Konstruksi Vektor Ekspresi
-
Upload
muhammad-yunus -
Category
Documents
-
view
52 -
download
15
description
Transcript of Konstruksi Vektor Ekspresi
-
Amplifikasi fragmen gen PerL
Konstruksi vektor ekspersi pGWB502-PerL
Introduksi pGWB502-PerL ke dalamAgrobacterium tumefaciens LBA4044
Transformasi genetik Nicotiana tabacumSR1
Identifikasi Nicotiana tabacum SR1 transgenik
METODE KERJA
-
KONSTRUKSI VEKTOR EKSPRESI GEN Peroksidase
Sistem Gateway Cloning
Fragmen PerL diamplifikasi dari pGEM-PerL dengan primer yang ditambah situs CACC pada ujung 5 forward
M 1
Purifikasi denganelusi
PerL pENTR-F 5-CAC CAT GCA TTT CTC TTC GTC-3Atprx-R 5-GTT CTG AAG TAA ACG TCT TGA GAG -3
1100bp
-
RESULT
Pengklonan Entry Vektor pENTR-PerL dengan VektorEkspresi pGWB502
PCR Koloni dengan primer 35SF dan AtprxR
1 2 3 4 M
1500bp
Hasil restriksi dengan enzim spe1 dan sac1
M 1 2
Spe1
RB 35S-P PerL Tnos LB
Sac1
Tnos:NPTII:Pnos
1000 Bp
1100 bp
1500 bp35SF AtprxR
-
Plasmid rekombinanpGWB502-PerL
Introduksi pGWB502-
PerL ke A. tumefaciens
Triparental mating
E. coliDH5
A. tumefaciens
Media LA
tanpa
antibiotik
Media LA dengan
antibiotik
spectinomisin dan
streptomisin
pRK2013
E. coliDH1
PCR koloni dengan primer
35SF dan AtprxR
-
RESULT
Introduksi pGWB502-PerL ke dalam A. tumefaciens LBA4404
1 2 M
1500 bp
RB 35S-P PerL TnosLBTnos:NPTII:Pno
s
1500 bp35SF AtprxR
-
Transformasi genetik Nicotiana tabacum
Daun dipotong
dan direndam
A. tumefaciensLBA 4404
transformanMedia kokultivasi
Media induksi
kalus
Seleksi hyg 30 mg/L
Media induksi
akar (5 minggu)
Media induksi
akar (8 minggu)
PCR
-
RESULT
Identifikasi Nicotiana tabacum SR1Transgenik
1500bp
M 1 2
RB 35S-P PerL Tnos LBTnos:NPTII:Pnos
1500 bp35SF AtprxR