způsobuje vlhkost, doporučuje se použít při derivatizaci nadbytek

57

derivatizačního činidla a vhodného rozpouštědla, které neobsahuje aktivní vodíkové atomy. Jako velmi vhodné rozpouštědlo se v mnoha případech uvádí pyridin [131]. Silylační reakce vyžaduje zvýšení teploty minimálně na 70 °C a vyšší. Je však třeba brát v úvahu termální stabilitu analytu. Doba derivatizace závisí na konkrétních sloučeninách. Může se pohybovat v rozmezí od několika minut až po několik hodin, a proto je třeba vždy provést optimalizaci.

Obrázek 26: Obecné znázornění silylační reakce a příklad štěpení MSTFA

58

3. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST

3.1. Nastavení přístroje Veškeré optimalizace, přípravy a finální stanovení reálných vzorků byly prováděny na přístroji Pegasus IV D (LECO, USA) vybaveným primární kolonou Rxi-5Sil MS 30 m x 0,25 mm, 0,25 µm (5 % difenyl / 95 % dimethyl arylene polysiloxan) a sekundární kolonou BPX-50 1,5 m x 0,1 mm, 0,1 µm (50 % difenyl / 50 % dimethyl polysiloxan). Nosným plynem bylo helium (99,99990%, Linde Gas, ČR). Pro kryogenní fokusaci v modulačním zařízení byl použit plynný a kapalný dusík. Plynový chromatograf byl propojen s hmotnostním spektrometrem s elektronovou ionizací a analyzátorem doby letu (TOF). Nastavení přístroje bylo, až na menší úpravy, použito z literatury [134], kde bylo efektivně aplikováno při detekci 5 léčiv ze skupiny NSAID. Předpokládalo se, že toto nastavení bude vhodné i pro rozšířená léčiva podobných struktur, což se během optimalizací potvrdilo. Některá měření byla prováděna pouze v první dimenzi (1D analýza, GC analýza), kde byly nastaveny následující parametry: PLYNOVÝ CHROMATOGRAF

� Množství nastříknutého vzorku: 1 µl � Teplota nástřiku (inlet temperature): 270 °C � Metoda nástřiku (inlet mode): splitless � Průtok nosného plynu: 1 ml.min-1 � Teplotní program: začátek 80 °C po dobu 1 min, poté nárůst teploty 20 °C.min-1 do

300 °C, která byla udržována po 2 min � Teplota Transfer Line: 280 °C

HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETR

� Solvent delay: 400 s � Rozsah sledovaných molekulových hmotností: 50 - 600 � Skenovací rychlost: 5 spekter.s-1 � Napětí na detektoru: 1850 V � Ionizační energie: 70 eV � Teplota iontového zdroje (temperature ion source): 220 °C

Pro měření v obou dimenzích (2D analýza, GCxGC analýza) byly nastaveny následující parametry: PLYNOVÝ CHROMATOGRAF

� Množství nastříknutého vzorku: 1 µl � Teplota nástřiku (inlet temperature): 270 °C � Metoda nástřiku (inlet mode): splitless � Průtok nosného plynu: 1 ml.min-1 � Teplotní program:

o První dimenze: začátek 80 °C po dobu 1 min, poté nárůst teploty 15 °C.min-1 do 300 °C, která byla udržována 2 min

o Druhá dimenze: začátek 85 °C po dobu 1 min, poté nárůst teploty 15 °C.min-1 do 305 °C, která byla udržována 2 min

� Teplota Transfer Line: 280 °C

59

� Modulator temperature Offset: 20 °C � Second dimension separation time: 2 s � Hot pulse: 0,40 s � Cool time: 0,60 s

HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETR

� Solvent delay: 400 s � Rozsah sledovaných molekulových hmotností: 50 - 600 � Skenovací rychlost: 100 spekter.s-1 � Napětí na detektoru: 1900 V � Ionizační energie: 70 eV � Teplota iontového zdroje (temperature ion source): 250 °C

3.2. Optimalizace derivatizace vybraných analgetik pro GCxGC analýzu Optimalizace derivatizace spočívala ve výběru vhodného derivatizačního činidla, určení jeho optimálního množství a určení optimálních podmínek pro derivatizaci (čas a teplota). Pro tyto účely byl připraven zásobní roztok, a to rozpuštěním standardů všech sledovaných léčiv ve 100 ml methanolu tak, aby jejich koncentrace byla 160 ng.ml-1. Tato vysoká koncentrace byla zvolena především z důvodu zajištění vysoké odezvy, což vedlo ke snadné identifikaci látek a k následnému zjištění jejich retenčních časů, charakteristických m/z a hmotnostních spekter, tj. údajů nezbytných pro další kvalitativní vyhodnocování. Optimalizace postupu derivatizace vycházela ze základů uvedených v v literatuře [134], kde byly úspěšně aplikovány při detekci některých NSAID. Z připraveného zásobního roztoku bylo odebráno 500 µl do 1,8ml vialky. Toto množství bylo dosucha odpařeno pod proudem dusíku a po odpaření veškerého rozpouštědla byl obsah vialky znovu rozpuštěn ve směsi pyridinu a derivatizačního činidla v takovém množství, aby výsledný objem směsi byl 400 µl. Poté byly vialky uzavřeny a vloženy do zahřívacího zařízení, kde po určitou dobu a při určité teplotě docházelo k derivatizaci. Jako derivatizační činidla byla použita silylační činidla MSTFA (N-methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamid) a BSTFA (N,O-bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamid). Po uplynutí doby určené k derivatizaci byly vzorky analyzovány pomocí GC-TOF MS nebo GCxGC-TOF MS. 3.2.1. Přístroje a zařízení

� Analytické váhy HR-120, A&D Instruments, Japonsko � Přístroj EVATERM pro sušení dusíkem a zahřívání vzorků, LABICOM, ČR � Běžné laboratorní vybavení � Plynový chromatograf Pegasus IV D, LECO®, USA

3.2.2. Chemikálie a standardy

� Methanol, pro HPLC, Lach-Ner, s.r.o., Česká republika � Pyridin, Lach-Ner, s.r.o., Česká Republika � Kyselina salicylová, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Německo � Kyselina acetylsalicylová, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Německo � Kyselina klofibrová, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Německo � Ibuprofen sodná sůl, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Německo � Paracetamol, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Německo

60

� Kofein, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Německo � Naproxen, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Německo � Kyselina mefenamová, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Německo � Ketoprofen, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Německo � Diklofenak sodná sůl, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Německo � N-methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamid (MSTFA), Sigma-Aldrich Chemie

GmbH, Německo � N,O-bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamid (BSTFA), Sigma-Aldrich Chemie GmbH,

Německo 3.2.3. Retenční časy, charakteristické m/z a hmotnostní spektra Pro zjištění retenčních časů a hmotnostních spekter vybraných látek byl při analýze použit následující zkušební postup: ze zásobního roztoku bylo odebráno 500 µl do 1,8ml vialky a toto množství odpařeno pod proudem dusíku. Po odpaření rozpouštědla bylo do vialky přidáno 100 µl pyridinu + 300 µl derivatizačního činidla (MSTFA, BSTFA). Derivatizace probíhala při teplotě 70 °C po dobu 90 minut. 3.2.4. Výběr vhodnějšího derivatizačního činidla Pro zjištění vhodnějšího derivatizačního činidla byly použity N-methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamid (MSTFA) a N,O-bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamid (BSTFA) a ověřen byl následující zkušební postup: ze zásobního roztoku bylo odebráno 500 µl do 1,8ml vialky a odpařeno pod proudem dusíku. Po odpaření rozpouštědla bylo do vialky přidáno 100 µl pyridinu + 300 µl derivatizačního činidla (MSTFA nebo BSTFA). Derivatizace probíhala při teplotě 70 °C po dobu 90 minut. 3.2.5. Optimalizace množství derivatizačního činidla Na základě výsledků z předešlého ověření, podrobněji uvedených v kapitole 4.1.2., se ukázalo, že vhodnějším derivatizačním činidlem je MSTFA, zejména díky jeho lepší odezvě při analýze. Zjišťování optimálního množství derivatizačního činidla tedy následně probíhalo již pouze pro MSTFA. Pro zjištění optimálního množství byly použity tyto poměry objemů MSTFA a rozpouštědla (pyridinu):

1. 25 µl činidla + 375 µl pyridinu 2. 50 µl činidla + 350 µl pyridinu 3. 100 µl činidla + 300 µl pyridinu 4. 200 µl činidla + 200 µl pyridinu

Derivatizace potom probíhala po prozatím navrženou zkušební dobu 90 minut při zkušební teplotě 70 °C. 3.2.6. Optimalizace času a teplota derivatizace Do 1,8ml vialky bylo, stejně jako v předešlých případech, odebráno 500 µl z připraveného zásobního roztoku. Po odpaření rozpouštědla pod proudem dusíku byl do vialky přidán již optimalizovaný poměr pyridinu a MSTFA zjištěný z předcházejícím měření, tj. 200 µl MSTFA + 200 µl pyridinu (viz. výsledky v kapitole 4.1.3.). Poté byly vialky

61

zahřívány různě dlouhou dobu při různých teplotách. Ověřené časy byly následující: 30 min, 60 min, 90 min a 120 min. Zvolené teploty byly tyto: 30 °C, 50 °C, 70 °C a 90 °C.

3.3. Optimalizace účinnosti SPE Základ postupu pro extrakci tuhou fází byl použit z literatury [136, 145]. Bylo však provedeno navíc několik dalších optimalizačních kroků, a to za účelem zvýšení účinnosti extrakce a zjištění optimálních podmínek extrakce pro tuto studii. Mezi tyto kroky patří především zjištění vlivu pH vzorku a vlivu množství aplikovaného vzorku na účinnost SPE metody vzhledem k rozšíření sledovaných léčiv. 3.3.1. Přístroje a zařízení

� pH metr inoLab pH 730, Česká republika � SPE extraktor Baker, model spe - 12G, s vakuovou pumpou Barmany, Co., USA � SPE kolonka typu Oasis HLB, 60 mg, Waters, USA � Běžné laboratorní vybavení � Plynový chromatograf Pegasus IV D, LECO®, USA

3.3.2. Chemikálie a standardy � Methanol, pro HPLC, Lach-Ner, s.r.o., Česká Republika � Pyridin, Lach-Ner, s.r.o., Česká Republika � Kyselina chlorovodíková ONEX CHEMIE, s.r.o., Česká republika � 2M roztok KOH � Kyselina salicylová, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Německo � Kyselina acetylsalicylová, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Německo � Kyselina klofibrová, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Německo � Ibuprofen sodná sůl, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Německo � Paracetamol, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Německo � Kofein, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Německo � Naproxen, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Německo � Kyselina mefenamová, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Německo � Ketoprofen, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Německo � Diklofenak sodná sůl, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Německo � N-methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamid (MSTFA), Sigma-Aldrich Chemie

GmbH, Německo

3.3.3. Účinnost SPE a její ovlivnění úpravou pH aplikovaného vzorku Pro zjištění vlivu pH vzorku na účinnost SPE byly ověřeny následující hodnoty pH: 2, 7 a 9. Byl připraven zkušební vzorek rozpuštěním standardů v milli-Q vodě a následně zředěn tak, aby koncentrace léčiv ve 100 ml milli-Q (objem zkušebního vzorku) byla 120 ng (tj. 1,2 ng.ml-1), což zhruba odpovídá nižším hladinám očekávaných koncentrací v reálných vzorcích vod (povrchové vody). U tohoto objemu zkušebního vzorku pak bylo upraveno pH na testovanou hodnotu. Pro úpravu pH na hodnotu 2 byla použita koncentrovaná kyselina chlorovodíková a pro úpravu pH na hodnotu 9 pak 2M roztok hydroxidu draselného. Pro každou hodnotu byly připraveny tři takovéto zkušební vzorky a výsledné hodnoty zprůměrňovány. Postup SPE byl následující:

62

� Předúprava kolonky: 6 ml methanolu, 3 ml milli-Q vody (s upraveným pH) � 100 ml zkušebního vzorku (s upraveným pH) � Promytí: 3 ml milli-Q vody � Sušení proudem vzduchu 10 – 15 minut � Eluce: 6 ml methanolu

Eluát byl sbírán do 12ml vialek. Z tohoto množství bylo odebráno 500 µl do 1,8ml vialky, odpařeno pod proudem dusíku a derivatizováno za optimalizovaných podmínek uvedených v kapitole 4.1.4. Po zjištění nejvhodnější hodnoty pH byla provedeno ještě posouzení účinnosti pro vyšší koncentrace, při kterém bylo aplikováno 100 ml zkušebního vzorku, stejně jako v předchozím případě, avšak s vyšší koncentrací a to 2000 ng v aplikovaných 100 ml zkušebního vzorku (tj. 20 ng.ml-1), což zhruba odpovídá vyšším koncentracím v reálných vzorcích vod (odpadní vody - přítok). 3.3.4. Vliv množství aplikovaného vzorku na účinnost SPE Protože se předpokládalo, že při vyšších objemech aplikovaného vzorku se bude část léčiv zachycených v SPE kolonce opět vymývat, bylo provedeno měření za účelem zjištění ideálního množství (objemu) aplikovaného vzorku. Pro tento účel bylo připraveno několik zkušebních vzorků o různých objemech milli-Q vody, avšak každý z nich obsahoval stejné množství rozpuštěných léčiv. Množství bylo volené tak, aby hodnota výsledné koncentrace, přepočtené na litr, odpovídala rozpětí hodnot mezi nižšími a vyššími koncentracemi v reálných vzorcích, což představovalo zhruba rozsah koncentrací 1 – 20 µg.l-1. Každý zkoušený objem obsahoval 2 µg od každého léčiva. Ověřené objemy byly následující: 100 ml, 250 ml, 400 ml, 600 ml, 900 ml. Těsně před vlastním provedením SPE bylo pH jednotlivých zkušebních vzorků upraveno na hodnotu 2. 3.3.5. Ověření účinnosti vybrané SPE metody na reálných vzorcích, vliv matrice Předpokládalo se, že reálné matrice (povrchová a odpadní voda) mohou určitým způsobem ovlivňovat stanovení vybraných látek především díky matričním efektům. V tomto případě představuje nejslabší část celého stanovení právě extrakce. Proto bylo nutné alespoň skupinově ověřit účinnost SPE na reálných vzorcích. Vzhledem k tomu, že odpadní i povrchová voda mnohdy obsahovaly některé stanovované analyty, musely být pro ověření použity takové standardy, o kterých se vědělo, že nebudou obsaženy v povrchové ani odpadní vodě, aby nedocházelo ke zkreslení získaných hodnot, a které budou díky své chemické povaze dobře reprezentovat celou skupinu vybraných látek. V tomto případě se jednalo o kyseliny klofibrovou a mefenamovou, které jako jediné nebyly detekovány v žádném ze všech odebraných vzorků (viz. výsledky v kapitole 4.4.4.). V prováděném testu proto byly použity jako „srovnávací“ standardy zastupující celou skupinu stanovovaných látek. Za tímto účelem byl použit modelový vzorek (milli-Q voda), vzorek odpadní vody (přítok ze dne 8.11.) a vzorek povrchové vody (místo odběru Jimramov 1). Od všech 3 vzorků bylo odebráno a pro hodnocení použito 5 x 250 ml, do kterých byly přidány 2 µg od obou standardů. Koncentrace v tomto případě tedy činila 8 µg.l-1, což odpovídá zhruba střední hodnotě mezi nižšími koncentracemi (povrchová voda) a vyššími koncentracemi (odpadní voda) v reálných vzorcích (tj. 1 – 20 µg.l-1). Objem aplikovaného vzorku ani připravená koncentrace nebyly v tomto případě rozhodující, protože šlo pouze o zjištění vlivu matričních

63

efektů porovnáním účinností extrakce modelového vzorku s vybranými vzorky odpadní a povrchové vody. Byla však snaha najít nějakou střední hodnotu a proto byla zvolena právě výše uvedená koncentrace. Po přípravě uvedených vzorků následovala jejich filtrace přes filtry ze skleněných mikrovláken a poté stejný postup pro SPE i derivatizaci, jaký byl optimalizován na modelových vzorcích:

� Předúprava kolonky: 6 ml methanolu, 3 ml milli-Q vody (pH = 2) � 250 ml vzorku (milli-Q, odpadní, povrchová) o pH = 2 � Promytí: 3 ml milli-Q vody � Sušení proudem vzduchu 10 – 15 minut � Eluce: 6 ml methanolu � 500 µl eluátu převedeno do 1,8ml vialky, odpařeno pod proudem dusíku, opětné

rozpuštění ve směsi 200 µl pyridinu + 200 µl MSTFA, inkubace při 70 °C 90 minut

� Analýza GCxGC-TOF MS

3.4. Studium degradace vybraných léčiv ve vodném prostředí Za účelem zjištění chování vybraných léčiv ve vodném prostředí byla provedena následující studie, jejímž hlavním úkolem bylo sledovat změnu koncentrace jednotlivých léčiv ve vodě v závislosti na čase při dvou různých teplotách. Byl připraven roztok standardů rozpuštěných v milli-Q vodě tak, aby počáteční koncentrace byla 160 ng.ml-1. Bylo nutné připravit vodný roztok zvlášť pro kyselinu acetylsalicylovou, protože se předpokládalo, že dochází ve vodném prostředí k jejímu rozkladu na kyselinu salicylovou, čímž by došlo ke zkreslení hodnot pro připravenou kyselinu salicylovou, v důsledku přírůstku její koncentrace. Proto byly připraveny 4 reakční lahve, které obsahovaly 100 ml milli-Q vody s rozpuštěnými léčivy; dvě obsahovaly pouze kyselinu acetylsalicylovou (c = 160 ng.ml-1) a další dvě obsahovaly ostatní léčiva. Poté byla každá dvojice reakčních lahví skladována v temnu při dvou rozdílných teplotách, jedna dvojice při 5 °C a druhá dvojice při 20 °C. V pravidelných intervalech (vždy po několika dnech) byla měřena koncentrace jednotlivých léčiv a sledován její pokles v důsledku samovolné degradace.

3.5. Stanovení vybraných léčiv v reálných vzorcích vod V odpadních a povrchových vodách byla zjišťována rezidua léčiv ze skupiny analgetik a nesteroidních protizánětlivých látek (kyselina salicylová, kyselina acetylsalicylová, kyselina klofibrová, ibuprofen, paracetamol, kofein, naproxen, kyselina mefenamová, ketoprofen, diklofenak) podrobněji popsaných v předcházející kapitole 2.3.4. 3.5.1. Velkokapacitní ČOV Brno – Modřice (technický popis) Vzorky odpadní vody byly odebírány z velkokapacitní ČOV v Brně – Modřicích. Tato ČOV byla do provozu uvedena v roce 1961 jako klasická dvoustupňová čistírna s anaerobní stabilizací kalu. S rozvojem města a následujícím hydraulickým i látkovým přetížením bylo v průběhu 80. let postupně prováděno rozšíření prakticky celé ČOV. V devadesátých letech již nebylo možné přetížení ČOV, a zejména poptávku okolních aglomerací po napojení na brněnský kanalizační systém, řešit dalšími dílčími úpravami, a proto v letech 2001 až 2004

64

proběhla celková rekonstrukce a rozšíření. V současné době je zajištěna dostatečná kapacita ČOV i pro očekávaný rozvoj Brna a blízkého okolí a čistírna odpadních vod splňuje podmínky české i evropské legislativy [135]. ČOV je navržená pro 630 tis. EO s průměrným přítokem 7 020 m3.h−1 (max. přítok 15 199 m3.h−1). Slouží pro čištění odpadních vod z města Brna a širokého okolí (Kuřim, Modřice, Želešice, Česká u Brna, Šlapanice, Šlapanice-Bedřichovice, Ostopovice, Moravské Knínice, Lipůvka, Podolí, Ponětovice a Rozdrojovice) (příloha 1, obr. 48). V případě vyššího přítoku, např. za deště, se voda nejprve kumuluje v dešťové zdrži s kapacitou 10 500 m3 a po skončení dešťové události je přečerpávána zpět na ČOV. Zádrž čistírny je 24 hodin. Mechanickou část čistírny tvoří: lápák hrubého štěrku, jemné česle, lapák písku (se separací tuku) a šest usazovacích nádrží. Biologická část je tvořena dvěma aktivačními nádržemi, které lze provozovat samostatně nebo společně. Voda je přiváděna nejprve do anaerobní nádrže s funkcí defosfatace, následně do oběhové anoxické nádrže s funkcí předřazené denitrifikace. Posledním stupněm aktivace je oxická část s jemnobublinnou aerací, která je rozdělená na provzdušňovanou a neprovzdušňovanou zónu. Z aktivačních nádrží postupuje směs do šesti dosazovacích nádrží. Přebytečný aktivovaný kal je zpracováván v kalovém hospodářství, které tvoří: zahušťovací nádrž primárního kalu, flotační zahušťovač pro biologický kal, homogenizační, vyhnívací a uskladňovací nádrže, zařízení na odvodňování kalu a sušárna kalu. Bioplyn, produkovaný při vyhnívání kalu, je odváděn z vyhnívacích nádrží, kumulován ve dvou membránových plynojemech a poté využíván pro výrobu elektrické energie a tepla v kogeneračních jednotkách [135, 136]. 3.5.2. Přístroje a zařízení Odběr vzorků

� Hloubkový vzorkovač o objemu 3 litrů od firmy OPTING service (pro odběr vzorků povrchové vody na některých místech)

� Odpadní voda byla odebírána speciálním kontinuálním odběrovým zařízením v ČOV přímo personálem čistírny

Příprava a extrakce vzorků

� Filtry ze skleněných mikrovláken, typ Z-4, 55 mm, Papírna Pernštejn s.r.o., ČR � pH metr inoLab pH 730, Česká republika � SPE kolonky typu Oasis® HLB Cartridge, Waters, USA � SPE extraktor Baker, model spe - 12G, s vakuovou pumpou Barmany, Co., USA � Přístroj EVATERM pro sušení dusíkem a zahřívání vzorků, LABICOM, ČR � Běžné laboratorní vybavení

Plynová chromatografie

� Plynový chromatograf Pegasus IV D, LECO®, USA 3.5.3. Chemikálie a standardy

� Methanol, pro HPLC, Lach-Ner, s.r.o., Česká Republika � Kyselina chlorovodíková ONEX CHEMIE, s.r.o., Česká republika � Pyridin, Lach-Ner, s.r.o., Česká Republika � MSTFA, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Německo

65

3.5.4. Použité postupy a metody

3.5.4.1. Odběr vzorků Vzorky odpadní vody byly odebírány pravidelně každý den v měsíci listopadu 2010 (od 2.11. do 1.12.) na přítoku i odtoku z velkokapacitní ČOV v Brně Modřicích. Jednalo se o 24 hodinové směsné vzorky odebírané speciálním odběrovým zařízením čistírny ve dvouhodinových intervalech. Vzorky povrchové vody byly odebrány 4. října 2010 na 11 místech řeky Svratky, po celé její délce v následujících obcích: Svratka, Jimramov, Vír, Štěpánov nad Svratkou, Tišnov, Veverská Bitýška, Brno - Jundrov, Brno – soutok řek Svratka a Svitava, Brno – Modřice, Rajhradice a Židlochovice. Odběry byly provedeny vždy před a za uvedenou obcí, kromě Brna, kde byly odebrány vzorky na třech místech. Z řeky Svratky tak bylo odebráno celkem 19 vzorků. Místa odběru povrchové vody z řeky Svratky jsou znázorněna na mapě [obr. 27 (a) a podrobněji v příloze 2]. Další monitorovanou řekou byla Svitava, ze které byly vzorky odebrány 23. října 2010 na 7 místech rovnoměrně rozložených po celé délce toku, a to v následujících obcích: Svitavy, Březová nad Svitavou, Letovice, Blansko, Adamov, před Brnem a Brno – soutok řek Svratka a Svitava. U prvních 5 míst byly vzorky odebrány vždy před a za uvedenou obcí. Celkem tedy bylo z řeky Svitavy odebráno 12 vzorků. Místa odběru povrchové vody z řeky Svitavy jsou znázorněna na mapě [obr. 27 (b) a podrobněji v příloze 2].

Obrázek 27: Mapa míst odběru povrchové vody z řek Svratky (a) a Svitavy (b)

(a) (b)

66

Ukázka odběrového protokolu pro povrchovou vodu je uvedena v příloze 3. Vzorky odpadní i povrchové vody byly vždy odebírány do tmavých 2,5 litrových lahví předem vymytých kyselinou chromsírovou a deionizovanou vodou. V následujících kapitolách je uvedeno zpracování a analýza odebraných vzorků. Z každého odběru byly paralelně zpracovány a proměřeny vždy 3 vzorky. 3.5.4.2. Příprava vzorků a SPE Ihned po dopravě do laboratoře byly vzorky zfiltrovány pomocí vysokotlakého filtračního zařízení přes filtr ze skleněných mikrovláken. Následovala extrakce tuhou fází (SPE) na kolonkách Oasis HLB (60 mg sorbentu, 3 ml) od firmy Waters, USA. Na SPE bylo použito 250 ml filtrátu odpadní vody a 400 ml filtrátu povrchové vody, v obou případech upravené s použitím kyseliny chlorovodíkové na pH 2. Pro SPE byl použit následující postup, který vychází z předem uvedených optimalizací podrobně uvedených v kapitole 4.2.:

� Předúprava kolonky: 6 ml methanolu, 3 ml milli-Q vody (pH = 2) � Vzorek o pH = 2 (250 ml pro odpadní vodu; 400 ml pro povrchovou vodu) � Promytí: 3 ml milli-Q vody � Sušení proudem vzduchu 10 – 15 minut � Eluce: 6 ml methanolu

Eluát byl jímán do 12ml vialek. Pokud k extrakci nedošlo ihned, byly přefiltrované vzorky vod uloženy v lednici při teplotě 5 °C a zpracovány nejpozději do třetího dne po odběru. 3.5.4.3. Derivatizace Derivatizace (trimethylsilylace) byla provedena pomocí derivatizačního činidla MSTFA. Postup vycházel z optimalizovaných podmínek zjištěných v předchozích částech. Po eluci (poslední krok SPE) bylo z eluátu odebráno vždy 500 µl do 1,8ml vialky a toto množství odpařeno pod proudem dusíku. Po odpaření bylo do vialky přidána směs 200 µl pyridinu + 200 µl MSTFA a obsah vialky znovu důkladně rozpuštěn. Poté následovala inkubace vzorku po dobu 90 minut při teplotě 70 °C. 3.5.4.4. Analýza vzorků Finální GCxGC-MS TOF analýza byla provedena za nastavených podmínek uvedených v kapitole 3.1.

67

4. VÝSLEDKY A DISKUZE

4.1. Optimalizace derivatizace vybraných analgetik 4.1.1. Retenční časy, charakteristické m/z a hmotnostní spektra Zjištění retenčních časů, charakteristických m/z a hmotnostních spekter derivátů jednotlivých léčiv vycházelo z měření roztoku získaného rozpuštěním příslušných standardů léčiv v methanolu (viz. kapitola 3.2.3.). Roztoky byly připraveny tak, aby koncentrace standardů léčiv byla vysoká (160 ng.ml-1). Díky vysoké koncentraci analytů a vysoké čistotě rozpouštědla (methanolu) měly při GC analýze na chromatogramu největší odezvu právě deriváty vybraných léčiv. V TIC (total iont current) módu TOF analyzátoru pak byly vybrány charakteristické poměry m/z, na kterých byla odezva jednotlivých derivátů léčiv nejvyšší a nejzřetelnější. Tyto hmoty později sloužily nejen jako identifikační, ale současně jako kvantifikační. Současně byla zjištěna i hmotnostní spektra, která byla uložena do vlastní knihovny spekter a s její pomocí pak byla rezidua léčiv identifikována v reálných vzorcích vod. Při tomto zjišťování se vycházelo z předpokladu, že při použití obou derivatizačních činidel vznikají stejné produkty derivatizace (stejné deriváty, tedy i stejné charakteristické m/z, retenční časy i hmotnostní spektra), protože MSTFA i BSTFA při derivatizaci poskytují trimethylsilylové skupiny. Následující chromatogramy (obr. 28 – 30) znázorňují píky trimethylsilyl derivátů jednotlivých standardů léčiv na vybraných m/z. Jedná se o různá možná zobrazení chromatogramů trimethylsilyl derivátů standardů jednotlivých léčiv v GCxGC analýze. V tabulce 6 jsou přehledně uvedeny charakteristické poměry m/z a retenční časy v první i druhé dimenzi. Zjištěná hmotnostní spektra trimethylsilyl derivátů standardů vybraných léčiv jsou uvedena v příloze 4.

Obrázek 28: Jeden z typů chromatogramů standardů v GCxGC analýze; 1st Time – retenční časy primární kolony, 2nd Time – retenční časy sekundární kolony; píky: 1 – kyselina salicylová (TMS), 2 – kyselina acetylsalicylová (TMS), 3 – kyselina klofibrová (TMS), 4 – ibuprofen (TMS), 5 – paracetamol (TMS), 6 – kofein, 7 – naproxen (TMS), 8 – kyselina mefenamová (TMS), 9 – ketoprofen (TMS), 10 – diklofenak (TMS)

68

Obrázek 29: Jiný způsob zobrazení předcházejícího chromatogramu v GCxGC analýze; horizontální osa – retenční časy primární kolony, vertikální osa – retenční časy sekundární kolony; píky: 1 – kyselina salicylová (TMS), 2 – kyselina acetylsalicylová (TMS), 3 – kyselina klofibrová (TMS), 4 – ibuprofen (TMS), 5 – paracetamol (TMS), 6 – kofein, 7 – naproxen (TMS), 8 – kyselina mefenamová (TMS), 9 – ketoprofen (TMS), 10 – diklofenak (TMS)

Obrázek 30: Další způsob zobrazení předcházejících chromatogramů v GCxGC analýze - 3D chromatogram standardů; osa nalevo – retenční časy primární kolony, spodní osa – retenční časy sekundární kolony; píky: 1 – kyselina salicylová (TMS), 2 – kyselina acetylsalicylová (TMS), 3 – kyselina klofibrová (TMS), 4 – ibuprofen (TMS), 5 – paracetamol (TMS), 6 – kofein, 7 – naproxen (TMS), 8 – kyselina mefenamová (TMS), 9 – ketoprofen (TMS), 10 – diklofenak (TMS)

69

Tabulka 6: GCxGC data (charakteristické m/z, retenční časy)

Retenční časy Trimethylsilyl deriváty

léčiv Charakteristické

m/z první dimenze (primární kolona)

druhá dimenze (sekundární kolona)

kyselina salicylová 267 638 1,130 kyselina acetylsalicylová 195 648 1,220 kyselina klofibrová 128 672 1,180 ibuprofen 160 692 1,150 Paracetamol * 166, 181 692 1,490 kofein 194 798 1,620 naproxen 243 884 1,320 kyselna mefenamová 223 922 1,330 ketoprofen 282 926 1,370 diklofenak 214 960 1,470

* kvantifikace provedena na hmotě 166

4.1.2. Zjištění vhodnějšího derivatizačního činidla Při zjišťování vhodnějšího derivatizačního činidla hráli rozhodující úlohu především odezva (velikost signálu) při GCxGC analýze a tvar píků. Pro derivatizaci dvou vzorků o stejné koncentraci byla použita dvě derivatizační činidla (MSTFA a BSTFA). Poté byly vzorky proměřeny a následně vyhodnoceny. Následující graf (obr. 31) znázorňuje intenzitu signálu při použití MSTFA a BSTFA v závislosti na konkrétním sledovaném léčivu.

0,0E+00

2,0E+06

4,0E+06

6,0E+06

8,0E+06

1,0E+07

1,2E+07

1,4E+07

1,6E+07

K. salic

ylová

K. ace

tylsa

licylo

vá

K. klo

fibro

vá

Ibup

rofe

n

Parace

tam

ol

Kofein

Naprox

en

K. mef

enam

ová

Ketop

rofe

n

Diklof

enak

léčiva

Inte

nzita

sig

nálu

(pl

ocha

pík

u)

MSTFA

BSTFA

Obrázek 31: Vliv použitého derivatizačního činidla na intenzitu signálu Z grafu je patrné, že vyšší intenzita u většiny léčiv, s výjimkou diklofenaku, je při použití MSTFA. U diklofenaku je však rozdíl nepatrný. Naopak poměrně značný rozdíl je u paracetamolu. U MSTFA byly pozorovány i mnohem lepší tvary píků než při použití BSTFA, kde byly širší a deformovanější. Proto bylo jako vhodnější derivatizační činidlo

70

zvoleno MSTFA, které bylo následně používáno při všech dalších optimalizacích a analýzách. Optimalizace množství, teploty i času derivatizace byly proto prováděny už pouze pro MSTFA. 4.1.3. Optimalizace množství derivatizačního činidla Pro zjištění optimálního množství, resp. optimálního poměru objemu MSTFA a rozpouštědla (pyridinu), byly vyzkoušeny 4 kombinace uvedené v experimentální části této práce (kapitola 3.2.5.). Rozhodujícím faktorem pro výběr optimálního množství MSTFA byl tvar a vzhled píků a v neposlední řadě i intenzita signálu. Pro lepší přehlednost a z ekonomických důvodů byly pokusy provedeny pouze v 1D analýze. Na následujících chromatogramech [obr. 32 (a) – 32 (d)] jsou znázorněny výsledky pro jednotlivé poměry objemů. Píky na chromatogramech: 1 – kyselina salicylová (TMS), 2 – kyselina acetylsalicylová (TMS), 3 – kyselina klofibrová (TMS), 4 – ibuprofen (TMS), 5 – paracetamol (TMS), 6 – kofein, 7 – naproxen (TMS), 8 – kyselina mefenamová (TMS), 9 – ketoprofen (TMS), 10 – diklofenak (TMS)

Obrázek 32 (a): Chromatogram TMS derivátů léčiv; 25 µl MSTFA + 375 µl pyridinu

Obrázek 32 (b): Chromatogram TMS derivátů léčiv; 50 µl MSTFA + 350 µl pyridinu

71

Obrázek 32 (c): Chromatogram TMS derivátů léčiv; 100 µl MSTFA + 300 µl pyridinu

Obrázek 32 (d): Chromatogram TMS derivátů léčiv; 200 µl MSTFA + 200 µl pyridinu Z chromatogramů vyplývá, že nejlepších výsledků (nedeformované, úzké píky i vysoká odezva) bylo dosaženo při použití kombinace 200 µµµµl MSTFA + 200 µµµµl pyridinu . U ostatních poměrů docházelo k různým deformacím nebo ke chvostování píků. 4.1.4. Optimalizace času a teploty derivatizace Pro zjištění optimálního času a teploty, tj. podmínek nutných k derivatizaci, byla opět rozhodující intenzita signálu, tentokrát již při GCxGC (2D) analýze, a tvar píků. Uměle kontaminované modelové vzorky o stejných koncentracích a při použití stejného množství derivatizačního činidla byly podrobeny procesu derivatizace při různých teplotách a po různou dnobu. Výsledky jsou shrnuty v následujících grafech (obr. 33 a 34), které pro jednotlivá léčiva znázorňují hodnoty intenzit signálu v závislosti na teplotě, případně doby derivatizace.

72

0,0E+00

2,0E+06

4,0E+06

6,0E+06

8,0E+06

1,0E+07

1,2E+07

1,4E+07

1,6E+07

1,8E+07

K. salic

ylová

K. ace

tylsa

licylo

vá

K. klo

fibro

vá

Ibup

rofe

n

Parace

tam

ol

Kofein

Naprox

en

K. mef

enam

ová

Ketop

rofe

n

Diklof

enak

léčiva

inte

nzita

sig

nálu

(plo

cha

píku

)

30°C

50°C

70°C

90°C

Obrázek 33: Vliv teploty derivatizace na intenzitu signálu

0,0E+00

2,0E+06

4,0E+06

6,0E+06

8,0E+06

1,0E+07

1,2E+07

1,4E+07

1,6E+07

1,8E+07

K. sali

cylov

á

K. ace

tylsa

licylo

vá

K. klofib

rová

Ibup

rofe

n

Parace

tamol

Kofein

Napro

xen

K. mefe

nam

ová

Ketop

rofe

n

Diklofe

nak

léčiva

inte

nzita

sig

nálu

(pl

ocha

pík

u)

30 min

60 min

90 min

120 min

Obrázek 34: Vliv doby derivatizace na intenzitu signálu Na základě údajů uvedených v grafech lze konstatovat, že optimální teplota pro derivatizaci je 70 °C a optimální doba je 90 minut. Tyto hodnoty byly proto použity a následně aplikovány při analýze reálných vzorků a při všech dalších operacích a optimalizacích.

73

4.2. Optimalizace účinnosti SPE 4.2.1. Účinnost SPE a její ovlivnění úpravou pH U vybrané metody SPE byla testována její účinnost pro jednotlivá léčiva v závislosti na pH aplikovaného vzorku. Výsledky vlivu hodnoty pH na účinnost metody jsou uvedeny v následující grafu (obr. 35).

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

K. sali

cylov

á

K. ace

tylsa

licylo

vá

K. klof

ibrová

Ibup

rofe

n

Parac

etam

ol

Kofein

Napro

xen

K. mefe

nam

ová

Ketop

rofe

n

Diklofe

nak

léčiva

úč

inno

st (%

)

pH 9

pH 7

pH 2

Obrázek 35: Vliv pH aplikovaného vzorku na účinnost SPE Z uvedeného grafu je patrné, že nejvyšší účinnosti je pro všechna posuzovaná léčiva bylo dosaženo při úpravě pH aplikovaného vzorku na hodnotu 2. U vyšších hodnot pH byla účinnost extrakce pro kyselinu acetylsalicylovou nulová a pro kyselinu salicylovou velice nízká. Důvodem je poměrně vysoký stupeň disociace molekul při vyšším pH a pro disociované molekuly je schopnost zachytit se na sorbentu velice nízká nebo téměř žádná. Snížením pH dojde k potlačení disociace a molekuly se tak dokáží snáze zachytit na sorbentu. Při vyšších hodnotách pH měla značné výkyvy i účinnost pro ibuprofen, při nižším pH už byly tyto hodnoty stabilizované a v rozumných mezích. Při vyšším pH byla prokázána také nižší účinnost pro kyselinu klofibrovou. Změna pH neovlivnila, nebo jen velmi málo, účinnost pro kofein, naproxen, kyselinu mefenamovou, ketoprofen a diklofenak. Nejnižší účinnost byla zaznamenána u paracetamolu. Při pH 2, která byla prokázána jako nejlepší hodnota pH pro úpravu vzorků, byla následně porovnána ještě účinnost SPE pro dvě koncentrační hladiny. Bylo aplikováno 8x 100 ml zkušebního vzorku, čtyři o koncentraci 1,2 ng.ml-1 (odpovídající přibližné koncentraci v povrchových vodách) a čtyři o koncentraci 20 ng.ml-1 (odpovídající přibližné koncentraci v odpadních vodách). Výsledky jsou porovnány v následujícím grafu (obr. 36). Z uvedených výsledků vyplývá, že při vyšších koncentracích je účinnost SPE u většiny léčiv, s výjimkou kyseliny mefenamové, o něco nižší. Přesto je však účinnost stále poměrně vysoká a je proto využitelná i pro vyšší koncentrační hladiny.

74

0

20

40

60

80

100

120

K. sali

cylov

á

K. ace

tylsa

licylo

vá

K. klof

ibrov

á

Ibupr

ofen

Parac

etamol

Kofein

Napro

xen

K. mefe

namov

á

Ketop

rofen

Diklofe

nak

léčiva

úč

inno

st (%

)

nižší koncentrace (1,2 ng/ml)

vyšší koncentrace (20 ng/ml)

Obrázek 36: Vliv koncentrace léčiv ve vzorku na účinnost SPE 4.2.2. Vliv množství aplikovaného vzorku na účinnost SPE Testování vlivu objemu aplikovaného vzorku na účinnost metody SPE bylo provedeno z důvodu předpokladu, že při aplikaci vyšších objemů vodných vzorků může docházet ke zpětnému vymývání analytů ze sorbentu, což může mít za následek snižování účinnosti samotné metody. Výsledky a průběh jsou uvedeny v následujícím grafu (obr. 37).

0

20

40

60

80

100

120

K. sali

cylov

á

K. ace

tylsa

licylo

vá

K. klof

ibro

vá

Ibupr

ofen

Parac

etamol

Kofein

Napro

xen

K. mef

enam

ová

Ketop

rofen

Diklofe

nak

léčiva

úč

inno

st (%

)

100 ml

250 ml

400 ml

600 ml

900 ml Obrázek 37: Vliv množství aplikovaného vzorku na účinnost SPE Z grafu je zřejmé, že se stoupajícím objemem aplikovaného vzorku postupně klesá účinnost SPE metody. Hodnoty se však značně liší v závislosti na konkrétní látce. Nejvíce je změna pozorována u kyseliny salicylové, kyseliny acetylsalicylové a paracetamolu. U ostatních léčiv je vliv minimální. Při analýze reálných vzorků přírodních vod je však třeba brát v úvahu i to, že přítomnost léčiv je v povrchových vodách velmi nízká (o mnoho nižší než v odpadních vodách), a je proto nutné aplikovat pro zakoncentrování vyšší objemy. Na základě tohoto testu a s ohledem na charakter povrchových i odpadních vod z pohledu

75

přítomnosti léčiv, byly pro extrakci vybrány následující objemy: 250 ml vzorku pro odpadní vody a 400 ml vzorku pro vody povrchové. 4.2.3. Účinnost navržené metody Na základě výsledků z předešlých kapitol (4.2.1. a 4.2.2.) byl navržen extrakční postup popsaný v kapitole 3.5.4.2. Postup obsahoval úpravu pH vzorku na hodnotu 2 a aplikaci 250 ml odpadní vody a 400 ml povrchové vody. Vzhledem k tomu, že byly pro tento postup používány stále stejné, předem optimalizované derivatizační podmínky, popsané v kapitole 3.5.4.3., a stále stejné podmínky GCxGC analýzy (kapitola 3.1.), bylo možno stanovit celkovou účinnost navržené metody. Stanovení bylo provedeno na dvou modelových vzorcích připravených rozpuštěním standardů vybraných analytů v milli-Q vodě tak, aby koncentrace jednoho modelového vzorku činila 1 ng.ml-1 (reprezentující přibližné koncentrace v povrchové vodě) a druhého modelového vzorku 15 ng.ml-1 (reprezentující přibližné koncentrace v odpadní vodě). Oba modelové vzorky byly připraveny v dostatečném množství tak, aby bylo možno u každého z nich provést 5 paralelních měření. S modelovými vzorky se následně pracovalo jako s reálnými vzorky povrchové a odpadní vody včetně počáteční filtrace a následných analytických postupů vypracovaných pro jednotlivé matrice. Výsledky účinnosti metody jsou uvedeny v následující tabulce 7.

Tabulka 7: Účinnost metody pro jednotlivé analyty (modelové vzorky)

Účinnost (%) * Léčiva

250 ml ** 400 ml ***

kyslina salicylová 92,2 ± 8,4 85,5 ± 6,2 kyselina acetylsalicylová 95,1 ± 4,1 92,0 ± 4,2 kyselina klofibrová 90,2 ± 5,3 87,6 ± 3,4 ibuprofen 94,3 ± 2,9 90,6 ± 2,7 paracetamol 46,4 ± 4,2 35,0 ± 6,8 kofein 98,3 ± 4,7 94,6 ± 3,0 naproxen 96,5 ± 8,7 95,6 ± 3,8 kyselina mefenamová 97,8 ± 3,5 95,5 ± 3,9 ketoprofen 97,2 ± 8,6 93,9 ± 8,3 diklofenak 98,1 ± 2,4 92,6 ± 2,1

* průměrná hodnota vypočítaná z hodnot pěti paralelních měření ± směrodatná odchylka

** reprezentující vzorek odpadní vody

*** reprezentující vzorek povrchové vody

4.2.4. Ověření účinnosti vybrané SPE metody na reálných vzorcích, vliv matrice Porovnání bylo provedeno za účelem zjištění případného vlivu matrice nejen na účinnost SPE metody, ale i na přítomnost vybraných analytů. Jako „srovnávací“ standardy byly použity kyseliny klofibrová a mefenamová. K výběru těchto standardů bylo přistoupeno ze dvou důvodů: 1) nebyly detekovány v žádném ze analyzovaných vzorků odpadní a povrchové vody (viz. výsledky v kapitole 4.4.4.), čímž bylo zamezeno tomu, že výsledky budou zkresleny případnou přítomností těchto látek ve vybraných reálných vzorcích; 2) tyto látky jsou stejné chemické povahy jako ostatní stanovovaná léčiva (karboxylové kyseliny) a mohou tak nejlépe reprezentovat celou skupinu vybraných analytů.

76

Měřením bylo zjištěno, že matrice bude s největší pravděpodobností do určité míry ovlivňovat proces extrakce (graf, obr. 38). Je však třeba si uvědomit, že do modelových vzorků byly vybrané analyty přidány záměrně, a proto pokles koncentrace oproti hodnotě, která by odpovídala přidanému množství (8 µg.l-1 = 100 %), nemusí nutně znamenat snížení účinnosti SPE, ale může být projevem působení matrice na přidanou látku (např. tvorba různých komplexů, reakce s dalšími přítomnými látkami apod.), čímž stanovovaný analyt může ztratit schopnost zachytit se na sorbentu. Jde tedy spíše o pozorování vlivu matrice, který se při extrakci projeví poklesem účinnosti ve srovnání s modelovým vzorkem, kde se vliv matrice nepředpokládal. Přehledně jsou výsledky znázorněny v následujícím grafu (obr. 38). Nejvíce se matriční efekty projevují u odpadní vody, u které byl pokles účinnosti, v porovnání s modelovým vzorkem, nejvyšší (10 – 14 %). U povrchové vody bude také pravděpodobně docházet k určitému vlivu, avšak méně než u vody odpadní (pokles v porovnání s modelovým vzorkem o 3 – 7 %).

95,4 %93,2 % 81,2 %83,6 %

88,7 %90,5 %

0

20

40

60

80

100

120

k. klofibrová k. mefenamová

léčiva

úč

inno

st (%

)

Modelový vzorek

Odpadní voda

Povrchová voda Obrázek 38: Vliv matrice znázorněn jako pokles účinnosti SPE na vybraných standardech

4.3. Studium degradace vybraných léčiv ve vodném prostředí Studie degradace probíhala pro jednotlivá léčiva ve vodném prostředí při dvou různých skladovacích teplotách po dobu 63 dnů. Během této doby bylo v pravidelných intervalech prováděno stanovení a sledování změn koncentrace. Výsledky jsou přehledně prezentovány v následujících grafech (obr. 39). Grafy znázorňují pokles koncentrace vyjádřený procentuálním zastoupením sledované látky ve vodném roztoku v průběhu 63 dnů. Procentuální hodnoty se odvíjí od koncentrace látky stanovené v prvním dni měření, které byla přidělena hodnota 100 %.

Kyselina salicylová

0

20

40

60

80

100

120

1. 4. 8. 11. 15. 18. 22. 25. 29. 32. 37. 42. 49. 63.

dny

mno

žstv

í op

roti

prvn

ímu

dni

(%)

5°C

20°C

Kyselina acetylsalicylová

0

20

40

60

80

100

120

1. 4. 8. 11. 15. 18. 22. 25. 29. 32. 37. 42. 49. 63.

dny

mno

žstv

í op

roti

prvn

ímu

dni (

%)

5°C

20°C

77

Kyselina klofibrová

0

20

40

60

80

100

120

1. 4. 8. 11. 15. 18. 22. 25. 29. 32. 37. 42. 49. 63.

dny

mno

žstv

í op

roti

prvn

ímu

dni

(%)

5°C

20°C

Ibuprofen

0

20

40

60

80

100

120

1. 4. 8. 11. 15. 18. 22. 25. 29. 32. 37. 42. 49. 63.

dny

mno

žstv

í op

roti

prvn

ímu

dni (

%)

5 °C

20 °C

Paracetamol

0

20

40

60

80

100

120

1. 4. 8. 11. 15. 18. 22. 25. 29. 32. 37. 42. 49. 63.

dny

mno

žstv

í op

roti

prvn

ímu

dni (

%)

5 °C

20 °C

Kofein

0

20

40

60

80

100

120

1. 4. 8. 11. 15. 18. 22. 25. 29. 32. 37. 42. 49. 63.

dnym

nožs

tví

opro

ti pr

vním

u dn

i (%

)

5 °C

20 °C

Naproxen

0

20

40

60

80

100

120

1. 4. 8. 11. 15. 18. 22. 25. 29. 32. 37. 42. 49. 63.

dny

mno

žstv

í op

roti

prvn

ímu

dni (

%)

5 °C

20 °C

Kyselina mefenamova

0

20

40

60

80

100

120

1. 4. 8. 11. 15. 18. 22. 25. 29. 32. 37. 42. 49. 63.

dny

mno

žstv

í op

roti

prvn

ímu

dni (

%)

5 °C

20 °C

Ketoprofen

0

20

40

60

80

100

120

1. 4. 8. 11. 15. 18. 22. 25. 29. 32. 37. 42. 49. 63.

dny

mno

žstv

í op

roti

prvn

ímu

dni (

%)

5 °C

20 °C

Diklofenak

0

20

40

60

80

100

120

1. 4. 8. 11. 15. 18. 22. 25. 29. 32. 37. 42. 49. 63.

dny

mno

žstv

í op

roti

prvn

ímu

dni (

%)

5 °C

20 °C

Obrázky 39: Pokles koncentrace jednotlivých léčiv ve vodném roztoku v průběhu dvou měsíců při teplotách 5 °C a 20 °C Na základě uvedených výsledků lze konstatovat, že při vyšších teplotách dochází k rychlejší degradaci většiny léčiv. K nejrychlejší degradaci dochází u kyseliny acetylsalicylové. Studium degradace bylo provedeno pouze na modelových vzorcích s milli-Q vodou, protože použití reálných vzorků by bylo těžko proveditelné vzhledem k postupu, který byl použit. Z výsledků získaných v předchozí kapitole 4.2.4. však lze usoudit, že degradace v reálných vzorcích vod bude s největší pravděpodobností ještě o něco rychlejší, a to z důvodu vlivu matričních efektů. Následující dvojice grafů (obr. 40) přísluší vzorku připravenému rozpuštěním pouze kyseliny acetylsalicylové. Současně byla sledována i přítomnost a koncentrace kyseliny

78

salicylové. Z grafů je patrné, že postupem času klesá koncentrace kyseliny acetylsalicylové a současně se objevuje, narůstá a kolísá koncentrace kyseliny salicylové, a to již první den, hned po přípravě roztoku. To potvrzuje domněnku, že kyselina acetylsalicylová degraduje ve vodném prostředí na kyselinu salicylovou. Tímto mohou být také vysvětleny i poměrně nízké koncentrace kyseliny acetylsalicylové a velmi vysoké koncentrace kyseliny salicylové na přítoku do ČOV (viz. kapitola 4.4.4.1.). Degradace kyseliny acetylsalicylové ve vodném roztoku je navíc poměrně rychlá, což dokazuje i pokles koncentrace naměřený hned po přípravě roztoku, v porovnání s připravenou koncentrací 160 ng.l-1u modelového vzorku.

5°C

0

20

40

60

80

100

120

140

160

1. 4. 8. 11. 15. 18. 22. 25. 29. 32. 37. 42. 49. 63.

dny

c (ng.ml -1)

Kyselina acetylsalicylová

Kyselina salicylová

20°C

0

20

40

60

80

100

120

140

160

1. 4. 8. 11. 15. 18. 22. 25. 29. 32. 37. 42.

dny

c (ng.ml -1)

Kyselina acetylsalicylová

Kyselina salicylová

Obrázky 40: Degradace kyseliny acetylsalicylové na kyselinu salicylovou ve vodném roztoku při teplotách 5 °C a 20 °C

4.4. Stanovení vybraných léčiv v reálných vzorcích vod Dříve než bylo přistoupeno k vyhodnocení a zpracování získaných výsledů, byla zjištěna účinnost, opakovatelnost, linearita a limity detekce a kvantifikace navržené metody (tj. metody popsané v kapitolách 3.5.4.2 – 3.5.4.4.). 4.4.1. Účinnost metody Účinnost navržené metody a vliv matrice úzce souvisí s účinností SPE a je podrobně popsána v kapitolách 4.2.3. a 4.2.4. 4.4.2. Opakovatelnost metody Opakovatelnost (repeatability) je definována jako shodnost (preciznost, precision) měření za souboru podmínek opakovatelnosti. Vyjadřuje těsnost souhlasu mezi výsledky nezávislých měření za souboru podmínek opakovatelnosti, tj. za podmínek, kdy se nezávislé výsledky zkoušek získávají stejnou metodou na identických zkoušených jednotkách v téže laboratoři, stejným operátorem, za použití téhož zařízení během krátkého období [137]. Opakovatelnost je vlastností metody, ne výsledku, a je charakterizována směrodatnou odchylkou opakovatelnosti. Kritériem opakovatelnosti je relativní směrodatná odchylka (RSD), tj. poměr mezi směrodatnou odchylkou a střední hodnotou souboru vyjádřený v procentech. Shodnost (preciznost, precision) – těsnost shody mezi nezávislými výsledky zkoušek získaných za předem stanovených podmínek [137]. Závisí na rozdělení náhodných chyb a nemá vztah ke skutečné hodnotě. Obvykle se uvádí ve formě směrodatné odchylky.

Za účelem zjištění opakovatelnosti uvedené metody bylo provedeno měření na modelovém vzorku vody a dále na reálných vzorcích odpadní a povrchové vody. Modelový vzorek byl připraven rozpuštěním standardů v milli-Q vodě. Bylo připraveno 2,5 l modelového vzorku vody tak, aby koncentrace každého analytu v tomto množství byla 2 µg.l-1. Poté bylo na připraveném modelovém vzorku provedeno 9 paralelních měření

79

zahrnujících filtraci (filtry ze skleněných mikrovláken), SPE (aplikace 250 ml vzorku), derivatizaci (MSTFA, 70 °C, 90 min) a analýzu GCxGC-TOF MS. Výsledky jsou pro přehlednost uvedeny graficky (obr. 41) a pro porovnání s reálnými vzorky zaznamenány i v tabulce 8. Pro zjištění opakovatelnosti na reálných vzorcích odpadní vody byly proměřeny vzorky odebrané z přítoku i odtoku na ČOV v Brně Modřicích ze dne 25.11. 2010. Bylo provedeno 9 paralelních měření pro přítok a 9 pro odtok zahrnujících filtraci (filtry ze skleněných mikrovláken), SPE (aplikace 250 ml vzorku), derivatizaci (MSTFA, 70 °C, 90 min) a analýzu GCxGC-TOF MS. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 8. Pro zjištění opakovatelnosti na reálných vzorcích povrchových vod byly proměřeny vzorky z lokality za obcí Tišnov. I v tomto případě bylo u tohoto vzorku provedeno 9 paralelních měření obsahujících filtraci (filtry ze skleněných mikrovláken), SPE (aplikace 400 ml vzorku), derivatizaci (MSTFA, 70 °C, 90 min) a analýzu GCxGC-TOF MS. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 8.

Kyselina salicylová

průměr

RSD 4,1 %

0,0E+00

5,0E+04

1,0E+05

1,5E+05

2,0E+05

2,5E+05

3,0E+05

1 2 3 4 5 6 7 8 9

měření

inte

nzita

sig

nálu

Kyselina acetylsalicylová RSD 4,8 %

průměr

0,0E+00

2,0E+04

4,0E+04

6,0E+04

8,0E+04

1,0E+05

1,2E+05

1,4E+05

1,6E+05

1,8E+05

2,0E+05

1 2 3 4 5 6 7 8 9

měření

inte

nzi

ta s

igná

lu

Kyselina klofibrová RSD 3,5 %

průměr

0,0E+00

5,0E+04

1,0E+05

1,5E+05

2,0E+05

2,5E+05

1 2 3 4 5 6 7 8 9

měření

inte

nzi

ta s

ign

álu

Ibuprofen RSD 5,2 %

průměr

0,0E+00

2,0E+04

4,0E+04

6,0E+04

8,0E+04

1,0E+05

1,2E+05

1 2 3 4 5 6 7 8 9

měření

inte

nzi

ta s

igná

lu

Paracetamol RSD 6,1 %

průměr

0,0E+00

5,0E+03

1,0E+04

1,5E+04

2,0E+04

2,5E+04

3,0E+04

3,5E+04

4,0E+04

1 2 3 4 5 6 7 8 9

měření

inte

nzita

sig

nálu

Kofein RSD 4,3 %

průměr

0,0E+00

2,0E+04

4,0E+04

6,0E+04

8,0E+04

1,0E+05

1,2E+05

1,4E+05

1,6E+05

1,8E+05

2,0E+05

1 2 3 4 5 6 7 8 9

měření

inte

nzi

ta s

igná

lu

Naproxen RSD 4,2 %

průměr

0,0E+00

1,0E+04

2,0E+04

3,0E+04

4,0E+04

5,0E+04

6,0E+04

7,0E+04

8,0E+04

9,0E+04

1 2 3 4 5 6 7 8 9

měření

inte

nzita

sig

nálu

Kyselina mefenamová RSD 6,9 %

průměr

0,0E+00

2,0E+04

4,0E+04

6,0E+04

8,0E+04

1,0E+05

1,2E+05

1,4E+05

1 2 3 4 5 6 7 8 9

měření

inte

nzi

ta s

ign

álu

80

Ketoprofen RSD 4,5 %

průměr

0,0E+00

5,0E+03

1,0E+04

1,5E+04

2,0E+04

2,5E+04

3,0E+04

3,5E+04

4,0E+04

4,5E+04

5,0E+04

1 2 3 4 5 6 7 8 9

měření

inte

nzita

sig

nálu

Diklofenak RSD 5,1 %

průměr

0,0E+00

5,0E+03

1,0E+04

1,5E+04

2,0E+04

2,5E+04

3,0E+04

3,5E+04

1 2 3 4 5 6 7 8 9

měření

inte

nzi

ta s

igná

lu

Obrázky 41: Grafické znázornění paralelních měření při zjišťování opakovatelnosti na modelových vzorcích V tabulce 8 jsou uvedeny opakovatelnosti metody pro jednotlivé analyty a vybrané matrice a jejich porovnání. Hodnoty opakovatelností jsou vyjádřeny relativní směrodatnou odchylkou. Některé analyty nebyly v reálných vzorcích detekovány, a proto u nich nebyla opakovatelnost měřena. Z tabulky je zřejmé, že v reálných vzorcích jsou RSD vyšší než u modelového vzorku, což je pravděpodobně způsobeno vlivem matričních efektů. Největší RSD byly vypočítány u reálných vzorků odpadní vody na odtoku a také u povrchové vody, kde se analyty pohybovaly v mnohem nižších koncentracích (jednotky – stovky ng.l-1) na rozdíl od přítoku na ČOV (jednotky – desítky µg.l-1). Důvodem těchto rozdílů může být skutečnost, že variabilita výsledků získaných z paralelních měření vzorků obsahujících nízké koncentrace bývá vyšší než u výsledků získaných z paralelních měření vzorků obsahujících vyšší koncentrace.

Tabulka 8: Opakovatelnost metody pro jednotlivé analyty a vybrané matrice RSD (%) *

odpadní voda Léčivo modelový vzorek

přítok odtok povrchová voda

kyselina salicylová 4,1 7,6 9,0 9,9 kyselina acetylsalicylová 4,8 10,6 - - kyselina klofibrová 3,5 - - - ibuprofen 5,2 6,6 9,4 10,9 paracetamol 6,1 6,7 - - kofein 4,3 5,7 14,7 12,1 naproxen 4,2 6,6 4,4 8,3 kyselina mefenamová 6,9 - - - ketoprofen 4,5 9,6 6,2 10,5 diklofenak 5,1 5,6 5,0 8,7 * určeno z devíti paralelních měření

4.4.3. Linearita, limity detekce a kvantifikace Linearita, limity detekce a kvantifikace byly určeny na základě kalibračních křivek standardů jednotlivých léčiv rozpuštěných v methanolu. Byl připraven směsný roztok obsahující všechna sledovaná léčiva s výjimkou kyseliny acetylsalicylové. Ta musela být rozpuštěna samostatně, protože by ve směsném roztoku, vzhledem ke své rychlé degradaci na kyselinu salicylovou, zkreslovala hodnoty stanovené pro kyselinu salicylovou. Kalibrační křivky pro jednotlivé standardy obsahovaly 8 bodů v rozmezí koncentrací od 10 ng.l-1 do 2400 ng.l-1 pro vodu povrchovou a v rozmezí od 10 ng.l-1 do 3840 ng.l-1 pro nižší koncentrace pro vodu odpadní; pro vyšší koncentrace pro vodu odpadní byly sestaveny kalibrační křivky z 5 bodů v rozmezí od 3,8 µg.l-1 do 57,6 µg.l-1. Zjištěna byla jak závislost plocha píku = f (c),

81

tak závislost výška píku = f (c). Při určování rozsahu kalibrace se vycházelo z koncentrací, v jakých se léčiva nejčastěji vyskytují v přírodních vodních ekosystémech (ng.l-1 - µg.l-1 [33]). Při přepočtech navíc bylo nutné zohlednit celý analytický postup (tj. 400 ml povrchové vody nebo 250 ml odpadní vody jako množství aplikovaného vzorku, průběh SPE a průběh derivatizace). Limity detekce (LOD) a limity kvantifikace byly vypočítány na základě rovnic (1) a (2) a při jejich přepočtu bylo také nutné zohlednit extrakční postup (jiné aplikované objemy pro odpadní a povrchovou vodu). Linearita a přehled hodnot LOD a LOQ pro jednotlivá léčiva a analytické postupy jsou uvedeny v tabulce 9.

m

hLOD n.3

= (1)

m

hLOQ n.10

= (2)

hn – výška šumu; m – směrnice kalibrační přímky [výška píku = f (c)]

Tabulka 9: Linearita, LOD, LOQ

Linearita Odpadní voda Povrchová voda Trimethylislyl deriváty

léčiv nižší koncentrace

vyšší koncentrace

LOD (ng.l -1)

LOQ (ng.l -1)

LOD (ng.l -1)

LOQ (ng.l -1)

kyselna salicylová 0,9959 0,9925 0,23 0,78 0,15 0,49 kyselina acetylsalicylová 0,9997 0,9997 0,48 1,59 0,30 0,99 kyselina klofibrová 0,9955 0,9983 1,33 4,42 0,83 2,76 ibuprofen 0,9955 0,9936 5,06 16,86 3,16 10,54 paracetamol 0,9996 0,9982 6,03 20,08 3,77 12,55 kofein 0,9989 0,9972 0,98 3,25 0,61 2,03 naproxen 0,9983 0,9992 0,82 2,74 0,51 1,71 kyselina mefenamová 0,9976 0,9949 0,68 2,26 0,42 1,41 ketoprofen 0,9979 0,9981 1,13 3,78 0,71 2,36 diklofenak 0,9969 0,9939 2,88 9,59 1,80 6,00

4.4.4. Koncentrace vybraných léčiv v reálných vzorcích Pro kvantitativní analýzu jednotlivých léčiv v odpadní i povrchové vodě byla použita metoda vnějšího standardu a pro vyhodnocení byly použity sestrojené kalibrační křivky [plocha píku = f (c)]. Celá analytická metoda, zahrnující vzorkování, předúpravu, SPE, derivatizaci a analýzu pomocí GCxGC-TOF MS, byla úspěšně aplikována pro povrchovou i odpadní vodu. Hodnoty koncentrací pro povrchovou a odpadní vodu včetně jejich grafického znázornění jsou uvedeny v následujících kapitolách. Během analýzy byl každý vzorek, jak povrchových vod, tak odpadních vod, zpracován a analyzován 3x a naměřené hodnoty byly zprůměrovány. 4.4.4.1. Koncentrace vybraných léčiv v odpadní vodě V odpadní vodě na přítoku do ČOV v měsíci listopadu 2010 byla detekována většina léčiv, s výjimkou kyseliny klofibrové a mefenamové, a to v rozsahu koncentrací řádově několika desítek µg.l-1 v závislosti na sledovaném analytu. Nejvyšších hodnot (30 – 55 µg.l-1) dosahovaly koncentrace kyseliny salicylové, ibuprofenu a kofeinu. Poměrně vysoké hodnoty

82

koncentrací (5 – 14 µg.l-1) byly pozorovány také u diklofenaku. Nejnižší hodnoty (0,5 – 2 µg.l-1) byly zaznamenány u kyseliny acetylsalicylové. Hodnoty koncentrací paracetamolu v závislosti na dnech poměrně značně kolísaly (1 – 18 µg.l-1). Naopak hodnoty koncentrací naproxenu a ketoprofenu byly poměrně stabilní, pohybovaly se v rozmezí 1 – 4 µg.l-1. Na odtoku z ČOV se hodnoty pohybovaly v řádu tisícin až jednotek µg.l-1, a to v závislosti na dnech a konkrétním analytu. Nejvyšší hodnoty (3 – 17 µg.l-1) byly pozorovány u diklofenaku, u kterého docházelo jen k zhruba 30% odstranění během čistících procesů na ČOV. Naopak téměř 100% eliminace bylo během čistících procesů dosaženo u kyseliny salicylové a ibuprofenu (koncentrace na odtoku 0,005 – 1,1 µg.l-1) a také u kyseliny acetylsalicylové a paracetamolu, které na odtoku nebyly detekovány v žádném z případů. Hodnoty koncentrací naproxenu a ketoprofenu byly na odtoku poměrně stabilní, pohybovaly se v rozmezí 0,3 – 1,2 µg.l-1). Výsledky z měření koncentrace léčiv na přítoku a odtoku ČOV za celý měsíc listopad a jejich porovnání jsou uvedeny v následujících grafech (obr. 42). Sloupcové grafy a1 – h1 znázorňují koncentraci jednotlivých léčiv na přítoku a odtoku vždy pro konkrétní den; bylo počítáno i s dobou zdržení v ČOV (24 hodin). Spojnicové grafy a2 - h2 znázorňují průběh koncentrací jednotlivých léčiv na přítoku v průběhu celého odběrového období. U naproxenu, ketoprofenu a diklofenaku je znázorněn i průběh koncentrací na odtoku, z důvodu jejich vyšších koncentrací; u ostatních by znázornění koncentrací na odtoku nebylo zřetelné. Červeně zvýrazněná data na ose x označují víkendy a státní svátek (17.11.2010). Konkrétní hodnoty koncentrací z jednotlivých dnů jsou uvedeny v příloze č. 6 a ukázka GCxGC chromatogramů pro reálný vzorek odpadní vody je uvedena v příloze č. 5, obr. 51 – 58.

Kyselina salicylová

0

10

20

30

40

50

60

2.11

.3.

11.

4.11

.5.

11.

6.11

.7.

11.

8.11

.9.

11.

10.1

1.11

.11.

12.1

1.13

.11.

14.1

1.15

.11.

16.1

1.17

.11.

18.1

1.19

.11.

20.1

1.21

.11.

22.1

1.23

.11.

24.1

1.25

.11.

26.1

1.27

.11.

28.1

1.29

.11.

30.1

1.1.

12.

datum

c (µµµµg.l -1)PřítokOdtok

(a1)

(a2)

83

Kyselina acetylsalicylová

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

2.11

.3.

11.

4.11

.5.

11.

6.11

.7.

11.

8.11

.9.

11.

10.1

1.11

.11.

12.1

1.13

.11.

14.1

1.15

.11.

16.1

1.17

.11.

18.1

1.19

.11.

20.1

1.21

.11.

22.1

1.23

.11.

24.1

1.25

.11.

26.1

1.27

.11.

28.1

1.29

.11.

30.1

1.1.

12.

datum

c (µµµµg.l -1) Přítok

Ibuprofen

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

2.11

.3.

11.

4.11

.5.

11.

6.11

.7.

11.

8.11

.9.

11.

10.1

1.11

.11.

12.1

1.13

.11.

14.1

1.15

.11.

16.1

1.17

.11.

18.1

1.19

.11.

20.1

1.21

.11.

22.1

1.23

.11.

24.1

1.25

.11.

26.1

1.27

.11.

28.1

1.29

.11.

30.1

1.1.

12.

datum

c (µµµµg.l -1)Přítok

Odtok

(b1)

(c1)

(b2)

(c2)

84

Paracetamol

0

5

10

15

20

25

2.11

.3.

11.

4.11

.5.

11.

6.11

.7.

11.

8.11

.9.

11.

10.1

1.11

.11.

12.1

1.13

.11.

14.1

1.15

.11.

16.1

1.17

.11.

18.1

1.19

.11.

20.1

1.21

.11.

22.1

1.23

.11.

24.1

1.25

.11.

26.1

1.27

.11.

28.1

1.29

.11.

30.1

1.1.

12.

datum

c (µµµµg.l -1) Přítok

Kofein

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

2.11

.3.

11.

4.11

.5.

11.

6.11

.7.

11.

8.11

.9.

11.

10.1

1.11

.11.

12.1

1.13

.11.

14.1

1.15

.11.

16.1

1.17

.11.

18.1

1.19

.11.

20.1

1.21

.11.

22.1

1.23

.11.

24.1

1.25

.11.

26.1

1.27

.11.

28.1

1.29

.11.

30.1

1.1.

12.

datum

c (µµµµg.l -1)PřítokOdtok

(d1)

(e1)

(d2)

(e2)

85

Naproxen

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

2.11

.3.

11.

4.11

.5.

11.

6.11

.7.

11.

8.11

.9.

11.

10.1

1.11

.11.

12.1

1.13

.11.

14.1

1.15

.11.

16.1

1.17

.11.

18.1

1.19

.11.

20.1

1.21

.11.

22.1

1.23

.11.

24.1

1.25

.11.

26.1

1.27

.11.

28.1

1.29

.11.

30.1

1.1.

12.

datum

c (µµµµg.l -1)PřítokOdtok

Ketoprofen

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

2.11

.3.

11.

4.11

.5.

11.

6.11

.7.

11.

8.11

.9.

11.

10.1

1.11

.11.

12.1

1.13

.11.

14.1

1.15

.11.

16.1

1.17

.11.

18.1

1.19

.11.

20.1

1.21

.11.

22.1

1.23

.11.

24.1

1.25

.11.

26.1

1.27

.11.

28.1

1.29

.11.

30.1

1.1.

12.

datum

c (µµµµg.l -1)PřítokOdtok

(f1)

(g1)

(f2)

(g2)

86

Diklofenak

0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

14,0

16,0

18,0

20,02.

11.

3.11

.4.

11.

5.11

.6.

11.

7.11

.8.

11.

9.11

.10

.11.

11.1

1.12

.11.

13.1

1.14

.11.

15.1

1.16

.11.

17.1

1.18

.11.

19.1

1.20

.11.

21.1

1.22

.11.

23.1

1.24

.11.

25.1

1.26

.11.

27.1

1.28

.11.

29.1

1.30

.11.

1.12

.

datum

c (µµµµg.l -1)PřítokOdtok

Obrázky 42: Grafické znázornění koncentrací jednotlivých léčiv v odpadní vodě za celé odběrové období. Sloupcové grafy s indexem 1 (a1 – h2) znázorňují porovnání koncentrací na přítoku a odtoku z ČOV pro konkrétní dny. Spojnicové grafy s indexem 2 (a2 – h2) znázorňují průběh koncentrací jednotlivých léčiv na přítoku a pro naproxen, ketoprofen a diklofenak i na odtoku z ČOV. Zvýrazněná data na ose x označují víkendy a státní svátek. 4.4.4.2. Koncentrace vybraných léčiv v povrchové vodě V povrchové vodě byla detekována jen některá ze sledovaných léčiv, a to v rozsahu koncentrací jednotek až stovek ng.l-1 v závislosti na místě odběru. Kyselina acetylsalicylová, kyselina klofibrová, paracetamol a kyselina mefenamová nebyly detekovány na žádném z odběrových míst. Kyselina salicylová, kofein a diklofenak byly detekovány téměř na všech místech; diklofenak v některých oblastech obsahoval poměrně vysokých hodnot. Ostatní léčiva (naproxen, ketoprofen) byla detekována pouze v některých oblastech s vyšším zalidněním. V tabulkách 10 a 11 jsou uvedeny koncentrace detekovaných léčiv ve vodě odebrané z obou monitorovaných řek. V grafech [obr. 43 (a) – (f) a obr. 44 (a) – (f)] jsou potom pro zajímavost znázorněny průběhy koncentrací detekovaných léčiv v závislosti na místě odběru. Číslo 1 za názvem obce (v tabulkách i grafech) značí odběr před danou obcí a číslo 2 značí odběr za danou obcí. Ukázka GCxGC chromatogramů vzorku povrchové vody je prezentována v příloze č. 5, obr. 59 a 60.

(h1)

(h2)

87

Tabulka 10: Koncentrace vybraných léčiv v povrchové vodě (řeka Svratka); k. acetylsalicylová, k.

klofibrová, paracetamol a k. mefenamová nebyly detekovány v žádném ze vzorků povrchové vody koncentrace (ng.l -1) *

Místo odb ěru kyselina salicylová ibuprofen kofein naproxen ketoprofen diklofenak

Svratka 1 52,5 ± 28,0 < LOD < LOD < LOD < LOD < LOD

Svratka 2 80,9 ± 17,6 66,2 ± 27,3 249,8 ± 32,9 < LOD < LOD 476,3 ± 27,5

Jimramov 1 105,7 ± 8,4 < LOD 261,3 ± 36,3 < LOD < LOD < LOD

Jimaramov 2 118,8 ± 5,9 13,1 ± 5,4 1068,5 ± 97,6 < LOD < LOD < LOD

Vír 1 < LOD 37,4 ± 5,4 79,0 ± 9,1 149,3 ± 13,3 306,3 ± 28,3 22,8 ± 10,7

Vír 2 109,9 ± 6,0 < LOD 248,6 ± 9,2 < LOD < LOD < LOD

Štěpánov 1 31,0 ± 6,2 < LOD 740,2 ± 58,1 42,0 ± 11,2 11,4 ± 6,1 57,3 ± 12,3

Štěpánov 2 6,6 ± 5,0 < LOD 121,3 ± 6,7 < LOD < LOD < LOD

Tišnov 1 53,8 ± 10,1 < LOQ 556,6 ± 46,6 < LOD < LOD < LOD

Tišnov 2 79,5 ± 11,4 23,8 ± 15,3 328,8 ± 38,0 32,2 ± 11,8 67,7 ± 15,2 95,4 ± 6,4

Veverská Bitýška 1 143,4 ± 15,3 12,0 ± 8,1 358,4 ± 17,7 36,6 ± 14,1 45,5 ± 11,9 841,5 ± 22,7

Veverská Bitýška 2 140,3 ± 15,4 60,2 ± 14,8 643,5 ± 63,8 2,4 ± 1,1 38,4 ± 8,4 204,9 ± 17,2

Brno - Jundrov < LOD < LOD 199,4 ± 9,8 < LOD < LOD 43,9 ± 8,2

Brno - soutok Svitavy a Svratky 84,1 ± 18,8 31,6 ± 8,1 515,4 ± 36,8 32,7 ± 14,4 57,8 ± 12,2 396,8 ± 45,0

Brno - Modřice 10,6 ± 15,0 17,1 ± 14,1 223,1 ± 20,7 46,7 ± 15,5 9,1 ± 4,3 469,1 ± 37,6

Rajhradice 1 89,2 ± 13,6 37,1 ± 9,2 398,2 ± 34,4 33,5 ± 10,0 17,3 ± 5,7 505,7 ± 44,6

Rajhradice 2 52,6 ± 16,4 43,8 ± 10,9 928,2 ± 68,6 26,8 ± 13,3 5,3 ± 4,7 435,5 ± 65,4

Židlochovice 1 97,4 ± 27,5 38,0 ± 10,2 336,3 ± 20,6 50,3 ± 15,1 < LOD 445,8 ± 55,0

Židlochovice 2 64,1 ± 21,7 57,7 ± 13,3 497,0 ± 47,9 43,4 ± 16,7 18,5 ± 6,7 416,9 ± 57,6

* průměrná hodnota vypočítaná z hodnot tří paralelních stanovení ± směrodatná odchylka

Kyselina salicylová

0306090

120

150180

Svratka

1

Svratka

2

Jimra

mov 1

Jimar

amov 2 Vír 1

Vír 2

Štěpáno

v n. S

. 1

Štěpánov

n. S

. 2

Tišnov 1

Tišnov

2

Vevers

ká B

itýšk

a 1

Vever

ská B

itýšk

a 2

Brno -

Jundr

ov

Brno -

soutok S

vitava

a S...

Brno -

Modřice

Rajhra

dice 1

Rajhra

dice 2

Židlochov

ice 1

Židlocho

vice 2

místo odb ěru

c (ng.l -1)

(a)

88

Ibuprofen

0

20

40

60

80

100

Svratk

a 1

Svratk

a 2

Jimra

mov 1

Jimar

amov

2Vír

1Vír

2

Štěpán

ov n.

S. 1

Štěpán

ov n.

S. 2

Tišnov

1

Tišnov

2

Vever

ská B

itýšk

a 1

Vever

ská B

itýšk

a 2

Brno -

Jund

rov

Brno -

souto

k Svit

ava

a S...

Brno -

Modřic

e

Rajhra

dice

1

Rajhra

dice

2

Židloc

hovic

e 1

Židloc

hovic

e 2

místo odb ěru

c (ng.l -1)

Kofein

0

200

400

600

800

1000

1200

Svratk

a 1

Svratk

a 2

Jimra

mov 1

Jimar

amov

2Vír

1Vír

2

Štěpán

ov n.

S. 1

Štěpán

ov n.

S. 2

Tišnov

1

Tišnov

2

Vever

ská B

itýšk

a 1

Vever

ská B

itýšk

a 2

Brno -

Jund

rov

Brno -

souto

k Svit

ava

a S...

Brno -

Modřic

e

Rajhra

dice

1

Rajhra

dice

2

Židloc

hovic

e 1

Židloc

hovic

e 2

místo odb ěru

c (ng.l -1)

Naproxen

0

40

80

120

160

200

Svratk

a 1

Svratk

a 2

Jimra

mov 1

Jimar

amov

2Vír

1Vír

2

Štěpán

ov n.

S. 1

Štěpán

ov n.

S. 2

Tišnov

1

Tišnov

2

Vever

ská B

itýšk

a 1

Vever

ská B

itýšk

a 2

Brno -

Jund

rov

Brno -

souto

k Svit

ava

a S...

Brno -

Modřic

e

Rajhra

dice

1

Rajhra

dice

2

Židloc

hovic

e 1

Židloc

hovic

e 2

místo odb ěru

c (ng.l -1)

Ketoprofen

050

100150200250300350

Svratk

a 1

Svratk

a 2

Jimra

mov 1

Jimar

amov

2Vír

1Vír

2

Štěpán

ov n.

S. 1

Štěpán

ov n.

S. 2

Tišnov

1

Tišnov

2

Vever

ská B

itýšk

a 1

Vever

ská B

itýšk

a 2

Brno -

Jund

rov

Brno -

souto

k Svit

ava

a S...

Brno -

Modřic

e

Rajhra

dice

1

Rajhra

dice

2

Židloc

hovic

e 1

Židloc

hovic

e 2

místo odb ěru

c (ng.l -1)

(b)

(c)

(d)

(e)

89

Diklofenak

0

200

400

600

800

1000

1200

Svratk

a 1

Svratk

a 2

Jimra

mov 1

Jimar

amov

2Vír

1Vír

2

Štěpán

ov n.

S. 1

Štěpán

ov n.

S. 2

Tišnov

1

Tišnov

2

Vever

ská B

itýšk

a 1

Vever

ská B

itýšk

a 2

Brno -

Jund

rov

Brno -

souto

k Svit

ava

a S...

Brno -

Modřic

e

Rajhra

dice

1

Rajhra

dice

2

Židloc

hovic

e 1

Židloc

hovic

e 2

místo odb ěru

c (ng.l -1)

Obrázky 43 (a) – (f): Grafické znázornění průběhu koncentrací detekovanách léčiv v závislosti na místě odběru; řeka Svratka

Tabulka 11: Koncentrace vybraných léčiv v povrchové vodě (řeka Svitava); k. acetylsalicylová, k. klofibrová,

paracetamol a k. mefenamová nebyly detekovány v žádném ze vzorků povrchové vody koncentrace (ng.l -1) *

Místo odb ěru kyselina salicylová ibuprofen kofein naproxen ketoprofen diklofenak

Svitavy 1 129,9 ± 31,8 < LOD < LOD < LOD < LOD < LOD

Svitavy 2 102,7 ± 21,0 1060,2 ± 63,8 2305,8 ± 198,3 65,9 ± 12,3 9,3 ± 2,8 162,3 ± 8,8

Březová n. S. 1 < LOQ 40,1 ± 9,9 711,6 ± 73,6 18,4 ± 3,3 27,1 ± 5,5 233,9 ± 8,7

Březová n. S. 2 17,2 ± 4,2 65,7 ± 18,5 425,0 ± 43,9 68,5 ± 11,1 65,8 ± 13,1 297,2 ± 42,5

Letovice 1 < LOD < LOD 325,2 ± 10,2 < LOD 9,0 ± 4,0 176,6 ± 10,4

Letovice 2 59,2 ± 18,1 53,1 ± 8,1 1090,8 ± 106,4 < LOD < LOD 68,7 ± 4,6

Blansko 1 1,0 ± 1,5 62,2 ± 11,5 403,3 ± 23,1 < LOD < LOQ 124,2 ± 19,4

Blansko 2 2,6 ± 2,5 < LOQ 882,5 ± 65,2 < LOD 4,0 ± 3,4 194,4 ± 8,5

Adamov 1 70,9 ± 10,2 < LOQ 492,2 ± 59,4 < LOD < LOD 255,5 ± 18,7

Adamov 2 2,4 ± 3,4 62,5 ± 20,4 515,5 ± 38,4 18,9 ± 2,9 < LOD 169,5 ± 9,8

Brno (před) 76,9 ± 21,9 48,6 ± 6,9 797,9 ± 61,2 41,3 ± 7,1 < LOD 204,1 ± 17,7

Brno - soutok Svitavy a Svratky 35,5 ± 7,2 29,7 ± 11,3 1093,8 ± 63,9 3,5 ± 1,9 68,6 ± 11,5 154,3 ± 16,6

* průměrná hodnota vypočítaná z hodnot tří paralelních stanovení ± směrodatná odchylka

Kyselina salicylová

0

30

60

90

120

150

180

Svitav

y 1

Svitav

y 2

Břez

ová n

. S. 1

Břez

ová n

. S. 2

Letov

ice 1

Letov

ice 2

Blansk

o 1

Blansk

o 2

Adam

ov 1

Adam

ov 2

Brno 1

Brno -

souto

k Svit

ava a

Svr

...

místo odb ě ru

c (ng.l -1)

(f)

(a)

90

Ibuprofen

0

200

400

600

800

1000

1200

Svitav

y 1

Svitav

y 2

Břez

ová n

. S. 1

Břez

ová n

. S. 2

Letov

ice 1

Letov

ice 2

Blansk

o 1

Blansk

o 2

Adam

ov 1

Adam

ov 2

Brno

1

Brno

- sou

tok S

vitav

a a

S...

místo odb ěru

c (ng.l -1)

Kofein

0

400

800

1200

1600

2000

2400

Svitav

y 1

Svitav

y 2

Břez

ová n

. S. 1

Břez

ová n

. S. 2

Letov

ice 1

Letov

ice 2

Blansk

o 1

Blansk

o 2

Adam

ov 1

Adam

ov 2

Brno

1

Brno

- sou

tok S

vitav

a a

...

místo odb ě ru

c (ng.l -1)

Naproxen

0

30

60

90

120

Svitav

y 1

Svitav

y 2

Březo

vá n

. S. 1

Březo

vá n

. S. 2

Letov

ice 1

Letov

ice 2

Blansko

1

Blansko

2

Adam

ov 1

Adam

ov 2

Brno

1

Brno -

soutok

Svit

ava

a S...

místo odb ě ru

c (ng.l -1)

(b)

(c)

(d)

91

Ketoprofen

0

20

40

60

80

100

Svitav

y 1

Svitav

y 2

Březo

vá n

. S. 1

Březo

vá n

. S. 2

Letov

ice 1

Letov

ice 2

Blansko

1

Blansko

2

Adamov

1

Adamov

2

Brno 1

Brno -

sout

ok S

vitav

a a S

...

místo odb ěru

c (ng.l -1)

Diklofenak

0

100

200

300

400

500

Svitav

y 1

Svitavy

2

Břez

ová n

. S. 1

Břez

ová n

. S. 2

Letovice

1

Letov

ice 2

Blansko

1

Blansk

o 2

Adamov

1

Adamov

2

Brno

1

Brno -

soutok

Svit

ava a

...

místo odb ě ru

c (ng.l -1)

Obrázky 44 (a) – (f): Grafické znázornění průběhu koncentrací detekovanách léčiv v závislosti na místě odběru; řeka Svitava 4.4.4.3. Zhodnocení výskytu vybraných léčiv ve vodném prostředí Na základě provedené studie je zřejmé, že vybraná léčiva, s výjimkou kyseliny klofibrové a kyseliny mefenamové, se vyskytují téměř ve všech analyzovaných matricích. Kyselina acetylsalicylová a paracetamol byly detekovány pouze na přítoku. Ostatní léčiva (kyselina salicylová, ibuprofen, naproxen, ketoprofen, diklofenak) byla prokázána i na odtoku a v povrchové vodě. Následující tabulka 12 umožňuje porovnat rozsahy koncentrací postupně od přítoku na ČOV, přes odtok z ČOV, až po povrchovou vodu. Pro přehlednost jsou koncentrace uvedeny ve stejných jednotkách (ng.l-1). Lze tedy pozorovat spojitosti mezi odtokem z ČOV a povrchovou vodou. Léčiva, která nebyla detekována na odtoku, nebyla detekována ani v povrchových vodách a naopak. Nicméně je zapotřebí si uvědomit, že nejenom ČOV mohou být potenciálními zdroji kontaminace. Je nezbytné brát v úvahu rovněž průsaky z různých septiků, skládek, ale především kanalizační vstupy ústící přímo do povrchových vod, a to zejména v menších obcích, které nemají vlastní ČOV nebo kanalizační systém.

(e)

(f)

92

Tabulka 12: Porovnání rozsahu koncentrací léčiv v sledovaných matricích

Odpadní voda (ng.l -1) Povrchová voda (ng.l -1) Trimethylsilyl deriváty léčiv přítok odtok Svratka Svitava

kyselina salicylová 20 000 - 55 000 5 - 550 6 - 140 1 -130 kyselina acetylsalicylová 400 - 2100 < LOD < LOD < LOD kyselina klofibrová < LOD < LOD < LOD < LOD ibuprofen 13 000 - 46 000 170 - 1 200 10 - 70 30 - 1060 paracetamol 1 000 - 20 000 < LOD < LOD < LOD kofein 10 000 - 36 000 80 - 1 200 80 - 170 320 - 2300 naproxen 500 - 3500 80 - 750 3 - 150 3 - 70 kyselna mefenamová < LOD < LOD < LOD < LOD ketoprofen 400 - 4 000 200 - 1 300 10 - 310 4 - 70 diklofenak 4 000 - 17 500 1 500 - 10 500 20 - 500 120 - 260

Nejvyšší koncentrace na přítoku byly pozorovány u kyseliny salicylové, ibuprofenu a kofeinu. Domníváme se, že je to pravděpodobně důsledek vysoké spotřeby léčiv s obsahem těchto účinných látek. Vysoké koncentrace kyseliny salicylové na přítoku mohou být způsobeny několika faktory. Jedním z nich je spotřeba léků obsahujících přímo kyselinu salicylovou jako účinnou látku. Těch však není mnoho. Hlavním faktorem je s největší pravděpodobností spotřeba léků obsahujících kyselinu acetylsalicylovou, která se v organismu přeměňuje na kyselinu salicylovou. Zároveň ze studie zaměřené na degradaci léčiv (viz. kapitola 4.3.) vyplývá, že i ve vodném prostředí dochází k poměrně rychlé degradaci kyseliny acetylsalicylové na kyselinu salicylovou a tato degradace se zvyšuje s rostoucí teplotou. To vše vysvětluje také zjištění poměrně nízkých koncentrací kyseliny acetylsalicylové na přítoku, navzdory vysoké spotřebě léků, které ji obsahují jako účinnou látku; velká část se totiž přemění již v organismu nebo následně v kanalizačním systému. Během čistících procesů dochází k téměř 100% eliminaci kyseliny salicylové, na odtoku se objevuje již v minimálním množství. O kyselině salicylové lze říci, že je téměř všudypřítomná. V povrchové vodě byla detekována téměř ve všech odebraných vzorcích. S velkou pravděpodobností může být důvodem také to, že má tato látka poměrně bohaté přírodní zdroje jako ovoce, vrbové a březové kůry, ale i mokřady a rašeliniště bohaté na obsah huminových látek, z nichž některé mohou být jejími prekurzory. Vysoké koncentrace ibuprofenu na přítoku jsou důsledkem vysoké oblíbenosti léků obsahujících tuto účinnou látku, především díky jejím rychlým a spolehlivým analgetickým účinkům, téměř žádným nebo minimálním nežádoucím účinkům, snadnému nákupu (bez lékařského předpisu) apod. Během čistících procesů na ČOV je však, podobně jako kyselina salicylová, poměrně účinně odstraňován. Jeho stopové koncentrace v řece kolísají v souvislosti s místem odběru. Na dolním toku a za většími městy, jsou již koncentrace ibuprofenu stabilnější. Přítomnost kofeinu v odpadní vodě, a to v poměrně vysokých koncentracích, je dán spíše vysokou spotřebou kávy a kofeinových přípravků než spotřebou léků obsahujících kofein jako pomocnou látku. Svědčí o tom především zvýšené koncentrace na přítoku o víkendech. Oblíbenost kávy a kofeinových přípravků vysvětluje i častý výskyt kofeinu v povrchové vodě. Detekován byl téměř ve všech vzorcích povrchové vody odebrané v obydlených oblastech. Výjimku tvořila pouze první místa odběru, která se nacházela převážně uprostřed lesů. Poměrně stabilní koncentrace naproxenu, ketoprofenu a diklofenaku svědčí o stálé

93

spotřebě léků obsahujících tyto látky. Všechny zmiňované látky byly detekovány i na odtoku z ČOV a v povrchové vodě, kde jejich výskyt postupně narůstal s místem odběru lokalizovaném po směru toku obou řek. Nejvyšší koncentrace na odtoku, tedy nejnižší účinnosti odstraňování během čistících procesů (cca 45 %), byly pozorovány u diklofenaku. To poukazuje na poměrně značnou stabilitu této látky a současně vysvětluje i její vyšší koncentrace v povrchových vodách. Nepřítomnost kyseliny klofibrové a mefenamové potvrzuje skutečnost, že se u nás již tyto účinné látky při výrobě léků vesměs nepoužívají (kyselina klofibrová) nebo se postupně omezují (kyselina mefenamová). Následující graf (obr. 45) uvádí průměrnou účinnost ČOV při odstraňování jednotlivých léčiv během čistících procesů za celý měsíc listopad 2010.

45,30 %

72,44 %

99,83 % 100,00 % 97,90 % 100,00 % 97,37 %81,16 %

0

20

40

60

80

100

120

K. sali

cylov

á

K. ace

tylsa

licylo

vá

Ibup

rofe

n

Parac

etam

ol

Kofein

Napro

xen

Ketop

rofe

n

Diklof

enak

léčiva

účin

nost

ods

traň

ován

í (%

)

Obrázek 45: Průměrná účinnost ČOV v Brně Modřicích při odstraňování vybraných léčiv za celé odběrové období (2.11. – 1.12. 2010)

V dalším grafu (obr. 46) jsou pro přehlednost uvedeny průměrné hodnoty zjištěné na přítoku i odtoku z ČOV za celé časové období odběru vzorků (2.11. – 1.12. 2010).

10,62

2,46

ND

2,37

22,25

5,59

25,10

34,51

0,83ND

5,57

0,66ND

0,420,65<LOD0,47ND0,08 <LOD0

10

20

30

40

50

K. salicy

lová

K. ace

tylsa

licylo

vá

K. klof

ibro

vá

Ibup

rofen

Parac

etam

ol

Kofein

Napro

xen

K. mef

enam

ová

Ketop

rofen

Diklof

enak

léčiva

c (µg.l -1)

přítok odtok

Obrázek 46: Průměrné koncentrace analytů detekovaných v přítokové odpadní vodě za celé odběrové období (2.11. – 1.12. 2010)

94

4.4.5. Porovnání aplikované metody a získaných dat s jinými publikovanými údaji Studium přítomnosti léčiv v odpadních a povrchových vodách je jedním ze stěžejních výzkumných úkolů prováděných na Ústavu chemie a technologie ochrany životního prostředí Fakulty chemické Vysokého učení technického v Brně. Řešitelský kolektiv pod vedením prof. RNDr. Milady Vávrové, CSc. se zaměřuje především na vývoj a aplikaci moderních analytických metod pro dostatečně citlivou a selektivní kvalitativní i kvantitativní stopovou a ultrastopovou analýzu reziduí léčiv různých farmaceutických skupin vyskytujících se ve vodném prostředí. Problematikou přítomnosti analgetik a NSAID v odpadních a povrchových vodách se zabývali také členové kolektivu Ing. Lucie Vydrová, Ph.D. a Ing. Lukáš Čapka, Ph.D. Lucie Vydrová využívala pro stanovení těchto látek jako konečnou analytickou metodu HPLC-MS a Lukáš Čapka CZE-DAD. Následující kapitola je proto věnována zevrubnému porovnání jednotlivých metod aplikovaných při analýze odpadních vod z ČOV v Brně Modřicích, odkud byly odebírány vzorky pro všechny tři studie. Porovnání je zaměřeno především na instrumentální metody, kterých bylo při analýzách využito, a zahrnuje detekční limity, účinnost metody, dobu analýzy (tabulka 13) a průměrné koncentrace, případně rozsah koncentrací (tabulka 14), ve vzorcích odpadních vod. Údaje byly získány z dizertačních prací Lucie Vydrové [139] a Lukáše Čapky [136]. Z tabulky 13 je zřejmé, že nejlepší hodnoty detekčních limitů byly získány u metody využívající GCxGC-TOF MS (desetiny – jednotky ng.l-1) a GC-TOF MS (desítky – stovky ng.l-1), horší detekční limity poskytovala metoda využívající CZE-DAD (desetiny – jednotky µg.l-1) a nejhorší detekční limit byly získány u metody využívající HPLC-MS (jednotky – desítky µg.l-1). Účinnost metody byla srovnána pouze s metodou využívající CZE-DAD, protože v práci Lucie Vydrové nebyla účinnost metody s použitím HPLC-MS uvedena. Z tohoto porovnání vycházela lépe účinnost pro metodu uvedenou a aplikovanou v této dizertační práci, tj. pro metodu využívající GCxGC-TOF MS, avšak rozdíly nebyly příliš veliké. Délka analýzy byla přibližně stejně u CZE-DAD a GCxGC-TOF MS (22 – 25 min), nejdelší čas analýzy byl zjištěn u metody využívající HPLC-MS (50 min). Metoda GCxGC-TOF MS se proto jeví jako velmi citlivá a časově nejméně náročná, avšak na rozdíl od metod HPLC-MS a CZE-DAD je poměrně náročná na spotřebu chemikálií; zejména se jedná o derivatizační činidla nezbytného pro derivatizaci analytů a v neposlední řadě také o spotřebu kapalného a plynného dusíku nezbytných pro kryogenní fokusaci v modulátoru, což jsou položky poměrně finančně náročné. Metoda s využitím HPLC-MS je náročná pouze na spotřebu plynného dusíku, který je využíván především jako sušící plyn. Z tohoto pohledu je tedy finančně nejméně nákladná metoda CZE-DAD. V tabulce 14 je uvedeno porovnání průměrných hodnot koncentrací vybraných analytů v přítokové odpadní vodě, které byly získané měřením všemi třemi uvedenými metodami. Z tabulky vyplývá, že hodnoty koncentrací vybraných analytů jsou u metod využívající CZE-DAD a GCxGC-TOF MS podobné, ačkoliv byly vzorky odebírány v různých časových obdobích. Toto porovnání svědčí o tom, že kontaminace odpadní vody těmito léčivy je v průběhu roku až na výjimky víceméně konstantní. Poněkud rozdílné hodnoty byly zjištěny v případě použité metody využívající HPLC-MS, avšak shodně jako údaje získané z metod využívající CZE-DAD a GCxGC-TOF MS, vypovídá o vyšší koncentraci ibuprofenu, diklofenaku a kofeinu v odpadních vodách v porovnáním s ostatními léčivy.

95

Tabulka 13: Detekční limity, účinnost a délka analýz jednotlivých metod

Tabulka 14: Průměrná koncentrace uvedených léčiv v odpadní vodě měřených různými metodami za časové období odběru vzorků

Vydrová (HPLC-MS) Čapka (CZE-DAD) Lacina (GCxGC-TOF MS) Léčivo

c (µµµµg.l -1) časové období odb ěru

vzork ů c (µµµµg.l -1) časové období odb ěru

vzork ů c (µµµµg.l -1) časové období odb ěru

vzork ů

k.salicylová 0,11 28,21 34,51 ibuprofen 8,36 23,11 25,10 paracetamol 0,75 6,32 5,59 naproxen 4,07 3,93 2,37 ketoprofen 1,43 9,37 2,46 diklofenak 16,76 4,37 10,62 kofein 22,40 - 22,25 k. mefenamová 0,03

duben - červenec 2010

(nepravideln ě)

-

25.7. - 19.8. 2011 (nepravideln ě)

ND

2.11. - 1.12. 2010 (každý den)

Detekční limity Účinnost metody (%) Délka analýzy

Léčivo HPLC-MS

(ug.l -1) CZE-DAD

(ug.l -1) GC-TOF MS

(ng.l -1) GCxGC-TOF MS

(ng.l -1) HPLC-MS CZE-DAD * GCxGC-TOF MS HPLC-MS CZE-DAD GCxGC-TOF MS

k.salicylová 42,4 0,46 14,17 0,23 85,8 92,2 ± 8,4

ibuprofen 30,64 1,17 75,24 5,06 87,6 94,3 ± 2,9

paracetamol 37,97 0,46 34,85 6,03 35,19 46,4 ± 4,2

naproxen 93,33 0,5 31,99 0,82 92,25 96,5 ± 8,7

ketoprofen 25,96 1,28 90,15 1,13 95, 81 97,2 ± 8,6

diklofenak 4,54 0,98 114,58 2,88 89,94 98,1 ± 2,4

kofein 12,49 - - 0,98 - 98,3 ± 4,7

k. mefenamová 1,35 - - 0,68

neuv

eden

o

- 97,8 ± 3,5

50 min: 32 min vlastní analýza, 18

min rpomývání

22 min

22 min: 16 min vlastní analýza, 6 min příprava

přístroje

* směrodatná odchalka neuvedena

96

Analgetika a NSAID patří k celosvětově nejvíce užívaným skupinám léčiv. Tato léčiva byla rovněž nejčastěji detekována v životním prostředí za posledních 15 let, jak uvádí Santos et al. [36], viz. graf na obr. 7. Produkce a spotřeba se však v různých státech liší, což je dáno nejen počtem obyvatel, ale také různě rozvinutým farmaceutickým průmyslem a v neposlední řadě i zdravotnictvím. Pro porovnání jsou v následujících tabulkách prezentovány průměrné koncentrace vybraných léčiv z těchto skupin v odpadních vodách na přítoku do ČOV (tabulka 15) a v povrchových vodách (tabulka 16) v několika evropských státech včetně ČR.

Tabulka 15: Průměrné koncentrace vybraných léčiv v odpadních vodách (přítok) pro různé evropské státy (ng.l-1)

Stát Kys. salicylová Ibuprofen Paracetamol Kofein Naproxen Kys.

mefenamová Ketoprofen Diklofenak

Francie [74] 52 219 - 2213 289 - 1081 486

Rakousko [140] - 2679 - - - - - 4144

V. Británie [141] - 405 - - - 1327 - -

Švédsko [142] - 751 - - 5153 - - 111

Švýcarsko [104] - 4620 - - - 4540 570 2940

Španělsko [143] - 516 10194 - 99 5 451 250

ČR (Brno)* 34510 25100 5590 22250 2370 - 2460 10620

* hodnoty koncentrací získané z měření v této dizertační práci

Na základě porovnání hodnot z tabulky 15 lze konstatovat, že odpadní voda přitékající do ČOV v Brně – Modřicích je poměrně značně kontaminovaná vybranými léčivy na rozdíl od ostatních států. Zjištěná data je však zapotřebí brát s určitou rezervou, protože při zjišťování průměrných hodnot bylo v jiných státech do hodnocení zahrnuto více ČOV, kdežto v případě ČR se brala v úvahu pouze jediná. Nicméně i tato tabulka svědčí o oblíbenosti ibuprofenu a diklofenaku nejen v ČR ale také v ostatních evropských státech. V některých státech je, na rozdíl od ČR, rovněž detekována přítomnost kyseliny mefenamové, což potvrzuje skutečnost, že v ČR byly již přípravky s touto účinnou látkou zakázány.

Tabulka 16: Průměrné koncentrace vybraných léčiv v povrchových vodách pro různé evropské státy (ng.l-1)

Stát Kys. salicylová Ibuprofen Paracetamol Kofein Naproxen Kys.

mefenamová Ketoprofen Diklofenak

V. Británie [144] 14 18 - - 29 5 4 8

Německo [96] - 11 - 104 - - - 33

Švédsko [142] - 56 - - 177 - - 669

Španělsko [143] - 60 42 - 33 3 - 29

ČR * 1 - 140 10 - 100 - 80 - 1000 3 - 150 - 4 - 310 20 - 500

* rozsah koncentrací nalezených v řekách Svratka a Svitava Rovněž u hodnot prezentovaných v tabulce 16 je nutné si uvědomit, že při zpracovávání statistických údajů v ostatních evropských státech byl uvažován průměr koncentrací získaných z daleko více povrchových toků než u této práce, kde byly brány v úvahu pouze dva moravské říční toky Svratka a Svitava. Proto jsou také hodnoty v případě ČR uvedeny pouze jako rozsah koncentrací. Při provedení průměru, vzhledem k malém počtu vybraných

97

říčních toků, by byly hodnoty velice zkreslené. I z této tabulky je však zřejmé, že existuje určitá podobnost mezi ČR a ostatními státy, zejména z pohledu prokázaných vyšších koncentrací ibuprofenu a diklofenaku v povrchových vodách. V povrchových vodách odebraných v ČR je poměrně vysoká i koncentrace kyseliny salicylové. To může být způsobeno především krajinou, kterými řeky protékají, tzn. je zde vysoká pravděpodobnost výskytu přírodních zdrojů obsahující salicyláty (vrby, břízy apod.). V ostatních státech, například ve Španělsku, je tato pravděpodobnost nižší.

98

5. ZÁVĚR Předkládaná dizertační práce byla zaměřena na optimalizaci a vývoj analytické metody určené pro kvalitativní i kvantitativní analýzu nejen vybraných léčiv ze skupin analgetik a NSAID, ale i pro ostatní látky kyselé povahy izolované z odpadních a povrchových vod. V rámci experimentálních studií souvisejících s řešením této práce byla provedena optimalizace derivatizační reakce s použitím silylačního činidla (MSTFA), která je využitelné nejen pro zástupce NSAID, ale také pro jiné látky podobných chemických vlastností. Současně byla optimalizována metoda SPE jako extrakční metoda, která je velice vhodná pro extrakci a zakoncentrování vybraných analytů. Na základě výsledků uvedených optimalizací pak byla navržena výsledná analytická metoda založená na SPE, derivatizaci pomocí MSTFA a finální analýze s využitím GCxGC-TOF MS. Limity detekce navržené metody se pohybovaly v rozmezí 0,18 - 5 ng.l-1 v závislosti na konkrétním analytu a zvolené matrici. Opakovatelnost metody se pohybovala, v závislosti na konkrétní látce a analyzované matrici, v rozmezí hodnot RSD 3 – 15 % a účinnost metody v rozmezí 85 – 97 %. Následně byla navržená metoda úspěšně aplikována na reálných vzorcích odpadních a povrchových vod. Vzorky odpadní vody byly odebírány každý den během celého měsíce listopadu 2010 na přítoku a odtoku z ČOV v Brně Modřicích. Přítomnost většiny vybraných léčiv byla v odpadní vodě prokázána v koncentracích řádově jednotek až desítek µg.l-1 v závislosti na konkrétním analytu. Povrchová voda byla odebrána v měsíci říjnu 2010 z dvou moravských řek Svratky a Svitavy. Lze proto v tomto případě hovořit o monitoringu, který byl zaměřen na sledování úrovně kontaminace obou řek vybranými léčivy. Bylo prokázáno, že v povrchových vodách obou řek byly některé analyty rovněž detekovány, a to v koncentracích řádově desítek až stovek ng.l-1 v závislosti na konkrétním analytu a místu odběru. Současně byla provedena studie samovolné degradace léčiv ve vodném prostředí za rozdílných teplot, jejímž cílem bylo sledovat měnící se koncentraci léčiv ve vodě v průběhu dvou měsíců a odpovědět tak na otázky stability vybraných léčiv ve vodném prostředí. V závěru práce bylo provedeno hodnocení přítomnosti léčiv v odpadních a povrchových vodách, zjištěna účinnost brněnské ČOV při odstraňování sledovaných léčiv a získané hodnoty byly následně porovnány s výsledky získanými při stanovení těchto látek jinými analytickými technikami. Výsledkem disertační práce je vypracování, optimalizace a následné ověření vysoce spolehlivé metody, vhodné pro stanovení vybraných analytů z vodného prostředí, která byla ověřena na cca 60 vzorcích odpadní vody a cca 30 vzorcích povrchové vody. Lze proto konstatovat, že uvedená metoda je využitelná pro monitoring zaměřený na posouzení kontaminace vod tímto druhem polutantů.

99

6. POUŽITÁ LITERATURA [1] ŠÍDLOVÁ, P.; PODLIPNÁ, R.; VANĚK, T.: Cytostatická léčiva v životním prostředí.

Chemické listy, 2011, roč. 105, s. 8-14. [2] HAMPL, F.; RÁDL, S.; PALEČEK, J.: Farmakochemie. 2. rozšířené vyd. Praha:

VŠCHT Praha, 2007. 450 s. ISBN 978-80-7080-639-5. [3] LINCOVÁ, D.; FARGHALI, H. et al.: Základní a aplikovaná farmakologie. 2. vyd.

Praha: Galén, 2007. 672 s. ISBN 978-80-7262-373-0. [4] BENEŠ, L.: Farmaceutická chemie (Farmakochemie) - úvod do chemie léčiv. 1. vyd.

Brno: Ediční středisko VFU Brno, 1997. 55 s. ISBN 80-85114-28-3. [5] MARTÍNKOVÁ, J. a kol.: Farmakologie pro studenty zdravotnických oborů. 1. vyd.

Praha: Grada Publishing, a.s., 2007. 380 s. ISBN 978-80-247-1356-4. [6] KOMÁREK, P.; RABIŠKOVÁ, M. et al.: Technologie léků. 3. přepracované a doplněné

vyd. Praha: Galén, 1997, 2001, 2006. 399 s. ISBN 80-7262-423-7. [7] Zákon č. 378/2008 Sb. O léčivech. [8] KUCHAŘ, M.: Výzkum a vývoj léčiv. 1. vyd. Praha: VŠCHT, 2008. 166 s.

ISBN 978-80-7080-677-7. [9] KATZUNG, B. G.: Základní a klinická farmakologie. 2. české vyd. Jinočany: H & H,

2006. ISBN 80-7319-056-7. [10] KOLÁŘ, J.; AMBRUS, T.; ŠPRINGER, V.: Názvosloví léčiv se zřetelem na lékopisné

názvy. Chemické listy, 2010, roč. 104, s. 27-32. [11] MARTÍNKOVÁ, J.; CHLÁDEK, J.; MIČUDA, S.; CERMANOVÁ, J.; GRIM, J.:

Obecná farmakologie. 1. vyd. Hradec Králové: Olga Čermáková, 2001. ISBN 80-902883-4-0.

[12] ROUSEK, V.; KUČEROVÁ, M.: Úvod do studia farmacie a dějiny farmacie. 1. vyd.

Praha: Avicenum, 1983. 195 s. [13] Historie léčby bolesti. Rescue 112 [online]. Poslední revize 3.1. 2011 [cit. 2011-01-19].

Dostupné z: <http://www.rescue112.cz/index.php?option=com_content&view=article&id=883:histor

ie-leby-bolesti&catid=34:odborne&Itemid=96>. [14] HYNIE, S.: Základy farmakologie. 1. vyd. Praha: TRITON, 1999. 368 s.

ISBN 80-7254-084-3.

100

[15] Český lékopis 2009. 1. vyd. Praha: Grada Publishing, 2009. ISBN 978-80-247-2994-7. [16] HYNIE, S.: Farmakologie v kostce. 2. vyd. Praha: TRITON, 2001. 520 s.

ISBN 80-7254-181-1. [17] KVĚTINA, J.; HERINK, J.; VOPRŠÁLOVÁ, M.: Základy farmakologie 2. díl. 1. vyd.

Brno: Farmaceutická fakulta, Ústav humánní farmakologie a toxikologie, 1999. 193 s. ISBN 80-85114-45-3.

[18] KRŠIAK, M.; LEJČKO, J.; DOLEŽAL, T.: Opioidní analgetika. Bolest. 1. vyd. Praha:

Tigis, 2006. s. 121-134. ISBN 80-7254-181-1. [19] Brevíř 2010. Praha: Medical Tribune, 2010. ISBN 978-80-87135-21-1. [20] Analgetika – antipyretika [online]. Cit. 2010-01-20. Dostupné z: <http://www.samoleceni.cz/analgetika-antipyretika>. [21] TRNAVSKÝ, K.: Příručka farmakoterapie revmatických chorob. Praha: Grada

Avicenum, 1994. 122 s. ISBN 80-85424-89-4. [22] Webové stránky Státního úřadu pro kontrolu léčiv (sekce dodávky a jiná hodnocení).

Dostupné z: <http://www.sukl.cz/dodavky-a-jina-hodnoceni> [23] KVĚTINA, J.; HERINK, J.; VOPRŠÁLOVÁ, M.: Farmakologie pro farmaceuty 1. díl.

1. vyd. Brno: Farmaceutická fakulta, Ústav humánní farmakologie a toxikologie, 2003. 109 s. ISBN 80-7305-457-4.

[24] VIŠŇOVSKÝ, P. a kol.: Farmakologie látek znečišťujících životní prostředí. 1. vyd.,

Praha: Karolinum, 1997. 106 s. ISBN 80-7184-407-1. [25] VEČERKOVÁ, J.: Biotransformace léčiv a její význam pro toxikologickou praxi.

1. vyd. Praha: Karolinum, 1997. 70 s. ISBN 80-7184-450-0. [26] KÜMMERER, K.: Pharmaceuticals in the Environment. Springer, 2004. 527 s.

ISBN 3-540-21342-2. [27] KÜMMERER, K.: Pharmaceuticals in the Environment: Sources, Fate, Efects and

Risks. Brlin-Heidelberg-New York-London: Springer-Verlag, 2001. 265 p. ISBN 3-540-41067-8.

[28] BENDZ, D.; PAXÉUS, N. A.; GINN, R. T.; LOGE, F. J.: Occurrence and fate of

pharmaceutically active compounds in the environment, a case study: Höje River in Sweden. Journal of Hazardous Material, 2005, vol. 122, pp. 195-204.

101

[29] HIRSCH, R.; TERNES, T.; HABERER, K.; KRATZ, K.: Occurence of antibiotics in the aquatic environment. The Science of the Total Environment, 1999, vol. 225, pp. 109-118.

[30] YANG, S.; CARLSON, K.: Evolution of antibiotic occurrence in a river through

pristine, urban and agricultural landscapes. Water Research, 2003, vol. 37, pp. 4645-4645.

[31] HERNANDO, M. D.; MEZCUA, M.; FERNÁNDEZ-ALBA, A. R.; BARCELÓ, D.:

Environmental risk assessment of pharmaceutical residues in wastewater effluents, surface waters and sediments. Talanta, 2006, vol. 69, pp. 334-342.

[32] HEBERER, T.: Occurence, fate, and removal of pharmaceutical residues in the aquatic

environment: a review of recent research data. Toxicology Letters, 2002, vol. 131, pp. 5-17.

[33] TOGOLA, A.; BUDZINSKI, H.: Analytical development for analysis of

pharmaceuticals in water samples by SPE and GC-MS. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2007, vol. 388, pp. 627-635.

[34] FARRÉ, M.; PETROVIC, M.; BARCELÓ, D.: Recently developed GC/MS and LC/MS

methods for determining NSAIDs in water samples. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2007, vol. 387, pp. 1203-1214.

[35] ZHANG, Y.; GEISEN, S.-U.; GAL, C.: Carbamazepine and diclofenac: Removal in

wastewater treatment plants and occurence in water bodies. Chemosphere, 2008, vol. 73, pp. 1151-1161.

[36] SANTOS, L. H. M. L. M.; ARAÚJO, A. N.; FACHINI, A.; PENA, A.; DELERUE-

MATOS, C.; MONTENEGRO, M. C. B. S. M.: Ecotoxicological aspects related to the presence of pharmaceuticals in the aquatic environment. Journal of Hazardous Materials, 2010, vol. 175, pp. 45-95.

[37] KOT-WASIK, A.; DEBSKA, J.; NAMIÉSNIK, J.: Analytical techniques in studies of

the enfironmental fate of pharmaceuticals and personal-care products. Trends in Analytical Chemistry, 2007, vol. 26, no. 6, pp. 557-568.

[38] HALLING-SÖRENSEN, B.; NIELSEN, N. S.; LANZKY, P. F.; INGERSLEV, F.;

LÜTZHÖF, H.; JÖRGENSEN, S. E.: Occurrence, Fate and Effects of Pharmaceutical Substances in the Environment. Chemosphere, 1998, vol. 36, no.2, pp. 357-393.

[39] DÍAZ-CRUZ, M. S.; LÓPEZ DE ALDA, J.; BARCELÓ, D.: Environmental behavior

and Analysisi of veterinary and human drugs in soil, sediments and sludge. Trends in Analytical Chemistry, 2003, vol. 22, no.6, 340-351.

102

[40] KAY, P.; BLACKWELL, P. A.; BOXALL, A. B. A.: Transport of veterinary antibiotics i overland flow following the application of slurry to arable land. Chemosphere, 2005, vol. 59, pp. 951-959.

[41] JÖRGENSEN, S. E.; HALLING-SÖRENSEN, B.: Drugs in the environment.

Chemosphere, 2000, vol. 40, pp. 691-699. [42] DOERR-MacEwen, N. A.; HAIGHT, M. E.: Expert Stakeholder`s Views on the

Management of Human Pharmaceuticals in the Environment. Environmental Management, 2006, vol. 38, pp. 853-866.

[43] MOMPELAT, S.; THOMAS, B. O.: Occurrence and fate of pharmaceutical products

and by-products, from resource to drinking water. Environment International, 2009, vol. 35, pp. 803-814.

[44] BATT, A. L.; BRUCE, I. B.; AGA, D. S.: Evaluating the vulnerability of surface waters

to antibiotic contamination from varying wastewater treatment plant discharges. Environmental Pollution, 2006, vol. 142, pp. 295-302.

[45] SIM, W.; LEE, J.; OH, J.: Occurrence and fate of pharmaceuticals in wastewater

treatment plants and revers in Korea. Environmental Pollution, 2010, vol. 158, pp. 1938-1947.

[46] COOPER, R. E.; SIEWICKI, C. T.; PHILLIPS, K.: Perliminary risk assessment

database and risk ranking of pharmaceuticals in the environment. Science of the Total Environment, 2008, vol. 398, pp. 26-33.

[47] AHRER, W.; SCHERWENK, E.; BUCHBERGER, W.: Determination of drug residues

in water by the combination of liquid chromatography or capillary electrophoresis with electrospray mass spectrometry. Journal of Chromatography A, 2001, vol. 910, pp. 69-78.

[48] LIN, W-CH.; CHEN, H-CH.; DING, W-H.: Determination of pharmaceutical residues

in waters by solid-phase extraction and large-volume on-line derivatization with gas chromatography-mass spectrometry. Journal of Chromatography A, 2005, vol. 1065, pp. 279-285.

[49] KÜMMERER, K.: Drugs in the environment: emission of drugs, diagnostic acids and

disinfectants into wastewater by hospitals in relation to other sources – a review. Chemosphere, 2001, vol. 45, pp. 957-969.

[50] CLEUVERS, M.: Aquatic ecotoxicity of pharmaceuticals including the assessment of

combination effects. Toxicology Letters, 2003, vol. 142, pp. 185-194.

103

[51] CLEUVERS, M.: Mixture toxicity of the anti-inflammatory drugs diclofenac, ibuprofen, naproxen and acetylsalicylic acid. Ecotoxicology and Environmental Safety. 2004, vol. 59, pp. 309–315.

[52] FATTA, D.; NIKOLAOU, A.; ACHILLEOS, A.; MERIC, S.: Analytical methods for

tracing pharmaceutical residues in water and wastewater. Trends in Analytical Chemistry, 2007, vol. 26, no. 6, pp. 515-533.

[53] ROBINSON, I.; JUNQUA, G.; COILLIE, R.; THOMAS, O.: Trends in the detection of

pharmaceutical products, and their impact and mitigation in warter and wastewater in North America. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2007, vol. 387, pp. 1143-151.

[54] BABIC, S.; ASPERGER, D.; MUTAVDZIC, D.; HORVAT, A. J. M.; KASTELA-

MACAN, M.: Solid phase extraction and HPLC determination of veterinary pharmaceuticals in wastewater. Talanta, 2006, vol. 70, pp. 732-738.

[55] SANTOS, J. L.; APARICIO, I.; ALONSO, E.; CALLEJON, M.: Simultaneous

determination of pharmaceutically active compounds in wastewater samples by solid phase extraction and high-performance liquid chromatography with diode array and fluorescence detectors. Analytica Chemica Acta, 2005, vol. 550, pp. 116-122.

[56] SEIFRTOVÁ, M.; PENA, A.; LINO, C. M.; SOLICH, P.: Determination of

fluoroquinolone antibiotics in hospital and municipal wastewaters in Coimbra by liquid chromatography with a monolithic column and fluorescence detection. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2008, vol. 391, pp. 799–805.

[57] PENA, A.; CHMIELOVA, D.; LINO, C. M.; SOLICH, P.: Determination of

fluorquinolone antibiotics in surface waters from Mondego River by high performance liquid chromatography using amonolithic column, Journal of Separation Science, 2007, vol. 30, pp. 2924–2928.

[58] CHIAVARIANO, B.; CRESTONI, E. M.; MARZIO, A.; FORNARINI, S.:

Determination of sulfonamide antibiotics by gas chromatography coupled with atomic emission detection. Journal of Chromatography B, 1998, vol. 706, pp. 269-277.

[59] MAMANI, M. C. V.; AMAYA-FARFAN, J.; REYES, F. G. R.; FRACASSI DA

SILVA, J. A.; RATH, S.: Use of experimental desig and effective mobility calculations to develop a method for the determination of antimicrobials by capillary electrophoresis. Talanta, 2008, vol. 76, pp. 1006-1014.

[60] FERDIG, M.; KALETA, A.; VO, T. D.; BUCHBERGER, W.: Improved capillary

electrophoretic separation of nine (fluoro)quinolines with fluorescence detection for biological and environmental samples. Journal of Chromatography A, 1004, vol. 1047, pp. 305-311.

104

[61] MACIÁ, A.; BORRULL, F.; CALULL, M.; AGUILAR, C.: Capillary electrophoresis for the analysis of non-steroidal anti-inflammatory drugs. Trends in Analytical Chemistry, 2007, vol. 26, pp. 133-153.

[62] FARRÉ, M.; PETROVIC, M.; BARCELÓ, D.: Recently developed GC/MS and LC/MS

methods for determining NSAIDs in water samples. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2007, vol. 387, pp. 1203-1214.

[63] FUKSA, J. K.: Příručka pro vzorkování vody a vodního prostředí. Praha: Výzkumný

ústav vodohospodářský T. G. Masaryka, 2003. ISBN 80-85900-53-X. [64] MORTIMER, M; MÜLLER, J. F.; LIESS, M.: Sampling Methods in Surface Waters. In

Handbook of water analysis. 2nd ed. Boca Raton: CRC Press, 2007. p. 1-45. ISBN 08-493-7033-7.

[65] ČURDOVÁ, E.; KOPLÍK, R.; MESTEK, O.: Zásady správného vzorkování. In Odběry

vzorků v terénu: sborník textů o vzorkování na celnicích, v průmyslu, v zemědělství, kontrole životního prostředí a hygieně. Václav Helán. Český Těšín: 2 THETA, 1999. s. 36-45. ISBN 80-902432-8-2.

[66] SEIDLEROVÁ, J.; PLACHÁ, D.; KRATOŠOVÁ, D.: Analytická chemie odpadních

materiálů. 1. vyd. Ostrava: VŠB – Technická univerzita Ostrava, 2006. 121 s. ISBN 80-248-1010-7.

[67] ČSN EN ISO 5667-1(757051): Jakost vod - Odběr vzorků - Část 1: Návod pro návrh

programu odběru vzorků a pro způsoby odběru vzorků. Praha: Český normalizační institut, 2007. 31 s.

[68] LANGHANS, J.: Vzorkování povrchových vod. In Odběry vzorků: sborník přednášek z

kurzu. 2. upravené a doplněné vyd. Václav Helán. Český Těšín: 2 THETA, 2006. ISBN 80-86380-33-5.

[69] POPL, M.: Analytická chemie životního prostředí. 4. přepracované vyd. Praha: VŠCHT

v Praze, 1999. ISBN 80-7080-336-3. [70] HORÁKOVÁ, M. a kol.: Analytika vody. 1. vyd. Praha: VŠCHT, 2000. 283 s.

ISBN 80-7080-391-6. [71] PAILLER, J.-Y.; KRAIN, A.; PFISTER, L.; HOFFMANN, L.; GUIGNARD, C.: Solid

phase extraction to liquid chromatography-tandem mass spectrometry analysis of sulfonamides, tetracyclines, analgesics and hormones in surface water and wastewater in Luxembourg. Science of the Total Environment, 2009, vol. 407, pp. 4736-4743.

105

[72] FARRÉ, M.; FERRER, I.; GINEBREDA, I.; FIGUERAS, M.; OLIVELLA, L; TIRAPU, L.; VILANOVA, M.; BARCELÓ, D.: Determination of drugs in surface water and wastewater samples by liquid chromatography-mass spectrometry: methods and preliminary results including toxicity studies with Vibio fischeri. Journal of Chromatography A, 2001, vol. 938, pp. 187-197.

[73] YING, G.: Analysis of Endocrine Disrupting Chemicals and Pharmaceuticals and

Personal Care Products in Water. In Handbook of water analysis. 2nd ed. Boca Raton: CRC Press, 2007. p. 694-727. ISBN 08-493-7033-7.

[74] TOGOLA, A.; BUDZINSKI, H.: Multi-residue analysis of pharamaceutical compounds

in aqueous samples. Journal of Chromatography A, 2008, vol. 1177, pp. 150-158. [75] CONLEY, J. M.; SYMES, S. J.; KINDELBERGER, S. A.; RICHARDS, S. M.: Rapid

liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for the determination of a broad mixture of pharmaceuticals in surface water. Journal of Chromatography A, 2008, vol. 1185, pp. 206-215.

[76] SUI, Q.; HUANG, J.; DENG, S.; YU, G.: Rapid determinantion of pharmaceuticals

from mulitiple therapeutic classes in wastewater by solid-phase extraction and ultra-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry. Chinese Science Bulletin, 2009, vol. 54, pp. 4633-4643.

[77] ČAPKOVÁ, A.: Odběr vzorků odpadních vod pro stanovení jednotlivých ukazatelů

znečištění odpadních vod. In Analytika odpadních vod, Praha – říjen 1995. Praha: Česká vědeckotechnická vodohospodářská společnost, 1996. 132 s. ISBN 80-02-01072-8

[78] POVÝŠILOVÁ, M.: Odběry vzorků z čistíren odpadních vod. In Odběry vzorků:

sborník přednášek z kurzu. 2. upravené a doplněné vyd. Václav Helán. Český Těšín: 2 THETA, 2006. ISBN 80-86380-33-5.

[79] RENEW, J. E.; HUANG, CH.: Simultaneous determination of fluoroquinoline,

sulfonamide, and trimethoprim antibiotics in wastewater using tandem solid phase extraction and liquid chromatography-electrospray mass spectrometry. Journal of Chromatography A, 2004, vol. 1042, pp. 113-121.

[80] YANG, S.; CHA, J.; CARLSON, K.: Simultaneous extraction and analysis of 11

tetracycline and sulfonamide antibiotics in influent and effluent domestic wastewater by solid-phase extraction and liquid chromatography-electrospray ionization tandems mass spectrometry. Journal of Chromatography A, 2005, vol. 1097, pp. 40-53.

[81] DÍAZ-CRUZ, M. S.; GRCÍA-GALÁN, M. J.; BARCELÓ, D.: Highly sensitive

simultaneous determination of sulfonamide antibiotics and one metabolite in environmental waters by liquid chromatography-quadrupole linear ion trap-mass spectrometry. Journal of Chromatography A, 2008, vol. 1193, pp. 50-59.

106

[82] GULKOWSKA, A.; LEUNG, H. W.; SO, M. K.; TANIYASU, S.; YAMASHITA, N.; YEUNG, L. W. Y.; RICHARDSON, B. J.; LEI, A. P.; GIESY, J. P.; LAM, P. K. S.: Removal of antibiotics from wastewater by sewage treatment facilities in Hong Kong and Shenzen, China. Water Research, 2008, vol. 42, pp. 395-403.

[83] HAO, CH.; LISSEMORE, L.; NGUYEN, B.; KLEYWEGT, S; YANG, P.;

SOLOMON, K.: Determination of pharmaceuticals in environmental waters by liquid chromatography/electrospray ionization/tandem mass spectrometry. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2006, vol. 384, pp. 505-513.

[84] LINBERG, R.; JARNHEIMER, P. A.; OLSEN, B.; JOHANSSON, M.; TYSKLIND,

M.: Determination of antibiotics substances in hospital sewage water using solid phase extraction and liquid chromatography/mass spectrometry and group analogue internal standards. Chemosphere, 2004, vol. 57, pp. 1479-1488.

[85] CHOI, K-J.; KIM, S-G.; KIM, CH.; KIM, S-H.: Determination of antibiotic compounds

in water by on-line SPE-LC/MSD. Chemosphere, 2007, vol. 66, pp. 977-984. [86] KARLÍČEK, R. a kol.: Analytická chemie pro farmaceuty. 3. vyd. Praha: Karolinum,

2007. 281 s. ISBN 978-80-246-1453-3. [87] PROCHÁZKOVÁ, D.: Extrakce tuhou fází (SPE) a mikroextrakce tuhou fází (SPME)

– extrakční metody pro přípravu vzorku k analýze. In Analýza organických látek: sborník přednášek z kurzu. 2. upravené a doplněné vyd. Český Těšín: 2 THETA, 2005. s. 25-56. ISBN 80-86380-29-7.

[88] JEN, J-F., LEE, H-L., LEE, B-N.: Simultaneous determination of seven sulfonamide

residues in swine wastewatwr by high-perormenace liquid chromatography. Journal of Chromatography A, 1998, vol. 793, pp. 378-382.

[89] BALAKRISHAN, V. K.; TERRY, K. A.; TOITO, J.: Determination of sulfonamide

antibiotics in wastewater: A comparison of solid phase microextraction and solid phase extraction methods. Journal of Chromatography A, 2006, vol. 1131, pp. 1-10.

[90] PAVLOVIĆ, D. M.; BABIĆ, S.; HORVAT, A. J. M.; KAŠTELAN-MACAN, M.:

Sample preparation in analysis of pharmaceuticals. Trends in Analytical Chemistry, 2007, vol. 26, pp. 1062-1075.

[91] PERTILE, E.; ČABLÍK, V.: Instrumentální metody analýzy. Ostrava: VŠB – Technická

univerzita Ostrava, 2006. 238 s. ISBN 80-248-1049-2. [92] JANČÁŘOVÁ, I.; JANČÁŘ, L.: Analytická chemie. Brno: Mendlova lesnická a

zemědělská univerzita, 2003. 195 s. ISBN 80-7157-647-6. [93] ŠTULÍK, K. a kol.: Analytické separační metody. 1. vyd. Praha: Karolinum, 2004.

ISBN 80-246-0852-9.

107

[94] SACHER, F.; LANGE, F.; BRAUCH, H.; BLANKENHORN, I.: Pharmaceuticals in graundwaters: Analytical methods and results of a monitoring program in Baden-Wüttenberg, Germany. Journal of Chromatography A, 2001, vol. 938, pp. 199-210.

[95] Webové stránky Chromacademy (sekce Sample Prep – Solid Phase Extraction).

Dostupné z: <http://www.chromacademy.com/frameset-chromacademy-final.asp?ID=876> [96] WEIGEL, S.; KALLENBORN, R.; HÜHNERFUSS, H.: Simultaneous solid-phase

extraction of acidic, neutral and basic pharmaceuticals from aqueous samples at ambient (neutral) pH and their determination by gas chromatography–mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 2004, vol. 1023, pp. 183-195.

[97] BOUND, P. J.; VOURVOULIS, N.: Predicted and measured concentrations for

selected pharmaceuticals in UK rivers: Implications for risk assessment. Water Research, 2006, vol. 40, pp. 2885-2892.

[98] MOLDOVAN, Z.: Occurrences of pharmaceutical and personal care products as

micropollutants in rivers from Romania. Chemosphere, 2006, vol. 64, pp. 1808-1817. [99] MOEDER, M.; SCHRADER, S.; WINKLER, M.; POPP, P.: Solid-phase

microextraction–gas chromatography–mass spectrometry of biologically active substances in water samples. Journal of Chromatography A, 2000, vol. 873, pp. 95-106.

[100] ZIRUI, Y.; PELDSZUS, S.; HUCK, P. M.: Optimizing gas chromatographic-mass

spectrometric analysis of selectet pharmaceuticals and endocrine-disrupting substances in water using factorial experimental design. Jouranl of Chromatography A, 2007, vol. 1148, pp. 65-77.

[101] RODRIGUEZ, I.; QUINTANA, B.; CARPINTEIRO, J.; CARRO, A. M.; LORENZO,

R. A.; CELA, R.: Determination of acidic drugs in sewage water by gas chromatography–mass spectrometry as tert-butyldimethylsilyl derivatives. Journal of Chromatography A, 2003, vol. 985, pp. 265-274.

[102] CARBALLA, M.; OMIL, F.; LEMA, M. J.; LIOMPART, M.; GARCIA-JARES, C.;

RODRIGUEZ, I.; GOMEZ, M.; TERNES, T.: Behavior of pharmaceuticals, cosmetics and hormones in a sewage treatment plant. Water Research, 2004, vol. 38, pp. 2918-2926.

[103] LEE, H. B.; PEART THOMAS, E.; LEWINA, S. M.: Determination of endocrine-

disrupting phenols, acidic pharmaceuticals, and personal-care products in sewage by solid-phase extraction and gas chromatography–mass spectrometry. Journal of Chromatography A, 2005, vol. 1094, pp. 122-129.

108

[104] TAUXE-WUERSCH, A.; DE ALENCASTRO, L. F.; GRANDJEAN, D.; TARRADELLAS, J.: Occurrence of several acidic drugs in sewage treatment plants in Switzerland and risk assessment. Water Research, 2005, vol. 39, pp. 1761-1772.

[105] GOMEZ, M. J.; PETROVIC, M.; FERNANDEZ-ALBA, A. R.; BARCELO, D.:

Determination of pharmaceuticals of various therapeutic classes by solid-phase extraction and liquid chromatography–tandem mass spectrometry analysis in hospital effluent wastewaters. Journal of Chromatography A, 2006, vol. 1114, pp. 224-233.

[106] GUNNAR, T.; MYKKÄNEN, S.; ARINIEMI, K.; LILLSUNDE, P.: Validated

semiquantitative/quantitative screening of 51 drugs in whole blood as silylated derivatives by gas chromatography-selected ion monitoring mass spectrometry and gas chromatography electron capture detection. Journal of Chromatography B, 2004, vol. 806, pp. 205-219.

[107] BOUKRAA, M. S.; DERUAZ, D.; BANNIER, A.; DESAGE, M.; BRAZIER, J. L.:

Detection of 13C labelled compounds by gas chromatography coupled to atomic emission detection - Application to caffeine metabolites. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2004, vol. 12, pp. 185-194.

[108] ROCHELEAU, M.; TITLEY, M.; BOLDUC, J.: Measuring residual solvents in

pharmaceutical samples using fast gas chromatography techniques. Jouranl of Chromatography B, 2004, vol. 805, pp. 77-86.

[109] HROCH, M.: Stanovení distribuce halogenovaných difenyletherů do složek životního

prostředí. Brno: Vysoké učení technické v Brně, Fakulta chemická, 2012. 137 s. Vedoucí dizertační práce Prof. RNDr. Milada Vávrová, CSc.

[110] ASSASSI, N.; TAZEROUTI, A.; CANSELIER, J. P.: Analysis of chlorinated,

sulfochlorinated and sulfonamide derivatives of n-tetradecane by gas chromatography/mass spectrometry. Journal of Chromatography A, 2005, vol. 1071, pp. 71-80.

[111] SOLIMAN, M. A.; PEDERSEN, J. A.; SUFFET, I. H. M.: Rapid gas

chromatography-mas spectrometry screening method for human pharmaceuticals, hormones, antioxidants and plasticizers in water. Journal of Chromatography A, 2004, vol. 1029, pp. 223-237.

[112] ÖLLERS, S.; SINGER, H. P.; FÄSSLER, P.; MÜLLER, S. R.: Simultaneous

quantification of neutral acidic pharmaceuticals and pesticides at the low-ng/l level in surface and waste water. Journal of Chromatography A, 2001, vol. 911, pp. 225-234.

[113] ŠEVČÍK, J. G. K.: Plynová chromatografie a její aplikace v organické analýze. In

Analýza organických látek: sborník přednášek z kurzu. 1. vyd. Český Těšín: 2 THETA, 1999. s. 103-150. ISBN 80-902432-9-0.

109

[114] AMIJEE, M.; CEUNG, J.; WELLS, R. J.: Direct on-column derivatisation in gas chromatography II. Comparsion of various on-column methylation reagens and the development of a new selective methylation reagent. Journal of Chromatography A, 1996, vol. 738, pp. 43-58.

[115] SAMARAS, G. S.; THOMAIDIS, N. S.; STASINAKIS, A. S.; LEKKAS, T. D.: An

analytical method for the simultaneous trace determination of acidic pharmaceuticals and phenolic endocrine disrupting chemicals in wastewater and sewage sludge by gas chromatography-mass spectrometry. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2011, vol. 399, pp. 2549-2561.

[116] VOLKA, K. a kol.: Analytická chemie II. 1. vyd. Praha:Vysoká škola chemicko-

technologická v Praze, 1995. 236 s. ISBN 80-7080-227-8. [117] MOEDER, M.; SCHRADER, S.; WINKLER, M.; POPP, P.: Solid-phase

microextraction-gas chromatography-mass spectrometry of biologically active substances in water samples. Journal of Chromatography A, 2000, vol. 873, pp. 95-106.

[118] KOUTSOUBA, V.; HEBERER, T.; FUHRMANN, B; SCHMIDT-BAUMLER, K.;

TSIPI, D.; HISKIA, A.: Determination of polar pharmaceuticals in sewage water of Greece by gas chromatography–mass spectrometry. Chemosphere, 2003, vol. 51, pp. 69-75.

[119] KOSJEK, T.; HEATH, E.; KRBAVČIČ, A.: Determination of non-steroidal anti-

inflammatory drug (NSAIDs) residues in water samples. Environment International, 2005, vol. 31, pp. 679-685.

[120] Ollers, S.; Winter, H. P.; Fassler, P.; Muller, S. R.: Simultaneous quantification of

neutral and acidic pharmaceuticals and pesticides at the low-ng/l level in surface and waste water. Journal of Chromatography A. 2001, vol. 911, pp. 225-234.

[121] AZZOUZ, A.; SOUHAIL, B.; BALLESTEROS, E.: Continuous spolid-phase

extraction and gas chromatography-mass spectrometry determination of pharmaceuticals and hormones in water samples. Journal of Chromatography A, 2010, vol. 1217, pp. 2956-2963.

[122] LIU, Z.; PHILLIPS, J. B.: Comprehensive Two-Dimensional Gas Chromatography

using an On-Column Thermal Modulator Interface. Journal of Chromatographic Science. 1991, Vol. 29, pp. 227-231.

[123] SCHŮREK, J.; HAJŠLOVÁ, J.; ZROSTLÍKOVÁ, J.: Plynová chromatografie

s „time-of-flight“ hmotnostně spektrometrickou detekcí a její aplikační potenciál. In Analýza organických látek: sborník přednášek z kurzu. 2. upravené a doplněné vyd. Český Těšín: 2 THETA, 2005. s. 321-350. ISBN 80-86380-29-7.

110

[124] Webové stránky firmy Leco (Ortogonální dvojrozměrná plynová chromatografie s hmotnostním spektrometrem Time-of-Flight). Dostupné z:

<http://www.leco.cz/cz/products/sep_sci/pegasus_4d/pegasus_4d.htm> [125] HARYNUK, J.: Comprehensive Two-dimensional Gas Chromatography (GCxGC)

[online]. 2009, poslední revize 18.6. 2009 [cit. 20.12. 2011]. Dostupné z: <http://www.scitopics.com/Comprehensive_Two_dimensional_Gas_Chromatography

_GCxGC.html> [126] ALENCASTRO DE, L. F.; GRANDJEAN, D.; TARRADELLAS, J.: Application of

Multidimensional (Heart-Cut) Gas Chromatography to the Analysis of Komplex Mixcures of Organic Pollutants in Environmental Samples. Chimia. 2003, vol. 57 (9), pp. 499-504.

[127] WANG, H.T.; WENG, N.; ZHANG, S.C.; ZHU, G.Y.; CHEN, J.P.; WEI, C.Y.:

Identification of petroleum aromatic fraction by comprehensive two-dimensional gas chromatography with time-of-flight mass spectrometry. Chinese Science Bulletin. 2010, vol. 55, pp. 2039-2045

[128] PROCHÁZKOVÁ, D.: Sigma-Aldrich-Aktuálně. Firemní prezentace na workshopu

Albertov Comprehensive Days v Praze, 8.2. 2011. [129] OPEKAR, F. a kol.: Základní analytická chemie. Praha: Karolinum, 2002.

ISBN 80-246-0553-8. [130] HIRSCH, R.; TERNES, T. A.; HABERER, K.; MEHLICH, A.; BALLWNZ, F.;

KRATZ K-L.: Determination of antibiotics in different water compartments via liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A, 1998, vol. 815, pp. 213-223.

[131] SEBÖK, Á.; VASANITS-ZSIGRAI, A.; PALKÓ, G.; ZÁRAY, G.; MOLNÁR-PERL,

I.: Identification and quantification of ibuprofen, naproxen, ketoprofen anddiclofenac present in waste-waters, as their trimethylsilyl derivatives, by gas chromatography mass spectrometry. Talanta, 2008, vol. 76, pp. 642-650.

[132] LANGEL, K.; GUNNAR, T.; ARINIEMI, K. et al.: A validated method for the

detection and quantitation of 50 drugs of abuse and medicinal drugs in oral fluid by gas chromatography–mass spectrometry. Journal of Chromatography B. 2011, vol. 879, pp. 859–870.

[133] NAGAMATSU, K.; KUDO, K.; USUMOTO, Y. et al.: Rapid screening of 18

nonsteroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) using novel NAGINATA™ gas chromatography-mass spectrometry software. Forensic Toxicology. 2012, vol. 30, pp. 11-18.

111

[134] LACINA, P.: Využití plynové chromatografie pro stanovení reziduí léčiv ve vodách. Brno: Vysoké učení technické, Fakulta chemická, 2009. 96 s. Vedoucí diplomové práce prof. RNDr. Milada Vávrová, CSc.

[135] Webové stránky Brněnských vodáren a kanalizací (sekce Odvádění a čištění

odpadních vod / ČOV Brno – Modřice) [online]. Poslední revize 17.2. 2012 [cit. 20.2. 2012]. Dostupné z:

<http://www.bvk.cz/o-spolecnosti/odvadeni-a-cisteni-odpadnich-vod/cov-brno-modrice>

[136] ČAPKA, L. Využití kapilární zónové elektroforézy pro stanovení vybraných analgetik

ve vodách . Brno: Vysoké učení technické v Brně, Fakulta chemická, 2011. 136 s. Vedoucí dizertační práce prof. RNDr. Milada Vávrová, CSc.

[137] ČSN P ISO/TS 21748: Návod pro použití odhadů opakovatelnosti,

reprodukovatelnosti a správnosti při odhadování nejistoty měření. Praha: Český normalizační institut, 2005. 36 s.

[138] JUX, U.; BAGINSKI, R.; HANS-GUNTER, A.; KRONKE, M.; SENG, P.: Detection

of pharmaceutical contaminations of river, pond, and tap water from Cologne (Germany) and surroundings. International Journal of Hygiene and Environmental Health. 2002, vol. 205, pp. 393-398.

[139] VYDROVÁ, L.: Využití separačních metod pro studium biologicky aktivních látek ve

vodách. Brno: Vysoké učení technické v Brně, Fakulta chemická, 2011. 118 s. Vedoucí dizertační práce prof. RNDr. Milada Vávrová, CSc.

[140] CLARA, M.; STRENN, B.; GANS, O.; MARTINEZ, E.; KREUZINGER, N.;

KROISS, H.: Removal of selected pharmaceuticals, fragrances and endocrine disrupting compounds in a membrane bioreactor and conventional wastewater treatment plants. Water Research, 2005, vol. 39, pp. 4797-4807.

[141] NEBOT, C.; GIBB, S. W.; BOYD, K. G.: Quantification of human pharmaceuticals in

water samples by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Analytica Chimica Acta, 2007, vol. 598, pp. 87-94.

[142] ZORITA, S.; BOYD, B.; STIG, J.; YILMAZ, E.; SVENSSON, C.; MATHIASSON,

L.; BERGSTROM, S.: Selective determination of acidic pharamceuticals in wastewater using molecularly imprinted solide phase extraction. Analytica Chimica Acta, 2008, vol. 626, pp. 147-154.

[143] GROS, M.; PETROVIC, M.; BARCELO, D.: Development of a multi-residue

analytical methodology based on liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) for screening and trace level determination of pahrmaceuticals in surface and wastewaters. Talanta, 2006, vol. 70, pp. 678-690.

112

[144] KASPRZYK-HORDERN, B.; DINSDALE, R. M.; GUWY, A. J.: The effect of signal suppression and mobile phase composition on the simultaneous analysis of multiple classes of acidic/neutral pharmaceuticals and personal care products in surface water by solid-phase extraction and ultra performance liquid chromatography-negative electrospray tandem mass spectrometry. Talanta. 2008, vol. 74, pp. 1299–1312.

[145] ČAPKA, L.; LACINA, P.; VÁVROVÁ, M.: Optimization of solid phase extraction of

selected non-steroidal anti-inflammatory drugs by capillary zone electrophoresis. Chemické listy. 2012, vol. 106, pp. 30-35.

113

7. SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK AED atomový emisní detektor BSTFA N,O-bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamid (derivatizační činidlo) CNS centrální nervový systém CZE kapilární zónová elektroforéza COX cyklooxygenáza ČOV čistírna odpadních vod ČR Česká republika DAD detektor diodového pole (Diode Array Detektor) ECD detektor elektronového záchytu (Electron Capture Detector) EMA Evropská léková agentura (European Medicines Agency) EO ekvivalentní obyvatel FID plamenový ionizační detektor (Flame Ionization Detector) FLD fluorescenční detektor GC plynová chromatografie GCxGC (2D) komplexní dvojrozměrná plynová chromatografie GIT gastrointestinální trakt HPLC vysokoúčinná kapalinová chromatografie LC kapalinová chromatografie LLE extrakce kapalina-kapalina (Liquid-Liquid Extraction) LOD limit detekce LOQ limit kvantifikace MS hmotnostní spektrometr / hmotnostní spektrometrie

114

MS/MS (MS2) tandemová hmotnostní spektrometrie MSTFA N-methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamid (derivatizační činidlo) MTBSTFA N-methyl-N-terc-buthyldimethylsilyl-trifluoroacetamid (derivatizační činidlo) NSAID nesteroidní protizánětlivé látky (Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drugs) PAH polycyklické aromatické uhlovodíky PCB polychlorované bifenyly PCDD polychlorované dibenzodioxiny PCDF polychlorované dibenzofurany PLOT typ kapilární kolony v plynové chromatografii (Porus Layer Open Tubular) QSAR označení pro pokusy o korelaci biologické aktivity látek s jejich strukturou

prováděné v 60. letech 20. století SOP standardní operační postup SPE extrakce tuhou fází (Solid Phase Extraction) RSD relativní směrodatná odchylka TIC celkový iontový proud (Total Ion Current) TMS trimethylsilyl TOF analyzátor doby letu (Time of Flight) UHPLC rychlá kapalinová chromatografie s vysokým rozlišením UV ultrafialový WCOT typ kapilární kolony v plynové chromatografii (Wall Coated Open Tubular)

115

8. PŘÍLOHY SEZNAM PŘÍLOH 8.1. Příloha 1: Velkokapacitní ČOV Brno – Modřice 8.2. Příloha 2: Odběr vzorků 8.3. Příloha 3: Ukázka odběrového protokolu 8.4. Příloha 4: Hmotnostní spektra derivátů vybraných léčiv 8.5. Příloha 5: Ukázka GCxGC chromatogramů reálných vzorků 8.6. Příloha 6: Tabulka 17: Koncentrace vybraných léčiv na přítoku i odtoku z ČOV za celé

vzorkovací období 8.7. Příloha 7: Použitá zařízení a přístroje

116

8.1. Příloha 1: Velkokapacitní ČOV Brno – Modřice

Obrázek 47: Místo odběru vzorků odpadní vody – čistírna odpadních vod Brno – Modřice

◄ Obrázek 48: Schéma kanalizační sítě vedoucí na ČOV Brno – Modřice

117

8.2. Příloha 2: Odběry vzorků

Obrázek 49: Mapa odběru vzorků povrchové vody s přibližnými GPS souřadnicemi

◄ ▼ Obrázky 50: Odběry vzorků povrchové vody

118

8.3. Příloha 3: Ukázka odběrového protokolu

Lokalita odběru: obec Štěpánov nad Svratkou_před číslo vzorku: 7

Sledovaná charakteristika Popis

Popis místa odběru (název) most; cca 200 m před začátkem obce (po směru

toku); silnice č. 387; GPS souřadnice: 49°30'41.291"N, 16°20'20.576"E

Přesná poloha odběrového místa na toku uprostřed toku

Datum a doba odběru 4.10. 2010; 11:40

Počasí (vítr, vlny, proudění) mírný vítr, zataženo, prudší tok

Teplota vzduchu, vody v hloubce odběru teplota vzduchu: 13,4 °C; teplota vody 12,2 °C

Použité odběrové zařízení hloubkový vzorkovač o objemu 3 litrů od firmy

OPTING service

Hloubka vzorku od povrchu (hladiny) cca 30 cm

Množství vzorku 2,5 l

Barva vzorku lehce nažloutlá až dohněda

Pach vzorku bez konkrétního zápachu

pH vzorku 6,8

119

8.4. Příloha 4: Hmotnostní spektra derivátů vybraných léčiv

Hmotnostní spektrum trimethylsilyl derivátu kyseliny salicylové

Hmotnostní spektrum trimethylsilyl derivátu kyseliny acetylsalicylové

Hmotnostní spektrum trimethylsilyl derivátu kyseliny klofibrové

Hmotnostní spektrum trimethylsilyl derivátu ibuprofenu

Hmotnostní spektrum trimethylsilyl derivátu paracetamolu

120

Hmotnostní spektrum kofeinu

Hmotnostní spektrum trimethylsilyl derivátu naproxenu

Hmotnostní spektrum trimethylsilyl derivátu kyseliny mefenamové

Hmotnostní spektrum trimethylsilyl derivátu ketoprofenu

Hmotnostní spektrum trimethylsilyl derivátu diklofenaku

121

8.5. Příloha 5: Ukázka GCxGC chromatogramů reálných vzorků

Obrázek 51: GCxGC chromatogram odpadní vody (2D zobrazení) - přítok (5.11.), TIC

Obrázek 52: GCxGC chromatogram odpadní vody - přítok (5.11.), TIC; 3D zobrazení předchozího chromatogramu

122

Obrázek 53: GCxGC chromatogram odpadní vody (2D zobrazení) - odtok (5.11.), TIC

Obrázek 54: GCxGC chromatogram odpadní vody - odtok (5.11.), TIC; 3D zobrazení předchozího chromatogramu

123

Obrázek 55: GCxGC chromatogram odpadní vody - přítok (5.11.), vybrané hmoty; 1 – kyselina salicylová (TMS), 2 – kyselina acetylsalicylová (TMS), 4 – ibuprofen (TMS), 5 – paracetamol (TMS); 6 – kofein, 7 – naproxen (TMS), 9 – ketoprofen (TMS), 10 – diklofenak

Obrázek 56: GCxGC chromatogram odpadní vody - přítok (5.11.), vybrané hmoty; 3D zobrazení předchozího chromatogramu; 1 – kyselina salicylová (TMS), 2 – kyselina acetylsalicylová (TMS), 4 – ibuprofen (TMS), 5 – paracetamol (TMS); 6 – kofein, 7 – naproxen (TMS), 9 – ketoprofen (TMS), 10 – diklofenak

124

Obrázek 57: GCxGC chromatogram odpadní vody - odtok (5.11.), vybrané hmoty; 1 – kyselina salicylová (TMS), 4 – ibuprofen (TMS), 6 – kofein, 7 – naproxen (TMS), 9 – ketoprofen (TMS), 10 – diklofenak

Obrázek 58: GCxGC chromatogram odpadní vody - odtok (5.11.), vybrané hmoty; 3D zobrazení předchozího chromatogramu; 1 – kyselina salicylová (TMS), 4 – ibuprofen (TMS), 6 – kofein, 7 – naproxen (TMS), 9 – ketoprofen (TMS), 10 – diklofenak

125

Obrázek 59: GCxGC chromatogram povrchové vody - Židlochovice 1, TIC

Obrázek 60: GCxGC chromatogram povrchové vody – Židlochovice 1, TIC; 3D zobrazení předchozího chromatogramu

126

8.6. Příloha 6: Tabulka 17: Koncentrace vybraných léčiv na přítoku i odtoku z ČOV za celé vzorkovací období

Koncentrace ( µg.l -1) *

k. salicylová k. acetylsalicylová k. klofibrová ibu profen paracetamol Datum

(2010) Přítok odtok p řítok odtok ** p řítok ** odtok ** p řítok odtok p řítok odtok **

2.11. 27,79 ± 0,48 0,240 ±±±± 0,026 2,137 ±±±± 0,525 ND ND ND 14,71 ±±±± 0,94 0,171 ±±±± 0,106 18,00 ±±±± 1,25 ND 3.11. 33,21 ± 4,18 0,036 ±±±± 0,051 0,865 ±±±± 0,046 ND ND ND 25,58 ±±±± 2,94 0,256 ±±±± 0,164 2,341 ±±±± 0,266 ND 4.11. 39,98 ± 2,28 0,026 ±±±± 0,011 0,896 ±±±± 0,081 ND ND ND 29,72 ±±±± 2,46 0,320 ±±±± 0,120 20,16 ±±±± 1,74 ND 5.11. 43,47 ± 1,51 0,036 ±±±± 0,043 0,716 ±±±± 0,009 ND ND ND 30,19 ±±±± 2,63 0,439 ±±±± 0,088 14,22 ±±±± 3,08 ND 6.11. 43,39 ± 0,81 0,026 ±±±± 0,027 0,955 ±±±± 0,151 ND ND ND 32,20 ±±±± 0,77 0,219 ±±±± 0,044 12,31 ±±±± 2,53 ND 7.11. 42,79 ± 1,37 0,018 ±±±± 0,023 0,683 ±±±± 0,018 ND ND ND 29,74 ±±±± 1,28 0,497 ±±±± 0,135 10,86 ±±±± 1,98 ND 8.11. 39,19 ± 3,14 0,115 ±±±± 0,038 0,650 ±±±± 0,042 ND ND ND 29,39 ±±±± 2,15 0,478 ±±±± 0,148 3,921 ±±±± 0,647 ND 9.11. 32,04 ± 0,31 0,041 ±±±± 0,045 0,857 ±±±± 0,042 ND ND ND 22,28 ±±±± 0,59 0,611 ±±±± 0,043 2,222 ±±±± 0,202 ND 10.11. 20,75 ± 0,76 0,012 ±±±± 0,008 0,814 ±±±± 0,025 ND ND ND 13,24 ±±±± 0,46 0,487 ±±±± 0,072 2,454 ±±±± 0,428 ND 11.11. 34,33 ± 0,93 0,047 ±±±± 0,024 1,161 ±±±± 0,021 ND ND ND 21,34 ±±±± 0,57 0,669 ±±±± 0,052 13,09 ±±±± 1,43 ND 12.11. 41,73 ± 1,39 0,069 ±±±± 0,033 0,483 ±±±± 0,056 ND ND ND 26,77 ±±±± 1,07 0,212 ±±±± 0,025 1,909 ±±±± 0,583 ND 13.11. 33,95 ± 1,15 0,001 ±±±± 0,002 0,766 ±±±± 0,047 ND ND ND 25,54 ±±±± 0,77 0,148 ±±±± 0,101 2,670 ±±±± 0,353 ND 14.11. 41,56 ± 0,78 < LOD 0,661 ±±±± 0,037 ND ND ND 26,89 ±±±± 1,61 0,148 ±±±± 0,014 2,405 ±±±± 0,379 ND 15.11. 37,44 ± 0,94 0,318 ±±±± 0,130 0,664 ±±±± 0,040 ND ND ND 27,97 ±±±± 0,32 0,303 ±±±± 0,100 1,964 ±±±± 0,282 ND 16.11. 34,93 ± 0,51 0,060 ±±±± 0,019 0,654 ±±±± 0,038 ND ND ND 24,86 ±±±± 2,18 0,234 ±±±± 0,044 1,960 ±±±± 0,394 ND 17.11. 34,02 ± 0,74 0,548 ±±±± 0,362 0,708 ±±±± 0,032 ND ND ND 24,28 ±±±± 0,53 0,515 ±±±± 0,026 12,35 ±±±± 1,54 ND 18.11. 49,09 ± 1,80 0,133 ±±±± 0,084 0,730 ±±±± 0,074 ND ND ND 27,30 ±±±± 0,57 0,456 ±±±± 0,089 2,401 ±±±± 0,291 ND 19.11. 40,78 ± 0,81 0,005 ±±±± 0,008 0,703 ±±±± 0,048 ND ND ND 29,64 ±±±± 0,90 0,260 ±±±± 0,037 1,729 ±±±± 0,066 ND 20.11. 44,48 ± 1,01 0,013 ±±±± 0,011 1,257 ±±±± 0,032 ND ND ND 38,57 ±±±± 0,81 0,612 ±±±± 0,058 17,43 ±±±± 2,28 ND 21.11. 51,97 ± 0,68 0,006 ±±±± 0,009 0,790 ±±±± 0,044 ND ND ND 45,93 ±±±± 1,37 0,704 ±±±± 1,006 3,307 ±±±± 0,188 ND 22.11. 30,14 ± 1,54 0,026 ±±±± 0,028 0,864 ±±±± 0,088 ND ND ND 27,89 ±±±± 0,62 0,226 ±±±± 0,103 3,957 ±±±± 0,767 ND 23.11. 20,21 ± 1,97 < LOD 0,478 ±±±± 0,032 ND ND ND 8,03 ±±±± 0,12 0,137 ±±±± 0,043 1,057 ±±±± 0,135 ND 24.11. 25,72 ± 0,58 < LOD 0,758 ±±±± 0,016 ND ND ND 23,53 ±±±± 1,69 0,652 ±±±± 0,064 1,808 ±±±± 0,082 ND 25.11. 23,95 ± 1,66 < LOD 0,795 ±±±± 0,050 ND ND ND 20,57 ±±±± 0,83 0,503 ±±±± 0,164 3,372 ±±±± 1,362 ND 26.11. 49,06 ± 5,49 0,021 ±±±± 0,015 0,721 ±±±± 0,067 ND ND ND 35,92 ±±±± 0,99 0,476 ±±±± 0,026 2,432 ±±±± 0,729 ND 27.11. 21,97 ± 3,21 < LOD 0,729 ±±±± 0,039 ND ND ND 19,25 ±±±± 0,21 0,892 ±±±± 0,279 2,073 ±±±± 0,335 ND 28.11. 21,96 ± 1,38 < LOD 0,855 ±±±± 0,071 ND ND ND 18,98 ±±±± 0,39 1,173 ±±±± 0,343 1,842 ±±±± 0,282 ND 29.11. 24,70 ± 1,22 < LOD 1,175 ±±±± 0,119 ND ND ND 18,44 ±±±± 0,83 0,556 ±±±± 0,119 1,644 ±±±± 0,304 ND 30.11. 22,83 ± 1,37 < LOD 0,830 ±±±± 0,137 ND ND ND 17,29 ±±±± 0,66 0,705 ±±±± 0,011 1,250 ±±±± 0,192 ND 1.12. 27,91 ± 0,92 < LOD 0,570 ±±±± 0,039 ND ND ND 16,99 ±±±± 0,89 1,032 ±±±± 0,388 0,456 ±±±± 0,101 ND

127

Tabulka 17 - pokračování

Koncentrace ( µg.l -1) * kofein naproxen k. mefenamová ketoprofen diklofenak

Datum

(2010) Přítok odtok p řítok odtok p řítok ** odtok ** p řítok odtok p řítok odtok

2.11. 20,59 ± 1,57 0,694 ± 0,144 3,071 ± 0,317 0,722 ± 0,032 ND ND 3,569 ± 0,186 1,181 ± 0,026 14,89 ± 1,36 8,869 ± 0,197 3.11. 16,07 ± 0,76 0,623 ± 0,209 2,526 ± 0,183 0,695 ± 0,041 ND ND 2,636 ± 0,047 1,113 ± 0,081 14,02 ± 0,62 10,439 ± 0,909 4.11. 18,09 ± 0,32 0,808 ± 0,122 3,024 ± 0,089 0,557 ± 0,059 ND ND 3,435 ± 0,026 0,867 ± 0,064 15,49 ± 0,09 7,646 ± 0,747 5.11. 17,38 ± 1,07 1,125 ± 0,218 3,298 ± 0,206 0,665 ± 0,046 ND ND 3,734 ± 0,085 1,105 ± 0,140 17,08 ± 0,27 8,747 ± 1,065 6.11. 16,74 ± 0,83 0,698 ± 0,160 2,723 ± 0,235 0,526 ± 0,032 ND ND 2,935 ± 0,095 1,262 ± 0,085 13,48 ± 0,74 8,908 ± 0,991 7.11. 23,15 ± 0,27 0,849 ± 0,179 3,185 ± 0,148 0,634 ± 0,080 ND ND 3,846 ± 0,112 1,225 ± 0,048 15,80 ± 0,99 8,383 ± 0,772 8.11. 27,96 ± 2,45 0,464 ± 0,097 3,452 ± 0,157 0,550 ± 0,115 ND ND 3,838 ± 0,350 0,841 ± 0,095 15,06 ± 1,39 4,958 ± 0,772 9.11. 28,28 ± 0,71 0,774 ± 0,178 2,130 ± 0,090 0,622 ± 0,033 ND ND 2,339 ± 0,157 1,007 ± 0,154 9,497 ± 0,421 6,990 ± 0,574 10.11. 26,32 ± 1,95 0,794 ± 0,117 1,370 ± 0,132 0,390 ± 0,019 ND ND 1,632 ± 0,177 0,488 ± 0,013 6,806 ± 0,255 4,930 ± 0,587 11.11. 33,54 ± 0,93 0,779 ± 0,093 2,763 ± 0,095 0,726 ± 0,136 ND ND 2,849 ± 0,187 1,240 ± 0,227 7,450 ± 0,329 3,666 ± 0,180 12.11. 11,28 ± 1,06 0,282 ± 0,129 2,717 ± 0,039 0,359 ± 0,115 ND ND 3,732 ± 1,064 0,533 ± 0,199 7,413 ± 1,728 2,936 ± 0,849 13.11. 28,58 ± 4,21 0,465 ± 0,235 2,412 ± 0,146 0,269 ± 0,040 ND ND 2,369 ± 0,096 0,538 ± 0,012 8,512 ± 0,957 5,067 ± 0,249 14.11. 24,44 ± 2,18 0,763 ± 0,230 2,979 ± 0,098 0,361 ± 0,018 ND ND 3,645 ± 0,040 0,455 ± 0,060 13,36 ± 0,72 4,644 ± 0,377 15.11. 23,52 ± 1,44 0,489 ± 0,117 3,062 ± 0,074 0,374 ± 0,042 ND ND 3,399 ± 0,071 0,748 ± 0,076 12,34 ± 0,39 4,054 ± 0,463 16.11. 21,35 ± 0,89 0,648 ± 0,319 2,502 ± 0,080 0,365 ± 0,010 ND ND 2,925 ± 0,155 0,842 ± 0,093 11,12 ± 0,22 6,381 ± 0,876 17.11. 26,48 ± 0,47 0,553 ± 0,256 2,738 ± 0,078 0,471 ± 0,095 ND ND 2,718 ± 0,088 0,771 ± 0,164 9,515 ± 0,452 5,890 ± 0,432 18.11. 21,54 ± 0,52 < LOD 2,646 ± 0,135 0,158 ± 0,033 ND ND 2,223 ± 0,109 0,208 ± 0,059 8,851 ± 0,281 3,042 ± 1,032 19.11. 14,99 ± 1,55 0,500 ± 0,305 1,397 ± 0,158 0,300 ± 0,015 ND ND 1,264 ± 0,204 0,405 ± 0,039 8,844 ± 0,835 6,309 ± 0,146 20.11. 25,38 ± 1,89 0,739 ± 0,459 1,958 ± 0,199 0,353 ± 0,147 ND ND 1,759 ± 0,159 0,471 ± 0,125 10,29 ± 1,56 6,857 ± 1,371 21.11. 20,50 ± 3,69 0,795 ± 0,429 3,163 ± 0,440 0,395 ± 0,050 ND ND 2,809 ± 0,218 0,606 ± 0,038 17,01 ± 1,27 7,391 ± 0,645 22.11. 19,19 ± 2,82 < LOD 2,764 ± 0,097 0,078 ± 0,025 ND ND 2,656 ± 0,127 0,069 ± 0,017 13,26 ± 0,56 1,592 ± 0,395 23.11. 10,36 ± 0,67 0,686 ± 0,397 0,411 ± 0,036 0,176 ± 0,012 ND ND 0,461 ± 0,030 0,213 ± 0,051 4,754 ± 0,396 3,406 ± 0,117 24.11. 21,64 ± 2,77 0,643 ± 0,434 1,728 ± 0,147 0,325 ± 0,006 ND ND 1,427 ± 0,052 0,392 ± 0,013 8,583 ± 0,282 4,917 ± 0,212 25.11. 18,84 ± 0,78 0,612 ± 0,353 2,085 ± 0,041 0,331 ± 0,055 ND ND 1,775 ± 0,108 0,473 ± 0,052 9,754 ± 0,526 5,531 ± 0,558 26.11. 19,35 ± 3,89 < LOQ 1,587 ± 0,209 0,341 ± 0,047 ND ND 1,673 ± 0,095 0,459 ± 0,036 9,671 ± 0,435 4,455 ± 0,288 27.11. 16,52 ± 3,82 0,395 ± 0,195 2,482 ± 0,572 0,454 ± 0,027 ND ND 1,780 ± 0,254 0,509 ± 0,093 10,39 ± 2,61 4,578 ± 0,388 28.11. 30,85 ± 2,89 0,987 ± 0,401 1,854 ± 0,113 0,488 ± 0,080 ND ND 1,680 ± 0,131 0,626 ± 0,084 8,015 ± 0,234 5,446 ± 0,450 29.11. 27,75 ± 5,26 0,082 ± 0,048 1,913 ± 0,068 0,289 ± 0,021 ND ND 1,888 ± 0,128 0,372 ± 0,051 7,618 ± 0,217 4,309 ± 0,257 30.11. 36,68 ± 4,96 < LOQ 1,498 ± 0,097 0,287 ± 0,029 ND ND 1,256 ± 0,155 0,297 ± 0,058 5,959 ± 0,434 3,427 ± 0,122 1.12. 20,17 ± 3,69 < LOQ 1,715 ± 0,121 0,299 ± 0,009 ND ND 1,415 ± 0,068 0,365 ± 0,033 3,720 ± 0,164 3,255 ± 0,092

* průměrná hodnota vypočítaná z hodnot tří paralelních stanovení ± směrodatná odchylka; ** ND – nedetekováno

128

8.7. Příloha 7: použitá zařízení a přístroje

▲ ▼ Obrázky 61: Instrumentace SPE

129

▲ ▼ Obrázky 62: GCxGC-TOF MS Pegasus IV D, LECO

130

ŽIVOTOPIS

OSOBNÍ ÚDAJE

Jméno a příjmení, titul Petr Lacina, Ing.

Datum narození: 18.8. 1984

Trvalé bydliště Krátká 4, 591 02 Žďár nad Sázavou

E-mail: lacina_petr@centrum.cz

VZDĚLÁNÍ

od roku 2009 Vysoké učení technické v Brně, Fakulta chemická

Typ studia: doktorský

Obor: Chemie životního prostředí

Téma dizertační práce: Využití plynové chromatografie s hmotnostně

spektrometrickou detekcí pro posouzení kontaminace odpadních a

povrchových vod rezidui léčiv

2007 – 2010 Vysoké učení technické v Brně, Fakulta chemická

Typ studia: bakalářský

Obor: Krizové řízení a ochrana obyvatelstva

Téma bakalářské práce: Nebezpečné chemické látka a přípravky

2007 – 2009 Vysoké učení technické v Brně, Fakulta chemická

Typ studia: navazující magisterský

Obor: Chemie a technologie ochrany životního prostředí

Téma diplomové práce: Využití plynové chromatografie pro stanovení

reziduí léčiv ve vodách

2004 – 2007 Vysoké učení technické v Brně, Fakulta chemická

Typ studia: bakalářský

Obor: Chemie a technologie ochrany životního prostředí

Téma bakalářské práce: Odmořovací a dezinfekční prostředky

1996 – 2004 Biskupské gymnázium, Žďár nad Sázavou

Maturitní zkouška: český jazyk, anglický jazyk, chemie, matematika

PRAXE

od 1.1. 2012 Vysoké učení technické v Brně, Fakulta chemická

technicko-hospodářský pracovník (chromatografické přístroje, chod

laboratoří)

131

JAZYKOVÉ ZNALOSTI

Anglický jazyk – středně pokročilý

DALŠÍ DOVEDNOSTI

Pokročilá znalost kancelářského balíku Microsoft Office

řidičský průkaz sk. B

KURZY, SEMINÁ ŘE, WORKSHOPY

2009

� 10. ročník školy hmotnostní spektrometrie (Seč – Ústupky; 14. – 18.9. 2009)

2010

� vzdělávací seminář: Rychlé chromatografické metody pro mnoho analytů v různých matricích (VŠCHT Praha, 11.2. 2010)

� vzdělávací seminář firmy Chromservis: SPE method development (Brno; 17.3. 2010)

� 14. ročník spektroskopické konference (Litomyšl; 31.5. – 3.6. 2010)

� 11. ročník školy hmotnostní spektrometrie (Pec pod Sněžkou; 20. – 24.9. 2010)

2011

� Workshop Albertov Comprehensive days: Teorie a praxe komprehensivních separačních metod (PřF UK Praha; 8.2. 2011)

� 12. ročník školy hmotnostní spektrometrie (Šumava – Srní; 12. – 16.9. 2011)

� 5th Meeting on Chemistry and Life (FCH VUT Brno; 14. – 16.9. 2011)

� 16th International Symposium on Environmental Pollution and its Impact on Life in the Maditerranean Region - MESAEP (Ioannina, Řecko; 24. – 27.9. 2011)

� Vzdělávací seminář firmy Waters „VIZE 2011“ (Brno; 22.11. 2011)

� 12th European Meeting on Environmental Chemistry – EMEC 12 (Clermont-Ferrand, Francie; 7. – 10.12. 2011)

2012

� Workshop Albertov Comprehensive days: Teorie a praxe komprehensivních separačních metod (PřF UK Praha; 7. - 8.2. 2012)

� Vzdělávací seminář firmyLabicom: Nové trendy v oblasti přípravy vzorků a měřící analytické techniky (Brno; 16.4. 2012)

� 30th Informal Meeting on Mass Spectrometry 2012 (Olomouc; 29.4. – 3.5. 2012)

132

VĚDECKÉ AKTIVITY (prezentace výsledků dizertační práce)

� 12. ročník školy hmotnostní spektrometrie (Šumava – Srní; 12. – 16.9. 2011) � Forma prezentace: přednáška

� 5th Meeting on Chemistry and Life (FCH VUT Brno; 14. – 16.9. 2011) � Forma prezentace: poster

� 16th International Symposium on Environmental Pollution and its Impact on Life in the Maditerranean Region - MESAEP (Ioannina, Řecko; 24. – 27.9. 2011)

� Forma prezentace: 2 postery

� 12th European Meeting on Environmental Chemistry – EMEC 12 (Clermont-Farrand, Francie; 7. – 10.12. 2011)

� Forma prezentace: poster

� 30th Informal Meeting on Mass Spectrometry 2012 (Olomouc; 29. 4. – 3.5. 2012) � Forma prezentace: poster

PROJEKTY

FCH-S-11-2 Využití chemických, biochemických a toxikologických metod k hodnocení zátěže ekosystémů (řešeno v roce 2010; specifický výzkum)

FRVŠ projekt č. 2013/2011/G4 Stanovení léčiv v biotických a abiotických složkách životního prostředí (řešeno v roce 2011) FCH-S-11-3 Hodnocení zátěže ekosystému prioritními polutanty (řešeno v roce 2011; specifický výzkum) FRVŠ projekt č. 1497/2012/G4 Studium průniku vybraných léčiv do biotické složky ekosystémů (řešeno v roce 2012)

133

PUBLIKA ČNÍ ČINNOST IMPAKTOVANÉ PUBLIKACE

ČAPKA, L.; LACINA, P. ; VÁVROVÁ, M.: Optimization of Solid-Phase Extraction of Selected Non-Steroidal Anti-inflammatory Drugs by Capillary Zone Electrophoresis. Chemické listy, 2012, roč. 106, č. 1, s. 30-35. ISSN: 0009-2770. [IF 0,620 (2010)] LACINA, P. ; ŽENATOVÁ, P.; VÁVROVÁ, M.: The Assessment of Contamination of Selected River Streams in the Czech Republic by Human and Veterinary Drug Residues with Liquid and Gas Chromatography. Fresenius Environmental Bulletin, 2012, vol. 21. ISSN: 1018-4619. (Přijato 1.2. 2012) [IF 0,716 (2010)] ČAPKA, L.; LACINA, P. ; VÁVROVÁ, M.: Development and Application of SPE/CZE Method for Detection and Determination of Selected Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drugs in Wastewater. Fresenius Environmental Bulletin, 2012, vol. 21. ISSN: 1018-4619. (Přijato 13.3. 2012) [IF 0,716 (2010)] LACINA, P. ; MRAVCOVÁ, L.; VÁVROVÁ, M.: Application of Comprehensive Two-Dimensional Gas Chromatography With Mass Spectrometric Detection For The Analysis of Selected Drug Residues in Wastewater and Surface Water. Zasláno do Journal of Environmental Sciences [IF 1,513 (2010)]. V současnosti v druhém kole recenzního řízení. DALŠÍ PUBLIKA ČNÍ ČINNOST (abstrakty a příspěvky na konferencích)

ČÁSLAVSKÝ, J.; LACINA, P. ; VÁVROVÁ, M.; MRAVCOVÁ, L.: Analysis of drug residuals in waste water by tandem gas chromatography with mass spectrometric detection. In Sborník 14. česko-slovenské spektroskopické konference. 1. vyd. Pardubice: Universita Pardubice, 2010. s. D-1. ISBN 978-80-7395-282-2. ČÁSLAVSKÝ, J.; LACINA, P. ; VÁVROVÁ, M.; MRAVCOVÁ, L.: Application of tandem gas chromatography with fast mass spectrometric detection for the analysis of drug residuals in waste water. In 29th Informal Meeting on Mass Spectrometry. 1. ed. Padova, Italy: Servizi Grafici Editoriali, 2011. s. 153-153. ISBN 978-88-89884-19-5. LACINA, P. ; MRAVCOVÁ, L.; VÁVROVÁ, M.: The use of comprehensive two-dimensional gas chromatograhy with mass spectrometric detection for the assessment of drug- residue contamination of wastewater and surface water. In 5th Meeting on Chemistry and Life: Book of Abstracts. Chemické listy (S). Brno: Fakulta chemická VUT v Brně, 2011. s. 964-965. ISSN 1803- 2389. ČAPKA, L.; LACINA, P. ; VÁVROVÁ, M.: Development and optimisation of SPE/CZE method for the analysis of non-steroidal anti-inflammatory drugs from water. In 5th Meeting on Chemistry and Life: Book of Abstracts. Chemické listy (S). Brno: Fakulta chemická VUT v Brně, 2011. s. 960. ISSN 1803- 2389.

134

ČAPKA, L.; LACINA, P. ; VÁVROVÁ, M.: Optimisation of solid phase extraction of selected non-steroidal anti- inflammatory drugs by capillary zone electrophoresis. In 16th International Symposium on Environmental Pollution and its Impact on Life in the Mediterranean Region: Book of Abstracts. Řecko, Ioannina, 2011. JÁROVÁ, K.; VÁVROVÁ, M.; STOUPALOVÁ, M.; ŽENATOVÁ, P.; LACINA, P. ; KRÁLOVÁ, Z.: Možnosti izolace vybraných léčiv z environmentálních matric. In Zborník proceedings. Ed. S. Hredzák. Hrádok pri Jelšave: Ústav geotechniky SAV Košice, 2011, s. 68-72. ISBN 978-80-970034-3-2. LACINA, P. ; MRAVCOVÁ, L.; VÁVROVÁ, M.: The assessment of analgesic- residue contamination of wastewater using tandem gas chromatography with mass spectrometric detection. In 16th International Symposium on Environmental Pollution and its Impact on Life in the Mediterranean Region: Book of Abstracts. Řecko, Ioannina, 2011. LACINA, P. ; VÁVROVÁ, M.; MRAVCOVÁ, L.; ČÁSLAVSKÝ, J.: Application of GCxGC- TOF MS for the analysis of drug residues in wastewaters and surface waters. In 12th European Meeting on Environmental Chemistry: Book of Abstracts. Francie, Clermont-Ferrand, 2011. VÁVROVÁ, M.; LACINA, P. ; ŽENATOVÁ, P.: Využití SPE a SPME při analýze léčiv ve vodách. In Pitná voda 2012. 2012. s. XXX-XXX. Článek v současnosti zaslaný do sborníku Pitná voda 2012; problematika bude přednesena na konferenci Pitná voda 2012, která se bude konat 21.5. – 24.5. 2012 v Táboře.