Teknik-teknik Pemeriksaan dan Interpretasi Hasildr. Yudha Nurhantari, Ph.D.

Bagian Ilmu Kedokteran KehakimanFakultas Kedokteran UGM Yogyakarta2005

A T G CT A C G

Ekstraksi DNASumber DNA : darah, tissue, cultured cell Lysis buffer + proteinase KInkubasi 37 0C semalamPhenol-chloroform precipitation

Sampel+lysisbufferPhenol-chlorofom

centrifuge

DNA sol

Phenol-Chlorf.transferEthanolGaram

centrifugeDNAprotein

1. Polymerase Chain Reaction (PCR)Adalah suatu cara amplifikasi/penggandaan suatu segmen DNA tertentu.PCR mesin : alat termocycle, otomatis berubah suhunya dalam siklus tertentu.Bahan : -1 pasang primer (Forward&Reverse): 18-30 basa, 50-60% GC

d-NTP mix : dATP,dCTP,dGTP,dTTPPCR buffer : Mg,pH aktivitas enzyme, primer-template specificityH20 Taq polymerase DNA template

2. Annealing t C3. Extension : 72 CRepeated 25-30 x1. Separate/denature c. Enzyme Taq polymeraseReverse primera.DNA templateb.

DNA templatePurity of DNA templateJumlah DNAHindarkan kontaminasi DNA lainShorter fragment amplify more efficient than longer fragment

PrimersSpecific hybridization to the template: - controlled by ionic strength of the buffer (K) - Mg++ concentration bind to dNTPs - annealing temperature

20-25 bases long, 50% G-C 52-580 CDesigning primers :S&E software, etcMelting temperature = 4x(#G+#C)+2(#A+#T) Annealing temp. 3-50 C below melting temp.

Agarose gel electrophoresisCek DNA hasil isolasiCek hasil PCRCek hasil restriction enzymeM1X TAE bufferDC power suplayLoading bufferPewarnaan Etbr Visualisasi :UV light1234

Interpretasi hasil electrophoresisTidak ada band/pita - PCR gagal perbaiki teknik suhu annealing, naikkan jumlah DNA - Hasil negatif : segmen DNA yang ingin kita amplifikasi tidak ada.Terdapat band/pita - expected size : result konfirmasi dengan sequencing, restriction enzyme mapping, blot hybridization

- non-expected size : nonspecific amplf.: primer-dimer, recombinasi antara 2 PCR produk yang berbeda cycles mutasi gen

marker100bp200bp180-bp 1 2 3 4 5 6 7

2. SequencingPembacaan urutan nuleotide/basa pada segmen DNA tertentu.Alat : Sequencing machineMethode dideoxyDNA disintesa dari dioxynucleotide triphosphate (dNTP)Tiap nucleotida baru ditambahkan pada group 3-OH nucleotide terakhir

Dideoxy method : sintetik nucleotide yang tidak punya gugus 3-OH, tetapi 3-H tidak terjadi elongasi chain termination methodProcedure - prepare single strand DNA - dNTP (dATP,dCTP,dGTP,dTTP) - ddNTP (ddATP,ddCTP,ddGTP,ddTTP) - DNA polymerase 1

Separation from the longest fragment to the shortest fragmentEach of ddNTP (ddATP, ddCTP, ddGTP,ddTTP) fluoresces different color

Pembacaan : - tentukan urutan basa primernya (Forward/Reverse) - cocokkan antara hasil dengan standar urutan (gen bank) - warna : merah (T), biru(C), hijau (A), hitam (G)

P- P- P C 5 O Thymine

C 4 1 C 3C 2 C OH H H

dTTPddTTPDeoxythymidine triphosphateDideoxythymidine triphosphatedATP ddATPdTTP ddTTPdCTP ddCTPdGTP ddGTP

Primer

3. Western Blot : - Deteksi suatu protein - transfer dari gel ke membran - antibody terhadap protein - Hasil : berupa band/pita -tidak ada pita : antibody/staining lemah hasil negatif : protein (-) - terdapat pita : expected size : hasil non- expected size : nonspecific protein