AISLAMIENTO Y PURIFICACION DE PROTEINAS A PARTIR DE MATERIALES

BIOLOGICOS

OBJETIVO: Aislar y purificar proteínas a partir de diversos materiales biológicos

FUNDAMENTO: Los métodos utilizados habitualmente para la separación de proteínas puras se basan en su distinta solubilidad en determinadas condiciones (pH próximo o alejado de su punto isoeléctrico, tamaño molecular, fuerza iónica del medio, etc.) de modo que, por regla general, se favorece la eliminación de materiales que puedan interferir, precipitando a continuación la proteína deseada y dejando los restantes componentes de la muestra biológica en el sobrenadante, para su eliminación.

Los métodos de separación son diversos. Así, la caseína, la principal proteína de la leche se precipita simplemente por variación del pH, hasta llegar al punto isoeléctrico donde es insoluble en agua. La caserna es, en realidad una mezcla heterogénea de fosfoproteínas que se encuentra en una proporción del 3.5 % en la leche y constituye un alimento muy completo pues posee todos los aminoácidos esenciales para un crecimiento y desarrollo normales.

La ovoalbúmina el principal componente de la clara de huevo (64 %), se obtiene tras precipitar las ovoglobulinas con sulfato amónico y ajuste del pH al punto isoeléctrico donde su solubilidad es menor y precipita.

La vitelina, una fosfoproteína que se encuentra en la yema de huevo, se obtiene por eliminación de los lípidos que la acompañan y por disminución de la fuerza iónica del medio.

La miosina, una globulina típica, forma parte del sistema de proteínas contráctiles de las miofibrillas del músculo estriado. Como globulina se solubiliza en una solución salina de fuerza iónica baja y precipita al disminuir notoriamente la fuerza iónica. El mismo efecto se utiliza para extraer una globulina de un tejido vegetal.

La ureasa (código 3.5.1.5) fue la primera enzima cristalina obtenida en forma pura por Sumner, en 1926, a partir de la soya, siguiendo el mismo procedimiento que seguiremos aquí, o sea mediante precipitación con acetona, a partir del extracto de semillas de soya.

La base de la separación de las proteínas que hemos mencionado es el hecho de que la solubilidad de los solutos ionizables, sean proteínas o sales inorgánicas sencillas, se modifica por la presencia de otros iones. Cada ion en solución se encuentra rodeado por una "atmósfera iónica" de iones de carga opuesta que puede modificar notablemente la solubilidad de una sustancia iónica dada. En general, la solubilidad de una proteína aumenta por la presencia de fuerzas iónicas relativamente bajas de sales neutras y disminuye por la presencia de fuerzas iónicas altas. Normalmente, como sal neutra se utiliza sulfato de amonio para aumentar o disminuir la solubilidad de una proteína.

La fuerza iónica, |x, depende de la concentración y la carga de los iones. Matemáticamente se define como

n - y2sc,zi2

donde C ^ concentración molar del ion z == número de cargas de este ion

De acuerdo a la fórmula, la fuerza iónica de un ion polivalente como el sulfato de amonio, (Nt^^SO^ , donde z >1, es bastante mayor que la fuerza iónica de un ion monovalente como el NaCI donde z =33 1 .

El efecto facilitador de las sales neutras sobre la solubilidad se llama solubilización salina o saltíng in, en tanto que la disminución de la solubilidad en presencia de fuerzas iónicas elevadas constituye la precipitación salina o salting out.

La solubilización salina estabiliza los grupos cargados en las proteínas mientras que la precipitación salina se presenta por una competición, por el agua, entre la proteína y la sal. Al aumentar la concentración de sal ésta desplaza al agua, que se transforma en agua de hidratación alrededor de los iones cargados de la sal. La consecuencia final es la precipitación de la proteína.

MATERIALES Y REACTIVOS: Centrífuga nevera Vidrio de reloj grande baño María Probeta de 50 ml probeta de 100 mL Termómetro tijeras Gasa algodón Media de nylon guantes de cirugía pH-metro balanza Embudo de vidrio vaso de precipitados de 500 mL Vaso de precipitados de 100 mL agitador de vidrio Erlenmeyer de 125 mL erlenmeyer de 500 mL 2 erlenmeyer de 21 papel de filtro trompa de vacío Hielo embudo de separación de 500 ml 100 mL de leche 2huevos 200 g de carne fresca 50 g de semillas vegetales 100 g de semilla de soya 50 mL de ácido acético al 25 % 50 mL etanol al 95 % 100 mL etanol al 50 %. Conservarlo en nevera 500 mL éter etílico I00 mLNaOH 0.lN 250 mL de solución saturada de sulfato de amonio (760 g/1) 250 mL acetona 250 ml NaC1 10% 50 mL NaCI 0.95 % 500 mL LiCl 0.7 M ó 500 mL KC1 0.6 M Mantener en nevera hasta su uso 20 mL tampón de citrato 0.5 M, pH 6.0. Para prepararlo se disuelven en agua 1.208 g de ácido cítrico cristalizado y 13.014 g de de citrato trisódico cristalizado, hasta completar 100 mL de solución. Si no se dispone de citrato trisódico, se pueden disolver 1.208 g de ácido cítrico cristalizado en unos 50 mL de agua destilada y se adiciona hidróxido sódico 1 N, gota a gota y con agitación continua, hasta que el pH-metro marque 6.0. Luego se diluye con agua destilada hasta 100 mL.25 mL tampón de citrato 0.05 M, pH 6.0. El tampón anterior se diluye 10 veces 10 ml tolueno 1 g citrato sódico 10 mg heparina 30 mL sangre fresca de res o humana

PROCEDIMIENTO:

Obtención de caseína:

En un vaso de precipitados de 125 mL vierta 30 mL de leche. Agregue ácido acético al 25 %, gota a gota, agitando después de cada adición, hasta que se observe la precipitación floculada de la caseína. En este momento el pH debe ser aproximadamente 4.8. Centrifugue a 2000 rpm durante cinco minutos. Si es necesario, agregue un pequeño volumen de agua destilada al vaso de precipitados para pasar todo el sólido al tubo de centrífuga. Deseche el sobrenadante. Por dos veces redisuelva el residuo en 30 mL de agua destilada y centrifugue de nuevo. En ambos casos elimine el sobrenadante.

Resuspenda el residuo en 20 mL de etanol al 95 % y centrifugue de nuevo. Elimine el sobrenadante. Prepare 20 mL de una mezcla etanol-éter 1:1 y en esa mezcla resuspenda el nuevo residuo. Centrifugue y elimine el sobrenadante. Resuspenda en 20 mL de éter y pase el conjunto a un vidrio de reloj grande o a otro recipiente previamente pesado. Deje secar al aire y pese el conjunto. Por diferencia de pesadas determine la cantidad de caseína obtenida. Guarde el polvo blanco obtenido para la práctica de "Caracterización de proteínas".

Obtención de ovoalbúmina de clara de huevo:

Pase una clara de huevo a través de una malla de media de nylon y recíbalas en un vaso de precipitados previamente tarado. Determine el peso de la clara de huevo.

Añada un volumen de tantos mililitros de solución saturada de sulfato de amonio como gramos de clara de huevo haya recogido. Esta adición se debe realizar con lentitud, casi gota a gota, mientras se agita vigorosamente. Las ovoglobulinas y la ovomucina (principal responsable de la viscosidad de la clara de huevo) precipitan fácilmente y se pueden separar por centrifugación a 3000 rpm, durante cinco minutos.

El sobrenadante se filtra a través de una mota de algodón situada en el vértice de un embudo y al filtrado se le añade solución saturada de sulfato de amonio., gota a gota, hasta que el líquido esté totalmente turbio. En este punto se añade ácido acético al 25 %, gota a gota y con agitación continua hasta que el pH de la solución esté próximo a 4.5 (comprobar con papel indicador) que es el punto isoeléctrico de la ovoalbúmina, A este pH se produce la precipitación de la proteína. El precipitado se separa por centrifugación a 3000 rpm durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y redisuelva el precipitado, agitando con una varilla, en unos 20 ml de agua destilada. Transfiera a otro recipiente filtrando a través de un embudo con una mota de algodón. Allí, añada lentamente, y con agitación, 20 mL de acetona. El precipitado que se forma se separa por centrifugación. Pase el residuo a un vidrio de reloj u otro recipiente previamente pesado, adiciónele 20 mL de éter y deje secar al aire. Pese el polvo obtenido y guárdelo para la práctica de "Caracterización de proteínas".

Obtención de miosina:

La carne que, en todo momento se debe conservar fría, se muele a máquina o se trocea finamente con unas tijeras (utilice guantes de cirugía) separando los tendones, masas de tejido adiposo y otros contaminantes. Se pesan 100 g de esta carne picada y se les adicionan 300 mL de cloruro de litio 0.7 M (o 300 mL de KC1 0.6 M) previamente enfriado. Se mezcla el conjunto y se agita constantemente, dentro de un baño de hielo, durante una media hora (el grado de molienda de la carne es crítico; cuanto mejor picada y aplastada esté, más adecuada es la disolución. A continuación se filtra el conjunto a través de un embudo con algodón, con el fin de retener las partículas de carne no disueltas. Se recibe el filtrado en un erlenmeyer grande (de dos litros de capacidad) y se le añaden lentamente y mezclando bien, 1200 mL de agua destilada. Se filtra el conjunto a través de un embudo de algodón. Si el filtrado no es claro se debe volver a filtrar a través de una nueva mota de algodón. El liquido claro se reparte, en dos partes iguales, en dos erlenmeyers de 2 1 y se añaden 1.2 1 de agua destilada en cada uno (volumen total del conjunto: 4 litros aproximadamente) lentamente y agitando bien.

Se dejan los recipientes en la nevera durante una noche. La miosina debe precipitar en este intervalo ya que la fuerza iónica es ahora tan baja que no mantiene la proteína en solución. Al día siguiente se decanta el líquido sobrenadante y se recobra un gel de miosina por centrifugación a 13000 rpm, durante cinco minutos. Guarde este gel para la práctica de "Caracterización de proteínas".

Obtención de hemoglobina:

A 20 mL de sangre fresca agregue 3 mg de heparina o 30 mg de citrato sódico, agite bien y centrifugue a 2000 rpm durante 20 minutos. Descarte el plasma sobrenadante. Se resuspende el precipitado de eritrocitos en un volumen aproximadamente igual de cloruro sódico al 0.95 % y centrifugue de nuevo, durante 10 minutos, para eliminar los restos de plasma. El residuo se resuspende en agua destilada hasta un volumen total de 50 mL. Se agregan 5 mL de tolueno y se mantiene el conjunto a 37 °C durante 15 minutos, con agitación fuerte y constante. Se centrifuga de nuevo a 2000 rpm, durante 10 minutos, y se descartan el precipitado y la fase orgánica que contiene buena parte de los lípidos- Se transfiere la disolución de hemoglobina a un baño de hielo y se mide su volumen, se agita fuertemente durante tres minutos y se le añade un volumen de etanol frío al 50 %, gota a gota, agitando el conjunto con una varilla para que la precipitación sea uniforme. Se centrifuga y el residuo se guarda para la práctica de "Caracterización de proteínas".

Obtención de vitelina:

Pese las yemas (sin restos de clara ni membranas) de dos huevos y mézclelas con tantos mililitros de cloruro de sodio al 10 % como gramos de peso tuviera la muestra, mezclando muy activamente el conjunto hasta que sea bien homogéneo. Mida el volumen y pase el conjunto a un embudo de separación. Adicione, con cuidado, un volumen doble de éter. Se hace girar el embudo de la posición vertical a una posición invertida, varias veces, sin agitar. Después de cada inversión se iguala la presión interna dentro del embudo, con la presión atmosférica, abriendo alternativamente la tapa o la llave del embudo. Se desecha la fracción etérea y se repite la operación dos veces más o hasta que el éter no se coloree de amarillo. La fase acuosa se diluye con 15 volúmenes de agua destilada en un recipiente grande, agitando el conjunto para que todo quede en una concentración uniforme. Se aprecia un ligero precipitado de vitelina que se puede dejar sedimentar durante la noche dentro de la nevera. Antes de guardar en la nevera agregue a la solución 0.5 mL de tolueno por cada litro de agua para evitar la putrefacción bacteriana. Pasado este tiempo se decanta la mayor parte del líquido y se recoge la vitelina por centrifugación a 5000 rpm, durante cinco minutos. La proteína se suspende en unos 15 mL de acetona-agua (1:1), deshaciendo los posibles grumos con una varilla. Se centrifuga de nuevo, se descarta el sobrenadante se lava el precipitado con unos 15 mL de acetona pura y se vuelve a centrifugar. Se elimina el sobrenadante y el residuo se pasa a un vaso de precipitados pequeño, previamente pesado. Para facilitar el paso de un recipiente a otro se pueden utilizar pequeñas porciones de éter. Se elimina la mayor cantidad posible de líquido por decantación y el resto se deja secar al aire. Se pesa el polvo seco que queda y se guarda para la práctica de "'Caracterización de proteínas".

Obtención de ureasa:

Se muelen 100 g de semillas de soya frescas (deben conservar la capacidad de germinar) hasta convertirlas en harina muy fina. La harina se transfiere a un erlenmeyer de 500 mL que contenga 300 mL de agua, se deja que se disuelva durante dos horas, agitando de vez en cuando para resuspender la harina. El sobrenadante claro se recoge por filtración o centrifugación a 3000 rpm, durante cinco minutos. SÍ el sobrenadante no está claro debe repetirse la filtración. A continuación se concentra el líquido hasta unos 50-75 mL por evaporación en la trompa de vacío en un baño de agua a unos 30-35 °C. Se filtra de nuevo la disolución y el sobrenadante claro se precipita con 0.6 volúmenes de acetona pura y fría (conservada previamente en nevera). Se deja en nevera unas dos horas, se decanta el líquido claro y se centrifuga el resto. El precipitado de ureasa se disuelve en 10 mL de tampón de citrato 0.05 M, pH 6.0. Se agita suavemente durante dos horas, a temperatura ambiente. Se centrifuga el conjunto y se elimina el precipitado. El sobrenadante se guarda para la práctica de Caracterización de proteínas"

RESULTADOS:

• ¿Cuáles son las características físicas de la solución o del polvo de proteína obtenido? • ¿Cuál es el porcentaje de la proteína aislada (en los casos en que se obtuvo un polvo) con respecto a la

muestra biológica utilizada? Compare ese valor con el que se encuentra en la literatura • En el caso de la ureasa, cómo podría comprobar que se obtuvo esta proteína?