4.ročník biochemie

KVANTITATIVNÍTERMODYNAMIKA

BENG-qTD

Bioenergetika v kostce ...

Něco na úvod...

Učebnice biochemie jsou plné omylů, chyb a nesprávných vysvětlení, vyplývajících z „termodynamické ignorance“

- Báje a mýty:* „ATP jako vysokoenergetická sloučenina“* pojem „makroergní sloučeniny“* „účinnost přeměny energie 40%“

BENG-qTD

Trochu opakování …

Systémy: a) Izolované (adiabatické)b) Uzavřenéc) Otevřené – vyžadují popis pomocí nerovnovážné

TD

Příspěvek rovnovážné TD v biochemii:- Studium jednotlivých reakcí jako uzavřené systémy- Otázka rovnovážného stavu reakce- Odchylka aktuálního stavu z rovnováhy

Hlavní nástroj pro:a) Výpočet rovnovážných podmínek při přenosu energie a

určení odchylky od rovnovážného stavu (= schopnost vykonávat práci)

b) Eliminace „termodynamicky nemožných“ reakcí

BENG-qTD

Entropie a Gibbsova energie

Někdo na entropii nevěří …

BENG-qTD

Entropie a Gibbsova energie 2

Entropie – hnací sílaEnthalpie (teplo)Gibssova energie = zahrnuje výměnu tepla a tok

entropie

G = H - TS Gibbs-Helmholtzova rovnice

Pokud G < 0 systém je schopen vykonávat práci (pokud je k dispozici příslušný mechanismus, kterým ji může vykonávat)

Gibbsova energie v biochemii:1) Reakce substrátů „zásobujících“ respirační řetězec a

syntézu ATP2) Redoxní potenciály při přenosu elektronů (dýchání,

fotosyntéza)3) Elektrochemické gradienty při přenosu iontů na

membránách4) Energie při absorbci kvant světla při fotosyntéze

BENG-qTD

G jako funkce odchylky z

rovnováhy Gibbsova energie = funkce poměru mezi pozorovaným a rovnovážným stavem reaktantů a produktů

BENG-qTD

G odpovídá Gibbsově energii/mol uvolněné při

průběhu reakce beze změny koncentrace

substrátu a produktu (in vivo)

G a rovnovážná konstanta reakce VÝCHODISKO:- uvažování reakcí ve smyslu vychýlení z rovnovážného stavu

BENG-qTD

Lze odvodit:

G = -2.3 RT log K/

R … plynová konstantaT … absolutní teplota … poměr nerovnovážných konc.

Z toho vyplývá: G je funkcí vychýlení z rovnováhy G je negativní pro < K G je pozitivní pro > K

Cc obsDd obs

= Aa obsBb obs

ZÁVĚR:- G nedává odpověď na otázku: „Kolik energie se uvolní při průběhu reakce z aktuálního stavu do rovnováhy ?“

Hodnoty G pro hydrolýzu ATP

Za „fyziologického“ stavu (pH= 7, 10-2 Mg2+ ) lze určit: K ´= 105 M ( ignorujeme vliv vody, pH, ionizačního

stavu,…)

a) Pro rovnovážný stav platí platí: ´= K ´= 105 M pro cytoplazmu (10-2 Pi, 10-3 ADP) – odhad rovnovážné koncentrace ATP 10-10

b) MTCH udržují odchylku od rovnovážného stavu na ´= 10-5 M

pro MTCH (10-2 Pi, 10-5 ADP)- odhad koncentrace ATP 10-2

„Fosforylační potenciál“G (pro syntézu) = - G (pro hydrolýzu)

BENG-qTD

K ´= [ADP] [Pi] [ATP]

zdánlivá reakční konstanta pro hydrolýzu ATP na ADP a Pi

Hodnoty G pro hydrolýzu ATP BENG-qTD

Zdánlivé TD konstanty K´ … zdánlivá rovnovážná konstanta

Vztah k reálným podmínkám v buňce:1) aktivita vs. koncentrace2) H2O jako reaktant nebo produkt3) Ionizační stavy a chelatace

Ad 1)* v biochemických systémech nelze určit aktivity všech reaktantů = používaní koncentrací

Ad 2)* v ředěných roztocích = voda jakoby ve standardním stavu (tj. jako čistá kapalina při tlaku 1 atm)tj. neobjevuje se v rovnicích (pokud jsou K a definovány za stejných podmínek)

BENG-qTD

K´ a ionizační stav

Ad 3)* jeden nebo více reaktantů nebo produktů ionizovatelný* nebo je schopen chelatovat kation

Rovnovážná konstanta – suma ionizovaných a chelatovaných forem nebo specifické formy vystupující v reakci ?

[ ATP] = [ATP4-] + [ATP3-] + [ATP.Mg2-] + [ATP.Mg- ]

Předpokládá se průběh reakce: ATP.Mg2- + H20 = ADP.Mg- + HPO4

2- + H+

Problémy:a) průběh reakce není zcela jasně známb) experimentálně obtížné určit koncentrace forem

BENG-qTD

„pravá konstanta“ K = [ADP.Mg-] [HPO42-]

[H+] [ATP.Mg2-]

Omezená platnost K´

Závěr:K´není univerzální konstantouK´je závislá na pH, koncentraci kationtu, …

G je odvozena z K´ , proto:1) G je podobně jako K´platná pouze pro příslušné podmínky2) G musí být vypočteno za stejných podmínek jako K´

Obecně platí: G = -2.3 RT log10 K/

Pro hypotetické standardní podmínky (1M koncentrace, čistá kapalina nebo čistý plyn při tlaku 1 atm):

G0 = -2.3 RT log10 K

BENG-qTD

Co vlastně znamená G0 ?

G0 nevypovídá nic o:a) o hodnotě G0 pro reakci v buňceb) o směru spontánního průběhu reakce v buňce nebo o hodnotě G uvolněné (spotřebované) při reakci

Lze odvodit:

G = -2.3 RT log10 K/ G = -2.3 RT log10 K + 2.3 RT log10 G = G0 + 2.3 RT log10

Pro rovnovážné podmínky:G = 0

a tedy = K

BENG-qTD

„Vysokoenergetické“ vazby v ATP

- mýtus nebo realita ?

Schopnost reaktantů „vykonávat užitečnou práci“ je dána vychýlením aktuálního poměru koncentrací z rovnovážného stavu

- nikoliv vlastností jednotlivých složek reakce

Příklad 1: moře naplněné rovnovážnou směsí ATP, ADP a Pi…. nic se neděje!

Příklad 2: glukosa-6-P v koncentraci 1010 větší než rovnovážné

… schopen konat práci v buňce jako ATP

BENG-qTD

REDOXní potenciály

Dýchání a fotosyntéza přenos elektronů v transportních

řetězcích

BENG-qTD

Redox potenciály: trocha

pojmů Oxidačně-redukční reakce:

Redoxní páry Příklad: Fe 3+.cyt c + 1 e- Fe2+.cyt c

Poloreakce Příklad: Pyruvát + NADH + H+ Laktát + NAD+

Oxidace NADH NAD+ + H+ + 2e-

Redukce Pyruvát + 2 H+ + 2e- Laktát

Redoxní reakce je možno popsat pomocí TD pojmů a veličin- Používají se elektrochemické veličiny

x někdy zamlžuje TD podstatu jevů

BENG-qTD

Stanovení redox

potenciálů Redoxní poloreakce jsou vratné a lze je popsat rovnovážnou konstantou !

PROBLÉM: * elektrony neexistují volně v roztoku* analogie v elektrochemii – rovnováha kov/roztok soli

ŘEŠENÍ:- popis soustavy 2 poločlánků spojených můstkem (kovová elektroda v rovnováze s 1M roztokem soli)

„Standardní vodíková elektroda“ = nulový potenciál

- H2 při 1 atm na platinové elektrodě

- v roztoku o 1M koncentraci H+ při 250C 2H+ + 2 e- H2

- Potenciály kovových elektrod se odvozují ve vztahu k elektrodě vodíkové

BENG-qTD

Redoxní potenciály v

biochemii Standardní redoxní potenciál:

- definován vůči vodíkové elektrodě- Ox/Red komponent v jednotkové aktivitě (nebo 1M)- pH=0

BENG-qTD

Standardní redox potenciál

Standardní redoxní potenciál Eo je určen za definovaných standardních podmínek vůči vodíkové elektrodě

Obdobně jako pro Gibbsovu energii lze pro redoxní pár

Ox + ne Red odvodit vztah:

E = E0 + 2,3 RT/nF log10 ([Ox] /[Red])

R …. plynová konstanta

F … Faradayova konstanta

BENG-qTD

Redox potenciál a pH

V redoxních reakcích často vystupují protony:

Ox + ne + mH + Red

E0 se stává negativnějším se zvyšujícím se pH:

změna 2,3 RT/F(m /n) mV na jednotku pH

tj. při m = n je změna - 60mV/pH

V biochemii se definuje standardní redox potenciál při pH 7E0´ ( označován také Em,7 = „mid-point potenciál“)

E0´ pro redox pár H +/ 1/2 H2 je 7 x (-60)mV= - 420 mV

Pro hodnotu aktuálního potenciálu:

Eh,pH=x = Em,pH=x + 2,3 RT/nF log10 ([Ox] /[Red])

BENG-qTD

Tabulka redox potenciálů BENG-qTD

Příklad: glutathion

Redoxní pár oxidovaný/ redukovaný glutathione:

GSSG + 2e + 2H + 2 GSH

- Jeden z nejdůležitějších faktorů pro udržení redoxní rovnováhy v cytoplazmě a matrix MTCH

- Nestejné množství reaktantů a produktů = závislost redox potenciálu na absolutní koncentraci

Pro n=2 Eh,pH 7 = E0´ + 30 log10 ([GSSG] /[GSH]2)

E0´ = -240 mV (pH 7, 25oC, 1M GSSG a 1M GSH)

Pro udržení redoxního potenciálu na – 200mV je potřeba:

a) při celkové konc. glutathionu 10mM: 1.2mM GSSG

b) při celkové konc. glutathionu 1mM: 20M GSSG

BENG-qTD

Význam celkové koncentrace

glutathionu BENG-qTD

~ kinetický limit enzymu

glutathion-reduktasy ?

Vztah G a rozdílu redox potenciálů

Pro redoxní páry A a B: Eh = Eh(A) – Eh(B)

- Lze odvodit G = - nF Eh

Z podmínky pro rovnováhu G = 0 …. Eh = 0

Příklad: mitochondrie

NADH/NAD+ Eh,7 = - 280mV

O2/H2O Eh,7 = + 780mV

Eh = 1,16 V … měřítko TD nerovnováhy mezi páry

- při přenosu 2 molů elektronů v dýchacím řetězci:

G = -2 x 96,5 x 1,16 = - 224 kJ mol-1

BENG-qTD

Redoxní potenciály na membráně

Na membráně s existujícím membránovým potenciálem platí :

G = - nF (Eh + )

- Pohyb e- vůči napětí na membráně – „z kopce/do kopce“

BENG-qTD

Elektrochemický potenciál iontu

Platí obecně pro pohyb iontů přes membrány ~ 2 hnací síly:

1) koncentrační gradient

2) membránový potenciál

Koncentrační gradient (přenos z koncentrace [X]A do [X]B)

G (kJmol-1) = 2,3 RT log [X]B /[X]A

Membránový potenciál (přenos kationtu Xm+ po potenciálu ):

G (kJmol-1) = - mF

Celkový elektrochemický potenciál:

Xm + = G = - mF + 2,3 RT log [X]B /[X]A

speciální případ: protony

BENG-qTD

Elektrochemický potenciál protonů

Pro přenos protonů lze odvodit vztah:

H + = - F + 2,3 RT pH

kde pH je definováno jako pH v P-fázi minus pH v N-fázi

Historická poznámka:

Mitchellova definice protonmotivní síly

p (mV) = - (H + / F)

H + 1kJmol -1 odpovídá p 10,4 mV

p 200 mV odpovídá H + 19 kJ mol -1

Pro 25oC a dosazení konstant:

p (mV) = - 59 pH

BENG-qTD

Fotony

- primární zdroj G při fotosyntéze

* energie fotonu E = h

h … Planckova konst. 6,62 x 10-34

… frekvence záření (s-1)

S 1 molem látky interaguje N fotonů:

G = N h = N hc / = 120 000 / (kJ mol-1)

Absorbce 1 molu červeného světla (600 nm) při fotosyntéze:

cca G = 200 kJ mol-1

BENG-qTD

Bioenergetické přeměny a jejich stechiometrie

Případ mitochondrií:

- protonmotivní síla p je „převodníkem“ mezi Eh a GATP

- in vivo nerovnovážné podmínky (otevřený systém)

- in vitro lze dosáhnout „rovnováhy“

např. isolované MTCH – rovnováha mezi protonmotivní silou a syntézou ATP – pokud neprobíhá hydrolýza ATP

- lze testovat lehkým vychýlením z rovnováhy – reakce musí běžet opačným směrem

„Průsak protonů“ MTCH membránou – ustálená hodnota p pod rovnovážnou hodnotou odpovídající Eh

(tj. „vždy tečou nějaké elektrony“ z NADH na kyslík)

Čerpání protonů dýchacím řetězcem

Příklad:

přechod 2 e- v dýchacím řetězci v redox rozmezí Eh přečerpá n H+

Rovnováhy bude dosaženo pro: n p = 2 Eh

Závěr: - čím vyšší stechiometrie H+/ O, tím nižšího rovnovážného p může být dosaženo (analogie převodů na kole do kopce)

Platí pouze pro vstup a výstup e- na stejné straně membrány !!!

x přenos succinátdehydrogenasa (matrix) – cyt c (cyt)

n p = 2 ( Eh +)

BENG-qTD

Čerpání protonů při syntéze ATP

Rovnovážný vztah pro syntézu ATP v mtch matrix:

Gp, matrix = n´ F p kde n´… stechiometrie H+/ATP

Závěr:

- čím vyšší stechiometrie H+/ATP, tím vyšší G lze dosáhnout při daném p (platí i pro bakteriální membrány a stroma chloroplastů)

Transport ADP/Pi do a ATP ven z mitochondrií = příspěvek transportní energie pro celkovou energii (n´ je zpravidla mezi 3 a 4)

Gp, cyt = (n´ + 1) F p

BENG-qTD

Účinnost syntézy ATP„ Oxidace NADH kyslíkem má Go = 220kJmol-1, syntéza ATP má

Go=+31kJmol-1 takže pokud na každý NADH jsou syntetizovány 3 molekuly ATP, oxidativní fosforylace zachycuje asi 93 kJmol-1, což je účinnost 42%…“ (nejmenovaná učebnice biochemie)

Nelze pominout:

a) v buňce nejsou standardní podmínky

b) ve fyzikální chemii nelze jednoduše spočítat účinnost podílem zdánlivého „výstupu“ a „vstupu“

Realita:Přenos 2 molů e- při oxidaci NADH p= 200mV a přenos 10mol

H+

* energie konzervovaná v protonovém gradientu 10 x 200 x F = 200kJ

* při syntéze ATP a přenosu do Cyt p = 3 x 60 kJ = 180kJ

BENG-qTD

Nabité molekuly a

BENG-qTD

Rovnovážná distribuce nabitých iontů mezi kompartmenty A a B oddělených membránou (pro G = 0)

Z rovnice pro elektrochemický potenciál platí za rovnováhy:

Xm+ = 0 = - mF + 2,3 RT log [X M+]B

[X M+]A

= 2,3 RT/mF . log [X M+]B

[X M+]A

- vztah mezi rovnovážnými koncentracemi iontu za daného membránového potenciálu

- elektrochemická rovnováha nastává při rozdílných koncentrací !!!

Rovnovážná distribuce kyselin a zásad

BENG-qTD

A) Membránový gradient a pH gradient na membránách:

- vliv na rovnovážnou distribuci permeabilních iontů s disociabilními protony

- použití syntetických kationtů pro měření a pH

B) Membránový potenciál generovaný přenosem jednoho iontu ovlivňuje distribuci všech ostatních iontů

- např. transport H+ přesun iontů elektrickým uniportem

Specifika:

* Anionty jsou vypuzovány z negativně nabité matrix

* Kationty se akumulují v exponenciální závislosti na

* Dvojmocné kationty akumulují daleko více než jednomocné

Nabité molekuly a

BENG-qTD

Rovnovážná distribuce nabitých iontů mezi kompartmenty A a B

Slabé kyseliny/báze a pH

BENG-qTD

- Distribuce neutrální molekuly není ovlivněna - rovnováha nastane při vyrovnání koncentračního gradientu

- Slabé kyseliny a zásady (pKa 3-11)

* obvykle prochází jako nenabité molekuly x v ionizované formě nepropustné i při vysokém koncentračním gradientu

* protonované kys. a deprotonované báze – nezávislost na

* při existenci pH - dochází k rozdělení ionizovaných částic

- slabé kyseliny akumulace v alkalickém zóně (matrix)

- slabé zásady akumulace v kyselé zóně (mezimembránový)

Další typy membránových potenciálů

BENG-qTD

Difúzní potenciál - vznik membránového potenciálu přidáním soli, jejíž kation a anion mají rozdílnou permeabilitu membránou (rozdíl od potenciálu tvořeného prací iontové pumpy)

např. KCl + valinomycin – vyšší propustnost pro K+ vede ke vzniku uvnitř částice (lze popsat Nerstovou rovnicí)

* na plasmatické embráně eukaryot trvalé difúzní potenciály

Povrchový potenciál – konc. H+ v bezprostřední blízkosti membrány je vyšší než v roztoku

* neovlivňuje p x může ovlivnit membránově vázané indikátory

Další oblíbená kapitola: Nerovnovážná TD

BENG-qTD

Pokračování příště BENG-qTD