Kök Hücre Kaynakları, Seçimi,

Toplama, Saklama ve İşleme

DoDoçç. . Dr. Dr. Fevzi Fevzi AltuntaAltuntaşşAnkara Onkoloji EAnkara Onkoloji Eğğitim ve Araitim ve Araşşttıırma Hastanesirma Hastanesi

KKöök Hk Hüücre Nakli ve Aferez cre Nakli ve Aferez ÜÜnitesinitesi

THD, Hematoloji Okulu, Kök Hücre Nakli Kursu, 27 Haziran 2009, Mardin

Kendini yenileyebilen (Self-Renewal)

Farklı

hücrelere yönlenebilen

(Differentiation)

Yamalanma yapabilen (Engrafment)

Klonal

hücreler

Kök Hücre Nedir?1

KKöök hk hüücreler ycreler yüüzeyinde belli zeyinde belli proteinler eksprese ederlerproteinler eksprese ederler::

CD34CD34

CD34+ CD34+ hhüücrelercreler

akakıım m sitometrisitometri

kullankullanıılarak larak

ööllçüçülebilirlebilir

En kEn kıısa zaman dilimi isa zaman dilimi iççinde kinde köök k hhüücreyi tespit etmek icreyi tespit etmek iççin in indirektindirekt

bir teknik,bir teknik,

BirkaBirkaçç

saat alsaat alıırr

CD34 eksprese eden tüm hücreler kök hücre değildir.

Kök hücre nasıl tespit edilir?2

Kök Hücre kaynakları nelerdir?

Kaynak

Kemik İliği

Periferik

Kan

Kord

Kanı

Verici

AllojeneikAkrabaAkraba dışı

Otolog

Singeneik

3

Uygulama kolaylıkları

Genel anestezi gerektirmemesi

Hastaneye yatırılmadan, ayaktan yapılabilmesi

Daha az travmatik

olması

Daha ağrısız olması

Aferez

öncesi transfüzyon gereksiniminin daha az olması

Nakil sonrası

engraftmanın

daha hızlı

gerçekleşmesi

Trombosit

süspansiyonu gereksiniminin daha az olması

Hastanede kalış

süresinin daha kısa olması

Morbidite

ve mortalite

oranının daha düşük olması

Periferik

Kök Hücre: AVANTAJLAR

Altuntas

F, et al. Peripheral

Blood

Progenitor

Cell

Collection. Transfus

Apher

Sci. 2007;36(2):159-167

Vasküler

giriş

yolu gerektirmesi

Mobilizasyon

protokolüne gereksinim duyulması

Toplama işleminin birkaç

gün (seans) sürebilmesi

Sitokinlere

veya aferez

işlemine bağlı

görülebilecek komplikasyonlar

Dondurulmuş

ürünün infüzyonu

sırasında görülebilecek yan etkiler

PKH içeriğinin Kİ’ne

göre yaklaşık 10 kat daha fazla T-lenfosit

içermesi GVHH riskini arttırabilir

Akut GVHH gelişimine etkisi yok

Kronik GVHH insidansını

arttırabilir

Periferik

Kök Hücre: DEZAVANTAJLAR

Altuntas

F. et al.

Transfusion

Med

& Hemother

2008

KordKord

kankanıı

kköök hk hüücrecre

Kord

kanı

kök hücreden zengin bir kaynak

Miktar az (75-200 cc): toplam kök hücre sayısı/kg başına sınırlı

50 kg kadar bireyler (çocuk) için yeterli

Kök hücreler PK veya Kİ’ne

göre daha az

Graft

yetmezliği ve engraftman

gecikmesi

Proliferasyon

hızı

yüksek

Düşük miktarda kök hücre tolere

edilebilir

2 x106

CD34+

hücre/kg

2 x107

NC/kg

Graft

rejeksiyon

ve GVHH gelişme riski daha düşüktür

Kısmi HLA match

(4/6) durumu tolere

edilebilir

Verici bulmayı

ve verici havuzu oluşturmayı

kolaylaştırmakta

Kordon Kanı Kİ/PK

Donör

için risk Yok Var

Arama süresi (ay) ≤1 3-6

Graft

yerleşimini sınırlayan faktör Hücre sayısı HLA uygunluğu

Sonucu etkileyen ana faktör Graft

yerleşmemesiGecikmiş

immün

düzelme GvHH

Uygunluk en az 4/6 9/10

GvHH

riski Az Yüksek

DLİ YOK Olası

KHT sonrası

infeksiyon Daha yüksek Yüksek

İmmünoterapi

olasılığı Yok Var

Kök Hücre Kaynakları

Kök Hücreler nasıl toplanır?

4

Kemik İliği Kaynaklı

Kök Hücre Toplama

(KI >MNH %1-4)

Alıcının kilogramı

başına ~10-20 ml ilik materyali alınır.

KEMİK İLİĞİ

ASPİRASYON SETİ

(Thomas İğneleri)

VERİCİDEN AMELİYATHANEDE KEMİK İLİĞİ TOPLANMASI

Kemik İliği Kaynaklı

Kök Hücre Toplama

Amaç:

2-3 x 108

çekirdekli

hücre/kg

>2 x 106

CD34+ hücre/kg

Kemik İliği harvest

10

ml x 100-200 aspirasyon

Periferik Kök Hücre Toplama

Çekirdekli hücrelerin%0.05

Mobilizasyon

Nedir? ve Rasyoneli Nedir?

Periferal

kan kök hücre içeriği kemik iliği kavitesindekinden

daha azdır:

Kİ

= hücrelerin %3-5’i

CD34 eksprese eder

PK

= hücrelerin %0.03-% 0.05

CD34 eksprese eder

Tanım:

Mobilizasyon

periferal

kandaki kök hücre içeriğini artırmak için kullanılan metot

İyi bir mobilizasyon

metodu:

Hematopoetik

yeniden yapılanmanın desteklenmesi ve

Transplant

sonrası

iyileşmenin hızlı

olması

için

Az sayıda aferez

işlemi ile

Yeterli kök hücre toplanmasına imkân sağlamalıdır

5

Kök Hücre Mobilizasyon

metotları

nelerdir?

Mobilizasyon

protokolleri:

Kemoterapi:

Periferik

kanda kök

hücre konsantrasyonunu 20-25

kat arttırır

SikSikloloffososffamiamitt

EtoposiEtopositt

SikSikloloffososffamiamit t + + EtoposiEtopositt

Sitokin

(G-CSF)

Filgrastim

Lenograstim

Kombinasyon (Kemoterapi

+ sitokin):

Periferik

kanda kök

hücre konsantrasyonunu

100-160

kat arttırır

Lemoli

RM,

et al. Haematologica. 2008 Mar;93(3):321-4, Narayanasami

U et al. Blood

2001; 98: 2059-2064

6

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Normal KT Sitokin KT + Sitokin

GG--CSF: CSF: mobilizasyondamobilizasyonda

rolrolüü

nedir?nedir?

ProteazlarProteazlar kköök hk hüücre cre mobilizasyonundamobilizasyonunda

rol oynamaktarol oynamakta

G-CSF kemik iliğinde osteoblastosteoblast aktivitesini aktivitesini supresesuprese

eder ve eder ve

SekonderSekonder

olarak da olarak da mRNAmRNA

ddüüzeyinde zeyinde

SDFSDF--11↓↓

de dde düüşşüüşşe yol ae yol aççar ve ar ve

Kritik basamak olan Kritik basamak olan SDFSDF--1/CXCR41/CXCR4 sinyalizasyonu kesersinyalizasyonu keser

BBööylece HKH ylece HKH mobilizasyonunumobilizasyonunu sasağğlarlar……

Pruijt, Fibbe

et al. 1999; Heissig, Hattori et al. 2002

G-CSF ve KT+G-CSF takiben periferal CD 34+ kök hücre değişimi

05

1015202530354045

1 2 3 4 5 6 7 8 9 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Günler

CD

34

+ H

ücre

Narayanasami U, et al. Randomized trial of filgrastim versus chemotherapy and filgrastim mobilization of HSC. Blood 2001; 98: 2059-2064

Kök hücre aferezine

ne zaman başlanır?

Mobilizasyon

ürün belirleyicisi: aferez

öncesi PK CD34 sayısı

İlk mobilizasyonda 1. aferez günü toplanan CD34 ürünü ile periferal CD34 sayısı korelasyon göstermektedir

y = 72,633x + 531225R2 = 0,5961

0,00E+00

2,00E+06

4,00E+06

6,00E+06

8,00E+06

1,00E+07

1,20E+07

0,00E+00 2,00E+04 4,00E+04 6,00E+04 8,00E+04 1,00E+05 1,20E+05

Periferal kanda dolaşan CD34 sayısı (hücre/ml kan)

CD

34 +

ürü

n (h

ücre

/ kg

)

Periferik

kan CD 34 sayısı

önemli midir?7

Altuntas

F et al. Transfus

Apher

Sci

2007;36(2):159-167.

Kök hücre aferezi: pratik bilgiler

8

Allojeneik

Transplant: Alıcı

Yaşı

Eğilimi 1987-2004

0

20

40

60

80

100

1987-1992 1993-1998 1999-2004

Tra

nsp

lant,

%

20 yrs21-40 yrs41-50 yrs51-60 yrs60 yrs

NATIONAL MARROW DONOR PROGRAM®

©2005

Aferez-

YAŞ

sınırı

var mı? Yaş

önemli mi?

Yaş:

Sağlıklı

vericilerde yaş

sınırı= 4-79

Akraba nakillerinde yaş

sınırı

yok

Akraba dışı

nakillerde yaş

sınırı

belirlenmemiş

Yaş

artıkça PK mobilizasyon

başarısızlığı

artabilir

Yaş

arttıkça GVHH riski artmakta

McCarty

J. IBMTR 2007 Meeting

Education

Book

Kavukcu

S, Altuntas

F. et al Transfusion

Med

& Hemother

2008

İnfeksiyon:

Vericiler:

İlk 30 gün içerisinde bulaşıcı

hastalık yönünden taraması yapılmış

ve normal olmalıdır.

Hastalar=

FEN ve infeksiyonu kontrol altında olan hastada aferez sürdürülürken infeksiyon bulaşına

yönelik önlemler alınmalıdır;

Aferez

ürünün dondurulması

sırasında otolog

plazma kullanılmamalı

Aferez

ürünü

eritilip geri infüze

edilirken yıkanmalı

Pnömonili

hastalarda aferez

ertelenmelidir

Viral

infeksiyon durumunda hastaya göre karar vermek gerekir

Kültür örnekleri alınmalıdır

Smith

AM, J Hemathother

1994;3:331-348

Aferez-

Febril

nötropeni

var. Tamam mı? Devam mı? Ne yapayım?

Aferez-

Trombositopeni

var. Ne yapayım?

TAM KAN SAYIMI:

Vericiler:

PLT

(x109/L)

Hb

(g/dL)

İşlem

Öncesi

>150

>12.5

1. Aferez Sonrası

>120

>10

2. Aferez Sonrası

>70

>10

Hastalar:

Trombosit: >20 x109/L

olmalıdır

• Aferez

ile kan hacminin 2 katı

işlenmesi sonrası

PLT sayısı

%5-30 azalır

• G-CSF kullanımı

da PLT sayısında azalmaya yol açar (dilusyonel)

Altuntas

F. et al Transfusion

Med

& Hemother

2008

Allogeneik

Transplant:

20yaş, CIBMTR

1989-2004

-

Verici

Tipi

ve

Kök Hücre Kaynağı

Eğilimi-

0

500

1.000

1.500

2.000

2.500

3.000

3.500

4.000

4.500

1989-90 1991-92 1993-94 1995-96 1997-98 1999-00 2001-02 2003-04

Tra

nsp

lant

AkrabaAkraba dışı

– Kİ

veya

PKAkraba dışı

– Kord kanı

NATIONAL MARROW DONOR PROGRAM®

©2005

Kordon Kanı Kök Hücre Toplama

Çekirdekli hücrelerin%0.3

Kordon kanKordon kanıı

nasnasııl toplanl toplanıır?r?

KK toplama aKK toplama ağğrrııssıız, kolay ve riski minimal bir z, kolay ve riski minimal bir

iişşlemdir. lemdir.

Bebek doBebek doğğduktan ve kordon duktan ve kordon klemplendiktenklemplendikten

sonra plasenta ve sonra plasenta ve umblikalumblikal

korddakordda

kalan 40kalan 40--100 100

ml kan, ml kan, umblikalumblikal

kordun antiseptik solkordun antiseptik solüüsyonla syonla

temizlenmesini takiben enjekttemizlenmesini takiben enjektöör yardr yardıımmııyla kan yla kan

torbastorbasıına toplanna toplanıır. r.

Toplama iToplama işşlemi 2lemi 2--4 dakika s4 dakika süürmektedir. rmektedir.

9

Kordon Kanının İşlenmesi

Toplanan üründen kültür alınır

İnfeksiyöz

tarama: Sifilis, HIV, HBV, HCV

ve CMV taraması

yapılır

Hacim: Toplanan kord

kanın hacmi kayıt edilir (ortalama 120 cc)

Hücre sayısı: MNH (>2x107

/kg) ve CD34+ hücre (>2x106

/kg) sayılır

HLA tiplemesi yapılır

Class

I serolojik, Class

II ise DNA (PCR-SSO veya PCR-SSP)

Kordon Kanı

Nerde, Ne kadar Süre Saklanabilir?

Bilgisayarlı

kademeli dondurucuda dondurulup -196°C de sıvı azot tankına aktarılır

Kordon kanındaki hücre canlılığı

10 yıllık sürede yeterli düzeyde korunabilmekte

En uzun 10 yıllık kord

kanı

başarılı

bir şekilde nakilde kullanılmış

10

CD34+ hCD34+ hüücre miktarcre miktarıı

öönemli midir?nemli midir?

KKöök hk hüücre dozu cre dozu KHTKHT’’nnıınn

babaşşararııssıınnıı

etkileretkiler

TRM, TRM, RelapsRelaps

riski, postriski, post--KHT MDS/AML ve LOSKHT MDS/AML ve LOS

Yeterli hYeterli hüücre miktarcre miktarıı::

SitopenilerSitopeniler

ile iliile ilişşkili maliyet ve yan etkileri skili maliyet ve yan etkileri sıınnıırlamak irlamak iççin in ççok ok hhıızlzlıı

(8(8--14 g14 güün) n) nnöötrofiltrofil

(>500)(>500)

ve ve trombosittrombosit

engraftmanengraftmanıı

(>20,000(>20,000))

sasağğlayan dozdur:layan dozdur:

AzalmAzalmışış

transftransfüüzyon gereksinimizyon gereksinimi

Daha az Daha az sepsissepsis

ataatağığı

Daha az antibiyotik kullanDaha az antibiyotik kullanıımmıı

Hastanede kalHastanede kalışış

ssüüresinde kresinde kıısalmasalma

McCarty

J. IBMTR 2007 Meeting

Education

Book

11

CD34 DoCD34 Dozuzu

Ne olmalNe olmalıı??

Otolog

KHT

> 2 x106

CD34+

hücre/kg

Allojeneik

KHT

> 5 X106

CD34+

hücre/kg

Kord

Kanı

KHT

> 2 x106

CD34+

hücre/kg

HematopoetikHematopoetik

yapyapıılanmalanma

MobilizasyonMobilizasyon

babaşşararııssıızlzlığıığı? nedenleri nelerdir?? nedenleri nelerdir?

<<2 x106

CD34+

hücre/kg

= %10= %10--2020

YaYaşş: Ya: Yaşşllıı

hastalarhastalar

PrimerPrimer

hastalhastalıık: k: LenfomaLenfoma

hastalarhastalarıı

(%35)(%35)

ÖÖnceki nceki KemoTerapilerKemoTerapiler: :

SaySayııssıı: Artt: Arttııkkçça risk artmaktaa risk artmakta

AlkilleyiciAlkilleyici

ajanlarajanlar

MobilizasyondanMobilizasyondan

2 ay 2 ay öönce nce fludarabinfludarabin

tedavisitedavisi

Kemik iliKemik iliğği alanlari alanlarıına RT almasna RT almasıı

TrombositopeniTrombositopeni

(d(düüşşüük k üürrüün belirteci)n belirteci)

MobilizasyonMobilizasyon

ööncesi PK CD34+ hncesi PK CD34+ hüücre saycre sayııssıı

ddüüşşüüklklüüğğüü

KemoKemo--mobilizasyonmobilizasyon

sonrassonrasıı

nnöötrofiltrofil

recoveryrecovery’’dede

gegeççikmeikme

McCarty

J. IBMTR 2007 Meeting

Education

Book

12

MobilizasyonMobilizasyon

babaşşararııssıızlzlığıığı

var: NE yapabilirim? var: NE yapabilirim?

MobilizasyonuMobilizasyonu

tekrarlatekrarla

YYüüksek volksek volüüm m aferezaferez

Maliyet artMaliyet artışış

ve ve MorbiditeMorbidite

artartışış

Alternatif ve/veya YAlternatif ve/veya Yüüksek doz ksek doz sitokinsitokin

YYüüksek doz Gksek doz G--CSFCSF

SCF, GMSCF, GM--CSF, ILCSF, IL--33

KemoKemo--mobilizasyonmobilizasyon

ToksisiteToksisite, FEN, maliyet art, FEN, maliyet artışıışı

AMD3100= AMD3100= PlerixifarPlerixifar

((MobozilMobozil); ); SDFSDF--1 alfa inhibit1 alfa inhibitöörrüü

BBüüyyüüme hormonu (GH)me hormonu (GH)

Kemik iliKemik iliğği i harvestharvest

Maliyet artMaliyet artışıışı

EngraftmanEngraftman

yavayavaşş

McCarty

J. IBMTR 2007 Meeting

Education

Book

KKÖÖK HK HÜÜCRELERCRELERİİN DONDURULMASI VE N DONDURULMASI VE SAKLANMASI SAKLANMASI

Kök hücre dondurmadan ne kadar süre saklayabilirim?

Isı

-79C’nin

altına inmedikçe metabolik

saatin durdurulması imkansız

0-20C ‘de Na-K pompası

bozulmakta ve hücreler şişmeye başlamakta

Enzim aktiveleri bozulmakta

pH

değişiklikleri oluşmakta

Sonuçta hücre viabilitesi

bozulmakta

Donma ısısının üzerinde vericiden alıcıya kök hücre

transferi 72-96 saat içinde gerçekleştirilmelidir

Stockschlaeder

M, et al. Long

term

follow

up

of leukemic

patients

after

related

cryopreserved

bone marrow

transplantation. Br

J Haematol

1997; 96: 382–386

13

Kriyoprotektif

ajanlar

iki

tiptir

1-

İntrasellüler

ajanlar Gliserol Dimetilsulfoksid

(DMSO)

2-

Ekstrasellüler

ajan HES (Hidroksietil

starch)

KRKRİİYOPRYOPROTEKTAN AJANLAR OTEKTAN AJANLAR NELERDNELERDİİR?R?

Gorlin

J. Stem

cell

cryopreservation. J Infusional

Chemother

1996; 6: 23-27

14

Amaç:

Kök hücreleri maksimum canlılık oranı

ve fonksiyonel kapasite ile

tekrar resüsite

edebilecek şekilde dondurarak saklamaktır.

DMSO= Tek başına kullanıldığında en ideal kriyoprotektan

ajan

%5-10 DMSO etkin koruma sağlayabildiği gösterilmiştir

Suda yüksek derecede çözünürlük gösterebildiği ve hücre

membranlarını

geçebildiği için, hem hücre içi hem de hücre dışında

osmolaliteyi

yükselterek membran

boyunca yerleşen tuz gradientini dengeye getirir.

Kök hücre dondurma

Gorlin

J. Stem

cell

cryopreservation. J Infusional

Chemother

1996; 6: 23-27

Programlı

dondurma

•

Ürün ısısı

-20C’ye

ulaşana kadar 15-20 C/dk’da

hızlı

bir soğutma işlemine tabi

tutulur.•

Geçiş

fazı

sonrası

ideal soğutma hızı

1-

3C/dk’dır. •

-80C’ye

ulaşıldıktan sonra ürün daha

düşük ısılara, örneğin sıvı

azot veya azot buharı

içine direkt olarak kaldırılabilir

Kök

hücreleri

için

en uygun

ısı

nedir?

-80 °C ile

-

196

°C arasıdır.

Hangi koşullarda ne kadar süre saklanabilir?

-80 °C’nin

üzerinde

(deep

freeze) = 5 yıl

-150 °C’nin

üzerinde

(azot buhar fazı) = 10-15 yıl

-196 196 °°C C ‘‘de de (s(sııvvıı

nitrojen) = nitrojen) = sonsuzasonsuza

dekdek

saklasaklananabilbilirir

Kök

hücreleri

saklamak için

en uygun

ısı

nedir?

Hangi koşullarda ne kadar süre saklanabilir

Valeri

CR, Pivacek

LE: Transfusion

36:303-308:1996 ve Galme

A et al; Transfusion

36:794-797:1996.

15

Kök Hücre Transferini Nasıl Yapabilirim?

Dondurulmuş

hücreler nakil yapılacak merkeze özel

taşıma tankları

ile transfer edilmeli:

Ürünlerin saklandığı

tankların ısısıyla aynı

olmalı

Ürünler taşınırken ısı

farkına maruz kalmamalı

Şehirlerarası

ve uluslar arası

taşımalarda, dökülme, sızıntı

v.b

risklere karşı

ürünler sıvı

azot içerisinde değil buhar fazında

taşınmalı

Taşıma tankı

üzerinde ortamın ısısını

belirten bir gösterge olmalı

Kök hücre eritme ve infüzyon

16

İçi %90 etil alkol ile yıkanmış

su banyosuna steril su konduktan sonra 37-40C kadar su ısıtılır

Kök hücre ürünü

hızlıca 37-40°C’de

çözülür

Bir miktar azot içeren kaplar ile transfer edilen ürün

torbaları

su banyosu içinde yumuşak masaj hareketleri ile

tamamen eritilir.

Ürün torbasının koruyucu kılıfı

yoksa ağız kısmının su

içine daldırılmamalıdır.

Kök Hücre Eritme işlemi nerde yapılır?

Kök Hücre infüzyonunda

nelere dikkat etmeliyim?

Banyodan çıkan torbalar steril bezlerle silindikten

sonra koruyucu kılıfından çıkarılarak 200m’lik

filtre içeren setlerle infüze

edilir.

Çözünme ile infüzyon

arasındaki süre 1 saati

geçmemelidir

İnfüzyon

süresi 10-15 dakikayı

geçmemelidir

Viyabilite

Nedir? Nasıl bakılır?

Viyabilite= Hücre canlılığı

1) Flörasan

mikroskobu

2) Akım sitometri

yöntemi

Tripan

Mavisi, Akridin-Oranje

ve

Propidyum

İyodit

Canlılık (%)= Canlı

hücre / Total

hücre x100

En az % 75 ve üzeri olmalıMNH

CanlıHücre

CanlıHücre

17

Kalite kontrolü

için neler yapılmalı?

1. Hücre

Miktarı:

A. Çekirdekli hücre miktarı

B. Eritrosit miktarı

C. Trombosit

miktarı

2. Hücre

morfolojisi (Yayma, formül)

3. Hücre canlılığı

(Viabilite)

4. Sterilite (Kültür)

5. Kök

Hücre miktarı

(Quantity):

A. CD34 hücre sayısı

B. Hematopoietik

progenitor hücre

kültür

6. Tümör hücre

kontaminasyonu